AT501101B1

AT501101B1 - Protein-allergen-derivat

Info

Publication number: AT501101B1
Application number: AT0202804A
Authority: AT
Original assignee: Biomay Ag
Priority date: 2004-12-02
Filing date: 2004-12-02
Publication date: 2008-01-15
Also published as: DE602005011667D1; AT501101A1; EP1817330B1; ATE417060T1; CN101068830A; CA2589187A1; PL1817330T3; AU2005312324B2; JP2008521837A; WO2006058359A2; AU2005312324A1; US20080286311A1; CN101068830B; WO2006058359A3; ES2319218T3; EP1817330A2

Description

2 AT 501 101 B1

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verringerung der Allergen-Wirkung von Wildtyp-Protein-Allergenen, neue Allergen-Derivate und Allergen-Impfstrategien.

Eine Allergie ist die ererbte oder erworbene spezifische Veränderung der Reaktionsfähigkeit gegen fremde (d.h. nichteigene) Substanzen, die normalerweise harmlos sind („Allergene“). Eine Allergie ist mit entzündlichen Reaktionen in den betroffenen Organ-Systemen (Haut, Bindehaut, Nase, Rachen, Schleimhaut der Bronchien, Magen-Darm-Trakt), unmittelbaren Krankheitssymptomen, wie allergische Rhinitis, Konjunktivitis, Dermatitis, anaphylaktischer Schock und Asthma, und chronischen Krankheitsmanifestationen, wie Reaktionen im Spätstadium bei Asthma und atopische Dermatitis, verbunden.

Die Typ-I-Allergie stellt eine genetisch bestimmte Überempfindlichkeits-Erkrankung dar, die etwa 20% der Bevölkerung der industrialisierten Welt betrifft. Das pathophysiologische Merkmal der Typ-I-Allergie ist die Erzeugung von Immunglobulin E (IgE)-Antikörpern gegen ansonsten harmlose Antigene (Allergene).

Derzeit ist die einzige ursächliche Form der Allergiebehandlung eine Allergen-spezifische Immuntherapie, wobei dem Patienten zunehmende Allergen-Dosen verabreicht werden, um ein Allergen-spezifisches Nichtreagieren zu induzieren. Obwohl mehrere Untersuchungen eine klinische Wirksamkeit der Allergen-spezifischen Immuntherapie zeigten, versteht man die zugrunde liegenden Mechanismen noch nicht ganz.

Der größte Nachteil der Allergen-spezifischen Immuntherapie ist, dass man von der Verwendung natürlicher Allergen-Extrakte abhängig ist, die schwierig - wenn nicht unmöglich - zu standardisieren sind, zumindest in industriellem Maßstab. Solche natürliche Allergen-Extrakte bestehen aus verschiedenen allergenen und nicht-allergenen Verbindungen, und infolgedessen ist es möglich, dass bestimmte Allergene im verabreichten Extrakt nicht vorhanden sind oder - noch schlimmer - dass Patienten neue lgE-Spezifitäten gegen Komponenten im Laufe der Behandlung entwickeln können. Ein weiterer Nachteil der Therapie auf Extrakt-Basis ergibt sich aus der Tatsache, dass die Verabreichung biologisch aktiver Allergen-Präparate anaphylaktische Nebenwirkungen induzieren kann.

Die Anwendung von Techniken der Molekularbiologie auf dem Gebiet der Allergen-Charakterisierung hat es ermöglicht, die cDNAs, die für alle relevanten Umwelt-Allergene codieren, zu isolieren, und die Produktion rekombinanter Allergene ermöglicht. Die Verwendung solcher rekombinanter Allergene hat es möglich gemacht, das Reaktivitäts-Profil des einzelnen Patienten entweder durch diagnostische Verfahren in vitro (d.h., Detektion Allergen-spezifischer IgE-Antikörper im Serum) oder durch Testen in vivo zu bestimmen. Auf der Grundlage dieser Technologie schien die Entwicklung neuer Impfstrategien, insbesondere gegen die Typ I-Allergie, auf Komponenten-Basis, welche für das Sensibilisierungsprofil des Patienten maßgeschneidert sind, im Bereich der Möglichkeit zu liegen. Infolge der Ähnlichkeit der rekombinanten Allergene mit ihren natürlichen Gegenstücken weisen aber auch rekombinante Allergene eine beträchtliche allergene Aktivität auf. Da die rekombinanten Allergene die allergene Aktivität der Wildtyp-Allergene sehr stark nachahmen, liegen alle mit dieser allergenen Aktivität verbundenen Nachteile der natürliche Allergene anwendenden Immuntherapie auch für rekombinante Allergene vor. Um die Immuntherapie zu verbessern, muss die allergene Aktivität der rekombinanten Allergene reduziert werden, so dass die Dosis der verabreichten Allergene - mit einem nur geringen Risiko anaphylaktischer Nebenwirkungen - erhöht werden kann.

Es wurde vorgeschlagen, ausschließlich die Aktivität von Allergen-spezifischen T-Zellen zu beeinflussen, indem Peptide verabreicht werden, die nur die T-Zellen-Epitope enthalten. Die T-Zellen-Epitope stellen kleine Peptide dar, die sich aus dem proteolytischen Verdau intakter Allergene durch Antigenpräsentierende Zellen ergeben. Solche T-Zellen-Epitope können als synthetische Peptide erzeugt werden. Bisher mit T-Zellen-Epitopen durchgeführte Tests zeigten jedoch nur schwache Ergebnisse und eine geringe Effizienz. Für die geringe Effizienz der 3 AT 501 101 B1

Immuntherapie auf T-Zellen-Peptid-Basis wurden mehrere Erklärungen erwogen: erstens kann es schwierig sein, die optimale Dosis zu verabreichen, um eine T-Zellen-Toleranz statt einer Aktivierung zu erreichen. Zweitens haben kleine T-Zellen-Epitop-Peptide im Körper eine kurze Halbwertszeit. Drittens gibt es beträchtliche Beweise, dass die IgE-Produktion bei atopischen Individuen eine Gedächtnis-Immun-Reaktion darstellt, die keine De-novo-Klassenumschaltung („de novo dass switching“) erfordert und somit nicht durch von T-Zellen abstammende Cytokine kontrolliert werden kann. Therapie-Formen, die ausschließlich auf der Verabreichung von T-Zellen-Epitopen basieren, könnten daher die Aktivität Allergen-spezifischer T-Zellen modulieren, könnten aber nur einen geringen Einfluss auf die Erzeugung von Allergen-spezifischen IgE-Antikörpern durch bereits umgeschaltete Gedächtnis-B-Zellen haben.

Weiters wurde vorgeschlagen, hypoallergene Allergen-Derivate oder Fragmente durch rekom-binante DNA-Technologie oder Peptid-Synthese zu erzeugen. Solche Derivate oder Fragmente tragen T-Zellen-Epitope und können IgG-Antikörper induzieren, die mit der IgE-Erkennung des nativen Allergens konkurrieren. Es wurde vor mehr als 20 Jahren nachgewiesen, dass der proteolytische Verdau von Allergenen kleine Allergen-Fragmente ergab, die zum Teil ihre IgE-Bindungsfähigkeit beibehielten, aber keine Reaktionen vom unmittelbaren Typ hervorriefen. Während die Proteolyse von Allergenen schwer zu steuern und zu standardisieren ist, eröffnete die Molekularbiologie neue Wege für die Erzeugung von IgE-bindenden Haptenen. Es wurde vorgeschlagen, dass solche IgE-bindenden Haptene für eine aktive Immunisierung mit geringeren Risiken anaphylaktischer Wirkungen und für eine passive Therapie zur Sättigung des Effek-tor-Zellen-gebundenen IgE vor dem Allergen-Kontakt und somit zur Blockierung der Allergeninduzierten Mediator-Freisetzung nützlich sein könnten.

Ein weiterer Vorschlag war, hypoallergene Allergen-Versionen durch Genmanipulation herzustellen, auf Grund der Beobachtung, dass Allergene von Natur aus als Isoformen, die sich nur in wenigen Aminosäure-Resten unterscheiden und/oder in Konformationen mit geringer IgE-Bindungsfähigkeit auftreten können. Beispielsweise ergab die Oligomerisation des Birken-Pollen-Hauptallergens, Bet v 1, durch Genmanipulation ein rekombinantes Trimer mit stark reduzierter allergener Aktivität. Alternativ wurde vorgeschlagen, dass die Einführung von Punkt-Mutationen entweder zu Konformationsänderungen in der Allergen-Struktur führt und somit diskontinuierliche IgE-Epitope aufbricht oder die IgE-Bindungsfähigkeit direkt beeinflusst (Valen-ta et al., Biol. Chem. 380 (1999), 815-824).

Es wurde auch gezeigt, dass die Fragmentierung des Allergens in einige wenige Teile (z.B. in zwei Teile) zu einem beinahe vollständigen Verlust der IgE-Bindungsfähigkeit und allergenen Aktivität des Allergens führt, infolge eines Verlusts ihrer nativ-artigen Faltungen (Vrtala et al. (J. Clin. Invest. 99 (1997), 1673-1681) für Bet v 1, Twardosz et al. (BBRC 239 (1997), 197-204) für Bet v 4, Hayek et al. (J. Immunol. 161 (1998), 7031-7039) für Aln g 4, Zeiler et al. (J. Allergy Clin. Immunol. 100 (1997), 721-727) für Rinder-Hautschuppen-Allergen, Elfman (Int. Arch. Allergy Immunol. 117 (1998), 167-173) für Lep d2), Westritschnig (J. Immunol. 172 (2004), 5684-5692) für Phlp 7), ...). Die Fragmentierung von Proteinen, die hauptsächlich diskontinuier-liche/konformationelle IgE-Epitope enthalten, führt zu einer wesentlichen Verringerung der IgE-Bindungsfähigkeit des Allergens. Auf Grund dieses Wissens wurde im Stand der Technik untersucht, ob solche hypoallergene Allergen-Fragmente in vivo schützende Immunantworten induzieren können (Westritschnig et al., (Curr. Opinion in Allergy and Clin. Immunol. 3 (2003), 495-500).

Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Mittel und Verfahren für eine verbesserte Allergie-Immuntherapie auf Basis des oben erwähnten Wissens vorzusehen. Solche Verfahren und Mittel sollten wirksam, mit einem geringen Risiko eines anaphylaktischen Schocks verbunden, leicht anwendbar und an die Bedürfnisse eines einzelnen Patienten angepasst und leicht auf industriellen Maßstab transformierbar sein.

Daher sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Derivaten von Wildtyp- 4 AT 501 101 B1

Protein-Allergenen mit verringerter allergener Aktivität vor, welches durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist:

Vorsehen eines Wildtyp-Protein-Allergens mit einer allergenen Aktivität,

Spleißen des Wildtyp-Protein-Allergens in zwei Teile, wobei die beiden Teile keine oder eine verringerte allergene Aktivität aufweisen, und

Wiederverbinden der beiden Fragmente in umgekehrter Orientierung.

Das vorliegende Verfahren basiert auf der Tatsache, dass die Fragmentierung von Proteinen, die hauptsächlich diskontinuierliche/konformationelle IgE-Epitope enthalten, zu einer wesentlichen Verringerung der IgE-Bindungskapazität des Allergens führt. Fragmente bestimmter Allergene waren jedoch zu wenig immunogen, um eine schützende Antikörper-Antwort zu induzieren (Westritschnig et al., (2004)).

Mit dem vorliegenden Verfahren werden neue und bestimmte Protein-Allergen-Derivate vorgesehen, welche die Vorteile der Ansätze auf Basis der T-Zellen- und B-Zellen-Epitope vereinigen. Gleichzeitig sind die Nachteile einer Impfung nur mit Fragmenten oder mit ausgeklügelten („sophisticated“) Anordnungen von Fragmenten (wie IgE-bindende Haptene und das Mischen („shuffling“) mit drei oder mehr Fragmenten) bei den Allergen-Derivaten der vorliegenden Erfindung nicht vorhanden.

Tatsächlich konnte mit der vorliegenden Erfindung gezeigt werden, dass die besten Ergebnisse mit jener Struktur erhalten werden können, die - hinsichtlich der Vollständigkeit der Strukturelemente - dem Wildtyp-Allergen am ähnlichsten ist (d.h., mit allen Aminosäuren des Wildtyp-Allergens), jedoch ohne dessen allergener Aktivität (oder mit einer genügend reduzierten allergenen Aktivität). Natürlich sind, wenn im Laufe der Erzeugung der Allergen-Derivate nur ein paar Aminosäure-Reste verloren (deletiert) oder hinzugefügt (insertiert) werden, oder wenn die Teile durch einen Linker verbunden werden anstatt einer direkten Kombination, die Vorteile gemäß der vorliegenden Erfindung noch immer vorhanden. Diese Reduktion oder Ausschaltung der allergenen Aktivität wird mit dem bekannten und allgemeinen Prinzip der Teilung des Allergens in definierte Fragmente erreicht. Zusätzlich zu diesem allgemeinen Prinzip verbindet die vorliegende Erfindung die beiden erhaltenen Teile des Allergens wiederum, in umgekehrter Orientierung, was zu Allergen-Derivaten führt, die im Wesentlichen die gesamte relevante Struktur-Information des Allergens enthalten (weil die Aminosäure-Sequenz vollständig oder beinahe vollständig in den Allergen-Derivaten gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten ist), jedoch im Vergleich zum Wildtyp-Allergen mit nur geringer (oder keiner) verbleibenden allergenen Aktivität.

Diese „Kopf-an-Schwanz“-Derivate gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglichen eine geeignete, individuelle und effiziente Immuntherapie für Allergie-Patienten, die mit Routine-Schritten leicht auf größeren Maßstab umsetzbar ist. Die Derivate gemäß der vorliegenden Erfindung induzieren schützende IgG-Antikörper, die die Bindung von IgE des Patienten an Wildtyp-Allergene blockieren und eine Allergen-induzierte Basophilen-Degranulation inhibieren kann.

Das vorliegende Verfahren ist besonders für rekombinante DNA-Technologie geeignet. Sobald das Derivat durch Genmanipulation erzeugt ist, kann es leicht in großen Mengen durch trans-gene Expression in geeigneten Wirten in industriellem Maßstab erhalten werden. Die Allergen-Derivate gemäß der vorliegenden Erfindung können vorzugsweise in einem Wirt mit großer Expressionskapazität erzeugt werden.

Zu den bevorzugten, durch die vorliegende Erfindung zu modifizierenden Allergenen zählen alle wesentlichen Protein-Allergene, die z.B. unter www.allergen.org/List.htm verfügbar sind. Zu den speziell bevorzugten Gruppen von Allergenen gemäß der vorliegenden Erfindung zählen Profiline, insbesondere Phi p 12, Birken-Allergene, insbesondere Bet v 4, Staubmilben-Allergene, insbesondere Der p 2, Vorratsmilben-Allergene, insbesondere Lep d 2, Wiesenlieschgras- 5 AT 501 101 B1

Allergene, insbesondere Phi p 7, und die in Tabelle A aufgezählten Allergene.

Tabelle A: bevorzugte, durch Mischen („shuffling“) gemäß der vorliegenden Erfindung zu modifizierende Allergene (einschließlich Bezugs-Beispiele)

Allergene

Spezies-Name

Allergen-Name Biochern.ID od MW* cDNA od. Referenz, obsoleter Name Protein Hinterlegungs-Nr. Ambrosia artemisiifolia Beifußblättrige Ambrosie („short ragweed“) Amb a 1 Antigen E 38 C 8, 20 Amb a 2 Antigen K 38 C 8, 21 Amb a 3 Ra3 11 C 22 Amb a 5 Ra5 5 C 11, 23 Amb a 6 Ra6 10 C 24, 25 Amb a 7 Ra7 12 P 26 Ambrosia trifida Dreilappige Ambrosie („giant ragweed“) Ambt5 Ra5G 4.4 C 9,10, 27 Artemisia vulgaris Beifuß („mugwort“) Art v 1 27-29 C 28 Art v 2 35 P 28A Art v 3 Lipid-T ransfer-Protein 12 P 53 Art v4 Profilin 14 C 29 Helianthus annuus Sonnenblume Heia 1 34 29A Heia 2 Profilin 15,7 C Y15210 Mercurialis annua Mera 1 Profilin 14-15 C Y13271 Caryophyllales Chenopodium album Weißer Gänsefuß („lamb's- -quarters“„,pigweed“), Che a 1 17 C AY049012, 29B Weißer Gänsefuß („white goosefoot“) Che a 2 Profilin 14 C AY082337 Che a 3 Polcalcin 10 C AY082338 Salsola kali Kali-Salzkraut („Russian-thistle“) Salk 1 43 P 29C

Rosales

Humulus japonicus

Japanischer Hopfen („Japanese hop“) 6 AT 501 101 B1

Spezies-Name Allergen-Name Biochem.lDod obsoleter Name

Hum j 4w Parietaria judaica Par j 1 Lipid-Transfer-Protein 1 Parj 2 Lipid-Transfer-Protein 2 Parj 3 Profilin Parietaria officinalis Paro 1 Lipid-T ransfer-Protein

MW* cDNA od. Referenz, Protein Hinterlegungs-Nr. C AY335187 15 C vgl. Liste der Isoallergene C vgl. Liste der Isoallergene C vgl. Liste der Isoallergene 15 29D B. Gräser Poales

Cynodon dactylon Bermudagrass („Bermuda grass“) 32 C 30, S83343 C 31, X91256 14 C 31a, Y08390 9 C AF517686 Daten anhängig 9 C AF517685 21 P anhängig 32 P 32 11 C 33, S45354 C 33A, U25343 31 P 34 60 “ C Z27084 27 C 35, 36 11 P 37, 37A, X73363 11 P 38 31/35 C 34, 39 16 39A C 40, S80654

Cyn d 1 Cyn d 7

Cyn d 12 Profilin

Cyn d 15

Cyn d 22w Enolase

Cyn d 23 Cyn d 14

Cyn d 24 Pathogenese-verwandt. P. Dactylis glomerata Knäuelgras („orchard grass“)

Dacgl AgDgl

Dac g 2 Dac g 3 Dac g 5

Festuca pratensis

Wiesenschwingel („meadow fescue“)

Fes p 4w Holcus lanatus

Wolliges Honiggras („velvet grass,,)

Hol 11 Lolium perenne

Ausdauerndes Weidelgras („rye grass“)

Lol p 1 Gruppe I Lol p 2 Gruppell Lol p 3 Gruppe III Lol p 5 Lol p IX, Lol p Ib Lol p 11 hom: Trypsin-Inhibitor Phalaris aquatica Wasserglanzgras („canary grass“)

Pha a 1 Phleum pratense 7 AT 501 101 B1

Spezies-Name

Allergen-Name Biochem.lDod MW* cDNA od. Referenz, obsoleter Name Protein Hinterlegungs-Nr. Wiesenlieschgras („timothy“) Phi p 1 27 C X78813 Phi p2 C X75925, 41 Phi p 4 P 41A Phi p 5 Ag25 32 C 42 Phi p6 C Z27082, 43 Phi p 11 Trypsin-lnhibitor-hom. 20 C AF521563, 43A Phi p 12 Profilin C X77583, 44 Phi p 13 Polygalacturonase 55-60 C AJ238848 Poa pratensis Wiesen-Rispengras („Kentucky blue grass“) Poa p 1 Gruppe I 33 P 46 Poa p 5 31/34 C 34, 47 Sorghum halepense Aleppohirse („Johnson grass“) Sor h 1 C 48 C. Bäume Arecales Phoenix dactylifera Dattelpalme Pho d 2 Profilin 14.3 C Asturias p.c. Fagales Ainus glutinosa Erle Alng 1 17 C S50892 Betula verrucosa Birke Bet v 1 17 C vgl. Liste der Isoal Bet v 2 Profilin 15 C lergene M65179 Bet v 3 C X79267 Bet v4 8 C X87153, S54819 Bet v 6 h: Isoflavon-Reduktase 33.5 C vgl Liste der Isoaller Bet v 7 Cyclophilin 18 P gene P81531 Carpinus betulus Hainbuche („hornbeam,,) Car b 1 17 C vgl. Liste der Isoal Castanea sativa Ess-Kastanie („chestnut“) Cas s 1 22 P lergene 52 Cas s 5 Chitinase Cass8 Lipid-Transfer-Protein 9.7 P 53 Corylus avellana Hasel Cor a 1 17 C vgl. Liste der Isoal Cor a 2 Profilin 14 C lergene 8 AT 501 101 B1

Spezies-Name

Allergen-Name Biochern.ID od MW* cDNA od. Referenz, obsoleter Name Protein Hinterlegungs-Nr.

Cor a 8 Lipid-Transfer-Protein 9 C Cor a 9 11S Globulin-art. Protein 40/? C Beyer p.c. Cora 10 Luminal-bindend. Prot. 70 C AJ295617 Cor a 11 7S Vicilin-art. Prot. 48 C AF441864 Quercus alba Weißeiche („white oak“) Que a 1 17 P 54 Lamiales Oleaceae Fraxinus excelsior Esche Fra e 1 20 P 58A, AF526295 Ligustrum vulgare Liguster („privet“) Lig v 1 20 P 58A Olea europea Olive Oie e 1 16 C 59,60 Oie e 2 Profilin 15-18 C 60A Oie e 3 9.2 60B Oie e 4 32 P P80741 Oie e 5 Superoxid-dismutase 16 P P80740 Oie e 6 10 C 60C, U86342 Oie e 7 ? P 60D, P81430 Oie e 8 Ca2+-bind. Protein 21 C 60E, AF078679 Oie e 9 beta-1,3-Glucanase 46 C AF249675 Oie e 10 Glycosyl-Hydrolase-hom. 11 C 60F, AY082335 Syringa vulgaris Flieder Syr v 1 20 P 58A Plantaginaceae Plantago lanceolata Spitzwegerich („English plantain“) Pia 11 18 P P842242 Pinales Cryptomeria japonica Sugi Cryj 1 41-45 C 55, 56 Cryj 2 C 57, D29772 Cupressus arizonica Zypresse Cup a 1 43 C A1243570 Cupressus sempervirens Gemeine Zypresse („common cypress“) Cup s 1 43 C vgl. Liste der Isoal Cup s 3w 34 C lergene Ref. anhängig Juniperus ashei Berg-Zeder („mountain cedar“) Jun a 1 43 P P81294 Jun a 2 c 57A, AJ404653 Jun a 3 30 P 57B, P81295

Juniperus oxycedrus 9 AT 501 101 B1

Spezies-Name

Allergen-Name Biochem.lD od MW* cDNA od. Referenz, obsoleter Name Protein Hinterlegungs-Nr. Stechwacholder („prickly juniper") Jun o 4 hom: Calmodulin 29 C 57C, AF031471 Juniperus sabinoides Bergzeder („mountain cedar“) Jun s 1 50 P 58 Juniperus virginiana Virginische Rotzeder („eastern red cedar“ Jun v 1 43 P P81825, 58B Platanaceae Platanus acerifolia Gewöhnliche Platane („London plane tree“) Pia a 1 18 P P82817 Pia a 2 43 P P82967 Pia a 3 Lipid-Transfer-Protein D. Milben 10 P Iris p.c. Acarus siro Arthropode Milbe Acas13 Fettsäure-bind. Prot. 14* C AJ006774 Blomia tropicalis Milbe Bio 11 Cystein-Protease 39 C AF277840 Blot 3 Trypsin 24* C Cheong p.c. Bio 14 alpha-Amylase 56 C Cheong p.c. Blot 5 C U59102 Bio 16 Chymotrypsin 25 C Cheong p.c. Blot 10 Tropomyosin 33 C 61 Bio 111 Paramyosin 110 C AF525465, 61A Blot 12 Bt11a C U27479 Bio 113 Bt6, Fettsäure-bind. Prot. C U58106 Bio 119 anti-mikrobiel. Pep. -hom. 7.2 C Cheong p.c. Dermatophagoides farinae Amerikanische Hausstaubmilbe („American house dust mite 0 Der f 1 Cystein-Protease 25 c 69 Derf 2 14 c 70, 70A, vgl. Liste der Isoallergene Derf3 Trypsin 30 c 63 Derf 7 24-31 c SW:Q26456, 71 Der f 10 Tropomyosin c 72 Der f 11 Paramyosin 98 c 72A Derf 14 mag3, Apolipophorin c D17686 Der f 15 98k Chitinase 98 c AF178772 Der f 16 Gelsolin/Villin 53 c 71A Derf 17 Ca-bind. EF-Protein 53 c 71A Der f 18w 60k Chitinase 60 c Weber p.c. Dermatophagoides microceras Hausstaubmilbe („house dust mite“) Der m 1 Cystein-Protease 25 P 68 Dermatophagoides pteronyssinus Europäische Hausstaubmilbe („European house dust mite“) Der p 1 Antigen P1, Cystein-Protease 25 c 62, vgl. Liste der

Isoallergene 10 AT 501 101 B1

Spezies-Name

Allergen-Name Biochern.ID < Dd MW* cDNA od. Referenz, obsoleter Name Protein Hinterlegungs-Nr. Der p 2 14 C 62A-C, vgl. Liste der Isoallergene Derp3 Trypsin 28/30 C 63 Der p 4 Amylase 60 P 64 Derp 5 14 C 65 Der p 6 Chymotrypsin 25 P 66 Derp 7 22/28 C 67 Der p 8 Glutathion-Transferase C 67A Der p 9 kollagenolytische Serin-pro. P 67B Derp 10 Tropomyosin 36 C Y14906 Derp 14 Apolipophorin-art. Prot. C Epton p.c. Euroglyphus maynei Milbe Eur m 2 C vgl. Liste der Isoallergene Eur m 14 Apolipophorin 177 C AF149827 Glycyphagus domesticus Vorratsmilbe („storage mite“) Gly d 2 C 72B, vgl. Isoallergen-Liste Lepidoglyphus destructor Vorratsmilbe („storage mite“) Lep d 2 Lep d 1 15 C 73, 74.74A, vgl. Isoallergen-Liste Lep d 5 C 75, AJ250278 Lep d 7 C 75, AJ271058 Lep d 10 Tropomyosin c 75A, AJ250096 Lep d 13 c 75, AJ250279 Tyrophagus putrescentiae Vorratsmilbe („storage mite“) Tyr p2 c 75B, Y12690 E. Tiere Bos domesticus Hausrind („domestic cattle“) Bos d 2 Ag3, Lipocalin 20 c 76, vgl. Isoallergen-Liste (vgl. auch Nahrungsmittel) Bos d 3 Ca-bind. S100-hom. 11 c L39834 Bos d 4 alpha-Lactalbumin 14.2 c M18780 Bos d 5 beta-Lactoglobulin 18.3 c X14712 Bos d 6 Serumalbumin 67 c M73993 Bos d 7 Immunglobulin 160 77 Bos d 8 Caseine 20-30 77 Canis familiaris (Canis domesticus) Can f 1 25 c 78, 79 Hund Can f 2 27 c 78, 79 Can f 3 Albumin c S72946 Can f 4 18 P A59491 Equus caballus 1 1 AT 501 101 B1

Spezies-Name

Allergen-Name Biochern.ID od MW* cDNA od. Referenz, obsoleter Name Protein Hinterlegungs-Nr. Hauspferd („domestic horse“) Equ c 1 Lipocalin 25 C U70823 Equ c 2 Lipocalin 18.5 P 79A, 79B Equ c 3 Ag3 - Albumin 67 C 79C, X74045 Equ c 4 17 P 79D Equ c 5 AgX 17 P Goubran Botros p.c. Felis domesticus Katze (Speichel) Fel d 1 cat-1 38 C 15 Fel d 2 Albumin c 79E, X84842 Fel d 3 Cystatin 11 c 79F, AF238996 Fel d 4 Lipocalin 22 c AY497902 Fel d 5w Immunglobulin A 400 Adedoyin p.c. Fel d 6w Imunglobulin M 800- 1000 Adedoyin p.c. Fel d 7w Immunglobulin G 150 Adedoyin p.c. Cavia porcellus Meerschweinchen Cav p 1 Lipocalin-Homolog 20 P SW:P83507, 80 Cav p 2 17 P SW:P83508 Mus musculus Maus (Harn) Mus m 1 MUP 19 c 81, 81A Rattus norvegius Ratte (Harn) Rat n 1 17 c 82, 83 F. Fungi (Schimmelpilze) 1. Ascomycota 1.1 Dothideales Alternaria alternata Alt a 1 28 c U82633 Alt a 2 25 c 83 A, U62442 Alt a 3 Hitzeschock-Prot. 70 c U87807, U87808 Alt a 4 prot. Disulfid-Isomerase 57 c X84217 Alt a 6 saures ribosomal. Prot. P2 11 c X78222, U87806 Alt a 7 YCP4 Protein 22 c X78225 Alt a 10 Aldehyd-Dehydrogenase 53 c X78227, P42041 Alt a 11 Enolase 45 c U82437 Alt a 12 saures ribosomal. Prot. P1 11 c X84216 Cladosporium herbarum Cla h 1 13 83B, 83C Cla h 2 23 83B, 83C Cla h 3 Aldehyd-Dehydrogenase 53 c X78228 Cla h 4 saures ribosomal. Prot. P2 11 c X78223 Cla h 5 YCP4 Protein 22 c X78224 Cla h 6 Enolase 46 c X78226 Cla h 12 saures ribosomal. Prot. P1 11 c X85180 1.2 Eurotiales Aspergillus flavus Asp fl 13 alkalische Serinprotease 34 84 1 2 AT 501 101 B1

Spezies-Name

Allergen-Name Biochern.ID od MW* cDNA od. Referenz, obsoleter Name Protein Hinterlegungs-Nr. Aspergillus fumigatus Aspf 1 18 C M83781, S39330 Aspf 2 37 C U56938 Asp f 3 peroxisomales Protein 19 C U20722 Aspf 4 30 C AJ001732 Asp f 5 Metallprotease 40 C Z30424 Aspf 6 Mn-Superoxid-dismut. 26.5 C U53561 Aspf 7 12 C AJ223315 Asp f 8 ribosomal. Prot. P2 11 C AJ224333 Asp f 9 34 C AJ223327 Asp f 10 Asparagin-Protease 34 C X85092 Asp f 11 Peptidyl-Prolyl-Isomerase 24 84A Asp f 12 Hitzeschock-Prot. P90 90 C 85 Asp f 13 alkalische Serin-Protease 34 84B Asp f 15 16 C AJ002026 Aspf 16 43 C g3643813 Asp f 17 C AJ224865 Asp f 18 vakuoläre Serin-Protease 34 84C Asp f 22w Enolase 46 C AF284645 Asp f 23 L3 ribosomal. Protein 44 C 85A, AF464911 Aspergillus niger Asp n 14 beta-Xylosidase 105 C AF108944 Asp n 18 vakuoläre Serin-Protease 34 C 84B Asp n 25 3-Phytase B 66-100 C 85B, P34754 Asp n ? 85 C Z84377 Aspergillus oryzae Asp o 13 alkalische Serin-Protease 34 C X17561 Asp o 21 TAKA-Amylase A 53 C D00434, M33218 Penicillium brevicompactum Pen b 13 alkalische Serin-Protease 33 86A Penicillium chrysogenum (vormals P. notatum) Pen ch 13 alkalische Serin-Protease 34 87 Pen ch 18 vakuoläre Serin-Protease Pen ch 20 N-Acetyl-glucosaminidase 68 32 87 87A Penicillium citrinum Pen c 3 peroxisomal. Mem.-Prot. 18 86B Pen c 13 alkalische Serin-Protease 33 86A Pen c 19 Hitzeschock-Prot. P70 70 C U64207 Pen c 22w Enolase 46 C AF254643 Pen c 24 Elongations-Faktor 1 beta C AY363911 Penicillium oxalicum Pen o 18 vakuoläre Serin-Protease 34 87B 1.3 Hypocreales Fusarium culmorum Fus c 1 ribosomales Prot. P2 11* C AY077706 Fus c 2 Thioredoxin-art. Prot. 13* c AY077707 1.4 Onygenales 1 3 AT 501 101 B1

Spezies-Name

Allergen-Name Biochern.ID od MW* cDNA od. obsoleter Name Protein

Referenz, Hinterlegungs-Nr.

Trichophyton rubrum Tri r 2 Tri r 4 Serin-Protease Trichophyton tonsurans Tri 11 Tri 14 Serin-Protease 1.5 Saccharomycetales Candida albicans Cand a 1 Cand a 3 peroxisomales Protein Candida boidinii Cand b 2

C C

30 P 83 C 88 88 88A 88

40 C 29 C 20 C 89 AY136739 J04984.J04985 2. Basidiomycotina 2.1 Hymenomycetes Psilocybe cubensis

Psi c 1

Psic2 Cyclophilin 16

Coprinus comatus Schopftintling („shaggy cap“)

Cop c 1 Leucin-Zipper-Protein 11 C

Cop c 2

Cop c 3

Cop c 5

Cop c 7

89A AJ132235 AJ242791 AJ242792 AJ242793 AJ242794 2.2 Urediniomycetes Rhodotorula mucilaginosa Rho m 1 Enolase 47 C Rho m 2 vakuoläre Serin-Protease 31 C 2.3 Ustilaginomycetes Malassezia furfur Mala f 2 MF1, peroxisomales 21 C Membran-Protein Mala f 3 MF2, peroxisomales 20 C Membran-Protein Mala f 4 Mitochondrien-Malat- Dehydrogenase 35 C Malassezia sympodialis Mala s 1 C Mala s 5 18* C Mala s 6 17* C Mala s 7 C Mala s 8 19* C Mala s 9 37* C Mala s 10 Hitzeschock-Prot. 70 86 C Mala s 11 Mn-Superoxid-Dismut. 23 C 3. Deuteromycotina

89B AY547285 AB011804, 90 AB011805,90

AF084828, 90A X96486, 91 AJ011955 AJ011956 AJ011957, 91A AJ011958, 91A AJ011959, 91A AJ428052 AJ548421 1 4

Spezies-Name Allergen-Name AT 501 101 B1

Biochern.ID od MW* cDNA od. Referenz, obsoleter Name Protein Hinterlegungs-Nr. 3.1 Tuberculariales Epicoccum purpurascens (vormals E. nigrum)

Epi p 1 Serin-Protease 30 P SW:P83340,91B G. Insekten Aedes aegyptii Stechmücke Aed a 1 Apyrase 68 C L12389 Aed a 2 37 C M33157 Apis mellifera Honigbiene Api m 1 Phospholipase A2 16 C 92 Api m 2 Hyaluronidase 44 C 93 Api m 4 Melittin 3 C 94 Api m 6 7-8 P Kettner p.c. Api m 7 CUB Serin-Protease 39 C AY127579 Bombus pennsylvanicus Hummel („bumble bee“) Born p 1 Phospholipase 16 P 95 Born p 4 Protease P 95 Blattelia germanica Deutsche Schabe Bla g 1 Bd90k C Bla g 2 Asparagin-Protease 36 C 96 Bla g 4 Calycin 21 C 97 Bla g 5 Glutathion-Transferase 22 C 98 Blag 6 Troponin C 27 C 98 Periplaneta americana Amerikanische Schabe Per a 1 Cr-PII C Per a 3 Cr-Pl 72-78 C 98A Per a 7 Tropomyosin 37 C Y14854 Chironomus kiiensis Mücke Chi k 10 Tropomyosin 32.5* C AJ012184 Chironomus thummi thummi Mücke Chi 11-9 Hämoglobin 16 c 99 Chi 11.01 Komponente III 16 c P02229 Chi 11.02 Komponente IV 16 c P02230 Chi 12.0101 Komponente I 16 c P02221 Chi 12.0102 Komponente IA 16 c P02221 Chi 13 Komponente ll-beta 16 c P02222 Chi 14 Komponente IIIA 16 c P02231 Chi 15 Komponente VI 16 c P02224 Chi 16.01 Komponente VIIA 16 c P02226 Chi 16.02 Komponente IX 16 c P02223 Chi 17 Komponente VIIB 16 c P02225 Chi 18 Komponente VIII 16 c P02227 Chi 19 Komponente X 16 c P02228

Ctenocephalides felis felis 15 AT 501 101 B1

Spezies-Name

Allergen-Name Biochern.ID od MW* cDNA od. Referenz, obsoleter Name Protein Hinterlegungs-Nr. Katzenfloh Ctef 1 Ctef 2 M1b 27 C AF231352 Ctef 3 25 C Thaumetopoea pityocampa Pinienprozessionsspinner („pine processionary moth“) Tha p 1 15 P PIR:A59396, 99A Lepisma saccharina Silberfischchen Lep s 1 Tropomyosin 36 C AJ309202 Dolichovespula maculata Langkopfwespe („white face hörnet“) Dol m 1 Phospholipase A1 35 C 100 Dol m 2 Hyaluronidase 44 C 101 Dol m 5 Antigen 5 23 C 102,103 Dolichovespula arenaria Gelbwespe („yellow hörnet“) Dol a 5 Antigen 5 23 C 104 Polistes annularies Wespe („wasp“) Pol a 1 Phospholipase A1 35 P 105 Pol a 2 Hyaluronidase 44 P 105 Pol a 5 Antigen 5 23 c 104 Polistes dominulus Mittelmeer-Papierwespe („Mediterranean paper wasp“) Pol d 1 Hoffman p.c. Pol d 4 Serin-Protease 32-34 c Hoffman p.c. Pol d 5 P81656 Polistes exclamans Wespe („wasp“) Pol e 1 Phospholipase A1 34 P 107 Pol e 5 Antigen 5 23 c 104 Polistes fuscatus Wespe („wasp“) Pol f 5 Antigen 5 23 c 106 Polistes gallicus Wespe („wasp“) Pol g 5 Antigen 5 24 c P83377 Polistes metricus Wespe („wasp“) Pol m 5 Antigen 5 23 c 106 Vespa crabo Europäische Hornisse („European hörnet“) Vesp c 1 Phospholipase 34 P 107 Vesp c 5 Antigen 5 23 c 106 Vespa mandarina Asiatische Riesenhornisse („giant asian hörnet“) Vesp m 1 Hoffman p.c. Vesp m 5 P81657

Vespula flavopilosa 1 6 AT 501 101 B1

Spezies-Name Allergen-Name Biochern.ID od MW* cDNA od. Referenz, obsoleter Name Protein Hinterlegungs-Nr. Wespe („yellowjacket”)Ves f 5 Antigen 5 23 C 106 Vespula germanica Wespe („yellowjacket”) Ves g 5 Antigen 5 23 C 106 Vespula maculifrons Wespe („yellowjacket“) Ves m 1 Phospholipase A1 33.5 C 108 Ves m 2 Hyaluronidase 44 P 109 Ves m 5 Antigen 5 23 C 104 Vespula pennsylvanica Wespe („yellowjacket“) Ves p 5 Antigen 5 23 C 106 Vespula squamosa Wespe („yellowjacket“) Ves s 5 Antigen 5 23 C 106 Vespula vidua Wespe („wasp“) Ves vi 5 Antigen 5 23 C 106 Vespula vulgaris Wespe („yellowjacket“) Ves v 1 Phospholipase A1 35 C 105A Ves v 2 Hyaluronidase 44 P 105A Ves v 5 Antigen 5 23 C 104 Myrmecia pilosula Australische „jumper ant“ Myr p 1 C X70256 Myr p 2 C S81785 Solenopsis geminata tropische Feuerameise („tropical fire ant“) Sol g 2 Sol g 4 Solenopsis invicta Feuerameise („fire ant“) Sol i 2 13 C Hoffinan p.c. Hoffman p.c. 110, 111 Soli 3 24 C 110 Sol i 4 13 C 110 Solenopsis saevissima Brasilianische Feuerameise („Brazilian fire ant“) Sols 2 Triatoma protracta Raubwanze („California kissing bug“) Triapl Procalin 20 C Hoffman p.c. AF179004, 111A. H. Nahrungsmittel Gadus callarias Dorsch („cod“) Gad c 1 Allergen M Salmo salar Atlantischer Lachs 12 C 112, 113 Sal s 1 Parvalbumin Bos domesticus Hausrind („domestic cattle“) 12 C X97824 1 7 AT 501 101 B1

Spezies-Name

Allergen-Name Biochern.ID od MW* cDNA od. Referenz, obsoleter Name Protein Hinterlegungs-Nr. Bos d 4 alpha-Lactalbumin 14.2 C M18780 (Milch) Bos d 5 beta-Lactoglobulin vgl. auch Tiere 18.3 C X14712 Bos d 6 Serum-Albumin 67 C M73993 Bos d 7 Immunglobulin 160 77 Bos d 8 Caseine Gallus domesticus 20-30 77 Huhn Gal d 1 Ovomucoid 28 C 114, 115 Gal d 2 Ovalbumin 44 C 114, 115 Gal d 3 Ag22, Conalbumin 78 C 114, 115 Gal d 4 Lysozym 14 C 114, 115 Gal d 5 Serum-Albumin Metapenaeus ensis 69 C X60688 Garnele Met e 1 Tropomyosin Penaeus aztecus C U08008 Garnele Pen a 1 Tropomyosin Penaeus indicus 36 P 116 Garnele Pen i 1 Tropomyosin Penaeus monodon Black Tiger-Garnele 34 C 116A Pen m 1 Tropomyosin 38 C Pen m 2 Arginin-Kinase Todarodes pacificus 40 C AF479772, 117 Kalmar („squid“) Tod p 1 Tropomyosin Helix aspersa Braune Gartenschnecke („brown garden snail“) 38 P 117A Hel as 1 Tropomyosin Haliotis midae Seeohr („abalone“) 36 C Y14855, 117B Hai m 1 Rana esculenta essbarer Frosch 49 117C Ran e 1 Parvalbumin-alpha 11.9* C AJ315959 Ran e 2 Parvalbumin-beta Brassica juncea Sareptasenf („oriental mustard“) 11.7* C AJ414730 Bra j 1 2S Albumin Brassica napus Rapssamen („rapeseed“) 14 C 118 Bra n 1 2S Albumin Brassica rapa Rübe („tumip“) 15 P 118A, P80208 Bra r 2 hom: Prohevein Hordeum vulgare 25 P81729 Gerste Hör v 15 BMAI-1 Hör v 16 alpha-Amylase Hör v 17 beta-Amylase 15 C 119 Hör v 21 gamma-3 Hordein SW:P80198 Secale cereale 34 C 119A, 1 8 AT 501 101 B1

Spezies-Name

Allergen-Name Biochern.ID od MW* cDNA od. Referenz, obsoleter Name Protein Hinterlegungs-Nr. Roggen Sec c 20 Secalin Triticum aestivum Weizen Tri a 18 Agglutinin Tri a 19 omega-5-Gliadin 65 P vgl. Isoall.-Liste PIR:A59156 Zea mays Mais, („maize, com“) Zea m 14 Lipid-Transfer-Prot. 9 P P19656 Oryza sativa Reis Ory s 1 C 119B, U31771 Apium graveolens Sellerie Api g 1 hom: Bet v 1 16* C Z48967 Api g 4 Profilin Api g 5 55/58 P AF129423 P81943 Daucus carota Karotte Dau c 1 hom: Bet v 1 16 C 117D, vgl. Isoaller- Dau c 4 Profilin C gen-Liste AF456482 Corylus avellana Haselnuss Cora1.04 hom: Bet v1 17 C vgl. Liste der Isoal Cor a 2 Profilin 14 C lergene AF327622 Cora8 Lipid-Transfer-Protein 9 C AF329829 Malus domestica Apfel Mal d 1 hom: Bet v 1 C vgl. Liste der Isoal Mal d 2 hom: Thaumatin C lergene AJ243427 Mal d 3 Lipid-Transfer-Protein 9 C Pastorello p.c. Mal d 4 Profilin 14.4* c vgl. Liste der Isoal Pyrus communis Birne Pyr c 1 hom: Bet v 1 18 c lergene AF05730 Pyr c 4 Profilin 14 c AF129424 Pyr c 5 hom: Isoflavon-Reduktase 33.5 c AF071477 Persea americana Avocado Pers a 1 Endochitinase 32 c Z78202 Prunus armeniaca Aprikose Pru ar 1 hom: Bet v 1 c U93165 Pruar3 Lipid-Transfer-Protein 9 P Prunus avium Süßkirsche Pru av 1 hom: Bet v 1 c U66076 Pru av 2 hom: Thaumatin c U32440 Pruav3 Lipid-Transfer-Protein 10 c AF221501 Pru av 4 Profilin 15 c AF129425 Prunus domestica Europäische Pflaume („European plum“) Pru d 3 Lipid-Transfer-Protein 9 P 119C Prunus persica Pfirsich Prup3 Lipid-Transfer-Protein 10 P P81402 1 9 AT 501 101 B1

Spezies-Name

Litchi chinensis Litchi Lit c 1 Profilin Sinapis alba gelber Senf („yellow mustard“) Sin a 1 2S albumin Glycine max Sojabohne Gly m 1 HPS Gly m 2 Gly m 3 Profilin Gly m 4 (SAM22) PR-10 Prot. Vigna radiata Mungbohne

Pru p 4 Profilin Asparagus officinalis Spargel

Aspa o 1 Lipid-Transfer-Protein Crocus sativus

Safran („saffron crocus“) Cro s 1 Lactuca sativa

Salat Lacsl Lipid-Transfer-Protein

Vitis vinifera

Traube Vit v 1 Lipid-Transfer-Protein Musa x paradisiaca Banane Mus xp 1 Profilin Ananas comosus Ananas („pineapple“)

Ana c 1 Profilin

Ana c 2 Bromelain

Citrus limon

Zitrone Cit I 3 Lipid-Transfer-Protein

Citrus sinensis

Orange („sweet orange“)

Cit s 1 Germin-artiges Protein

Cit s 2 Profilin

Cit s 3 Lipid-Transfer-Protein 14 C vgl. Isoallergen-Liste 9 P 119D 21 Varasteh A-R p.c. 9 Vieths p.c. 9 P P80274 15 C AF377948 15 C AF377949 22.8* C 119E-G, D14059 9 P Torrejon p.c. 23 P Torrejon p.c. 14 P Torrejon p.c. 9 P Torrejon p.c. 15 C AY049013 14 C 120 7 P 120A 8 P A57106 14 C vgl. Liste der Isoallergene 17 C X60043, 120B 15 C AY792956 63.5 C L34402 17 C L77197 60 C AF093541 37 C AF086821 15 C AF059616 15 C AF092846 15 C AF091737 17 c AY328088 47 c vgl. Liste der Isoallergene

Vig r 1 PR-10 Protein Arachis hypogaea Erdnuss Ara h 1 Vicilin Ara h2 Conglutin Ara h 3 Glycinin Ara h 4 Glycinin Ara h 5 Profilin Ara h 6 hom: Conglutin Ara h 7 hom: Conglutin Ara h 8 PR-10 Protein Lens culinaris Linse Len c 1 Vicilin 20 AT 501 101 B1

Spezies-Name Allergen-Name Biochern.ID od MW* cDNA od. obsoleter Name Protein Len c 2 Samen biotinyliert. Prot. 66 P Pisum savitum Erbse Pis s 1 Vicilin 44 C Pis s 2 Convicilin 63 C Actinidia chinensis Kiwi Act c 1 Cystein-Protease 30 P Act c 2 Thaumatin-art. Protein 24 p Capsicum annuum Paprika („bell pepper“) Cap a 1w Osmotin-artiges Protein 23 C Cap a 2 Profilin 14 C Lycopersicon esculentum Tomate Lycel Profilin 14 c Lyc e 2 b-Fructofuranosidase 50 c Lyc e 3 Lipid-Transfer-Prot. 6 c Solanum tuberosum Kartoffel Sola 11 Patatin 43 P Sola 12 Cathepsin-D-Inhibitor 21 1 p Sola 13 Cystein-Protease-Inhibitor 21 p Sola 14 Aparagin-Protease-Inhibitor 16+4 p Bertholletia excelsa r Paranuss („Brazil nut“) Ber e 1 2S Albumin 9 c Bere2 11S Globulin XJ Samen-Speicherprotein 29 c Juglans nigra Schwarznuss („black walnut“) Jug n 1 2S Albumin 19* c Jug n 2 Vicilin-art. Prot. 56* V·/ c Juglans regia Echte Walnuss („English walnut“) Jug r 1 2S Albumin n Jug r 2 Vicilin 44 V c Jug r 3 Lipid-Transfer-Protein 9 p Anacardium occidentale Γ Cashew-Nuss Ana o 1 Vicilin-artiges Protein 50 c Ana o 2 Legumin-artiges Protein 55 c Ana o 3 2S Albumin 14 p Ricinus communis Rizinussamen („Castor bean“) Ric c 1 2S albumin p Sesamum indicum Vs Sesam Ses i 1 2S Albumin 9 p Ses i 2 2S Albumin 7 Vs p Ses i 3 7S Vicilin-art. Globulin 45 Vs p Ses i 4 Oleosin 17 Vs p Ses i 5 Oleosin 15 Vs c AJ297410 AJ417552 AJ417553 vgl. Isoallergen-Liste U81996 P15476 P16348 P20347 P30941 P04403, M17146 AY221641 AY102930 AY102931 U66866 AF066055 Pastorello vgl. Isoallergen-Liste AF453947 AY081853

Referenz,

Hinterlegungs-Nr.

120C vgl. Liste der Isoallergene anhängig P00785 SW:P81370, 121 P01089 121A, AF240005 AF091841 AF240006 AAG23840 AAD42942 21 AT 501 101 B1

Spezies-Name

Allergen-Name Biochern.ID od MW* cDNA od. Referenz, obsoleter Name Protein Hinterlegungs-Nr. Cucumis melo Kantaloupmelone („muskmelon“) Cuc m 1 Serin-Protease 66 C D32206 Cuc m 2 Profilin 14 C AY271295 Cuc m 3 Pathogenese-verw. P. PR-1 16* P P83834 I. Andere Anisakis Simplex Nematode Ani s 1 24 P 121B, A59069 Ani s 2 Paramyosin 97 C AF173004 Anis 3 Tropomyosin 41 C 121C, Y19221 Ani s 4 9 P P83885 Argas reflexus Taubenzecke („pigeon tick“) Arg r 1 17 C AJ697694 Ascaris suum Wurm Asc s 1 10 P 122 Carica papaya Papaya Car p 3w Papain 23.4* C 122A, M15203 Dendronephthya nipponica Weichkoralle („soft coral“) Den n 1 53 P 122B Hevea brasiliensis Gummi (Latex) Hev b 1 Elongations-Faktor 58 P 123, 124 Hev b 2 1,3-Glucanase 34/36 C 125 Hev b 3 24 P 126, 127 Hev b 4 Komponente von Microhelix-Komplex 100- 115 P 128 Hev b 5 16 C U42640 Hev b 6.01 Hevein-Präkursor 20 c M36986, p02877 Hev b 6.02 Hevein 5 c M36986, p02877 Hev b 6.03 C-terminales Fragment 14 c M36986, p02877 Hev b 7.01 hom: Patatin aus B-Serum 42 c U80598 Hev b 7.02 hom: Patatin aus C-Serum 44 c AJ223038 Hev b 8 Profilin 14 c vgl. Liste der Isoallergene Hev b 9 Enolase 51 c AJ132580 Hev b 10 Mn-Superoxid-Dismut. 26 c vgl. Liste der Isoallergene Hev b 11 Klasse 1-Chitinase c vgl. Liste der Isoallergene Hev b 12 Lipid-Transfer-Protein 9.3 c AY057860 Hev b 13 Esterase 42 P P83269 Homo sapiens Human-Autoallergene Hom s 1 73* c Y14314 Hom s 2 10.3* c X80909 Hom s 3 20.1* c X89985 22 AT 501 101 B1 38.5

Spezies-Name Allergen-Name

Horn s 4 Horn s 5 Triplochiton scleroxylon Abachi („obeche“) Tripsl Klasse 1 *MW=Molekulargewicht

Biochem.lD od MW* obsoleter Name 36* 42.6* -Chitinase cDNA od. Referenz, Protein Hinterlegungs-Nr. C Y17711 C P02538 P Kespohl p.c.

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Mit vorliegendem Spleißen/Kopf-an-Schwanz-Modifizieren kann eine signifikante Verringerung der allergenen Aktivität erhalten werden. Je nach dem Verfahren kann diese Aktivität aus dem Wildtyp-Protein-Allergen großteils ausgelöscht werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Verringerung der allergenen Aktivität durch eine Verringerung der Inhibition der IgE-Bindungskapazität von mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 20%, insbesondere mindestens 30%, im Vergleich zum Wildtyp-Allergen gemessen. Ein 37 AT 501 101 B1 bevorzugtes Verfahren ist im Beispiel-Abschnitt unten gezeigt.

Bei einem alternativen, aber ebenfalls bevorzugten Weg zur Definition der Verringerung der allergenen Aktivität verwendet man die Messung der IgE-Bindung. Das Fehlen der Bindung von IgE-Antikörpern von mit Allergen sensibilisierten Patienten-Seren an einen „dot blot“ des Derivats wird als Beweis für eine sehr wesentliche Verringerung angesehen. Auch dieses Verfahren ist unten im Beispiel-Abschnitt gezeigt.

Die gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltenen Derivate können leicht mit einem pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten kombiniert und zu einem pharmazeutischen Präparat fertig gestellt werden.

Vorzugsweise werden die Derivate mit einem geeigneten Vakzin-Adjuvans kombiniert und zu einem pharmazeutisch akzeptablen Vakzin-Präparat fertig gestellt.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden die Derivate gemäß der vorliegenden Erfindung mit weiteren Allergenen zu einem Kombinations-Vakzin kombiniert. Solche Allergene sind vorzugsweise Wildtyp-Allergene, insbesondere eine Mischung von Wildtyp-Allergenen, rekombinanten Wildtyp-Allergenen, Derivaten von Wildtyp-Protein-Allergenen oder Mischungen davon. Solche Mischungen können speziell für die Bedürfnisse (Allergen-Profil) eines bestimmten Patienten hergestellt werden.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthält ein solches pharmazeutisches Präparat weiters einen Allergen-Extrakt.

Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Allergen-Derivat eines Wild-typ-Protein-Allergens vorgesehen, wobei das Wildtyp-Protein-Allergen eine Aminosäure-Sequenz von 1 bis Z aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass das Derivat nebeneinander - in N-Terminus zu C-Terminus-Orientierung - die beiden Wildtyp-Allergen-Fragmente X bis Z und 1 bis X enthält, wobei die beiden Wildtyp-Allergen-Fragmente eine reduzierte allergene Aktivität aufweisen oder ihnen die allergene Aktivität fehlt.

Vorzugsweise ist das Allergen-Derivat gemäß der vorliegenden Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass X bis Z und 1 bis X mindestens 30 Aminosäure-Reste lang, vorzugsweise mindestens 50 Aminosäure-Reste lang, insbesondere mindestens 60 Aminosäure-Reste lang sind.

Es ist sogar noch mehr bevorzugt, wenn X bis Z und 1 bis X sich längenmäßig um 50% oder weniger, vorzugsweise um 30% oder weniger, insbesondere um 20% oder weniger, voneinander unterscheiden.

Besonders bevorzugte Allergen-Derivate gemäß der vorliegenden Erfindung sind ausgewählt aus Typ I-Allergen, vorzugsweise aus einem Allergen der Tabelle A, mehr bevorzugt von Wiesenlieschgras (Phleum pratense)-Pollen, insbesondere Phi p 12, Birken (Betula verrucosa)-Pollen, insbesondere Bet v 2 und Bet v 4, Gift der gemeinen Wespe (Vespula vulgaris), Gift der Papierwespe („paper wasp“, Polistes annularis), Parietaria judaica-Pollen, Weidelgras-Pollen usw..

Vorzugsweise sind die Derivate gemäß der vorliegenden Erfindung als Allergen-Zusammensetzung vorgesehen, wobei nicht nur ein Allergen vorhanden ist, sondern zwei oder mehr. Die vorliegenden Derivate können auch mit Allergen-Extrakten gemischt sein, die durch die Derivate der vorliegenden Erfindung ergänzt sind, um das Fehlen genügender Mengen spezifischer Allergene in den natürlichen Extrakten zu substituieren. Mischungen von Allergenen sind besonders bei Patienten notwendig, die allergene Reaktionen auf nicht nur ein Allergen aufweisen. Es ist daher bevorzugt, die vorliegenden Derivate in Kombination mit weiteren (anderen) Allergenen zu einem Kombinations-Vakzin vorzusehen. 38 AT 501 101 B1

Die Allergen-Derivate gemäß der vorliegenden Erfindung können daher vorzugsweise mit Wild-typ-Allergen zu einer Allergen-Zusammensetzung kombiniert sein, insbesondere einer Mischung von Wildtyp-Allergenen, rekombinanten Wildtyp-Allergenen, Derivaten von Wildtyp-Protein-Allergenen oder Mischungen davon (jeweils vom gleichen und/oder einem anderen Allergen und/oder Isoformen oder Mutanten davon; solange eine Gesamt-Reduktion der aller-genen Aktivität im Vergleich zum Wildtyp-Protein oder rekombinanten Allergen im Präparat als Ganzes gegeben ist).

Vorzugsweise enthält das vorliegende Präparat weiters einen Allergen-Extrakt.

Das Allergen oder die Allergen-Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung enthält vorzugsweise einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten.

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Allergen-Derivats gemäß der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Allergen-spezifischen Immuntherapie-Medikaments.

Vorzugsweise enthält das Medikament weiters andere geeignete Ingredienzien, wie Adjuvantien, Verdünnungsmittel, Konservierungsmittel, usw..

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Medikament 10 ng bis 1 g, vorzugsweise 100 ng bis 10 mg, insbesondere 0,5 pg bis 200 pg, des rekombinanten Allergen-Derivats pro Applikationsdosis. Bevorzugte Wege der Verabreichung umfassen alle Standard-Verabreichungssysteme, die zur Impfung im Allgemeinen und für die Allergie-Immuntherapie im Besonderen beschrieben und vorgeschlagen wurden (oral, transdermal, intravenös, intranasal, über die Schleimhaut usw.). Die vorliegende Erfindung umfasst ein Verfahren zur Behandlung und Prävention von Allergie durch Verabreichen einer wirksamen Menge der pharmazeutischen Präparate gemäß der vorliegenden Erfindung.

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung eines Allergen-Derivats gemäß der vorliegenden Erfindung, welches durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist: - Vorsehen eines DNA-Moleküls, das für ein Allergen-Derivat gemäß der vorliegenden Erfindung codiert, - Transformieren einer Wirtszelle mit dem DNA-Molekül, und - Exprimieren des Derivats in der Wirtszelle und Isolieren des Derivats.

Vorzugsweise ist der Wirt ein Wirt mit einer großen Expressionskapazität.

Natürlich können die Allergen-Derivate gemäß der vorliegenden Erfindung auch mit irgendeinem anderen geeigneten Verfahren, insbesondere mittels chemischer Synthese oder halbchemischer Synthese, hergestellt werden.

Die vorliegende Erfindung ist weiters durch die folgenden Beispiele und die Zeichnungsfiguren beschrieben, ohne jedoch auf diese eingeschränkt zu sein.

Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung der primären Struktur von MP12 (einem umstrukturierten („reshuffled“) Phi p 12-Allergen gemäß der vorliegenden Erfindung) im Vergleich zu Phi p 12-Wildtyp;

Fig. 2 zeigt CD-Spektren von Phi p 12-Wildtyp und MP12. Die mittlere Rest-Elliptizität [Θ] (y-Achse) von Phi p 12 und dem Derivat MP12 ist für einen Bereich von Wellenlängen gezeigt (x-Achse);

Fig. 3 zeigt die Coomassie-Färbung von 14% SDS PAGE, beladen mit Fraktionen von rekombi-nantem MP12, das einer Polyprolin-Säule ausgesetzt war. Bahn M stellt den Molekularge- 39 AT 501 101 B1 wichtsmarker dar, Bahn 1 stellt die Durchfluss-Fraktion dar, die Bahnen 2-4 Wasch-Fraktionen, die Bahnen 5-6 Elutions-Fraktionen. Molekulargewichte (kDa) sind am linken Rand angegeben; Fig. 4 zeigt die IgE-Reaktivität von Nitrozellulose-aufgepunktetem („dotted“) Phi p 12 und MP12. Die aufgepunkteten Proteine sowie humanes Serumalbumin (HSA) für Zwecke der Negativkontrolle wurden Seren von 24 gegen Phi p 12 allergischen Patienten ausgesetzt (Bahnen 1-24). Bahn N stellt Serum von einem nicht-allergischen Kontroll-Probanden dar. Gebundene IgE-Antikörper wurden mit anti-humanen IgE-Antikörpern detektiert;

Fig. 5 zeigt die Induktion einer Basophilen-Histamin-Freisetzung bei zwei Phi p 12-allergischen Patienten. Die Granulocyten der Patienten wurden mit verschiedenen Konzentrationen (x-Achse) von Phi p 12 (Quadrate) und MP12 (Kreise) inkubiert. Der Prozentsatz des gesamten Histamins, das in den llberstand freigesetzt wurde, ist auf der y-Achse gezeigt;

Fig. 6 zeigt die Reaktivität von Kaninchen-Antiseren mit Profilinen aus Wiesenlieschgras-, Birken- und Beifuß-Pollen. Kaninchen-Antiseren, die gegen Phi p 12 (Karos) und M12 (Quadrate) gezogen worden waren, wurden auf ihre Reaktivität gegen Phi p 12- (A), Bet v 2- (B) und Bei-fuß-Profilin (C) mittels ELISA getestet. Die Verdünnungen der Seren sind auf der x-Achse gezeigt, die entsprechenden OD-Werte auf der y-Achse. Die entsprechenden Präimmun-Seren zeigten keine Reaktivität;

Fig. 7 zeigt die Inhibition von rPhl p 12-induzierter Basophilen-Degranulation durch mit anti-rPhl p 12 (P12) und anti-MP12 induziertes IgG. Ratten-Basophile waren mit Phi p 12-spezifischem Maus-lgE beladen worden;

Fig. 8 zeigt eine schematische Darstellung der primären Struktur und Erzeugung von Der p 2-Hybride (ein umstrukturiertes Der p 2-Allergen gemäß der vorliegenden Erfindung) im Vergleich mit Der p 2-Wildtyp;

Fig. 9 zeigt, dass rDer p 2-Hybriden eine reduzierte IgE-Bindungskapazität im Vergleich zu rDer p 2-Wildtyp in einem Dot-Blot-Test haben.

Beispiele

In den Beispielen 1 bis 5 sind die Prinzipien der vorliegenden Erfindung durch ein Profilin-Allergen, das Wiesenlieschgras-Pollen-Profilin Phi p 12, beispielhaft gezeigt. Die Beispiele 6 bis 8 beziehen sich auf das Haupt-Milben(Dermatophagoides pteronyssinus)-Allergen, Der p 2.

Beispiel 1: Charakterisierung eines hypoallergenen Derivats aus Wiesenlieschgras-Pollen-Profilin a) Erzeugung, Expression und Reinigung einer hypoallergenen Variante aus Wiesenlieschgras-Pollen-Profilin, Phi p 12

Die Überlappungs-PCR-Technik wurde zur Herstellung eines umstrukturierten Phi p 12-Derivats verwendet. Die PCR-Matrize war die cDNA- die für das Wiesenlieschgras-Pollen-Profilin, Phi p 12, codiert, subkloniert in pet17b-Expressionsvektor. Die folgenden Primer wurden verwendet, um zwei PCR-Fragmente zu erzeugen, die überlappende Sequenzen sowie die Ndel- und EcoRI-Restriktions-Stellen und eine für einen C-terminalen 6x Histidin-Rest für Protein-Reinigung enthielten. Für das Fragment 1 wurden der Primer MDE-1: 5'CATATG-AGGCCCGGCGCGGTCATC3' und der Primer MDE-2: 5 ’GTACGTCTGCCACGCCAT-CATGCCTTGTTCAAC3’ verwendet, für das Fragment 2 wurden der Primer MABC-1: 5'GTTGAACAAGGCAT-GATGTCGTG-GCAGACG3' und der Primer MABC-2: 5’GAATT-CTT AAT GGT-GAT GGT GAT GGT GACCCT-GGAT GACCAT GTA3' verwendet. Im nächsten Schritt wurden beide wie beschrieben erhaltenen PCR-Produkte als Matrizen für die Überlap-pungs-PCR-Reaktion verwendet, wobei Primer MDE-1 und MABC-2 verwendet wurde, um die DNA zu erzeugen, die für das Phi p 12-Derivat (d.h., MP12) codierte (schematisch in Fig. 1 dargestellt). Die für MP-12 codierende DNA wurde in pBluescript-Vektor-System (Stratagene) kloniert, und die DNA-Sequenz wurde mittels Doppelstrang-Sequenzierung (MWG Biotech, Deutschland) bestätigt. 40 AT 501 101 B1

Zur Protein-Reinigung musste MP12-codierende cDNA in ein pet17b-Expressions-Vektor-System unter Verwendung von Ndel- und EcoRI-Restriktionsenzymen subkloniert werden, und die DNA-Sequenz wurde wiederum mittels Doppelstrang-Sequenzierung (MWG Biotech) bestätigt.

Zur Protein-Reinigung wurde MP-12 in Escherichia coli BL21 (DE3) (Stratagene, East Kew, Australien) in Flüssigkultur exprimiert. E.coli wurde zu einer OD6oo von 0,4 in LB-Medium, das 100 mg/l Ampicillin enthielt, gezüchtet. Die Expression rekombinanter Proteine wurde durch Zugeben von Isopropyl-b-thiogalactopyranosid bis zu einer Endkonzentration von 1 mM induziert und weiteres Züchten für zusätzliche 4 Stunden bei 37°C. E.coli-Zellen aus einer 500 ml-Kultur wurden durch Zentrifugieren geerntet, in Puffer A (100mM NaH2P04, 10mM Tris, 8M Harnstoff, pH 7,5) resuspendiert. Nach dem Zentrifugieren bei 20.000 U/min, 30 min, wurde der Überstand auf eine Ni-NTA-Agarose-Säule (Quiagen, Hilden, Deutschland) transferiert, und die Elution des 6x Histagged MP12-Proteins wurde unter Verwendung von Puffer A mit abnehmenden pH-Werten durchgeführt. Das Protein eluierte bei einem pH-Wert von 4,9 und wurde danach durch stufenweise Dialyse gegen Puffer A, pH 7,5, enthaltend 6-0 M Harnstoff, wieder gefaltet. Der endgültige Dialyse-Schritt erfolgte gegen mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), wo MP12 löslich war, wie durch Zentrifugier-Experimente gezeigt.

Die Protein-Reinheit wurde mittels SDS-PAGE bestätigt, und die Quantifizierung wurde unter Verwendung eines Micro BCA-Kit (Pierce, Rockford, IL) durchgeführt. b) Sekundär-Struktur-Analyse

Zirkular-Dichroismus(CD)-Messungen erfolgten auf einem Jasco J-715-Spektropolarimeter unter Verwendung einer Zelle mit einer Weglänge von 0,1 cm, äquilibriert bei 20°C. Die Spektren wurden mit 0,5 nm Auflösung bei einer Scan-Geschwindigkeit von 100 nm/min aufgezeichnet und ergaben sich aus dem Durchschnitt von 3 Scans. Die endgültigen Spektren wurden durch Subtrahieren der korrespondierenden MilliQ-Spektren, die unter identischen Bedingungen erhalten wurden, Basislinien-korrigiert. Die Ergebnisse wurden mit dem Sekundär-Struktur-Bewertungs-Programm J-700 angepasst.

Die Ergebnisse weisen auf eine beträchtliche Menge an Sekundärstruktur des Derivats hin. Das Spektrum von Phi p 12 ist mit einem Minimum bei 218nm und einem starken Maximum unter 200nm gekennzeichnet, wogegen das Minimum des Derivats zu einer kleineren Wellenlänge verschoben ist und die Null-Überquerung der Kurve unter 200nm ist (Fig. 2). Diese Ergebnisse weisen auf einen steigenden Anteil einer beliebig-gewundenen Sekundärstruktur innerhalb des Derivats hin. c) Dem hypoallergenen Derivat Phi p 12 fehlt die Affinität für Polyprolin

Die Affinität zu Polyprolin ist ein Merkmal, das Profilinen aus verschiedenen Organismen gemeinsam ist. Es wurde gezeigt, dass das hypoallergene Phi p 12-Derivat, MP12, Polyprolin nicht bindet und somit veränderte biochemische Eigenschaften aufweist.

Etwa 5 pg gereinigtes rekombinantes MP12 in PBS wurde einer mit Polyprolin beladenen, CnBr-aktivierten Agarose-Säule (Amersham Bioscience, Uppsala, Schweden), die mit PBS äquilibriert war, unterzogen. Nach dem Sammeln des Durchflusses wurde die Säule mit 3 Volumina (PBS) gewaschen, und die Elution wurde mit 5x 1 ml PBS, die 2 bzw. 6M Harnstoff enthielt, durchgeführt. Zehn μΙ Aliquots des Durchflusses, die Waschfraktionen und Elutionsfraktionen wurden einer 14% Natrium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS PAGE) unterzogen, und die Proteine wurden mit Coomassie-Färbung sichtbar gemacht (Fig. 3). Die Ergebnisse weisen auf einen Verlust der Polyprolin-Bindungsstelle infolge der Reorganisation der primären Struktur von Phi p 12 hin. 41 AT 501 101 B1

Beispiel 2: Verringerung der IgE-Bindungskapazität von MP12 a) MP12 zeigt eine stark verringerte IgE-Bindungskapazität

Die IgE-Bindungskapazität von rekombinantem MP12 wurde mit jener von rekombinantem Phi p 12-Wildtyp mittels Dot-Blot-Analyse unter Verwendung von Seren von 24 mit Profilin sensibilisierten Patienten verglichen (Fig. 4). Phi p 12 und MP12 sowie humanes Serumalbumin (HSA) für Kontrollzwecke wurden auf Nitrozellulose punktweise aufgetragen und mit Seren von 24 mit Profilin sensibilisierten Patienten untersucht. Gebundene IgE-Antikörper wurden unter Verwendung von mit 125l markierten anti-Human-lgE-Antikörpern nachgewiesen. Alle Patienten wiesen eine IgE-Reaktivität mit Phi p 12-wildtyp auf, wogegen keiner der 24 Patienten mit MP12 oder mit dem Kontroll-Protein HSA reagierte (Fig. 4).

Um die Verringerung der IgE-Bindungskapazität von MP12 zu quantifizieren, wurden Flüssig-phasen-lnhibitionen durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde Serum von sechs mit Profilin sensibilisierten Patienten mit je 10 pg von Phi p 12 und MP12 vorinkubiert und danach mit ELISA-Platten-gebundenem Phi p 12 (5 pg/ml) inkubiert. Gebundene IgE-Antikörper wurden mit einem mit alkalischer Phosphatase markiertem anti-Human-lgE-Antikörper (Pharmingen) detektiert. Die Inhibition der IgE-Bindung wurde mit der folgenden Formel berechnet: lnhibition%= 100x [(A-B)/Aj; wobei A OD-Werte darstellt, die nach der Inkubation von Serum mit BSA erhalten wurden, B OD-Werte nach Inkubation von Serum mit Phi p 12 bzw. MP12 darstellt.

Die Fähigkeit von MP12, die Bindung von IgE an Phi p 12 zu inhibieren, ist als Prozentsatz Inhibition in Tabelle 2 gezeigt, welcher im Bereich von 20-40% liegt, mit einer mittleren Inhibition von 31,2% für MP12, wogegen die mit Phi p 12 erreichte Inhibition im Bereich von 76-91% lag (Mittel: 86%).

Tabelle 2: Inhibition der Antikörper-Bindung an immobilisiertes Phi 12 unter Verwendung von Phi p 12 und MP12. Die IgE-Antikörper-Bindung wurde durch Vorinkubation von Seren von 6 mit Profilin sensibilisierten Patienten mit Phi p 12 Wildtyp oder MP12 inhibiert. Die mittlere Inhibition der Antikörperbindung wurde berechnet und ist dargestellt.

Protein name Aminosäuresequenz Anzahl der Aminosäuren berechneter Pi MW (kDa) strukturelle Integrität Phlp 12 MSWQTYVDEHLMCEIEGHHLASA- AILGHDGTVWAQSADFPQFKPEEIT- GIMKDFDEPGHLAPTGMFVAGAKYM VIQGEPGAVIRGKKGAGGITIKKTG- QALWGIYDEPMTPGQCNMWERLG- 131 4.92 14.1 + DYLVEQGM MP 12 MEPGAVIRGKKGAGGITIKKTGQALV- 137 5.68 15 + GIYDEPMTPGQCNMWERLGDYL- VEQGMMSWQTYVDEHLMCEIEGHH- LASAAILGHDGTVWAQSADFPQFK- PEEITGIMKDFDEPGHLAPTGMFVAGA- KYMVIQGHHHHHH b) MP12 weist eine verringerte allergene Aktivität auf

Danach wurde umstrukturiertes Phi p 12 mit Phi p 12-Wildtyp im Hinblick auf seine Fähigkeit, die Histamin-Freisetzung aus Basophilen von auf Profilin allergischen Patienten zu induzieren, verglichen. 42 AT 501 101 B1

Granulozyten wurden aus heparinisierten Blutproben von gegen Wiesenlieschgras-Pollen allergischen Patienten mittels Dextran-Sedimentation isoliert. Nach der Isolierung wurden die Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von Phi p 12, MP12 oder - für Kontrollzwecke - mit einem monoklonalen anti-Human-lgE-Antikörper (Immunotech, Marseille, Frankreich) inkubiert. Die Histamin-Freisetzung in den Überstand wurde mittels Radioimmunoassay (Immunotech) gemessen. Das Gesamt-Histamin wurde nach Gefrieren/Auftauen von Zellen bestimmt. Die Ergebnisse sind als Mittelwerte von Duplikat-Bestimmungen ausgedrückt und stellen den Prozentsatz des gesamten Histamins dar.

Wie in Fig. 5 beispielhaft angegeben, induzierte Phi p 12 stark und Dosis-abhängig die Histamin-Freisetzung in Basophilen von beiden Patienten, wobei sich eine maximale Histamin-Freisetzung bei Konzentrationen zwischen 10'5 - 10"4 pg/ml ergab, wogegen keine Histamin-Freisetzung bei MP12 bei Konzentrationen bis zu 10'2 pg/ml beobachtet wurde, was eine mehr als 1000-fache Verringerung der allergenen Aktivität anzeigt. Außerdem war die maximale Histamin-Freisetzung aus Basophilen nach der Zugabe von MP12 beträchtlich niedriger als jene, die mit Phi p 12-Wildtyp erreicht wurde.

Beispiel 3: Immunisierung mit MP12 induziert IgG-Antikörper, die Phi p 12-Wildtyp sowie Profiline von anderen Pollen erkennen

Um zu testen, ob die Immunisierung mit umstrukturiertem Phi p 12 IgG-Antikörper induziert, die mit Phi p 12-Wildtyp und mit Profilinen aus anderen Pollen reagieren, wurden Kaninchen dreimal mit Phi p 12 oder MP12 unter Verwendung von Freundschen kompletten und unvollständigen Adjuvantien (200 pg/lnjektion) (Charles River, Kisslegg, Deutschland) immunisiert. Serum-Proben wurden in vierwöchigen Intervallen erhalten. Die Seren wurden bei -20°C bis zur Analyse gelagert.

Die Reaktivität von mit MP12 und Phi p 12 induzierten IgG-Antikörpern wurde mittels ELISA untersucht (Fig. 6). Phi p 12 sowie Profiline aus Birke (Bet v 2) und Beifuß wurden auf ELISA-Platten beschichtet (5 pg/ml) und mit seriellen Verdünnungen von Kaninchen-Antiseren (1:2000-1:64000) inkubiert. Gebundene Kaninchen-Antikörper wurden mit einem 1:1000 verdünntem, Peroxidase-markiertem Esel-anti-Kaninchen-Antiserum (Amersham Pharmacia Bio-tech) detektiert. MP12 induzierte eine IgG anti-Phl p 12-Antikörper-Antwort, die mit jener, die mit Phi p 12-Wildtyp induziert war, vergleichbar war (Fig. 6A). Außerdem führten sowohl mit Phi p 12- als auch mit MP12-induzierte IgG-Antikörper zu einer Kreuzreaktion mit Profilinen aus Birke und Beifuß (Fig. 6B, C).

Beispiel 4: Anti-MP12-Antikörper inhibieren die Bindung von Serum-lgE von gegen Gras-Pollen allergischen Patienten an vollständigen Phi p 12

Die Fähigkeit von mit MP 12 induziertem Kaninchen-IgG, die Bindung des IgE allergischer Patienten an Phi p 12 zu inhibieren, wurde mittels ELISA-Konkurrenz-Test untersucht. ELISA-Platten (Nunc Maxisorp, Rosklide, Dänemark) wurden mit Phi p 12 (1 pg/ml) beschichtet und entweder mit einer 1:250 Verdünnung von jeweils dem anti-MP12-Antiserum oder dem Phi p 12-Antiserum vorinkubiert und - für Kontrollzwecke - mit dem korrespondierenden Präimmun-Seren. Nach dem Waschen wurden die Platten mit 1:3 verdünnten Seren von sieben mit Phi p 12 sensibilisierten, gegen Gras-Pollen allergischen Patienten inkubiert, und die gebundenen IgE-Antikörper wurden mit einem monoklonalen Ratten-anti-Human-lgE-Antikörper (Pharmin-gen, San Diego, CA) nachgewiesen, 1:1000 verdünnt, gefolgt von einem 1:2000 verdünnten HRP-gekoppelten Schaf-anti-Ratten-lg-Antiserum (Amersham). Der Prozentsatz der Inhibition der IgE-Bindung, der durch Vorinkubation mit den Anti-Peptid- oder Anti-Mutanten-Antiseren erreicht wurde, wurde wie folgt berechnet: 43 AT 501 101 B1 % Inhibition der IgE-Bindung = 100-OD|/ODPx100. OD| und ODP repräsentieren die Absorptionen nach Vorinkubation mit den Immunseren der Kaninchen bzw. den korrespondierenden Präimmunseren.

Wie in Tabelle 3 gezeigt, lag die Inhibition der Patienten-lgE-Bindung an Phi p 12, die mit anti-Phl p 12-Antikörpern erreicht wurde, zwischen 30,2-66,7% (49,8% mittlere Inhibition). Ebenso wurde eine beträchtliche Verringerung der anti-Phl p 12-lgE-Reaktivität beobachtet, die im Bereich von 10,8-27,6% (20,8% mittlere Inhibition) bei Antikörpern, die gegen MP12 gezogen worden waren, lag (Tabelle 3).

Tabelle 3: Inhibition der IgE-Bindung allergischer Patienten an rPhl p 12 durch Kaninchen-Antikörper. Der Prozentsatz der Inhibition der IgE-Bindung an rPhl p 12, der durch Vorinkubation mit Kaninchen-Antiseren (Kaninchen-anti-Phl p 12, anti-MP12) bei sieben gegen Phi p 12 allergischen Patienten erreicht wurde, und die errechnete mittlere Inhibition sind gezeigt.

Patient % Inhibition anti-Phl p12 anti-MP12 1 66,7 27,6 2 53,8 18,8 3 46,0 16,2 4 43,2 18,9 5 45,7 27,0 6 30,2 10,8 7 63,0 26,1 Mittel 49,8 20,8

Beispiel 5: Anti-MP12-Antiserum inhibiert die Basophilen-Degranulation

Die biologische Relevanz und mögliche Schutzwirkung der Peptid-induzierten IgG-Antikörper wurde in einem definierten Zell-Modell-System unter Verwendung von Ratten-Basophilen-Leukämie (RBL)-Zellen, die mit Allergen-spezifischem IgE beladen waren, untersucht RBL-2H3-Zellen wurden in Gewebe-Kulturplatten mit 96 Vertiefungen (4x104 Zellen/Vertiefung) ausplattiert, 24 h lang bei 37°C unter Verwendung von 7% C02 inkubiert. Die passive Sensibilisierung wurde 2 h lang mit Maus-Seren, die Profilin-reaktives IgE in einer endgültigen Verdünnung von 1:30 enthielten, vorgenommen. Ungebundene Antikörper wurden durch zweimaliges Waschen der Zellschicht in Tyrode-Puffer (137mM NaCI, 2,7mM KCl, 0,5 mM MgCI2, 1,8 mM CaCI2, 0,4 mM NaH2P04, 5,6 mM D-Glucose, 12 mM NaHC03, 10 mM HEPES und 0,1% Gew./Vol. BSA, pH 7,2) entfernt. RBL-Zellen, die mit Phi p 12-spezifischem Maus-lgE vorbeladen worden waren, wurden rPhl p 12 (0,005 pg/ml) ausgesetzt. Phi p 12 wurde in Tyrode-Puffer mit 0, 2, 5, 7,5 oder 10% V/V Kaninchen-Antiserum aus einem mit Phi p 12-immunisierten Kaninchen, einem mit MP12 immunisierten Kaninchen oder den entsprechenden Präimmun-Seren 2h lang bei 37°C vorinkubiert.

Vorinkubiertes Phi p 12 wurde zu den RBL-Zellen 30 min lang in einer befeuchteten Atmosphäre bei 37°C zugesetzt, und ihre Überstände wurden auf ß-Hexosaminidase-Aktivität durch ein-stündige Inkubation mit 80 μΜ 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-ß-D-glucosamid (Sigma-Aldrich, Wien, Österreich) in Citrat-Puffer (0,1 M, pH 4,5) bei 37°C analysiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 μΙ Glycin-Puffer (0,2 M Glycin, 0,2 M NaCI, pH 10,7) gestoppt, und die Fluoreszenz wurde bei λ«*: 360/Aem: 465 nm unter Verwendung einer Fluoreszenz-Mikroplatten-Lesevorrichtung (Spectrafluor, Tecan, Österreich) gemessen. Die Ergebnisse sind als Fluoreszenz-Einheiten und Prozentsatz der gesamten ß-Hexosaminidase, die nach Lyse der Zellen mit 1% Triton X-100 freigesetzt wurde, berichtet. 44 AT 501 101 B1

Wie in Fig. 7 beispielhaft angeführt, führte sowohl die Vorinkubation von Phi p 12 mit steigenden Konzentrationen (2-10% VA/) von Kaninchen-anti-MP12-Antikörpem als auch mit Kanin-chen-anti-Phl p 12-Antikörpem zu einer Dosis-abhängigen Inhibition der rPhl p 12-induzierten Mediator-Freisetzung aus RBLs, die mit Phi p 12-spezifischen Maus-lgE vorbeladen worden waren. Es wurde keine Inhibition der Basophilen-Degranulation beobachtet, wenn das Allergen mit denselben Konzentrationen von Präimmun-Ig vorinkubiert worden war.

Beispiel 6: Charakterisierung eines hypoallergenen Derivats des Dermatophagoides pteronys-sinus-Allergens Der p 2 (Der p 2-Hybride)

Zwei rekombinante Fragmente von Der p 2, umfassend die Aminosäuren (AS) 1-53 und AS 54-129, wurden mittels PCR-Amplifikation, wie in Beispiel 1 dargestellt, konstruiert (vgl. Fig. 8). Ein Der p 2-Hybride-Molekül wurde in umgekehrter Anordnung (AS 54-129 + 1-53) mittels auf PCR basierender Gene-SOEing (Linhart et al., FASEB J.16 (2002), 1301-1303) erzeugt.

Beispiel 7: Rekombinante Der p 2-Hybride (rDer p 2-Hybride) zeigt stark verringerte IgE-Bindungskapazität

Wie in Beispiel 2 angegeben, wurden gereinigtes rDer p 2 und seine Derivate auf Nitrozellulose punktförmig aufgetragen und mit Humanseren inkubiert (Bahn 1-18: gegen Milben allergische Patienten: Bahn 19: nicht-allergische Person; Bahn 20: Puffer-Kontrolle). Gebundenes IgE wurde mit mit 1251 markierten anti-Human-lgE-Antikörpern detektiert und mittels Autoradiographie sichtbar gemacht. Die Ergebnisse sind in Fig. 9 dargestellt. Die Der p 2-Hybride zeigt eine signifikant verringerte IgE-Bindungskapazität.

Beispiel 8: Anti-Der p 2-Hybride-Antikörper inhibieren die Bindung von Serum-lgE von gegen Milben allergischen Patienten an komplettes Der p 2

Gemäß der allgemeinen Vorgangsweise von Beispiel 4 wurden Mikrotiter-Platten mit rDer p2 beschichtet, vorinkubiert mit Maus-Antiseren, die mit rDer p 2, rDer p 2-Derivaten oder mit einem Präimmun-Serum als Kontrolle induziert worden waren, und mit Seren von gegen Milben allergischen Patienten inkubiert. Gebundene IgE-Antikörper wurden mit mit POX markierten anti-Human-lgE-Antikörpern nachgewiesen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 angeführt. Die Inhibition der Serum-lgE-Bindung ist in % gezeigt.

Tabelle 4:

Patient 1 Patient 2 Patient 3 Patient 4 Mittel Der p2 (AS 1-53) 48 66 53 50 54 Der p2 (AS 54-129) 39 50 52 24 41 Der p2-Hybride 59 76 64 47 62 Der p2 61 87 77 73 75

Anti-rDer p 2- und anti-rDer p 2-Derivat-Antikörper, die durch Immunisierung von Mäusen induziert worden waren, inhibieren die IgE-Bindung allergischer Patienten an rDer p 2, wie in einem ELISA-Inhibitions-Test gezeigt.

Die Der p 2-Hybride induziert blockierende Antikörper im vorliegenden Maus-Modell; die Immu-nogenität wird durch Umstrukturierung der Fragmente signifikant erhöht.

Claims

45 AT 501 101 B1 Patentansprüche: 1. Verfahren zur Herstellung von Derivaten von Wildtyp-Protein-Allergenen mit verringerter allergener Aktivität, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: - Vorsehen eines Wildtyp-Protein-Allergens mit einer allergenen Aktivität, - Spleißen des Wildtyp-Protein-Allergens in zwei Teile, wobei die beiden Teile keine oder eine verringerte allergene Aktivität aufweisen, und - Wiederverbinden der beiden Fragmente in umgekehrter Orientierung.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Derivat als rekombinantes Protein in einem Wirt, insbesondere in einem Wirt mit großer Expressionskapazität, erzeugt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Wildtyp-Allergen ausgewählt ist aus der Gruppe der Profiline, insbesondere Phi p 12, Birken-Allergene, insbesondere Bet v 4, Staubmilben-Allergene, insbesondere Der p2, Vorratsmilben-Allergene, insbesondere Lep d 2, Wiesenlieschgras-Allergene, insbesondere Phi p 7.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Verringerung der allergenen Aktivität durch eine Verringerung der Inhibition der IgE-Bindungskapazität von mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 20%, insbesondere mindestens 30%, im Verlgeich zum Wildtyp-Allergen, gemessen wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Verringerung der allergenen Aktivität durch das Fehlen der Bindung von IgE-Antikörpern aus mit Allergen sensibilisierten Patienten-Seren an einen Dot-Blot des Derivats gemessen wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Derivate mit einem pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten kombiniert und zu einem pharmazeutischen Präparat fertig gestellt werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Derivate mit einem geeigneten Vakzin-Adjuvans kombiniert und zu einem pharmazeutisch akzeptablen Vakzin-Präparat fertig gestellt werden.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Derivate mit weiteren Allergenen zu einem Kombinations-Vakzin kombiniert werden.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Allergen ein Wildtyp-Allergen ist, insbesondere eine Mischung von Wildtyp-Allergenen, rekombinanten Wildtyp-Allergenen, Derivaten von Wildtyp-Protein-Allergenen oder Mischungen davon.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Präparat weiters einen Allergen-Extrakt enthält.
11. Allergen-Derivat eines Wildtyp-Protein-Allergens, wobei das Wildtyp-Protein-Allergen eine Aminosäure-Sequenz von 1 bis Z aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass das Derivat nebeneinander - in N-Terminus zu C-Terminus-Orientierung - die beiden Wildtyp-Allergen-Fragmente X bis Z und 1 bis X enthält, wobei die beiden Wildtyp-Allergen-Fragmente eine reduzierte allergene Aktivität aufweisen oder ihnen die allergene Aktivität fehlt.
12. Allergen-Derivat nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass X bis Z und 1 bis X mindestens 30 Aminosäure-Reste lang, vorzugsweise mindestens 50 Aminosäure-Reste lang, insbesondere mindestens 60 Aminosäure-Reste lang sind. 46 AT 501 101 B1
13. Allergen-Derivat nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass X bis Z und 1 bis X sich längenmäßig um 50% oder weniger, vorzugsweise um 30% oder weniger, insbesondere um 20% oder weniger, voneinander unterscheiden.
14. Allergen-Derivat nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Wildtyp-Allergen ausgewählt ist aus Typ I-Allergen, vorzugsweise aus Amb a 1, Amb a 2, Amb a 3, Amb a 5, Amb a 6, Amb a 7, Amb 15, Art v 1, Art v 2, Art v 3, Art v 4, Hel a 1, Hel a 2, Mer a 1, Che a 1, Che a 2, Che a 3, Sal k 1, Pia 11, Hum j 4w, Par j 1, Par j 2, Par j 3, Par o 1, Cyn d 1, Cyn d 7, Cyn d 12, Cyn d 15, Cyn d 22w, Cyn d 23, Cyn d 24, Dac g 1, Dac g 2, Dac g 3, Dac g 5, Fes p 4w, Hol 11, Lol p 1, Lol p 2, Lol p 3, Lol p 5, Lol p 11, Pha a 1, Phi p 1, Phi p 2, Phi p 4, Phi p 5, Phi p6, Phi p 11, Phi p 12, Phi p 13, Poa p 1, Poa p 5, Sor h 1, Pho d 2, Aln g 1, Bet v 1, Bet v 2, Bet v 3, Bet v 4, Bet v 6, Bet v 7, Car b 1, Cas s 1, Cas s 5, Cas s 8, Cor a 1, Cor a 2, Cor a 8, Cor a 9, Cor a 10, Cor a 11, Que a 1, Fra e 1, Lig v 1, Oie e 1, Oie e 2, Oie e 3, Oie e 4, Oie e 5, Oie e 6, Oie e 7, Oie e 8, Oie e 9, Oie e 10, Syr v 1, Cry j 1, Cry j 2, Cup a 1, Cup s 1, Cup s 3w, Jun a 1, Jun a 2, Jun a 3, Jun o 4, Jun s 1, Jun v 1, Pia a 1, Pia a 2, Pia a 3, Aca s 13, Bio 11, Bio 13, Bio 14, Bio 15, Bio t 6, Bio 110, Bio 111, Blot 12, Blot 13, Blot 19, Derf 1, Derf 2, Derf 3, Derf 7, Derf 10, Der f 11, Derf 14, Derf 15, Derf 16, Derf 17, Derf 18w, Der m 1, Der p 1, Der p 2, Der p 3, Der p 4, Der p 5, Der p 6, Der p 7, Der p 8, Der p 9, Der p 10, Der p 14, Eur m 2, Eur m 14, Gly d 2, Lep d 1, Lep d 2, Lep d 5, Lep d 7, Lep d 10, Lep d 13, Tyr p 2, Bos d 2, Bos d 3, Bos d 4, Bos d 5, Bos d 6, Bos d 7, Bos d 8, Can f 1, Can f 2, Can f 3, Can f 4, Equ c 1, Equ c 2, Equ c 3, Equ c 4, Equ c 5, Fel d 1, Fel d 2, Fel d 3, Fel d 4, Fel d 5w, Fel d 6w, Fel d 7w, Cav p 1, Cav p 2, Mus m 1, Rat n 1, Alt a 1, Alt a 2, Alt a 3, Alta 4, Alt a 6, Alta 7, Alt a 10, Alt a 11, Alt a 12, Cla h 1, Cla h 2, Cla h 3, Cla h 4, Cla h 5, Cla h 6, Cla h 12, Asp fl 13, Asp f 1, Asp f 2, Asp f 3, Asp f 4, Asp f 5, Asp f 6, Asp f 7, Asp f 8, Asp f 9, Asp f 10, Asp f 11, Asp f 12, Asp f 13, Asp f 15, Asp f 16, Asp f 17, Asp f 18, Asp f 22w, Asp f 23, Asp n 14, Asp n 18, Asp n 25, Asp o 13, Asp o 21, Pen b 13, Pen ch 13, Pen ch 18, Pen ch 20, Pen c 3, Pen c 13, Pen c 19, Pen c 22w, Pen c 24, Pen o 18, Fus c 1, Fus c 2, Tri r 2, Tri r 4, Tri 11, Tri 14, Cand a 1, Cand a 3, Cand b 2, Psi c 1, Psi c 2, Cop c 1, Cop c 2, Cop c 3, Cop c 5, Cop c 7, Rho m 1, Rho m 2, Mala f 2, Mala f 3, Mala f 4, Mala s 1, Mala s 5, Mala s 6, Mala s 7, Mala s 8, Mala s 9, Mala s 10, Mala s 11, Epi p 1, Aed a 1, Aed a 2, Api m 1, Api m 2, Api m 4, Api m 6, Api m 7, Born p 1, Born p 4, Bla g 1, Bla g 2, Bla g 4, Bla g 5, Bla g 6, Per a 1, Per a 3, Per a 7, Chi k 10, Chi 11-9, Chi 11.01, Chi 11.02, Chi 12.0101, Chi 12.0102, Chi 13, Chi 14, Chi 15, Chi 16.01, Chi 16.02, Chi 17, Chi 18, Chi 19, Cte f 1, Cte f 2, Cte f 3, Tha p 1, Lep s 1, Dol m 1, Dol m 2, Dol m 5, Dol a 5, Pol a 1, Pol a 2, Pol a 5, Pol d 1, Pol d 4, Pol d 5, Pol e 1, Pol e 5, Pol f 5, Pol g 5, Pol m 5, Vesp c 1, Vesp c 5, Vesp m 1, Vesp m 5, Ves f 5, Ves g 5, Ves m 1, Ves m 2, Ves m 5, Ves p 5, Ves s 5, Ves vi 5, Ves v 1, Ves v 2, Ves v 5, Myr p 1, Myr p 2, Sol g 2, Sol g 4, Sol i 2, Sol i 3, Sol i 4, Sol s 2, Tria p 1, Gad c 1, Sal s 1, Bos d 4, Bos d 5, Bos d 6, Bos d 7, Bos d 8, Gal d 1, Gal d 2, Gal d 3, Gal d 4, Gal d 5, Met e 1, Pen a 1, Pen i 1, Pen m 1, Pen m 2, Tod p 1, Hel as 1, Hai m 1, Ran e 1, Ran e 2, Bra j 1, Bra n 1, Bra r2, Hör v 15, Hör v 16, Hör v 17, Hör v 21, Sec c 20, Tri a 18, Tri a 19, Zea m 14, Ory s 1, Api g 1, Api g 4, Api g 5, Dau c 1, Dau c 4, Cor a 1.04, Cor a 2, Cor a 8, Mal d 1, Mal d 2, Mal d 3, Mal d 4, Pyr c 1, Pyr c 4, Pyr c 5, Pers a 1, Pru ar 1, Pru ar 3, Pru av 1, Pru av 2, Pru av 3, Pru av 4, Pru d 3, Pru p 3, Pru p 4, Aspa o 1, Lac s 1, Vit v 1, Mus xp 1, Ana c 1, Ana c 2, Cit I 3, Cit s 1, Cit s 2, Cit s 3, Lit c 1, Sin a 1, Gly m 1, Gly m 2, Gly m 3, Gly m 4, Vig r 1, Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3, Ara h 4, Ara h 5, Ara h 6, Ara h 7, Ara h 8, Len c 1, Len c 2, Pis s 1, Pis s 2, Act c 1, Act c 2, Cap a 1 w, Cap a 2, Lyc e 1, Lyc e 2, Lyc e 3, Sola 11, Sola 12, Sola 13, Sola 14, Ber e 1, Ber e 2, Jug n 1, Jug n 2, Jug r 1, Jug r 2, Jug r 3, Ana o 1, Ana o 2, Ana o 3, Ric c 1, Ses i 1, Ses i 2, Ses i 3, Ses i 4, Ses i 5, Cuc m 1, Cuc m 2, Cuc m 3, Ani s 1, Ani s 2, Ani s 3, Ani s 4, Arg r 1, Asc s 1, Car p 3w, Den n 1, Hev b 1, Hev b 2, Hev b 3, Hev b 4, Hev b 5, Hev b 6.01, Hev b 6.02, Hev b 6.03, Hev b 7.01, Hev b 7.02, Hev b 8, Hev b 9, Hev b 10, Hev b 11, Hev b 12, Hev b 13, Horn s 1, Horn s 2, Horn s 3, Horn s 4, Horn s 5 und Trip s 1, mehr bevorzugt einem Allergen von Wiesenlieschgras (Phleum pratense)-Pollen, insbesondere Phi p 12, Birken (Betula verrueosa)-Pollen, insbesondere Bet v 4, Gift der Gemeinen 47 AT 501 101 B1 Wespe (Vespula vulgaris), Gift der Papierwespe („paper wasp", Polistes annularis), Parie-taria judaica-Pollen, Weidelgras-Pollen, oder Mischungen davon.
15. Allergen-Zusammensetzung, umfassend ein Allergen-Derivat nach einem der Ansprüche 11 bis 14 und weitere Allergene, vorzugsweise Wildtyp-Allergene, insbesondere eine Mischung von Wildtyp-Allergenen, rekombinante Wildtyp-Allergenen, Derivate von Wildtyp-Protein-Allergenen oder Mischungen davon.
16. Allergen-Zusammensetzung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung weiters einen Allergen-Extrakt enthält.
17. Allergen-Zusammensetzung nach den Ansprüchen 15 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten enthält.
18. Verwendung eines Allergen-Derivats oder einer Allergen-Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 11 bis 17 zur Herstellung eines Allergen-spezifischen Immuntherapie-Medikaments.
19. Verwendung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament weiters Adjuvantien, Verdünnungsmittel, Konservierungsmittel oder Mischungen davon enthält.
20. Verwendung nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass es weiters 10 ng bis 1 g, vorzugsweise 100 ng bis 10 mg, insbesondere 0,5 pg bis 200 pg des rekom-binanten Allergen-Derivats aufweist.
21. Verfahren zur Herstellung eines Allergen-Derivats nach einem der Ansprüche 11 bis 17, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: - Vorsehen eines DNA-Moleküls, das für ein Allergen-Derivat nach einem der Ansprüche 11 bis 17 codiert, - Transformieren einer Wirtszelle mit dem DNA-Molekül, und - Exprimieren des Derivats in der Wirtszelle und Isolieren des Derivats.
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirt ein Wirt mit einer großen Expressionskapazität ist.
23. Verfahren zur Herstellung eines Allergen-Derivats nach einem der Ansprüche 11 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass es durch chemische Synthese erzeugt wird. Hiezu 6 Blatt Zeichnungen