AT502292A2

AT502292A2 - Melanomdiagnose

Info

Publication number: AT502292A2
Application number: AT0080705A
Authority: AT
Original assignee: Greenhills Biotechnology Res D
Priority date: 2005-05-11
Filing date: 2005-05-11
Publication date: 2007-02-15
Also published as: WO2006119527A8; WO2006119527A2; NZ564153A; AU2006246342A8; AU2006246342B2; EP2001507A2; US20090130129A1; US20100285509A1; WO2006119527A3; AU2006246342A1; CA2605006A1; AT502292B1

Description

* . <
- 1 -
Die vorliegende Erfindung betrifft mit Krebs in Beziehung stehende, humane endogene Retroviren und antigene Fragmente davon. Anwendungen zur Melanom-Diagnose und Prognose, sowie für Vakzine und Immuntherapien werden präsentiert.
Humane endogene retrovirale Sequenzen (HERVs) sind bei der Karzinogenese mögliche Pathogene. Das menschliche Genom enthält etwa 5% endogene retrovirale Sequenzen (Venter et al.). Das humane endogene Retrovirus, Typ K (HERV-K) umfasst pro Haploid-Genom 30-50 Mitglieder der gesamten Länge und weist für die gag-, pol- und env-Gene intakte offene Leserahmen auf.

Obwohl die meisten der HERV-Proviren Deletionen, Stop-Codons oder Rasterverschiebungen<(>frame shifts) enthalten, ist HERV-K eines der am besten beschriebenen humanen endogenen Retroviren mit offenen Leserahmen für die Struktur- und Enzym-Proteine gag, prt, pol und env<(>Löwer et al., Mayer et al.). Es zeigte sich auch, dass die HERV-K-<(>HML-2) -Gruppe Virus-Partikel bildet (Bronson, Lower, Turner) .
<O>ft wird berichtet, dass endogene Retroviren mit einer Tumor-Bildung in Verbindung stehen. Ein 80 kDa-Protein, das dem gag-Polyprotein verwandt ist, wurde bei Teratokarzinom-Zelllinien und bei humanen Keimzelltumoren identifiziert. Die bei diesen Zellen beobachtete hohe Expression ist mit dem Vorhandensein von Antikörpern verbunden, die gegen die retroviralen Produkte bei Patienten mit Keimzelltumoren gerichtet sind (Sauter et al.).

Kürzlich wurden HERV-K gag/env-Antikörper als Indikatoren für die Therapie-Wirkungen bei Patienten mit Keimzelltumoren charakterisiert<(>Kleiman et al.). Boiler et al. wiesen nach, dass HTDV-Partikel in vivo exprimiert werden und dass die Immunreaktion gegen HTDV/HERV-K für definierte Virus-Proteine spezifisch ist. Hohe Antikörper-Titer fand man bei etwa 60% der männlichen Patienten mit Keimzelltumoren. Die Antikörper-Reaktivität nahm nach dem Entfernen des Tumors ab. Goedert et al. beschrieben, dass HERV-KlO-Antikörper häufig bei Hodenkrebs nachgewiesen werden und sich bei einer wirksamen Therapie der Malignität rasch aufzulösen scheinen. Die Antikörper-Reaktivität tritt auch bei etwa 5% der Kontrollen auf, möglicherweise wegen nicht-spezifischer oder kreuzreaktiver Epitope.

Unter Verwendung der Echtzeit-RT-PCR wurde eine Überexpression von HERV-KlO-artigen gagGenen in den Blutzellen von Leukämie-Patienten gezeigt(Depil et al.<)>. Ausserdem wurden Autoantikörper gegen HERV-K bei Autoimmun-
NACHGEREICHT .. ..
- 2 -
Erkrankungen beschrieben (Herve et al.), und IgG-Antikörper gegen Mäuse-Leukämie-Virus wurden bei Psoriasis nachgewiesen (Moles et al. )
Kürzlich wurde berichtet, dass retrovirale Proteine und Teilchen spezifisch in humanen Melanomen und Metastasen, jedoch nicht in Melanozyten exprimiert werden (Muster et al.). Wegen einer Sequenz-Homologie von 98% mit entsprechenden Regionen des endogenen Retrovirus HERV-K 108 wurde der Name MERV (Melanomassoziiertes endogenes Retrovirus) verwendet.

Die Daten lassen darauf schliessen, dass die Expression der Virus-Sequenzen während der Transformation von Melanozyten zu Melanom-Zellen aktiviert wird.
Das Melanom ist ein Hautkrebs, wobei bis zu 30% der Patienten systemische Metastasen entwickeln, und die Mehrheit stirbt (Kirbwood et al.). Zu den klassischen Modalitäten der Behandlung des Melanoms zählen Operation, Bestrahlung und Chemotherapie. Im letzten Jahrzehnt kamen die Immuntherapie und die Gentherapie als neue und vielversprechende Methoden zur Behandlung des Melanoms auf. Daher werden optimierte Antigene mit spezifischen Bund T-Zell-Epitopen gesucht.
Verschiedene antigene Peptide sind in der WO 03/018610 geoffenbart, die zur Behandlung von Melanom-Patienten verwendet werden.

Diese Peptide stammen vom Melanozyten-DifferenzierungsAntigen gplOO, welches bei mehr als 75% der humanen Melanome exprimiert wird.
Die JP 2002/223765 A sieht ein malignes Melanom-Antigen vor, das mittels cDNA-Techniken von einer malignen Melanom-Zelllinie erhalten wird.
Weitere Melanom-assoziierte Antigen-artige Peptide, die bei etwa 40% der Melanome exprimiert werden und im Xp-Arm des XChromosoms lokalisiert sind, sind in der WO 02/059314 dargelegt.
Die WO 01/14884 offenbart ein Epitop eines mit einem Melanom assoziierten Antigens mit hohem Molekulargewicht (high molecular weight melanoma associated antigen, HMW-MAA) , das sich an der Oberfläche von Human-Zellen befindet.
Die WO 00/24778 beschreibt Epitope des Melanom-Antigens Tyrosinase-related Protein 2.
Weitere Antigene oder von Melanom stammende Epitope sind in WO 98/55133, WO 97/39774, US 6,500,919, WO 95/04542,

WO 92/21767 oder WO 89/11296 geoffenbart.
NACHGEREICHT Die WO 03/029460 beschreibt ein MERV (NCBI Hinterlegungsnummer: AX743231) und sieht Sequenzen für die gag-, env- und polGene sowie antigene Fragmente davon vor.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Identifizierung von MERV-spezifischen Antigenen und Epitopen für die Detektion von Melanomen und Metastasen davon. Geeignete Antigene für die Detektion von Melanomen können mittels Tests unter Verwendung von Seren von Melamon-Patienten identifiziert werden.

Die spezifische Expression retroviraler Proteine in Melanomen und das Vorhandensein von Antikörpern gegen diese Proteine bei MelanomPatienten zeigen an, dass die korrespondierenden Antigene Ziele sowohl für die Immuntherapie als auch die Diagnose darstellen.
Daher sieht die vorliegende Erfindung ein Antigen vor, das ein Fragment einer Aminosäure-Sequenz des env- oder gag-Proteins des Melanom-assoziierten endogenen Retrovirus (MERV) ist, umfassend eine der Aminosäure-Sequenzen EMQRKAPPRRRRHRNRA, YQRSLKFRPKGKPCPKE, FRPKGKPCPKEIPKESK, FSYQRSLKFRPKGKPCP,
SYQRSLKFRPKGKPCPK, QRSLKFRPKGKPCPKEI, RSLKFRPKGKPCPKEIP, SLKFRPKGKPCPKEIPK oder SYQRSLKFRPKGKPCPKEIP (SEQ ID Nr. 1, 7, 8, 55-59 bzw. 69) .

Die antigenen Eigenschaften von Peptiden, die die Sequenzen SEQ ID Nr. 1, 7, 8, 13, 21, 55-59 oder 69 umfassen, wurden getestet und unter Verwendung der in den Beispielen geoffenbarten Methoden verifiziert. Die Ergebnisse sind in Beispiel 11 unten angeführt. Dadurch wurde die antigene Aktivität der Peptide mit den Aminosäure-Sequenzen der SEQ ID Nr.

1, 7, 8, 13, 21, 55-59 und 69 gegen Antikörper-hältige Seren von MelanomPatienten bewiesen, und somit werden diese Antigene oder antigenen Peptide von der vorliegenden Erfindung vorgesehen.
Zusätzlich zu den oben erwähnten Antigenen, welche ausgezeichnete antigene Eigenschaften aufwiesen, inkludiert die vorliegende Erfindung auch ein Antigen, das ein Fragment einer Aminosäure-Sequenz des Melanom-assoziierten endogenen Retrovirus MERV ist, umfassend eine der Aminosäure-Sequenzen von RMKLPSTKKAEPPTWAQ, TKKAEPPTWAQLKKLTQ, MPAGAAAA Y YWAYVP, PIDDRCPAKPEEEGMMI, YPPICLGRAPGCLMPAV, GKPCPKEIPKESKNTEV,
GTIIDWAPRGQFYHNCS, RGQFYHNCSGQTQSCPS, DLTESLDKHKHKKLQSF, PWGWGEKGISTPRPKIV, PKIVSPVSGPEHPELWR, CPWFPEQGTLDLKDWKR, IGKELKQAGRKGNIIPL, DCNENTRKKSQKETEGL, TLKLEGKGPELVGPSES,
GPSESKPRGTSPLPAGQ, QPQTQVKENKTQPPVAY, PAELQYRPPPESQYGYP, MPPAPQGRAPYPQPPTR, EIIDKSRKEGDTEAWQF, MPPGEGAQEGEPPTVEA,

MKEGVKQYGPN SPYMRT, VQEQVQRNRAANPPVNI, LRAWEKIQDPGSTCPSF, TVRQSSKEPYPDFVARL, QSAIKPLKGKVPAGSDV, TGREPPDLCPRCKKGKH, LSGNEQRGQPQAPQQTG, QPFVPQGFQGQQPPLSQ, QLPQYNNCPPPQAAVQQ, AINNKEPATRFQWKVLP, ENRKIKPQKIEIRKDTL, ILPKITRREPLENALTV, FTDGSSNGKAAYTGPKE, PKERVIKTPYQSAQRAE, LPGPLTKANEEADLLVS, LKNKFDVTWKQAKDIVQ, PTQEAGVNPRGLCPNAL, IWATCQTGESTSHVKKH, VPEKIKTDNGPGYCSKA, LVKQKEGGDSKECTTPQ, AEQHLTGKKNSPHEGKL, IWWKDNKNKTWEIGKVI (SEQ ID Nr. 2-6, 9-46), PRVNYLQDFSYQRSLKF, RVNYLQDFSYQRSLKFR, VNYLQDFSYQRSLKFRP, NYLQDFSYQRSLKFRPK, YLQDFSYQRSLKFRPKG, QDFSYQRSLKFRPKGKP, DFSYQRSLKFRPKGKPC, LKFRPKGKPCPKEIPKE, KFRPKGKPCPKEIPKES, RPKGKPCPKEIPKESKN, PKGKPCPKEIPKESKNT, KGKPCPKEIPKESKNTE, KPCPKEIPKESKNTEVL, PCPKEIPKESKNTEVLV, CPKEIPKESKNTEVLVW, PKEIPKESKNTEVLVWE (SEQ ID Nr. 47-54, 60-68) .

Diese Antigene wiesen auch eine Antigenität auf, die deutlich über dem Schwellenwert der nicht-antigenen Kontrollen lag (vgl. Fig. 2 und 4) .
Es ist bekannt, dass die Mindestgrösse eines kontinuierlichen Epitops 6 Aminosäure-Reste ist (King et al., 1994). Obwohl Epitope von verschiedenen, nicht direkt verbundenen Aminosäuren in grösseren Peptiden gebildet werden können, ist bei kleineren Peptiden das Epitop, d.h., jener Teil des Peptids, der mit einem Antikörper interagiert, eine kleine Sequenz kontinuierlicher Aminosäuren. Daher inkludieren die Antigene der vorliegenden Erfindung auch jedes Fragment einer Aminosäure-Sequenz des envoder gag-Proteins des Melanom-assoziierten endogenen Virus (MERV) , welches ein Fragment von mindestens 6 kontinuierlichen Aminosäuren einer der Aminosäure-Sequenzen der SEQ ID Nr. 1, 7, 8, 55-59 oder 69 umfasst.

Bevorzugte Fragmente haben eine Länge von mindestens 8 Aminosäuren. Die bevorzugten Fragmente können eine Länge von zwischen 8 und 15, insbesondere zwischen 8 bis 12 Aminosäuren aufweisen. Solche kleinen Peptide können beispielsweise zum Kartieren der Antigen-Bindungs-Spezifität von Antikörpern bei einem Patienten mit einem Melanom zur besseren Klassifizierung des Krebses verwendet werden.
Bevorzugte Fragmente sind EMQRKA, MQRKAPPRRRRHRN, RKAPPRR, KAPPRRRRHRN, RRRRHRNRA, (enthalten in SEQ ID Nr. 1) YQRSLK, QRSLKFRPKGKP, RSLKFRPKGK, SLKFRPKGKPCP, FRPKGKPCP, KGKPCPK, GKPCPKE, (enthalten in SEQ ID Nr. 7), GKPCPKE, PCPKEIP, EIPKESK, KGKPCPKEIPKESK (enthalten in SEQ ID Nr. 8), FSYQRSL, SYQRSLKFRPK, YQRSLKFRP, RSLKFRP (enthalten in SEQ ID Nr. 55), KGKPCPKEI, FRPKGKPCPKEIP, GKPCPKEIPK (enthalten in SEQ ID Nr. 59) .
NACHGEREICK .. .. .. . .

..
- 5 -
Weitere Antigene oder antigene Verbindungen sind Mimotope der oben erwähnten Antigene. Der Ausdruck "Mimotope" bezieht sich auf Peptide, die die Polypeptide, wie oben definiert, immunologisch nachahmen. Da bei MERV eine Sequenz-Variabilität auftreten kann (da es mit kanzerösen Mutationen verwandt ist), kann es erwünscht sein, eine oder mehrere Aminosäuren zu variieren, um die Epitope verschiedener MERV-Mutanten besser nachzuahmen, selbst mit einer verschiedenen Immunhistologie.

Es sei ver-standen, dass solche Mimotope nicht mit irgendeiner besonderen MERVSequenz identisch sein müssen, solange als die vorliegenden Verbindungen eine immunologische Stimulation vorsehen können, nach welcher die T- und B-Zellen MERV-reaktiv sind (insbesondere werden die natürlich vorkommenden Homologe von MERV-Antigen-Sequenzen, die den oben erwähnten SEQ ID Nummern entsprechen, bevorzugt) . Die oben beschriebenen Polypeptide können daher Insertionen, Deletionen und konservativen sowie nicht-konservativen Aminosäure-Substitutionen unterzogen werden, wenn solche Veränderungen bestimmte Vorteile bei ihrer Verwendung bringen könnten. Auch nicht natürlich vorkommende Aminosäure-Reste (d.h.

Aminosäure-Reste, die nicht die 20 Standard-Aminosäuren sind, wie D-Aminosäuren, Ornithin, 3- oder 4-OH-Prolin, Norvalin, Norleucin etc.) oder chemisch veränderte Aminosäure-Reste können angewendet werden. Die Peptide sind vorzugsweise so kurz wie möglich, während sie noch immer die gesamte Sensitivität der grösseren Sequenz beibehalten. In bestimmten Fällen kann es erwünscht sein, zwei oder mehrere Peptide zu einer einzigen Struktur zu verbinden. Die Bildung eines solchen Komposits kann kovalente oder nicht-kovalente Bindungen beinhalten. Das Mimotop kann mit einem (monoklonalen) Antikörper und (im Handel erhältlichen) Peptid-Bibliotheken identifiziert werden (z.B. gemäss Reineke et al., 2002: "Identification of distinct antibody epitopes and mimotopes from a peptide array of 5520 randomly generated sequences" J Immunol Methods 267:37).

Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Antigen, das ein Mimotop irgendeines oben definierten Antigens umfasst.
Derzeitige Test-Techniken zum Nachweis von Antigenen oder Antikörpern verwenden zuvor hergestellte (kompetitive) Antigene. Solche Antigene werden vorzugsweise auf einem festen Träger immobilisiert vorgesehen. Ein übliches Verfahren zur Immobilisation ist, Antigene mit einem Biotin-Linker zu versehen, der leicht
NACHGEREICHT » an Oberflächen-Strukturen (z.B. Avidin) einer Oberfläche (z.B. eine Mikrotiter-Vertiefung, oder eine Biochip-Oberfläche für Mikro-Arrays) gebunden werden kann. Daher schliesst die vorliegende Erfindung auch Antigene, wie oben definiert, mit ein, die kovalent gebundenes Biotin aufweisen.

Zur besseren Epitop-Erkennung durch den Antikörper kann ein Linker-Molekül zwischen der Oberfläche und dem Antigen verwendet werden, um die Flexibilität und besondere Arten der Orientierung des Antigens zu erhöhen.
Kleine Epitope können von Antikörpern erkannt werden, sind jedoch selbst nicht Antikörper-induzierend, d.h., sie induzieren nicht die Bildung spezifischer Antikörper. Das Antigen gemäss der vorliegenden Erfindung kann jedoch hinsichtlich seiner T-ZellenReaktivität vorgesehen oder getestet werden. Ausserdem kann ein Antigen der vorliegenden Erfindung als Protein-Aggregat oder -Konjugat vorgesehen werden, umfassend ein nicht-antigenes Protein und ein Antigen der vorliegenden Erfindung. Ein solches Aggregat kann zur Herstellung von Antiseren oder für eine Immuntherapie verwendet werden.

Nicht-antigene Verbindungen sind im Stand der Technik bekannt und inkludieren Blutbestandteile, wie Albumin.
Grosse immunogene Verbindungen können auch als Fusionsproteine hergestellt werden, welche ein nicht-antigenes Protein und ein Antigen gemäss der vorliegenden Erfindung umfassen. Der Vorteil bei Fusionsproteinen liegt in der kovalenten Verbindung des Antigens und des nicht-antigenen Proteins, was eine zusätzliche Stabilität bringt. Weiters kann ein solches Fusionsprotein rekombinant mittels mikrobiologischer Standard-Techniken erzeugt werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Antiserum, welches Antikörper gegen ein Antigen oder Protein-Aggregat oder Fusionsprotein, wie oben angemerkt umfasst.

Antiseren werden allgemein mittels wiederholter Antigen-Injektion (z.B. 2 oder 3 Mal) in ein Tier, wie Maus, Ratte, Kaninchen, Meerschweinchen, Huhn, Ziege, Schaf, Pferd oder Kuh, und nachfolgendes Sammeln von Seren vom Tier (z.B. durch Blutentnahme oder Sammeln von Eiern) erzeugt. Ein auf diese Weise erzeugtes Antiserum ist ein polyklonales Antiserum, d.h. es können mehrere Typen von Antikörpern, die das selbe Antigen erkennen, im Serum vorhanden sein. Solche Antiseren können gegebenenfalls an Antigen-spezifischen Antikörpern angereichert werden durch Immunad-
NACHGEREICK[Iota] ! sorption und Desorption an einer Säule oder an Kügelchen, die das vorliegende Antigen umfassen, d.h. ein Antigen wie oben definiert. Solche Antiseren können zur Detektion von MERV-Antigenen in einer Probe mittels Standard-Test-Methoden verwendet werden.

Antiseren können Konservierungsmittel, wie Timerosal oder Natriumazid, aufweisen.
Weiters ist ein isolierter Antikörper vorgesehen, der gegen ein Antigen oder Protein-Aggregat oder Fusionsprotein, wie oben definiert, gerichtet ist, welches für verschiedene, mit einer MERV-Analyse verbundene Test- und Nachweis-Techniken verwendet werden kann, wobei MERV-Antikörper in einem Patienten einen diagnostischen Indikator für ein Melanom darstellen.

Ein solcher Antikörper ist aus einem polyklonalen Antiserum durch einen Affinitäts-Assay erhältlich, oder alternativ können monoklonale Antikörper unter Verwendung des Hybridom-Verfahrens erzeugt werden (Barnstable et al.).
Weiters sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Detektion von anti-MERV-Antikörpern in einer Probe unter Verwendung eines Antigens gemäss der vorliegenden Erfindung vor, umfassend die Schritte
(a)Kontaktieren der Probe mit den Antigenen, was zu einer Antikörper-Antigen-Reaktion zwischen dem Antikörper aus der Probe und dem Antigen führt, und
(b)

Detektieren und gegebenenfalls Quantifizieren des antiMERV-Antikörpers durch die Bindung an das Antigen.
Solche Detektionsmethoden sind im Stand der Technik der ImmunoAssays allgemeines Wissen.
Vorzugsweise wird das obige Verfahren zur Detektion von anti-MERV-Antikörpern gleichzeitig für die Quantifizierung der anti-MERV-Antikörper verwendet, wobei der anti-MERV-Antikörper entweder durch Bestimmen der Menge des Antikörper-gebundenen Antigens, oder der Menge des Antigen-gebundenen Antikörpers, oder der Menge des Antikörper-freien Antigens, oder der Menge des Antigen-freien Antikörpers quantifiziert wird.
Bei einem bevorzugten Verfahren zur Detektion von anti-MERVAntikörpern, wie oben beschrieben,

wird das Antigen an einer Oberfläche immobilisiert.
Ein weiterer Aspekt des Verfahrens zur Detektion von antiMERV-Antikörpern bewertet die Menge des Antikörper-freien Antigens durch mindestens einen zusätzlichen sekundären Antikörper,
NACHGEREICI [Iota]T der ein detektierbares Marker-Signal erzeugt. Sekundäre Antikörper werden verwendet, um primäre Antikörper durch Bindung an den konstanten Teil oder Fc-Teil des primären Antikörpers zu detektieren.

Dies ist ein allgemeiner Ansatz für Immunoassays, insbesondere für kompetitive Immunoassays.
Ein bevorzugtes Verfahren gemäss der Erfindung ist ein Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) , wobei das detektierte Signal durch eine enzymatische Reaktion eines Enzyms, das kovalent an einen (sekundären) Antikörper gebunden ist, verstärkt wird.
Da HERV- oder MERV-Proteine unter normalen Umständen nicht exprimiert werden, ist das Vorhandensein von MERV-Antigenen und anti-MERV-Antikörpern bei einem Patienten ein Indikator für ein Melanom. Daher inkludiert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Diagnose eines Melanoms, wobei ein Antikörper wie oben beschrieben detektiert wird, wobei das Vorhandensein eines solchen Antikörpers ein Indikator für ein Melanom ist.

Daher betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur MelanomDiagnose unter Verwendung eines Antigens gemäss der Erfindung, umfassend die Schritte:
(a) Kontaktieren einer Probe mit den Antigenen, was zu einer Antikörper-Antigen-Reaktion zwischen Antikörpern der Probe und dem Antigen führt, und
(b) Detektieren und gegebenenfalls Quantifizieren des antiMERV-Anti örpers durch die Bindung an das Antigen, wobei das Vorhandensein von Antigenen ein Melanom anzeigt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Detektion eines MERV-Proteins oder MERV-Protein-Fragments in einer Probe unter Verwendung eines Antikörpers oder Antikörper-Fragments, welches gegen ein Antigen, wie oben definiert, gerichtet ist, umfassend die Schritte:

(a) Kontaktieren der Probe mit dem Antikörper, was zu einer Antikörper-Antigen-Reaktion zwischen dem Antikörper und dem MERV-Protein oder MERV-Protein-Fragment führt, und
(b) entweder Bestimmen der Menge des Antikörper-gebundenen MERV-Proteins oder MERV-Protein-Fragments, oder der Menge des MERV-Protein- oder MERV-Protein-Fragment-gebundenen Antikörpers, oder der Menge des Antikörper-freien MERV-Proteins oder MERV-Protein-Fragments, oder der Menge des MERVProtein- oder MERV-Protein-Fragment-freien Antikörpers.
Die Anwesenheit eines solchen Proteins oder Protein-Fragments in f f \ ,Jl i\, .

1
,[Lambda] i t \ einer von einem Patienten erhaltenen Probe ist ein Indikator für ein Melanom.
Vorzugsweise benützt das oben angegebene Verfahren ein Antigen, wie oben definiert, als kompetitives Antigen.
Noch mehr bevorzugt ist die Immobilisierung des Antigens an einer Oberfläche des kompetitiven Antigens zur leichteren Phasen-Trennung während eines Immunoassays.
Wie oben angemerkt, kann die Detektion von MERV-Antigenen oder gegen MERV gerichteten Antikörpern für die Diagnose eines Melanoms oder von Melano -Zellen verwendet werden.

Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Diagnostizierung von kanzerösen Zellen, umfassend die Schritte:
(a) Vorsehen einer Probe der zu testenden Zellen oder eines ÜberStands davon,
(b) Analysieren, ob ein Antigen, wie oben definiert, in der Probe vorhanden ist oder nicht, wobei
(c) das Vorhandensein des Antigens in der Probe kanzeröse Zellen diagnostiziert.
Obwohl MERV-assoziierte Antigene bei einem Patienten mit einem Melanom vorhanden sind, ist es wahrscheinlich, dass solche Antigene exprimiert werden, selbst bevor der Krebs bösartig wird. Die Expression von MERV-Proteinen kann die Ursache des Melanoms sein, da retrovirale Aktionen, wie eine umgekehrte Transkription ("reverse transcription") und Insertionen des VirusGenoms in verschiedene Stellen der Wirtszelle den Krebs fördern.

Daher kann das Vorhandensein von MERV-Antigenen auch kanzeröse Zellen anzeigen, wobei das Verfahren zur Detektion von MERV-assoziierten Antigenen oder anti-MERV-Antikörpern zur Diagnose oder Prognose von Krebs, vorzugsweise Melanom, verwendet werden kann.
Die Antigene der vorliegenden Erfindung können auch verwendet werden, um die Immun-Antwort bei einem Patienten vor dem Auftreten von Krebs oder nach dem Auftreten eines Melanoms zu stimulieren. Die Erfindung sieht eine pharmazeutische Zusammensetzung vor, die ein Antigen oder ein antigenes Protein-Aggregat oder ein antigenes Fusionsprotein, wie oben angeführt, umfasst.
Eine solche pharmazeutische Zusammensetzung kann weiters einen pharmazeutischen Träger und/oder ein Adjuvans aufweisen.

Solche pharmazeutischen Träger sind beispielsweise stabilisierende Salze, Emulgatoren, Lösungsvermittler oder Osmo-Regulatoren, Suspendierungsmittel, Verdickungsmittel, Redox-Komponenten,
NACH<Q>EREICK[iota]<¯>j .......
- 10 die ein physiologisches Redox-Potential aufrecht erhalten. Bevorzugte Adjuvantien inkludieren Aluminiumsalze, Mikroemulsionen, Lipid-Partikel, Oligonukleotide, wie jene, die in Singh et al. geoffenbart sind, und werden verwendet, um die Immun-Antwort zu steigern.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung oder ein pharmazeutisches Präparat als Vakzin, umfassend ein Antigen oder ein antigenes Protein-Aggregat oder ein antigenes Fusions-Protein, wie oben angeführt.

Ein Vakzin kann zur Injektion als Melanom-Behandlung oder für die Melanom-Prävention verwendet werden.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Set zur Durchführung eines Verfahrens zur Detektion von MERV-Antigenen oder anti-MERV-Antikörpern in einer Probe, umfassend ein Antigen, wie oben definiert, einen ersten Antikörper, der gegen dieses Antigen gerichtet ist, einen mit einem Marker verbundenen sekundären Antikörper, der gegen die Fc-Region des ersten Antikörpers gerichtet ist, Puffer-Substanzen, positive KontrollStandards, welche Zusammensetzungen sind, die ein Protein oder Protein-Fragment von MERV enthalten, und negative Kontroll-Standards, welche Zusammensetzungen sind, die ein Protein oder Protein-Fragment enthalten,

das nicht vom MERV-Genom codiert ist.
Ein weiterer Aspekt eines solchen Sets sieht das Antigen der vorliegenden Erfindung an einem festen Träger, wie Mikrotiterplatten-Vertiefungen oder Biochips für Mikro-Arrays, immobilisiert vor.
Die vorliegende Erfindung ist mit Hilfe der folgenden Beispiele und Figuren, auf welche sie jedoch nicht eingeschränkt sein sollte, genauer beschrieben.
Fig. 1: Antigenitäts-Profile von env (A) , gag (B) und pol<(>C<)>. Die x-Achse repräsentiert die Position innerhalb jedes Proteins<(>beginnend am N-Terminus mit Rest eins) .

Die y-Achse gibt die E-Score-Vorhersagen an, d.h. die Epitop-Bewertungen, wobei eindeutige Werte für jede Aminosäure entlang der Sequenz, auf das Intervall [-1,1] normalisiert, angegeben sind.
Fig. 2: Durch Epitop-Vorhersage ausgewählte Anwärter-Peptide wurden mit einem Melanom-Seren-Pool bzw. einem Referenz-SerenPool getestet. Die von der Maus stammenden Kontroll-Peptide Kl<(>Biotin-SGSG-KPLA<Q>-NH2) und K2 (Biotin-SGSG-GLAQ-NH2) wurden als negative und positive Kontroll-Peptide verwendet. ELISA-Ablesung
NACHGEREICHT von einem Patienten-Seren-Pool (schwarze Balken) , angeführt als bei 405 nm bestimmte Absorption. Alle angeführten A405nm-Werte beziehen sich auf die gemessenen A405nm-Werte jeder Probe, minus dem Blindwert.
Fig. 3: Antwort des Melanom-Seren-Pools auf 5 vorher ausgewählte Antigene.

Die Platten wurden mit den Antigenen (AI, E2, E3, Gl, Hl) beschichtet, und serielle Verdünnungen des MelanomSeren-Pools wurden in die Vertiefungen zugegeben. Die Verdünnungen erfolgten unter Verwendung des Referenz-Seren-Pools, und ein Maus-Peptid wurde als negatives Kontroll-Peptid verwendet. Ein Experiment von zwei durchgeführten ist gezeigt. Die Mittelwerte aus Duplikat-Versuchen sind gezeigt.
Fig. 4: Epitop-Kartierung von 25 überlappenden env-Peptiden, die mit einem Patienten-Seren-Pool und einem Referenz-SerenPool, wie oben beschrieben, getestet wurden. Der erste Balken repräsentiert Aminosäure 204-220, der zweite Balken repräsentiert Aminosäure 205-221, usw. Del A405nm bezieht sich auf die gemessenen A405nm-Werte des Melanom-Seren-Pools minus der A405nm-Werte des Referenz-Seren-Pools von jedem Peptid. Ein Experiment von zwei durchgeführten ist gezeigt.

Die Mittelwerte aus Duplikat-Versuchen sind gezeigt.
Fig. 5: Reaktivität von Serum-Antikörpern mit 2 MERV-spezifischen, teilweise überlappenden Peptiden (GHB-Gl und GHB-Hl) und 1 autoimmun-verwandten Peptid (GHB-17'), getestet mit 3 verschiedenen Melanom-Seren- bzw. Referenz-Seren-Pool-Verdünnungen. Ein HlV-Peptid wurde als negatives Kontroll-Peptid verwendet. Alle angegebenen A405nm-Werte beziehen sich auf den gemessenen A 05nm-Wert jeder Probe, minus dem Blindwert.
Fig. 6: Vorausgehende Daten-Analyse wurde durchgeführt, um die allgemeine Sensitivität und Spezifität zu zeigen.

Die ROC ("receiver-operating characteristic") -Kurve wurde verwendet, um den diagnostischen Wert von Melanom-Patienten-Seren zu evaluieren und den optimalen Ausschluss-Punkt ("cut-off point") für den Ablesungs-Wert zu definieren, der der höchsten Unterscheidungsgenauigkeit zwischen Melanom- und Nicht-Melanom-Patienten entspricht. Mittelwerte von Triplikat-Messungen wurden verwendet. Zur Berechnung der ROC-Kurven wurde jede Platte in Bezug auf das mittlere Signal der HIV-Kontroll-Vertiefungen pro Platte normalisiert. Die ROC-Kurven wurden erzeugt durch Berechnung von FP, FN, TP, TN bei diversen Signal-Differenz-Ausschluss-Grenzwerten
NACHGEREICHT

- 12 in Bezug auf den Hintergrund.

Insgesamt wurden 100 AusschlussGrenzen gewählt (äquidistante Intervalle, die zwischen der Minimum- und Maximum-Signal-Ablesung vorliegen) .
Die Sensitivität wurde berechnet als: SE = TP / (TP + FN) = P (T+ » exp+)
Die Sensitivität definiert daher die Wahrscheinlichkeit eines positiven Tests, wenn ein positives Experiment vorliegt (d.h. Melanom-Seren). Die Anzahl der falsch Negativen verringert die Test-Sensitivität.
Die Spezifität wurde berechnet als: SP = TN / (TN + FP) = P(T- » exp-)
Die Spezifität definiert daher die Wahrscheinlichkeit eines negativen Tests, wenn ein negatives Experiment vorliegt (d.h. Referenz-Seren) .

Die Anzahl der falsch Positiven verringert die Test-Spezifität .
Die folgende Anzahl von Seren wurde für die Analyse verwendet (Seren mit unklarer Stadium-Zuteilung wurden nicht weiter in Betracht gezogen) : Stadium I: 12 Stadium II: 14 Stadium III: 204 Stadium IV: 136 Referenz: 95
Eine Analyse der ROC-Kurve für alle Seren zeigt eine Ablesungs-Ausschlussgrenze, wo SE 90% erreicht und SP 80% erreicht. SE und SP sind für Stadium II, III und IV vergleichbar. Die jeweiligen Werte sind für die Stadium I-Seren signifikant niedriger.

Dies kann aufgrund der kleinen Anzahl der vorliegenden Seren sein, oder aufgrund der Biologie, z.B. ungenügend Breslow, das die Präsentation von Epitopen für das Immunsystem behindert.
B e i s p i e l e :
Die folgenden Beispiele präzisieren ein Verfahren zur Detektion von kurzen Peptiden, die B-Zellen-Epitopen von MERV entsprechen, vom Programm E-Score vorhergesagt. Die vorhergesagten Peptide wurden hinsichtlich ihrer Reaktivität gegenüber von Melanom-Patienten stammenden Seren-Pools analysiert.

Immundominante Peptide, die sich im env-Protein von MERV befinden, wurden identifiziert.
Beispiel 1: Epitop-Vorhersage
Kurze Aminosäure-Sequenzen von MERV (NCBI Hinterlegungsnum-
NACHGEREICHT
- 13 mer: AX743231) wurden während Evaluierungs-Läufen unter Verwendung des E-Score-Programms für Sequenz-Analyse und Epitop-Vorhersage identifiziert.
Beispiel 2: Epitop-S[beta]lektion
Gag, pol und env-Proteine wurden auf das Vorliegen potentieller B-Zellen-Epitope analysiert. Die Epitop-Selektion basierte auf den E-Score-Vorhersagen. Fig. 1 zeigt die berechneten Antigenitäts-Profile für env (699 AS), gag (670 AS) und pol (726 AS). Peptide (17-mere), die Peaks entsprechen, welche E-Score-Werte gleich oder höher als 0,8 aufwiesen, wurden für das nachfolgende Pre-screening verwendet.

Diese Ausschlussgrenze wurde verwendet, da E-Score-Validierungs-Experimente positive vorherzusagende Werte von über 80% bei dieser besonderen Vorhersage-Ausschlussgrenze zeigten. Falls die Vorhersage breite Peak-Bereiche zeigte, wurden überlappende Peptide ausgewählt, um den gesamten Bereich, an dem ein Interesse bestand, abzudecken. Insgesamt wurden 14 von env stammende Peptide, 19 von gag stammende Peptide und 13 pol-Sequenzen ausgewählt, synthetisiert und getestet.
Beispiel 3: Immunseren
Serum-Proben wurden von Melanom-Patienten (Diagnose mittels Histopathologie bestätigt) an der Abteilung für Dermatologie, Medizinische Universität Wien, Österreich, genommen. Die Stadium-Zuteilung von Patienten und die entsprechende Klassifizierung von Seren erfolgte gemäss den Richtlinien des US Joint Committee on Cancer, 2001, (Balch 2001) .

Die Verwendung der Patienten-Seren wurde von der Ethik-Kommission der Medizinischen Universität Wien genehmigt, die Geheimhaltung der Studien-Teilnehmer wurde durch entsprechende Proben-Codierung geschützt. Seren von gesunden Spendern dienten als negative Kontrollen. Alle Seren wurden bei -20[deg.]C sofort nach der Blutentnahme gelagert. Von Melanom-Patienten stammende Seren-Pools und jeweilige Referenz-Seren-Pools von gesunden Probanden wurden für das Epitop-Screening und weitere Peptid-Tests verwendet.

Die Probengrösse war 10 Seren von verschiedenen Melanom-Patienten, die Stadium III und IV zum Zeitpunkt der Blutabnahme (Melanom-Seren-Pool) aufwiesen, bzw. 10 Seren von gesunden Probanden (Referenz-Seren-Pool) .
Beispiel 4: Peptid-Synthese
Auf Basis der E-Score-Vorhersage-Bewertungen ausgewählte Peptide wurden mit 80% Reinheit synthetisiert (PERBIO Science, Niederlande) . 3-5 mg synthetisiertes, biotinyliertes Peptid wur-
NACHGEREICHT den in 400 [mu]l einer 50% Dimethylformamid-Lösung verdünnt. Peptide für weiteres Testen und endgültiges Screening wurden mit >9095% Reinheit ohne Biotinylierung synthetisiert (PiCHEM research and development, Graz, Österreich) . Die Reinheit dieser Peptide wurde mittels HPLC und MS bewertet.

Die Peptide wurden mit Dimethylsulfoxid bis zu einer Endkonzentration von 3 mg/ml verdünnt.
Beispiel 5: Epitop-Screening
Mit Streptavidin beschichtete Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Mimotopes Pty Ltd., Australien) wurden mit 200 [mu]l/ Vertiefung 2% Rinderalbumin (Sigma-Aldrich) in PBST (PBS [0,1 M Natriumphosphat, 0,15 M NaCl, pH 7,0] + 0,1% V/V Tween 20 (PBST)) über Nacht bei 4[deg.]C blockiert. Die Vertiefungen wurden dann vier Mal mit PBST gewaschen und mit 100 [mu]l/Vertiefung 1:500 verdünnten biotinylierten Peptiden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. 2 Vertiefungen pro Platte wurden mit PBST in Abwesenheit von Peptid (Blindwert-Vertiefungen) inkubiert. Die Platten wurden 4 Mal mit PBST gewaschen.

Danach wurden 100 [mu]l eines Melanom-Seren-Pools, 1:40 in 1% Rinderalbumin/PBST verdünnt, und ein Referenz-Serum-Pool (1:40) in jede Vertiefung zugegeben und 2 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde 4 Mal mit PBST gewaschen und mit 100 [mu]l/Vertiefung des sekundären Antikörpers, einem mit alkalischer Phosphatase konjugierten Ziegen-anti-human-IgG (h+1) -Antikörper (BETHYL Laboratories, Inc., USA) inkubiert. Detektions-Antikörper wurde 1:1000 in Blockierungslösung verdünnt und 1 h lang inkubiert. Nach 6 Waschschritten mit PBST wurden 200 [mu]l einer 1,0 mg/ml p-Nitrophenylphosphat-Substratlösung in 0,2 M Tris-Puffer (Sigma-Aldrich) in jede Vertiefung zugegeben.

Die Absorption wurde auf einem BDSL Immunoskan PLUS bei 405 nm gemessen.
Während des anfänglichen Screenens verschiedener Peptide wurden Peptide, die auf das von Melanom-Patienten stammende Seren-Pool reagierten, ausgewählt und auch validiert durch Bestimmen der Reaktivität gegenüber dem von gesunden Freiwilligen erhaltenen Referenz-Seren-Pool. Tabelle 1 zeigt ausgewählte Anwärter-Peptide und die Peptid-Position innerhalb der Proteine env, gag und pol. Diese Peptide wurden getestet, um die experimentelle Antigenität zu bestimmen.
Tabelle 1: Liste synthetischer, als antigen vorhergesagter Peptide, die den env-, gag- und pol-Bereich abdecken. Alle Peptide
NACHGEREICHT \ . *
- 15 wurden experimentell getestet (mit N-terminaler Biotin-Markierung)
Fragment Nr. SEQ ID Nr.

Peptidsequenz von bis Länge Protein
AI 1 EMQRKAPPRRRRHRNRA 5 21 17 Env
Bl 2 RMKLPSTKKAEPPTWAQ 36 52 17 Env
Cl 3 TKKAEPPTWAQLKKLTQ 42 58 17 Env
Dl 4 MPAGAAAANYTYWAYVP 92 108 17 Env
El 5 PIDDRCPAKPEEEGM I 136 152 17 Env
Fl 6 YPPICLGRAPGCLMPAV 160 176 17 Env
Gl 7 YQRSLKFRPKGKPCPKE 214 230 17 Env
Hl 8 FRPKGKPCPKEIPKESK 220 236 17 Env
A2 9 GKPCPKEIPKESKNTEV 224 240 17 Env
B2 10 GTIIDWAPRGQFYHNCS 260 276 17 Env
C2 11 RGQFYHNCSGQTQSCPS 268 284 17 Env
D2 12 DLTESLDKHKHKKLQSF 294 310 17 Env
E2 13 PWGWGEKGISTPRPKIV 312 328 17 Env
F2 14 PKIVSPVSGPEHPELWR 325 341 17 Env
G2 15 CP FPEQGTLDLKDWKR 50 66 17 Gag
H2 16 IGKELKQAGRKGNIIPL 67 83 17 Gag
A3 17 DCNENTRKKSQKETEGL 118 134 17 Gag
B3 18 TLKLEGKGPE VGPSES 164 180 17 Gag
C3 19 GPSESKPRGTSPLPAGQ 176 192 17 Gag
D3 20 QPQTQVKENKTQPPVAY 198 214 17 Gag
E3 21 PAELQYRPPPESQYGYP 219 235 17 Gag
F3 22 MPPAPQGRAPYPQPPTR 237 253 17 Gag
G3 23

EIIDKSRKEGDTEAWQF 270 286 17 Gag
H3 24 MPPGEGAQEGEPPTVEA 293 309 17 Gag
A4 25 MKEGVKQYGPNSPYMRT 322 338 17 Gag
B4 26 VQEQVQRNRAANPPVNI 378 394 17 Gag
<EMI ID=15.1>
N NA N NAACHGEREICHT
16 -
C4 27 LRAWEKIQDPGSTCPSF 428 444 17 Gag
D4 28 TVRQSSKEPYPDFVARL 446 462 17 Gag
E4 29 QSAIKPLKGKVPAGSDV 493 509 17 Gag
F4 30 TGREPPDLCPRCKKGKH 578 594 17 Gag
G4 31 LSGNEQRGQPQAPQQTG 610 626 17 Gag
H4 32 QPFVPQGFQGQQPPLSQ 631 647 17 Gag
A5 33 QLPQYNNCPPPQAAVQQ 654 670 17 Gag
B5 34 AINNKEPATRFQWKVLP 9 25 17 Pol
C5 35 ENRKIKPQKIEIRKDTL 109 125 17 Pol
D5 36 ILPKITRREPLENALTV 313 329 17 Pol
E5 37 FTDGSSNGKAAYTGPKE 330 346 17 Pol
F5 38 PKERVIKTPYQSAQRAE 344 360 17 Pol
G5 39 LPGPLTKANEEADLLVS 433 449 17 Pol
H5 40 LKNKFDVTWKQAKDIVQ 469 485 17 Pol
A6 41 PTQEAGVNPRGLCPNAL 496 512 17 Pol
B6 42 IWATCQTGESTSHVKKH 540 556 17 Pol
C6 43 VPEKIKTDNGPGYCSKA 566 582 17 Pol
D6 44 LVKQKEGGDSKECTTPQ 619 635 17 Pol
E6

45 AEQHLTGKKNSPHEGKL 659 675 17 Pol
F6 46 IWWKDNKNKTWEIGKVI 676 692 17 Pol
<EMI ID=16.1>

Aufgrund der experimentellen Ergebnisse wurde eine EpitopKartierung für den ausgewählten Anwärter-Bereich von env, Gl (AS 214-230) durchgeführt (siehe Tabelle 2) .
Tabelle 2: Liste der synthetischen Peptide des experimentell bestimmten immundominanten Teils des env-Proteins (Aminosäuren 204-244)
Peptid Nr. SEQ ID Nr.

Sequenz von - bis
1 47 PRVNYLQDFSYQRSLKF 204 - 220
2 48 RVNYLQDFSYQRSLKFR 205 - 221
3 49 VNYLQDFSYQRSLKFRP 206 - 222
<EMI ID=16.2>

NACHGEREICHT .. ..
- 17 -
4 50 NYLQDFSYQRSLKFRPK 207 - 223
5 51 YLQDFSYQRSLKFRPKG 208 - 224
6 52 LQDFSYQRSLKFRPKGK 209 - 225
7 53 QDFSYQRSLKFRPKGKP 210 - 226
8 54 DFSYQRSLKFRPKGKPC 211 - 227
9 55 FSYQRSLKFRPKGKPCP 212 - 228
10 56 SYQRSLKFRPKGKPCPK 213 - 229
11 = Gl 7 YQRSLKFRPKGKPCPKE 214 - 230
12 57 QRSLKFRPKGKPCPKEI 215 - 231
13 58 RSLKFRPKGKPCPKEIP 216 - 232
14 59 SLKFRPKGKPCPKEIPK 217 - 233
15 60 LKFRPKGKPCPKEIPKE 218 - 234
16 61 KFRPKGKPCPKEIPKES 219 - 235
17 = Hl 8 FRPKGKPCPKEIPKESK 220 - 236
18 62 RPKGKPCPKEIPKESKN 221 - 237
19 63 PKGKPCPKEIPKESKNT 222 - 238
20 64 KGKPCPKEIPKESKNTE 223 - 239
21 = A2 9 GKPCPKEIPKESKNTEV 224 - 240
22 65 KPCPKEIPKESKNTEVL 225 - 241
23 66 PCPKEIPKESKNTEVLV 226 - 242
24 67 CPKEIPKESKNTEVLVW 227 - 243
25 68

PKEIPKESKNTEVLVWE 228 - 244
26 (10 - 69 SYQRSLKFRPKGKPCPKEIP 213 - 232 13)
<EMI ID=17.1>

Die Sequenz jedes Peptids wurde durch eine Serie von 17Rest-Peptiden (ausschliesslich SGSG-Leader-Sequenz) repräsentiert, die eine Überlappung zwischen fortlaufenden Peptiden von 16 Resten haben.
Beispiel 6: Antigen-Herstellung
Mit Streptavidin beschichtete Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Mimotopes Pty Ltd., Australien) wurden mit 200 [mu]l/ Vertiefung 2% Rinderalbumin (Sigma-Aldrich) in PBST (PBS [0,1 M
NACHGEREICHT Natriumphosphat, 0,15 M NaCl, pH 7,0] + 0,1% V/V Tween 20 (PBST)) über Nacht bei 4[deg.]C blockiert. Die Vertiefungen wurden dann vier Mal mit PBST gewaschen und mit 100 [mu]l/Vertiefung biotinylierten Peptiden AI, Gl, Hl, E2, E3, 1:250 verdünnt, 2 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Ein Maus-spezifisches Peptid wurde als negative Kontrolle verwendet.

Die Platte wurde 4 Mal mit PBST gewaschen. 2-fache Serien-Verdünnungen des Melanom-Seren-Pools, enthaltend 1% des Referenz-Seren-Pools (wie oben beschrieben) in 1% Rinderalbumin/PBST wurden hergestellt. Die Platte wurde 4 Mal mit PBST gewaschen und mit 100 [mu]l/Vertiefung des sekundären Antikörpers, einem mit alkalischer Phosphatase konjugierten Ziegen-anti-human-IgG (h+1) Antikörper (BETHYL Laboratories, Inc., USA), inkubiert. Der Detektions-Antikörper wurde 1:1000 in Blockierungslösung verdünnt und 1 h lang inkubiert. Nach weiteren 6 Waschschritten mit PBST wurde die Reaktion mit 200 [mu]l/Vertiefung einer 1,0 mg/ml p-Nitrophenylphosphat-Substrat-Lösung in 0,2 M Tris-Puffer (Sigma-Aldrich) entwickelt.

Die Absorption wurde auf einem BDSL Immunoskan Plus bei 405 nm gemessen.
Beispiel 7: Peptid-Testen
NUNC Maxisorp F-Platten wurden mit 1,0 [mu]g Peptid/Vertiefung in 100 [mu]l Beschichtungspuffer (0,1 M Natriumcarbonat-Puffer, pH 9,5) beschichtet. 1 Vertiefung pro Platte wurde mit 100 [mu]l Beschichtungspuffer ohne Antigen (Blindwert-Vertiefung) beschichtet. Die Platten wurden über Nacht bei 4[deg.]C inkubiert. Danach wurden die Platten vier Mal mit PBST gewaschen. Unspezifische Bindungsstellen wurden mit 200 [mu]l/Vertiefung 2% Rinderalbumin (Sigma-Aldrich) in PBST (PBS + 0,1% V/V Tween 20 (PBST)) 1 h lang bei Raumtemperatur blockiert. Die Platten wurden 4 Mal mit PBST gewaschen. Für den Test wurden 100 [mu]l/Vertiefung von drei verschiedenen Seren-Pool-Verdünnungen (1:50, 1:200, 1:1600), verdünnt in 1% Rinder-Albumin/PBST, zugegeben und 2 h lang bei Raumtemperatur inkubiert.

Die Platten wurden 4 Mal mit PBST gewaschen und mit 100 [mu]l/Vertiefung des sekundären Antikörpers, einem mit alkalischer Phosphatase konjugierten Ziegen-anti-human IgG (h+1) Antikörper, bezogen von BETHYL Laboratories, Inc., USA (der Detektions-Antikörper war 1:1000 in Blockierungslösung verdünnt) 1 h lang inkubiert. Nach einem zusätzlichen 6-maligen Waschschritt mit PBST wurde die Farbe mit 200 [mu]l/Vertiefung einer 1,0 mg/ml p-Nitrophenylphosphat-Substrat-Lösung in 0,2 M Tris-Puffer (Sigma-Aldrich) entwickelt. Die Absorption wurde auf
NACHGEREICHT einem BDSL Immunoskan PLUS bei 405 nm gemessen.
Die Peptide wurden mit denselben Seren-Pools, wie für die obigen Experimente angegeben, getestet.

Als negatives KontrollPeptid wurde ein von HIV stammendes Peptid (GKLICTTTVPWNASWSNKSL) mit 1 [mu]g/Vertiefung verwendet.
Wie in Fig. 2 gezeigt, offenbarte die Inkubation der Peptide mit dem Melanom-Seren-Pool Absorptionswerte im Bereich zwischen 0,25 und 0,53. Das Referenz-Seren-Pool offenbarte Absorptionswerte unter 0,14. Von diesen 46 getesteten Peptiden waren die 5 am meisten reaktiven Peptide AI, E2, E3, Gl, Hl (SEQ ID Nr. 1, 7, 8, 13 bzw. 21). Die Peptide AI, Gl, Hl und E2 stammen von der env-Sequenz, und Peptid E3 stammt von der gag-Sequenz.
Fig. 4 zeigt weiters deutlich, dass die Peptide 9-14 (SEQ ID Nr. 55-59) eine signifikant höherer Reaktivität aufweisen als die anderen Peptide, was anzeigt, dass dieser Aminosäure-Abschnitt die Core-Epitop-Region darstellt.

Interessanterweise zeigte das Peptid Nr. 11 (Gl) in zwei unabhängigen Versuchen eine geringere Absorption im Test als die drei Nachbar-Peptide. Ein neu synthetisiertes, unbiotinyliertes 20-mer-Peptid, das die Sequenz von Peptiden 10-13 (SYQRSLKFRPKGKPCPKEIP, SEQ ID Nr. 69) abdeckt, zeigte keine signifikante Verbesserung im Vergleich zum unbiotinylierten 17-mer-Peptid Gl, was in einem unabhängigen Versuch bewiesen wurde.
Beispiel 8: Screening
NUNC Polysorp F Peptide Immobiliser-Platten wurden mit 0,125 [mu]g Peptid/Vertiefung in 100 [mu]l Beschichtungspuffer (0,1 M Natriumcarbonat-Puffer, pH 9,5) beschichtet. Die Platten wurden über Nacht bei 4[deg.]C inkubiert.

Die Platten wurden dann vier Mal mit PBST gewaschen, und unspezifische Bindungsstellen wurden mit 200 [mu]l/Vertiefung 2% Rinderalbumin (Sigma-Aldrich) in PBST (PBS + 0,1% V/V Tween 20 (PBST)) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur blockiert. Die Platten wurden 4 Mal mit PBST gewaschen. Für den Assay wurden 100 [mu]l/Vertiefung Serien-Verdünnungen der Seren (anfängliche Verdünnung 1:200 in 1% Rinderalbumin/PBST) zugegeben und 2 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden 4 Mal mit PBST gewaschen und mit dem sekundären Antikörper (100 [mu]l/Vertiefung) inkubiert. Als sekundärer Antikörper wurde ein mit alkalischer Phosphatase konjugiertes Ziegen-anti-humanIgG (h+1) (BETHYL Laboratories, Inc., USA), 1:1000 in Blockierungslösung verdünnt, verwendet. Der InkubationsZeitraum war 1
NACHGEREICHT Stunde.

Nach weiteren 6 Waschschritten mit PBST wurde das Substrat zugegeben (1,0 mg/ml p-Nitrophenylphosphat, (Sigma-Aldrich) in 0,2 M Tris-Puffer, 200 [mu]l/Vertiefung). Die Absorption wurde auf einem BDSL Immunoskan PLUS bei 405 nm gemessen. Beispiel 9: Vergleich mit dem Stand der Technik Herve et al. charakterisieren retrovirale Peptide im Zusammenhang mit Autoimmunerkrankungen. Interessanterweise überlappte ein antigenes Peptid (17') teilweise mit dem Peptid GHB-Gl und GHB-Hl. Alle drei Peptide wurden mit drei Melanom-Seren-PoolVerdünnungen (1:100, 1:200 und 1:1600) getestet. Die Peptide wurden auf Nunc Maxisorp F-Platten beschichtet und zum Einfangen von Serum-Antikörpern verwendet, welche dann unter Verwendung von Ziegen-anti-human-IgG-Antikörpern, wie in Fig. 5 gezeigt, detektiert wurden.

Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass das mit Autoimmunerkrankungen in Verbindung stehende Peptid 17' sich nicht signifikant vom negativen Kontroll-Peptid unterscheidet, wogegen die Peptide GHB-Hl und GHB-Gl Absorptionen über 0,50 bzw. beinahe 1,50 bei einer Melanom-Seren-Pool-Verdünnung von 1:50 zeigten. GHB-Gl gab ein Signal von 1,50 sogar bei einer Melanom-Seren-Pool-Verdünnung von 1:200.
Beispiel 10: Analyse von Serum-Proben von Melanom-Patienten: Zur Analyse von Serum-Proben von Melanom-Patienten wurden Nunc Polysorp Immobilizer Amino-Platten verwendet. Im Vergleich mit Maxisorp-Platten (Nunc) zeigten die Polysorp-Platten eine um 25% höhere Absorption bei Melanom-Seren und eine um 10% niedrigere Absorption bei negativen Seren.

Das optimierte ELISA-System wurde unter Verwendung von 31 Serum-Proben von Melanom-Patienten getestet. 16 Serum-Proben von gesunden Individuen dienten als Kontrollen, um einen negativen Schwellenwert zu etablieren, wie mittels der durchschnittlichen Absorption plus drei StandardAbweichungen berechnet. Ein Wert von 0,39 oder darüber wird als positiv definiert. Die Ergebnisse für das Gl-Epitop sind in Fig. 6 gezeigt, was deutlich zeigt, dass 15 von den 31 Melanom-SerumProben positiv reagierten, wogegen 16 Melanom-Seren das Gl-Epitop nicht erkannten.
NACHGEREICHT
- 21 -
L i t<[beta]>r a tu r s t e l l e n :
Venter et al., Science 291:1304-51, 2001
Lower et al., Proc Natl Acad Sei U S A. 93 (11) :5177-84, 1996
Barnstable et al., Cell 14(1): 9-20, 1978
Bronson et al., J. Natl . Cancer Inst . 60, 1305-1308, 1978
Lower et al., J. Gen. Virol. 65, 887-898, 1984
Turner et al., Curr.

Biol. 11, 1531-1535, 2001
Mayer et al., Nat Genet. 21(3):257-8, 1999
Muster et al., Cancer Res. 15; 63 (24) : 8735-41, 2003
Kleiman et al.. Int J Cancer. 110 (3) : 459-61, 2004
Kirkwood and Agarwala, Principles and Practice of Oncoloqv 7- 116, 1993
Herve et al., Clin Exp Immunol. 128 (1) : 75-82, 2002
Goedert et al., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 8(4 Pt l)-2936, 1999
Boiler et al., J Virol. 71 (6) : 4581-8, 1997
Reineke et al.,<j>Immunol Methods 267:37, 2002
Sauter et al., J Virol. 69 (1) :414-21, 1995
Singh et al., Nature Biotech. 17: 1075-1081, 1999
Depil et al., Leukemia. 16(2):254-9, 2002
Moles et al., Virus Res. 94 (2) : 97-101, 2002
Balch et al., J Clin Oncol. 19 (16) : 3635-48, 2001
King et al., Transcript of "Conference on Scientific Issues Related to Potential Allergenicity in Transgenic Food Crops," April 18-19, 1994.
NACHGEREICHT

Claims

* 22 - .. Patentansprüche:

1. Antigen, das ein Fragment einer Aminosäure-Sequenz des envoder gag-Proteins des Melanom-assoziierten endogenen Retrovirus

(MERV) ist, umfassend eine der Aminosäure-Sequenzen von EMQRKAPPRRRRHRNRA (SEQ ID NO 1), YQRSLKFRPKGKPCPKE (SEQ ID NO 7), FRPKGKPCPKEIPKESK (SEQ ID NO 8), FSYQRSLKFRPKGKPCP (SEQ ID NO 55), SYQRSLKFRPKGKPCPK (SEQ ID NO 56), QRSLKFRPKGKPCPKEI (SEQ ID NO 57), RSLKFRPKGKPCPKEIP (SEQ ID NO 58), SLKFRPKGKPCPKEIPK

(SEQ ID NO 59) oder SYQRSLKFRPKGKPCPKEIP (SEQ ID NO 69) .

1. Antigen, das ein Fragment einer Aminosäure-Sequenz des envoder gag-Proteins des Melanom-assoziierten endogenen Retrovirus (MERV) ist, umfassend eine der Aminosäure-Sequenzen von EMQRKAPPRRRRHRNRA, YQRSLKFRPKGKPCPKE, FRPKGKPCPKEIPKESK, FSYQRSLKFRPKGKPCP, SYQRSLKFRPKGKPCPK, QRSLKFRPKGKPCPKEI, RSLKFRPKGKPCPKEIP, SLKFRPKGKPCPKEIPK oder SYQRSLKFRPKGKPCPKEIP (SEQ ID Nr. 1, 7, 8, 55-59 bzw. 69) .

2. Antigen, das ein Fragment einer Aminosäure-Sequenz des Melanom-assoziierten endogenen Retrovirus (MERV) ist, umfassend eine der Aminosäure-Sequenzen von RMKLPSTKKAEPPTWAQ (SEQ ID NO 2), TKKAEPPTWAQLKKLTQ (SEQ ID NO 3), MPAGAAAANYTYWAYVP (SEQ ID NO 4), PIDDRCPAKPEEEGMMI (SEQ ID NO 5), YPPICLGRAPGCLMPAV (SEQ ID NO 6), GKPCPKEIPKESKNTEV (SEQ ID NO 9), GTIIDWAPRGQFYHNCS (SEQ ID NO 10), RGQFYHNCSGQTQSCPS (SEQ ID NO 11), DLTESLDKHKHKKLQSF (SEQ ID NO 12), PWGWGEKGISTPRPKIV (SEQ ID NO 13), PKIVSPVSGPEHPELWR (SEQ ID NO 14), CPWFPEQGTLDLKDWKR (SEQ ID NO 15), IGKELKQAGRKGNIIPL (SEQ ID NO 16), DCNENTRKKSQKETEGL (SEQ ID NO 17), TLKLEGKGPELVGPSES (SEQ ID NO 18), GPSESKPRGTSPLPAGQ (SEQ ID NO 19), QPQTQVKENKTQPPVAY (SEQ ID NO 20), PAELQYRPPPESQYGYP (SEQ ID NO 21), MPPAPQGRAPYPQPPTR (SEQ ID NO 22), EIIDKSRKEGDTEAWQF (SEQ ID NO 23), MPPGEGAQEGEPPTVEA (SEQ ID NO 24),

MKEGVKQYGPNSPYMRT (SEQ ID NO 25), VQEQVQRNRAANPPVNI (SEQ ID NO 26), LRAWEKIQDPGSTCPSF (SEQ ID NO 27), TVRQSSKEPYPDFVARL (SEQ ID NO 28), QSAIKPLKGKVPAGSDV (SEQ ID NO 29), TGREPPDLCPRCKKGKH (SEQ ID NO 30), LSGNEQRGQPQAPQQTG (SEQ ID NO 31), QPFVPQGFQGQQPPLSQ (SEQ ID NO 32), QLPQYNNCPPPQAAVQQ (SEQ ID NO 33), AINNKEPATRFQWKVLP (SEQ ID NO 34), ENRKIKPQKIEIRKDTL (SEQ ID NO 35), ILPKITRREPLENALTV (SEQ ID NO 36), FTDGSSNGKAAYTGPKE (SEQ ID NO 37), PKERVIKTPYQSAQRAE (SEQ ID NO 38), LPGPLTKANEEADLLVS (SEQ ID NO 39), LKNKFDVTWKQAKDIVQ (SEQ ID NO 40), PTQEAGVNPRGLCPNAL (SEQ ID NO 41), IWATCQTGESTSHVKKH (SEQ ID NO 42), VPEKIKTDNGPGYCSKA (SEQ ID NO 43), LVKQKEGGDSKECTTPQ (SEQ ID NO 44), AEQHLTGKKNSPHEGKL (SEQ ID NO 45), IWWKDNKNKTWEIGKVI (SEQ ID NO 46), PRVNYLQDFSYQRSLKF (SEQ ID NO 47), RVNYLQDFSYQRSLKFR (SEQ ID NO 48), VNYLQDFSYQRSLKFRP (SEQ ID NO 49), NYLQDFSYQRSLKFRPK (SEQ ID NO 50),

YLQDFSYQRSLKFRPKG (SEQ ID NO 51), LQDFSYQRSLK-

NACHGEREICHT .

R45313 - 2 - A807/2005

FRPKGK (SEQ ID NO 52), QDFSYQRSLKFRPKGKP (SEQ ID NO 53), DFSYQRSLKFRPKGKPC (SEQ ID NO 54), LKFRPKGKPCPKEIPKE (SEQ ID NO 60), KFRPKGKPCPKEIPKES (SEQ ID NO 61), RPKGKPCPKEIPKESKN (SEQ ID NO 62), PKGKPCPKEIPKESKNT( SEQ ID NO 63), KGKPCPKEIPKESKNTE (SEQ ID NO 64), KPCPKEIPKESKNTEVL (SEQ ID NO 65), PCPKEIPKESKNTEVLV (SEQ ID NO 66), CPKEIPKESKNTEVLVW (SEQ ID NO 67), PKEIPKESKNTEVLVWE (SEQ ID NO 68).

2. Antigen, das ein Fragment einer Aminosäure-Sequenz des Melanom-assoziierten endogenen Retrovirus (MERV) ist, umfassend eine der Aminosäure-Sequenzen von RMKLPSTKKAEPPTWAQ, TKKAEPPTWAQLKKLTQ, MPAGAAAANYTYWAYVP, PIDDRCPAKPEEEGMMI, YPPICLGRAPGCLMPAV, GKPCPKEIPKESKNTEV, GTIIDWAPRGQFYHNCS, RGQFYHNCSGQTQSCPS, DLTESLDKHKHKKLQSF, PWGWGEKGISTPRPKIV, PKIVSPVSGPEHPELWR, CPWFPEQGTLDLKDWKR, IGKELKQAGRKGNIIPL, DCNENTRKKSQKETEGL, TLKLEGKGPELVGPSES, GPSESKPRGTSPLPAGQ, QPQTQVKENKTQPPVAY, PAELQYRPPPESQYGYP, MPPAPQGRAPYPQPPTR, EIIDKSRKEGDTEAWQF, MPPGEGAQEGEPPTVEA, MKEGVKQYGPNSPYMRT, VQEQVQRNRAANPPVNI, LRAWEKIQDPGSTCPSF, TVRQSSKEPYPDFVARL, QSAIKPLKGKVPAGSDV, TGREPPDLCPRCKKGKH, LSGNEQRGQPQAPQQTG, QPFVPQGFQGQQPPLSQ, QLPQYNNCPPPQAAVQQ, AINNKEPATRFQWKVLP, ENRKIKPQKIEIRKDTL, ILPKITRREPLENALTV, FTDGSSNGKAAYTGPKE, PKERVIKTPYQSAQRAE, LPGPLTKANEEADLLVS, LKNKFDVTWKQAKDIVQ, PTQEAGVNPRGLCPNAL,

IWATCQTGESTSHVKKH, VPEKIKTDNGPGYCSKA, LVKQKEGGDSKECTTPQ, AEQHLTGKKNSPHEGKL, IWWKDNKNKTWEIGKVI (SEQ ID Nr. 2-6, 9-46), PRVNYLQDFSYQRSLKF, RVNYLQDFSYQRSLKFR, VNYLQDFSYQRSLKFRP, NYLQDFSYQRSLKFRPK, YLQDFSYQRSLKFRPKG, QDFSYQRSLKFRPKGKP, DFSYQRSLKFRPKGKPC, LKFRPKGKPCPKEIPKE, KFRPKGKPCPKEIPKES, RPKGKPCPKEIPKESKN, PKGKPCPKEIPKESKNT, KGKPCPKEIPKESKNTE, KPCPKEIPKESKNTEVL, PCPKEIPKESKNTEVLV, CPKEIPKESKNTEVLVW, PKEIPKESKNTEVLVWE (SEQ ID Nr. 47-54, 60-68).

3. Antigen, das ein Fragment einer Aminosäure-Sequenz des envoder gag-Proteins des MERV ist, umfassend ein Fragment von mindestens 6 kontinuierlichen Aminosäuren von einer der AminosäureSequenzen der SEQ ID Nr. 1, 7, 8, 55-59 oder 69.

4. Antigen, das ein Fragment einer Aminosäure-Sequenz des envoder gag-Proteins des MERV ist, umfassend ein Fragment von mindestens 8 kontinuierlichen Aminosäuren, vorzugsweise mit einer Länge von zwischen 8 und 15, insbesondere zwischen 8 bis 12 Aminosäuren, von einer der Aminosäure-Sequenzen der SEQ ID Nr. 1,

7, 8, 55-59 oder 69.

4. Antigen, das ein Fragment einer Aminosäure-Sequenz des envoder gag-Proteins des MERV ist, umfassend ein Fragment von min-

NACHGEREICHT destens 8 kontinuierlichen Aminosäuren, vorzugsweise mit einer Länge von zwischen 8 und 15, insbesondere zwischen 8 bis 12 Aminosäuren, von einer der Aminosäure-Sequenzen der SEQ ID Nr. 1, 7, 8, 55-59 oder 69.

5. Antigen, das ein Fragment einer Aminosäure-Sequenz des envoder gag-Proteins des MERV gemäss Anspruch 1 ist, umfassend eine der Aminosäure-Sequenzen von EMQRKA, MQRKAPPRRRRHRN, RKAPPRR, KAPPRRRRHRN, RRRRHRNRA, YQRSLK, QRSLKFRPKGKP, RSLKFRPKGK, SLKFRPKGKPCP, FRPKGKPCP, KGKPCPK, GKPCPKE, GKPCPKE, PCPKEIP, EIPKESK, KGKPCPKEIPKESK, FSYQRSL, SYQRSLKFRPK, YQRSLKFRP, RSLKFRP, KGKPCPKEI, FRPKGKPCPKEIP, GKPCPKEIPK.

6. Antigen, umfassend ein Mimotop eines Antigens nach einem der Ansprüche 1 bis 5.

7. Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend kovalent gebundenes Biotin.

8. Protein-Aggregat, umfassend ein nicht-antigenes Protein und ein Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 7.

9. Fusionsprotein, umfassend ein nicht-antigenes Protein und ein Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 7.

NACHGEREICHT R45313 - 3 - A807/2005

10. Antiserum, umfassend Antikörper gegen ein Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder ein Protein-Aggregat nach Anspruch 8 oder ein Fusionsprotein nach Anspruch 9.

11. Antikörper, gerichtet gegen ein Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder ein Protein-Aggregat nach Anspruch 8 oder ein Fusionsprotein nach Anspruch 9.

12. Verfahren zur Detektion von anti-MERV-Antikörpern in einer Probe unter Verwendung eines Antigens nach einem der Ansprüche 1 bis 7, umfassend die Schritte

(a) Kontaktieren der Probe mit den Antigenen, was zu einer Antikörper-Antigen-Reaktion zwischen dem Antikörper aus der Probe und dem Antigen führt, und

(b) Detektieren und gegebenenfalls Quantifizieren des antiMERV-Antikörpers durch die Bindung an das Antigen.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der anti-MERV-Antikörper entweder durch Bestimmen der Menge des Antikörper-gebundenen Antigens, oder der Menge des Antigen-gebundenen Antikörpers, oder der Menge des Antikörper-freien Antigens, oder der Menge des Antigen-freien Antikörpers quantifiziert wird.

14. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Antigen an einer Oberfläche immobilisiert wird.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei die Menge des Antikörper-freien Antigens durch mindestens einen zusätzlichen sekundären Antikörper detektiert wird, der ein detektierbares Marker-Signal erzeugt.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, welches ein Enzyme-linked Immunosorbent Assay ist.

17. Verfahren zur Melanom-Diagnose unter Verwendung eines Antigens nach einem der Ansprüche 1 bis 7, umfassend die Schritte

(a) Kontaktieren einer Probe mit den Antigenen, was zu einer Antikörper-Antigen-Reaktion zwischen Antikörpern aus der Probe und dem Antigen führt, und

(b) Detektieren und gegebenenfalls Quantifizieren des anti-

NACHGEREICH R45313 - 4 - A807/2005

MERV-Antikörpers durch die Bindung an das Antigen, wobei das Vorhandensein von Antigenen ein Melanom anzeigt.

18. Verfahren zur Detektion eines MERV-Proteins oder MERV-Protein-Fragments in einer Probe unter Verwendung eines gegen ein Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 7 gerichteten Antikörpers oder Antikörper-Fragments, umfassend die Schritte:

(a) Kontaktieren der Probe mit dem Antikörper, was zu einer Antikörper-Antigen-Reaktion zwischen dem Antikörper und dem MERV-Protein oder MERV-Protein-Fragment führt, und

(b) entweder Bestimmen der Menge des Antikörper-gebundenen MERV-Proteins oder MERV-Protein-Fragments, oder der Menge des MERV-Protein- oder MERV-Protein-Fragment-gebundenen Antikörpers, oder der Menge des Antikörper-freien MERV-Proteins oder MERV-Protein-Fragments, oder der Menge des MERVProtein- oder MERV-Protein-Fragment-freien Antikörpers.

19. Verfahren nach Anspruch 18 unter Verwendung eines Antigens nach einem der Ansprüche 1 bis 7 als kompetitives Antigen in Schritt (a) .

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei der kompetitive Antikörper an einer Oberfläche immobilisiert wird.

21. Verfahren zur Diagnostizierung von kanzerösen Zellen, umfassend die Schritte

(a) Vorsehen einer Probe der zu testenden Zellen oder eines Überstands davon,

(b) Analysieren, ob ein Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in der Probe vorhanden ist oder nicht, wobei

(c) das Vorhandensein des Antigens in der Probe kanzeröse Zellen diagnostiziert.

22. Verfahren nach Anspruch 21 zur Diagnose oder Prognose von Krebs, vorzugsweise eines Melanoms.

23. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder ein antigenes Protein-Aggregat nach Anspruch 8 oder ein antigenes Fusionsprotein nach Anspruch 9.

NACHGEREICHT - 5 -

R45313

A807/2005

24. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch . -Iche^Liters einen pharmazeutischen Träger und/oder em<A>d3uvans fasst.25. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 23 oder 24 als Vakzin.

(b) Detektieren und gegebenenfalls Quantifizieren des anti-

NACHGEREICHT MERV-Antikörpers durch die Bindung an das Antigen.

(b) Detektieren und gegebenenfalls Quantifizieren des antiMERV-Antikörpers durch die Bindung an das Antigen, wobei das Vorhandensein von Antigenen ein Melanom anzeigt.

18. Verfahren zur Detektion eines MERV-Proteins oder MERVProtein-Fragments in einer Probe unter Verwendung eines gegen ein Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 7 gerichteten Antikörpers oder Antikörper-Fragments, umfassend die Schritte:

(b) entweder Bestimmen der Menge des Antikörper-gebundenen MERV-Proteins oder MERV-Protein-Fragments, oder der Menge des MERV-Protein- oder MERV-Protein-Fragment-gebundenen Antikörpers, oder der Menge des Antikörper-freien MERV-Proteins oder MERV-Protein-Fragments, oder der Menge des MERV-

NACHGEREICHT

- 25 Protein- oder MERV-Protein-Fragment-freien Antikörpers.

(a) Vorsehen einer Probe der zu testenden Zellen oder eines Überstands davon,

23. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder ein antigenes ProteinAggregat nach Anspruch 8 oder ein antigenes Fusionsprotein nach Anspruch 9.

24. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 23, welche weiters einen pharmazeutischen Träger und/oder ein Adjuvans umfasst.

25. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 23 oder 24 als Vakzin.

26. Set zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 12 bis 22, umfassend ein Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 7, einen ersten Antikörper, der gegen ein Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 7 gerichtet ist, einen mit einem Marker verbundenen sekundären Antikörper, der gegen die Fc-Region des ersten Antikörpers gerichtet ist, Puffer-Substanzen, positive Kontroll-Standards, welche Zusammensetzungen sind, die

NACHGEREICHT ein Protein oder Protein-Fragment von MERV enthalten, und negative Kontroll-Standards, welche Zusammensetzungen sind, die ein Protein oder Protein-Fragment enthalten, das nicht vom MERV-Genom codiert ist.

27. Set nach Anspruch 26, wobei das Antigen an einem festen Träger immobilisiert ist.

NACHGEREICHT R45313 - 1 - A807/2005

Patentansprüche:

,6 Set zur Durchführung eines Verfahrens nach einem<d>er An-12 b s 22 umfassend ein Antigen nach einem der<A>nsprüspruche 12 bis ll , "" Antigen nach ehe 1 bis 7, einen ersten ^tr. rper d r , en er g^ ^_ einem derAnsprüche 1 bis 7 gerichtetst, enen mkererbundenen - ren Anti-per<e>r ^^ ^ . des ersten Antikörpers gerichtet ist, PutreveKontroll-Standards, welche Zusammensetzungen snd d e Protein oder Protein-Fragment von MERV enthalten und [pi]<[beta]>gat- -mi Standards, welche Zusammensetzungen snd, de em Kontroll-Stan[alpha]ar[alpha]s,<w>nicht vom MERV-Genom tein oder Protein-Fragment enthalten,<d>as ncht vom codiert ist.27.S[beta]t nach Anspruch 26, wobei das Antigen an einem festen

Träger immobilisiert ist.

NACHGEREICHT