AT503530A1 - Polypeptid mit allergenen eigenschaften - Google Patents

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AT503530A1 AT0073306A AT7332006A AT503530A1 AT 503530 A1 AT503530 A1 AT 503530A1 AT 0073306 A AT0073306 A AT 0073306A AT 7332006 A AT7332006 A AT 7332006A AT 503530 A1 AT503530 A1 AT 503530A1
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Description

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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polypeptid mit aller-genen Eigenschaften.
Mehr als 25% der Bevölkerung der Industrieländer leiden an durch IgE-vermittelten Allergien. Allergische Patienten sind durch die gesteigerte Produktion von IgE-Antikörpern gegen an sich harmlose antigene (d.h., Allergene) gekennzeichnet. Die unmittelbaren Symptome der Typ I-Allergie (allergische Rhinokon-junktivitis, Asthma, Dermatitis, anaphylaktischer Schock) werden durch eine Allergen-induzierte Vernetzung von an Mastzellen gebundenen IgE-Antikörpern und die Freisetzung biologisch aktiver Vermittler (z.b. Histamin, Leukotriene) bewirkt.
Hausstaubmilben (house dust mites, HDMs) stellen weltweit eine der wichtigsten Allergenquellen dar. Beinahe 10% der Bevölkerung und mehr als 50% der allergischen Patienten sind gegen Milben-Allergene sensibilisiert. Die HDM Dermatophagoides ptero-nyssinus (Der p) herrscht in Mitteleuropa vor. Die Allergene der Der p umfassen mehr als 30 Proteine oder Glykoproteine, von welchen 21 Allergene bisher charakterisiert wurden. Die Allergene der Gruppe 1 und 2 (Der p 1 und Der p 2 stellen die wichtigsten Allergene von HDM dar, welche von mehr als 80% der gegen Der p allergischen Patienten erkannt werden, es zeigte sich aber auch, dass andere HDM-Allergene (z.B. Der p 5 und Der p 7) trotz einer wesentlich geringeren IgE-Bindungs-Häufigkeit wichtige Der p-Allergene darstellen.
Rohe HDM-Extrakte, die derzeit für die Diagnose und Therapie von gegen HDM allergischen Patienten verwendet werden, sind nur für Der p 1 und Der p 2 standardisiert, wogegen andere wichtige Allergene nur in geringen Mengen in HDM-Extrakten vorhanden sind.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, neue Polypeptide mit allergenen und hypoallergenen Eigenschaften vorzusehen, die bei der Diagnose, Therapie und Prävention von Allergien, insbesondere der Hausstaubmilben-Allergie, verwendet werden können.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung ein Polypeptid, umfassend eine Aminosäure-Sequenz mit mindestens 60% Identität mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1, oder umfassend mindestens ein Aminosäure-Fragment mit mindestens 6 aufeinander folgenden Aminosäureresten der Aminosäure-Sequenz SEQ ID Nr. 1, oder mit einer immunologischen Kreuzreaktivität mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1 oder Fragmenten davon, wobei die Aminosäuresequenz
NACHGEREICHT
- 2 - SEQ ID Nr. 1 für ein Allergen codiert und das Polypeptid mindestens ein T-Zell-Epitop aufweist, das von einem T-Zell-Rezeptor erkannt wird, der für ein Molekül mit der Aminosäure-Sequenz SEQ ID Nr. 1 spezifisch ist.
Das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1 ist ein neues Der p-Hauptallergen, welches beispielsweise für die Diagnose und Therapie von gegen Der p allergischen Patienten nützlich sein kann. Dieses neue Der p-Allergen hat ein Molekulargewicht von etwa 8 kDa und bindet IgE von mehr als 50% der gegen Milben allergischen Patienten.
Die große IgE-Bindungshäufigkeit des Allergens mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1 und die Beobachtung, dass dieses Allergen biologisch aktiv ist, machen es zu einem wichtigen Molekül für die Diagnose der Hausstaubmilben-Allergie bei einem Individuum.
Weiters ist dieses neue Milben-Allergen auch für die Therapie oder Prävention der Hausstaubmilben-Allergie nützlich Das Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung induziert hohe Titer spezifischer IgG-Antikörper in Säugern. Wenn diese spezifischen IgG-Antikörper einem Individuum verabreicht werden, wird das Hausstaubmilben-Allergen, das einer Probe, vorzugsweise einem Serum eines gegen Hausstaubmilben allergischen Individuums, zugesetzt wurde und IgE-Moleküle des Individuums enthält, die an dieses neue Allergen binden, inhibiert. Dies zeigt, dass eine Allergen-spezifische Immuntherapie mit diesem neuen Milben-Allergen bei Menschen blockierende IgG-Antikörper induzieren wird. Die Bedeutung der Induktion blockierender IgG-Antikörper für eine erfolgreiche Immuntherapie wurde kürzlich bei Immuntherapie-Versuchen mit definierten Allergenen und Allergen-Derivaten gezeigt (Gafvelin G., et al., (2005) Int. Arch. Allergy Immunol. 138:59; Jutel, M., et al., (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:608). Große Mengen an Allergen-spezifischen IgG-Antikörpern wurden induziert, die eine Allergen-induzierte Basophilen-Degra-nulation hemmten (Niederberger, V., et al. (2004) PNAS USA 101 Suppl. 2:14677). Modifikationen des Polypeptids gemäß der vorliegenden Erfindung, die allergene Eigenschaften aufweisen, welche zu hypoallergenen Derivaten mit verringerter allergener Aktivität und konservierter Immunogenität führen, können die Immuntherapie durch die Verringerung anaphylaktischer Nebenwirkungen weiter verbessern (Valenta, R., et al., (2004) Adv. Immunol.
NACHGEREICHT - 3 • · • · ·· ·· ♦·
82:105). Hypoallergene Derivate können mittels molekularbiologischer Techniken oder durch die Synthese von Peptiden, die vom T-Zell- oder B-Zell-Epitopen des Allergens stammen, erzeugt werden (Kyte, J., und R.F. Doolittle. (1982) J. Mol. Biol. 157:105).
Wie hierin verwendet bezieht sich ein „Polypeptid" auf ein Molekül, welches mindestens 6 Aminosäurereste, vorzugsweise mindestens 8 Aminosäurereste, umfasst.
Der Ausdruck „Identität", wie hierin verwendet, gibt an, ob irgendwelche zwei (oder mehrere) Peptid-, Polypeptid- oder Protein-Sequenzen Aminosäuresequenzen aufweisen, die bis zu einem bestimmten Grad („% Identität") miteinander identisch sind. Dieser Grad kann unter Verwendung bekannter Computer-Algorithmen, wie dem „FAST A"-Programm bestimmt werden, wobei beispielsweise die Standardparameter („default parameters") wie in Pearson et al. (1988) PNAS USA 85: 2444 verwendet werden (andere Programme inkludieren das GCG program package (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research (1984) Nucleic Acids Res., 12, 387-395), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F., et al. , J Molec Biol 215: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, Hrg., Academic Press, San Diego, 1994, und Carillo et al, (1988)SIAM J Applied Math 48 : 1073) . Beispielsweise kann das BLAST-Tool der NCBI-Datenbank zur Bestimmung der Identität verwendet werden. Zu anderen im Handel oder öffentlich erhältlichen Programmen zählen das DNAStar "MegAlign"-Programm (Madison, WI) und das University of Wisconsin Genetics Computer Group(UWG) "Gap"-Programm (Madison, WI)). Die prozentuelle Identität von Protein-Molekülen kann weiters beispielsweise durch Vergleich der Sequenz-Information unter Verwendung eines GAP-Computer-Programms bestimmt werden (z.B. Needleman et al., (1970) J. Mol. Biol. 48:443, in der Neubearbeitung von Smith und Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482). Kurz gesagt definiert das GAP-Programm die Identität als Anzahl der fluchtenden Symbole (d.h., Nukleotide oder Aminosäuren) , die identisch sind, geteilt durch die Gesamtzahl der Symbole in der kürzeren der beiden Sequenzen. Die Standardparameter für das GAP-Programm können inkludieren: (1) eine un-äre Vergleichs-Matrix (enthaltend einen Wert von 1 für Identitäten und für Nicht-Identitäten) und die gewichtete Vergleichsmatrix von Gribskov et al., 14:6745, wie von Schwartz und Dayhoff, Hrsg., ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, S. 353-358 (1979) beschrie-
NACHGEREICHT ben; (2) ein Pönale von 3,0 für jede Lücke und ein zusätzliches 0,10-Pönale für jedes Symbol in jede Lücke; und (3) kein Pönale für End-Lücken.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Aminosäuresequenz zu mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 80%, mehr bevorzugt mindestens 90%, am meisten bevorzugt mindestens 95%, insbesondere 100%, identisch mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1.
Wie hierin verwendet bezieht sich „Kreuzreaktivität" auf die Fähigkeit eines Antikörpers, neben dem Antigen (z.B. Peptid, Protein, Polypeptid), das seine Produktion in einem in vivo-Sys-tem stimulierte, andere Antigene zu binden. Dies bedeutet, dass ein Antikörper, der zur spezifischen Bindung eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1 oder Fragmenten davon erzeugt wurde, auch eine Bindungsaffinität für ein Polypeptid aufweisen kann, das nicht mit der SEQ ID Nr. 1 homolog ist. Die Bindungsspezifität eines Antikörpers an ein Polypeptid kann mit im Stand der Technik bekannten Methoden, z.B. ELISA, RIA, Immu-noblot usw., wie von Valenta et al. J. Exp. Med. (1992) 175: 377-385 beschrieben, bestimmt werden.
Das Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise mit irgendeinem auf dem Gebiet bekannten Verfahren re-kombinant erzeugt. Der Wirt, in dem dieses Polypeptid erzeugt werden kann, kann von jeglicher Ärt sein, indem korrespondierende Vektoren und Plasmide (z.B. eukaryontische Zellen, vorzugsweise Hefen, Säugerzellen, Pflanzenzellen und Insektenzellen, und prokaryontische Zellen, vorzugsweise Escherichia coli und Bacillus subtilis) verwendet werden. Natürlich ist es auch möglich, die Polypeptide der vorliegenden Erfindung chemisch mittels auf dem Gebiet bekannter Methoden herzustellen.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Polypeptid hypoallergen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „hypoallergen" auf die Fähigkeit eines Peptids, Polypeptids oder Proteins, das von einem Allergen mit allergenen—Eigenschaften stammt, die Produktion von Antikörpern zu induzieren, welche spezifisch an dieses Allergen binden, und die verringerte oder keine allergischen Reaktionen zeigen, wenn sie einem Individuum verabreicht werden. Die verringerte oder fehlende Fähigkeit „hypoallergener" Derivate eines Allergens wie SEQ ID Nr. 1, eine allergische Re-
NACHGEREICHT aktion bei einem Individuum hervorzurufen, wird durch Entfernen oder Zerstören der IgE-bindenden Epitope dieser Allergene erhalten, wobei jedoch die an diesen Allergenen vorhandenen T-Zell-Epitope erhalten bleiben. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass das Allergen in Fragmente mit verringerter oder keiner IgE-Bindungskapazität gespalten wird und einige oder alle dieser Fragmente in einer Reihenfolge miteinander fusioniert werden, die nicht der Reihenfolge der Fragmente im Wildtyp-Allergen entspricht (vgl. z.B. EP 1 440 979). Ein anderes Verfahren zur Herstellung „hypoallergener" Moleküle aus Allergenen ist mit C- und/oder N-terminalen Deletionen des Wildtyp-All-ergens verbunden (vgl. z.B. die EP 1 224 215) .
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden diese Aminosäure-Fragmente in einer Reihenfolge miteinander fusioniert, die sich von der Reihenfolge der Fragmente in SEQ ID Nr. 1 unterscheidet.
Das Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung kann von der SEQ ID Nr. 1 stammende Aminosäure-Fragmente umfassen, die vorzugsweise in einer Reihenfolge miteinander fusioniert sind, die sich von der Reihenfolge in SEQ ID Nr. 1 unterscheidet. Diesej „Umordnen" ergibt ein Polypeptid mit veränderten Merkmalen im Vergleich zum Wildtyp-Allergen mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1. Beispielsweise ergibt diese Umordnung ein Polypeptid mit intakten T-Zell-Epitopen und zerstörten B-Zell-Epitopen. Ein solches Molekül kann hypoallergene Eigenschaften haben.
Das mindestens eine Aminosäure-Fragment, welches im Wesentlichen aus einem T-Zell-Epitop besteht, ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäure-Molekülen umfassend die Aminosäuren 5 bis 13, 9 bis 17, 10 bis 18, 11 bis 19, 12 bis 20, 16 bis 24, 17 bis 25, 43 bis 51, 44 bis 52, 45 bis 53, 47 bis 55, 51 bis 59 und 60 bis 68 von SEQ ID Nr. 1.
Um in einem Individuum bei Verabreichung eines Polypeptids gemäß der vorliegenden Erfindung eine T-Zell-Immunantwort hervorzurufen, muss das Polypeptid T-Zell-Epitope aufweisen. T-Zell-Epitope umfassen mindestens 6, vorzugsweise mindestens 7, mehr bevorzugt mindestens 8 aufeinanderfolgende Aminosäurereste der Seq ID Nr. 1. Diese T-Zell-Epitope können auch über einen Linker oder ohne einen Linker an einen Träger gebunden sein. Der Träger kann ein fester Träger sein, wie er in der Microarray-Technologie verwendet wird. Die Gegenwart von T-Zell-Epitopen in
NACHGEREICHT • · • · • · · ······« · · ·· ·· ·· · ···· ·· - Ο “ einem Polypeptid kann mittels auf dem Gebiet bekannter Methoden festgestellt werden (vgl. z.B. „Epitope Mapping: A practical ap-proach" Hrsg. 0. Westwood and F. Hay, 2001, Oxford University Press). Ein besonders bevorzugtes Verfahren ist ELISpot (Tobey TW und Caulfield MJ (2004), Methods Mol. Med. 94:121-132).
Die identifizierten T-Zell-Epitope können N- oder C-terminal mit anderen Molekülen, wie Proteinen, fusioniert sein, oder sie können Teil eines größeren, durch Fragmentierung aus SEQ ID Nr. 1 erhaltenen Fragments sein.
Noch ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein DNA-Molekül, das für ein Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung codiert.
Noch ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Vektor, der ein DNA-Molekül gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst.
Bevorzugte Vektoren (z.B. Plasmide), die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, sind Klonier- sowie Expressions-Vektoren umfassende Promotoren, ein Replikationsursprung, regulatorische Elemente, Selektionsmarker und/oder andere Vektor-Elemente. Wenn der Vektor ein Integrationsvektor ist, der in das Genom der Wirtszelle integriert werden kann, können entsprechende Mittel am Vektor vorgesehen sein (z.B. Insertions-Se-quenz-Elemente). Die Art des verwendeten Vektors und die am Vektor vorhandenen regulatorischen Elemente hängen auch davon ab, in welche Wirtszelle der Vektor integriert wird. Wenn Expressions-Vektoren verwendet werden, ist das erfindungsgemäße DNA-Molekül, das für ein Polypeptid wie oben beschrieben codiert, funktionell mit einer Promotor-Region verknüpft.
Noch ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine mit einem Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung transformierte Zelle.
Die dabei zu verwendende Zelle kann eine eukaryontische sowie eine prokaryontische Zelle sein. Bevorzugte eukaryontische Zellen sind Hefezellen, insbesondere Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris und Hansenula polymorpha, Pflanzenzellen, insbesondere Tabakpflanzenzellen, Insektenzellen und Säugerzellen, wie Human- und Tierzellen, insbesondere Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters. Bevorzugte polykaryontische Zellen sind z.b. Bacillus subtilis und Escherichia coli. Eine Zelle, die einen Vektor oder ein DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung umfasst,
NACHGEREICHT kann zur Herstellung eines Polypeptids gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Antikörper, der an ein Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung bindet.
Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung inkludieren -ohne darauf eingeschränkt zu sein - polyklonale, monoklonale, multispezifische, humanisierte oder Chimäre Antikörper, Einzelkett en-Antikörper, Fab-Fragmente F(ab')-Fragmente und Epitopbindende Fragmente von jedem der Obigen. Weiters werden Antikörper als Immunglobulin-Moleküle und immunologisch aktive Teile von Immunglobulin-Molekülen angesehen, d.h. Moleküle, die eine Antigen-Bindungsstelle enthalten, die ein Antigen immunspezifisch bindet. Die Immunglobulin-Moleküle der Erfindung sind vorzugsweise vom Typ IgG, IgM, IgD, IgA und IgY, der Klasse (z.B. IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl und IgA2) oder der Unterklasse des Immunglobulin-Moleküls.
Polyklonale Antikörper können durch Verabreichen eines Polypeptids gemäß der Erfindung, vorzugsweise unter Verwendung eines Adjuvans, an einen nicht-humanen Säuger und Sammeln des resultierenden Antiserums hergestellt werden. Verbesserte Titer sind durch über einen Zeitraum wiederholte Injektionen erhältlich. Es gibt keine bestimmte Einschränkung auf die Säuger-Spezies, die für das Hervorrufen von Antikörpern verwendet werden kann; es ist allgemein bevorzugt, Kaninchen oder Meerschweinchen zu verwenden, doch können auch Pferde, Katzen, Hunde, Ziegen, Schweine, Ratten, Kühe, Schafe, Kamele usw. verwendet werden. Bei der Herstellung von Antikörpern wird eine bestimmte Menge des Immu-nogens der Erfindung beispielsweise mit physiologischer Kochsalzlösung zu einer geeigneten Konzentration verdünnt, und die resultierende verdünnte Lösung wird beispielsweise mit vollständigem Freundschen Adjuvans gemischt, um eine Suspension herzustellen, oder mit Mineral-Gelen, wie Aluminiumhydroxid, oberflächenaktiven Substanzen, wie Lysolecithin, Pluronic-Polyo-len, Polyanionen, Peptiden, Öl-Emulsionen, Schlüsselloch-Napfschnecken („keyhole limpet")-Haemocyaninen, Dinitrophenol und potentiell nützlichen humanen Adjuvantien, wie BCG (Bacillus Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum. Die Suspensionen und Mischungen werden Säugern z.B. intraperitoneal verabreicht, beispielsweise einem Kaninchen, wobei von etwa 50 pg bis etwa
NACHGEREICHT • · ♦ · • · ♦ ·
2500 pg Polypeptid der Erfindung pro Verabreichung verwendet werden. Die Suspension wird vorzugsweise etwa alle zwei Wochen über einen Zeitraum von bis zu etwa 2-3 Monaten, vorzugsweise etwa 1 Monat, verabreicht, um eine Immunisierung zu bewirken. Antikörper wird gewonnen, indem dem immunisierten Tier nach Ablauf von 1 bis 2 Wochen nach der letzten Verabreichung Blut entnommen wird, das Blut zentrifugiert wird und Serum vom Blut isoliert wird.
Monoklonale Antikörper können beispielsweise humanen oder murinen Ursprungs sein. Murine monoklonale Antikörper können mit dem Verfahren von Köhler und Milstein (Köhler, G. und Milstein, C., Nature 256 (1975) 495) hergestellt werden, beispielsweise durch Fusionieren von Milzzellen hyperimmunisierter Mäuse mit einer geeigneten Maus-Myeloma-Zelllinie.
Ein chimärer Antikörper ist ein Molekül, bei welchem verschiedene Teile des Antikörpers von verschiedenen Tier-Spezies stammen, wie Antikörper mit einer variablen Region, die von einem murinen monoklonalen Antikörper stammt, und einer Human-Im-munglobulin-konstanten Region. Verfahren zur Herstellung chimärer Antikörper sind auf dem Gebiet bekannt. Vgl. z.B. Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202; US 5,807,715; US 4,816,567 und US 4,816,397.
Humanisierte Antikörper sind Antikörper-Moleküle einer nicht-humanen Spezies, ein Antikörper, der das gewünschte Antigen bindet, welches eine oder mehrere komplementäre determinierende Regionen (CDRs) aus der nicht-humanen Spezies und Rahmen-Regionen aus einem humanen Immunglobulin-Molekül hat. Häufig werden Rahmen-Reste in den humanen Rahmen-Regionen mit dem entsprechenden Rest aus dem CDR-Donor-Antikörper substituiert, um die Antigen-Bindung zu verändern, vorzugsweise zu verbessern. Diese Rahmen-Substitutionen sind durch auf dem Gebiet gut bekannte Verfahren identifiziert, z.B. durch Modellieren der Wechselwirkungen von CDR und Rahmen-Resten, um Rahmen-Reste zu identifizieren, die für eine Antigen-Bindung wichtig sind, und einen Sequenz-Vergleich, um ungewöhnliche Rahmen-Reste an bestimmten Positionen zu identifizieren (vgl. beispielsweise Queen et al., US 5,585,089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)). Antikörper können humanisiert werden, indem verschiedene auf dem Gebiet bekannte Techniken verwendet werden, einschließlich bei-
NACHGEREICHT 9 • ♦ • · • · • · · • ·· • · · • · · · · · ·· ·· ♦♦ • · • · · ♦ · · • ··· • · ··»* ·· spielsweise CDR-Grafting (EP 239,400; WO 91/09967; US 5,225,539; US 5,530,101; und US 5,585,089), Furnieren („veneering") oder Oberflächenerneuern („resurfacing") (EP 592,106, EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska et al., PNAS 91:969-913 (1994) und Ketten-Umordnung („chain shuffling")(US 5,565,332).
Die Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung können vorteilhaft zur passiven Immunisierung eines Individuums, das an einer Allergie, insbesondere an einer Hausstaubmilben-Allergie, leidet, verwendet werden. Für eine passive Immunisierung ist der Antikörper vorzugsweise ein IgG oder ein Derivat davon (z.B. ein chimärer oder humanisierter Antikörper). Weiters kann dieser Antikörper auch zur Desensibilisierung eines Individuums verwendet werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Vakzin-Formulierung, die ein Polypeptid oder einen Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst.
Neben dem Polypeptid oder dem Antikörper kann die Formulierung gemäß der vorliegenden Erfindung auch andere Substanzen, wie Stabilisatoren, Adjuvantien, pharmazeutisch akzeptable Träger usw. umfassen. Geeignete Protokolle für die Herstellung von Vakzin-Formulierungen sind dem Fachmann bekannt und z.B. in „Vaccine Protocols" (A. Robinson, M.P. Cranage, M. Hudson; Humana Press Inc. U.S.; 2. Ausgabe 2003) zu finden.
Noch ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Polypeptids gemäß der vorliegenden Erfindung für die Diagnose einer Allergie, insbesondere einer Hausstaubmilben-Allergie, bei einem Individuum.
Dieses Polypeptid kann zur Diagnoese einer Allergie, insbesondere einer Hausstaubmilben-Allergie verwendet werden, indem z.B. eine Probe eines Individuums, die Histamin-freisetzende Zellen aufweist, dem Polypeptid ausgesetzt wird (vgl. z.B. Puro-hit et al., Clin. Exp. Allergy 35 (2005): 186-192). Weiters kann (können) das (die) Polypeptid(e) gemäß der vorliegenden Erfindung auf einer Oberfläche immobilisiert sein, um ein(en) Poly-peptid-Array/Chip zu bilden solche Arrays können beispielsweise bei Screenings mit hohem Durchsatz verwendet werden, um eine Allergie in einer Reihe von Proben, die von einer Reihe von Individuen entnommen wurden, zu diagnostizieren.
NACHGEREICHT - 10 • · · • · · • t · • · · • · • ♦ • ♦ ·· ·· • · · · · • · · · • · ··· • · · • ···· ··
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Polypeptids oder eines Antikörpers gemäß der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Medikaments für die Immuntherapie einer Allergie, insbesondere der Hausstaubmilben-Allergie.
Die Polypeptide und Antikörper der vorliegenden Erfindung könen zur aktiven Impfung bzw. passiven Impfung verwendet werden. Beides kann verwendet werden, weil die Bildung schützender IgGs induziert wird, wenn ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung einem Individuum verabreicht wird, und die Verabreichung von gegen dieses Polypeptid gerichteten Immunglobulinen führt zum Wettbewerb zwischen IgE und verabreichten schützenden Antikörpern, was wiederum die Symptome der Allergie erleichtert.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder eines Antikörpers gemäß Anspruch 7 zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention einer Allergen-Sensibilisierung, insbesondere einer Hausstaubmilben-Allergen-Sensibilisierung.
Das für die Impfung eines Individuums verwendete Polypeptid ist vorzugsweise hypoallergen. Die Verwendung eines solchen Po-lypeptids verhindert die Bindung von IgE an das Polypeptid und verhindert somit eine allergische Reaktion.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das Medikament weiters Adjuvantien, Träger, Verdünnungsmittel, Konservierungsmittel oder Mischungen davon.
Das Medikament umfasst vorzugsweise 10 ng bis 1 g, mehr bevorzugt 100 ng bis 10 mg, insbesondere 0,5 pg bis 200 pg des Polypeptids .
Die vorliegende Erfindung ist durch die folgenden Figuren und Beispiele weiter veranschaulicht, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein.
Fig. 1 zeigt die cDNA und Aminosäuresequenz des von Klon 30 abstammenden Allergens. Das Start-Codon und das Stop-Codon sind unterstrichen. Die Signalsequenz umfasst die Aminosäurereste 1 bis 21 mit der vorhergesagten Schnittstelle zwischen den Aminosäureresten 21 (A) und 22 (A) fett gedruckt. Die Zahlen an der linken Seite der Sequenz geben die Nukleotid-Positionen und die Zahlen an der rechten Seite der Sequenz die Aminosäure-Positionen an.
Fig. 2 zeigt eine Coomassie-Blue-Färbung und eine Massen- Γnachgereicht 11
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Spektroskopie (MS) des von Klon 30 stammenden Allergens. A, Das Coomassie-Blue-gefärbte SDS-PAGE-Gel zeigt einen Molekulargewicht-Marker (M) und 3 pg gereinigtes, von Klon 30 stammendes Allergen (30). B, Die MS-Analyse des gereinigten, von Klon 30 stammenden Allergens zeigt das Masse/Ladungs-Verhältnis auf der x-Achse und die Signal-Intensität auf der y-Achse als Prozentsatz des stärksten Signals, das im untersuchten Massen-Bereich erhalten wurde. Der Peak bei 7979,20 entspricht der berechneten Masse der abgeleiteten Aminosäure-Sequenz des von Klon 30 stammenden Allergens.
Fig. 3 zeigt einen Immunoblot des von Klon 30 stammenden Allergens. Proben des gereinigten, von Klon 30 stammenden Allergens wurden mittels SDS-PAGE getrennt, auf Nitrozellulose ge-blottet und mit Seren von zwei gegen Milben allergischen Patienten (1, 2) und einem Serum von einem nicht-allergischen Individuum (3) inkubiert. Gebundene IgE-Antikörper, die für das von Klon 30 stammende Allergen spezifisch sind, wurden mit mit 125I-markierten anti-Human-IgE-Antikörpern nachgewiesen.
Fig. 4 zeigt die IgE-Reaktivität eines Kaninchen-anti-Klon 30-abgeleiteten Allergen-Antiserums. Das von Klon 30 stammende Allergen und das Milben-Hauptallergen, Der p 2, wurden auf Nitrozellulose-Streifen punktweise aufgetragen und mit 1:1000-1:1,000.000 verdünntem Kaninchen-Präimmunserum (A) oder mit Kaninchen-anti-Klon 30-abgeleitetem Allergen-Antiserum (B) inkubiert. Gebundene IgG-Antikörper wurden mit mit 125I-markierten anti-Kaninchen-Gesamtantikörpern vom Esel nachgewiesen.
Fig. 5 zeigt die biologische Aktivität des von Klon 30 stammenden Allergens. Blutproben von einem gegen Milben allergischen Patienten wruden 10 pg/ml, 1 pg/ml und 0,1 pg/ml des von Klon 30 stammenden Allergens, und 1 pg/ml anti-IgE-Antikörpern oder PBS als Puffer-Kontrolle (Co) (x-Achse) ausgesetzt. Die CD203c-Ex-pression wurde mittels FACS-Analyse bestimmt und ist als mittlerer Fluoreszenz-Index (MFI) gezeigt (y-Achse).
Fig. 6A zeigt eine Analyse der Hydrophobizität (Kyte & Doo-little) des reifen von Klon 30 stammenden Allergens unter Verwendung von ProtScale. Die Aminosäure-Positionen des reifen Proteins einschließlich eines N-terminalen Methionins sind auf der x-Achse gezeigt. Fig. 6B zeigt eine Vorhersage möglicher T-Zell-Epitope des von Klon 30 stammenden Allergens mit MULTIPRED, einem Rechensystem auf Web-Basis. Die Zahlen an jeder Seite der nachgereic, .. i 12 ·· • · • · ·« ·· • · * ·»·· ··
Sequenz zeigen die Aminosäure-Positionen des reifen von Klon 30 stammenden Allergens an. BEISPIELE:
Die vorliegenden Beispiele beschreiben die Identifikation eines neuen Der p-Hauptallergens, welches beispielsweise für die Diagnose und Therapie von gegen Der p allergischen Patienten nützlich sein kann.
Die für dieses neue Milben-Allergen codierende cDNA wurde aus einer Der p-Expressions-cDNA-Bibliothek isoliert und in Escherichia coli (E. coli) als rekombinantes Allergen expri-miert. Das neue Allergen hat ein Molekulargewicht von etwa 8 kDa und bindet IgE von mehr als 50% der gegen Milben allergischen Patienten und stellt somit ein Hauptallergen dar.
Beispiel 1: Expression und Reinigung des von Klon 30 stammenden Allergens
Die cDNA-Sequenz von Klon 30 (Fig. 1), die für das vorhergesagte reife von Klon 30 stammende Allergen codiert (Nukleotide 89-295 mit einem zusätliehen ATG am N-Terminus) wurde in den Expressionsvektor pET-17b (Novagene WI) subkloniert und in Escherichia coli BL21 (DE3)-Zellen (Stratagene, CA) exprimiert. Die Bakterienzellen wurden über Nacht in LB-Medium, das 100 mg/1 Ampicillin enthielt bei 27°C gezüchtet und die Expression des re-kombinanten Proteins wurde durch Zugabe von Isopropyl-ß-thiogalaktopyranosid (IPTG) bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mM induziert. Nach Züchten bei 27°C für zusätzliche 6 Stunden wurden Zellen von 1 Liter E. coii-Kultur durch Zentrifugieren (15 min, 3.000 U/min, 4°C, Sorvall RC5C) geerntet, und die Pellets wurden in 30 ml 25 mM Imidazol, pH 7,4/0,1% (V/V) Triton X 100 resuspendiert. Danach wurden die Bakterienzellen mit 300 pg Lysozym 20 min lang bei Raumtemperatur behandelt. Das Lysat der Bakterienzellen wurde dreimal in flüssigem Stickstoff gefroren und in einem 50°C Wasserbad aufgetaut. Die Genom-DNA wurde durch Zugabe von 3 pg DNase 10 min lang bei Raumtemperatur, gefolgt von der Zugabe von 600 pl 5M NaCl abgebaut. Diese lysierten Bakterienzellen wurden bei 18.000 U/min 20 min, 4°C zentrifugiert, und Proteine der löslichen Fraktion die das von Klon 30 stammende Allergen enthielten, wurden mit 60% Ammoniumsulfat 1,5 Stunden lang bei 4°C behandelt. Ausgefällte Proteine wurden durch Zentrifugieren (18.000 U/min, 20 min, 4°C) abgetrennt, und die das von Klon 30 stammende Allergen enthaltende
NACHGEREICHT - 13 - - 13 - • · • · • ·· # · · « m · • ··* • · ··«· ·· lösliche Fraktion wurde gegen 2M Ammoniumsulfat/50 mM Natriumphosphat, pH 7,0/10 mg/1 Phenylmethylsulphonylfluorid (PMSF) dialysiert und auf eine HiTrap Phenyl FF (high sub)-Säule (Amersham Biosciences AB, Schweden) aufgetragen. Das von Klon 30 stammende Allergen wurde mit einem 500-0mM Ammoniumsulfat-Gradi-enten eluiert, und die das von Klon 30 stammende Allergen enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt. Nach Dialyse gegen 20 mM Tris-Cl pH 8,0/10mg/l PMSF wurde die Probe auf eine HiTrap DEAE-Sephrose FF-Säule (Amersham Biosciences) aufgetragen. Das von Klon 30 stammende Allergen wurde mit einem 0-500mM NaCl-Gradien-ten eluiert, und die mehr als 90% reines, von Klon 30 stammendes Allergen enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt. Das von Klon 30 stammende Allergen wurde gegen 20mM Tris-Cl pH 8,0 dialysiert und bei -20°C gelagert. Eine Protein-Probe wurde mittels 14% Na-triumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) und Coomassie brilliant blue-Protein-Färbung auf Reinheit analysiert (Fig. 2A). Eine Molekularmassenanalyse des reifen Proteins zeigte eine Masse von 7,98 kDa (Fig. 2B), was der berechneten Masse der abgeleiteten Aminosäuresequenz des von Klon 30 stammenden Allergens entspricht, obwohl das Protein in SDS-PAGE bei etwa 14 kDa läuft (Fig. 2A).
Beispiel 2: IgE-Reaktivität des von Klon 30 stammenden Allergens
Die IgE-Bindungskapazität des von Klon 30 stammenden Allergens wurde mittels Immunoblot-Analyse unter Verwendung von zwei Seren von mit Dermatophagoid.es pteronyssinus sensibilisierten Individuen dargelegt (Fig. 3) . Proben des von Klon 30 stammenden Allergens wurden mittels SDS-PAGE getrennt und auf Nitrozellulose geblottet. Nitrozellulose-Streifen wurden mit 1:10 verdünnten Humanseren (1-3) inkubiert, und gebundene IgE-Antikörper wurden mit 1:10 verdünnten, mit 125I markierten anti-Human-IgE-Antikör-pern detektiert. Die Seren der gegen Milben allergischen Patienten (1, 2) reagierten spezifisch mit dem von Klon 30 stammenden Allergen. Das Kontrollserum eines nicht-allergische Individuums (3) reagierte mit dem von Klon 30 stammenden Allergen nicht.
Die Häufigkeit der IgE-Bindung wurde in einem ELISA-Test mit Seren von 53 gegen Milben allergischen Individuen mit ganzjährigen Symptomen, die eine Milben-Allergie anzeigen, positivem SPt und für D-pteronyssinus spezifischem IgE-RAST bestimmt. Eine ELISA-Platte (Nunc, Dänemark) wurde mit 5 pg/ml von Klon 30 NACHGEREICHT j - 14 • · • · • · • ·« • • • · • « « • • ··* • · · • • • ·· • «··« ·· staminendem Allergen beschichtet und mit 1:10 verdünnten Seren von gegen Milben allergischen Patienten inkubiert. Humane IgE-Bindung wurde mit 1:1000 verdünnten AKP-konjugierten anti-Human-IgE-Antikörpern (BD Biosciences-Pharmingen, NJ) nachgewiesen.
Neunundzwanzig von 53 Seren von gegen Milben allergischen Patienten (55%) zeigten eine IgE-Reaktivität gegen das von Klon 30 stammende Allergen (Tabelle I).
Tabelle I. IgE-Bindungshäufigkeit des von Klon 30 stammenden Allergens_ _
Rekombinantes Protein Anzahl der Patienten mit IgE-Reaktivität Prozentsatz der IgE-Reaktivität von Klon 30 stammendes Allergen 29 (n=53) 55
Beispiel 3: Immunisierung mit dem von Klon 30 stammenden Allergen induziert IgG-Antikörper bei Kaninchen
Um zu testen, ob das von Klon 30 stammende Allergen immuno-gen ist, wurde ein Kaninchen mit dem neuen Allergen unter Verwendung von Freundschem Adjuvans immunisiert. Das Kaninchen wurde 3 Mal mit 200pg Protein/Injektion immunisiert, wobei einmal vollständiges und zweimal unvollständiges Freundsches Adjuvans verwendet wurde (Charles River, Deutschland).
Die Induktion von IgG-Antikörpern wurde mit Dot-Blot-Experi-menten untersucht. Rekombinantes Der p 2 und das von Klon 30 stammende Allergen wurden auf Nitrozellulosestreifen punktweise aufgetragen (0,5 pg/Dot) und die Streifen mit 1:1000, 1:10.000, 1:100.000 und 1:1,000.000 verdünntem Kaninchen-Präimmun-Serum und anti-Klon 30-abgeleitetem Allergen-Antiserum inkubiert. Die gebundenen IgG-Antikörper wurden mit mit 125I markierten anti-Ka-ninchen-Gesamtantikörpern von Esel (Amersham) nachgewiesen.
Hohe Titer von spezifischen IgG-Antikörpern wurden mit dem von Klon 30 stammenden Allergen induziert (Fig. 4). Das anti-Klon 30-abgeleitete Allergen-Antiserum reagierte spezifisch mit dem von Klon 30 stammenden Allergen bis zu einer Verdünnung von 1:100.000 und keine Reaktion mit Der p 2 wurde beobachtet (Fig. 4 B). Das Präimmun-Serum reagierte nicht mit dem von Klon 30 stammenden Allergen und mit Der p 2 (Fig. 4 A) .
Beispiel 4: IgG-Antikörper, die mit dem von Klon 30 stammen-
NACHGEREICHT 15 • · • · • · • ·· · • ο · · • · · · • · • •Μ ··* + ·· den Allergen in Kaninchen induziert wurden, blockieren bei gegen Milben allergischen Patienten die IgE-Bindung an das von Klon 30 stammende Allergen
Die Fähigkeit von für das von Klon 30 stammende Allergen spezifischen Kaninchen-Antikörpern, die Bindung von Patienten-IgE an das Allergen zu blockieren, wurde mittels ELISA-Inhibiti-ons-Tests untersucht. An ELISA-Platten gebundenes, von Klon 30 stammendes Allergen (5 pg/ml) wurde mit 1:100 in PBST/0,5% (Gew./Vol.) BSA verdünnten Kaninchen-anti-Klon 30-abgeleiteten Allergen-Antikörpern oder mit Kaninchen-Präimmunserum vorinku-biert und über Nacht bei 4°C inkubiert. Danach wurde die Platte über Nacht bei 4°C 1:5 in PBST/0,5% (Gew./Vol.) BSA-verdünnten Seren von 14 gegen Milben allergischen Patienten ausgesetzt. Gebundene IgE-Antikörper wurden mit HRP-gekoppelten Ziegen-anti-Human-IgE-Antikörpern (Kirkegaard & Perry Gaithersburg, MD), das 1:2500 in PBST/0,5% BSA verdünnt war, nachgewiesen. Der Grad der Inhibierung wurde wie folgt berechnet: % Inhibierung der IgE-
Bindung — 100 — OD^^ti-Klon 30-abgeleitetes Serum X 100/OD Prä-Immun-Serum ♦
Bei der Mehrheit der Patienten konnte eine starke Inhibierung der IgE-Bindung in einem Bereich von 25 bis 97% (Mittelwert: 82%) beobachtet werden (Tabelle II). Bei der Hälfte der Seren wurde die IgE-Bindung an von Klon 30 stammendes Allergen zu 90% oder mehr inhibiert.
Tabelle II. Kaninchen anti-Klon 30-abgeleitete IgG-Antikör-per inhibieren die IgE-Bindung von gegen Milben allergischen Pa-tienten-Seren an das von Klon 30 stammende Allergen
Tabelle II: Kaninchen antl-Klon 30-abgeleitete IgG-Antikörper inhibieren IgE-Bindung aus Seren von Milben-Allergikem an von Klon 30 stammendes Allergen
Patienten Nummer
Vorinkubation mit 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Mittel Präimmun-Serum (OD- 0, 569 1,140 0,451 0, 982 2, 520 0, 628 0,790 0,347 0,484 0,269 0,553 1,333 1,638 1,038 0,910 Werte) Anti-Klon 30-abgelei 0, 060 0, 083 0,070 0,155 0,220 0, 039 0,071 0,101 0,029 0,078 0,415 0, 047 0,362 0,137 0,133 tetes Serum (OD-Werte) % Inhibierung d. IgE- 90 93 85 84 91 94 91 71 94 71 25 97 78 87 82
Bindung
Beispiel 5: Das von Klon 30 stammende Allergen ist biologisch aktiv NAOHGEREicHT | 16 16 • ♦ « · • · ♦ · ·· t« ·· · ···· ··
Die Hinaufregulierung von CD203c an Basophilen kann als Marker für eine induzierte Aktivierung und nachfolgende Degranulierung von Basophilen und deshalb zum Bestimmen der allergenen Aktivität eines Allergens verwendet werden. Heparinisierte Blutproben (100 μΐ) von einem gegen Milben allergischen Patienten wurden mit verschiedenen Konzentrationen des von Klon 30 stammenden Allergens, einem monoklonalen anti-IgE-Antikörper (Immu-notech, Frankreich) oder PBS 15 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Die CD203c-Expression wurde mittels Zweifarben-Durchflusszytome-trie auf einem FACScan (Becton Dickinson, CA) bestimmt.
Das von Klon 30 stammende Allergen induzierte eine Hinaufregulierung der CD203c-Expression an Basophilen eines gegen Milben allergischen Patienten bei einer Konzentration von 10 pg/ml (Fig. 5) . Anti-Human-IgE-Antikörper (positive Kontrolle) induzierten eine Hinaufregulierung der CD203c-Expression bei 1 pg/ml, wogegen bei der negativen Kontrolle (nur PBS) keine Hinaufregulierung erhalten wurde.
Beispiel 6: Oberflächen-exponierte Regionen und mögliche T-Zell-Epitope des von Klon 30 stammenden Allergens
Es ist wahrscheinlich, dass die hydrophilen Regionen eines Proteins an der Oberfläche des Moleküls freilegen und potentiell antigen sind. Daher können die hydrophilen Regionen an der Oberfläche des von Klon 30 stammenden Allergens potentielle B-Zell-Epitope darstellen. ProtScale (http://www.expasy.org/tools/protscale.html) ermöglicht die Berechnung und Präsentation des Hydrophobie-Profils (Kyte & Doo-little), das von jedem Aminosäure-Rahmen des von Protein 30 stammenden Allergens erzeugt wurde. Eine Fenstergröße von 7 wurde für die strukturelle Untersuchung gewählt. Das ProtScale-Er-gebnis des reifen, von Klon 30 stammenden Allergens zeigt ein Protein mit vielen negativen Peaks, die hydrophile Segmente darstellen (Fig. 6A) . Die B-Zell-Epitope des von Klon 30 stammenden Allergens befinden sich zwischen den Aminosäuren 3-12, 15-28, 34-43 und 49-68 des reifen Proteins.
Die T-Zellen des humanen Immunsystems erkennen Allergene als kurze Peptid-Fragmente (T-Zell-Epitope), die aus dem Abbau der Allergene stammen. MULTIPRED (http://antigen.i2r.a-star.edu.sg/multipred/) ist ein Berechnungssystem auf Web-Basis für die Voraussage von Peptiden, die an zahlreiche Moleküle binden, welche zu den Human-Leukozyten-Antigen(HLAs; humaner MHC,
NACHGEREICHT 17 • · · ·· ·♦ ·· ···· ·· major histocompatibility complex ,,Histokompatibilitätshauptkomplex" )) -Allelen gehören. Die vorausgesagten Ergebnisse für individuelle 9-mer-Peptide mit einer „Summe" (die Summe der einzelnen Bindungs-Bewertungen („scores") des Peptids an die MHC-Moleküle) von über 40 sind in Figur 6B gezeigt. T-Zell-Epi-tope befinden sich in der Nähe des N- und des C-Terminus des reifen von Klon 30 stammenden Allergens.
NACHGEREICHT

Claims (15)

  1. - 18 - 18 • • • ♦ • · • · · • · • • • · ·» • · • · • • • « ♦ · v · «·< • • • · • · • · • «· ·· «· • ···♦ Patentansprüche: 1. Polypeptid, umfassend eine Aminosäure-Sequenz mit mindestens 60% Identität mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 1, oder umfassend mindestens ein Aminosäure-Fragment mit mindestens 6 aufeinander folgenden Aminosäureresten der Aminosäure-Sequenz SEQ ID Nr. 1, oder mit einer immunologischen Kreuzreaktivität mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1 oder Fragmenten davon, wobei die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1 für ein Allergen codiert und das Polypeptid mindestens ein T-Zell-Epitop aufweist, das von einem T-Zell-Rezeptor erkannt wird, der für ein Molekül mit der Aminosäure-Sequenz SEQ ID Nr. 1 spezifisch ist.
  2. 2. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz zu mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 80%, mehr bevorzugt, mindestens 90%, am meisten bevorzugt, mindestens 95%, insbesondere 100%, identisch ist mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1.
  3. 3. Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid hypoallergen ist.
  4. 4. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäure-Fragmente in einer Reihenfolge miteinander fusioniert sind, die sich von der Reihenfolge der Fragmente in SEQ ID Nr. 1 unterscheidet.
  5. 5. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Aminosäure-Fragment ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aminosäure-Molekülen umfassend die Aminosäuren 5 bis 13, 9 bis 17, 10 bis 18, 11 bis 19, 12 bis 20, 16 bis 24, 17 bis 25, 43 bis 51, 44 bis 52, 45 bis 53, 47 bis 55, 51 bis 59 und 60 bis 68 der SEQ ID Nr. 1.
  6. 6. DNA-Molekül, das für ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 codiert.
  7. 7. Vektor, umfassend ein DNA-Molekül nach Anspruch 5.
  8. 8. Zelle, transformiert mit einem Vektor nach Anspruch 6. nachgereicht - 19 ♦ · »· ·· • • t 0 • • • • • • • · • • • *1 ♦ • • • • Φ • • ·« • · ··#« ·· ·· • · · · · • · · · • · t • ···· «·
  9. 9. Antikörper, der an ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 bindet.
  10. 10. Vakzin-Formulierung, umfassend ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder einen Antikörper nach Anspruch 9.
  11. 11. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Diagnose einer Allergie, insbesondere einer Hausstaub-milben-Allergie, bei einem Individuum.
  12. 12. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder eines Antikörpers nach Anspruch 9 zur Herstellung eines Medikaments für die Immuntherapie einer Allergie, insbesondere der Hausstaubmilben-Allergie.
  13. 13. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder eines Antikörpers nach Anspruch 9 zur Herstellung eines Medikaments für die Prävention feiner Allergen-Sensibilisierung, insbesondere einer Hausstaubmilben-Allergen-Sensibilisierung.
  14. 14. Verwendung nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament weiters Adjuvantien, Verdünnungsmittel, Konservierungsmittel oder Mischungen davon enthält.
  15. 15. Verwendung nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament 10 ng bis 1 g, vorzugsweise 100 ng bis 10 mg, insbesondere 0,5 pg bis 200 pg, des Polypeptids umfasst. NACHGEREICHT
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2110383A1 (de) 2008-04-14 2009-10-21 Biomay AG Hypoallergene Varianten
CO6260019A1 (es) * 2009-01-30 2011-03-22 Fundacion Universidad Del Norte Metodo y composicion inmunoquimica para la deteccion de alergenos de acaros usando anticuerpos policlonales igy
PT2717910T (pt) 2011-06-09 2019-05-22 Biomay Ag Proteínas de fusão transportadoras de péptido como vacinas para alergia
EP2543725A1 (de) 2011-07-08 2013-01-09 Biomay Ag Polysaccharidlyasen
EP3269730A1 (de) 2016-07-12 2018-01-17 Universität Salzburg Allergenvarianten
JOP20200285A1 (ar) 2018-05-11 2020-11-09 Astellas Pharma Inc حمض نووي لعلاج حساسية العث
CN108840917B (zh) * 2018-06-12 2021-11-12 刘志刚 屋尘螨变应原Der p 30及其制备方法和应用
CN108892715B (zh) * 2018-06-12 2021-11-12 刘志刚 屋尘螨变应原Der p 33及其制备方法和应用
CN108892716B (zh) * 2018-06-12 2021-11-12 刘志刚 屋尘螨变应原Der p 29及其制备方法和应用

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU717187B2 (en) * 1994-04-14 2000-03-16 Merck Patent Gmbh Pharmaceutical peptide formulations for treatment of dust mite allergy
SE9903950D0 (sv) 1999-10-29 1999-10-29 Pharmacia & Upjohn Diag Ab Non-anaphylactic forms of grass pollen allergen and their use
US20110131679A2 (en) * 2000-04-19 2011-06-02 Thomas La Rosa Rice Nucleic Acid Molecules and Other Molecules Associated with Plants and Uses Thereof for Plant Improvement
US20060084794A1 (en) * 2001-04-12 2006-04-20 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
GB0214942D0 (en) * 2002-06-28 2002-08-07 Secr Defence Immunogenic proteins and DNA encoding these
RU2372074C2 (ru) * 2002-11-26 2009-11-10 Альк-Абелло А/С Лекарственная форма, содержащая аллерген
EP1440979B1 (de) 2003-01-21 2005-10-19 BIOMAY Produktions- und Handels- Aktiengesellschaft Verfahren zur Vorbereitung von hypoallergenen Mosaikproteine
RU2265450C2 (ru) * 2003-08-28 2005-12-10 Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН Способ получения клещевого аллергена для постановки диагностической пробы
US20060048240A1 (en) * 2004-04-01 2006-03-02 Nickolai Alexandrov Sequence-determined DNA fragments and corresponding polypeptides encoded thereby
US20060150283A1 (en) * 2004-02-13 2006-07-06 Nickolai Alexandrov Sequence-determined DNA fragments and corresponding polypeptides encoded thereby
ES2340767T5 (es) * 2004-07-01 2013-11-13 Biomay Ag Alérgenos de ácaros del polvo doméstico
PT2717910T (pt) * 2011-06-09 2019-05-22 Biomay Ag Proteínas de fusão transportadoras de péptido como vacinas para alergia

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