DE60320425T2

DE60320425T2 - Ostertagia-impfstoff

Info

Publication number: DE60320425T2
Application number: DE60320425T
Authority: DE
Inventors: Peter Geldhof; Isabel Vercauteren; Edwin Claerebout; Jozef Vercruysse; Veerle De Maere
Original assignee: Universiteit Gent
Current assignee: Universiteit Gent
Priority date: 2002-09-13
Filing date: 2003-09-11
Publication date: 2008-07-31
Anticipated expiration: 2023-09-12
Also published as: NZ542733A; BRPI0314258B1; US20100209446A1; WO2004024769A3; EP1539820A2; BR0314258A; US8227584B2; AR041243A1; US20090028892A1; CA2498249C; US7264812B2; AU2003270190A1; CA2498249A1; ATE392435T1; EP1539820B1; US20050271683A1; AU2003270190B2; ES2304526T3; US7718179B2; US20040052817A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuresequenzen, die Ostertagia ostertagi-Proteine kodieren, und DNA-Fragmente, rekombinante DNA-Moleküle, lebende rekombinante Trägermikroorganismen oder -viren und Wirtszellen, die solche Nukleinsäuresequenzen umfassen. Die Erfindung betrifft auch Ostertagia ostertagi-Proteine, die durch solche Sequenzen kodiert sind. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung Impfstoffe, umfassend solche Nukleinsäuresequenzen, DNA-Fragmente, rekombinante DNA-Moleküle, lebende rekombinante Trägermikroorganismen oder -viren und Wirtszellen, die solche Nukleinsäuresequenzen, Proteine und Antikörper gegen solche Proteine umfassen. Außerdem betrifft die Erfindung die Verwendung dieser Proteine in Impfstoffen und zur Herstellung von Impfstoffen. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung der Nukleinsäuresequenzen, Proteine oder Antikörper für Diagnose- oder Impfzwecke. Schließlich betrifft die Erfindung diagnostische Kits, die solche Nukleinsäuren, Proteine oder Antikörper gegen solche Proteine umfassen.
Es gibt etwa 82 Millionen Rinder in der EU und etwa 97 Millionen in den USA, von denen die meisten beim Grasen einer Infektion mit gastrointestinalen Nematoden ausgesetzt sind, was zu einer oft erheblichen, beeinträchtigten Produktionswirksamkeit führt. Der üblichste und pathogenste dieser Nematoden ist Ostertagia ostertagi, der den Labmagen von Rindern infiziert. Das Krankheitssyndrom, das durch gastrointestinale Nematoden hervorgerufen wird und die üblicherweise als parasitische Gastroenteritis (PGE) bezeichnet wird, reduziert die wirtschaftliche Realisierbarkeit von Rinderproduktionseinheiten drastisch (Kloosterman, A. u. a., Parasitology Today 8, 330–335 (1992); Vercruysse, J. und Claerebout, E., Veterinary Parasitology 98, 195–214 (2001)). Die Tiere, für die das größte Risiko einer PGE besteht, sind Kälber in ihrer ersten Grassaison. Klinische PGE bei grasenden Kälbern wird durch (wässrige) Diarrhö, Gewichtsverlust, stumpfes Fell, Anorexie, ein allgemeiner Verlust der Kondition und schließlich Tod gekennzeichnet (Andreson, N. u. a., Veterinary Record 41, 196–204 (1965); Hilderson, H. u. a., Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift 56, 269–29 (1987)). Allerdings sind Produktionsverluste hauptsächlich eine Folge von subklinischen Infektionen ohne offene Zeichen einer Erkrankung. Weitgehende Reduzierungen des täglichen Gewichtszuwachses werden bei unbehandelten Kälbern in ihrer ersten Grassaison und mit subklinischen Infektionen beobachtet (Shaw D. J. u. a., Veterinary Parasitology 75, 115–131 (1998). Ausgewachsene Kühe können noch immer eine große Anzahl von O. ostertagi beherbergen (z. B. Borgsteede, F. H. M. u. a., Veterinary Parasitology 89, 287–296 (2000); Agneessens, J. u. a., Veterinary Parasitology 90, 83–92 (2000)). Obwohl gastrointestinale Nematodeninfektionen bei erwachsenen Kühen gewöhnlich subklinisch verlaufen, werden sie mit einer niedrigeren Milchproduktion in Verbindung gebracht (Gross, S. J. u. a., Veterinary Record 144, 581–587 (1999)). Die Schlachtkörperqualität wird auch durch gastrointestinale Nematodeninfektionen beeinträchtigt, einhergehend mit einem reduzierten Schlachtkörpergewicht, Ausschlachtungsprozentsatz und verwandten Schlachtkörpermessungen (Entrocasso, C. M. u. a., Research in Veterinary Science 40, 76–85 (1986)). Die Kontrolle von PGE beruht in Europa fast ausschließlich auf der Verwendung von anthelmintischen Medikamenten (Vercruysee, J. und Dorny, P., International Journal for Parasitology 29, 165–175 (1999)). Allerdings hat die verstärkte Verwendung von Anthelmintika bei Rindern über die letzten zwei Jahrzehnte (Borgsteede, F. H. M. u. a., Veterinary Parasitology 78, 23–36 (1998); Schnieder, T. u. a., Veterinary Record 145, 704–706 (1999); Claerebout, E. u. a., Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift 69, 108–115 (2000) mehrere Nachteile. Die hohen Kosten von anthelmintischen Behandlungen, die negative Wirkung von präventiven anthelmintischen Behandlungen auf die Entwicklung der natürlichen Immunität gegen gastrointestinale Nematoden (Vercruysse, J. u. a., Parasitology Today 10, 129–132 (1994); Claerebout, E. und Vercruysse, J., Le Point Vétérinaire (Numéro special) 28, 175–179 (1997)), die Verbraucherbedenken im Hinblick auf Medikamentenrückstände in Nahrungsmittelprodukten und in der Umwelt (Wall, R. und Strong, L., Nature 327–418–421 (1987); Steel, J. W. in: NRA Special Review of Macrocyclic Lactones. National Registration Authority for Agricultural and Veterinary Chemicals, Canberra (1998); Strong L., Veterinary Parasitology 48, 3–17 (1993)) und nicht zuletzt die steigende Häufigkeit einer Parasitenresistenz gegen die verfügbaren Anthelmintika (Vermunt, J. J. u. a., Veterinary Record 137, 43–45 (1995); Vermunt, J. J. u. a., New Zealand Veterinary Journal 44, 188–193 (1996); Coles G. C. u. a., Veterinary Record 142, 255–256 (1998); Gill, J. H. und Lacey, E., International Journal for Parasitology 28, 863–877 (1998); and Fiel, C. A. u. a., Revista de Medicina Veterinaria (Buenos Aires) 81, 310–315 (2000)) sind starke Anreize für die Produzenten, um alternative Kontrollsysteme anzuwenden (Vercruysse & Dorny (1999), oben). Die Impfung wird als die durchführbarste Lösung erachtet (Knox, D. P., Parasitology 120, S43–S61 (2000)).
Allerdings stehen trotz der Entwicklung der Biotechnik, die die Entwicklung von Impfstoffen ,der neuen Generation' bezogen auf die rekombinante DNA-Technologie ermöglicht, bis heute keine Impfstoffe gegen gastrointestinale Nematoden-Parasiten zur Verfügung. Die Hauptprobleme, die die Entwicklung von Nematoden-Impfstoffen in Wiederkäuern behindern, sind: (1) die meisten Parasiten-Antigene, die für die Impfstoffentwicklung ausgewählt werden, sind ,versteckte Antigene', d. h. Antigene, die bei einer natürlichen Infektion vom Wirt nicht erkannt werden. Demgemäß wird die Immunreaktion, die durch Impfung mit diesen Antigenen erzeugt wird, nicht durch eine natürliche Reinfektion angekurbelt; (2) rekombinante Nematoden-Proteine, die eine schützende Immunreaktion hervorrufen, sind bisher nicht festgestellt worden.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Polypeptide zur Verfügung zu stellen, die in der Lage sind, den Schutz vor den pathgenen Wirkungen einer Ostertagia ostertagi Infektion bei Rindern zu verbessern.
Es ist überraschenderweise festgestellt worden, dass 7 unterschiedliche Polypeptide speziell identifiziert und isoliert werden konnten, wobei jedes dieser unterschiedlichen Polypeptide in der Lage war, eine Immunreaktion auf Ostertagia-Parasiten hervorzurufen. Die Erfinder haben festgestellt, dass diese Polypeptide als Impfstoffkomponenten verwendet werden können, um einen Impfstoff zur Verfügung zu stellen, der tatsächlich den Schutz vor einer Ostertagia ostertagi Infektion bei Rindern verbessert und hilft, die durch Ostertagia ostertagi verursachten Schaden zu begrenzen.
Drei unterschiedliche Ansätze sind zum Nachweisen der Gene, die die Impfstoffkomponenten gemäß der Erfindung kodieren, verwendet worden. Ein Ansatz, der ausführlich im Beispiel 1 dargelegt ist, verwendet speziell hergestelltes anti-exkretorisch-sekretorisches Protein-Kaninchenantiserum zum Nachweisen von Genen, die für immunreaktive Ostertagia ostertagi Proteine kodieren. Dieser Ansatz hat zum Auffinden eines neuen immunogenen Proteins geführt, für das die kodierende Sequenz in SEQ ID NO: 9 gezeigt ist, wie unten angegeben.
Es ist auf dem Fachgebiet bekannt, dass viele unterschiedliche Nukleinsäuresequenzen ein und dasselbe Protein kodieren können. Dieses Phänomen ist üblicherweise in der zweiten und insbesondere dritten Base von jedem Triplett, das für eine Aminosäure kodiert, als Wackeln bekannt. Dieses Phänomen kann für zwei Nukleinsäuresequenzen, die noch immer dasselbe Protein kodieren, zu einer Heterologie führen. Deshalb können im Prinzip zwei Nukleinsäuresequenzen, die eine Sequenzhomologie von nur 70% haben, noch immer für ein und dasselbe Protein kodieren.
Das Molekulargewicht von allen Proteinen gemäß der Erfindung wird in der Gelelektrophorese auf einem Polyacrylamidgel bestimmt. Aufgrund einer leichten Schwankung der Molekulargewichtsbestimmung, die häufig auf dem Fachgebiet angetroffen wird, kann das Molekulargewicht variieren. Daher sollte das Molekulargewicht der Proteine gemäß der Erfindung als das theoretische Molekulargewicht +/–5 kD interpretiert werden.
Das Nukleotidhomologieniveau kann mit dem Computerprogramm „BLAST 2 SEQUENCES" durch Auswahl des Unterprogramms: „BLASTIN" bestimmt werden, das unter www.ncbl.nim.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html. gefunden werden kann.
Eine Empfehlung für dieses Programm gibt Tatlana A. Tatusova, Thomas L. Madden, FEMS Microbiol. Letters 174, 247–250 (1999). Die verwendeten Parameter sind die Standardparameter: Belohnung für eine Übereinstimmung: +1. Strafe über eine Nichtübereinstimmung: –2. öffnen einer Lücke: 5. Verlängerung einer Lücke 2. Lücke x-dropoff: 50
Nukleotidsequenzen, die zu den Sequenzen, die in der hier beschriebenen SEQ ID NO: 9 gezeigt sind, oder den Nukleotidsequenzen, die Tandem-Anordnungen der Sequenzen gemäß der Erfindung umfassen, komplementär sind, liegen auch im Umfang der Erfindung.
Eine Ausführungsform betrifft eine Nukleinsäuresequenz, die ein 30 kD Ostertagia ostertagi Protein kodiert, wobei die Nukleinsäuresequenz mindestens 85% Homologie mit der Nukleinsäuresequenz des 30 kD Ostertagia ostertagi Proteingens, wie in SEQ ID NO: 9 gezeigt, aufweist.
Vorzugsweise hat eine Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung, die dieses 30 kD Ostertagia ostertagi Protein kodiert, mindestens 90%, vorzugsweise 93%, besonders bevorzugt 95%, Homologie mit der Nukleinsäuresequenz von Ostertagia ostertagi, die in SEQ ID NO: 9 gezeigt ist.
Noch weiter bevorzugt ist ein Homologieniveau von 98%, 99% oder sogar 100%.
In der veröffentlichten internationalen Anmeldung WO 95/09182 werden mutmaßliche schützende Antigene und ihre kodierenden Nukleinsäuren beschrieben, unter anderem der Parasit Ostertagia circumcincta. Diese Art des Ostertagia-Parasits infiziert Ziegen und Schafe, nicht aber Rinder. Die in der WO 95/09182 beschriebenen Antigene sind Galektin (GenBank Zugangsnummer AAC47546) und Peptide eines Tropomyosins und einer Gluthation-S- Transferase. Weder das Galektinprotein noch die Peptide haben eine signifikante Homologie mit den Proteinen gemäß der Erfindung.
Antigene, die zuvor als EMBL-EBI Datenbank-Eintrag Nr.: AJ310812 und BM052055 veröffentlicht wurden, haben einen maximalen Grad an Nukleotidsequenzidentität zu SEQ ID NO: 9 von nur 52% bzw. 79%.
Ein zweiter Ansatz für den Nachweis von Impfstoffkomponenten, der ausführlich im Beispiel 2 dargestellt ist, beruhte auf der Analyse von Komponenten in einem speziellen Parasitenanteil, dem ES-Anteil (extretorisch-sekretorischer Anteil), der beim Erstellen der Immunität gegenüber Ostertagia ostertagi eine Rolle spielte. Dieser Ansatz führte überraschenderweise zum Auffinden der oben beschriebenen 31 und 30 kD Proteine (SEQ ID NO: 1 und 9). Dies lieferte eine volle Bestätigung für die Wichtigkeit der oben beschriebenen 31 und 30 kD Proteine als Impfstoffkomponenten.
Ähnliche Versuche haben wiederholt diese Impfstoffwirksamkeit der 30 kD Proteine gemäß der Erfindung gezeigt, siehe die Veröffentlichungen, die nach dem Prioritätstag der vorliegenden Anmeldung veröffentlicht wurden, Vercauteren u. a., 2003, Mol. and Biochem. Parasitol., Bd. 126, Seite 201–208; und: Geldhof u. a., 2003, Mol. and Biochem. Parasitol., Bd. 128, Seite 111–114.
Ein dritter Ansatz zum Nachweisen von Impfstoffkomponenten, der ausführlich im Beispiel 3 dargestellt ist, verwendet örtliche Antikörper, die von einem Schleim und Antikörper sezernierenden Zell(ASC)-Kulturüberstand erhalten werden. Obwohl Serumantikörper prinzipiell zum Durchsuchen nach Kandidaten-Nematodenantigenen verwendet werden können, sind örtliche Antikörperreaktionen, die an beschränkten Gewebestellen erzeugt werden, nicht immer im Serum feststellbar. Darüber hinaus macht es die Hartnäckigkeit von Serumantikörpern schwer, zwischen früheren und neueren Einwirkungen durch einen Erreger zu unterscheiden. Im Gegensatz dazu sind lokale Antikörper von den abomasalen drainierenden Lymphknoten und vom Schleim, der die abomasale Schleimhaut bedeckt, für Antigene spezifischer, die zur Zeit der Untersuchung im infizierten Gewebe vorhanden sind. Es wurde bei Untersuchungen mit Ratten und Schafen gezeigt, dass Zellkulturen, die Antikörper sezernierende Zellen (ASC) enthalten, die in vivo in Lymphknoten induziert wurden, die das infizierte Gewebe drainieren, Antikörper (ASC-Sonden) im Kulturüberstand erzeugen, die speziell die Antigeneinwirkung des abgeleiteten Bereichs widerspiegeln, und dass stufenspezifische Antigene leichter durch Lymphknoten-ASC-Sonden als durch Serumantikörper festgestellt werden. Nach einer Belastungsinfektion von Kälbern mit O. ostertagi wurde eine negative Korrelation zwischen der Fruchtbarkeit des Wurms und der parasitenspezifischen IgA im Schleim beobachtet (Claerebout, E. u. a., 17^th International Conference of the World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology, Kopenhagen, 1999). cDNA-Bibliotheken der 3 unterschiedlichen parasitären Phasen wurden mit denselben Antikörpersonden durchsucht, um die Nukleotidsequenzen zu identifizieren, die für diese Antigene kodieren.
Details bezüglich der Isolation der Gene, die diese Antigene kodieren, und der Charakterisierung der Proteinantigene sind in den Beispielen 4 und 5 gezeigt.
Dieser hochspezifische Ansatz wird zur Auswahl von Proteinen und Genen verwendet, die diese Proteine kodieren, die direkt mit dem Immunzustand anstatt bloß dem infizierten Zustand verknüpft werden können. Dieser Ansatz hat überraschenderweise zwei oder mehr immunogene Proteine enthüllt, für die die kodierenden Sequenzen nachfolgend unter SEQ ID NO: 11 und 13 gezeigt sind.
Da die vorliegende Erfindung Nukleinsäuresequenzen, die neue Osteragia ostertagi Proteine kodieren, offenbart, ist es nun zum ersten Mal möglich, diese Proteine in ausreichenden Mengen zu erhalten. Dies kann z. B. durch Verwendung von Expressionssystemen erfolgen, um die Gene zu exprimieren, die die Proteine gemäß der Erfindung kodieren. Daher betrifft die Erfindung in einer bevorzugteren Form dieses Ausführungsbeispiels DNA-Fragmente, die eine Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung umfassen. Ein DNA-Fragment ist ein Abschnitt von Nukleotiden, der als Träger für eine Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung fungiert. Solche DNA-Fragmente können z. B. Plasmide sein, in die eine Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung kloniert wird. Solche DNA-Fragmente sind zum Beispiel zum Erhöhen der DNA-Menge zur Verwendung als Primer und zur Expression einer Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung nützlich, wie nachfolgend beschrieben.
Ein wesentliches Erfordernis für die Expression der Nukleinsäuresequenz ist ein geeigneter Promotor, der funktionsmäßig mit der Nukleinsäuresequenz verknüpft ist, so dass die Nukleinsäuresequenz unter der Kontrolle des Promotors ist. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass sich die Wahl eines Promotors auf jeden eukaryontischen, prokaryontischen oder viralen Promotor erstreckt, der in der Lage ist, die Gentranskription in Zellen, die als Wirtszellen für die Proteinexpression verwendet werden, zu lenken. Daher betrifft eine noch weiter bevorzugte Form dieses Ausführungsbeispiels ein rekombinantes DNA-Molekül, umfassend ein DNA-Fragment und/oder eine Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung, wobei die Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung unter die Kontrolle eines funktionsfähig verknüpften Promotors gestellt wird. Dies kann z. B. mittels standardmäßigen molekularbiologischen Verfahren erhalten werden, z. B. Sambrook & Russell: „Molecular cloning: a laboratory manual" (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN: 0879695773.
Funktionsfähig verknüpfte Promotoren sind Promotoren, die in der Lage sind, die Transkription der Nukleinsäuresequenzen, an die sie gebunden sind, zu kontrollieren. Ein solcher Promotor kann der native Promotor eines neuen Gens gemäß der Erfindung oder ein anderer Promotor von Ostertagia ostertagi sein, vorausgesetzt, dass der Promotor in den zur Expression verwendeten Zellen funktionsfähig ist. Er kann auch ein heterologer Promotor sein. Wenn die Wirtszellen Bakterien sind, umfassen nützliche, verwendbare Expressionskontrollsequenzen den Trp-Promotor und Operator (Goeddel u. a., Nucl. Acids Res., 8, 4057 (1980)); den lac-Promotor und Operator (Chang u. a., Nature, 275, 615 (1978)); den Außenmembranproteinpromotor (Nakamura, K. und Inouge, M., EMBO J., 1, 771–775 (1982)); die Bakteriophagen-lambda-Promotoren und Operatoren (Remaut, E. u. a., Nucl. Acids Res., 11, 4677–4688 (1983)); den α-Amylase (B. subtilis) Promotor und Operator, Terminierungssequenzen und eine andere Expressionsverstärkung und Kontrollsequenzen, die mit der ausgewählten Wirtszelle kompatibel sind.
Wenn die Wirtszelle Hefe ist, umfassen nützliche Expressionskontrollsequenzen z. B. den α-Paarungsfaktor. Für Insektenzellen können die Polyhedrin- oder p10-Promotoren von Baculoviren verwendet werden (Smith, G. E. u. a., Mol. Cell. Biol. 3, 2156–2165 (1983)). Wenn die Wirtszelle Wirbeltierursprungs ist, umfassen veranschaulichende nützliche Expressionskontrollsequenzen den (humanen) immediate early Promotor von Cytomegalovirus (Seed, B. u. a., Nature 329, 840–842 (1987); Fynan, E. F. u. a., PNAS USA 90, 11478–11482 (1993); Ulmer, J. B. u. a., Science 259, 1745–1748 (1993)), Rous-Sarkom-Virus LTR (RSV), Gorman, C. M. u. a., PNAS USA 79, 6777–6781 (1982); Fynan u. a., oben; Ulmer u. a., oben) den MPSV LTR (Stacey u. a., J. Virology 50, 725–732 (1984)), den immediate early Promotor von SV40 (Sprague J. u. a., J. Virology 45, 773 (1983)), den SV-40-Promotor (Berman, P. W. u. a., Science 222, 524–527 (1983)), den Metallothionein-Promotor (Brinster, R. L. u. a., Nature 296, 39–42 (1982)), den Hitzeschockpromotor (Voellmy u. a., PNAS USA 82, 4949–53 (1985)), the major late Promotor von Ad2 und den β-Aktinpromotor (Tang u. a., Nature 356, 152–154 (1992)). Die regulatorischen Sequenzen können auch Terminator- und Polyadenylierungssequenzen umfassen. Unter den Sequenzen, die verwendet werden können, sind die bekannte Rinderwachstumshormon-Polyadenylierungssequenz, die Polyadenylierungssequenz von SV40, die humanen Cytomegalovirus-Terminator- und Polyadenylierungssequenzen.
Bakterien-, Hefe-, Pilz- und Wirbeltier-Zellexpressionssysteme sind sehr häufig verwendete Systeme. Solche Systeme sind auf dem Fachgebiet bekannt und allgemein erhältlich, z. B. im Handel durch Clontech Laborstories Inc. (4030 Fabian Way, Palo Alto, Kalifornien 94303-4607, USA). Neben diesen Expressionssystemen sind parasitenbezogene Expressionssysteme attraktive Expressionssysteme. Solche Systeme sind zum Beispiel in der französischen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 2 714 074 und in der US NTIS Publikation Nr. US 08/043109 beschrieben (Hoffman, S. und Rogers, W.: Veröffentlichungsdatum: 1. Dezember 1993).
Ein sehr attraktives Expressionssystem für die heterologe Nematodengenexpression ist ein Nematoden-Expressionssystem, das auf dem Wurm Caenorrhabditis elegans beruht. Ein heterologes Expressionssystem für diesen Nematoden ist von Redmond, D. L. u. a. in Molecular and Biochemical Parasitology 112, 125–131 (2001) beschrieben. Siehe auch Hashmi, S. u. a., in Trends in Parasitology 17, 387–393 (2001).
Die Gene gemäß der vorliegenden Erfindung können direkt stromabwärts von einem C. elegans Cysteinproteasepromotor, cpr-5, fusioniert werden, der, wie kürzlich gezeigt wurde, die Expression auf die Eingeweide von C. elegans (Redmond u. a., 2001) richtet und in den pGEX-Vektor kloniert. Das langsame Wachstum des DR96 unc76(e911) C. elegans Mutantenstamms kann durch Mikroinjektion von Plasmid-DNA in den distalen Arm der Zwittergonade kloniert werden. Die Plasmid-DNA kann zum Beispiel mit dem Qiagen-Verfahren hergestellt werden. Ostertagia-Gene gemäß der Erfindung können mit dem Reparaturplasmid p76-16B koinjiziert werden. Das p76-16B-Plasmid rettet den unc76-Phänotyp und ermöglicht es, dass Transformanten durch Umkehr zurück zum Wildtyp-Phänotyp identifiziert werden. Transformierte Linien, bei denen die zweite und nachfolgende Generation den Wildtyp-Phänotyp zeigen, werden erhalten. Das Vorhandensein des injizierten Konstrukts in transgenen Würmern kann leicht durch PCR-Analyse von einzelnen Würmern mit Primern, die speziell für die interessante DNA entwickelt werden, verifiziert werden (Kwa u. a., Journal of Molecular Biology 246, 500–510, (1995)). Transgene Würme, die durch p76-16B gerettet werden, wachsen schneller als die unc76(e911)-Mutanten und ermöglichen die schnelle Akkumultation von transgenem Wurmmaterial. Wegen ihres schnellen Lebenszyklus können Transformanten in vitro in großen Mengen wachsen gelassen werden. Somatische Extrakte von transgenen Würmern können durch Mahlen der Nematoden in einem Mörser unter flüssigem Stickstoff und Resuspendieren derselben in 0,05M PBS, enthaltend 2% TritonX-100^®, hergestellt werden. Fusionsproteine werden durch Affinitätschromatographie mittels einer Glutathion-Sepharose-Säule gereinigt.
Eine noch weiter bevorzugte Form dieses Ausführungsbeispiels der Erfindung betrifft lebende rekombinante Träger (LRCs), die eine Nukleinsäuresequenz umfassen, die ein Ostertagia ostertagi Protein gemäß der Erfindung, ein DNA-Fragment gemäß der Erfindung oder ein rekombinantes DNA-Molekül gemäß der Erfindung kodieren. Diese LRCs sind Mikroorganismen oder Viren, bei denen zusätzliche genetische Informationen, in diesem Fall eine Nukleinsäuresequenz, die ein Ostertagia ostertagi Protein gemäß der Erfindung kodieren, kloniert wurden. Rinder, die mit solchen LRCs infiziert sind, erzeugen eine immunologische Reaktion nicht nur auf die Immunogene des Träger sondern auch auf das/die immunogene(n) Protein(e), für die der genetische Kode zusätzlich in die LRC kloniert ist, wie beispielsweise das neue Ostertagia ostertagi Proteingen gemäß der Erfindung.
Als Beispiel für bakterielle LRCs können abgeschwächte Salmonellenstämme, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, sehr günstig verwendet werden.
Auch sind lebende rekombinante Trägerparasiten unter anderem von Vermeulen, A. N. (Int. J. Parasitol. 28, 1121–1130 (1998)) beschrieben worden.
Außerdem können LRC-Viren als Art zum Transportieren der Nukleinsäuresequenz in eine Zielzelle verwendet werden. Lebende rekombinante Trägerviren werden auch Vektorviren genannt. Viren, die oft als Vektoren verwendet werden, sind Vaccinia-Viren (Panicali u. a.; PNAS USA 79, 4927 (1982), Herpesviren (E. P. A. 0473210A2) und Retroviren (Valerio, D. u. a.; in Baum, S. J., Dicke, K. A., Lotzova, E. und Pluznik, D. H. (Hrsg.), Experimental Haematology today – 1988, Springer Verlag, New York: Seite 92–99 (1989)).
Die Technik der in vivo homologen Rekombination, die auf dem Fachgebiet bekannt ist, kann verwendet werden, um eine rekombinante Nukleinsäuresequenz in das Genom eines Bakteriums, Parasiten oder Virus der Wahl einzuführen, welches/r in der Lage ist, die Expression der eingeführten Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung im Wirtstier hervorzurufen.
Schließlich betrifft eine andere Form dieses Ausführungsbeispiels der Erfindung eine Wirtszelle, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die ein Protein gemäß der Erfindung, ein DNA-Fragment, das eine solche Nukleinsäuresequenz umfasst, oder ein rekombinantes DNA-Molekül, das eine solche Nukleinsäuresequenz umfasst, unter der Kontrolle eines funktionsfähig verknüpften Promotors kodiert. Diese Form betrifft auch eine Wirtszelle, die einen lebenden rekombinanten Trägermikroorganismus oder -virus enthält, der ein Nukleinsäuremolekül umfasst, das ein Ostertagia ostertagi Protein gemäß der Erfindung kodiert.
Eine Wirtszelle kann eine Zelle bakteriellen Ursprungs sein, z. B. Escherichia coli, Bacillus subtilis und Lactobacillus-Art, und zwar in Kombination mit auf Bakterien bezogenen Plasmiden wie pBR322 oder bakteriellen Expressionsvektoren wie die pEX-, pET-, pGEX-Reihe oder mit Bakteriophagen. Die Wirtszelle kann auch von eukaryontischem Ursprung sein, z. B. Hefe-Zellen in Kombination mit Hefe spezifischen Vektormolekülen oder höhere eukaryontische Zellen, wie Insektenzellen (Luckow u. a.; Biotechnology 6, 47–55 (1988)) in Kombination mit Vektoren oder rekombinanten Baculoviren, Pflanzenzellen in Kombination z. B. mit auf Ti-Plasmid beruhenden Vektoren oder viralen Pflanzenvektoren (Barton, K. A. u. a.; Cell 32, 1033 (1983), Säugetierzellen wie Hela-Zellen, Zellen aus Ovarien chinesischer Hamster (CHO) oder Crandell-Rees Katzennierenzellen, auch mit geeigneten Vektoren oder rekombinanten Viren.
Außerdem kann der Wirt ein Nematode, wie beispielsweise C. elegans sein, wie oben erläutert.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die neuen Ostertagia ostertagi Proteine gemäß der Erfindung.
Eine Form dieses Ausführungsbeispiels betrifft ein 30 kD Ostertagia ostertagi Protein, wobei das Protein eine Sequenzhomologie von mindestens 90%, allerdings vorzugsweise 92%, besonders bevorzugt 94%, 95% oder sogar 96% Homologie, und zwar in dieser Reihenfolge oder Priorität, mit der Aminosäuresequenz besitzt, wie in SEQ ID NO: 10 gezeigt.
Noch weiter bevorzugt ist ein Homologieniveau von 97%, 98%, 99% oder sogar 100% in dieser Prioritätsreihenfolge.
Eine besonders bevorzugte Form dieses Ausführungsbeispiels betrifft ein 30 kD Ostertagia ostertagi Protein, das durch eine Nukleinsäuresequenz gemäß der vorliegenden Erfindung kodiert wird.
Der Grad der Proteinhomologie kann mit dem Computerprogramm „BLAST 2 SEQUENCES" durch Auswahl des Unterprogramms: „BLASTP" bestimmt werden, das bei www.ncbl.nim.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html. zu finden ist.
Eine Referenz für dieses Programm ist Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden, FEMS Microbiol. Letters 174, 247–250 (1999). Verwendete Matrix: „blosum62". Verwendete Parameter sind die Standardparameter: Öffnen der Lücke: 11. Erweiterung der Lücke: 1 Lücke x_dropoff: 50.
Es wird davon ausgegangen, dass für die speziellen hier erfassten Proteine natürliche Variationen zwischen einzelnen Ostertagia ostertagi-Stämmen bestehen können. Diese Variationen können durch (eine) Aminosäuredifferenz(en) in der Gesamtsequenz oder durch Deletionen, Substitutionen, Insertionen, Inversionen oder Additionen von (einer) Aminosäure(n) in der Sequenz gezeigt werden. Aminosäuresubstitutionen, die die biologischen und immunologischen Aktivitäten nicht wesentlich ändern, sind beschrieben worden, z. B. von Neurath u. a. in The Proteins, Academic Press New York (1979). Aminosäureaustausch zwischen verwandten Aminosäuren oder Austausche, die oft in der Evolution aufgetreten sind, sind unter anderem Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val (siehe Dayhof, M. D., Atlas of Protein sequence and structure, Nat. Biomed. Res. Found., Washington D. C. (1978), Bd. 5, Ergänz. 3). Andere Aminosäuresubstitutionen umfassen Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Leu/Ile, Leu/Val und Ala/Glu. Bezogen auf diese Informationen entwickelten Lipman und Pearson eine Methode für den schnellen und sensiblen Proteinvergleich (Science 227, 1435–1441 (1985)) und zum Bestimmen der funktionellen Ähnlichkeit zwischen homologen Proteinen. Solche Aminosäuresubstitutionen der beispielhaften Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sowie Variationen mit Deletionen und/oder Insertionen liegen im Umfang der Erfindung, solange die sich ergebenden Proteine ihre Immunreaktivität beibehalten.
Dies erklärt, warum Ostertagia ostertagi Proteine gemäß der Erfindung bei Isolation von unterschiedlichen Feldisolaten Homologieniveaus von etwa 70% haben können, während sie noch dasselbe Protein mit denselben immunologischen Merkmalen darstellen. Diese Variationen in der Aminosäuresequenz eines bestimmten Proteins gemäß der Erfindung, die noch ein Protein vorsehen, das in der Lage ist, eine Immunreaktion gegenüber einer Infektion mit Ostertagia ostertagi oder zumindest gegenüber den klinischen Manifestationen der Infektion hervorzurufen, werden als „die Immunogenität nicht wesentlich beeinflussend" angesehen.
Eine Form eines noch anderen Ausführungsbeispiels der Erfindung betrifft Impfstoffe zum Bekämpfen einer Ostertagia ostertagi Infektion, die mindestens ein Ostertagia ostertagi Protein gemäß der Erfindung, wie oben beschrieben, zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassen.
Eine noch andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Ostertagia ostertagi Proteine gemäß der Erfindung zur Verwendung in einem Impfstoff.
Eine noch andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, eines DNA-Fragments, eines rekombinanten DNA-Moleküls, eines lebenden rekombinanten Trägermikroorganismus oder -virus, einer Wirtszelle oder eines Proteins gemäß der Erfindung zur Herstellung eines Impfstoffs, insbesondere eines Impfstoffs zum Bekämpfen einer Ostertagia ostertagi Infektion.
Ein Weg zum Herstellen eines Impfstoffs gemäß der Erfindung ist der des Wachsenlassens des Nematoden, gefolgt von einer biochemischen Reinigung eines Ostertagia ostertagi Proteins, von der Nematode oder dem Überstand. Dies ist allerdings ein sehr zeitaufwändiger Weg zur Herstellung des Impfstoffs.
Es ist daher viel angenehmer, die Expressionsprodukte eines Gens, das ein Ostertagia ostertagi Protein gemäß der Erfindung kodiert, in Impfstoffen zu verwenden. Dies ist nun zum ersten Mal möglich, weil die Nukleinsäuresequenzen von Genen, die ein neues Ostertagia ostertagi Protein kodieren, die als Impfstoffkomponenten geeignet sind, in der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt werden.
Impfstoffe, die auf den Expressionsprodukten dieser Gene beruhen, können leicht durch Mischen des Proteins gemäß der Erfindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, wie unten beschrieben, hergestellt werden.
Alternativ kann ein Impfstoff gemäß der Erfindung lebende rekombinante Trägermikoorganismen oder -viren umfassen, wie oben beschrieben, die in der Lage sind, das Protein gemäß der Erfindung zu exprimieren. Solche Impfstoffe, z. B. bezogen auf einen Salmonellen-Träger oder einen viralen Träger, z. B. einen Herpesvirusvektor, haben den Vorteil gegenüber Untereinheit-Impfstoffen, dass sie den natürlichen Weg der Infektion von Ostertagia ostertagi besser nachahmen. Außerdem ist ihre Selbstverbreitung ein Vorteil, weil nur geringe Mengen an rekombinantem Träger zur Immnisierung notwendig sind.
Impfstoffe können auch auf Wirtszellen beruhen, wie oben beschrieben, die das Protein davon gemäß der Erfindung umfassen.
Alle oben beschriebenen Impfstoffe tragen zur aktiven Impfung bei, d. h. sie fördern das Immunsystem des Wirts.
Alternativ können Antikörper zum Beispiel in Kaninchen aufgezogen werden, oder können von Antikörper erzeugenden Zelllinien erhalten werden, wie nachfolgend beschrieben. Solche Antikörper können dann an die Kuh verabreicht werden. Dieses Impfverfahren, die passive Impfung, ist die Impfung der Wahl, wenn ein Tier bereits infiziert ist und keine Zeit isbt, um die natürliche Immunreaktion auszulösen. Es ist auch das bevorzugte Verfahren zur Impfung von Tieren, die zu einem plötzlichen hohen Infektionsdruck neigen. Die verabreichten Antikörper gegen das Protein gemäß der Erfindung können in diesen Fällen Ostertagia ostertagi stören. Dieser Ansatz hat den Vorteil, dass er die Entwicklung von Ostertagia ostertagi reduziert oder stoppt.
Daher betrifft eine andere Form dieses Ausführungsbeispiels der Erfindung einen Impfstoff zum Bekämpfen einer Ostertagia ostertagi Infektion, die Antikörper gegen ein Ostertagia ostertagi Protein gemäß der Erfindung umfasst, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Eine noch andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft Antikörper gegen ein Ostertagia ostertagi Protein gemäß der Erfindung.
Verfahren für die Großserienproduktion von Antikörpern gemäß der Erfindung sind auch auf dem Fachgebiet bekannt. Solche Verfahren beruhen auf der Klonierung von (Fragmenten) der genetischen Information, die das Protein gemäß der Erfindung in einem filamentösen Phagen für das Phadendisplay kodiert. Solche Techniken sind unter anderem im „Antibody Engineering Page" unter „filamentous phage display" bei http://aximt1.imt.unimarburg.de/~rek/aepphage.html und in dem Übersichtsreferat von Cortese, R. u. a., (1994) in Trends in Biotechn. 12, 262–267, von Clackson, T. & Wells, J. A. (1994) in Trends in Biotechn. 12, 173–183, von Marks, J. D. u. a., (1992) in J. Biol. Chem. 267, 16007–16010, von Winter, G. u. a., (1994) in Annu. Rev. Immunol. 12, 433–455, und von Little, M. u. a., (1994) Biotechn. Adv. 12, 539–555 beschrieben. Die Phagen werden im Wesentlichen verwendet, um Kamel-Expressionsbibliotheken, die Antikörper der schweren Kette von Kamelen exprimieren, zu durchsuchen. (Muyldermans, S. und Lauwereys, M., Joum. Molec. Recogn. 12, 131–140 (1999) und Ghadroudi, M. A. u. a., FEBS Letters 414, 512–526 (1997)). Zellen von der Bibliothek, die die gewünschten Antikörper exprimieren, können repliziert und anschließend für die großtechnische Expression von Antikörpern verwendet werden.
Eine noch andere Ausführungsform betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs gemäß der Erfindung, umfassend das Zumischen von Antikörpern gemäß der Erfindung und eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers.
Eine alternative und wirksame Art der Impfung ist die direkte Impfung mit DNA, die das relevante Antigen kodiert. Die direkte Impfung mit DNA, die Proteine kodiert, ist für viele unterschiedliche Proteine erfolgreich. (Wie zum Beispiel in Donnelly u. a., The Immunologist 2, 20–26 (1993) wiedergegeben.) Auf dem Gebiet von Antiparasitenimpfstoffen wird ein Schutz zum Beispiel vor Plasmodium yoelii mit einer DNA-Impfung mit Plasmodium yoelii circumsporozoite-Gen erhalten (Vaccine 12, 1529–1533 (1994)). Schutz vor Leishmania major wird mit einer DNA-Impfung mit dem Leishmania major Oberflächenglycoprotein gp63 Gen erhalten (Vaccine 12, 1534–1536 (1994)).
Dieser Impfweg ist auch für die Impfung von Rindern gegen eine Ostertagia ostertagi Infektion attraktiv. Daher betreffen noch andere Formen dieses Ausführungsbeispiels der Erfindung Impfstoffe, die Nukleinsäuresequenzen umfassen, die ein Protein gemäß der Erfindung kodieren, Impfstoffe, die DNA-Fragmente umfassen, die solche Nukleinsäuresequenzen umfassen, oder Impfstoffe, die rekombinante DNA-Moleküle gemäß der Erfindung umfassen, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Beispiele für DNA-Plasmide, die in einem DNA-Impfstoff gemäß der Erfindung verwendet werden können, sind herkömmliche Klonierungs- oder Expressionsplasmide für bakterielle, eukaryontische und Hefewirtszellen, wobei viele der Plasmide im Handel erhältlich sind. Bekannte Beispiele für solche Plasmide sind pBR322 und pcDNA3 (Invitrogen). Die DNA-Fragmente oder rekombinanten DNA-Moleküle gemäß der Erfindung sollten in der Lage sein, eine Proteinexpression der Nukleotidsequenzen hervorzurufen. Die DNA-Fragmente oder rekombinanten DNA-Moleküle können eine oder mehrere Nukleotidsequenzen gemäß der Erfindung umfassen. Darüber hinaus können DNA-Fragmente oder rekombinante DNA-Moleküle andere Nukleotidsequenzen, wie beispielsweise immunstimulierende Oligonukleotide, mit unmethylierten CpG-Dinukleotiden oder Nukleotidsequenzen umfassen, die für andere antigene Proteine oder adjuvierende Cytokine kodieren.
Die Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung oder das DNA-Plasmid, das eine Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, welche vorzugsweise funktionsfähig mit einer regulatorischen Transkriptionssequenz verbunden ist, um im Impfstoff gemäß der Erfindung verwendet zu werden, kann nackt oder in einem Abgabesystem verpackt sein. Geeignete Abgabesysteme sind Lipidvesikel, ISCOMs^®, Dendromere, Niosome, Mikropartikel, insbesondere chitosanbezogene Mikropartikel, Polysaccharidmatrizen und dergleichen (siehe weiter unten), die alle auf dem Fachgebiet bekannt sind. Auch sehr geeignet als Abgabesystem sind abgeschwächte lebende Bakterien, wie beispielsweise Salmonella-Arten, und abgeschwächte lebende Viren, wie beispielsweise Herpesvirus-Vektoren, wie oben erwähnt.
Noch andere Formen dieses Ausführungsbeispiels betreffen Impfstoffe, die rekombinante DNA-Moleküle gemäß der Erfindung umfassen.
DNA-Impfstoffe können z. B. leicht durch intradermale Anwendung, wie beispielsweise durch Verwendung eines nadellosen Injektors, verabreicht werden. Diese Verabreichungsart gibt die DNA direkt in die Zellen des zu impfenden Tiers ab. DNA-Mengen im Bereich zwischen 10 pg und 1000 μg liefern gute Ergebnisse. Insbesondere wenn die DNA selbstreplizierend ist, reichen geringe Mengen aus. Vorzugsweise werden Mengen im Mikrogrammbereich zwischen 1 und 100 μg verwendet.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst der Impfstoff gemäß der vorliegenden Erfindung zusätzlich ein oder mehr Antigene, die von für Rinder pathogenen Organismen und Viren stammen, Antikörper gegen diese Antigene oder genetische Informationen, die solche Antigene und/oder eine pharmazeutische Komponente, wie beispielsweise ein Antibiotikum, kodieren.
Natürlich können solche Antigene, Antikörper gegen solche Antigene oder genetischen Informationen von Ostertagia ostertagi Ursprung sein, wie beispielsweise einem anderen Ostertagia ostertagi Antigen. Sie können auch ein Antigen, Antikörper oder eine genetische Information sein, die aus einem anderen für Kühe pathogenen Organismus oder Virus ausgewählt ist. Solche Organismen und Viren werden vorzugsweise aus der Gruppe bovines Herpesvirus, bovines Virusdiarrhoe-Virus, Parainfluenzavirus Typ 3, bovines Paramyxovirus, Maul-und-Klauenseuche-Virus, Pasteurella haemolytica, bovines Respiratory-Syncytial-Virus, Theileria sp., Babesia sp., Trypanosoma sp., Anaplasma sp., Neospora caninum, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Mycoplasma, E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Cryptosporidium, Salmonella und Streptococcus dysgalactiae ausgewählt.
Impfstoffe, die auf den Ostertagia ostertagi Proteinen gemäß der Erfindung beruhen, sind auch als Markerimpfstoffe sehr geeignet. Ein Marker-Impfstoff ist ein Impfstoff, der es ermöglicht, zwischen geimpften und feldinfizierten Kühen z. B. auf der Basis eines charakteristischen Antikörperpanels zu unterscheiden, das sich vom durch eine Wild-Typ-Infektion hervorgerufenen Antikörperpanel unterscheidet. Ein unterschiedlicher Antikörperpanel wird beispielsweise hervorgerufen, wenn ein immunogenes Protein, das auf einem Wild-Typ Ostertagia vorhanden ist, nicht in einem Impfstoff vorkommt: Der Wirt wird dann nach der Impfung keine Antikörper gegen das Protein produzieren. Daher würde ein Impfstoff, der auf den Ostertagia ostertagi Proteinen gemäß der Erfindung beruht, nur Antikörper gegen das spezifische Protein hervorrufen, während ein Impfstoff, der auf einem lebenden Wild-Typ, lebenden geschwächten oder inaktivierten ganzen Ostertagia ostertagi beruht, Antikörper gegen alle oder die meisten der Nematodenproteine hervorrufen.
Ein einfacher ELISA-Test mit Löchern, die ein anderes Ostertagia Protein außer den Ostertagia ostertagi Proteinen gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen, und Löchern, die nur eines oder mehrere gereinigte Ostertagia ostertagi Proteine gemäß der Erfindung umfassen, reicht aus, um Serum von Kühen zu testen und zu unterscheiden, ob die Kühe entweder mit dem Proteinimpfstoff gemäß der Erfindung geimpft wurden oder an einer Ostertagia ostertagi Feldinfektion litten.
Alle Impfstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. Ein pharmazeutisch annehmbarer Träger kann zum Beispiel steriles Wasser oder eine sterile physiologische Salzlösung sein. In einer komplexeren Form kann der Träger zum Beispiel ein Puffer sein.
Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs umfassen das Mischen eines Proteins gemäß der Erfindung und/oder von Antikörpern gegen das Protein und/oder eine Nukleinsäuresequenz und/oder ein DNA-Fragment, ein rekombinantes DNA-Molekül, ein lebender rekombinanter Trägermikroorganismus oder -virus oder eine Wirtszelle gemäß der Erfindung und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Impfstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung können in einer bevorzugten Darstellung auch eine immunstimulatorische Substanz, ein so genanntes Adjuvans, enthalten. Adjuvanzien im Allgemeinen umfassen Substanzen, die die Immunreaktion des Wirts auf nicht spezifische Weise erhöhen. Eine Anzahl von unterschiedlichen Adjuvanzien sind auf dem Fachgebiet bekannt. Beispiele für Adjuvanzien, die häufig in Kuhimpfstoffen verwendet werden, sind Muramyldipeptide, Lipopolysaccharide, mehrere Glukane und Glykane und Carbopol^® (ein Homopolymer).
Der Impfstoff kann auch einen so genannten „Träger" umfassen. Ein Träger ist eine Verbindung, an die das Protein anhaftet, ohne kovalent daran gebunden zu sein. Solche Träger sind unter anderem Biomikrokapseln, Mikroalginate, Liposome und Makrosole, die alle auf dem Fachgebiet bekannt sind. Mikropartikel, besonders speziell die auf Chitosan beruhenden, insbesondere zur Verwendung bei der oralen Impfung, sind sehr als Impfträger geeignet.
Eine spezielle Form für einen solchen Träger, bei dem das Antigen teilweise im Träger eingebettet ist, ist das so genannte ISCOM^® ( EP 109.942 , EP 180.564 , EP 242.380 ). Darüber hinaus kann der Impfstoff ein oder mehrere geeignete oberflächenaktive Verbindungen oder Emulgatoren, z. B. Span^® oder Tween^®, haben.
Antigene werden vorzugsweise mit Adjuvanzien kombiniert, die ohne weiteres zur Verfügung stehen und die zur Verwendung bei Haustieren eingetragen sind, zum Beispiel Aluminiumhydroxid, ein Th2-artiges modulierendes Adjuvans.
Zwei alternative Ansätze für die Antigenabgabe sind besonders zur Anwendung der Impfstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet:

a. systemische Immunisierung mit dem Einschluss von Adjuvanzien modulierenden Immunreaktionen bezüglich der Schleimhaut, wie beispielsweise Vitamin D3 (Van der Stede, Y., u. a., Vaccine 19, 1870–1878 (2001) oder QuilA^®, und
b. direkte Abgabe an die respiratorische Schleimhaut durch Inhalation von nackter DNA (Plasmid) (Vanrompay, D., u. a., Immunology 103, 106–112 (2001)).

Die Zugabe von CpG-Oligonukleotidsequenzen innerhalb oder außerhalb des Plasmids ist auch zur Verbesserung des Schutzes bevorzugt (Van der Stede, Y., u. a., Vet. Immunol. Immunopathol., 86, 31–41 (2002).
Oft wird der Impfstoff mit Stabilisatoren gemischt, zum Beispiel um die zum Abbau neigenden Proteine davor zu schützen, abgebaut zu werden, um die Lebensdauer des Impfstoffs zu verlängern oder um die Gefriertrockungswirksamkeit zu verbessern. Nützliche Stabilisiatoren sind unter anderem SPGA (Bovarnik u. a.; J. Bacteriology 59, 509 (1950)), Kohlenhydrate, z. B. Sorbit, Mannit, Trehalose, Stärke, Saccharose, Dextran oder Glucose, Proteine, wie beispielsweise Albumin oder Kasein oder Abbauprodukte davon, und Puffer, wie beispielsweise Alkalimetallphosphate.
Darüber hinaus kann der Impfstoff in einem physiologisch annehmbaren Verdünnungsmittel suspendiert sein. Es ist selbstverständlich, dass andere Arten von adjuvierenden, addierenden Trägerverbindungen oder Verdünnungsmitteln, die ein Protein emulgieren oder stabilisieren, auch in der vorliegenden Erfindung verkörpert sind.
Impfstoffe gemäß der Erfindung, die auf einem Protein gemäß der Erfindung beruhen, können sehr geeignet in Mengen im Bereich zwischen 1 und 100 μm Protein pro Tier verabreicht werden, obwohl kleinere Dosen im Prinzip verwendet werden können. Eine Dosis, die 100 μm übersteigt, ist aus kommerziellen Gründen weniger attraktiv, obwohl sie immunologisch sehr geeignet ist.
Impfstoffe, die auf den lebenden abgeschwächten rekombinanten Trägermikroorganismen oder -viren, wie beisielsweise den LRC-Viren, Parasiten und Bakterien, wie oben beschrieben, beruhen, können in viel geringeren Dosen verabreicht werden, weil sie sich während der Infektion multiplizieren. Daher liegen sehr geeignete Mengen im Bereich zwischen 10³ und 10⁹ CFU/PFU sowohl für Bakterien als auch für Viren.
Impfstoffe gemäß der Erfindung können z. B. intradermal, subkutan, intramuskulär, intraperitoneal, intravenös oder bei mukosalen Oberflächen beispielsweise oral oder intranasal verabreicht werden.
Zum wirksamen Schutz vor Erkrankung ist eine schnelle und richtige Diagnose einer Ostertagia ostertagi Infektion wichtig.
Daher ist es ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, diagnostische Werkzeuge vorzusehen, die zum Nachweis einer Ostertagia ostertagi Infektion geeignet sind.
Die Nukleinsäuresequenzen, die Proteine und die Antikörper gemäß der Erfindung sind auch zur Verwendung bei der Diagnose geeignet sind.
Daher betrifft eine andere Ausführungsform der Erfindung Nukleinsäuresequenzen, Proteine und Antikörper gemäß der Erfindung zur Verwendung bei der Diagnose.
Die Nukleinsäuresequenzen oder Fragmente davon gemäß der Erfindung können verwendet werden, um das Vorhandensein von Ostertagia ostertagi in Kühen nachzuweisen. Eine Probe aus dem Labmagen von Kühen, die mit Ostertagia ostertagi infiziert waren, umfasst Nukleinsäurematerial, das vom Parasiten stammt, einschließlich Nukleinsäuresequenzen, die für ein Protein gemäß der Erfindung kodieren. Diese Nukleinsäuresequenzen hybridisieren mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung. Geeignete Verfahren zum Nachweisen, die mit den Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung reagieren können, beinhalten Hybridisierungsverfahren, einschließlich – aber nicht ausschließlich – PCR-Techniken und NASBA^®-Techniken. Daher können die Nukleinsäuresequenzen gemäß der Erfindung verwendet werden, um Sonden und Primer zur Verwendung bei PCR- und oder NASBA-Verfahren herzustellen.
Ein Diagnose-Testkit zum Nachweisen von Ostertagia ostertagi kann zum Beispiel Hilfsmittel umfassen, um die Reaktion von Ostertagia-Nukleinsäure zu ermöglichen, die von den mit diesen Hilfsmitteln zu testenden Kühen isoliert wurden. Solche Hilfsmittel sind z. B. spezielle Sonden oder (PRC-)Primer, die auch als Primerfragmente bezeichnet werden, die auf den Nukleinsäuresequenzen gemäß der Erfindung beruhen. Wenn genetisches Material von Ostertagia ostertagi in dem Tier vorhanden ist, wird es zum Beispiel spezifisch an spezifische PCR-Primer binden und z. B. nach der cDNA-Synthese, anschließend in der PCR-Reaktion amplifiziert werden. Das PCR-Reaktionsprodukt kann dann leicht in einer DNA-Gelelektrophorese nachgewiesen werden.
Standardmäßige PCR-Lehrbücher beschreiben Verfahren zum Bestimmen der Primer für selektive PCR-Reaktionen mit Ostertagia ostertagi DNA. Primer-Fragmente mit einer Nukleotidsequenz von mindestens 12 Nukleotiden werden häufig verwendet, aber Primer von über 15, besonders bevorzugt 18, Nukleotiden werden etwas mehr ausgewählt. Insbesondere Primer mit einer Länge von mindestens 20, vorzugsweise mindestens 30, Nukleotiden sind sehr allgemein anwendbar. PCR-Techniken sind umfassend in C. Dieffenbach & G. Dveksler beschrieben: PCR primers: a laborator manual, CSHL Press, ISBN 879694473 (1995)). Nukleinsäuresequenzen gemäß der Erfindung oder Primer dieser Nukleinsäuresequenzen mit einer Länge von mindestens 12, vorzugsweise 15, besonders bevorzugt 18, sogar noch weiter bevorzugt 20, 22, 25, 30, 35 oder 40 Nukleotiden, in dieser bevorzugten Reihenfolge, wobei die Nukleinsäuresequenzen oder Teile davon mindestens 70 Homologie mit der Nukleinsäuresequenz aufweisen, wie in SEQ ID NO: 9 gezeigt, sind daher auch ein Teil der Erfindung. Primer sollen eine Länge von mindestens 12 Nukleotiden und eine Homologie von mindestens 70%, besonders bevorzugt 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder sogar 100%, in dieser bevorzugten Reihenfolge mit der Nukleinsäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 9 gezeigt, haben. Solche Nukleinsäuresequenzen können als Primerfragmente in PCR-Reaktionen verwendet werden, um die Menge an DNA zu erhöhen, die sie kodieren, oder in Hybridisierungsreaktionen verwendet werden. Dies ermöglicht die schnelle Amplifikation oder Detektion auf Blots von spezifischen Nukleotidsequenzen zur Verwendung als diagnostisches Hilfsmittel zum Beispiel zum Nachweis von Ostertagia ostertagi, wie oben angegeben.
Ein anderer Test für genetisches Material beruht auf Ostertagia-Material, das z. B. von einem Abstrich erhalten wurde, dem eine klassische DNA-Reinigung und danach eine klassische Hybridisierung mit radioaktiv oder farblich markierten Primerfragmenten folgt. Farblich markierte und radioaktiv markierte Fragmente werden allgemein als Nachweismittel bezeichnet. Beide PCR-Reaktionen und Hybridisierungsreaktionen sind auf dem Fachgebiet bekannt und sind unter anderem in Sambrook & Russell, oben, beschrieben.
Daher betrifft eine Ausführungsform der Erfindung einen diagnostischen Testkit zum Nachweisen von Ostertagia ostertagi Nukleinsäuresequenzen. Ein solcher Test umfasst eine Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung oder ein Primerfragment davon.
Ein diagnostischer Testkit, der auf dem Nachweis von antigenem Material der speziellen Ostertagia ostertagi Proteine gemäß der Erfindung beruht und daher zum Nachweis einer Ostertagia ostertagi Infektion geeignet ist, kann unter anderem einen standardmäßigen ELISA-Test umfassen. In einem Beispiel eines solchen Tests werden die Wände der Löcher einer ELISA-Platte mit Antikörpern überzogen, die gegen eines der Proteine gemäß der Erfindung gerichtet sind. Nach der Inkubation mit dem zu testenden Material werden markierte anti-Ostertagia ostertagi Antikörper den Löcher zugegeben. Eine Farbreaktion zeigt dann das Vorhandensein von antigenem Material von Ostertagia ostertagi. Daher betrifft eine noch andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung diagnostische Testkits zum Nachweisen von antigenem Material von Ostertagia ostertagi. Solche Testkits umfassen Antikörper gegen ein Protein gemäß der Erfindung.
Ein diagnostischer Testkit, der auf dem Nachweis von Antikörpern gegen ein Protein von Ostertagia ostertagi gemäß der Erfindung im Serum beruht und daher zum Nachweisen einer Ostertagia ostertagi Infektion geeignet ist, kann unter anderem einen standardmäßigen ELISA-Test umfassen. In einem solchen Test können die Wände der Löcher einer ELISA-Platte zum Beispiel mit einem Ostertagia ostertagi Protein gemäß der Erfindung überzogen sein. Nach der Inkubation mit dem zu testenden Material werden markierte Antikörper gegen das Protein den Löchern zugegeben. Eine Farbreaktion zeigt dann das Vorhandensein von Antikörpern gegen Ostertagia ostertagi. Daher betrifft eine noch andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung diagnostische Testkits zum Nachweisen von Antikörpern gegen Ostertagia ostertagi. Solche Testkits umfassen ein Ostertagia ostertagi Protein gemäß der Erfindung.
Der Aufbau des Immunoassays kann variieren. Zum Beispiel kann der Immunoassay auf Wettbewerb oder direkte Reaktion beruhen. Weiterhin können die Protokolle feste Träger verwenden oder können zelluläres Material verwenden. Der Nachweis des Antikörper-Antigen-Komplexes kann die Verwendung von markierten Antikörpern umfassen; die Markierungen können zum Beispiel Enzyme, fluoreszierende, chemolumineszierende, radioaktive oder Farbstoffmoleküle sein.
Geeignete Verfahren zum Nachweisen von mit einem Protein gemäß der vorliegenden Erfindung reaktiven Antikörpern in der Probe umfassen den enzymverbundenen Immunosorbentassay (ELISA), Immunfluoreszenztest (IFT) und die Western-Blotarialysen.
Die Proteine gemäß der Erfindung, die zum Beispiel wie oben angegeben exprimiert sind, können verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen, die polyklonal, monospezifisch oder monoklonal (oder ein Derivat davon) sein können. Wenn polyklonale Antikörper gewünscht sind, sind Techniken zum Erzeugen und Verarbeiten von polyklonalen Seren auf dem Fachgebiet bekannt (z. B. Mayer und Walter, Hrsg. Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academic Press, London (1987)).
Monoklonale Antikörper, die gegen das Protein gemäß der Erfindung reagieren können, können durch Immunisierung von durch Inzucht erzeugten Mäusen mittels Verfahren produziert werden, die auch auf dem Fachgebiet bekannt sind (Kohler und Milstein, Nature, 256, 495–497 (1975)).
BEISPIELE
Beispiel 1
1.1. Parasiten-ES-Produkte, EX-Produkte und anti-ES-Kaninchenserum-Herstellung
Ex-Produkte wurden wie in Geldhof, P., u. a., Parasite Immunology 24, 263–270 (2002), beschrieben, hergestellt. Das in diesem Beispiel verwendete EX ist mit S1 vergleichbar, wie in dieser Veröffentlichung beschrieben. Exkretorisch-sekretorische Produkte wurden wie von Geldhof P, u. a., Parasitology 121, 639–647 (2000) beschrieben, hergestellt. Kaninchen wurden dreimal mit einer Woche Abstand mit 100 μg der erhaltenen ES-Proteine der Stadien L₃, L₄ und Adult in Kombination mit Freunds Adjuvans immunisiert und drei Wochen nach der letzten Immunisierung ausbluten gelassen. Polyklonale Seren von diesen Kaninchen wurden zum Immunoscreening von O. ostertagi cDNA-Bibliotheken verwendet.
1.2. cDNA-Bibliotheksaufbau von O. ostertagi
Gesamt-RNA von L₃-, L₄- und adulten Parasiten wurde mit TRIZOL^® Reagens (GibcoBRL, Life Technologies) hergestellt. PolyA⁺ RNA wurde mit mRNA Separator^® Kit (Clontech Laborstories, Inc.) gereinigt. Drei μg mRNA wurde in eine Erststrang-cDNA mit willkürlichen Hexamerprimern umgewandelt (SuperScript^® Auswahlsystem für die cDNA-Synthese, GibcoBRL, Life Technologies). Doppelsträngige cDNA wurde mit EcoRI-NotI-Adaptern modifiziert und in den lambda gt11-Vektor (Stratagene) kloniert. Rekombinante lambda-Phagen wurden verpackt (Gigapack^®III Goldverpackungsextrakt, Stratagene) und die Verpackungsreaktion titriert. Es wurde geschätzt, dass die L₃-cDNA-Bibliothek 1.15 × 10⁶ unabhängige Klone enthielt; die L₄-cDNA-Bibliothek 9.6 × 10⁶ und die Adult-cDNA-Bibliothek enthielten 3.41 × 10⁶ plaquebildende Einheiten. Nach der Amplifikation wurden diese cDNA-Bibliotheken mit den anti-ES-Kaninchenseren immungescreent.
1.3. Immunoscreening von cDNA-Bibliothek
Ungefähr 100.000 Plaques wurden auf Luria-Broth-Agar (8.000 Plaque pro Platte) plattiert und Kopien wurden auf Nitrozellulosefiltern erzeugt, die in 10 mM Isopropylthio-β-D-galactosid eingeweicht waren. Nach dem Blockieren des Hintergrunds (5% Milchpulver in PEST, Nestlé Gloria) wurden die Filter über Nacht mit Kaninchenserum inkubiert, (1:200) in Blockierungspuffer verdünnt. Ziegen anti-Kaninchenserum, das mit Merrrettichperoxidase (Verdünnung 1:100) verbunden wurde, wurde als Konjugat verwendet, und die Antigen-Antikörper-Komplexe wurden mit Daminobenzidin nachgewiesen. Die reagierenden Plaques wurden erneut gescreent, bis eine homogene Population von immunpositiven rekombinanten Phagen erhalten wurde. Die gereinigten Plaques wurden in sterilem SM-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgSO₄) resuspendiert und bei 4°C gelagert.
1.4. Klonieren und DNA-Sequenzanalyse von cDNA-Inserts
Phagen-Inserts wurden mit PCR mittels lambda gt11 Primern amplifiziert:
und in einen Plasmidvektor kloniert (pGEM-T^®, Promega). DH5α E. coli Transformanten, der das rekombinante Plasmid enthält, wurden auf Luria Broth Agarplatten, die mit 0,1 mg/ml Ampicillin, 0,1 mM Isopropylthio-β-D-galactosid und 40 μg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactose selektiert, und die cDNA-Inserts wurden mit PCR mittels Vektorprimer amplifiziert:
Die Nukleotidsequenz der cDNA-Klone wurde durch das Dideoxy-Kettenterminatorverfahren mittels fluoreszierenden BigDye^TM-Terminatoren in einem 377 automatisierten DNA-Sequenzer (PE Biosystems) bestimmt. Die DNA-Sequenzdaten wurden gesammelt (DNASTAR^®, Inc.) und mit Nukleinsäure-(Blast+Beauty) und Aminosäuresequenzen (BlastX+Beauty) in verschiedenen Datenbanken verglichen (EMBL, GenBank, WU-Blast2 und Swiss-Prot).
Ergebnisse von Beispiel 1:
Das Screeningverfahren mittels eines speziell hergestellten anti-exkretorisch-sekretorischen Kaninchen-Antiserums zum Nachweisen von Genen, die immunreaktives Ostertagia ostertagi kodieren, führte zum Nachweis von fünf neuen Genen, die Impfstoffkomponenten kodieren.

1) ein Gen, das ein neues immunogenes Protein kodierte, wurde gefunden, dessen Nukleotidsequenz, die wichtige immunogene Determinanten kodiert, in SEQ ID NO: 7 angegeben ist. Das Gen kodiert ein Protein mit einer Länge von etwa 1600 Aminosäuren und einem Molekulargewicht von >= 200 kD. Die Aminosäuresequenz eines wichtigen immunreaktiven Teils dieses Proteins ist in der SEQ ID NO: 8 angegeben. Wie in der 1 zu sehen ist, umfassen mehrere Klone, von denen einer durch einen Pfeil angegeben ist, mindestens Teile des Gens, die einen immunogenen Teil dieses Proteins kodieren. Es ist deutlich zu sehen, dass dieses Protein stark durch Antikörper gegen dieses Protein erkannt werden kann.
2) ein Gen, das ein neues immunogenes Protein mit 28 kD kodiert, wurde ermittelt. Der Hauptteil der Nukleotidsequenz dieses Gens ist in SEQ ID NO: 3 angegeben. Die Aminosäuresequenz des Proteins ist in SEQ ID NO: 4 angegeben. Wie in der 2B zu sehen ist, wird in der Spur, die als ES und EX bezeichnet ist (siehe unter 1.1 zur Erläuterung), die klare Bande von etwa 28 kD, die dieses Protein darstellt, stark durch monospezifische Antiseren dargestellt, die auf Spuren von plaquereinen immunpositiven Klonen gereinigt ist, die das Protein kodieren.
3) ein Gen, das ein neues immunogenes Protein von 25 kD kodierte, wurde ermittelt. Die Nukleotidsequenz dieses Gens ist in SEQ OID NO: 5 angegeben. Die Aminosäuresequenz des Proteins ist in SEQ ID NO: 6 angegeben. Wie in der 2C zu sehen ist, wird in der EX genannten Spur (siehe unter 1.1. wegen der Erläuterung) die klare Bande von etwa 25 kD, die dieses Protein darstellt, stark und hochspezifisch durch monospezifische Antiseren erkannt, die auf Spuren von plaquereinen immunpositiven Klonen, die dieses Protein kodieren, gereinigt sind.
4) ein Gen, das ein neues immunogenes Protein von 31 kD kodierte, wurde ermittelt. Die Nukleotidsequenz dieses Gens ist in SEQ ID NO: 1 angegeben. Die Aminosäuresequenz des Proteins ist in SEQ ID NO: 2 angegeben. In der 3B sind im eingerahmten Bereich die vier rechten Proteine Formen dieses Proteins (Siehe auch unter Ergebnissen von Beispiel 2). Aus der 3A geht hervor, dass das Protein stark durch monospezifische Antiseren erkannt wird, die auf Spuren von plaquereinen immunpositiven Klonen, die dieses Protein kodieren, gereinigt sind.
5) ein Gen, das ein neues immunogenes Protein von 30 kD kodiert, wurde ermittelt. Die Nukleotidsequenz dieses Gens ist in SEQ ID NO: 9 angegeben. Die Aminosäuresequenz des Proteins ist in SEQ ID NO: 10 angegeben. In der 3B sind im eingerahmten Bereich die zwei linken Proteine Formen dieses Proteins. (Siehe auch unter Ergebnisse von Beispiel 2). Aus der 3A geht hervor, dass das Protein stark durch monospezifische Antiseren erkannt wird, die auf Spuren von plaquereinen immunpositiven Klonen, die dieses Protein kodieren, gereinigt sind.

Beispiel 2
2.1. Herstellung von Antigenen
Adulte O. ostertagi Parasiten und adulte ES-Produkte wurden wie von Geldhof u. a. beschrieben (2000, Parasitology, 121, 639–647), erhalten.
2.2 Chromatographie auf Thiol-Sepharose
Gesamt-ES wurde mit einer Endkonzentration von 2,5 mM Dithiothreitol (DTT) 30 Minuten lang bei 37°C vor der Chromatographie vorinkubiert. Überschüssiges DTT wurde durch Hindurchleiten durch eine 10 × 2,6 cm Sephadex^® G-25 (Pharmacia) Säule entfernt und mit 10 mM Tris, 0,5 M NaCl, pH 7,4, mit 5 ml/Minute eluiert. Eine aktivierte Thiol-Sepharose 4B (Sigma) Säule, 5 ml Bettvolumen, wurde in 10 mM Tris, 0,5 M NaCl, pH 7,4, äquilibriert. Proteinproben (10 mg/Durchlauf) wurden auf die Thiol-Sepharose 4B Säule mit einer Strömungsrate von 5 ml/Stunde aufgetragen. Ungebundenes Material wurde durch Waschen der Säule mit Äquilibrierungspuffer (10 mM Tris, 0,5 M NaCl, pH 7,4) eluiert, bis die OD₂₈₀ zu einer konstanten Grundlinie zurückgekehrt war. Gebundenes Material wurde mit Äquilibrierungspuffer, enthaltend 50 mM DTT, mit einer Strömungsrate von 5 ml/Stunde eluiert. Die Spitzenfraktionen wurden gepoolt. DTT wurde von den eluierten Proteinen durch Hindurchleiten bei 5 ml/Minute durch eine Sephadex^® G-25 (Pharmacia) Säule in 10 mM Tris pH 7,4 entfernt. Die Spitzenfraktionen wurden wieder gepoolt und der Proteingehalt durch das BCA-Verfahren (Pierce) bestimmt. Beide Reinigungen, S3- und ES-Thiol, ergaben eine Ausbeute zwischen 10 und 15%. Aliquote der ES-Thiolfraktionen wurden für SDS-PAGE und Substratgelanalyse entfernt. Der Rest der Eluate wurden dann bei –70°C gelagert, bis sie benötigt wurden.
2.3. 1D- und 2D-Gelelektrophorese
Die Peptidkomponenten von ES-Thiol wurden durch Coomassie-Blau Färbung (0,1 Coomassie-Blau R-250 in 40% Methanol und 10% Essigsäure) im Anschluss an eine Fraktionierung von 10 μg Proteinprobe mittels 10% SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen sichtbar gemacht.
Die 2D-Gelelektrophorese wurde mit dem 1 PG-SDS/PAGE System gemäß Bjellqvist u. a. (Elektrophoresis 14, 1357–1365 (1993)) durchgeführt. Die Proteinproben wurden durch Zugabe von 10 Volumen eiskalten Aceton ausgefällt und für 2 Stunden bei –20°C gelassen. Das Aceton wurde nach der Zentrifugation verworfen. Das Pellet wurde 2 Stunden lang in der Rehydrierungslösung, enthaltend 9 M Harnstoff, 4% CHAPS (Pharmacia), Bromphenol-Blau, 18 mM Dithiothreitol und 2% IPG-Puffer (Pharmacia), gelöst. Diese Probe, die ungefähr 100 μg Protein beinhaltete, wurde auf 7 cm Immobilinstreifen (pH 3–10, Pharmacia) geladen, um die isoelektrische Fokussierung durchzuführen. Der Streifen wurde anschließend 30 Minuten lang in 50 mM Tris-Cl, pH 8,8, enthaltend 6 M Harnstoff, 30 Glycerin (v/v), 2% SDS (G/v), 64 mM Dithiothreitol und eine Spur Bromphenol-Blau gewaschen. Die zweite Dimension wurde auf 12% SDS-PAGE durchgeführt. Gele wurden durch kolloidales Coomassie-Färben (Sigma) gefärbt.
2.4. Western Blotting
Die Serumantikörperreaktionen der Kälber auf die Immunisierungen mit ES-Thiol wurden durch Western Blotting mittels Seren bewertet, die eine Woche nach der zweiten Immunisierung geerntet wurden. Fünf μg ES-Thiol wurde mittels 10% SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen fraktioniert und dann auf eine PVDF-Membran blot-transferiert. Die Blotabschnitte wurden in Streifen geschnitten und über Nacht in 10% Pferdeserum in PEST blockiert. Nach 2-stündigem Sondieren mit gepoolten Seren (verdünnt 1:400 in 2 Pferdeserum in PEST) von den unterschiedlichen Gruppen wurde das Konjugat (Kaninchen anti-Rinder-HPRO, Sigma, 1:8000 in 2% Pferdeserum in PEST) für eine Stunde zugesetzt. Die erkannten Antigene wurden durch Zugabe von 0,05% 3,3-Diaminobenzidintetrachlorid in PBS, enthaltend 0,01% H₂O₂ (v/v), sichtbar gemacht.
2.5. Massenspektrometrische Analyse
Die massenspektrometrische Analyse wurde im Wesentlichen wie zuvor von Jensen u. a. (Proteins, Ergänz. 2, 74–89 (1998)) besprochen durchgeführt. Kurz gesagt, wurden Proteinstellen mittels Trypsin im Gel verdaut und die Peptide wurden anschließend mit der AnchorChip^® Technologie gereinigt. Die Peptidproben wurden durch MALDI-TOF Massenspektrometrie analysiert. Das verbliebene Material wurde für eine IC-MS/MS-Analyse verwendet, um die Aminosäuresequenz der unterschiedlichen Peptide zu bestimmen.
Ergebnisse von Beispiel 2
Peptidprofil von ES-Thiol und vollständiges ES
Die Analyse der ES-Thiolproteinfraktion auf 1D- und 2D-Geleelektrophorese ist in der 4 gezeigt. ES-Thiol umfasste eine herausragende Bande bei ~30 kD sowie 3 niedermolekulare Banden und etwa 6 Peptide im Größenbereich von 45 bis 92 kD (3A). Eine Analyse dieser Proteinfraktion auf 2D-Gel ist in der 3B gezeigt. Die herausragende 30 kD Bande, die auf dem 1D-Gel sichtbar ist, wandert in etwa 6 Flecken zwischen pl 5–7 auf dem 2D-Gel. Weitere 13 blassere Flecken mit pl-Werten im Bereich von 4 bis 8 mit Molekülmassen zwischen 53 und 15 kD wurden in ES-Thiol auf 2D-Gel sichtbar (3B).
Antikörperreaktionen von immunisierten Kälbern
Die Kontrolltiere zeigten eine gewisse geringere Hintergrunderkennung von ein paar Peptiden in ES-Thiol (4). Die ES-Thiolgruppe erkannte das 30 und 31 kD Antigen stark (4).
Massenspektrometrieergebnisse
Die 6 überreichen Flecken bei 30 kD wurden aus dem Gel herausgeschnitten und in einer MALDI-Peptidmassenfingerabdruckanalyse verwendet (in 3B eingerahmt). Zwei unterschiedliche Proteine wurden in diesen Flecken identifiziert. Die Peptidmassenfingerabdruckanalyse zeigte, dass die Flecken Nr. 3–6 dasselbe 31 kD Protein enthielten, wie oben unter 4) beschrieben und Fleck 1 und 2 enthielten das 30 kD Protein, wie oben unter 5) beschrieben. Das übrige Material wurde in der IC-MS/MS-Analyse verwendet, was zu Peptidsequenzen von Fleck 1–6 führte. Diese zeigten 100% Homologie mit einem zuvor charakterisierten exkretorisch-sekretorischen Antigen, wie durch die Gene kodiert, die ein 31 kD und 30 kD Ostertagia ostertagi Protein kodieren, wie im Beispiel 1 unter 4) und 5) beschrieben.
Beispiel 3
3.1. Tiere
Insgesamt 17 Kälber, männliche und weibliche Holstein-Kreuzungen, zwischen 6 und 12 Monate alt, von 3 unterschiedlichen Bauernhöfen erhielten eine natürliche Infektion mit gastrointestinalen Nematoden während einer ersten Grassaison von mindestens 6 Monaten. Um den Immunstatus der Kälber zu bestätigen, wurden Verringerungen der Wurmbelastungen beim Unterbringen nach der Behandlung mit Benzimidazolen und anschließender Belastungsinfektion gemessen. Kälber des Bauernhofs 1 (n = 4) erhielten eine natürliche Belastung während eines Monats in der zweiten Grassaison (Claerebout u. a., Veterinary Parasitology 75, 153–167 (1998)). Kälber des Bauernhofs 2 (n = 6) und 3 (n = 7) erhielten eine experimentelle Belastung mit 50.000 O. ostertagi L₃-Larven eine Woche nach der Behandlung. Die O. ostertagi Wurmzählungen dieser Tiere (,immunisierte' Tiere) wurden mit denen von darmwurmfreien Kälbern verglichen (n = 6 für jeden Bauernhof), die eine ähnliche Belastung erhielten (,primär infizierte' Tiere). Verringerungen der Wurmzählungen waren 48%, 45% und 24% für Kälber des Bauernhofs 1, 2 bzw. 3.
Probensammlung
3.2 Schleimsammlung
Labmagenschleim von allen 17 ,immunisierten' Tieren von den 3 unterschiedlichen Bauernhöfen und von den 18 ,primär infizierten' Tieren wurde durch sanftes Abschaben der Schleimoberfläche mit einem Glasmikroskopobjektträger gesammelt. Schleimabschabungen wurden mit einem gleichen Gewicht an phosphatgepufferter Kochsalzlösung (0,05 M PBS, pH 7,3, 3 mM Na-Azid) mittels eines Ultra-Turrax Homogenisierers (13.000 UpM, 3 × 1 min) homogenisiert. Die Homogenate wurden bei 20.000 g 30 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und bei –70°C gelagert. Um die Immunglobuline zu isolieren, wurde der Überstand mit Protein G-Agarosekügelchen (Roche) behandelt. Schleim (1 ml) wurde zentrifugiert (14.000 g, 4°C, 30 min), um die Trümmer zu entfernen. 200 μl Ausgangspuffer (20 mM NaH₂PO₄, pH 7,0) wurde dem Überstand zugegeben, um sicherzustellen, dass der pH-Wert der Probe neutral blieb. Nach dem Äquilibrieren der Probe (2 Waschungen mit Ausgangspuffer) wurden 100 μl Protein G-Agarosekügelchen zugegeben. Die Probe wurde für 2 h auf einem Rotor bei 4°C gegeben, um die Bindung der Fc-Teilchen der Igs an die Kügelchen zu ermöglichen. Der Überstand wurde gesammelt und zusammen mit den ersten 5 Waschungen aufbewahrt (400 μl Waschpuffer/Waschung, 20 mM NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 7,0). Die gebundenen Igs wurden mit 400 μl Elutionspuffer eluiert (100 mM Glycin, pH 2,7), bis die OD der Elutionen 0 war. Die Fraktionen wurden sofort mit 20% Neutralisierungspuffer (1 M Tris-HCl, pH 9,0) neutralisiert. Der Überstand/Waschfraktion wurden erneut mit Protein G-Agarosekügelchen behandelt, um sicherzustellen, dass alle Antikörper, die in der Schleimprobe vorhanden waren, gesammelt wurden. Die behandelten Schleimproben wurden in 2 Gruppen für jeden Bauernhof gepoolt: die ,immunisierte' Gruppe und die ,primär infizierte' Gruppe.
3.3. Sammlung von Antikörper sekretierende Zellsonden (ASC-Sonden)
ACS-Sonden wurden von Tieren des Bauernhofs 3 (n = 13) gesammelt. Die Antikörper sekretierenden Zellsonden (ASC-Sonden) bezeichnen den Überstand einer Lymphknotenzellkultur, die mit dem Verfahren hergestellt wurde, das ursprünglich von Meeusen und Brandon beschrieben wurde (J. Immunol. Methods 172, 71–76 (1994a); Eur. J. Immunol. 24, 469–474 (1994b)). Kurz gesagt, wurden Labmagenlymphknoten bei der Leichenschau gesammelt und in kaltes PBS + 1% Penicillin-Streptomycin transportiert. Lymphozyten wurden mit Schneiden und Reizen der Knoten in 5 ml RPMI-Medium (Gibco BRL) geerntet, in RPMI-Medium gewaschen und zentrifugiert (1.000 g, 10 min, 4°C). Die roten Blutzellen wurden durch Zugabe von 20 ml Lyselösung (2% Tris, pH 7,65, 0,8 NH₄Cl) 10 min lang unter leichtem Schütteln lysiert. Zwanzig ml RPMI, enthaltend 1 Penicillin-Streptomycin und 2% Pferdeserum wurde verwendet, um die Zellen 3-mal zu waschen. Die Zellen wurden bis zu einer Endkonzentration von 5 × 10⁶ Zellen/ml im Kulturmedium resuspendiert (RPMI ergänzt mit 20% Pferdeserum, 1% Penicillin-Streptomycin, 1% Natrium–Pyruvat, 1% nicht essentielle Aminosäuren, 1% Kanamycin, 0,1% Gentamycin und 0,035% β-Mercaptoethanol). Kulturkolben mit 50 ml Zellsuspension wurden bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO₂ unter Luft ohne Stimulation inkubiert. Nach 3 Tagen wurden die Zellen durch Zentrifugation (1000 g, 10 min) entfernt und 400 ml Überstand pro Tier wurden gesammelt. Der Überstand (ADSC-Sonden) wurde 10-fach in einem SpeedVac^® konzentriert und Antikörperpools von den ,immunisierten' Tieren und den ,primär infizierten' Tieren wurden zum Screenen von Western-Blots und cDNA-Bibliotheken erstellt.
3.4. cDNA Bibliothekenscreening
O. ostertagi L₃-, L₄- und Adult-cDNA-Bibliotheken wurden in λgt11-Phage, konstruiert, auf Y1090r^– Zellen propagiert und durch Standardverfahren plattiert (Sambrook & Russell, oben). Ungefähr 100.000 Plaques von allen 3 Bibliotheken wurden mit ASC-Sonden und Schleimantikörpern durchsucht. Alle Plaques wurden zuerst mit einem Antikörperpool von ,immunisierten' Tiere von allen drei Bauernhöfen durchsucht. Alle positiven Plaques wurden erneut durchsucht, bis ein einzelnes Plaque isoliert werden konnte. Diese positiven Plaques wurden erneut mit dem Antikörperpool von ,primär infizierten' Tieren von allen drei Bauernhöfen durchsucht. Die Plaques, die ausschließlich durch die Antikörper von den ,immunen' Tieren erkannt wurden, wurden zurückgehalten, in 200 μl sterilem SM-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgSO₄) resuspendiert und bei 4°C mit einem Tropfen Chloroform gelagert. Die anderen wurden aufgrund der Kreuzerkennung der Antikörper von den ,primär infizierten' Tieren als falsch-positiv bezeichnet.
Die Inserts wurden durch PCR-Reaktion mit universellen λgt11 Primern amplifiziert und das Amplikon wurde mit einem Gelreinigungskit (QIAGEN) gelgereinigt. Das cDNA-Fragment wurde in den pGEM-T-Vektor (Promega) subkloniert und in DH5 E. coli Zellen transformiert.
Im Anschluss an das Blau-Weiß-Screening (IPTG/X-gal) und die PCR mit SP6 und T7-Vektorprimern, wurden rekombinante Klone ausgewählt und Plasmid-DNA wurde mit dem Qiagen Plasmidisolationskit isoliert. Die Nukleotidsequenz der cDNA-Klone wurde durch das Dideoxy-Kettenterminatorverfahren mittels fluroreszierenden BigDye^TM-Terminatoren in einem 377 automatisierten DNA-Sequenzierer (PE Biosystems) bestimmt. Der Zusammenbau und die Analyse von Nukleotid- und abgeleiteten Aminosäuresequenzen wurden mit dem DNASTAR^® Softwareprogramm durchgeführt.
Ergebnisse von Beispiel 3.
Das Screening-Verfahren mittels lokalen Antikörpern, die von Schleim und Kulturüberstand mit Antikörper sezernierende Zellen (ASC) erhalten wurden, machte es möglich, dass zwei zusätzliche neue Gene, die Impfstoffkomponenten kodieren, gefunden wurden:

1) ein Gen mit 900 Nukleotiden wurde sowohl in der Larven-L₄-Stadiums- als auch Adultstadiums-cDNA-Bibliothek gefunden. Die Nukleotidsequenz dieses Gens ist in der SEQ ID NO: 11 angegeben. Das Gen kodiert ein Protein mit einer Länge von 300 Aminosäuren und einem Molekulargewicht von etwa 24 kD. Das Protein hat einen isoelektrischen Punkt von pl 6,6. Die Aminosäuresequenz des Proteins ist in SEQ ID NO: 12 angegeben. Die Pfeile im linken Bild der 5 zeigen, wie Bakterien, die dieses Protein exprimieren, speziell durch Antikörper erkannt werden, die im Überstand von Lymphknoten gefunden werden, die von immunen Tieren isoliert wurden. Die Wichtigkeit dieses Befunds wird durch die Tatsache unterstrichen, dass Antikörper, die von primär infizierten Tieren isoliert werden, überhaupt nicht mit diesen Klonen reagieren. Dies zeigt deutlich die Wichtigkeit dieses Proteins bei der Induktion der Immunität. Eine weitere Charakterisierung dieses Proteins ist im Beispiel 4 angegeben.
2) ein Gen mit 1238 Nukleotiden wurde in der Larven-L₃-Stadiums- und Adultstadiums-cDNA-Bibliothek gefunden. Die Nukleotidsequenz dieses Gens ist in SEQ ID NO: 13 angegeben. Das Gen kodiert für ein Protein von 65 kD. Die Aminosäuresequenz des Proteins ist in SEQ ID NO: 14 angegeben. Die Pfeile im linken Bild der 6 zeigen, wie Bakterien, die dieses Protein exprimieren, speziell durch Antikörper erkannt werden, die vom Schleim von immunen Tieren isoliert wurden. Die Wichtigkeit dieses Befunds wird wieder durch die Tatsache unterstrichen, dass Antikörper, die von primär infizierten Tieren isoliert wurden, überhaupt nicht mit diesen Klonen reagieren. Dies zeigt deutlich die Wchitigkeit dieses Proteins bei der Induktion der Immunität.

Details über die Identifizierung des Gens voller Länge sind im Beispiel 5 angegeben.
Beispiel 4
4.1 Klonieren des Gens für das 24 kD Protein
Ein 653 bp Fragment wurde vom Genklon, der das 24 kD Protein kodiert, (De Maere u. a., Parasitoloy, 125, 383–391 (2002)) durch PCR mittels Primern amplifiziert, die auch die Restriktionsendonukleasestellen (unterstrichen) beinhalten. Die verwendeten Primer waren:
Das PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und XhoI verdaut, gelgereinigt (Qiagen Kit) und im Rahmen in den T7-/6 × Histidin-markierten Vektor pET21a kloniert (Novagen). Der korrekte Leserahmen wurde durch Sequenzierung bestätigt und das Konstrukt wurde in den Bl21 (DE3) Stamm von Escherichia coli transformiert. Rekombinante Proteinexpression wurde durch Zugabe von Isopropyl-β-thiogalactosidase 2 h lang bei 37°C hervorgerufen.
Die Zellen wurden zentrifugiert, in PBS resuspendiert und durch Zugabe von 0,1 Volumen Lysozym lysiert. Nach einem Gefrierzyklus (–70°C) und Tauzyklus wurden Zelltrümmer herunter zentrifugiert und Überstand wurde gesammelt. Zelltrümmer wurden im T7-BindBuffer^® (+ 6M Ureum) 1 h lang auf Eis resuspendiert, um die unlöslichen Proteine zu resuspendieren.
Rekombinante Proteine wurden über eine T7-Markier-Affinitätssäule und danach durch eine His-Eindungs-Harzsäule gereinigt.
4.2 Polyklonale Antikörper
100 μg rekombinantes Protein wurden 3-mal intramuskulär mit 3-wöchigen Intervallen in ein Kaninchen injiziert. Präimmunes Blut wurde direkt vor der ersten Immunisierung genommen und die Endausblutung erfolgte 3 Wochen nach der letzten Immunisierung.
4.3 Probensammlung
Die Schleimsammlung und Antikörpersekretierzellsondensammlung sind im Beispiel 3 oben (Abschnitte 3.3 und 3.4) und in De Maere u. a. (2002, oben) beschrieben.
4.4 Western Blotting
Die Erkennung von nativem oder rekombinantem 24 kD Protein durch ASC-Sonden, Schleimantikörper oder Kaninchen anti-24 kD Proteinserum wurde durch Western Blotting bewertet. Zehn μg Ostertagia-Extrakt oder Exkretions-Sekretion-Produkt wurden mit 10 SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen fraktioniert und dann auf eine PVDF-Membran übertragen. Die Fleckenabschnitte wurden in Streifen geschnitten, 2 h lang in 10 normalem Pferdeserum in PEST blockiert und über Nacht mit ASC-Sonden sondiert. Schleimantikörper oder Kaninchen anti-24 kD Proteinserum und Konjugat wurden dann zugegeben: Kaninchen anti-Rinder-HPRO (H+L) (Jackson Immunoresearch Laborstories Inc.) bei 1:8000 oder HRPO-konjugiertes Ziegen anti-Kaninchen (Sigma) bei 1:6000 in 2 normales Pferdeserum in PEST. Streifen wurden 1 Stunde lang inkubiert. Die erkannten Antigene wurden durch Zugabe von 0,05% 3,3 Diaminobenzidintetrachlorid in PBS, enthaltend 0,01% H₂O₂ (v/v), sichtbar gemacht.
4.5. Quantitative RT-PCR
Die RT-PCR wurde verwendet, um Transkripte der Gene, die das 24 kD Protein kodieren, in den parasitischen Lebensstadien von O. ostertagi zu untersuchen. Drei Mikrogramm von Gesamt-RNA von jedem Lebensstadium (L₃, L_3'' „exsheathed" bzw. ohne Hülle, L₄ und Adult) wurde für die cDNA-Synthese mittels eines oligo(dT)-Primers (Superscript^®, Life technologies) verwendet. Die Oligonukleotidprimer, die zum Nachweisen von Transkripten des Gens, das das 24 kD Protein kodiert, verwendet wurden, wurden so aufgebaut, dass sie eine etwa 300 Basenpaar lange cDNA amplifizierten. Actin (Oo-act), das von Vercauteren u. a. (Molecular and Biochemical Parasitology, 126, 201–208 (2003)) beschrieben wurde, wurde als eine grundlegend exprimierte „Housekeeping" Genkontrolle verwendet, um die Einheitlichkeit der Umkehrtranskriptionsreaktionen zu bestimmen.
Die cDNA des Gens, das das 24 kD Protein kodiert, wurde amplifiziert und mit dem Light Cycler^® und dem Lightcycler-Schnellstart DNA Master SYBR Grün I Kit (Roche, Mannheim, Deutschland) amplifiziert und quantifiziert. Das Reaktionsgemisch besteht aus einer Master-Mischung, enthaltend Taq DNA Polymerase, dNTP-Gemisch und SYBR Grün I, 2 mM MgCl₂, 5 pM von jedem Primer und 2 μl Matrizen-cDNA von insgesamt 20 μl. Die Bestätigung der Spezifität der PCR-Produkte wurde durch Unterwerfen dieser Produkte einer Schmelzkurvenanalyse, anschließende Agarosegelelektrophorese und Sequenzierung durchgeführt. Die PCR-Analyse wurde dreifach durchgeführt und die Quantifizierung trat mit externen Standards von 24 kD Protein und Oo-act cDNA auf. Die Berechnung wurde mit der Lightcycler Analysesoftware durchgeführt. Die relative Menge an 24 kD Proteinexpression wurde als Verhältnis ((Kopienzahl von 24 kD Protein/Kopienzahl von Housekeeping-Gen) × 10) aufgetragen.
Ergebnisse von Beispiel 4:
Rekombinantes 24 kD Protein (7A) wurde durch ASC-Sonden und Schleimantikörper von immunen Tieren (7B-C) erkannt. Dies zeigt, dass die Epitope des rekombinanten Proteins denen des nativen Proteins ähnlich sind und dass das rekombinante Protein dieselben schützenden Fähigkeiten wie das native Protein hat. Antikörper gegen das rekombinante Protein in Kaninchen erkennen daher auch das native Protein auf 1D-Gel (7D) und 2D-Gel (8A).
Antikörper gegen rekombinantes 24 kD Protein wurden verwendet, um die stufenspezifische Expression des Proteins auf Western Blot zu spezifizieren (8B).
Die RT-PCR zeigte die Expression des Proteins in allen Lebensstadien, insbesondere in L₃ mit Hülle und in dem L₄-Stadium (9A).
Da das 24 kD Protein hauptsächlich in den Larvenstadien L₃ und L₄ exprimiert wird, stört ein Impfstoff, der auf diesem Protein beruht, die Entwicklung der Larvenparasitenstadien L₃ (das infektiöse Stadium) und L₄, wodurch die Etablierung einer Ostertagia-Infektion reduziert oder verhindert wird. Dies führt wiederum zu einer reduzierten Wurmbelastung im Tier mit allen günstigen hier angegebenen Konsequenzen.
Beispiel 5
Erhalt des Gens voller Länge, das das 65 kD Protein kodiert
Unter Verwendung des Ad-Klons (De Maere u. a., Parasitoloy, 125, 383–391 (2002)) als Grundlage für den speziellen Primeraufbau wurde die vollständige Sequenz des Gens, wie in SEQ ID NO: 13 gezeigt, durch das Verfahren der 5'/3'-Schnellamplifikation von cDNA-Enden (RACE) erhalten. Der 5'-RACE-Kit von GibcoBRL wurde verwendet, um das 5'-Ende des Gens für das 65 kD Protein zu identifizieren. Zuerst wurde eine Strang-cDNA in einer Umkehrtranskriptionsreaktion mittels des spezifischen Primers 65Rev1 (siehe unten) auf 2 μg Adult-RNA erzeugt. Diese cDNA wurde poly-C-seitig an ihrem 3'-Ende mit der terminalen Deoxytransferase und als Matrize in einer PCR mit dem verkürzten Ankerprimer (AAP, GibcoBRL):
und dem genspezifischen Primer 65Rev2 (siehe unten) verwendet. Das 5' RACE PCR-Produkt wurde kloniert und sequenziert.
Der 3'-RACE Kit von GibcoBRL wurde verwendet, um das 3'-Ende des Gens für das 65 kD Protein zu identifizieren. Kurz gesagt wurde Erststrang-cDNA in einer Umkehrtranskriptionsreaktion mit einem oligo(dT) enthaltenden Adapterprimer (AP) auf 2 μg Adult-RNA erzeugt. Diese cDNA wurde als Matrize in einer PCR mit einem genspezifischen Primer 65kForw (siehe unten) und dem universalen Amplifikationsprimer (UAP, GibcoBRL):
Verwendet. Das 3'-RACE PCR-Produkt wurde kloniert und sequenziert.
Ein Abgleich aller Sequenzdaten machte es möglich, neue genspezifische Primer zu entwerfen, die das Start- und Stoppkodon, For65 und Rev65 umfassen (siehe unten). Das SUPERSCRIPT^TM Präamplifikationssystem für die Erststrang-cDNA-Synthese (GibcoBRL) wurde verwendet, um eine Matrize für eine PCR mit diesen Primern zu erzeugen und so die cDNA voller Länge zu erhalten.
Genspezifische Primer, die zur Identifizierung der kodierenden Sequenz voller Länge der cDNA für das 65 kD Protein verwendet werden, sind:
Quantitative RT-PCR
Die RT-PCR wurde verwendet, um Transkripte des Gens für das 65 kD Protein in den parasistischen Lebensstadien von O. ostertagi zu erforschen. Drei Mikrogramm der Gesamt- RNA aus jedem Lebensstadium (L₃, L₃ ohne Hülle, L₄ und Adult) wurden für die cDNA-Synthese mit einem oligo(dT)-Primer (Superskript, Life technologies) verwendet. Die Oligonukleotidprimer, die für einen Nachweis des Transkripts für das 65 kD Protein verwendet wurden, wurden entworfen, um eine ungefähr 300–500 Basenpaar lange cDNA zu amplifizieren. Aktin (Oo-act), das von Vercauteren u. a. (2003, oben) beschrieben wurde, wurde als konstitutiv exprimierte „Housekeeping"-Genkontrolle verwendet, um die Einheitlichkeit der Umkehrtranskriptionsreaktionen zu bestimmen.
Die cDNA für das 65 kD Protein wurde amplifiziert und wie im Beispiel 4, Abschnitt 4.5 beschrieben quantitativ bestimmt.
Ergebnisse von Beispiel 5:
Die vollständige Kodierungssequenz des Gens, das das 65 kD Protein kodiert, wie die SEQ ID NO: 13 zeigt, ist 1722 bp lang und kodiert für ein Protein mit einem Molekulargewicht von 65 kD (SEQ ID NO: 14). Die N-terminale Aminosäuresequenz enthält eine mutmaßliche Signal-Sequenz, die wahrscheinlich zwischen der Aminosäure 16 und 17 gespalten ist (Glycin-Glycin). Die kodierte Proteinsequenz enthält 5 N-Glycosylierungsstellen, eine Zinkbindungsregion (cd00203: HEXXHALGFXHEXXRXDR) und eine pfam01400 Domäne (HEXXHXXG), wodurch sie in die Familie von Astacin gehört (Peptidasefamilie M12A).
Die RT-PCR zeigte eine stufenspezifische Expression des Gens für das 65 kD Protein durch Ostertagia ostertagi. Transkripte wurden in den Stadien L₃ und Adult mit besonders hohem Expressionsniveau im adulten Lebensstadium ermittelt (9B). Dies stimmt mit dem Durchsuchen der cDNA-Bibliothek überein (De Maere u. a., 2002, oben).
Da das 65 kD Protein hauptsächlich in den Adultstadien exprimiert wird, stört ein Impfstoff, der auf diesem Protein beruht, die Entwicklung zum adulten Parasiten. Dies führt zu einer verringerten Produktion von Eiern, was wiederum die Kontamination der Felder reduziert. Dadurch werden die Wurmbelastung und Kontaminationsniveaus später in der Saison gesenkt.
Beispiel 6
Expression im Baculovirus-Expressionsvektorsystem
Die kodierenden Regionen für die 65, 28, 31 und 24 kD Proteine der Erfindung wurden von ihren jeweiligen Vektoren in ein pFastBac^®-Plasmid (Invitrogen) mittels Standardverfahren subkloniert. Diese FastBac-Konstrukte wurden in Sf9-Insektenzellen transfiziert, um rekombinante Bakuloviren gemäß den Anweisungen des Herstellers (Invitrogen) zu erzeugen. Die nächsten Expressionskulturen wurden mittels Sf9 und Sf158 Insektenzellen laufen gelassen, die in Mikroträger-Spinner-Kolben von 100 und 250 ml kultiviert wurden. Verwendete serumfreie Kulturmedien waren CCM3^TM (Hyclone) und SF900-II^TM (Invitrogen). Die Zellen wurden bei einer MOI von 0,1–0,5 infiziert und 3–4 Tage kultiviert. Dann wurden die Kulturen zentrifugiert, der Kulturüberstand geerntet und die Zellpellets wurden 10 × konzentriert in PBS konzentriert. Triton X-100^® wurde allen Proben bei einer Konzentration von 0,2% v/v zugegeben. Die Proben wurden über Nacht bei Raumtemperatur extrahiert, zentrifugiert und die Überstände wurden bei –20°C bis zu ihrer Verwendung gelagert.
Extraktüberstände wurden auf standardmäßigen SDS/PAGE-Gels neben geeigneten Markern laufen gelassen, auf Immobilon-P^® Transfermembran (Millipore) aufgetragen, die Membranen wurden mit anti-His-Tag monoklonalem Antikörper (Sigma) gefärbt und sichtbar gemacht.
Die 10 zeigt die Ergebnisse dieser Bakulovirusexpressionen im Western Blot; die Proteine der Erfindung waren in den Insektenzell-Pellet-Proben am häufigsten. Diese werden verwendet, um Impfstoffe für Impfungen zu formulieren.
FIGURENLEGENDE
1: Dot-Blot von lysierten Bakterien, die eine Nukleotidsequenz umfassen, welche (mindestens einen immunogenen Teil) des Proteins kodiert, wie in SEQ ID NO: 8 gezeigt. Das Durchsuchen erfolgte mit speziell hergestelltem anti-exkretorisch-sekretorischem Kaninchen-Antiserum (siehe Beispiel 1). Ein Pfeil zeigt einen der positiven Klone.
2: Western Blots; in der 2B des 28 kD Proteins mit anti-ES und anti-EX Kaninchen-Antiserum (siehe Beispiel 1) und in der 2C des 25 kD Proteins mit anti-ES und anti-EX Kaninchen-Antiserum (siehe Beispiel 1).
3: Analyse der ES-Thiol-Proteinfraktion (siehe auch Beispiel 2); in der 3A eine 1D-Gelelektrophorese und in der 3B eine 2D-Gelelektrophorese. Das 2D-Gel zeigt das 31 kD Protein (die vier ganz rechts liegenden Flecken im eingerahmten Bereich) und das 30 kD Protein (die zwei ganz links liegenden Flecken im eingerahmten Bereich).
4: Antikörperreaktion von mit ES-Thiol immunisierten Kälbern auf ES-Fraktionsproteine.
5: Dot-Blot von lysierten Bakterien, die eine Nukleotidsequenz umfassen, welche das 24 kD Protein kodiert, wie in SEQ ID NO: 12 gezeigt. Das Durchsuchen erfolgte mit speziell hergestellten Antikörpern aus dem Lymphknotenüberstand von immunen Tieren (linkes Bild). (Siehe auch die Beispiele 3 und 4). Die Pfeile zeigten einige der positiven Klone. Das rechte Bild zeigt einen vergleichbaren Dot-Blot, der nun mit Antikörpern von primär infizierten Tieren inkubiert ist. Mit diesen Antikörpern werden keine positiven Klone erkannt.
6: Dot-Blot von lysierten Bakterien, die eine Nukleotidsequenz umfassen, welche das 65 kD Protein kodiert, wie in SEQ ID NO: 14 gezeigt. Das Durchsuchen erfolgte mit speziell hergestellten Antikörpern aus dem Schleim von immunen Tieren (linkes Bild). (Siehe auch die Beispiele 3 und 5). Die Pfeile zeigen einige der positiven Klone. Das rechte Bild zeigt einen vergleichbaren Dot-Blot, der jetzt mit Antikörpern von primär infizierten Tieren inkubiert ist. Mit diesen Antikörpern werden keine positiven Klone erkannt.
7: Elektrophoretische Charakterisierung des 24 kD Proteins; 7A: Ergebnis der Expression von rekombinantem 24 kD Protein in E. coli; 7B: ein Western Blot von rec 24 kD Protein, entwickelt mit ASC-Sonden-Antikörpern von immunen Tieren; 7C: Western Blot von rec 24 kD Protein, entwickelt mit Schleim-Antikörpern von immunen Tieren, und 7D: Western Blot von L₄-Extrakt, entwickelt mit Kaninchen anti-24 kD Protein-Antikörpern.
8: Charakterisierung des 24 kD Proteins; 8A: 2D-Gelelektrophorese und Western Blotting von Adult-Extrakt von Ostertagia ostertagi, entwickelt mit speziellen Antikörpern gegen in E. coli exprimiertem, rekombinantem 24 kD Protein, gezüchtet in Kaninchen, und 8B: stufenspezifische Expression von 24 kD Protein, entwickelt mit anti-rec 24 kD Protein-Antikörpern.
9: Ergebnisse von quantitativen RT-PCRs, um die stufenspezifische Expression zu ermitteln; in 9A für das 24 kD Protein (siehe Beispiel 4) und in 9B für das 65 kD Protein (siehe Beispiel 5).
10: Western Blot von Ostertagia-Proteinen, die im Baculovirus-Expressionsvektorsystem exprimiert sind (siehe Beispiel 6), die Färbung erfolgte mit einem anti-His Antikörper

Spur 1 und 11: BioRad Protein Präzisionsmarker^®
Spur 2: 65 kD Protein, Überstand + 0,2% TX-100
Spur 3: 65 kD Protein, Zellpellet in PBS + 0,2% TX-100 (5 × konz.)
Spur 4: 28 kD Protein, Überstand + 0,2% TX-100
Spur 5: 28 kD Protein, Zellpellet in PBS + 0,2% TX-100 (5 × konz.)
Spur 6: 31 kD Protein, Überstand + 0,2% TX-100
Spur 7: 31 kD Protein, Zellpellet in PBS + 0,2% TX-100 (5 × konz.)
Spur 8: 24 kD Protein, Überstand + 0,2% TX-100
Spur 9: 24 kD Protein, Zellpellet in PBS + 0,2% TX-100 (5 × konz.)
Spur 10: leer

Claims

Nukleinsäuresequenz, die ein 30 kD Ostertagia ostertagi Protein kodiert, wobei die Nukleinsäuresequenz mindestens 85% Homologie zur Nukleinsäuresequenz von Ostertagia ostertagi, wie in SEQ ID NO: 9 dargestellt, aufweist.
DNA-Fragment, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1.
Rekombinantes DNA-Molekül, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 oder ein DNA-Fragment gemäß Anspruch 2, unter der Kontrolle eines funktionsfähig verbundenen Promotors.
Lebender rekombinanter Trägermikroorganismus oder Virus, umfassend eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1, ein DNA-Fragment nach Anspruch 2 oder ein rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 3.
Wirtszelle umfassend eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1, ein DNA-Fragment nach Anspruch 2, ein rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 3 oder einen lebenden rekombinanten Trägermikroorganismus oder Virus nach Anspruch 4.
30 kD Ostertagia ostertagi Protein, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein eine Sequenzhomologie von mindestens 90% zur Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 10 dargestellt, aufweist.
Ostertagia ostertagi Protein nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein durch eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 kodiert ist.
Ostertagia ostertagi Protein nach Anspruch 6 zur Verwendung in einem Impfstoff.
Verwendung einer Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1, eines DNA-Fragments nach Anspruch 2, eines rekombinanten DNA-Moleküls nach Anspruch 3, eines lebenden rekombinanten Trägermikroorganismus oder Virus nach Anspruch 4, einer Wirtszelle nach Anspruch 5 oder eines Proteins nach Anspruch 6, zur Herstellung eines Impfstoffs zum Bekämpfen einer Ostertagia ostertagi Infektion.
Impfstoff zum Bekämpfen einer Ostertagia ostertagi Infektion, dadurch gekennzeichnet, dass der Impfstoff mindestens ein Ostertagia ostertagi Protein nach Anspruch 6 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Impfstoff zum Bekämpfen einer Ostertagia ostertagi Infektion, dadurch gekennzeichnet, dass der Impfstoff eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1, ein DNA-Fragment nach Anspruch 2, ein rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 3, einen lebenden rekombinanten Trägermikroorganismus oder Virus nach Anspruch 4 oder eine Wirtszelle nach Anspruch 5 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Impfstoff zum Bekämpfen einer Ostertagia ostertagi Infektion, dadurch gekennzeichnet, dass der Impfstoff Antikörper gegen ein Protein nach Anspruch 6 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Impfstoff nach Anspruch 10–12, dadurch gekennzeichnet, dass der Impfstoff ein Adjuvans umfasst.
Impfstoff nach Anspruch 10–13, dadurch gekennzeichnet, dass der Impfstoff ein zusätzliches Antigen umfasst, das von einem Virus oder Mikroorganismus, pathogen für Vieh, einem Antikörper gegen das Antigen oder der genetischen Information, die das Antigen kodiert, und/oder einer pharmazeutische Komponente stammt.
Impfstoff nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus oder der Mikroorganismus, pathogen für Vieh, aus der Gruppe von Rinder-Herpesvirus, Rinder virales Diarrhö-Virus, Parainfluenza-Virus Typ 3, Rinder-Paramyxovirus, Maul- und Klauenseuche-Virus, Pasteurella haemolytica, respiratorisches Rinder-Synzytial-Virus, Theileria sp., Babesia sp., Trypanosoma sp., Anaplasma sp., Neospora caninum, Staphylococcus aureus, Streptococcus, agalactiae, Mycoplasma, E. Coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Cryptosporidium, Samonella und Streptococcus dysgalactiae ausgewählt ist.
Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs nach Anspruch 10–15, wobei das Verfahren das Zumischen einer Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1, eines DNA-Fragments nach Anspruch 2, eines rekombinanten DNA-Moleküls nach Anspruch 3, eines lebenden rekombinanten Trägermikroorganismus oder Virus nach Anspruch 4, einer Wirtszelle nach Anspruch 5, eines Proteins nach Anspruch 6 oder von Antikörpern gegen ein Protein nach Anspruch 6 und eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers umfasst.
Diagnostischer Testkit zum Nachweisen von Ostertagia ostertagi Nukleinsäuresequenzen, umfassend eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1.
Diagnostischer Testkit zum Nachweisen von antigenem Material von Ostertagia ostertagi, umfassend Antikörper gegen ein Protein nach Anspruch 6.
Diagnostischer Testkit zum Nachweisen von Antikörpern gegen Ostertagia ostertagi, umfassend ein Ostertagia ostertagi Protein nach Anspruch 6.