AT503690A1 - Hypoallergene moleküle - Google Patents

Description

• *· · I« ·· ··· # · · ·· · • · ···· · · • · ····· ··· · • · · · · · ·»# Μ · Μ ···· - 1 -

Die vorliegende Erfindung betrifft neue hypoallergene Moleküle und deren Verwendung.

Die Typ I-Allergie ist eine durch IgE vermittelte Überempfindlichkeitserkrankung, von der beinahe 25% der Bevölkerung betroffen sind. Sie beruht auf der Erkennung harmloser, über die Luft übertragener Insekten-, Gift-, Nahrungsmittel-Allergen- und Kontakt-Allergen-Antigene, die aus an sich harmlosen Antigen-Quellen, wie Pollen-, Insekten-, Schimmelpilz- und Tier-Proteinen stammen, durch spezifisches Immunglobulin E. Die Vernetzung von an Effektor-Zellen gebundenen IgE-Antikörpern führt zu einer Freisetzung von Entzündungs-Mediatoren (z.B. Histamin, Leukotriene) und somit zu unmittelbaren Symptomen einer Allergie (z.B. Rhinokonjunktivitis, Asthma, Dermatitis, Anaphylaxis). T-Zell-Aktivierung über sowohl IgE-abhängige als auch IgE-unabhän-gige Mechanismen trägt zur chronischen allergischen Entzündung bei.

Die vermutlich einzige ursächliche Form der Allergiebehandlung ist die Allergen-spezifische Immuntherapie, welche auf der wiederholten Verabreichung zunehmender Mengen von Allergen-Extrakten für die meisten Quellen basiert. Zahlreiche klinische Studien belegten die klinische Effizienz der Injektions-Immuntherapie, und es gibt Beweise für mehrere immunologische Mechanismen, die dieser Behandlung zugrunde liegen. Wegen der Schwierigkeit, qualitativ hochwertige Allergen-Extrakte aus bestimmten Allergenquellen herzustellen und der Tatsache, dass die Verabreichung von Allergenen an Patienten schwere Nebenwirkungen hervorrufen kann, kann eine Allergen-spezifische Immuntherapie nur für bestimmte Patientengruppen und Krankheitsmanifestationen empfohlen werden. Es ist besonders schwierig, Patienten mit Co-Sensibilisierungen für mehrere verschiedene Allergen-Quellen und Patienten, die an schweren Krankheitsmanifestationen, wie allergischem Asthma leiden, zu behandeln. Allergisches Asthma ist eine der heftigsten Manifestationen einer Allergie, weil sie die Qualität des täglichen Lebens stark beeinträchtigt, eine hohe Rate an Spitalsaufenthalten verursacht und sich in ernsten, lebensbedrohenden Formen manifestieren kann, die eine Intensiv-pflege des Patienten erfordern.

Allergenextrakte, die aus natürlichen Allergen-Quelllen zubereitet werden, sind von roher („crude") Natur, und es ist unmöglich, die Qualität und Mengen einzelner Allergene in solchen

NACHGEREICHT 2

Präparaten mit technischen Mitteln zu beeinflussen. Sie enthalten auch zahlreiche Undefinierte, nicht-allergene Komponenten, und mehrere jüngere Untersuchungen weisen auf die schlechte Qualität solcher Extrake hin und dokumentieren ihre große Heterogenität .

Im letzten Jahrzehnt wurden große Fortschritte auf dem Gebiet der molekularen Allergen-Charakterisierung unter Verwendung rekombinanter DNA-Technologie gemacht. Eine große Anzahl der wichtigsten krankheitsbewirkenden Allergene wurde bis auf Molekularebene charakterisiert, und rekombinante Allergene, die die Epitop-Komplexität natürlicher Allergen-Extrakte nachahmen, wurden erzeugt. Außerdem verwendeten mehrere Forschungsgruppen das Allergen-Strukturen betreffende Wissen, um definierte neue Allergie-Vakzine zu entwickeln. Die Gentechnik, die synthetische Peptid-Chemie und die Konjugation von Allergenen mit immunstimulierenden DNA-Sequenzen wurden verwendet, um die allergene Aktivität der neuen Vakzine - und somit die Rate von Therapieinduzierten Nebenwirkungen - zu verringern. Erste vielversprechende klinische Studien wurden mit solchen Allergen-Derivaten durchgeführt. Interessanterweise zeigte es sich, dass, obwohl die IgE-Reaktivität von gentechnisch erzeugten rekombinanten Allergenen und von von Allergenen stammenden synthetischen T-Zell-Epitop-enthaltenden Peptiden stark verringert oder sogar eliminiert werden konnte, diese Derivate noch immer systemische Nebenwirkungen hervorrufen konnten, die mehrere Stunden nach der Injektion auftraten. Beispielsweise wurde berichtet, dass T-Zell-Epitop-Peptide des Katzen-Hauptallergens, Fel d 1, mehrere Stunden nach intrakutaner Injektion Asthma und bronchiale Hyperreaktivität induzierten, und es gibt einen starken Beweis dafür, dass diese Wirkung durch T-Zellen vermittelt und durch MHC eingeschränkt ist.

Diese Ergebnisse zeigen an, dass das Entfernen der IgE-Reak-tivität die durch IgE vermittelten Nebenwirkungen verringert, weil keine unmittelbaren Reaktionen im Verlauf dieser Immuntherapie-Untersuchungen aufgezeichnet wurden. Jedoch sind die Allergen-spezifischen T-Zell-Epitope, die in den rekombinanten Allergen-Derivaten sowie in den Peptid-Mischungen erhalten blieben, für die späten Nebenwirkungen verantwortlich (z.B. sehr problematische oder atopische Dermatitis, chronische T-Zell-ver-mittelte allergische Haut-Manifestation). Die im Fall der rekom-

NACHGEREICHT binanten Allergen-Derivate bewirkten Nebenwirkungen waren relativ schwach und können im Fall der T-Zell-Peptid-Vakzine durch angemessene Dosierung überwunden werden. Es scheinen daher beide neuen Ansätze für die Immuntherapie allergischer Rhinokonjunkti-vitis sehr vielversprechend, haben jedoch ihre Grenzen, wenn es um die Behandlung schwerer Formen von allergischem Asthma geht, wo die Induktion später Nebenwirkungen in der Lunge sehr problematisch sein kann.

Um Peptide, Polypeptide und Proteine zu verabreichen und folglich eine effiziente Immunantwort gegen sie hervorzurufen, werden regelmäßig Adjuvantien und/oder Träger verwendet. Komplettes Freundsches Adjuvans z.B. ist eines der stärksten Adjuvantien, die zur Verfügung stehen. Wegen seiner Nebenwirkungen ist jedoch seine Verwendung für Menschen nicht gestattet. Daher besteht ein Bedarf an Vakzin-Zusammensetzungen, die eine starke Immunantwort gegen Peptide und Polypeptide, die von Allergenen und natürlich von anderen Antigenen abstammen, hervorrufen, wobei die Verwendung von komplettem Freundschem Adjuvans vermieden wird. Weiters könnte BSA, obgleich es als Träger in Tiermodellen erfolgreich verwendet wurde, für die Verwendung in Human-Vakzin-Zusammensetzungen nicht geeignet sein, wegen des Risikos von nachteiligen Reaktionen, wie dem Risiko der Übertragung einer Prionen-Erkrankung (Variante Creutzfeldt-Jakob-Krankheit). Eine weitere Herausforderung bei der Entwicklung eines wirksamen Vakzins gegen Allergene ist die Notwendigkeit einer Immunantwort, die die Allergene in einem Individuum oder Tier rasch verringern kann. Daher sind hohe Konzentrationen von Allergen-spezifischen Antikörpern im Blut, die vor allem vom IgG-Subtyp sind, notwendig. Bei Schleimhaut-Oberflächen sind IgA-Antikörper der primäre Subtyp.

Cholera-Toxin, ein auf dem Gebiet bekanntes Trägerprotein, wird auch regelmäßig als Adjuvans verwendet, wobei die Notwendigkeit eines kompletten Freundschen Adjuvans in einer Vakzin-Zusammensetzung eliminiert wird. Cholera-Toxin erhöht jedoch die gesamten und spezifischen IgE-Antikörper-Mengen und führt zu mit IgE in Verbindung stehenden entzündlichen Reaktionen.

Wegen der Nebenwirkungen, die von den meisten für eine Impfung verwendeten Trägerproteinen hervorgerufen werden, besteht ein Bedarf an TrägerSystemen, die Immunantworten gegen Allergene oder andere Antigene stimulieren können, ohne Verwendung toxi-

nachgereici t I ·· # ·· #

scher Adjuvantien, ohne Verwendung schlecht verträglicher Trägerproteine und - in bestimmten Situationen - ohne Stimulierung potentiell pathologischer Immunantworten. Neue Trägersysteme, die diesen Anforderungen entsprechen, können zur Bildung neuer Konjugate und Zusammensetzungen, die für die Behandlung oder Prävention von Krankheiten, wie allergischen Erkrankungen, geeignet sind, verwendet werden.

Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Medikamente und Träger vorzusehen, mit welchen die zuvor erwähnten Nachteile überwunden werden und die eine Allergen-Impfung mit verringerten Nebenwirkungen gestatten.

Daher betrifft die vorliegende Erfindung ein hypoallergenes Protein bestehend aus mindestens einem von einem Allergen stammenden hypoallergenen Molekül, welches mit mindestens einem zweiten nicht-allergenen Protein oder Fragment desselben fusioniert oder konjugiert ist.

Um eine verstärkte Immunantwort gegen ein Molekül, insbesondere ein hypoallergenes Molekül gemäß der vorliegenden Erfindung, hervorzurufen, wird dieses Molekül mit einem Träger (mittels Gentechnik) fusioniert oder mit diesem (durch chemische Reaktionen) konjugiert. Ein herkömmlicher und üblicherweise verwendeter Träger ist z.B. KLH („Keyhole limpet hemocyanin", Schlüsselloch-Napfschnecken-Haemocyanin). KLH, welches aus der riesigen Meeresmolluske („giant sea mollusc") Megathura crenula-ta isoliert wird, ist eines der populärsten Trägerproteine, die zur Erzeugung eines Immunogens zur Injektion verwendet wird. Wegen seiner großen Masse und weil es ein Nicht-Säuger-Protein ist, induziert KLH eine starke Antikörperantwort.

Das zweite Protein (der „Träger" oder das „Trägerprotein"), das mit einem hypoallergenen Molekül der Erfindung fusioniert oder konjugiert werden soll, stammt nicht von einem Allergen („nicht-allergen"). Das bei der vorliegenden Erfindung verwendete Trägerprotein kann jedoch eine T-Zell-Reaktivität aufweisen und/oder eine Immunantwort gegen sich selbst und das damit fusionierte oder konjugierte hypoallergene Molekül hervorrufen, wenn es einem Tier- oder Menschenkörper verabreicht wird. Folglich werden, wenn das Trägerprotein von einem Pathogen (z.B. Virus, Bakterien usw.) abstammt, (schützende) Antikörper, die gegen den Träger und die Pathogene gerichtet sind, erzeugt.

Wie hierin verwendet bedeutet „hypoallergenes Protein" ein

NACHGEREICHT ··

• · • · • · ·· - 5 -

Fusionsprotein/-Polypeptid eines Trägers aus einer nicht-aller-genen Quelle mit einem hypoallergenen Molekül. Weiters soll ein „hypoallergenes Protein" auch ein Konjugationsprodukt (z.B. chemische Kopplung, Adsorption) eines Trägers mit einem hypoallergenen Molekül sein. „Hypoallergen", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Moleküle mit reduziertem allergenen Potential. Solche Moleküle haben eine im Vergleich zum Wildtyp-Protein, aus welchem diese Moleküle stammen, verminderte Kapazität, allergische Reaktionen bei einem Individuum hervorzurufen.

Das mindestens eine hypoallergene Molekül, das von einem Allergen stammt und mit einem zweiten Protein fusioniert/konju-giert ist, ist vorzugsweise C- und/oder N-terminal trunkiert. „C- und/oder N-terminale Trunkierung", wie hierin verwendet, bedeutet, dass Aminosäurereste entweder vom N-Terminus oder vom C-Terminus oder sowohl vom N- als auch vom C-Terminus des Wildtyp-Allergens durch Deletion von mindestens 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15, 20, 30 Aminosäureresten entfernt worden sind.

Die hypoallergenen Moleküle, d.h. Peptide/Polypeptide, umfassen vorzugsweise 10 bis 50 Aminosäuren, mehr bevorzugt 15 bis 40 Aminosäuren, insbesondere 20 bis 30 Aminosäuren und weisen eine verminderte IgE-Reaktivität auf. Diese Moleküle sind entworfen, um T-Zell-Epitope auszuschließen, welche T-Zell-vermit-telte Nebenwirkungen verursachen könnten. T-Zell-Epitope und Moleküle, die eine verringerte T-Zell-Antwort aufweisen, können mittels Methoden, die dem Fachmann bekannt sind, bestimmt und identifiziert werden (z.B. Bercovici N. et al., Clin Diagn. Lab. Immunol. (2000) 7:859-864).

Es zeigte sich, dass es unter Verwendung von Oberflächen-ex-ponierten Peptiden möglich ist, Peptid-Vakzine zu entwerfen, die von Allergenen stammen, wie den Graspollen-Hauptallergenen, z.B. Phi p 1, und vom Birkenpollen-Hauptallergen, Bet v 1. Die erhaltenen Daten zeigen, dass solche Peptid-Vakzine für jedes Allergen erzeugt werden können, dessen primäre Struktur gemäß IgE-Epitop-Kartierung, dreidimensionaler Struktur-Daten oder Compu-ter-unterstützer Voraussage von Oberflächen-exponierten Domänen, bekannt ist. Jedoch bleibt die Auswahl geeigneter Peptide, die für eine Impfung verwendet werden können, äußerst wichtig, weil nicht alle mit diesen Methoden identifizierten Peptide bei einer Impfung verwendet werden können. Die geeigneterweise für Imp-

NACHGEREICHT - 6 - ·· ♦♦·♦ fungszwecke verwendeten Peptide sollten eine reduzierte IgE-Bin-dungskapazität und - um späte Nebenwirkungen zu verringern oder zu vermeiden - eine reduzierte T-Zell-Reaktivität aufweisen.

Der Ausdruck „von einem Allergen stammend", wie hierin verwendet, bedeutet, dass die hypoallergenen Moleküle gemäß der vorliegenden Erfindung direkt von einem Allergen durch Fragmentierung oder Trunkierung erhalten werden. Die Aminosäuresequenz der hypoallergenen Moleküle der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise zu mindestens 80%, mehr bevorzugt zu mindestens 90%, am meisten bevorzugt zu mindestens 95%, insbesondere zu 100% identisch mit dem Aminosäureabschnitt des Wildtyp-Allergens, von welchem das hypoallergene Molekül stammt. Jedoch sollten die Moleküle, die nicht zu 100% identisch mit den Wildtyp-Allergen-Fragmenten sind, mit mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 70%, mehr bevorzugt mindestens 80%, am meisten bevorzugt mindestens 90% Festigkeit an einen Antikörper oder an Antikörper, vorzugsweise an IgG-Antikörper, binden können, die gegen die Wildtyp-Allergen-Fragmente gerichtet sind.

Der Grad der Identität einer ersten Aminosäuresequenz mit einer zweiten Aminosäure^kann durch einen direkten Vergleich zwischen beiden Aminosäuresequenzen unter Verwendung bestimmter Algorithmen bestimmt werden. Solche Algorithmen sind beispielsweise in verschiedenen Computer-Programmen inkorporiert (z.B. „BLAST 2 SEQUENCES (blastp)" (Tatusova et al. (1999) FEMS Micro-biol. Lett. 174:247-250; Corpet F, Nucl. Acids Res. (1988) 16:10881-10890).

Die trunkierten Moleküle gemäß der vorliegenden Erfindung können definiert werden als Teile des kompletten Allergens, die eine geringere Aktivierung von Allergen-spezifischen T-Zellen induzieren als das komplette Wildtyp-Allergen (vorzugsweise mindestens eine 30%, mehr bevorzugt mindestens eine 50%, am meisten bevorzugt mindestens eine 70% Reduktion), eine um mehr als 50% reduzierte (vorzugsweise um mehr als 70%) allergene Aktivität aufweisen, wie mittels IgE-Bindungs-Tests beurteilt, und die Fähigkeit haben, eine IgE-vermittelte Zellaktivierung zu induzieren, und bei Kopplung mit einem Träger, wie beschrieben, IgG-Antikörper zu induzieren, die die Bindung von polyklonalem IgE von allergischen Patienten an das komplette Wildtyp-Allergen inhibieren.

Die Peptide sollten Sequenzen aus den Allergenen enthalten,

NACHGEREICHT ··

·» ··· ·· · ·· • · ···· ··· • · · ·

7 um Überlappungen mit den Mimotopen zu vermeiden. Jedoch stellen Mimotope, die kleine Peptid-Nachahmungen („peptide mimics") (weniger als 15 Aminosäuren) von Antigen-Stücken sind und aus beliebigen Peptid-Bibliotheken erhalten wurden, keine originalen, von Allergen-stammenden Moleküle, wie hierin definiert, dar. Sie können nicht erfindungsgemäß verwendet werden, weil sie zu klein sind, um eine robuste blockierende IgG-Antwort zu induzieren.

Die hypoallergenen Moleküle gemäß der vorliegenden Erfindung können mittels rekombinanter Methoden oder chemischer Synthese erhalten werden. Alternativ ist es natürlich auch möglich, die Moleküle durch enzymatische oder chemische Spaltung des Wildtyp-Allergens oder eines das Molekül, an dem ein Interesse besteht, aufweisenden Polypeptids/Proteins zu erhalten.

Das hypoallergene Molekül kann vorzugsweise mindestens zwei trunkierte Allergen-Moleküle umfassen, welche von mindestens einem Allergen stammen, wobei die Reihenfolge der trunkierten Allergen-Fragmente sich von der Reihenfolge der Fragmente im Wildtyp-Allergen unterscheidet, wenn die mindestens zwei Moleküle vom gleichen Allergen stammen.

Das hypoallergene Molekül gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein oder mehrere (vorzugsweise mindestens 2, mehr bevorzugt mindestens 3) hypoallergene Moleküle, wie hierin definiert, umfassen, was somit zu einem Fusionsprotein führt. Die einzelnen hypoallergenen Moleküle des Fusionsproteins, dem natürlich auch die IgE-Bindungskapazität fehlt und dem die T-Zell-Epitope fehlen, können von Allergenen desselben Ursprungs und/oder verschiedenen Ursprungs stammen. Wenn die Moleküle vom selben Allergen stammen, sollte die Reihenfolge im hypoallergenen Fusionsprotein nicht mit der Reihenfolge im Wildtyp-Allergen identisch sein (dies verhindert die Rekonstitution und Bildung von IgE-Bindungsstellen) (vgl. z.B. W02004/065414, Linhart B und Va-lenta R (Int. Arch. Allergy Immunol. (2004) 134:324-31).

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das mindestens eine hypoallergene Molekül mit dem N-Terminus und/oder C-Terminus des mindestens einen zweiten Proteins oder Fragments davon fusioniert.

Das Allergen oder Fragmente davon kann (können) z.B. chemisch oder durch rekombinante Methoden miteinander konjugiert sein. Wenn das Allergen oder Fragment davon chemisch mit einem Träger konjugiert ist, sollte das Allergen oder Fragment davon

NACHGEREICHT • · · · · ··· ·· · ·· · • ·· · *· ·· · · # · · · • · · · · · ·

·· 8 mit einem terminalen Cystein-Rest versehen sein (was zu einer freien Sulfhydryl-Gruppe führt). An den terminalen (N- oder C-terminalen) Cystein-Rest kann jedes Maleimid-aktivierte Trägerprotein konjugiert werden, wodurch ein Immunogen/Träger-Komplex geschaffen wird. Wenn das Allergen oder Fragment davon keine Sulfhydryl-Gruppe an einem Terminus hat, kann EDC (l-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid)-Chemie verwendet werden, um Amine (Lysin) oder Carbonsäuren (Glutamin-, Aspara-gin-Säure oder 5'-Phosphat) an das Trägerprotein zu koppeln.

Wenn das hypoallergene Molekül mit dem N- oder C-Terminus des Trägers fusioniert wird, werden rekombinante Methoden verwendet .

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das mindestens eine zweite Protein ein Virus-, insbesondere RNA- oder DNA-Virus-, Bakterien-, Pilz- oder Protozoen-Protein.

Das mindestens eine zweite Protein („Träger") kann von jedem oben erwähnten Ursprung sein. Es ist jedoch besonders bevorzugt, Proteine zu verwenden, die eine Immunantwort gegen das Protein selbst und das hypoallergene Molekül, das damit fusioniert oder konjugiert ist, hervorrufen. Infolge der Induktion der Bildung von (schützenden) Antikörpern, die auch auf das mindestens eine zweite Protein gerichtet sind, kann das hypoallergene Protein gemäß der vorliegenden Erfindung auch als Vakzin für das zweite Protein und seine Herkunftsquelle (z.B. Virus, Bakterien, Pilz) verwendet werden. Natürlich ist es auch möglich, auf dem Gebiet wohlbekannte Trägerproteine (z.B. KLH) als das mindestens zweite Protein zu verwenden.

Das Virus-Protein gemäß der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise ein Capsid-Protein.

Virus-Capsid-Proteine sind besonders geeignet, weil sie eine antivirale Aktivität induzieren, die Bildung von Antikörpern hervorrufen, die die Adhäsion von Viren, z.B. Rhinoviren, an Epithel-Zellen blockieren, eine immunmodulierende Aktivität zu einer Thl-Antwort hin aufweisen, die Immunogenität des Peptids erhöhen (d.h., höhere Anti-Peptid- und daher höhere Mengen an protektiven IgG-Antikörpern), und sie erwiesen sich als geeignet für die prophylaktische Impfung (Virus-Impfung) und sind sicher, wenn Capsid-Proteine verwendet werden, welchen Menschen dauernd ausgesetzt sind (z.B. Rhinoviren). r——_

NACHGEREICHT II ·· • · · · ·· · ·· · • · ·· · ♦ ♦ • · · · · · ♦

• · •I ··♦♦ • · · ··· · 9

Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stammt das mindestens eine Virus-Capsid-Protein von einem humanpathogenen Virus, vorzugsweise einem Virus der Familie der Picornaviridae.

Das Virus der Familie der Picornaviridae ist vorzugsweise von der Gattung der Rhinoviren, vorzugsweise von der Spezies der Human-Rhinoviren, insbesondere Human-Rhinovirus 89 und 14. Das Capsid-Protein kann VP1, VP2, VP3 und/oder VP4 sein.

Das mit einem Virus-Capsid-Protein zu fusionierende Allergen ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Hauptallergenen von Birkenpollen, insbesondere Bet v 1 und Bet v 4, den Hauptallergenen von Wiesenlieschgras-Pollen, insbesondere Phi p 1, Phi p 2, Phi p 5, Phi p 6 und Phi p 7, den Hauptallergenen der Hausstaubmilbe, insbesondere Der p 1 und Der p 2, dem Hauptallergen der Katzen Fel d 1, den Hauptallergenen der Biene, den Hauptallergenen der Wespe, Profilinen, insbesondere Phi p 12, und den Allergenen der Vorratsmilbe, insbesondere Lep d 2.

Andere geeignete, gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendende Allergene können der folgenden Tabelle entnommen werden.

NACHGEREICHT

• ·· · ·· ·· ····· · · · · ······· · • · · ··♦· ··· · • · · · · · ··· ·· · t« ♦·♦· - 10 -

ALLERGENE Spezies-Name Allergen-Name Biochem.ID od. MW* cDNA od. Referenz, obsoleter Name Protein Hinterlegungs-Nr. Ambrosia artemisiifolia Beifußblättrige Ambrosie („short ragweed“) Amb a 1 Antigen E 8 C 8,20 Amb a2 Antigen K 38 C 8,21 Amba3 Ra3 11 C 22 Amb a 5 Ra5 5 C 11,23 Amb a6 Ra6 10 C 24,25 Amba7 Ra7 12 P 26 Ambrosia trifida Dreilappige Ambrosie („giant ragweed“ ) Ambt5 Ra5G 4,4 C 9, 10, 27 Artemisia vulgaris Beifuß („mugwort“) Art v 1 27-29 C 28 Art v 2 35 P 28A Art v 3 Lipid-Transfer -Protein 12 P 53 Art v 4 Profilin 14 C 29 Helianthus annuus Sonnenblume Hel a 1 34 29A Heia 2 Profilin 15,7 C Y15210 Mercurialis annua Mer a 1 Profilin 14-15 C Y13271 Caryophyllales Chenopodium album Weißer Gänsefuß („lamb's-quarters“„,pigweed“), Che a 1 17 C AY049012, 29B Weißer Gänsefuß („white goosefoot“) Chea2 Profilin 14 C AY082337 Che a 3 Polcalcin 10 C AY082338 Salsola kali Kali-Salzkraut („Russian-thistle“) Salkl 43 P 29C Rosales Humulus japonicus Japanischer Hopfen („Japanese hop“) Humj 4w C AY335187 Parietaria judaica Par j 1 Lipid-Transfer-Protein 1 15 C vgl. Liste der Isoallergene Par j 2 Lipid-Transfer-Protein 2 C vgl. Liste der Isoallergene Par j 3 Profilin C vgl. Liste der Isoallergene Parietaria officinalis Par ο 1 Lipid-Transfer- Protein 15 29D B. Gräser Poales Cynodon dactylon Bermudagrass („Bermuda grass“) Cyndl 32 C 30, S83343 Cyn d 7 C 31, X91256 Cyn d 12 Profilin 14 C 31a, Y08390

NACHGEREICHT ·· · ·· * #· ·· • ······ · · · · • · ······· · • f · · «···· ··· · ······ · · ·· ··· ·· · Μ ···♦

Cyn d 15 9 - 11 -C AF517686 Cyn d 22w Enolase Daten anhängig Cyn d 23 Cyn d 14 9 c AF517685 Cyn d 24 Pathogenese-verwandt. P. 21 P anhängig Dactylis glomerata Knäuelgras („orchard grass“) Dac g 1 AgDgl 32 P 32 Dac g2 11 c 33,S45354 Dac g 3 c 33A, U25343 Dacg 5 31 P 34 Festuca pratensis Wiesenschwingel („meadow fescue“) Fes p 4w 60 - Holcus lanatus Wolliges Honiggras („velvet grass „) Hol 11 c Z27084 Lolium perenne Ausdauerndes Weidelgras („rye grass“) Lol p 1 Gruppe I 27 c 35,36 Lolp2 Gruppen 11 P 37, 37A, X73363 Lolp3 Gruppe III 11 P 38 Lolp5 Lol p IX, Lol p Ib 31/35 c 34,39 Lol p 11 hom: Trypsin-Inhibitor 16 39A Phalaris aquatica Wasserglanzgras („canary grass“) Phaa 1 c 40, S80654 Phleum pratense Wiesenlieschgras („timothy“) Phlp 1 27 c X78813 Phlp2 c X75925,41 Phlp 4 P 41A Phlp5 Ag25 32 c 42 Phlp 6 c Z27082,43 Phi p 11 Trypsin-Inhibitor-Hom. 20 c AF521563,43A Phi p 12 Profilin c X77583,44 Phlp 13 Polygalacturonase 55-60 c AJ238848 Poa pratensis Wiesen-Rispengras („Kentucky blue grass“) Poa p 1 Gruppe I 33 P 46 Poap 5 31/34 c 34,47 Sorghum halepense Aleppohirse („Johnson grass“) Sorhl c 48 C. Bäume Arecales

Phoenix dactylifera Dattelpalme

Phod2 Profilin 14,3 C Asturias p.c. Fagales Ainus glutinosa Erle Alng 1 17 C S50892 Betula verrucosa Birke Bet v 1 17 C vgl. Liste der Isoallergene Betv2 Profilm 15 C M65179 Bet v 3 Bet v4 8 C C X79267 X87153, S54819 Betv6 h: Isoflavon-Reduktase 33,5 C vgl. Liste der Isoallergene Bet v 7 Cyclophilin 18 P P81531

NACHGEREICHT ·· • · ·· · ·· · · · · • · ······· · • · · · ··· ··· · ······ ·· ·· ··· #· I ·· ···· Carpinus betulus Hainbuche („hombeam „) Carbi 17 - 12 -C vgl. Liste der Isoallergene Castanea sativa Ess-Kastanie („chestnut“) Cas s 1 22 P 52 Cas s 5 Chitinase Cas s 8 Lipid-Transfer-Protein 9,7 P 53 Corylus avellana Hasel Cor a 1 17 c vgl. Liste der Isoallergene Cor a 2 Profilin 14 c Cor a 8 Lipid-Transfer-Protein 9 c Cor a 9 11S Globulin-art. Protein 40/? c Beyer p.c. Cor a 10 Luminal-bindend. Prot. 70 c AJ295617 Cor a 11 7S Vicilin-art. Prot. 48 c AF441864 Quercus alba Weißeiche („white oak“) Quea 1 17 P 54 Lamiales Oleaceae Fraxinus excelsior Esche Fra e 1 20 P 58A, AF526295 Ligustrum vulgare Liguster („privet“) Ligv 1 20 P 58A Olea europea Olive Oie e 1 16 c 59, 60 Oie e 2 Profilin 15-18 c 60A 01ee3 9,2 60B 01ee4 32 P P80741 Oie e 5 Superoxid-dismutase 16 P P80740 Oleeö 10 c 60C, U86342 01ee7 ? P 60D, P81430 Oie e 8 Ca2+-bind. Protein 21 c 60E, AF078679 01ee9 beta-l,3-Glucanase 46 c AF249675 Oie e 10 Glycosyl-Hydrolase-Hom. 11 c 60F, AY082335 Syringa vulgaris Flieder Syr v 1 20 P 58A Plantaginaceae Plantago lanceolata Spitzwegerich („English plantain“) Pia 11 18 P P842242 Pinales Cryptomeria japonica Sugi Cryj 1 41-45 c 55, 56 Cryj 2 c 57, D29772 Cupressus arizonica Zypresse Cup a 1 43 c A1243570 Cupressus sempervirens Gemeine Zypresse („common cypress“) Cup s 1 43 c vgl. Liste der Isoallergene Cup s 3w 34 c Ref. anhängig Juniperus ashei Bergzeder („mountain cedar “) Juna 1 43 P P81294 Juna 2 c 57A, AJ404653 Juna 3 30 P 57B, P81295

NACHGEREICHT ·· • · • · • · • · ·· ·· ♦ ·· #· ····

Juniperus oxycedrus Stechwacholder („prickly juniper“)

Jim o 4 hom: Calmodulin Juniperus sabinoides Bergzeder („mountain cedar“)

Jun s 1

Juniperus virginiana

Virginische Rotzeder („eastem red cedar“) Jun v 1 » · · · • ···· I · t ♦ · ·

- 13 - 29 C 57C, AF031471 50 P 58 43 P P81825, 58B

Platanaceae Platanus acerifolia

Gewöhnliche Platane („London plane tree“)

Plaal 18 P P82817 Plaa2 43 P P82967 Plaa3 Lipid-Transfer-Protein 10 P Irisp.c. D. Milben Acarussiro Arthropode Milbe Aca s 13 Fettsäure-bind. Prot. 14* c AJ006774 Blomia tropicalis Milbe Blot 1 Cystein-Protease 39 c AF277840 Blot 3 Trypsin 24* c Cheong p.c. Blot 4 alpha-Amylase 56 c Cheong p.c. Blot 5 c U59102 Blot 6 Chymoöypsin 25 c Cheong p.c. Bio 110 Tropomyosin 33 c 61 Blot 11 Paramyosin 110 c AF525465,61A Bio 112 Btlla c U27479 Bio 113 Bt6, Fettsäure-bind. Prot. c U58106 Blot 19 anti-mikrobielles Pep.-Hom. 7,2 c Cheong p.c. Dermatophagoides farinae Amerikanische Hausstaubmilbe („American house dust mite“) Derfl Cystein-Protease 25 c 69 Der f2 14 c 70,70A, vgl. Liste der Isoallergene Derf3 Trypsin 30 c 63 Der f 7 24-31 c SW:Q26456, 71 Der f 10 Tropomyosin c 72 Derfll Paramyosin 98 c 72A Der f 14 mag3, Apolipophorin c D17686 DerflS 98k Chitinase 98 c AF178772 Der f 16 Gelsolin/Villin 53 c 71A Der f 17 Ca-bind. EF-Protein 53 c 71A Derf 18w 60k Chitinase 60 c Weber p.c. Dermatophagoides microceras Hausstaubmilbe („house dust mite“) Derm 1 Cystein-Protease 25 P 68

Dermatophagoides pteronyssinus

Europäische Hausstaubmilbe („European house dust mite“)

Derp 1 Antigen PI, Cystein-Protease 25 C 62, vgl. Liste der Isoallergene Derp2 14 C 62A-C, vgl. Liste der Isoallergene Derp 3 Trypsin 28/30 C 63 Derp 4 Amylase 60 P 64 Derp 5 14 C 65 Der p 6 Chymotrypsin 25 P 66 Derp 7 22/28 C 67 Derp 8 Glutathion-Transferase C 67A Derp 9 kollagenolytische Serin-Pro. P 67B Derp 10 Tropomyosin 36 C Y14906

NACHGEREICHT ·· · ·· · »· ·· • •••••· · · · · ·· ······· · • * · · · ···· ··· · ······ · · ·· #·· ·· · ·· ···· - 14 -

NACHGEREICHT

Der p 14 Apolipophorin-art. Prot. C Epton p.c. Euroglyphus maynei Milbe Eur m 2 c vgl. Liste der Isoallergene Eurm 14 Apolipophorin 177 c AF149827 Glycyphagus domesticus Vorratsmilbe („storage mite“) Glyd2 c 72B, vgl. Isoallergen-Liste Lepidoglyphus destructor Vorratsmilbe („storage mite“) Lepd2 Lepd 1 15 c 73, 74, 74A, vgl. Isoallergen· LepdS c 75, AJ250278 Lepd7 c 75, AJ271058 Lep d 10 Tropomyosin c 75A, AJ250096 Lepd 13 c 75, AJ250279 Tyrophagus putrescentiae Vorratsmilbe („storage mite“) Tyrp 2 c 75B, Y12690 E. Tiere Bos domesticus Hausrind („domestic cattle“) Bosd2 Ag3, Lipocalin 20 c 76, vgl. Isoallergen-Liste (vgl. auch Nahrungsmittel) Bosd3 Ca-bind. SlOO-Hom. 11 c L39834 Bosd4 alpha-Lactalbumin 14,2 c M18780 Bosd5 beta-Lactoglobulin 18,3 c X14712 Bosd6 Serumalbumin 67 c M73993 Bosd7 Immunglobulin 160 77 Bosd8 Caseine 20-30 77 Canis familiaris (Canis domesticus) Canfl 25 c 78, 79 Hund Canf2 27 c 78, 79 Canf3 Albumin c S72946 Canf4 18 P A59491 Equus caballus Hauspferd („domestic horse“) Equc 1 Lipocalin 25 c U70823 Equc 2 Lipocalin 18,5 P 79A, 79B Equc 3 Ag3 - Albumin 67 c 79C, X74045 Equc 4 17 P 79D Equc 5 AgX 17 P Goubran Botros p.c. Felis domesticus Katze (Speichel) Fel dl cat-1 38 c 15 Feld 2 Albumin c 79E, X84842 Feld 3 Cystatin 11 c 79F, AF238996 Feld 4 Lipocalin 22 c AY497902 Fel d 5w Immunglobulin A 400 Adedoyin p.c. Fel d 6w Imunglobulin M 800-1000 Adedoyin p.c. Fel d 7w Immunglobulin G 150 Adedoyin p.c. Cavia porcellus Meerschweinchen Cavp 1 Lipocalin-Homolog 20 P SW:P83507, 80 Cavp2 17 P SW:P83508 Mus musculus Maus (Ham) Mus m 1 MUP 19 c 81, 81A Rattus norvegius Ratte (Ham) Ratn 1 17 c 82, 83 ·· · ·· · ·· ·· ······· ···· • · ··#···· · • · · « · ···· ··· · ······ · · ·· *·· ·· · ·· ·#·· - 15 - F. Fungi (Schimmelpilze) 1. Ascomycota 1.1 Dothideales Altemaria altemata

NACHGEREICHT

Alta 1 28 C U82633 Alta2 25 C 83A, U62442 Alt a 3 Hitzeschock-Prot. 70 C U87807, U87808 Alt a 4 prot. Disulfid-Isomerase Alt a 6 saures ribosomal. 57 c X84217 Prot. P2 11 c X78222, U87806 Alt a 7 YCP4 Protein 22 c X78225 Alt a 10 Aldehyd-Dehydrogenase 53 c X78227, P42041 Alt all Enolase Alt a 12 saures ribosomal. 45 c U82437 Prot. PI Cladosporium herbarum 11 c X84216 Clahl 13 83B, 83C Clah2 23 83B, 83C Cla h 3 Aldehyd-Dehydrogenase 53 c X78228 Cla h 4 saures ribosomal. Prot. P2 11 c X78223 Clah5 YCP4 Protein 22 c X78224 Clah6 Enolase 46 c X78226 Cla h 12 saures ribosomal. Prot. PI 1.2 Eurotiales Aspergillus flavus 11 c X85180 Asp fl 13 alkalische Serinprotease Aspergillus fumigatus 34 84 Asp f 1 18 c M83781, S39330 Asp f 2 37 c U56938 Asp f 3 peroxisomales Protein 19 c U20722 Aspf4 30 c AJ001732 Asp f 5 Metallprotease 40 c Z30424 Asp f 6 Mn-Superoxid-dismut. 26,5 c U53561 Aspf7 12 c AJ223315 Asp f 8 ribosomal. Prot. P2 11 c AJ224333 Asp f 9 34 c AJ223327 Asp f 10 Asparagin-Protease Asp f 11 Peptidyl-Prolyl- 34 c X85092 Isomerase 24 84A Asp f 12 Hitzeschock-Prot. P90 Asp f 13 alkalische Serin- 90 c 85 Protease 34 84B Asp f 15 16 c AJ002026 Asp f 16 43 c g3643813 Asp f 17 Asp f 18 vakuoläre Serin- c AJ224865 Protease 34 84C Asp f 22w Enolase 46 c AF284645 Asp f 23 L3 ribosomal. Protein Aspergillus niger 44 c 85A, AF464911 Asp n 14 beta-Xylosidase Asp n 18 vakuoläre Serin- 105 c AF108944 Protease 34 c 84B Asp n 25 3-Phytase B 66-100 c 85B, P34754 Aspn? Aspergillus oryzae Asp o 13 alkalische Serin- 85 c Z84377 Protease 34 c XI7561 Asp o 21 T AKA-Amylase A Penicillium brevicompactum Pen b 13 alkalische Serin- 53 c D00434, M33218 Protease 33 86A • · • ·· • ·· ·· • · ·· · · • · · • · • · • · · • φ φ · • • · • * · • ••· ··«* • • · • · · • · • ·· ··· ·· • ·· φφφφ - 16 - Penicillium chrysogenum (vormals P. notatum) Pen ch 13 alkalische Serin-Protease 34 87 Pen ch 18 vakuoläre Serin-Protease 32 87 Pen ch 20 N-Acetyl- glucosaminidase 68 87A Penicillium citrinum Pen c 3 peroxisomal. Mem.-Prot. 18 86B Pen c 13 alkalische Serin-Protease 33 86A Pen c 19 Hitzeschock-Prot. P70 70 C U64207 Pen c 22w Enolase 46 C AF254643 Pen c 24 Elongations-Faktor 1 beta C AY363911 Penicillium oxalicum Pen o 18 vakuoläre Serin-Protease 34 87B 1.3 Hypocreales Fusarium culmorum Fus c 1 ribosomales Prot. P2 11* C AY077706 Fus c 2 Thioredoxin-art. Prot. 13* C AY077707 1.4 Onygenales Trichophyton rubrum Trir2 C 88 Tri r 4 Serin-Protease C 88 Trichophyton tonsurans Trit 1 30 P 88A Tri 14 Serin-Protease 83 c 88 1.5 Saccharomycetales Candida albicans Canda 1 40 c 89 Cand a 3 peroxisomales Protein 29 c AY136739 Candida boidinii Cand b 2 20 c J04984,J04985 2. Basidiomycotina 2.1 Hymenomycetes Psilocybe cubensis Psi c 1 Psi c 2 Cyclophilin 16 89A Coprinus comatus Schopftintling („shaggy cap“) Cop c 1 Leucin-Zipper-Protein 11 c AJ132235 Copc2 Cop c 3 Cop c 5 Copc7 2.2 Urediniomycetes Rhodotorula mucilaginosa Rho m 1 Enolase 47 c AJ242791 AJ242792 AJ242793 AJ242794 89B Rho m 2 vakuoläre Serin-Protease 31 c AY547285

NACHGEREICHT

«· · ·· ·# • · · · · · · • · · · · · · * · ···· ··· · • · · · · • ·· · ·· ···· - 17 - 2.3 Ustilaginomycetes Malassezia furfur

Mala f 2 MF 1, peroxisomales

Membran-Protein 21 C AB011804, 90 Mala f 3 MF2, peroxisomales Membran-Protein 20 C ABO 11805,90 Mala f 4 Mitochondrien-Malat-Dehydrogenase 35 C AF084828, 90A Malassezia sympodialis Mala s 1 C X96486, 91 Mala s 5 18* C AJ011955 Mala s 6 17* C AJ011956 Mala s 7 C AJ011957, 91A Mala s 8 19* C AJ011958,91A Mala s 9 37* C AJ011959,91A Mala s 10 Hitzeschock-Prot. 70 86 C AJ428052 Mala s 11 Mn-Superoxid-Dismut. 23 c AJ548421 3. Deuteromycotina 3.1 Tuberculariales Epicoccum purpurascens (vormals E. nigrum) Epi p 1 Serin-Protease 30 P SW:P83340,91B G. Insekten Aedes aegyptii Stechmücke

Aed a 1 Apyrase 68 C L12389 Aed a 2 37 C M33157 Apis mellifera Honigbiene Api m 1 Phospholipase A2 16 C 92 Api m 2 Hyaluronidase 44 C 93 Api m 4 Melittin 3 C 94 Apim6 7-8 P Kettner p.c. Api m 7 CUB Serin-Protease 39 C AY127579 Bombus pennsylvanicus Hummel („bumble bee“) Born p 1 Phospholipase 16 P 95 Born p 4 Protease P 95 Blattelia germanica Deutsche Schabe Blag 1 Bd90k C Bla g 2 Asparagin-Protease 36 C 96 Bla g 4 Calycin 21 C 97 Bla g 5 Glutathion-Transferase 22 C 98 Bla g 6 Troponin C 27 C 98 Periplaneta americana Amerikanische Schabe Peral Cr-PII C Per a 3 Cr-PI 72-78 C 98A Per a 7 Tropomyosin 37 C Y14854 Chironomus kiiensis Mücke Chi k 10 Tropomyosin 32,5* C AJ012184 Chironomus thummi thummi Mücke Chi 11-9 Hämoglobin 16 C 99 Chi 11.01 Komponente III 16 C P02229 Chi 11.02 Komponente IV 16 C P02230 Chi 12.0101 Komponente I 16 c P02221 Chi 12.0102 Komponente IA 16 c P02221 Chi 13 Komponente II-beta 16 c P02222

NACHGEREICHT • ♦ • · · • ·· ·· • · ·· · · • • · · · • · • · · • · · · • · · · • · • · · • • · • ♦ t * · ·· • • · · · · · - 18 -

Chit4 Komponente IIIA 16 C P02231 Chit 5 Komponente VI 16 C P02224 Chi 16.01 Komponente VIIA 16 C P02226 Chit 6.02 Komponente IX 16 C P02223 Chit 7 Komponente VIIB 16 C P02225 Chit 8 Komponente VIII 16 C P02227 Chit 9 Komponente X 16 C P02228

Ctenocephalides felis felis Katzenfloh

Ctefl

Cte f 2 Mlb 27 C AF231352 Cte f 3 25 C Thaumetopoea pityocampa Pinienprozessionsspinner („pine processionary moth“) Thap 1 15 P PIR:A59396, 99A Lepisma saccharina Silberfischchen Lep s 1 Tropomyosin 36 C AJ309202 Dolichovespula maculata Langkopfwespe („white face homet“) Dol m 1 Phospholipase Al 35 C 100 Dol m 2 Hyaluronidase 44 C 101 Dol m 5 Antigen 5 23 C 102, 103 Dolichovespula arenaria Gelbwespe („yellow homet“) Dol a 5 Antigen 5 23 C 104 Polistes annularies Wespe („wasp“) Pol a 1 Phospholipase Al 35 P 105 Pol a 2 Hyaluronidase 44 P 105 Pol a 5 Antigen 5 23 C 104 Polistes dominulus Mittelmeer-Papierwespe („Mediterranean paper wasp“) Pol dl Hoffman p.c. Pol d 4 Serin-Protease 32-34 C Hoffman p.c. Pol d 5 P81656 Polistes exclamans Wespe („wasp“) Pol e 1 Phospholipase Al 34 P 107 Pol e 5 Antigen 5 23 C 104 Polistes fuscatus Wespe („wasp“) Pol f 5 Antigen 5 23 C 106 Polistes gallicus Wespe („wasp“) Pol g 5 Antigen 5 24 C P83377 Polistes metricus Wespe („wasp“) Pol m 5 Antigen 5 23 C 106 Vespa crabo Europäische Hornisse („European homet“) Vesp c 1 Phospholipase 34 P 107 Vesp c 5 Antigen 5 23 C 106 Vespa mandarina Asiatische Riesenhomisse („giant asian homet“) Vesp m 1 Hoffman p.c. Vesp m 5 P81657 Vespula flavopilosa Wespe („yellowjacket“) Ves f 5 Antigen 5 Vespula germanica 23 c 106 Wespe („yellowjacket“) Ves g 5 Antigen 5 Vespula maculifrons 23 c 106

nachgereicht • · · • · - 19 - ·····# · · ·· ··· ·· · ·· ···· Ves m 1 Phospholipase Al 33,5 C 108 Ves m 2 Hyaluronidase 44 P 109 Ves m 5 Antigen 5 23 C 104 Vespula pennsylvanica Wespe („yellowjacket“) Ves p 5 Antigen 5 23 c 106 Vespula squamosa Wespe („yellowjacket“) Vess5 Antigen 5 23 c 106 Vespula vidua Wespe („wasp“) Ves vi 5 Antigen 5 23 c 106 Vespula vulgaris Wespe („yellowjacket“) Ves v 1 Phospholipase Al 35 c 105A Ves v 2 Hyaluronidase 44 P 105A Ves v 5 Antigen 5 23 c 104 Myrmecia pilosula Australische, jumper ant“ Myr p 1 c X70256 Myrp 2 c S81785 Solenopsis geminata tropische Feuerameise („tropical fire ant“) Sol g2 Hoffman p.c. Sol g4 Hoffman p.c. Solenopsis invicta Feuerameise („fire ant“) Soli 2 13 c 110,111 Soli 3 24 c 110 Soli 4 13 c 110 Solenopsis saevissima Brasilianische Feuerameise („Brazilian fire ant“) Sols 2 Hoffman p.c. Triatoma protracta Raubwanze („California kissing bug“) Tria p 1 Procalin 20 c AF179004, 111A. H. Nahrungsmittel Gadus callarias Dorsch („cod“) Gad c 1 Allergen M 12 c 112,113 Salmo salar Atlantischer Lachs Sal s 1 Parvalbumin 12 c X97824 Bos domesticus Hausrind („domestic cattle“) Bos d 4 alpha-Lactalbumin 14,2 c M18780 (Milch) Bosd5 beta-Lactoglobulin vgl. auch Tiere 18,3 c X14712 Bos d 6 Serum-Albumin 67 c M73993 Bos d 7 Immunglobulin 160 77 Bos d 8 Caseine 20-30 77 Cyprinus carpio (Gemeiner Karpfen) Cyp cl Parvalbumin 12 c 129 Gallus domesticus Huhn Gal d 1 Ovomucoid 28 c 114,115 Gal d 2 Ovalbumin 44 c 114,115 Gal d 3 Ag22, Conalbumin 78 c 114, 115 Gal d 4 Lysozym 14 c 114,115 Gal d 5 Serum-Albumin 69 c X60688 Metapenaeus ensis Garnele Met e 1 Tropomyosin c U08008

I NACHGEREICHT

Penaeus aztecus Garnele Pen a 1 Tropomyosin 36 P 116 Penaeus indicus Garnele Pen i 1 Tropomyosin 34 C 116A Penaeus monodon Black Tiger-Garnele Pen m 1 Tropomyosin 38 C Pen m 2 Arginin-Kinase 40 C AF479772, 117 Todarodes pacificus Kalmar („squid“) Tod p 1 Tropomyosin 38 P 117A Helix aspersa Braune Gartenschnecke („brown garden snail“) Hel as 1 Tropomyosin 36 c Y14855, 117B Haliotis midae Seeohr („abalone“) Halm 1 49 117C Rana esculenta essbarer Frosch Ran e 1 Parvalbumin-alpha 11,9* c AJ315959 Ran e 2 Parvalbumin-beta 11,7* c AJ414730 Brassica juncea Sareptasenf („oriental mustard“) Braj 1 2S Albumin 14 c 118 Brassica napus Rapssamen („rapeseed“) Bra η 1 2S Albumin 15 P 118A, P80208 Brassica rapa Rübe („tumip“) Bra r 2 hom: Prohevein 25 P81729 Hordeum vulgare Gerste Hör v 15 BMAI-1 15 c 119 Hör v 16 alpha-Amylase Hör v 17 beta-Amylase Hör v 21 gamma-3 Hordein 34 c 119A, SW:P80198 Secale cereale Roggen Sec c 20 Secalin Triticum aestivum Weizen Tri a 18 Agglutinin Tri a 19 omega-5-Gliadin 65 P vgl. Isoall.-Liste PIR:A59156 Zea mays Mais, („maize, com“) Zea m 14 Lipid-Transfer-Prot. 9 P P19656 Oryza sativa Reis Ory s 1 c 119B, U31771 Apium graveolens Sellerie Api g 1 Hom: Bet v 1 16* c Z48967 Api g 4 Profilin Api g 5 55/58 P AF129423 P81943 Daucus carota Karotte Dau c 1 Hom: Bet v 1 16 c 117D, vgl. Isoallergen-Liste Dau c 4 Profilm c AF456482 Corylus avellana Haselnuss Cor a 1.04 Hom: Bet v 1 17 c vgl. Liste der Isoallergene Cor a 2 Profilin 14 c AF327622 Cor a 8 Lipid-Transfer-Protein 9 c AF329829 Malus domestica Apfel Mal d 1 Hom: Bet v 1 c vgl. Liste der Isoallergene Mal d 2 Hom: Thaumatin c AJ243427 Mal d 3 Lipid-Transfer-Protein 9 c Pastorello p.c. Mal d 4 Profilm 14,4* c vgl. Liste der Isoallergene

NACHGEREICHT • · • · · - 21 - Pyrus communis Birne Pyr c 1 Hom: Bet v 1 18 C AF05730 Pyr c 4 Profilin 14 C AF129424 Pyrc 5 Hom: Isoflavon-Reduktase 33,5 c AF071477 Persea americana Avocado Pers a 1 Endochitinase 32 c Z78202 Prunus armeniaca Aprikose Pru ar 1 Hom: Bet v 1 c U93165 Pru ar 3 Lipid-Transfer-Protein 9 P Prunus avium Süßkirsche Pru av 1 Hom: Bet v 1 c U66076 Pru av2 Hom: Thaumatin c U32440 Pruav3 Lipid-Transfer-Protein 10 c AF221501 Pru av4 Profilin 15 c AF129425 Prunus domestica Europäische Pflaume („European plum“) Pru d 3 Lipid-Transfer-Protein 9 P 119C Prunus persica Pfirsich Pru p 3 Lipid-Transfer-Protein 10 P P81402 Prup4 Profilin 14 c vgl. Isoallergen-Liste Asparagus officinalis Spargel Aspao 1 Lipid-Transfer-Protein 9 P 119D Crocus sativus Safran („saffron crocus“) Cro s 1 21 Varasteh A-R p.c. Lactuca sativa Salat Lac s 1 Vitis vinifera Lipid-Transfer-Protein 9 Vieths p.c. Traube Vit v 1 Musa x paradisiac; Lipid-Transfer-Protein i 9 P P80274 Banane Mus xp 1 Ananas comosus Profilin 15 c AF377948 Ananas („pineapple“) Ana c 1 Profilin 15 c AF377949 Anac2 Bromelain 22,8* c 119E-G, D14059 Citrus limon Zitrone Cit 13 Citrus sinensis Lipid-Transfer-Protein 9 P Torrejon p.c. Orange („sweet orange“) Cit s 1 Germin-artiges Protein 23 P Torrejon p.c. Cits2 Profilin 14 P Torrejon p.c. Cits3 Lipid-Transfer-Protein 9 P Torrejon p.c. Litchi chinensis Litchi Lit c 1 Sinapis alba Profilin 15 c AY049013 gelber Senf („yellow mustard“) Sina 1 2S Albumin 14 c 120 Glycine max Sojabohne Gly m 1 HPS 7 P 120A Gly m2 8 P A57106 Gly m 3 Profilin 14 c vgl. Liste der Isoallergene Glym4 (SAM22) PR-10 Prot. 17 c X60043, 120B Vigna radiata Mungbohne Vig r 1 PR-10 Protein 15 c AY792956 Arachis hypogaea Erdnuss Ara h 1 Vicilin 63,5 c L34402 Arah2 Conglutin 17 c L77197 Arah 3 Glycinin 60 c AF093541 Arah4 Glycinin 37 c AF086821

NACHGEREICHT

• · • · · · · · f · · · · Ara h 5 Profilin 15 - 22 -C AF059616 Ara h 6 Hom: Conglutin 15 C AF092846 Ara h 7 Hom: Conglutin 15 c AF091737 Ara h 8 PR-10 Protein 17 c AY328088 Lens culinaris Linse Len c 1 Vicilin 47 c vgl. Liste der Isoallergene Len c 2 Samen biotinyliert. Prot. 66 P 120C Pisum savitum Erbse Pis s 1 Vicilin 44 c vgl. Liste der Isoallergene Pis s 2 Convicilin 63 c anhängig Actinidia chinensis Kiwi Act c 1 Cystein-Protease 30 P P00785 Act c 2 Thaumatin-art. Protein 24 P SW:P81370,121 Capsicum annuum Paprika („bell pepper“) Cap a lw Osmotin-artiges Protein 23 c AJ297410 Cap a 2 Profilm 14 c AJ417552 Lycopersicon esculentum Tomate Lyc e 1 Profilm 14 c AJ417553 Lyc e 2 b-Fructofuranosidase 50 c vgl. Isoallergen-Liste Lyc e 3 Lipid-Transfer-Prot. 6 c U81996 Solanum tuberosum Kartoffel Sola 11 Patatin 43 P P15476 Sola 12 Cathepsin-D-Inhibitor 21 P P16348 Sola 13 Cystein-Protease-Inhibitor 21 P P20347 Sola 14 Asparagin-Protease-Inhibitor 16+4 P P30941 Bertholletia excelsa Paranuss („Brazil nut“) Ber e 1 2S Albumin 9 c P04403, M17146 Bere2 11S Globulin Samen-Speicherprotein 29 c AY221641 Juglans nigra Schwarznuss („black walnut“) Jug η 1 2S Albumin 19* c AY102930 Jug n 2 Vicilin-art. Prot. 56* c AY102931 Juglans regia Echte Walnuss („English walnut“) Jug r 1 2S Albumin c U66866 Jugr2 Vicilin 44 c AF066055 Jug r 3 Lipid-Transfer-Protein 9 P Pastorello Anacardium occidentale Cashew-Nuss Ana ο 1 Vicilin-artiges Protein 50 c vgl. Isoallergen-Liste Ana o 2 Legumin-artiges Protein 55 c AF453947 Ana o 3 2S Albumin 14 c AY081853 Ricinus communis Rizinussamen („Castor bean“) Ric c 1 2S Albumin c P01089 Sesamum indicum Sesam Ses i 1 2S Albumin 9 c 121A, AF240005 Ses i 2 2S Albumin 7 c AF091841 Ses i 3 7S Vicilin-art. Globulin 45 c AF240006 Ses i 4 Oleosin 17 c AAG23840 Ses i 5 Oleosin 15 c AAD42942 Cucumis melo Kantaloupmelone („muskmelon“) Cuc m 1 Serin-Protease 66 c D32206 Cuc m 2 Profilin 14 c AY271295 Cuc m 3 Pathogenese-verw. P. PR-1 16* P P83834

NACHGEREICHT I. Andere Anisakis Simplex Nematode Ani s 1 24 P 121B, A59069 Ani s 2 Paramyosin 97 C AF173004 Ani s 3 Tropomyosin 41 c 121C, Y19221 Anis 4 9 P P83885 Argas reflexus Taubenzecke („pigeon tick“) Argr 1 17 c AJ697694 Ascaris suum Wurm Asc s 1 10 P 122 Carica papaya Papaya Carp3w Papain 23,4* c 122A, Ml 5203 Dendronephthya nipponica Weichkoralle („soft coral“) Denn 1 53 P 122B Hevea brasiliensis Gummi (Latex) Hev b 1 Elongations-Faktor 58 P 123,124 Hev b 2 1,3-Glucanase 34/36 c 125 Hevb 3 24 P 126,127 Hev b 4 Komponente von 100- P 128 Microhelix-Komplex Hevb 5 115 16 c U42640 Hev b 6.01 Hevein-Präkursor 20 c M36986, p02877 Hev b 6.02 Hevein 5 c M36986,p02877 Hev b 6.03 C-terminales Fragment 14 c M36986, p02877 Hev b 7.01 Hom: Patatin aus B-Serum 42 c U80598 Hev b 7.02 Hom: Patatin aus C-Serum 44 c AJ223038 Hev b 8 Profilin 14 c vgl. Liste der Isoallergene Hev b 9 Enolase 51 c AJ132580 Hevb 10 Mn-Superoxid-Dismut. 26 c vgl. Liste der Isoallergene Hev b 11 Klasse 1-Chitinase c vgl. Liste der Isoallergene Hev b 12 Lipid-Transfer-Protein 9,3 c AY057860 Hev b 13 Esterase 42 P P83269 Homo sapiens Human-Autoallergene Hom s 1 73* c Y14314 Homs2 10,3* c X80909 Homs3 20,1* c X89985 Homs4 36* c Y17711 Homs 5 42,6* c P02538 Triplochiton scleroxylon Abachi („obeche“) Trip s 1 Klasse 1-Chitinase 38,5 P Kespohl p.c. *MW=Molekulargewicht

NACHGEREICHT

Literatursteilen: 1 Marsh, D.G., und L.R. Freidhoff. 1992. ALBE, an allergen da-tabase. IUIS, Baltimore, MD, Edition 1.0. 2 Marsh, D. G. et al. 1986. Allergen nomenclature. Bull WHO 64:767-770. 3 King, T.P. et al. 1964. Biochemistry 3:458-468. 4 Lowenstein, H. 1980. Allergy 35:188-191. 5 Aukrust, L. 1980. Allergy 35:206-207. 6 Demerec, M. et al. 1966. Genetics 54:61-75. 7 Bodmer, J. G.et al. 1991. Immunogenetics 33:301-309. 8 Griffith, I.J. et al. 1991. Int. Arch. Allergy Appl.

Immunol. 96:296-304. 9 Roebber, M. et al. 1985. J. Immunol. 134:3062-3069. 10 Metzler, W. J. et al. 1992. Biochemistry 31:5117-5127. 11 Metzler, W. J. et al. 1992. Biochemistry 31:8697-8705. 12 Goodfriend, L. et al. 1979. Fed. Proc. 38:1415. 13 Ekramoddoullah, A. K. M. et al. 1982. Mol. Immunol. 19:1527-1534. 14 Ansari, A. A. et al. 1987. J. Allergy Clin. Immunol. 80:229-235. 15 Morgenstern, J.P. et al. 1991. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:9690-9694. 16 Griffith, I.J. et al. 1992. Gene 113:263-268. 17 Weber, A. et al. 1986. Biochem. Physiol. 83B:321-324. 18 Weber, A. et al. 1987. Allergy 42:464-470. 19 Stanworth, D. R. et al. 1990. Bulletin WHO 68:109-111. 20 Rafnar, T. et al. 1991. J. Biol. Chem. 266: 1229-1236. 21 Rogers, B.L. et al. 1991. J. Immunol. 147:2547-2552. 22 Klapper, D.G. et al. 1980. Biochemistry 19:5729-5734. 23 Ghosh, B. et al. 1993. J. Immunol. 150:5391-5399. 24 Roebber, M. et al. 1983. J. Immunol. 131:706-711. 25 Lubahn, B., und D.G. Klapper. 1993. J. Allergy Clin. Immunol. 91:338. 26 Roebber, M., und D.G. Marsh. 1991. J. Allergy Clin. Immunol. 87:324. 27 Goodfriend L. et al. Mol Immunol 22: 899-906, 1985. 28 Himly M. et al. FASEB J 17: 106-108, 2003. 28A Nilsen, B. M. et al. 1991. J. Biol. Chem. 266:2660-2668.

I NAOHGEREICHT - 25 ΦΦ Φ ΦΦ ΦΦ Φ Φ Φ · · · · • · Φ · · · # Φ Φ ΦΦΦ# ··· Φ Φ Φ Φ · Φ ΦΦΦ Φ φ Φ ΦΦΦΦ 29 Wopfner Ν. et al. Biol Chem 383: 1779-1789, 2002. 29A Jimenez A. et al. 1994. Int Arch Allergy Immunol 105:297-307. 29B Barderas R. et al. Int Arch Allergy Immunol 127: 47-54, 2002. 29C Carnes J. et al. Allergy 56, Supplement 68: 274, 2001. 29D Giuliani A. et al. Allergy 42: 434-440, 1987. 30 Smith,P.M. et al. 1996. J. Allergy Clin. Immunol. 98:331-343. 31 Suphioglu,C. et al. 1997. FEBS Lett. 402:167-172. 31a Asturias J.A. et al. 1997. Clin Exp Allergy 27:1307-1313. 32 Mecheri, S. et al. 1985. Allergy Appl. Immunol. 78:283-289. 33 Roberts, A.M. et al. 1993. Allergy 48:615-623. 33a Guerin-Marchand,C. et al. 1996. Mol. Immunol. 33:797-806. 34 Klysner, S. et al. 1992. Clin. Exp. Allergy 22: 491-497. 35 Perez, M. et al. 1990. J. Biol. Chem. 265:16210-16215. 36 Griffith, I. J. et al. 1991. FEBS Letters 279:210-215. 37 Ansari, A. A. et al. 1989. J. Biol. Chem. 264:11181-11185. 37a Sidoli,A. et al. 1993. J. Biol. Chem. 268:21819-21825. 38 Ansari, A. A. et al. 1989. Biochemistry 28:8665-8670. 39 Singh, Μ. B. et al. 1991. Proc. Natl. Acad. Sei. 88:1384-1388. 39a van Ree R. et al. 1995. J Allergy Clin Immunol 95:970-978. 40 Suphioglu,C. und Singh,M.B. 1995. Clin. Exp. Allergy 25:853-865. 41 Dolecek,C. et al. 1993. FEBS Lett. 335:299-304. 41A Fischer S. et al. 1996. J Allergy Clin Immunol 98:189-198. 42 Matthiesen, F., und H. Lowenstein. 1991. Clin. Exp. Allergy 21:297-307. 43 Petersen,A. et al. 1995. Int. Arch. Allergy Immunol. 108:55-59. 43A Marknell DeWitt A. et al. Clin Exp Allergy 32: 1329-1340, 2002. 44 Valenta,R. et al. 1994. Biochem. Biophys. Res. Commun. 199:106-118. 46 Esch, R. E., und D. G. Klapper. 1989. Mol. Immunol. 26:557-561. 47 Olsen, E. et al. 1991. J. Immunol. 147:205-211. 48 Avjioglu, A. et al. 1993. J. Allergy Clin. Immunol. 91:340. 52 Kos T. et al. 1993. Biochem Biophys Res Commun 196:1086-92.

NACHGEREICHT • ·· * ·· ·· · · • • · • · • « • · ♦ • • · · ···· ··« • • · « « • • ··· ·· • ·· ··· · • ♦ • · ·· - 26 - 53 Diaz-Perales Ä. et al. 2000. Clin Exp Allergy 30:1403-1410. 54 Ipsen, H., und O.C. Hansen. 1991. Mol. Immunol. 28: 1279-1288. 55 Taniai, M. et al. 1988. FEBS Lett. 239:329-332. 56 Griffith, I.J. et al. 1993. J. Allergy Clin. Immunol. 91:339. 57 Sakaguchi, M. et al. Allergy 45: 309-312, 1990. 57A Yokoyama M. et al. Biochem Biophys Res Commun 275: 195-202, 2000. 57B Midoro-Horiuti T. et al. J Immunol 164: 2188-2192, 2000. 57C Tinghino R. et al. J. Allergy Clin. Immunol. 101: 772-777, 1998. 58 Gross GN et al. Scand J Immunol 8: 437-441, 1978. 58A Obispo TM et al. Clin Exp Allergy 23: 311-316, 1993. 58B Midoro-Horiuti T. et al. Clin Exp Allergy 31: 771-778, 2001. 59 Lombardero M. et al. Clin. Exp. Allergy 24: 765-770, 1994. 60 Villalba, M. et al. Eur. J. Biochem. 216: 863-869, 1993. 60A Asturias JA et al. J Allergy Clin Immunol 100: 365-372, 1997. 60B Batanero E. et al. Eur J Biochem 241: 772-778, 1996. 60C Batanero E. et al. FEBS Lett. 410: 293-296, 1997. 60D Tejera ML et al. J Allergy Clin Immunol 104: 797-802, 1999. 60E Ledesma A. et al. FEBS Lett 466: 192-196, 2000. 60F Barral P. et al. J Immunol 172: 3644-3651, 2004. 61 Yi FC et al. Clin Exp Allergy 32: 1203-1210, 2002. 61A Ramos JD et al. Int Arch Allergy Immunol 126: 286-293, 2001. 62 Chua, K. Y. et al. J. Exp. Med. 167: 175-182, 1988. 62A Chua, K. Y. et al. Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 91: 118-123, 1990. 62B Smith AM et al. Int Arch Allergy Immunol 124: 61-63, 2001. 62C Smith AM et al. J Allergy Clin Immunol 107: 977-984, 2001. 63 Smith WA, Thomas WR. Int Arch Allergy Immunol 109: 133-140, 1996. 64 Lake, F.R. et al. J. Allergy Clin. Immunol. 87: 1035-1042, 1991. 65 Tovey, E. R. et al. J. Exp. Med. 170: 1457-1462, 1989. 66 Yasueda, Η., T. Shida, T. Ando, S. Sugiyama, und H. Yamakawa. 1991. Allergenic and proteolytic properties oi

NACHGEREICHT ·· · ·· ·· • · · · · · · ······ · • · ···· ··· · • · · f · • ·· · ·· ···· ·· • · · • · • · • · ·· · - 27 - from Dermatophagoides mites. In: "Dust Mite Allergens and Asthma. Report of the 2nd international workshop" A. Todt, Hrsg., UCB Institute of Allergy, Brüssel, Belgien, S. 63-64. 67 Shen, H.-D. et al. Clin. Exp. Allergy 23: 934-940, 1993. 67A O'Neil GM et al. Biochim Biophys Acta,1219: 521-528, 1994. 67B King C. et al. J Allergy Clin Immunol 98: 739-747, 1996. 68 Lind P. et al. J. Immunol. 140: 4256-4262, 1988. 69 Dilworth, R. J. et al. Clin. Exp. Allergy 21: 25-32, 1991. 70 Nishiyama, C. et al. Int. Arch. Allergy Immunol. 101: 159-166, 1993. 70A Trudinger, M. et al. Clin. Exp. Allergy 21: 33-38, 1991. 71 Shen HD et al. Clin Exp Allergy 25: 1000-1006, 1995. 71A Tategaki A. et al. ACI International suppl. 1: 74-76, 2000. 72 Aki T. et al. J Allergy Clin Immunol 96: 74-83, 1995. 72A Tsai L. et al. Clin Exp Allergy 29: 1606-1613, 1999. 72B Gafvelin G. et al. J Allergy Clin Immunol 107: 511-518, 2001. 73 van Hage-Hamsten. et al. J. Allergy Clin. Immunol. 91:353, 1993. 74 Varela J. et al. Eur J Biochem 225: 93-98, 1994. 74A Schmidt M. et al. FEBS Lett 370: 11-14, 1995. 75 Eriksson TLJ et al. Eur. J. Biochem. 268: 287-294, 2001. 75A Saarne T. et al. Int Arch Allergy Immunol 130: 258-265, 2003. 75B Eriksson TL et al. Eur. J. Biochem. 251 (1-2), 443-447, 1998. 76 Rautiainen J, Rytkonen M, Pelkonen J, Pentikainen J, Perola 0, Virtanen T, Zeiler T, Mantyjarvi R. BDA20, a major bovine dander allergen characterised at the sequence level is Bos d 2. Vorgelegt. 77 Gjesing B, Lowenstein H. Ann Allergy 53:602, 1984. 78 de Groot, H. et al. J. Allergy Clin. Immunol. 87:1056-1065, 1991. 79 Konieczny, A. Personal communication; Immunologie Pharmaceu-tical Corp. 79A Bulone, V. Eur J Biochem 253: 202-211, 1998. 79B Swiss-Prot acc. P81216, P81217. 79C Dandeu J. P. et al. (1993). J. Chromatogr. 621:23-31. 79D Goubran Botros H. et al. 1998. J. Chromatogr. B 710:57-65. 79E Hilger C. et al. Allergy 52: 179-187; und Hilger C. et al.

| NACHGEREICHT ·· * ·« • ·· ♦♦ • • ·· · • ♦ * · • · • • • · • • · · · • • • • · • ···· ♦·· ♦ • • • · • • · • ·· ♦ ·· ·· • ·· ····

Gene 169:295-296, 1996. 79F Ichikawa K. et al. Clin Exp Allergy, in Druck 2001. 80 Fahlbusch B. et al. Allergy 57: 417-422, 2002. 81 McDonald, B. et al. 1988. J. Allergy Clin. Immunol. 83:251. 81A Clarke, A. J. et al. 1984. EMBO J 3:1045-1052. 82 Longbottom, J. L. 1983. Characterisation of allergens from the urines of experimental animals. McMillan Press, London, S. 525-529. 83 Laperche, Y. et al. 1983. Cell 32:453-460. 83A Bush RK et al. 1999. J Allergy Clin Immunol 104:665-671. 83B Aukrust L, Borch SM. 1979. Int Arch Allergy Appl Immunol 60:68-79. 83C Sward-Nordmo M. et al. 1988. Int Arch Allergy Appl Immunol 85:288-294. 84 Shen, et al. J. Allergy Clin. Immunol. 103:S157, 1999. 84A Crameri R. Epidemiology and molecular basis of the involve-ment of Aspergillus fumigatus in allergic diseases. Contrib. Microbiol. Bd. 2, Karger, Basel (in Druck). 84B Shen, et al. (Manuskript vorgelegt), 1999 84C Shen HD et al. Vacuolar serine proteinase: A major aller-gen of Aspergillus fumigatus. lOth International Congress of Immunology, Abstract, 1998. 85 Kumar A. et al. 1993. J. Allergy Clin. Immunol. 91:1024-1030. 85A Saxena S. et al. 2003. Clin Exp Immunol 134:86-91. 85B Baur X. et al. Allergy 57: 943-945, 2002. 86A Shen HD et al. 1996. Clin Exp Allergy 26:444-451. 86B Shen, et al. Abstract; The XVIII Congress of the European Academy of Allergology and Clinical Immunology, Brüssel, Belgien, 3-7 Juli 1999. 87 Shen HD et al. Clin Exp Allergy 29: 642-651, 1999. 87A Shen HD et al. Clin Exp Allergy 25: 350-356, 1995. 87B Shen HD et al. J Lab Clin Med 137: 115-124, 2001. 88 Woodfolk JA et al. 1998. J Biol Chem 273:29489-96. 88A Deuell, B. et al. 1991. J. Immunol. 147:96-101. 89 Shen, H.D. et al. 1991. Clin. Exp. Allergy 21:675-681. 89A Horner WE et al. 1995. Int Arch Allergy Immunol 107:298-300. 89B Chang CY et al. J Biomed Sei 9: 645-655, 2002. 90 Yasueda H. et al. Biochem Biophys Res Commun 248: 240-244,

NACHGEREICHT ·· · • · · • · · • « · ·· tt« I · ·· ·· • · · · · · • · ♦ · # · • ··· ··· · • · · · • ·· ···· - 29 - 1998. NB:strain TIMM2782 (Teikyo University Institute for Medical Mycology) equal to strain CBS1878 (Central Bureau von Schim-melkulturen). 90A Onishi Y. et al. Eur J Biochem 261: 148-154, 1999. NB: strain TIMM2782 (Teikyo University Institute for Medical Mycology) equal to strain CBS1878 (Central Bureau von Schimmelkultu-ren) . 91 Schmidt M. et al. Eur J Biochem 246:181-185, 1997. NB: strain ATCC no. 42132 (American Type Culture Collection). 91A Rasool 0. et al. Eur J Biochem 267: 4355-4361, 2000. NB: strain ATCC no. 42132 (American Type Culture Collection). 91B NB: ; strain 4625 (Indian Agricultural Research Institute, PUSA; New Delhi , Indien). 92 Kuchler, K. et al. 1989. Eur. J. Biochem. 184:249-254. 93 Gmachl, M., und G. Kreil. 1993. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:3569-3573. 93A Hoffman DR. 1977. J Allergy Clin. Immunol. 59:364-366. 94 Habermann, E. 1972. Science 177:314-322. 95 Hoffman DR, Jacobson RS. 1996. J. Allergy Clin. Immunol. 97:812-821. 95A Hoffman DR, El-Choufani AE, Smith MM, de Groot H. 2001. Oc-cupational allergy to bumblebee venom: Allergens of Bombus ter-restris. J Allergy Clin Immunol; in Druck. 95B Helm R. et al. 1996. J Allerg Clin Immunol 98:172-180. 95C Pomes A. et al. 1998. J Biol Chem 273:30801-30807. 96 Arruda LK et al. J Biol Chem 270:19563-19568, 1995. 97 Arruda LK et al. J Biol Chem 270:31196-31201, 1995. 98 Arruda LK et al. Int Arch Allergy Immunol 107:295-297, 1995. 98A Wu CH et al. 1998. J Allergy Clin Immunol 101:832-840. 98B Melen E. et al. 1999. J Allergy Clin Immunol 103:859-64. 98C Wu CH et al. J Biol Chem 271:17937-17943, 1996. 98D Wu CH et al. Molecular Immunol 34:1-8, 1997. 98E Santos ABR et al. 1999. J Allergy Clin Immunol 104:329-337. 98F Asturias JA et al. 1999. J Immunol 162:4342-4348. 99 Mazur, G. et al. 1990. Monog. Allergy 28:121-137. 99A Moneo I. et al. Allergy 58: 34-37, 2003. 100 Soldatova, L. et al. 1993. FEBS Letters 320:145-149. 101 Lu, G. et al. 1994. J. Allergy Clin. Immunol. 93:224.

102 Fang, K. S. F. et al. 1988. Proc. Natl. Acad. Sei., USA

NACHGEREICHT ·· • ·· • ·· ·· • · ·· · ♦ # • · • ♦ • • • · t • · · · • • • • · ···· ··· • • · • · · • • • ·· ··· ·· • ·· ···· - 30 - 85:895-899. 103 King, T. P. et al. 1990. Prot. Seq. Data Anal. 3:263-266. 104 Lu, G. et al. 1993. J. Immunol. 150: 2823-2830. 105 King, T. P. und Lu, G. 1997. Unveröffentlichte Daten. 105A King TP et al. 1996. J. Allergy Clin. Immunol. 98:588-600. 106 Hoffman, D.R. 1993. J. Allergy Clin. Immunol. 92:707-716. 107 Hoffman DR. 1992. Unveröffentlichte Daten. 108 Hoffman DR. J. Allergy Clin. Immunol. 91:187, 1993. 109 Jacobson RS et al. J. Allergy Clin. Immunol. 89:292, 1992. 110 Hoffman DR. J. Allergy Clin. Immunol 91: 71-78, 1993. 111 Schmidt M. et al. FEBS Letters 319: 138-140, 1993. 111A Paddock CD et al. J Immunol 167: 2694-2699, 2001. 112 Elsayed S, Bennich H. Scand J Immunol 3: 683-686, 1974. 113 Elsayed S. et al. Immunochemistry 9: 647-661, 1972. 114 Hoffman, D. R. 1983. J. Allergy Clin. Immunol. 71: 481-486. 115 Langeland, T. 1983. Allergy 38:493-500. 116 Daul CB, Slattery M, Morgan JE, Lehrer SB. 1993. Common crustacea allergens: Identification of B cell epitopes with the shrimp specific monoclonal antibodies. In: "Molecular Biology and Immunology of Allergens" (D. Kraft und A. Sehon, Hrsg.). CRC Press, Boca Raton. S. 291-293. 116A Shanti KN et al. J. Immunol. 151: 5354-5363, 1993. 117 Yu CJ et al. J Immunol 170: 445-453, 2003. 117A Miyazawa M et al. J. Allergy Clin. Immunol. 98: 948-953, 1996. 117B Asturias JA et al. Int Arch Allergy Immunol 128: 90-96, 2002. 117C Lopata AL et al. J. Allergy Clin. Immunol. 100: 642-648, 1997. 117D Hoffmann-Sommergruber K. et al. Clin. Exp. Allergy 29: 840-847, 1999. 118 Monsalve RI et al. Biochem. J. 293: 625-632 1993. 118A Monsalve RI et al. 1997. Clin Exp Allergy 27:833-841. 119 Mena, M. et al. Plant Molec. Biol. 20: 451-458, 1992. 119A Palosuo K. et al. J. Allergy Clin. Immunol. 108: 634-638, 2001. 119B Xu H. et al. Gene 164: 255-259, 1995. 119C Pastorello EA et al. J. Allergy Clin. Immunol. 94: 699-707,

NACHGEREICHT 1994. 119D Diaz-Perales A. et al. J Allergy Clin Immunol 110: 790-796, 2002. 119E Galleguillos F, Rodriguez JC. Clin Allergy 8: 21-24, 1978. 119F Baur X. Clin Allergy 9: 451-457, 1979. 119G Gailhofer G. et al. Clin Allergy 18: 445-450, 1988. 120 Menendez-Arias, L. et al. 1988. Eur. J. Biochem. 177:159- 166. 120A Gonzalez R. et al. Lancet 346:48-49, 1995. 120B Kleine-Tebbe J. et al. J Allergy Clin Immunol 110: 797-804, 2002. 120C Sanchez-Monge R. et al. J. Allergy Clin. Immunol. 106: 955-961, 2000. 121 Gavrovic-Jankulovic M. et al. J Allergy Clin Immunol 110: 805-810, 2002. 121A Pastorello EA et al. J. Chromatogr. B Biomed. Sei. Appl. 756: 85-93, 2001. 121B Moneo I. et al. J. Allergy Clin. Immunol. 106: 177-182, 2000. 121C Asturias JA et al. 2000. Allergy 55:898-890. 122 Christie, J. F. et al. 1990. Immunology 69:596-602. 122A Baur X. et al. Clin Allergy 12: 9-17, 1982. 122B Onisuka R. et al. Int Arch Allergy Immunol 125: 135-143, 2001. 123 Czuppon AB et al. J Allergy Clin Immunol 92:690-697, 1993. 124 Attanayaka DPSTG et al. 1991. Plant Mol Biol 16:1079-1081. 125 Chye ML, Cheung KY. 1995. Plant Mol Biol 26:397-402. 126 Alenius H. et al. 1993. Int Arch Allergy Immunol 102:61- 66. 127 Yeang HY, Cheong KF, Sunderasan E, Hamzah S, Chew NP, Hamid S, Hamilton RG, Cardosa MJ. 1996. The 14.6 kD (REF, Hev b 1) and 24 kD (Hev b 3) rubber particle proteins are recognised by IgE from Spina Bifida patients with Latex allergy. J Allerg Clin Immunol (in Druck). 128 Sunderasan E. et al. 1995. J nat Rubb Res 10:82-99. 129 Swoboda I. et al. 2002. J Immunol. 168:4576-84.

I NACHGEREICHT • ·· · ·· ·· ·· · ·· · ·· · • · «··· · · • · ··«·· ··· · • · · · · · ··· ·· I *· ···* ·· • · • · • · • · ·· - 32 -

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das hypoallergene Molekül eine verminderte IgE-Bindungskapazität auf.

Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das hypoallergene Molekül eine verminderte T-Zell-Reaktivität auf.

Es können jedoch auch Allergen-Fragmente, die mindestens ein T-Zell-Epitop umfassen, im hypoallergenen Protein gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

Wie hierin verwendet, bedeutet „eine verminderte IgE-Bin-dungskapazität aufweisend", dass die Moleküle gemäß der vorliegenden Erfindung eine signifikant verminderte IgE-Bindungskapazität oder -aktivität haben (mindestens 50% weniger, vorzugsweise mindestens 70% weniger, mehr bevorzugt mindestens 80% weniger, noch mehr bevorzugt mindestens 90% weniger, am meisten bevorzugt mindestens 95% weniger Bindungskapazität im Vergleich zum Wildtyp-Allergen) oder ihnen diese sogar fehlt.

Die IgE-Bindungsaktivität/-kapazität von Molekülen, wie Peptiden und Proteinen, kann beispielsweise durch einen Enzyme lin-ked immunosorbent assay (ELISA) bestimmt werden, wobei z.B. von einem Subjekt (d.h. einem allergischen Subjekt), das zuvor dem Wildtyp-Allergen ausgesetzt war, erhaltene Seren verwendet werden. Kurz gesagt wird ein zu testendes Peptid auf Vertiefungen einer Mikrotiterplatte beschichtet. Nach dem Waschen und Blockieren der Vertiefungen wird eine Antikörper-Lösung bestehend aus dem Plasma eines allergischen Subjekts, das dem getesteten Peptid oder dem Protein, von welchem es stammt, ausgesetzt war, in den Vertiefungen inkubiert. Ein markierter sekundärer Antikörper wird in die Vertiefungen zugegeben und inkubiert. Die Menge der IgE-Bindung wird dann quantifiziert und mit der Menge des IgE, das von einem gereinigten Wildtyp-Allergen gebunden wird, verglichen.

Alternativ kann die Bindungsaktivität eines Peptids mittels Western Blot-Analyse bestimmt werden. Beispielsweise wird ein zu testendes Peptid unter Verwendung von SDS-PAGE auf einem Polyacrylamid-Gel laufen lassen. Das Peptid wird dann auf Nitrocellulose transferiert und danach mit Serum von einem allergischen Subjekt inkubiert. Nach Inkubation mit dem markierten sekundären Antikörper wird die Menge des gebundenen IgE bestimmt und quantifiziert. -- | nachgereicht

• · · · • · ♦ ♦ ·· · ··

Ein anderer Test, der zum Bestimmen der IgE-Bindungsaktivi-tät eines Peptids verwendet werden kann, ist ein Kompetitions-ELISA-Test. Kurz gesagt wird ein IgE-Antikörper-Pool erzeugt, indem das Plasma von allergischen Subjekten, welche sich im direkten ELISA als IgE-reaktiv gegenüber dem Wildtyp-Allergen erwiesen, vereinigt wird. Dieser Pool wird in Kompetitions-ELISA-Tests verwendet, um die IgE-Bindung an Wildtyp-Allergen mit dem getesteten Peptid zu vergleichen. Die IgE-Bindung für das Wildtyp-Allergen und das getestete Peptid wird bestimmt und quantifiziert .

Ein „T-Zell-Epitop" bedeutet ein Protein (z.B. Allergen) oder Fragment davon, für welches eine T-Zelle eine Antigen-spezifische Bindungsstelle aufweist, wobei das Ergebnis der Bindung an diese Bindungsstelle die T-Zelle aktiviert. Der Ausdruck „verringerte T-Zell-Reaktivität aufweisend", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Moleküle, die eine T-Zell-Reaktivität aufweisen, die signifikant verringert ist im Vergleich mit der Stimulation, die durch das Wildtyp-Allergen induziert wird, von welchem das hypoallergene Molekül abstammt, wobei äquimolare Mengen in Standard-Tests verwendet werden, die auf dem Gebiet bekannt sind (verringerte T-Zell-Reaktivität bedeutet mindestens 30%, vorzugsweise mindestens 50%, mehr bevorzugt mindestens 70%, am meisten bevorzugt mindestens 90% weniger Stimulation der hy-poallergenen Moleküle im Vergleich zum Wildtyp-Allergen in äqui-molaren Mengen). Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung können den Molekülen T-Zell-Epitope „fehlen", und weist somit das Molekül eine verringerte T-Zell-Reaktivität in dem (den) zu behandelnden Individuum (Individuen) auf (d.h. jemand, der ein Epitop-präsentierendes Valenz-Plattform-Molekül („epitope-presenting valency platform molecule") erhalten soll). Es ist wahrscheinlich, dass beispielsweise einem von einem Allergen stammenden Molekül (ein) T-Zell-Epitop(e) in Bezug auf ein Individuum oder eine Gruppe von Individuen fehlt, wogegen es (ein) T-Zell-Epitop(e) in Bezug auf (ein) andere(s) Individuum (Individuen) hat. Verfahren zur Detektion des Vorhandenseins eines T-Zell-Epitops sind auf dem Gebiet bekannt und inkludieren Tests, welche die T-Zell-Proliferation nachweisen (wie Thymidin-Inkorporierung) . Es wird allgemein angenommen, dass Immunogenen, die keine statistisch signifikante Inkorporierung von Thymidin über dem Hintergrund induzieren (d.h., im Allgemeinen p weniger ·· ·· ·· · • · ♦ • · # · # · ···** • · · ·· · • · · · • · · ··· * • · ·· ···· - 34 -als 0,05 unter Verwendung von statistischen Standard-Methoden), T-Zell-Epitope fehlen, obwohl man verstehen wird, dass die quantitative Menge der Thymidin-Inkorporierung je nach dem getesteten Immunogen variieren kann (vgl. z.B. Zhen L. et al., (Infect. Immun. (2003) 71:3920-3926)). Im Allgemeinen zeigt ein Stimula-tinsindex von unter etwa 2-3, mehr bevorzugt weniger als etwa 1, ein Fehlen der T-Zell-Reaktivität und Epitope an. Das Vorhandensein von T-Zell-Epitopen kann auch durch Messen der Sekretion von von T-Zellen stammenden Lymphokinen gemäß Standard-Methoden bestimmt werden. Der Stimulations-Index (SI) kann durch Teilen der Proliferationsrate (Thymidin-Aufnahme) stimulierter Zellen durch die Proliferationsrate nicht-stimulierter Zellen im Medium alleine berechnet werden. SI=1 bedeutet keine Stimulation, SI<1 bedeutet toxische Auswirkungen und SI>1 bedeutet Stimulation von Zellen. Der Ort und der Gehalt an T-Zell-Epitopen, soferne vorhanden, kann empirisch bestimmt werden.

Die Cytokin-Sekretion kann zusätzlich zur Stimulation von T-Zellen bestimmt werden. Beispielsweise wurde IFN-gamma als schädliches Cytokin erkannt. Andere Beispiele können TNF-alpha, IL-5, IL-4, IL-8 usw. sein.

Das Allergen-Fragment ist vorzugsweise zusammengesetzt aus den Aminosäuren 151 bis 177, 87 bis 117, 1 bis 30, 43 bis 70 oder 212 bis 241 von Phi p 1, den Aminosäuren 98 bis 128, 26 bis 58, 132 bis 162, 217 bis 246, 252 bis 283 oder 176 bis 212 von Phi p 5, den Aminosäuren 1 bis 34 oder 35 bis 70 der Kette 1 von Fel d 1, den Aminosäuren 1 bis 34, 35 bis 63 oder 64 bis 92 der Kette 2 von Fel d 1, den Aminosäuren 30 bis 59, 50 bis 79 oder 75 bis 104 von Bet v 1, den Aminosäuren 1 bis 33, 21 bis 51, 42 bis 73, 62 bis 103 oder 98 bis 129 von Der p 2, den Aminosäuren 1 bis 30, 20 bis 50, 50 bis 80, 90 bis 125, 125 bis 155 oder 165 bis 198 von Der p 7, den Aminosäuren 1-35, 36-70, 71-110, 111-145, 140-170, 175-205, 210-250 oder 250-284 von Der p 10, den Aminosäuren 1 bis 35, 35 bis 72, 70 bis 100 oder 90 bis 122 von Der p 21, den Aminosäuren 1 bis 32, 15 bis 48 oder 32 bis 70 von Klon 30, den Aminosäuren 19 bis 58, 59 bis 95, 91 bis 120 oder 121 bis 157 von Alt a 1, den Aminosäuren 31 bis 60, 45 bis 80, 60 bis 96 oder 97 bis 133 von Par j 2, den Aminosäuren 1 bis 40, 36 bis 66, 63 bis 99, 86 bis 120 oder 107 bis 145 von Oie e 1, den Aminosäuren 25 bis 58, 99 bis 133, 154 bis 183, 277 bis 307, 334 bis 363, 373 bis 402, 544 bis 573, 579 bis 608, 58 bis 99, I NACHGEPe:~l ·· • ·· • ·· ·· • · ·· · · • • · • · • · • · · ···* ··# • ♦ · • · · • • • «· ··· ·· • *« ···· - 35 - 125 bis 165, 183 bis 224, 224 bis 261, 252 bis 289, 303 bis 340, 416 bis 457, 460 bis 500 oder 501 bis 542 von Fel d 2, den Ami nosäuren 19 bis 58, 52 bis 91, 82 bis 119, 106 bis 144 oder 139 bis 180 von Can f 2, den Aminosäuren 19 bis 56, 51 bis 90, 78 bis 118, 106 bis 145 oder 135-174 von Can f 1, den Aminosäuren 27 bis 70, 70 bis 100 oder 92 bis 132 von Art v 1, den Aminosäuren 31 bis 70, 80 bis 120, 125 bis 155, 160 bis 200, 225 bis 263, 264 bis 300, 305 bis 350 oder 356 bis 396 von Amb a 1, den Aminosäuren 1 bis 34, 35 bis 74, 74 bis 115, 125 bis 165, 174 bis 213, 241 bis 280, 294 bis 333, 361 bis 400 oder 401 bis 438 von Alt a 6, den Aminosäuren 1 bis 40, 41 bis 80, 81 bis 120, 121 bis 160 von Alt a 2 oder Fragmenten davon.

Die spezifischen Aminosäuresequenzen der oben identifizierten, von einem Allergen stammenden Moleküle sind:

NACHGEREICHT

Peptid Position Sequenz SEQ ID Nr. Pep Alt a 1.1 19-58 APLESRQDTASCPVTTEGDYVWKISEFYGRKPEG- TYYNSL 23 Pep Alt a 1.2 59-95 GFNIKATNGGTLDFTCSAQADKLEDHKWYSCGENSFM 24 Pep Alt a 1.3 91-120 ENSFMDFSFDSDRSGLLLKQKVSDDITYVA 25 Pep Alt a 1.4 121-157 TATLPNYCRAGGNGPKDFVCQGVADAYITLVTLPKSS 26 Pep Alt a 2.1 1-40 MHS S NN FFKDNIFRSLS KEDPDYSRNIEGQVIRLH-WDWAQ 27 Pep Alt a 2.2 41-80 LLMLSAKRMKVAFKLDIEKDQRVWDRCTADDLK-GRNGFKR 28 Pep Alt a 2.3 81-120 CLQFTLYRPRDLLSLLNEAFFSAFRENRETIINTD- LEYAA 29 Pep Alt a 2.4 121-160 KSISMARLEDLWKEYQKIFPSIQVITSAFRSIE- PELTVYT 30 Pep Alt a 2.5 161-190 CLKKIEASFELIEENGDPKITSEIQLLKAS 31 Pep Alt a 6.1 1-34 MTITKIHARSVYDSRGNPTVEVDIVTETGLHRAI 32 Pep Alt a 6.2 35-74 VTETGLHRAIVPSGASTGSHEACELRDGDKSKWG- GKGVTK 33 Pep Alt a 6.3 74-115 APALIKEKLDVKDQSAVDAFLNKLDGTTNKTNL- GANAILGVS 34 Pep Alt a 6.4 125-165 EKGVPLYAHISDLAGT KKPYVLPVPF QNVLNG-GSHAGGRLA 35 Pep Alt a 6.5 174-213 CEAPTFSEAMRQGAEVYQKLKALAKKTYGQSAGN- VGDEGG 36 Pep Alt a 6.6 241-280 IKIAMDVASSEFYKADEKKYDLDFKNPDSDKSKWL- 37 36 • · ····

Peptid Position Sequenz SEQ ID Nr. TYEQL Pep Alt a 6.7 294-333 VSIEDPFAEDDWEAWSYFFKTYDGQIVGDDLTVT- NPEFIK 38 Pep Alt a 6.8 361-400 AKDAFGAGWGVMVSHRSGETEDVTIADIVVGLRS- GQIKTG 39 Pep Alt a 6.9 401-438 APARSERLAKLNQILRIEEELGDNAVYAGNNFR-TAVNL 40 Pep Amb a 1.1 31-70 EILPVNETRRLTTSGAYNIIDGCWRGKADWAEN -RKALADC 41 Pep Amb a 1.2 80-120 GGKDGDIYTVTSELDDDVANPKEGTLRFGAAQNR- PLWIIFE 42 Pep Amb a 1.3 125-155 IRLDKEMWNSDKTIDGRGAKVEIINAGFTL 43 Pep Amb a 1.4 160-200 NVIIHNINMHDVKVNPGGLIKSNDGPAAPRAGSDG- DAISIS 44 Pep Amb a 1.5 225-263 GTTRLTVSNSLFTQHQFVLLFGAGDENIEDRGMLAT- VAF 45 Pep Amb a 1.6 264-300 NT FT DNVDQRMPRCRHGFFQ WNNN YDKWGS YAIGGS 46 Pep Amb a 1.7 305-350 ILSQGNRFCAPDERSKKNVLGRHGEAAAESMKWN- WRTNKDVLENGA 47 Pep Amb a 1.8 356-396 GVDPVLTPEQSAGMIPAEPGESALSLTSSAGVLSC- QPGAPC 48 Pep Art v 1.1 27-70 S KLCEKT S KT Y SGKC DNKKC DKKCIEWEKAQHGACH-KREAGKES 49 Pep Art v 1.2 70-100 SCFCYFDCSKSPPGATPAPPGAAPPPAAGGS 50 Pep Art v 1.3 92-132 APPPAAGGSPSP- PADGGSPPPPADGGSPPVDGGSPPPPSTH 51 Can f 1 Pep 1 19-56 QDTPALGKDTVAVSGKWYLKAMTAD- QEVPEKPDSVTPM 52 Can f 1 Pep 2 51-90 DS VT PMILKAQKGGNLE AKITMLTNGQCQNITWL-HKTSE 53 Can f 1 Pep 3 78-118 CQNITWLHKTSEPGKYTAYEGQRVVFIQPSPVRD- HYILYC 54 Can f 1 Pep 4 106-145 QPSPVRDHYILYCEGELHGRQIRMAKLLGRDPEQS- QEALE 55 Can f 1 Pep 5 135-174 RDPEQSQEALEDFREFSRAKGLNQEILELAQSET- CSPGGQ 56 Can f 2 Pep 1 19-58 QEGNHEEPQGGLEELSGRWHSVALASNKSDLIKP- WGHFRV 57 Can f 2 Pep 2 52-91 PWGHFRVFIHSMSAKDGNLHGDILIPQDGQCEKVSL- 58

NACHGEREICHT - 37 - • · · · · · ·

Peptid Position Sequenz SEQ ID Nr. TAFK Can f 2 Pep 3 82-119 CEKVSLTAFKTATSNKFDLEYWGHNDLYLAEVD- PKSYL 59 Can f 2 Pep 4 106-144 NDLYLAEVDPKSYLILYMINQYNDDTSLVAHLM- VRDLSR 60 Can f 2 Pep 5 139-180 VRDLSRQQDFLPAFESVCEDIGLHKDQIWLSDD- DRCQGSRD 61 Fel d 2 Pep 1 25-58 EAHQSEIAHRFNDLGEEHFRGLVLVAFSQYLQQC 62 Fel d 2 Pep 2 99-133 CTVASLRDKYGEMADCCEKKEPERNECFLQHKDDN 63 Fel d 2 Pep 3 154-183 NEQRFLGKYLYEIARRHPYFYAPELLYYAE 64 Fel d 2 Pep 4 277-307 CADDRADLAKYICENQDSISTKLKECCGKPV 65 Fel d 2 Pep 5 334-363 VE DKEVCKNYQEAKDVFLGT FLYEYS RRH P 66 Fel d 2 Pep 6 373-402 LAKEYEATLEKCCATDDPPACYAHVFDEFK 67 Fel d 2 Pep 7 544-573 EKQIKKQSALVELLKHKPKATEEQLKTVMG 68 Fel d 2 Pep 8 579-608 VDKCCAAEDKEACFAEEGPKLVAAAQAALA 69 Fel d 2 Pep 9 58-99 CPFEDHVKLVNEVTEFAKGCVADQSAANCEKSL- HELLGDKLC 70 Fel d 2 Pep 10 125-165 CFLQHKDDNPGFGQLVTPEADAMCTAFHENEQRFLG- KYLYE 71 Fel d 2 Pep 11 183-224 EEYKGVFTECCEAADKAACLTPKVDALREKVLASSA- KERLKC 72 Fel d 2 Pep 12 224-261 CASLQKFGERAFKAWSVARLSQKFPKAEFAEIS- KLVTD 73 Fel d 2 Pep 13 252-289 FAEISKLVTDLAKIHKECCHGDLLECADDRAD- LAKYIC 74 Fel d 2 Pep 14 303-340 CGKPVLEKSHCISEVERDELPADLPPLAVDFVED- KEVC 75 Fel d 2 Pep 15 416-457 CELFEKLGEYGFQNALLVRYTKKVPQVSTPTL- VEVSRSLGKV 76 Fel d 2 Pep 16 460-500 CTHPEAERLSCAEDYLSWLNRLCVLHEKT- PVSERVTKC 77 Fel d 2 Pep 17 501-542 CTESLVNRRPCFSALQVDETYVP-KEFSAET FT FHADLCTLPE 78 Pep Oie e 1.1 1-40 EDIPQPPVSQFHIQGQVYCDTCRAGFITELSEFIP- GASLR 79 Pep Oie e 1.2 36-66 GASLRLQCKDKENGDVTFTEVGYTRAEGLYS 80 Pep Oie e 1.3 63-99 GLYSMLVERDHKNEFCEITLISSGRKDCNEIPTEGWA 81 Pep Oie e 1.4 86-120 GRKDCNEIPTEGWAKPSLKFKLNTVNGTTRTVNPL 82 Pep Oie e 1.5 107-145 LNTVNGT T RTVN PLG FFKKEAL PKCAQVYNKL- 83

NACHGEREICHT

• ··· ·· ·· • •ft ft * · ·· · • ft ···· · ft • · ····· ··« · • · · · · · ··· ·· · ·· ···· - 38 -

Peptid Position Sequenz SEQ ID Nr. GMYPPNM Pep Par j 2.1 31-60 GEEACGKWQDIMPCLHFVKGEEKEPSKEC 84 Pep Par j 2.2 45-80 CLHFVKGEEKEPSKECCSGTKKLSEEVKTTEQKREA 85 Pep Par j 2.3 60-96 CCSGTKKLSEEVKTTEQKREACKCIVRATKGISGIKN 86 Pep Par j 2.4 97-133 ELVAEVPKKCDIKTTLPPITADFDCSKIQSTIFRGYY 87 Der p 1 Pep 1 1-30 TNACSINGNAPAEIDLRQMRT VT PIRMQGG 88 Der p 1 Pep 2 52-84 NQSLDLAEQELVDCASQHGCHGDTIPRGIEYIQ 89 Der p 1 Pep 3 85-115 HNGWQES Y YRYVAREQS CRRPNAQRFGI SN 90 Der p 1 Pep 4 99-135 REQSCRRPNAQRFGISNYCQIYPPNVNKIREALAQTH 91 Der p 1 Pep 5 145-175 KDLDAFRHYDGRTIIQRDNGYQPNYHAVNIV 92 Der p 1 Pep 6 155-187 GRTIIQRDNGYQPNYHAVNIVGYSNAQGVDYWI 93 Der p 1 Pep 7 175-208 VGYSNAQGVDYWIVRNSWDTNWGDNGYGYFAANI 94 Der p 1 Pep 8 188-222 VRNSWDTNWGDNG Y G Y FAANIDLMMIEE Y P Y WIL 95 Der p 2 Pep 1 1-33 DQVDVKDCANHEIKKVLVPGCHGSEPCIIHRGK 96 Der p 2 Pep 2 21-51 CHGSEPCIIHRGKPFQLEAVFEANQNSKTAK 97 Der p 2 Pep 3 42-73 EANQNSKTAKIEIKASIEGLEVDVPGIDPNAC 98 Der p 2 Pep 4 62-103 EVDVPGIDPNACHYMKCPLVKGQQYDIKYTWIVP- KIAPKSEN 99 Der p 2 Pep 5 98-129 APKSENVWTVKVMGDNGVLACAIATHAKIRD 100 Der p 5 Pep 1 1-35 MEDKKHDYQNEFDFLLMERIHEQIKKGELALFYLQ 101 Der p 5 Pep 2 25-60 KKGELALFYLQEQINHFEEKPTKEMKDKIVAEMDTI 102 Der p 5 Pep 3 65-95 DGVRGVLDRLMQRKDLDIFEQYNLEMAKKSG 103 Der p 5 Pep 4 78-114 DLDIFEQYNLEMAKKSGDILERDLKKEEARVKKIEV 104 Der p 7 Pep 1 1-30 DPIHYDKITEEINKAVDEAVAAIEKSETFD 105 Der p 7 Pep 2 20-50 VAAIEKSETFDPMKVPDHSDKFERHIGIIDL 106 Der p 7 Pep 3 50-80 LKGELDMRNIQVRGLKQMKRVGDANVKSEDG 107 Der p 7 Pep 4 90-125 VHDDWSMEYDLAYKLGDLHPNTHVISDIQDFWEL 108 Der p 7 Pep 5 125-155 LSLEVSEEGNMTLTS FEVRQFANWNHIGGL 109 Der p 7 Pep 6 165-198 LS DVLTAIFQDTVRAEMTKVLAPAFKKELERNNQ 110 Der p 10 Pep 1 1-35 MEAIKKKMQAMKLEKDN AI DRAEIAEQKARDANLR 111 Der p 10 Pep 2 36-70 AEKSEEEVRALQKKIQQIENELDQVQEQLSAANTK 112 Der p 10 Pep 3 71-110 LEEKEKALQTAEGDVAALNRRIQLIEEDLERSEERL- KIAT 113 Der p 10 Pep 4 111-145 AKLEEASQSADESERMRKMLEHRSIT DEERMEGLE 114 Der p 10 Pep 5 140-170 RMEGLENQLKEARMMAEDADRKYDEVARKLA 115 Der p 10 Pep 6 175-205 DLERAEERAETGESKIVELEEELRWGNNLK 116 Der p 10 Pep 7 210-250 SEEKAQQREEAHEQQIRIMTTKLKEAEARAEFAERS- VQKLQ 117

| NACHGEREICHT # · - 39 - • ···· ·· · · · « • · · · ···· · · # · · · · ···· ··· · ······ ·· ·· ··· ·· · ·· ····

Peptid Position Sequenz SEQ ID Nr. Der p 10 Pep 8 250-284 QKEVDRLEDELVHEKEKYKSISDELDQTFAELTGY 118 Der p 21 Pep 1 1-35 MFIVGDKKEDEWRMAFDRLMMEELETKIDQVEKGL 119 Der p 21 Pep 2 35-72 LHLSEQYKELEKTKSKELKEQILRELTIGENFMKGAL 120 Der p 21 Pep 3 70-100 GALKFFEMEAKRTDLNMFERYNYEFALESIK 121 Der p 21 Pep 4 90-122 YNYEFALESIKLLIKKLDELAKKVKAVNPDEYY 122 Clone 30 Pep 1 1-32 MANDNDDDPTTTVHPTTTEQPDDKFECPSRFG 123 Clone 30 Pep 2 15-48 PTTTEQPDDKFECPSRFGYFADPKDPHKFYICSN 124 Clone 30 Pep 3 32-70 GYFADPKDPHKFYICSNWEAVHKDC PGNTRWNE DEE TCT 125 Bet v 1 Pep 1 30-59 LFPKVAPQAISSVENIEGNGGPGTIKKISF 126 Bet v 1 Pep 2 50-79 GPGTIKKISFPEGFPFKYVKDRVDEVDHTN 127 Bet v 1 Pep 3 75-104 VDHTNFKYNYSVIEGGPIGDTLEKISNEIK 128 Fel d 1 Kette 1 Pep 1 1-34 EIC PAVKRD VDL FLTGT PDE Y VEQVAQ YKALP WC 129 Fel d 1 Kette 1 Pep 2 35-70 LENARILKNCVDAKMTEEDKENALSLLDKIYTSPLC 130 Fel d 1 Kette 2 Pep 1 1-34 VKMAITCPIFYDVFFAVANGNELLLDLSLTKVNAC 131 Fel d 1 Kette 2 Pep 2 35-63 TEPERTAMKKIQDCYVENGLISRVLDGLVC 132 Fel d 1 Kette 2 Pep 3 64-92 CMTTIS SS KDCMGEAVQNTVEDLKLNTLGR 133 Phi p 5 Pep 1 98-128 CGAASNKAFAEGLSGEPKGAAESSSKAALTSK 134 Phi p 5 Pep 2 26-58 ADLGYGPATPAAPAAGYTPATPAAPAEAAPAGKC 135 Phi p 5 Pep 3 132-162 AYKLAYKTAEGAT PEAKYDAYVATLS EALRIC 136 Phi p 5 Pep 4 217-246 CEAAFNDAIKASTGGAYESYKFIPALEAAVK 137 Phi p 5 Pep 5 252-283 TVATAPEVKYTVFETALKKAITAMSEAQKAAKC 138 Phi p 5 Pep 6 176-212 CAEEVKVIPAGELQVIEKVDAAFKVAATAANAA- PANDK 139

Es wird angemerkt, dass das Klon 30-Allergen ein Allergen ist, das von der Hausstaubmilbe Dermatophagoides pteronyssinus stammt und aus der folgenden Sequenz besteht: MANDNDDDPTTTVHPTT-TEQPDDKFECPSRFGYFADPKDPHKFYICSNWEAVHKDCPGNTRWNEDEETCT (SEQ ID Nr. 140; vgl. auchÄT A 733/2006).

Gemäß der vorliegenden Erfindung sind auch Peptide mit eingeschlossen, die zumindest zu 80% identisch, vorzugsweise zu 90% identisch mit den oben geoffenbarten Aminosäuresequenzen sind.

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein

NACHGEREICHT • · · ·· · ·· «· • · ·ο · · · « ·· · • · ······· ψ • · · · · ···· ··· · ····«· ·· ·· ··· ·· · ·· ···· - 40 -

Nukleinsäuremolekül, das für ein fusioniertes hypoallergenes Protein gemäß der vorliegenden Erfindung codiert.

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Vektor, welcher ein Nukleinsäuremolekül gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst.

Dieser Vektor ist vorzugsweise ein Expressionsvektor.

Der das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung enthaltende Vektor kann für Klonierungszwecke oder für die Herstellung von Expressionsvektoren verwendet werden. Dieser Vektor kann ein Plasmid, Cosmid, Virus, Bakteriophage oder jeder andere allgemein in der Gentechnik verwendete Vektor sein und kann zusätzlich zum Nukleinsäuremolekül der Erfindung eukaryontische oder prokaryontische Elemente zur Steuerung der Expression inkludieren, wie regulatorische Sequenzen für die Initiierung und Terminierung der Transkription und/oder Translation, Enhancer, Promotoren, Signal-Sequenzen u. dgl.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Vektor ein Bakterien-, Pilz-, Insekten-, Virusoder Säuger-Vektor.

Der Vektor der vorliegenden Erfindung kann vorzugsweise für Klonier- und Expressionszwecke in verschiedenen Wirten verwendet werden. Daher umfasst der Vektor außer einer Nukleinsäure, die für ein hypoallergenes Molekül oder Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung codiert, Wirts-spezifische regulatorische Sequenzen.

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Wirt, der ein Nukleinsäuremolekül oder einen Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung aufweist.

Das Nukleinsäuremolekül und der Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung können in einen geeigneten Wirt eingeführt werden. Dieses Molekül kann in das Genom des Wirts inkorporiert werden. Der Vektor kann extrachromosomal im Cytoplasma oder in das Chromosom des Wirts inkorporiert vorhanden sein.

Noch ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Antikörper, der gegen ein hypoallergenes Molekül, ein hypoallergenes Fusionsprotein oder ein Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung gerichtet ist.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Antikörper ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper. ...............

NACHGEREICHT ·· · ·♦ · ·· ·· *···♦♦· ♦ * · « • · ······· » • · · · · ··#» ♦·· · ······ ·· ·· ··· ·· « ·» ···· - 41 -

Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung inkludieren -ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein - polyklonale, monoklonale, multispezifische, humanisierte oder Chimäre Antikörper, Einzelketten-Antikörper, Fab-Fragmente F(ab')-Fragmente und Epitop-bindende Fragmente von jedem der Obigen. Weiters werden Antikörper als Immunglobulin-Moleküle und immunologisch aktive Teile von Immunglobulin-Molekülen angesehen, d.h. Moleküle, die eine Antigen-Bindungsstelle enthalten, die ein Antigen immunspezifisch bindet. Die Immunglobulin-Moleküle der Erfindung sind vorzugsweise vom Typ IgG, IgM, IgD, IgA und IgY, der Klasse (z.B. IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl und IgA2) oder der Unterklasse des Immunglobulin-Moleküls.

Polyklonale Antikörper können durch Verabreichen eines Polypeptids der Erfindung, vorzugsweise unter Verwendung eines Adjuvans, an einen nicht-humanen Säuger und Sammeln des resultierenden Antiserums hergestellt werden. Verbesserte Titer sind durch über einen Zeitraum wiederholte Injektionen erhältlich. Es gibt keine bestimmte Einschränkung auf die Säuger-Spezies, die für das Hervorrufen von Antikörpern verwendet werden kann; es ist allgemein bevorzugt, Kaninchen oder Meerschweinchen zu verwenden, doch können auch Pferde, Katzen, Hunde, Ziegen, Schweine, Ratten, Kühe, Schafe, Kamele usw. verwendet werden.

Bei der Herstellung von Antikörpern wird eine bestimmte Menge des Immunogens der Erfindung beispielsweise mit physiologischer Kochsalzlösung zu einer geeigneten Konzentration verdünnt, und die resultierende verdünnte Lösung wird beispielsweise mit vollständigem Freundschen Adjuvans gemischt, um eine Suspension herzustellen, oder mit Mineral-Gelen, wie Aluminiumhydroxid, oberflächenaktiven Substanzen, wie Lysolecithin, Pluronic-Polyo-len, Polyanionen, Peptiden, Öl-Emulsionen, Schlüsselloch-Napf-schnecken („keyhole limpet")-Haemocyaninen, Dinitrophenol und potentiell nützlichen humanen Adjuvantien, wie BCG (Bacillus Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum. Die Suspensionen und Mischungen werden Säugern z.B. intraperitoneal verabreicht, beispielsweise einem Kaninchen, wobei von etwa 50 pg bis etwa 2500 pg Polypeptid der Erfindung pro Verabreichung verwendet werden. Die Suspension wird vorzugsweise etwa alle zwei Wochen über einen Zeitraum von bis zu etwa 2-3 Monaten, vorzugsweise etwa 1 Monat, verabreicht, um eine Immunisierung zu bewirken.

Der Antikörper wird gewonnen, indem dem immunisierten Tier nach | nachgereicht • · • ·· ·

• · · • φ • ΦΦ - 42 -

Ablauf von 1 bis 2 Wochen nach der letzten Verabreichung Blut entnommen wird, das Blut zentrifugiert wird und Serum vom Blut isoliert wird.

Monoklonale Antikörper können beispielsweise humanen oder murinen Ursprungs sein. Murine monoklonale Antikörper können mit dem Verfahren von Köhler und Milstein (Köhler, G. und Milstein, C., Nature 256 (1975) 495) hergestellt werden, beispielsweise durch Fusionieren von Milzzellen hyperimmunisierter Mäuse mit einer geeigneten Maus-Myeloma-Zelllinie.

Ein chimärer Antikörper ist ein Molekül, bei welchem verschiedene Teile des Antikörpers von verschiedenen Tier-Spezies stammen, wie Antikörper mit einer variablen Region, die von einem murinen monoklonalen Antikörper stammt, und einer Human-Immunglobulin-konstanten Region. Verfahren zur Herstellung chimärer Antikörper sind auf dem Gebiet bekannt. Vgl. z.B. Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202; US 5,807,715; US 4,816,567 und US 4,816,397.

Humanisierte Antikörper sind Antikörper-Moleküle eines Antikörpers einer nicht-humanen Spezies, der das gewünschte Antigen bindet, welches eine oder mehrere Komplementaritäts-determinie-rende Regionen (CDRs) aus der nicht-humanen Spezies und Rahmen-Regionen („framework regions") aus einem humanen Immunglobulin-Molekül hat. Häufig werden Rahmen-Reste in den humanen Rahmen-Regionen mit dem entsprechenden Rest aus dem CDR-Donor-Antikör-per substituiert, um die Antigen-Bindung zu verändern, vorzugsweise zu verbessern. Diese Rahmen-Substitutionen sind durch auf dem Gebiet gut bekannte Verfahren identifiziert, z.B. durch Modellieren der Wechselwirkungen von CDR und Rahmen-Resten, um Rahmen-Reste zu identifizieren, die für eine Antigen-Bindung wichtig sind, und einen Sequenz-Vergleich, um ungewöhnliche Rahmen-Reste an bestimmten Positionen zu identifizieren (vgl. beispielsweise Queen et al., US 5,585,089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)). Antikörper können humanisiert werden, indem verschiedene auf dem Gebiet bekannte Techniken verwendet werden, einschließlich beispielsweise CDR-Grafting (EP 239,400; WO 91/09967; US 5,225,539; US 5,530,101; und US 5,585,089), Furnieren („veneering") oder Oberflächenerneuern („resurfacing") (EP 592,106, EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein F.nninpprinn 7f6\;fl05-814_

NACHGEREICHT (1994); Roguska et al., PNAS 91:969-913 (1994) und Ketten-Umord-nung („chain shuffling")(US 5,565,332).

Die Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung können vorteilhaft für die Densensibilisierung eines an einer Allergie, insbesondere an einer Hausstaubmilben-Allergie, leidenden Individuums verwendet werden. Für eine passive Immunisierung ist der Antikörper vorzugsweise ein IgG oder ein Derivat davon (z.B. ein chimärer oder humanisierter Antikörper). Weiters kann dieser Antikörper auch zur Desensibilisierung eines Individuums verwendet werden.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Vakzin-Formulierung, die ein hypoallergenes Protein oder einen Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst.

Die Vakzin-Formulierung gemäß der vorliegenden Erfindung kann wie auf dem Gebiet bekannt formuliert werden, und nötigenfalls an die Verabreichungsweise der Vakzin-Formulierung adaptiert werden.

Bevorzugte Verabreichungarten der Vakzin-Formulierung (der vorliegenden Erfindung) inkludieren alle Standard-Verabrei-chungs-Schemata, die für die Impfung im Allgemeinen und für die Allergie-Immuntherapie im Besonderen beschrieben und empfohlen wurden (oral, transdermal, intravenös, intranasal, über die Schleimhaut, rektal usw.). Es ist jedoch besonders bevorzugt, die Moleküle und Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung subkutan oder intramuskulär zu verabreichen.

Die Vakzin-Formulierung gemäß der vorliegenden Erfindung kann nur ein Virus-Capsid-Protein oder Fragmente davon eines Mitglieds der Gattung Rhinovirus umfassen.

Die Formulierung umfasst vorzugsweise weiters mindestens ein Adjuvans, einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten und/oder ein Konservierungsmittel.

Um die Immunogenität der hypoallergenen Moleküle gemäß der vorliegenden Erfindung zu erhöhen, können beispielsweise Adjuvantien in einem Medikament gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Ein Adjuvans gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Hilfsmittel, welches, wenn es gemeinsam mit oder parallel zu einem Antigen verabreicht wird, dessen Immunogenität erhöht und/oder die Qualität der Immunantwort beeinflusst.

Folglich kann das Adjuvans z.B. das Ausmaß der humoralen oder zellulären Immunantwort beträchtlich beeinflussen. Übliche Adju-

NACHGEREICHT - 44 - vantien sind z.B. Aluminium-Verbindungen, Lipid-hältige Verbindungen oder inaktivierte Mycobakterien.

Im Allgemeinen können die Adjuvantien verschiedener Form sein, mit der Maßgabe, dass sie für die Verabreichung an Menschen geeignet sind. Weitere Beispiele für solche Adjuvantien sind Öl-Emulsionen mineralischen oder vegetativen Ursprungs, Mineralverbindungen, wie Aluminiumphosphat oder -hydroxid, oder Calciumphosphat, bakterielle Produkte und Derivate, wie P40 (aus der Zellwand von Corynebacterium granulosum stammend), Monophos-phoryl-Lipid A (MPL, Derivat von LPS) und Muramylpeptid-Derivate und Konjugate davon (Derivate von Mycobacterium-Komponenten),

Alum, unvollständiges Freundsches Adjuvans, Liposyn, Saponin, Squalen usw. (vgl. z.B. Gupta R.K. et al. (Vaccine 11:293-306 (1993)) und Johnson A.G. (Clin. Microbiol. Rev. 7:277-289).

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Formulierung 10 ng bis 1 g, vorzugsweise 100 ng bis 10 mg, insbesondere 0,5 pg bis 200 pg des hypoallergenen Moleküls oder Antikörpers.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines hypoallergenen Proteins oder eines Antikörpers gemäß der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder Prävention einer Virusinfektion und/oder einer Allergie bei einem Menschen oder Tier.

Dieses Medikament umfasst vorzugsweise mindestens ein Adjuvans, einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten und/oder ein Konservierungsmittel.

Das Medikament gemäß der vorliegenden Erfindung kann für die aktive (Verabreichung des hypoallergenen Proteins und/oder von Molekülen der Erfindung) sowie für die passive Immunisierung (Antikörper, die auf das hypoallergene Protein und/oder Moleküle der Erfindung gerichtet sind) verwendet werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst dieses Medikament 10 ng bis 1 g, vorzugsweise 100 ng bis 10 mg, insbesondere 0,5 pg bis 200 pg des hypoallergenen Moleküls, Nukleinsäuremoleküls, Vektors, Wirts oder Antikörpers . nachgereicht

Das Medikament wird vorzugsweise einem Individuum in einer Menge von 0,01 mg/kg Körpergewicht bis 5 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise 0,1 mg/kg Körpergewicht bis 2 mg/kg Körpergewicht, verabreicht. I —- ·· • · • · • · • · ·· » · ·· « • · · · ♦ • · · · · • ···· ··· ·♦ ·*·· - 45 -

Das spezielle Dosis-Schema, d.h. Dosis, Timing und Wiederholung, hängt vom bestimmten Individuum und von der Krankengeschichte dieses Individuums ab. Empirische Überlegungen, wie die Halbwertszeit, tragen im Allgemeinen zur Bestimmung der Dosierung bei. Die Häufigkeit der Verabreichung kann im Laufe der Therapie bestimmt und angepasst werden.

Das Individuum, welchem das Medikament gemäß der vorliegenden Erfindung verabreicht wird, ist vorzugsweise ein Individuum oder Tier, bei welchem die Gefahr besteht, dass es eine Allergie bekommt.

Subjekte, bei welchen ein allergischer Zustand, eine Störung oder Krankheit oder die Gefahr einer solchen besteht, inkludieren Subjekte mit einem bestehenden allergischen Zustand, oder von welchen bekannt ist oder vermutet wird, dass sie eine Disposition für Symptome haben, die mit einem allergischen Zustand verbunden oder durch diesen verursacht sind. So kann das Subjekt einen aktiven chronischen allergischen Zustand, eine Störung oder Erkrankung, eine akute allergische Episode, oder einen latenten allergischen Zustand, eine Störung oder Erkrankung haben. Bestimmte allergische Zustände sind mit jahreszeitlichen oder geographischen ümweltfaktoren verbunden. Somit zählen zu den Risiko-Subjekten jene, bei welchen die Gefahr besteht, dass sie an einem Zustand aufgrund einer früheren persönlichen oder Familienanamnese, der Jahreszeit oder des Ortes, an dem sie sich befinden, leiden, wobei sich jedoch der Zustand oder ein mit dem Zustand verbundenes Symptom zurzeit möglicherweise bei diesem Subjekt nicht zeigt.

Die Verabreichung des Medikaments gemäß der vorliegenden Erfindung, welches mindestens ein hypoallergenes Molekül, wie hierin beschrieben, umfasst, an ein Individuum kann die Sensibilisierung dieses Individuums verhindern oder eine angemessene Immunantwort auf Allergene induzieren. Wenn das Medikament der vorliegenden Erfindung zur Verhinderung einer Sensibilisierung verwendet wird, sollte es vor dem ersten Kontakt mit diesem Allergen an ein Individuum verabreicht werden. Daher ist bevorzugt, das Medikament gemäß der vorliegenden Erfindung an Neugeborene und Kinder zu verabreichen. Es zeigte sich, dass auch die Verabreichung des Medikaments gemäß der vorliegenden Erfindung an Schwangere die Bildung von gegen Allergene gerichteten Antikörpern im ungeborenen Kind induziert. Es ist hogonHorc _ nachgereicht

46 hypoallergene Moleküle gemäß der vorliegenden Erfindung für solche Therapien zu verwenden, weil infolge des Fehlens von T-Zell-Epitopen Nebenwirkungen, die im Laufe einer Allergen-Immunthera-pie auftreten, signifikant verringert oder sogar vollständig vermieden werden können.

Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines hypoallergenen Proteins oder eines Antikörpers gemäß der vorliegenden Erfindung für die Diagnose einer Allergie und/oder einer Virusinfektion bei einem Individuum.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Virus-Capsid-Proteins von einem Virus der Familie der Picornaviridae als Träger bei Medikamenten oder Vakzinen oder für die Diagnostizierung einer Virusinfektion, insbesondere einer Erkältung.

Als wertvolle Alternative zum weit verbreiteten KLH-Träger-Protein können Virus-Capsid-Proteine von Viren der Familie der Picornaviridae verwendet werden. Der Träger kann mit Peptiden, Proteinen und Polypeptiden oder anderen Antigenen chemisch konjugiert oder mittels rekombinanter Techniken fusioniert sein. Weiters kann das Virus-Capsid-Protein beispielsweise für die Detektion von Antikörpern, die auf das Capsid-Protein im Serum eines Individuums gerichtet sind, verwendet werden.

Einer der Vorteile eines solchen Trägers ist, dass nicht nur das damit fusionierte oder konjugierte Antigen dem Immunsystem ausgesetzt sein kann, sondern auch eine Immunantwort gegen das Capsid-Protein eines Rhinovirus induziert wird. Folglich führt eine solche Impfung zur Prävention und/oder Behandlung von durch Rhinoviren verursachten Krankheiten. Das Virus ist vorzugsweise von der Spezies humaner Rhinoviren, insbesondere Human-Rhinovi-rus 89 und 14.

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein hypoallergenes Molekül, das von Phi p 5 (Genbank No. X7435) stammt und eine C- und/oder N-terminale Trunkierung hat und welchem im Wesentlichen die IgE-Bindungskapazität fehlt.

Graspollen ist eine der stärksten jahreszeitlichen Quellen im Freien für durch die Luft übertragene Allergene, die für Heuschnupfen und allergisches Asthma verantwortlich sind.

Mehr als 40% der allergischen Individuen weisen eine IgE-Re-aktivität mit Graspollen-Allergenen auf, welche in mehr als 11 Gruppen unterteilt sind. Mehr als 80% der Graspollen-Allergiker

NACHGEREICHT φφ

φφ « φ φ φ φ φ φ φφφ φ φ φ φ φ φ φφ

47 reagieren mit den Allergenen der Gruppe 5.

Die Allergene der Gruppe 5 sind nicht-glykosylierte, sehr homologe Proteine mit einem Molekülmassenbereich von 25-33kD. Mehrere Allergene der Gruppe 5 wurden kloniert und/oder immunologisch charakterisiert.

Der Versuch, die allergene Aktivität durch Einführen von Punktmutationen, Reihen-Mutationen von mehreren Aminosäuren oder Deletionen zu reduzieren, zeigte keine Wirkung (Schramm G., et al., J. Immunol. 1999; 162: 2406-1435). Die IgE-bindenden Regionen von Phi p 5 (Flicker S., et al., J. Immunol. 2000; 165: 3849-3859) wurden bereits beschrieben und die dreidimensionale Struktur gelöst (Maglio 0., et al., 2002. Protein Eng. 15:635-642) .

Es stellte sich heraus, dass insbesondere die Phi p 5-Pepti-de gemäß der vorliegenden Erfindung, welche C- und/oder N-termi-nal trunkiert sind und welchen die IgE-Bindungskapazität fehlt, für die aktive Impfung von Individuen verwendet werden können.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung fehlen dem trunkierten Molekül die T-Zell-Epitope.

Wie bereits oben angedeutet, können späte Nebenfolgen einer Allergen-Immuntherapie signifikant verringert oder sogar vermieden werden, wenn den hypoallergenen Molekülen im Wesentlichen T-Zell-Epitope fehlen.

Trunkierte Phi p 5-Moleküle, welchen T-Zell-Epitope fehlen, sind aus den Aminosäuren 98 bis 128, 26 bis 58 oder 252 bis 283 von Phi p 5 oder Fragmenten davon zusammengesetzt.

Insbesondere zeigen diese trunkierten Moleküle im Wesentlichen keine T-Zell-Epitope und können trotzdem eine angemessene gegen das Wildtyp-Allergen gerichtete Immunantwort hervorrufen.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das hypoallergene trunkierte Phi p 5 aus den Aminosäuren 132 bis 162, 217 bis 246 oder 176 bis 212 von Phi p 5 zusammengesetzt.

Diese hypoallergenen Moleküle umfassen ein oder mehrere T-Zell-Epitope, jedoch fehlt ihnen die IgE-Bindungskapazität.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein hypoallergenes Molekül, das von Fel d 1 (Genbank No. X62477 und X62478) stammt, eine C- und/oder N-terminale Trunkierung aufweist und welchem die IgE-Bindungskapazität fehlt.

Allergien gegen Tiere betreffen bis zu 40% der allergischen

NACHGEREICHT ·· · ·· · ·· ·· ···♦··# · · · » • · ······· · • · · · · ··#· ·»· · ·*···· · · ·· ··· ·· t ·♦ ··«» - 48 -

Patienten. Im häuslichen Umfeld sind Allergien gegen die beliebtesten Haustiere, Katzen und Hunde, besonders vorherrschend und das ganze Jahr hindurch mit Symptomen verbunden. Tierallergene befinden sich in Hautschuppen, im Epithelium, Speichel, Serum oder Harn. Die Einwirkung von Allergenen kann entweder durch direkten Hautkontakt oder durch Einatmen von Allergene tragenden Teilchen erfolgen. Es zeigte sich, dass die Hauptallergene von Katze und Hund weit verbreitet vorhanden sind, und sie konnten sogar in Haushalten, die keine Haustiere besaßen und an öffentlichen Orten, z.B. in Schulen, nachgewiesen werden. Dies kann der großen und zunehmenden Anzahl von Haustieren haltenden Haushalten in den Industrieländern (etwa 50%) und auf die große Stabilität von Allergenen, die verschleppt und verteilt werden, zurückgeführt werden.

Fel d 1 wurde als das Hauptallergen der Katze identifiziert, welches von mehr als 90% der gegen Katzen allergischen Patienten erkannt wird. Fel d 1 stellt ein saures 38 kDa Glykoprotein mit unbekannter biologischer Funktion dar. Es besteht aus zwei identischen, nicht kovalent verbundenen Heterodimeren, welche wiederum aus zwei Polypeptid-Ketten besteht, die antiparallel durch drei Disulfid-Bindungen verbunden sind. Die Kette 1 und die Kette 2 sind auf verschiedenen Genen codiert, wobei jede aus 3 Ex-ons besteht. Rekombinantes Fel d 1 (rFel d 1), das als ein Kette 2-an Kette 1-Fusionsprotein exprimiert wird, wurde in E. coli erzeugt. Dieses rekombinante Fel d 1 kann die immunologischen Eigenschaften des Wildtyp-Allergens vollständig nachahmen.

Peptide, die vom Hauptallergen der Katze, Fel d 1, stammen und welchen die IgE-Bindungskapazität fehlt, sind z.B. für die Immuntherapie und die prophylaktische Allergie-Impfung geeignet. Diese Peptide können in einem größeren Polypeptid enthalten sein oder an ein geeignetes Trägerprotein, wie KLH (keyhole limpet hemocyanin), gekoppelt sein. Die von Fel d 1 stammenden synthetischen Peptide - wie das Phi p 5 und die von Allergen abstammenden Peptide, die hierin geoffenbart sind - können eine IgG-Antwort induzieren, d.h. die Produktion sogenannter „blockierender Antikörper" oder „protektiver Antikörper". Diese Antikörper verhindern die IgE-Bindung an das Allergen Fel d 1. Eine signifikante Verringerung allergischer Symptome kann so erreicht werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Er-

NACHGEREICHT • · ··

♦ »· * · • · • · 49 findung weist das trunkierte Molekül eine verringerte T-Zell-Re-aktivität auf.

Um späte Nebenwirkungen zu vermeiden oder signifikant zu verringern, weist das von Fel d 1 stammende hypoallergene Molekül eine verringerte T-Zell-Reaktivität, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, auf.

Das trunkierte Fel d 1 ist vorzugsweise aus den Aminosäuren 1 bis 34 oder 35 bis 70 der Kette 1 von Fel d 1, den Aminosäuren 1 bis 34, 35 bis 63 oder 64 bis 92 der Kette 2 von Fel d 1 zusammengesetzt.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft hypoallergene Moleküle, die aus den Aminosäuren 1 bis 33, 21 bis 51, 42 bis 73, 62 bis 103 oder 98 bis 129 von Der p 2, den Aminosäuren 1 bis 30, 20 bis 50, 50 bis 80, 90 bis 125, 125 bis 155 oder 165 bis 198 von Der p 7, den Aminosäuren 1 bis 35, 35 bis 72, 70 bis 100 oder 90 bis 122 von Der p 21, den Aminosäuren 1 bis 32, 15 bis 48 oder 32 bis 70 von Klon 30, den Aminosäuren 19 bis 58, 59 bis 95, 91 bis 120 oder 121 bis 157 von Alt a 1, den Aminosäuren 31 bis 60, 45 bis 80, 60 bis 96 oder 97 bis 133 von Par j 2, den Aminosäuren 1 bis 40, 36 bis 66, 63 bis 99, 86 bis 120 oder 107 bis 145 von Oie e 1, den Aminosäuren 25 bis 58, 99 bis 133, 154 bis 183, 277 bis 307, 334 bis 363, 373 bis 402, 544 bis 573, 579 bis 608, 58 bis 99, 125 bis 165, 183 bis 224, 224 bis 261, 252 bis 289, 303 bis 340, 416 bis 457, 460 bis 500 oder 501 bis 542 von Fel d 2, den Aminosäuren 19 bis 58, 52 bis 91, 82 bis 119, 106 bis 144 oder 139 bis 180 von Can f 2, den Aminosäuren 19 bis 56, 51 bis 90, 78 bis 118, 106 bis 145 oder 135-174 von Can f 1, den Aminosäuren 27 bis 70, 70 bis 100 oder 92 bis 132 von Art v 1, den Aminosäuren 31 bis 70, 80 bis 120, 125 bis 155, 160 bis 200, 225 bis 263, 264 bis 300, 305 bis 350 oder 356 bis 396 von Amb a 1, den Aminosäuren 1 bis 34, 35 bis 74, 74 bis 115, 125 bis 165, 174 bis 213, 241 bis 280, 294 bis 333, 361 bis 400 oder 401 bis 438 von Alt a 6, den Aminosäuren 1 bis 40, 41 bis 80, 81 bis 120, 121 bis 160 von Alt a 2 oder Fragmenten davon zusammengesetzt sind oder diese umfassen.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein hypoallergenes Fusionsprotein, welches mindestens zwei hypoallergene Moleküle gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, die eine verringerte IgE-Bindungskapazität aufweisen und gegebenenfalls eine verringerte T-Zell-Reaktivität aufweisen.

| NACHGEREICHT

φ φ φ · φ φφφφ φ φ φ · φ φ φφ φφφ φφ φ

50

Die hypoallergenen Moleküle der vorliegenden Erfindung, die von einem Allergen stammen und welchen die IgE-Bindungskapazität fehlt, können miteinander rekombinant fusioniert oder chemisch konjugiert sein. Wie den einzelnen Komponenten (Allergen-Fragmente) des Fusionsproteins/Polypeptids fehlt auch dem Fusions-protein/Polypeptid die IgE-Bindungskapazität.

Das Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung kann mindestens zwei, vorzugsweise mindestens drei, mehr bevorzugt, mindestens vier, noch mehr bevorzugt mindestens fünf hypoaller-gene Moleküle gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen. Es ist natürlich auch möglich, die hypoallergenen Moleküle mit anderen Peptiden, Polypeptiden und Proteinen, die nicht von Allergenen stammen, zu fusionieren. Diese Peptide, Polypeptide und Proteine können, wenn sie an ein Individuum verabreicht werden, auch eine immunologische Reaktion induzieren oder sie können als Träger fungieren oder enzymatische Aktivitäten aufweisen. Die hypoallergenen Moleküle im Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung können direkt aneinander gekoppelt sein oder über einen Linker, welcher vorzugsweise aus Aminosäureresten besteht.

Verfahren zur Herstellung von Fusionsproteinen sind auf dem Gebiet wohl bekannt und in molekularbiologischen Standard-Literaturstellen zu finden, wie Sambrook et al. (Molecular Cloning, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) und Aus-ubel et al. (Short Protocols in Molecular Biology, 3. Ausgabe; Wiley and Sons, 1995). Im Allgemeinen wird ein Fusionsprotein erzeugt, indem zuerst ein Fusionsgen konstruiert wird, welches in einen geeigneten Expressionsvektor insertiert wird, welcher wiederum zur Transfektion einer geeigneten Wirtszelle verwendet wird. Im Allgemeinen werden rekombinante Fusionskonstrukte durch eine Reihe von Restriktions-Enzym-Verdaue und Ligations-Reaktio-nen, welche dazu führen, dass die gewünschten Sequenzen in ein Plasmid inkorporiert werden, hergestellt. Wenn keine geeigneten Restriktionsstellen zur Verfügung stehen, können synthetische Oligonukleotid-Adapter oder -Linker verwendet werden, wie den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt und in den oben angeführten Literaturstellen beschrieben ist. Die Polynukleotidsequenzen, die für Allergene codieren, und native Proteine können vor der Insertion in einen geeigneten Vektor zusammengefügt werden, oder die für das Allergen codierende Sequenz kann angrenzend an eine Sequenz, die für eine in einem Vektor bereits vorhandene native

NACHGEREICHT • ·· · ΦΦ ΦΦ ΦΦ m Φ Φ · « · « Φ φ ···· · · • * · #·· ··# · Φ · φ Φ φ · ··· ·· · ·· ···· ΦΦ • · • · • · • · ΦΦ - 51 -

Sequenz codiert, insertiert werden. Die Insertion der Sequenz im Vektor sollte „in frame" sein, so dass die Sequenz in ein Protein transkribiert werden kann. Es wird für den Durchschnittsfachmann verständlich sein, dass die genauen Restriktionsenzyme, Linker und/oder Adaptoren, die benötigt sind, sowie die genauen Reaktionsbedingungen je nach den verwendeten Sequenzen und Klonierungsvektoren verschieden sein werden. Der Zusammenbau von DNA-Konstrukten ist auf dem Gebiet jedoch Routine und kann vom Fachmann leicht durchgeführt werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Moleküle in einer Reihenfolge miteinander fusioniert, die von der Reihenfolge der Fragmente im Wildtyp-Aller gen verschieden ist, wenn die mindestens zwei Moleküle vom selben Allergen stammen.

Das Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung kann mindestens zwei hypoallergene Moleküle umfassen, die vom selben Wildtyp-Allergen stammen. In einem solchen Fall werden die einzelnen Moleküle (Allergen-Fragmente) in einer Reihenfolge miteinander fusioniert, die sich von der Reihenfolge im Wildtyp-Allergen unterscheidet. Ein derartiges Vorgehen verhindert die erneute Bildung von potentiellen IgE-Bindungsstellen/Epitopen im hypoallergenen Fusionsprotein.

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Nukleinsäuremolekül, das für ein hypoallergenes Molekül und für ein Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung codiert.

Das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung kann z.B. verwendet werden, um diese Moleküle rekombinant herzustellen.

Dieses Nukleinsäuremolekül kann - gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung - in einem Vektor enthalten sein.

Dieser Vektor ist vorzugsweise ein Expressionsvektor.

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Vakzin-Formulierung, umfassend ein hypoallergenes Molekül, ein Fusionsprotein oder einen Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung.

Die Formulierung umfasst weiters vorzugsweise mindestens ein Adjuvans, einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten und/oder ein Konservierungsmittel.

Die Verwendung bestimmter Träger-Substanzen, wie KLH (keyhole limpet hemocyanin) gehört auch zu den neuesten aktuellen Me- nachgereicht ·* · ·· · ·· ·· ······♦ · · · · • · ······· · • · · · · ··«· ··· · «····· · · •· ·*· ·♦ · ·· «··· - 52 - thoden zur Steigerung von Immunantworten. Die hypoallergenen Moleküle der vorliegenden Erfindung können auch mit Virus-Capsid-Proteinen, welche auch als Träger fungieren können (siehe oben), fusioniert oder konjugiert sein.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst diese Formulierung 10 ng bis 1 g, vorzugsweise 100 ng bis 10 mg, insbesondere 0,5 pg bis 200 pg des hypoallergenen Moleküls oder Antikörpers.

Die Vakzin-Formulierung kann im Wesentlichen wie das Medikament der vorliegenden Erfindung zusammengesetzt sein (siehe oben).

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines hypoallergenen Moleküls, eines Fusionsproteins oder eines Antikörpers gemäß der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder Prävention einer Allergie bei einem Individuum.

Das hypoallergene Molekül, Fusionsprotein und der Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung können zur Impfung eines Individuums verwendet werden. Diese Impfung kann die durch ein Wildtyp-Allergen bewirkte allergische Reaktion verringern oder verhindern.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst dieses Medikament weiters mindestens ein Adjuvans, einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten und/oder ein Konservierungsmittel.

Das Medikament gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst vorzugsweise 10 ng bis 1 g, vorzugsweise 100 ng bis 10 mg, insbesondere 0,5 pg bis 200 pg des immunogenen Moleküls, Nukleinsäuremoleküls, Vektors, Wirts oder Antikörpers.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Medikament an ein Individuum in der Menge von 0,01 mg/kg Körpergewicht bis 5 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise 0,1 mg/kg Körpergewicht bis 2 mg/kg Körpergewicht verabreicht.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht bei diesem Individuum die Gefahr, eine Allergie zu bekommen.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines hypoallergenen Moleküls, eines Fusionsproteins oder eines Antikörpers gemäß der vorliegenden Erfindung zur Dia-

NACHGEREICHT

• ·· · • · ·· ···» ·· ·· • · · 53 gnostizierung einer Allergie oder zur Überwachung des Fortschritts einer Allergie-Therapie bei einem Individuum.

Das hypoallergene Molekül, Fusionsprotein oder der Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung kann nicht nur in Medikamenten verwendet werden, sondern kann auch zweckmäßig für verschiedene diagnostische Zwecke verwendet werden. Beispielsweise können diese Moleküle und Fusionsproteine für die Diagnostizierung einer Allergie verwendet werden, indem z.B. eine Probe von einem Individuum, die Histamin-freisetzende Zellen umfasst, diesem Polypeptid ausgesetzt wird (vgl. z.B. Purohit et al.,

Clin. Exp. Allergy 35 (2005): 186-192). Weiters können diese Moleküle, Fusionsproteine und Antikörper an einer Oberfläche immobilisiert sein, um ein(en) Polypeptid-Array/Chip zu bilden.

Solche Arrays können beispielsweise bei Screenings mit hohem Durchsatz verwendet werden, um eine Allergie in einer Reihe von Proben, die von einer Reihe von Individuen entnommen wurden, zu diagnostizieren.

Die vorliegende Erfindung ist durch die folgenden Figuren und Beispiele weiter veranschaulicht, ohne jedoch auf diese eingeschränkt zu sein.

Fig. 1A zeigt eine schematische Übersicht des Vektors p89V- pl.

Fig. 1B zeigt die DNA-Sequenz der multiplen Klonierungsstelle des pET-17b-Vektors und des für 89VP1 codierenden Gens.

Fig. IC zeigt die schematische Darstellung von drei Möglichkeiten zur Schaffung von Nukleinsäure-Fusionen.

Fig. 2 zeigt ein mit Coomassie Blue gefärbtes 12% SDS-PAGE Gel, enthaltend gereinigtes 89VP1 His-markiertes Protein (Bahn 1: 5 pg Molekular-Marker; Bahnen 2-5: 10 μΐ 89VP1 Elutions-Proben) .

Fig. 3 zeigt die IgG-Erkennung von 14VP1: Immunoblotten von 14VP1 und Kontrollen. Die Punkte („dots") werden durch Autoradiographie sichtbar gemacht (Bahnen 1-6: Inkubation mit 1:500-1:16000 verdünntem Kaninchen-anti-14VPl-Antiserum; Bahnen 7-12: Inkubation mit 1:500-1:16000 verdünntem Präimmunserum).

Fig. 4 zeigt die 89VPl-spezifische IgGl-Antwort bei Mäusen. Gruppen von Mäusen wurden mit verschiedenen Antigenen immunisiert, wie oben auf jeder Box angegeben. Die 89VPl-spezifischen IgGl-Titer wurden mittels ELISA gemessen und sind als OD-Werte auf der y-Achse ausgedrückt. Die Ergebnisse sind als Box-Dia-

NACHGEREICHT

54 gramme gezeigt, wobei sich 50% der Werte innerhalb der Boxen und Nicht-Ausreißer zwischen den Balken befinden. Die Linie innerhalb der Boxen gibt die Mittelwerte an.

Fig. 5 zeigt die Phi p 1-spezifische IgGl-Antwort bei Mäusen. Gruppen von Mäusen wurden mit verschiedenen Antigenen immunisiert, wie oben auf jeder Box angegeben. Die rPhl p 1-spezifischen IgGl-Titer wurden mittels ELISA gemessen und sind als optischer Wert (OD 405 nm) auf der y-Achse ausgedrückt. Der optische Wert entspricht der Menge von IgGl-Antikörper in den Maus-Seren. Die Ergebnisse sind als Box-Diagramme gezeigt, wobei sich 50% der Werte innerhalb der Boxen und Nicht-Ausreißer zwischen den Balken befinden. Die Linie innerhalb der Boxen gibt die Mittelwerte an.

Fig. 6 zeigt die für Wiesenlieschgras-Pollenextrakt spezifische IgGl-Antwort bei immunisierten Mäusen. Gruppen von Mäusen wurden mit verschiedenen Antigenen immunisiert, wie oben auf jeder Box angegeben. Die für Wiesenlieschgras-Pollenextrakt spezifischen IgGl-Titer wurden mittels ELISA gemessen und sind als optischer Wert (OD 405 nm) auf der y-Achse ausgedrückt. Der optische Wert entspricht der Menge von IgGl-Antikörper in den Maus-Seren. Die Ergebnisse sind als Box-Diagramme gezeigt, wobei sich 50% der Werte innerhalb der Boxen und Nicht-Ausreißer zwischen den Balken befinden. Die Linie innerhalb der Boxen gibt die Mittelwerte an.

Fig. 7 zeigt den Mittelwert der %Hemmung der Patienten-IgE-Bindung an rPhl p 1 durch Vorinkubation mit Antiseren gegen rPhl p 1 r89P5 und KLHP5 von allen 19 Patienten. Die %Hemmung ist auf der y-Achse gezeigt. Die Ergebnisse sind als Balken gezeigt.

Fig. 8 zeigt die Proliferation von Milzzellen immunisierter Mäuse. T-Zellen immunisierter Mäuse mit verschiedenen Antigenen, wie oben auf jeder Box angegeben, wurden mit Peptid 5, 89VP1(89) und KLH stimuliert. Medium wurde als Referenz verwendet. An der y-Achse ist der Stimulations-Index gezeigt. Die Ergebnisse sind als Balken gezeigt.

Fig. 9 zeigt die IgGl-, IgG2-, IgG4- und IgA-Antwort auf 14VP1, 89VP1 und rPhl p 1, das mittels ELISA-Messung in Humanseren nachgewiesen wurde. 10 Patienten-Seren wurden auf vier Antikörper, die für 89VP1, 14VP1 und rPhl p 1 spezifisch sind, getestet, wie oben auf jeder Box angegeben ist. Seren, die im

NACHGEREICHT

• · · · • · · • · ·· ···· 55

Herbst und Winter genommen wurden, sind links bzw. rechts von jedem „Balken-Paar" gezeigt. Die Titer wurden mittels ELISA gemessen und sind als optischer Wert (OD 405 nm) auf der y-Achse ausgedrückt. Der optische Wert entspricht der Menge an Antikörper in den Humanseren. Die Ergebnisse sind als Box-Diagramme gezeigt, wobei sich 50% der Werte innerhalb der Boxen und Nicht-Ausreißer zwischen den Balken befinden. Die Linie innerhalb der Boxen gibt die Mittelwerte an.

Fig. 10 zeigt die Detektion von anti-89VPl- und anti-rPhl p 1-Antikörpern in Seren von allergischen Patienten. Die Seren von 5 gegen Phi p 1 allergischen Patienten wurden auf sieben Antikörper, die für 89VP1 (linker Balken von jedem Paar) und rPhl p 1 (rechter Balken von jedem Paar) spezifisch sind, getestet. Die Titer wurden mittels ELISA gemessen und sind als optischer Wert (OD 405 nm) auf der y-Achse ausgedrückt. Der optische Wert entspricht der Menge an Antikörper in den Humanseren. Die Ergebnisse sind als Box-Diagramme gezeigt, wobei sich 50% der Werte innerhalb der Boxen und Nicht-Ausreißer zwischen den Balken befinden. Die Linie innerhalb der Boxen gibt die Mittelwerte an.

Fig. 11 zeigt die anti-14VPl-IgG-Bindung an HRV14-Proteinex-trakt und gereinigtes 14VP1 (Bahnen 1 und 4: 5 pg Marker; Bahnen 2 und 5: Virusextrakt; Bahnen 3 und 6: 5 pg 14VP1). Blot A und B wurden mit anti-14VPl-Immunserum bzw. Präimmunserum inkubiert. Gebundenes IgG wurde mittels Western-Blotten detektiert und mittels Autoradiographie sichtbar gemacht.

Fig. 12 zeigt die Neutralisation von HRV14 (Bahn A (Zell-Kontrolle) : Zellen nach Vorinkubation von HRV14 mit einer Verdünnung von anti-14VPl-Immunserurn 1:102-1:108 (Reihe A1-A6); Bahn B; Zellen nach Vorinkubation von HRV14 mit einer Verdünnung von Präimmunserum 1:102-1: 108 (Reihe B1-B6) ; Bahn C: Zellen nach Inkubation mit HRV14 10 TCD50-106 TCD50 (Reihe C1-C6); D5: Zellen nach Inkubation mit Präimmunserum; D6: Zellen nach Inkubation mit Immunserum) . Die Zellen wurden in allen Vertiefungen ausplattiert und mit Kristallviolett nach drei Tagen gefärbt.

Fig. 13 zeigt die IgG-Reaktivität von Anti-Peptid-Antiseren mit dem vollständigen Phi p 5-Allergen. Die IgG-Reaktivitäten (OD-Werte) gegenüber Phi p 5 sind für 3 Serum-Proben gezeigt (Blut 1: Präimmunserum; Blut 2-3: Serumproben, die in monatlichen Intervallen von 6 Kaninchen entnommen wurden, von welchen

NACHGEREICHT ·· · ·· · #· ·· ······· ···· • · «·*···· · • · · » · ··«· ··· · ······ ·· ·· ··· ·· · ·♦ ···· - 56 - jedes mit einem der mit KLH konjugierten Peptide immunisiert war.

Fig. 14 zeigt die allergene Aktivität von rPhl p 5, und die Peptid-Mischung, wie sie mittels CD203c-Expression nachgewiesen wurde. Heparinisierte Blutproben von drei gegen Phi p 5 allergischen Patienten wurden mit seriellen Verdünnungen von IO-4 bis 10 pg/ml von rekombinantem Allergen, einer äquimolaren Mischung von von Phi p 5 stammenden Peptiden, anti-IgE oder Kontroll-Puf-fer (co, x-Achse) inkubiert. Die Zellen wurden dann mit CD203c mAb gefärbt und auf eine CD203c-Expression auf einem FACScan analysiert. Der Stimulations-Index (SI) ist auf der y-Achse dargestellt.

Fig. 15 zeigt die Identifikation von von Phi p5 stammenden Peptiden, welche niedrige lymphoproliferative Antworten induzieren. PBMCs von gegen Wiesenlieschgras allergischen Patienten wurden mit verschiedenen Konzentrationen von Peptiden und, für Kontrollzwecke, mit Interleukin-2 stimuliert (x-Achse). Die Sti-mulations-Indices (SI) sind auf der y-Achse angegeben.

Fig. 16 zeigt von Fel d 1 stammende synthetische Peptide, die bei Kaninchen für Fel d 1 spezifische IgG-Immunantworten induzieren. Sechs Kaninchen wurden mit den KLH-konjugierten, von Fel d 1 stammenden synthetischen Peptiden oder unkonjugierten rFel d 1 immunisiert, und 3-4 Blute wurden in monatlichen Intervallen entnommen. Die IgG-Reaktivitäten der Präimmunseren und der Antiseren zu an ELISA-Platten gebundenen rFel d 1 sind als optische Dichten gezeigt (OD-Werte, y-Achse).

Fig. 17 zeigt die niedrige allergene Aktivität von von Fel d 1 stammenden synthetischen Peptiden, wie mittels CD63- und CD203c-Expression an basophilen Zellen allergischer Patienten bestimmt. PBMCs von 5 gegen Katzen allergischen Patienten wurden mit seriellen Verdünnungen von Fel d 1 (geschlossene Felder ) oder einer Mischung von von Fel d 1 stammenden synthetischen Peptiden (offene Felder □) inkubiert (x-Achse). Für den Patenten RR wurden auch PBMCs mit seriellen Verdünnungen von von Fel d 1 stammenden synthetischen Peptiden als einzelne Komponenten untersucht. Die Induktion der Expression der Oberflächen-Marker CD203c und CD63 wurde als mittlere Fluoreszenz-Intensitäten gemessen, und die berechneten Stimulations-Indices sind auf der y-Achse gezeigt.

Fig. 18 zeigt, dass eine Behandlung mit mit KLH gekoppelten,

NACHGEREICHT • · · » ····· ··» · • · ··#· ·· • Λ ··· «· · ·· ··»· - 57 - von Bet v 1 stammenden Peptiden die lymphoproliferativen Antworten auf rBet v 1 bei sensibilisierten Mäusen verringert. Die T-Zell-Proliferation wurde in Milz-Zellkulturen nach einer in vi-tro-Stimulation mit dem rekombinanten Birkenpollen-Allergen Bet v 1 weiße Balken), KLH (schwarze Balken) oder der Peptidmischung (graue Balken) gemessen. Die Balken stellen die mittleren Stimu-lations-Indices (SI±SA) für die verschiedenen Gruppen von Mäusen dar.

Fig. 19 zeigt die prophylaktische Impfung von naiven Mäusen mit mit KLH gekoppelten, von Bet v 1 stammenden Peptiden, welche die lymphoproliferativen Antworten auf rBet v 1 nach einer Sensibilisierung verringert.

Fig. 20 zeigt, dass die prophylaktische Impfung naiver Mäuse mit mit KLH gekoppelten, von Bet v 1 stammenden Peptiden eine Bet v 1-spezifische IgG-Antwort induziert und für die Induktion von Allergen-spezifischen IgG-Antworten durch das vollständige Allergen primt. Die IgG-Antworten (OD-Werte: y-Achse) auf Bet v 1 wurden in den vier Behandlungsgruppen zu verschiedenen Zeitpunkten gemessen (x-Achse).

BEISPIELE

Beispiel 1: Konstruktion von Vektor p89VPl

Proben der Virus-Stammlösung wurden für die RT-PCR hergestellt durch Zugabe von 1 μΐ RNase-Inhibitor (Boehringer GmbH, Deutschland) bis zu einer Endkonzentration von 0,01 E/μΙ nach RNA-Extraktion aus Zellkultur-Überständen mit dem „QIAamp viral RNA-Kit" (Qiagen, Deutschland).

Das Plasmid p89VPl (Fig. 1A) wurde konstruiert, indem das Ndel/EcoRI-Fragment der multiplen Klonierungsstelle von pET-17b durch die cDNA-Sequenz, die für das VPl-Protein vom humanen Rhinovirus-Stamm 89 (89VP1) kloniert, ersetzt wurde. Die Ndel- und EcoRI-Restriktionsstellen (in pET-17b) wurden verwendet für die Insertion von mit 89VP1 verbundenem Asel/EcoRI mit ATG am 5'-Ende, sechs Histidinen gefolgt durch das Stop-Codon TGA am 3'-Ende (Fig. 1B).

Die Insertion von 89VP1 in pET-17b wurde durch Nukleotid-Sequenzierung bestätigt.

Nach der Ndel/Asel-Fusion wurde anstatt der Ndel-Stelle CATAAT erzeugt und konnte mit keinem verfügbaren Enzym geschnitten werden. Daher wurde die Stelle zu CTTAAG, der Restriktionsstelle von Afl II, mutiert. Um ein weiteres Allergen-Fragment zu

| NACHGEREICHT ♦ · · ··«· ♦ ····** · * ♦ · ··*· ··· « • · ♦ ♦ · · ··· ·· · ·· ♦··· ·· • ♦ • · • · • · ·· - 58 - insertieren wurde die ACCGTT-Sequenz am 3'-Ende zu ACCGGT, der Restriktionsstelle von Agel, mutiert. Die nachstehend gezeigten Aminosäuresequenzen sind die Nukleotid-Sequenzen von 89VP1. Die Restriktionsstellen sind in Fig. 1B unterstrichen gezeigt.

Diese Afl II und Agel-Restriktionsstellen wurden mit dem Quick change site mutagenesis Kit (Stratagene) erzeugt. cDNAs für Gen-Fragmente können somit für eine leichte Reinigung in die übrigen Restriktionsstellen entweder am 5'-Ende (unter Verwendung von Afl II) oder am 3'-Ende (unter Verwendung von Agel) von 89VP1, oder in beide Stellen, wie in Fig. IC gezeigt, insertiert werden. Rekombinante Allergen-Fragmente werden somit am N-Terminus und/oder am C-Terminus des 89VP1 exprimiert.

Tabelle I: Klonierung und Mutagenese-Primer (5' nach 3') 89VP1 Klonierung SEQ ID Nx. 89VP1 vorwärts CGGAATTCATTAATATGAACCCAGTTGAAAAT -TATATAGATAGTGTATTA 1 89VP1 rückwärts CGATTAATT- CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGACGTTTGTAA- CGGTAA 2 Mutagenese Afl II vorwärts C T T T AAGAAGGAGAT AT AC T T AAGAT GAACC -CAGTTG 3 Afl II rückwärts CAACTGGGTTCATCTTAAGTATATCTCCTTCT- TAAAG 4 Agel vorwärts CCTGATGTTTTTACCGGTACAAACGTCCACCAC 5 Agel rückwärts GTGGTGGACGTTTGTACCGGTAAAAACATCAGG 6

Beispiel 2: Klonierung eines Konstrukts, das ein 89VP1-A11-ergen-Fracment-Fusionsprotein exprimiert

Die oben beschriebene Vorgangweise wurde beispielhaft für ein C-terminales Phi p 1-Allergen-Fragment angeführt, nämlich das Peptid 5 (CVRYTTEGGTKTEÄEDVIPEGWKADTAYESK; M. Focke et al. FASEB J (2001) 15:2042-4). Die Peptid 5-DNA-Sequenz wurde mittels PCR amplifiziert, wobei die Phi p 1-cDNÄ (GenBank: X78813) als Matrize verwendet wurde (Primer: Phi p 1 vorwärts 5'-CGCGCT-TAAGATGGTCCGCTACACCACCGAGGGC-3' (SEQ ID Nr. 7); Phi p 1 rück-

INACHGEREICHT • · ······· · • · · · · *··· »·· i • · · · · · ι ·

·· ··· ·· · ·· MM - 59 - wärts 5' -CGCGCTTAAGCTTGGACTCGTAGGCGGTGTCGGC-3' (SEQ ID Nr. 8)).

Das PCR-Produkt wurde in die Afl II-Restriktionsstelle des p89V-Pl-Vektors insertiert, und das resultierende Konstrukt wird als Vektor p89P5 und Gen-Produkt r89P5 bezeichnet.

Beispiel 3: Expression und Reinigung von 89VP1-Peptid 5-Fu-sionsprotein und 89VP1

Um die Expression von 89VP1 oder r89P5 (rekombinantes 89VP1-Peptid 5-Fusionsprotein) zu erreichen, wurden Plasmide in E. coli BL21 (DE3) transformiert. Transformierte E. coli-Zellen wurden in 250 ml LB-Medium, das 100 mg/1 Ampicillin enthielt, bei 37°C zu einer optischen Dichte (600 nm) von 0,4 gezüchtet, und die Protein-Expression wurde durch Zugabe von Isopropyl-beta-D-thiogalaktosidase (IPTG) bis zu einer Endkonzentration von 1 mM induziert. E. coli-Zellen wurden nach 4 Stunden durch 10-minütiges Zentrifugieren bei 3500 U/min bei 4°C geerntet. Die Reinigung wurde mit dem Qiagen-Protokoll unter Verwendung von Qiagen Ni-NTA und Säulen durchgeführt. Das Zell-Pellet wurde unter denaturierenden Bedingungen in 5 ml 6 M Guanidinium-Hydro-chlorid 1 Stunde lang resuspendiert. Nach dem Zentrifugieren (20 min, 10000 x g) wurde der Überstand mit 1 ml Ni-NTA eine zusätzliche Stunde lang inkubiert. Die Suspension wurde dann auf eine Säule geladen, zweimal mit 5 ml Waschpuffer (8 M Harnstoff, pH 6,3) gewaschen und danach mit 4 ml Elutionspuffer (8 M Harnstoff, pH 3,5) eluiert. Renaturierung wurde nach Dialyse mit abnehmender Molarität von Harnstoff erreicht.

Die Reinheit und Größe des gereinigten Proteins wurden mittels SDS-PAGE, wie in Fig. 2 gezeigt, analysiert. Die Protein-Banden korrelierten mit der berechneten Protein-Größe von 33,6 kD. Die Integrität der Proteine wurde ebenfalls mittels Western Blot-Analyse unter Verwendung von Anti-Histidin-Tag-An-tikörper bestätigt.

Beispiel 4: Detektion von 14VPl-spezifischen Kaninchen-Antikörpern mittels Immunoblotten 5 pg 14VP1 (VPl-Protein vom humanen Rhinovirus-Stamm 14) und Kontrollen (Bet v 1, Phi p 5, BSA) wurden auf Nitrozellulose-Membranstreifen punktweise aufgetragen („dotted"). Diese Streifen wurden einer Verdünnung von Kaninchen-anti-14VPl-Antiserum (Bahnen 1-6) und Präimmunserum (Bahnen 8-12) ausgesetzt. Gebundene Kaninchen-IgG-Antikörper wurden mit mit 1251 markiertem Esel-anti-Kaninchen-IgG 1:1000 nachgewiesen und mittels Autora-_ \ NAOHGEREIOHT \ • ·

• · • ·· • · · • ···· • · • · • · · • · • · • ' · ···· 60 diographie sichtbar gemacht (Fig. 3) .

Die Dot-Blot-Analyse von Kaninchen-anti-14VPl-Serum zeigt, dass 14VP1 stark immunogen ist. IgG-Antikörper wurden mit einer 1:16000-Verdünnung des Antiserums im Gegensatz zum Präimmunserum und den Bet v 1, Phi p 5 und BSA-Kontrollen noch immer nachgewiesen.

Beispiel 5: 89VPl-spezifische Antikörper-Antwort bei immunisierten Mäusen, mittels ELISA bestimmt

Zur Bestimmung der Immunogenität von 89VP1 und seiner Fähigkeit, als Träger für Peptid 5 zu fungieren, wurden Gruppen von sechs Wochen alten weiblichen Balb/c-Mäusen (Charles River) mit den folgenden Antigenen immunisiert: KLH, mit KLH-Maleimid gekoppeltes Peptid 5 (KLHP5) und mit KLH-EDC-gekoppeltes Peptid 5 (KLHP5edc). Die chemische Kopplung erfolgte mit dem Imject-Ma-leimid-aktivierten mcKLH und Imject Immunogen EDC Kit (Pierce) . Die Maleimid-Gruppe reagiert mit SH-Gruppen, und EDC reagiert mit Carboxyl- und Aminogruppen, um stabile Bindungen zu bilden. Gruppen von 4 Mäusen wurden mit 89VP1, r89P5 und 89P5edc immunisiert, und 2 Mäuse wurden nur mit Peptid 5 immunisiert (jeweils 5 pg und 1:2 mit Aluminiumhydroxid gemischt). Die Mäuse wurden subkutan in etwa dreiwöchigen Intervallen immunisiert und aus den Schwanzvenen wurde Blut entnommen. Die 89VPl-spezifische IgGl-Antikörper-Menge wurde mittels ELISA bestimmt. ELISA-Platten (Nunc) wurden mit 5 pg/ml 89VP1 beschichtet. Die Maus-anti-89VPl-, anti-r89P5- und Pepid 5-Seren wurden 1:500 verdünnt. Gebundenes IgGl wurde mit Ratten-anti-Maus-IgGl (BD Pharmingen) 1:1000 und danach mit Ziegen-POX-gekoppeltem anti-Ratten-IgG (Amersham Bioscience) 1:2000 nachgewiesen. Der optische Wert (OD 405 nm) ist auf der y-Achse gezeigt und entspricht der Menge des IgGl-Antikörpers in den Maus-Seren (Fig. 4). KLHP5, KLHP5edc, KLH und Peptid 5 wurden als Kontrollen verwendet. IgGl-Antikörper wurden mit zunehmendem Titer während der Immunisierung bei Mäusen, welchen 89VP1 (89VP1, 89P5edc und r89P5) injiziert worden war, nachgewiesen. Mit 89VP1, r89P5 und KLHP5 immunisierte Kaninchen zeigen dieselben Ergebnisse.

Beispiel 6: rPhl pl-spezifische Antikörper-Antwort bei immunisierten Mäusen, mittels ELISA bestimmt

Um zu evaluieren, ob eine Immunisierung mit r89P5 IgG-Anti-körper induziert, die mit vollständigem Phi p 1 reagieren, wurden dieselbe Methode und dieselben Maus-Seren verwendet, wie in

NACHGEREICHT

Beispiel 5 beschrieben. ELISA-Platten wurden mit 5 pg/ml rPhl p 1 beschichtet, und der IgGl-Antikörper-Titer wurde bestimmt (Fig. 5) .

Alle von Phi p 1 stammenden Peptide, entweder mit KLH oder mit 89VP1 gekoppelt, induzierten rPhl p 1-spezifische IgGl-Anti-körper, wobei die Reaktionen während der Immunisierungen Zunahmen. Mit r89P5 und KLHP5 immunisierte Kaninchen zeigen dieselben Ergebnisse.

Beispiel 7: ELISÄ-Detektion von Wiesenlieschgras-Pollen-Ex-trakt-spezifischen laGl-Antikörpern

Die Immunisierung von Mäusen und die ELISA-Analyse wurden durchgeführt, wie in Abschnitt 5 beschrieben. Gesamter Wiesen-lieschgras-Pollen-Extrakt wurde auf ELISA-Platten beschichtet (100 pg/ml), und der IgGl-Antikörper-Titer wurde bestimmt (Fig. 6) .

Nach drei Immunisierungen konnten Extrakt-spezifische IgGl-Antikörper bei mit Peptid 5 immunisierten Mäusen nachgewiesen werden.

Beispiel 8: Kaninchen-anti-r89P5-Antikörper blockieren Pa-tienten-IgE-Bindung an rPhi p 1

Zur Bestimmung der Fähigkeit von Peptid-induziertem Kanin-chen-Ig, die Bindung von IgE-Antikörpern von allergischen Patienten an rPhl p 1 zu inhibieren, wurden ELISA-Platten mit 1 pg/ml rPhl p 1 beschichtet, gewaschen und blockiert. Die Platten wurden mit 1:100 verdünntem Kaninchen-anti-Peptid (89P5, KLHP5), einem Kaninchen anti-rPhl p 1 und, für Kontrollzwecke, mit den entsprechenden Präimmunseren vorinkubiert. Nach dem Waschen wurden die Platten mit Humanseren von gegen Phi p 1 allergischen Patienten (1:3 verdünnt) inkubiert, und gebundenes IgE wurde mit Maus-anti-Human-IgE (Pharmingen 1:1000) und danach mit Schaf-POX-gekoppeltem anti-Maus-IgG (Amersham Bioscience) 1:2000 nachgewiesen. Die Prozent Inhibition der IgE-Bindung, welche durch Vorinkubation mit den anti-Peptid-Antiseren erreicht wurde, wurde wie folgt berechnet: 100-ODi/ODP x 100. ODi und 0DP stellen die Extinktion nach Präinkubation mit dem Kaninchen-Immun- bzw. -Präimmunserum dar. Die Tabelle 2 zeigt die Kapazität von anti-Phl p 1 Peptid-Antikörpern, die Bindung des IgE von 19 allergischen Patienten an vollständiges rPhl p 1 zu inhibieren. Fig. 7 zeigt die mittlere Inhibition (in %) aller anti-rPhl p 1-, anti-r89P5- und anti-KLHP5-Immunseren.

NACHGEREICHT ·· » ·· ·· • · • · · · · * · ·· ······· · • · 9 · · 9999 999 · ·····# ·· • · 999 ·· 9 99 9999 - 62 -

Die Anti-Peptid-Seren blockierten die IgE-Bindung viel besser als rPhl p 1. Die Fähigkeit zur Inhibition ist bei 89P5 und KLH-P5 fast gleich. Tabelle 2 zeigt die Inhibition (in %) von allen 19 Patienten.

Tabelle 2: %Inhibition der Bindung des IgE von 19 Patienten an rPhl p 1 nach Inkubation mit Kaninchen-anti-rPhl pl-, r89P5-und anti-KLHP5-Antiseren. %Inhibition Patient rPhl p 1 x89P5 KLHP5 1 32,343 68,291 68,213 2 29,373 64,915 61,509 3 10,367 59,469 66,270 4 28,087 73,906 71,330 5 13,808 49,358 45,372 6 22,597 66,259 67,331 7 5,375 26,667 18,902 8 22,478 42,612 47,979 9 5,019 39,822 56,837 10 13,756 53,878 63,047 11 26,444 58,430 57,944 12 25,795 67,243 62,458 13 41,330 75,694 79,517 14 35,543 85,714 87,012 15 45,796 84,255 75,185 16 32,641 76,508 77,412 17 26,483 63,171 47,735 18 19,229 85,750 86, 642 19 31,142 62,428 71,086

Beispiel 9: T-Zell-Proliferation von Milzzellen der Maus nach Antigen-Stimulation

Gruppen von drei Mäusen wurden mit KLH, KLHP5 und KLHP5edc immunisiert. Gruppen von 4 Mäusen wurden vier Mal mit 89VP1, r89P5 und 89P5edc immunisiert, und 2 Mäuse wurden nur mit Peptid 5 immunisiert (je 5 μg). Milzzellen wurden 10 Tage nach der letzten Immunisierung entnommen, und einzelne Zellkulturen wurden im Triplikat in Platten mit 96 Vertiefungen mit Peptid 5 (P5), 89VP1, KLH, Con A und einem Medium als positive bzw. nega-

NACHGEREICHT - 63 - • · »· ··· · » · · ft · · ···φ tive Kontrolle stimuliert. Nach 4 Tagen wurde in jede Vertiefung radioaktives [3H]Thymidin 0,5 pCi zugegeben. Die Zellen wurden dann mit einem Packard Cell Harvester auf Unifilter-Platten nach 15 Stunden geerntet. Die den Zellen zugehörige Radioaktivität wurde mit einem Beta-Zähler gemessen. Die Stimulations-Indices wurden berechnet und sind auf der y-Achse gezeigt. Das Antigen, welches für die Stimulation verwendet wurde, ist auf der x-Achse gezeigt. Jede Box stellt die Daten des Antigens dar, welches für die Immunisierung der Mäuse verwendet wurde (Fig. 8). Alle Werte über zwei zählen als positiv. Die mit KLH und KLHP5 immunisierten Mäuse waren nur positiv, wenn sie mit KLH stimuliert wurden, und die Peptid 5-Mäuse waren vollständig negativ. Die KLHP5edc-Gruppe ist ebenfalls negativ, was mit den ELISA-Ergebnissen übereinstimmt. Zellen von mit r89P5, 89P5edc und 89VP1 immunisierten Mäusen vermehrten sich nur nach Stimulation mit 89VP1.

Die naive Kontroll-Maus zeigt in allen Fällen keine Proliferation. Diese Ergebnisse zeigen, dass T-Zell-Epitope vom Träger 89V-Pl, und nicht vom Peptid 5 vorgesehen werden.

Beispiel 10: Detektion von 14VP1-, 89VP1- und rPhl p 1-spezifischen Antikörpern in im Herbst und im Winter erhaltenen Humanseren mittels ELISA Fünf Humanseren von willkürlich gewählten Personen wurden im Herbst und fünf im Winter genommen. Die IgGl-, IgG2-, IgG4- und IgA-Antikörpermenge gegen 14VP1, 89VP1 und rPhl p 1 wurde mittels ELISA, wie in Beispiel 5 beschrieben, bestimmt. Humanes IgGl, IgG2, IgG4 und IgA wurden (BD Pharmingen) 1:1000 und mit Schaf-POX-gekoppeltem anti-Maus-IgG (Amersham Bioscience) 1:2000 nachgewiesen. Ein hoher anti-14VPl- und 89VPl-IgGl-Titer von Seren, die im Herbst und Winter genommen wurden, konnte nachgewiesen werden (Fig. 9). Der anti-rPhl p 1-IgGl-Antikörper-Titer war viel niedriger. IgG2-, IgG4- und IgA-Antikörper konnten in allen Fällen in sehr geringer Menge nachgewiesen werden. Die VPl-Pro-teine der verschiedenen HRV-Stämme sind nah verwandt, und in anderen Studien wurde eine Kreuz-Reaktivität gezeigt.

Beispiel 11: Anti-89VP1- und anti-rPhl p 1-Antikörper von gegen Phi p 1 allergischen Patienten

NACHGEREICHT

Seren von fünf gegen Phi p 1 allergischen Patienten wurden genommen, und ein ELISA-Versuch wurde wie in Beispiel 5 beschrieben durchgeführt. ELISA-Platten wurden mit rPhl p 1 und 89VP1 beschichtet, und die spezifischen IgM-, IgGly-IgS?-

IgG3-, IgG4-, IgA- und IgE-Antikörper-Titer wurden bestimmt (Fig. 10). Mehr anti-89VPl-IgGl-Antikörper als anti-rPhl p 1-IgGl-Antikörper konnten nachgewiesen werden.

Beispiel 12: Nachweis der anti-14VPl-Antikörper-Bindung an das ganze Virus mittels Western Blot-Änalvse

Die IgG-Antikörper-Bindung von Seren des mit 14VP1 injizierten Kaninchens an das ganze Virus wurde unter Verwendung des ganzen HRV14-Virus (Bahnen 2 und 5) und von 5 pg gereinigtem 14VP1 (Bahnen 3 und 6) als Kontrolle bestätigt. Der Virus-Extrakt wurde mittels 12% SDS-PAGE getrennt und auf eine Nitrocellulose-Membran geblottet. Kaninchen-anti-14VPl-Antiserum (Bahnen 1-3) 1:500 und Präimmunserum (Bahnen 4-6) 1:500 wurden auf Bindung an HRV14 und 14VP1 getestet. Gebundenes IgG wurde mit mit 1251 markiertem Esel-anti-Kaninchen-Antikörper nachgewiesen und mittels Autoradiographie sichtbar gemacht (Fig. 11).

Die Bindung von 14VPl-Antiserum konnte in derselben Größe (33,6 kD) wie 14VP1 nachgewiesen werden.

Beispiel 13: Änti-14VPl-Antikörper-Neutralisation von intaktem Human-Rhinovirus 14

Die Gewebskultur-Dosis 50 (TCD50) von HRV14 wurde bestimmt. Daher wurde eine Virus-Verdünnung von 1:102-1: 108 in MEM-Eagle 1% FCS und 40 mM MgCl2 vorgenommen und in Platten mit 24 Vertiefungen bei 34 °C in angefeuchteter 5% C02-Atmosphäre zusammen mit HeLa Ohio-Zellen drei Tage lang inkubiert. Eine Kontrolle ohne das Virus wurde ebenfalls aufgestrichen.

Die zytotoxische Wirkung des Virus wurde mit Kristallviolett nach drei Tagen sichtbar gemacht, und die TCD50 (die Verdünnung, bei welcher 50% der Zellen tot sind) wurde berechnet.

Serum-Verdünnungen und Virus (100TCD50) in Reihen A und B wurden bei 34°C inkubiert. Nach 2 Stunden waren Zellen in allen Vertiefungen ausgebreitet. D5 und D6 sind Serum-Kontrollen. Das VersuchsSchema ist in Fig. 12 gezeigt. Die Neutralisationswirkung der Antikörper wurde nach drei Tagen mit Kristallviolett nachgewiesen (Fig. 12) .

Beispiel 14: Charakteristika der synthetischen, von Phi p 5 stammenden Peptide

Peptide wurden unter Verwendung der Fmoc-Strategie mit HBTU-Aktivierung (0,1 mmol, Zyklen in kleinem Umfang) auf dem Applied Biosystems-Peptid-Synthesizer Modell 433A wie beschrieben synthetisiert (Focke et al. Faseb J (2001) 15-204?' Nach rtründli-

NACHGEREICHT

- 65 - eher Analyse des Phi p 5-Allergens wurden sechs von Phi p 5 abstammende Peptide mit einer Länge im Bereich von 31 (PI: 3026 Dalton) bis 38 (P6: 3853 Dalton) Aminosäuren, die reich an Lösungsmittel-exponierten Aminosäuren sind, hergestellt (Tabelle 3) .

Diese Peptide haben einen isoelektrischen Punkt zwischen 4,32 und 8,98, und drei davon (Peptid 3, 4 und 6) könnten humane T-Zell-Epitope enthalten.

Tabelle 3. Charakteristika von nicht-allergenen synthetischen, von Phi p 5 stammenden Peptiden. Position (in Bezug auf das Phi p 5-Molekül), Sequenz, Länge, Molekulargewicht (MW), isoelektrischer Punkt (pl) und Vorhandensein von T-Zell-Epitopen der von Phi p 5 stammenden Peptide sind dargestellt. Der Cy-stein-Rest, der zur Erleichterung der Kopplung zugesetzt ist, ist fett und unterstrichen markiert.

NACHGEREICHT

AS- Poai- tion Sequenz AS- Länge Mtf pi T-Zell-Epitop Pept. 1 98- CGAASNKAFAEGLSGEPK- 32 3026 8,16 - (SEQ ID 128 GAAESSSKAALTSK Nr. 9) Pept. 2 26-58 ADLGYGPATPAAPAAGYT- 34 3068 4,37 - (SEQ ID PAT PAAPAEAAPAGKC Nr. 10) Pept. 3 132- AYKLAYKTAEGATPEAKY- 32 3482 6,29 + (SEQ ID 162 DAYVATLSEALRIC Nr. 11) Pept. 4 217- CEAAFNDAIKASTGGAYE- 31 3236 4,87 + (SEQ ID 246 SYKFIPALEAAVK Nr. 12) Pept. 5 252- TVATAPEVKYTVFETALK- 33 3501 8, 98 - (SEQ ID 283 KAITAMSEAQKAAKC Nr. 13) Pept. 6 176- CAEEVKVIPAGEL- 38 3853 4,66 + (SEQ ID 212 QVIEKVDAAFKVAA- Nr. 14) TAANAAPANDK

Beispiel 15: von Phi p 5 stammenden Peptiden fehlt die IgE-Reaktivität und die alleraene Aktivität 15.1. Fehlen der IgE-Reaktivität

Um die IgE-Reaktivität der sechs von Phi p 5 stammenden Peptide zu analysieren, wurden isolierte sowie mit KLH gekoppelte, von Phi p 5 stammende Peptide mit vollständigem rPhl p 5 im Hinblick auf die IgE-Bindungskapazität mittels ELISA unter Verwendung der Seren von 29 gegen Graspollen allergischen Patienten verglichen (Tabelle 4).

Tabelle 4: Serologische Charakterisierung von 29 gegen Graspollen allergischen Patienten und einer nicht-allergenen Kontrolle. Gezeigt sind Geschlecht, Alter, Gesamtserum-IgE-Mengen (kü/1), Wiesenlieschgras-Extrakt-spezifisches IgE (kUA/1), IgE-Antikörper, die für rPhl p 5 spezifisch sind, und die 6 isolierten (P1-P6) und mit KLH gekoppelten (KLH-P1-KLH-P6) Peptide, die mittels ELISA gemessen wurden, und die ODs (optischen Dichten). Bindestriche zeigen das Fehlen der IgE-Reaktivität gegenüber den isolierten sowie den mit KLH gekoppelten Peptiden.

NACHGEREICHT ·· ·« ·· ·« • ♦ • · ······· · • · · · · t··· ··· · ····♦· · ♦ • · ··· ·· · ·· ·♦·· - 67 -

Patient Geschl. Alter Ges.- IgE IgE- Wiesen- IgE (OD) lieschgras (kU/L) kUA/L) rPhlp5 P1 P2 P3 P4 P5 P6 1 m 29 140,0 25,90 1,437 - - - - - - 2 m 39 76,2 10,50 0,456 - - - - - - 3 w 29 100,0 33,50 0,699 - - - - - - 4 w 31 261,0 28,10 0,930 - - - - - - 5 m 33 380,0 32,00 0,545 - - - - - - 6 w 31 278,0 37,00 1,720 - - - - - - 7 m 43 128,0 20,70 1,118 - - - - - - 8 w 29 200,0 18,40 0,489 - - - - - - 9 w 34 76,6 18,70 0,571 - - - - - - 10 m 35 144,0 39,30 0,157 - - - - - - 11 w 33 79,2 29,60 0,574 - - - - - - 12 w 30 30,3 10,70 0,350 - - - - - - 13 w 34 106,0 20,80 0,395 - - - - - - 14 w 52 448,0 43,00 1,320 - - - - - - 15 w 25 294,0 95,50 1,638 - - - - - - 16 m 30 471,0 82,60 0,752 - - - - - - 17 m 44 2000,0 100,00 2,500 - - - - - - 18 w 30 168,0 66,60 0,806 - - - - - - 19 m 42 512,0 50,30 1,175 - - - - - - 20 w 28 253,0 54,00 1,954 - - - - - - 21 m 30 315,0 100,00 1,054 - - - - - - 22 w 42 401,0 89,50 2,297 - - - - - - 23 w 28 100,0 82,10 1,802 - - - - - - 24 m 42 52,5 3,52 0,885 - - - - - - 25 m 34 136,0 6,11 2,036 - - - - - - 26 m 30 31,2 9,17 1,909 - - - - - - 27 m 36 24,9 4,34 0,233 - - - - - - 28 w 41 41,5 2,19 0,281 - - - - - - 29 w 51 370,0 90,10 1,296 - - - - - - NHS m 39 0,0 0,00 0,065 - - - - - - ELISA-Platten (Nunc Maxisorp, Dänemark) wurden mit von Phi p 5 stammenden Peptiden (5 pg/ml) oder mit rPhl p 5 als Kontrolle (5 pg/ml) beschichtet, gewaschen und blockiert. Danach wurden die Platten mit 1:3 verdünnten Seren von 29 gegen Graspollen allergischen Patienten und von einem nicht-atopischen Individuum über Nacht bei 4°C inkubiert. Gegen Graspollen allergische Patienten, die an einer allergischen Rhinokonjunktivitis und/oder Asthma leiden, wurden gemäß einer Krankengeschichte, die eine saisonbedingte Gras-Pollinose anzeigt und durch Haut-Pricktest mit Wiesenlieschgras-Pollen-Extrakt und serologische CAP-FEIA (Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Schweden)-Testung charakterisiert ist, ausgewählt. Die Gesamt-IgE-Mengen in den Seren wurden mittels CAP-Messungen (Pharmacia) bestimmt. IgE-Antikörper, die

NACHGEREICHT - 68 - ·· ·· • · · · · ♦ · • · · · · · · • · 0t·· ··· ♦ • · · · · ·· · ·· ···· für rPhl p 5 spezifisch sind, wurden mittels ELISA bestimmt. Seren von 29 gegen Graspollen allergischen Patienten und einem nicht-atopischen Individuum wurden für IgE-Kompetitions-Untersu-chungen verwendet. Die gegen Graspollen allergische Patienten-Gruppe bestand aus 13 Männern und 16 Frauen mit einem Durchschnittsalter von 35 Jahren (Bereich von 25-51 Jahre) (Tabelle 4) .

Gebundene IgE-Antikörper wurden mit einem 1:1000 verdünnten, mit alkalischer Phosphatase gekoppelten Maus-monoklonalen anti-Human-IgE-Antikörper (Pharmingen, CA) nachgewiesen.

Die IgE-Gesamtmengen und das Graspollen-Extrakt-spezifische IgE lagen im Bereich von 24,9-2000 kü/1 (Mittelwert: 262,7) bzw. 2,2-100 kUA/1 (Mittelwert: 41,5). Alle Patienten enthielten rPhl p 5-spezifische IgE-Antikörper im einem Bereich zwischen 0,157-2,530 OD-Einheiten (Mittelwert: 1,082 OD-Einheiten), aber keiner der 29 Patienten wies eine IgE-Reaktivität gegenüber irgendeinem der Peptide (P1-P6) oder gegenüber einer äquimolaren Mischung der Peptide auf (OD < 0,08). Dieses Ergebnis beweist, dass kein Serum nachweisbare IgE-Antikörper mit einer Spezifität für irgendeines der sechs von Phi p 5 stammenden Peptide enthielt. 15.2 Verringerte allergene Aktivität der Peptide, wie mittels CD 203 c-Expression an basophilen Zellen nachgewiesen: Aktivierung basophiler Zellen und Durchflusszytometrie:

Die Hinaufregulierung von CD 203 c wurde als Surrogat-Marker für eine Allergen-induzierte Aktivierung basophiler Zellen und Degranulation beschrieben (Hauswirth et al., J. Allergy Clin. Immunol. 2002; 110:102). Daher wurde die allergene Aktivität des vollständigen rPhl p 5-Allergens und einer äquimolaren Mischung von Peptiden durch Messung der CD 203 c-Hinaufregulierung an basophilen Zellen von gegen Graspollen allergischen Patienten verglichen.

Periphere Blutzellen wurden von 3 allergischen Spendern erhalten, nachdem eine Einverständniserklärung abgegeben worden war. Heparinisierte Blut-Aliquots (100 μΐ) wurden mit seriellen Verdünnungen rekombinanter Allergene (10'4 bis 10 pg/ml), anti-IgE-Antikörper (1 pg/ml) oder Kontroll-Puffer (Phosphat-gepuf-ferte Kochsalzlösung, „phosphate-buffered saline" = PBS) 15 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen in PBS, das 20 mM EDTA enthielt, gewaschen. Die Zellen wurden dann mit 10 μΐ von mit PE konjugiertem CD203c mAb 97A6 15

NACHGEREICHT 69 ·· # · ··· ·· »· · • ♦ ♦ ♦ · · ♦ • · ···♦

Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Danach wurden Erythrozyten mit 2 ml FACS™ Lysing Solution lysiert. Die Zellen wurden dann gewaschen, in PBS resuspendiert und mittels Zweifar-ben-Durchflusszytometrie auf einem FACScan (Becton Dickinson) unter Verwendung von Paint-a-Gate Software analysiert. Die All-ergen-induzierte Hinaufregulierung von CD203c wurde aus den mittleren Fluoreszenz-Intensitäten (MFIs) berechnet, die mit stimulierten (MFIstim) und unstimulierten (MFIcontrol) Zellen erhalten wurden, und als Stimulations-Index ausgedrückt (MFIstim : MFIcontrol). Ein SI von >2,0 (> 2-fache Hinaufregulierung) wurde als eine spezifische Antwort anzeigend angesehen.

Wie in Fig. 14 gezeigt, wurde festgestellt, dass vollständiges rPhl p 5 eine Dosis-abhängige (IO-4 bis 10 pg/ml) Steigerung der Expression von CD203c an basophilen Zellen von peripherem Blut bei einem sensibilisierten Individuum zeigt, wogegen eine äquimolare Mischung der Peptide keine Wirkung zeigt.

Die Bestimmung der CD 203c-Expression an basophilen Zellen von gegen Graspollen allergischen Patienten zeigt, dass keine allergische Aktivität bei den von Phi p 5 stammenden Peptiden beobachtet werden kann.

Beispiel 16: Die Immunisierung mit von Phi p 5 stammenden Peptiden induziert IaG-Antikörper, die mit rPhl p 5 und mit natürlichen Allergenen aus verschiedenen Gras-Spezies reaktiv sind 16.1. Rekombinante Allergene und Allergen-Extrakte

Gereinigtes rekombinantes Phi p 5 wurde in E. coli wie beschrieben exprimiert (Vrtala et al., J. of Immunol. (1993) 151:4773-4781).

Graspollen von Phleum pratense, Lolium perenne, Poa pratensis, Dactylis glomerata, Secale cereale, Triticum aestivum, Ave-na sativa, Hordeum vulgare, Anthoxanthum odoratum wurden von Allergon Pharmacia (Schweden) erhalten, und ein wässeriger Pollen-Extrakt wurde wie beschrieben hergestellt (Vrtala et al.,

Int. Arch. Allergy Immunol. (1993) 102: 160-9). 16.2 Immunisierung von Kaninchen HPLC-gereinigte Peptide wurden mit KLH (Schlüsselloch-Napf-schnecken-Haemocyanin, MW 4,5x 103 - l,2xl07, Pierce, USA) gemäß dem Rat der Hersteller gekoppelt und unter Verwendung eines Con-jugation Kit (Sigma, USA) gereinigt.

Kaninchen wurden mit jedem der mit KLH konjugierten Peptide (200 pg/Injektion) und - für Kontrollzwecke - mit vollständigem

NACHGEREICHT ·· · ·♦ ♦ ·· ·· • · ·· φ · # · · · · ♦ · ·»····· · • · φ φ · φφφφ φφφ · φ φ φ φ φ φ φ φ φφ φφφ ·· · φφ φφφφ - 70 - rPhl ρ 5 unter Verwendung von Freundschem vollständigem und unvollständigem Adjuvans immunisiert (Charles River). Serum-Proben wurden in vierwöchigen Intervallen erhalten. 16.3. Reaktivität von Kaninchen-Antikörpern mit vollständigem rPhl p 5 und mit natürlichen Allergenen aus verschiedenen Gras-Spezies

Um zu untersuchen, ob Antikörper, die nach Immunisierung mit mit KLH gekoppelten Peptiden induziert wurden, rPhl p 5, natürliches Phi p 5 und Phi p 5-verwandte Graspollen-Allergene von anderen Graspollen-Spezies erkennen, wurden ELISA-Versuche durchgeführt. Für den ELISA-Nachweis wurden Platten (Nunc Ma-xisorp, Dänemark) mit Pollen-Allergen-Extrakten (100 pg/ml:

Phleum pratense, Lolium perenne, Poa pratensis, Dactylis glome-rata, Secale cereale, Triticum aestivum, Avena sativa, Hordeum vulgare, Anthoxanthum odoratum) oder mit gereinigtem rekombinan-tem Allergen (5 pg/ml: rPhl p 5) beschichtet. Die ELISA-Platten wurden gewaschen und blockiert und danach mit Kaninchen-anti-Peptid-Antiseren und entsprechenden Präimmunseren, verdünnt 1:2500, inkubiert. Gebundenes Kaninchen-IgG wurde mit einem HRP-gekoppelten Ziegen-anti-Kaninchen-Ig-Antiserum (Jackson Immunresearch, Pennsylvania) nachgewiesen. Die Ergebnisse stellen die Mittelwerte von Duplikat-Bestimmungen mit einem Fehler von <5% dar (Fig. 13, Tabelle 5).

Tabelle 5: Kreuzreaktivität von anti-Phl p 5-Peptid-Antise-ren mit rPhl p 5 und mit natürlichen Gruppe 5-Allergenen von Phleum pratense, Lolium perenne, Poa pratensis, Dactylis glome-rata, Secale cereale, Triticum aestivum, Avena sativa, Hordeum vulgare, Anthoxanthum odoratum. Die IgG-Reaktivitäten (OD-Werte) von Peptid-Antiseren (anti-Pl bis anti-P6) gegen Phi p 5 und Pollen-Extrakte von Graspollen sind für 6 Kaninchen, die mit mit KLH konjugierten, von Phi p 5 stammenden Peptiden immunisiert wurden, gezeigt (P1-P6).

NACHGEREICHT - 71 - - 71 - ·· ·· · ·· · ·· • · «· · · · · · · · • · ······ + · • · · · · ···· ♦·· · ······ · · • ι ··· ·· · ·· ····

Kreuzreaktivität von Anti-Peptid-Antiseren mit rPhi p 5 und Graspollen-Extrakten anti-P1 anti-P2 anti-P3 anti-P4 anti-P5 anti-P6 rPhl p 5a 1,115 2,418 1,336 1,600 1,540 2,142 Phleum pratense 0,227 1,155 0,955 0,703 1,138 1,000 Lolium perenne 0,056 1,320 0,834 0,238 0,163 2,500 Poa pratensis 0,070 1,491 1,045 1,880 2,200 2,500 Dactylis glomerata 0,060 0,390 0,728 0,689 0,154 0,657 Secale cereale 0,090 0,292 0,777 0,676 0,162 0,843 Triticum aestivum 0,116 1,076 0,734 0,404 0,570 0,703 Avena sativa 0,150 0,790 1,029 0,551 0,224 1,494 Anthoxanthum 0,114 1,209 1,531 0,827 1,114 1,115 Hordeum vulgare 0,080 1,972 1,150 1,184 0,602 1,513 16.4. Immunisierung mit von Phi p 5 stammenden Peptiden induziert kreuzreaktive IgG-Antikörper

Die Immunisierung mit jedem der Peptide induzierte eine robuste für Phi p 5 spezifische IgG-Antwort, die vier Wochen nach der ersten Immunisierung nachweisbar wurde und nach der zweiten Immunisierung zunahm (Fig. 13) . Die Immunisierung mit Peptid 2 induzierte die höchste für Phi p 5 spezifische IgG-Antwort, gefolgt von den Peptiden 6, 4, 5 und 1, welches die geringste Antwort induzierte. Mit Ausnahme der Anti-Peptid 1-Antikörper, welchen eine Reaktivität mit den Gruppe 5-Allergenen in Lolium perenne, Poa pratensis, Dactylis glomerata, Secale cereale und Hordeum vulgare fehlte, wiesen die anderen Peptid-Antiseren eine Kreuzreaktivität mit jedem der getesteten Gras-Pollen-Extrakte auf (Tabelle 5).

Beispiel 17: Immunisierung mit von Phi p 5 stammenden Peptiden induziert IgG-Antikörper, die die Bindung des IaE von gegen Gras-Pollen allergischen Patienten an Phi p 5 inhibieren

17.1. Inhibition der IgE-Bindung der allergischen Patienten an rPhl p 5a durch Peptid-spezifisches IgG

Informationen betreffend die Kapazität der Peptide, blockierende Antikörper zu induzieren, sind wichtig, da es sich zeigte, dass blockierende Antikörper eine große Rolle bei der Immuntherapie spielen.

Zur Untersuchung der Fähigkeit von Peptid-induziertem Kanin-chen-Ig, die Bindung des IgE von allergischen Patienten an voll-

NACHGEREICHT 72 72

• · • · · ··· ·· • · • · · • ···· ·· • · · ··· · • · ·· ···· ständiges rPhl p 5 zu inhibieren, wurden ELISA Kompetitions-Ver-suche unter Verwendung von Seren von 29 gegen Gras allergischer Patienten durchgeführt.

Die ELISA-Platten wurden mit rPhl p5 (1 pg/ml) beschichtet und entweder mit einer 1:250-Verdünnung von jedem der anti-Pep-tid-Antiseren (anti-Pl-anti-Pg), einer Mischung der Anti-Peptid-Antiseren, einem anti-rPhl p 5-Antiserum oder - für Kontrollzwe-cke - mit den entsprechenden Präimmunseren oder einer Mischung der Präimmunseren vorinkubiert. Nach dem Waschen wurden die Platten mit 1:3 verdünnten Seren von 29 gegen Gras-Pollen allergischen Patienten inkubiert, und gebundene IgE-Antikörper wurden mit dem mit alkalischer Phosphatase gekoppelten Maus-monoklonalen anti-Human-IgE-Antikörper (Pharmingen) nachgewiesen. Die durch Vorinkubation mit den anti-Peptid-Antiseren erreichten Prozent Inhibition der IgE-Bindung wurde wie folgt berechnet: %Inhibition der IgE-Bindung = lOO-ODj/ODpxlOO. ODi und 0DP stellen die Extinktion nach Vorinkubation mit dem Immun- bzw. Präimmunserum des Kaninchens dar. Die Vorinkubation von Phi p 5 mit Pep-tid-induziertem Kaninchen-IgG inhibierte die IgE-Reaktivität allergischer Patienten in unterschiedlichem Ausmaß. Der durchschnittliche Grad der Inhibition der IgE-Bindung war im Bereich von 19,3% für anti-Peptid 6 IgG bis zu 28,5% bei anti-Peptid 1-IgG. Kaninchen-Antikörper, die gegen vollständiges Phi p 5 gezogen worden waren, induzierten eine mittlere Inhibition der IgE-Bindung von 43,6%.

Tabelle 6: Kaninchen-anti-Phl p 5-Peptid-Antiseren inhibieren die Serum-IgE-Bindung von gegen Wiesenlieschgras-Pollen allergischen Patienten an Phi p 5. Die Prozent Hemmung der IgE-Bindung an Phi p 5 sind für jeden Patienten nach Vorinkubation von Phi p 5 mit Anti-Peptid-Antiseren (anti-Pl - anti-P6), mit einer Mischung der sechs Anti-Peptid-Antiseren (anti-Pl-P6) oder mit einem anti-rPhl p 5-Antiserum angezeigt. Der Mittelwert der Prozent Hemmung ist in der unteren Zeile angezeigt. N.d.: nicht durchgeführt.

NACHGEREICHT ·· · ·· · ·· ·· • •••••· ···· • · ······· φ φ · · · ···· ··· φ ······ · · φφ φφφ φφ φ φφ φφφφ - 73 - % Inhibition der IgE-Bindung an Phi p 5 mit Antiseren spezifisch für

Patient P1 P2 P3 P4 P5 P6 P1-P6 PNp 5 1 0 5 4 0 0 0 0 nd 2 1 10 4 0 0 0 0 nd 3 28 35 28 39 37 38 46 50 4 33 40 33 42 35 45 54 20 5 0 0 3 8 8 0 9 nd 6 46 34 39 47 47 34 21 56 7 41 48 46 49 50 45 49 60 8 41 8 34 18 39 0 0 8 9 6 0 0 0 0 0 0 nd 10 34 46 30 35 39 42 48 38 11 28 0 32 0 28 9 0 nd 12 33 0 27 4 33 0 0 nd 13 30 31 29 0 29 11 15 0 14 46 14 49 17 47 2 8 15 15 48 44 55 22 46 25 23 72 16 41 0 44 24 41 19 8 28 17 52 71 50 57 49 59 73 82 18 43 17 42 0 32 0 10 0 19 5 17 19 16 7 0 4 nd 20 42 54 43 38 38 41 48 65 21 39 51 46 43 43 43 40 39 22 44 49 44 46 44 40 50 70 23 38 54 40 42 48 40 50 66 24 23 0 15 0 0 0 0 nd 25 0 35 0 8 4 28 43 nd 26 51 26 31 21 24 0 19 nd 27 14 15 3 0 9 11 25 nd 28 9 0 17 0 9 0 0 nd 29 10 44 11 31 21 28 24 73 Mittel 28,5 25,8 28,2 20,9 27,8 19,3 23,0 43,6

Beispiel 18: Von Phi p 5 stammende Peptide induzieren geringe spezifische lymphoproliferative Antworten 18.1. Lymphoproliferations-Tests

Um Peptide mit der niedrigst möglichen T-Zell-Reaktivität zu identifizieren, um die Therapie-bezogenen Nebenwirkungen auf ein Minimum zu reduzieren, wurde die T-Zell-Reaktivität mittels Lym-phoproliferations-Tests untersucht. Periphere mononukleäre Zellen des Blutes („peripheral blood mononuclear cells", PBMC) wurden von zwei gegen Graspollen allergischen Patienten mittels Ficoll(Amersham Pharmacia Biotech, UK)-Dichtegradienten-Zentri-fugation isoliert. PBMC (2xl05) wurden in Triplikaten in Platten mit 96 Vertiefungen (Nunclone; Nalge Nunc International, Dänemark) in 200 μΐ Serum-freiem Ultra Culture-Medium (Biowhittaker,

NACHGEREICHT ·· · ·· • · · · · · · ···#·# · • ···♦ ♦·· · • · · · · • ·· · ·♦ ···♦ ·· • # · • · • · ♦ « ·· · - 74 -

Rockland, ME), ergänzt mit 2 mM L-Glutamin (SIGMA, USA), 50 μΜ beta-Mercaptoethanol (SIGMA) und 0,1 mg Gentamicin pro ml (SIGMA) bei 37 °C und 5% C02 in einer angefeuchteten Atmosphäre gezüchtet. Die Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen synthetischer Peptide (1,25, 0,6 und 0,3 pg pro Vertiefung) und, zum Vergleich, mit 4 E Interleukin-2 pro Vertiefung (Boehringer Mannheim, Deutschland) und mit Medium alleine stimuliert. Nach 6 Tage Züchten wurden 0,5 pCi [3H]Thymidin (Amersham Pharmacia Biotech) pro Vertiefung zugegeben, und 16 h danach wurde die inkorporierte Radioaktivität mittels Flüssigkeitsszintillations-zählung unter Verwendung eines Mikrobeta-Szintillationszählers (Wallac ADL, Deutschland) gemessen. Die mittleren cpm wurden aus den Triplikaten berechnet, und die Stimulationsindices (SI) wurden als Quotient der cpm, erhalten durch Antigen- oder Interleukins-Stimulation und der nicht-stimulierten Kontrolle berechnet. PBMCs aus gegen gegen Wiesenlieschgras-Pollen allergischen Patienten wurden mit verschiedenen Konzentrationen der synthetischen Peptide stimuliert. Die Stimulations-Indices mit Peptiden waren signifikant niedriger als bei IL2. Von Phi p 5 stammende Peptide induzierten geringe spezifische lymphoproliferative Antworten. Die geringste Antwort fand man beim Peptid 5, gefolgt vom Peptid 4.

Beispiel 19: Charakteristika von von Fel d 1 stammenden synthetischen Peptiden

Um Peptide zu erhalten, die für eine Katzen-Allergie-Impfung geeignet sind, wurden fünf Peptide, die 30 bis 36 Aminosäuren lang waren und das gesamte Molekül abdecken, gemäß der bekannten Aminosäuresequenz von Fel d 1 entworfen.

Die Peptide wurden unter Verwendung einer Fmoc (9-Fluorenyl-methoxycarbonyl)-Strategie mit HBTU (2-(lH-Benzotriazol-l-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-hexafluorphosphat)-Aktivierung (0,1 mmol Zyklen in kleinem Maßstab) auf dem Applied Biosystems-Peptid-Synthesizer Modell 433A (USA) synthetisiert. Vorher aufgeladenes PEG-PS (Polyethylenglykol-Polystyrol)-Harze (0,15-0,2 irunol/g Beladung) (PerSeptive Biosystems, UK) wurden als feste Phase zum Aufbau der Peptide verwendet. Die Chemikalien wurden von Applied Biosystems käuflich erworben. Die Kopplung der Aminosäuren wurde mittels Leitfähigkeitsüberwachung in einem Feedback-Steuersystem bestätigt. Ein Cystein-Rest wurde zu den

IMACHGEREICHT 75

Peptiden 1, 3, 4 und 5 zugegeben, um die Kopplung an Träger zu erleichtern (Tabelle 7). Die Peptide wurden von den Harzen mit einer Mischung aus 250 μΐ destilliertem Wasser, 250 μΐ Triiso-propylsilan (Fluka, Schweiz), 9,5 ml TFA 2 h lang gespalten und in tert.-Butylmethylether (Fluka, Schweiz) ausgefällt (Focke 2001). Die Identität der Peptide wurde mittels Massen-Spektrome-trie überprüft, und die Peptide wurden auf >90% Reinheit mittels präparativer HPLC (PiChem, Österreich) gereinigt.

Tabelle 7: Molekulare Charakteristika von von Fel d 1 stammenden synthetischen Peptiden. Die Position innerhalb des nativen Fel d 1-Moleküls, die Aminosäuresequenz, die Anzahl der Aminosäuren, das berechnete Molekulargewicht (MW) und der theoretische isoelektrische Punkt (pl) der von Fel d 1 stammenden synthetischen Peptide sind gezeigt. Alle Peptide sind in Wasser löslich.

Position Aminosäuresequenz AS-Länge HW pi Pept. 1 SEQ Kette 1, EICPAVKRDVDLFLTGTPDEY- 35 3911 4,30 ID Nr. 15 AS 1-34 VEQVAQYKALPVVC Pept. 2 SEQ Kette 1, IiENARILKNCVDAKMTEED- 36 4083 4,72 ID Nr. 16 AS 35-70 KENALSLLDKIYTSPLC Pept. 3 SEQ Kette 2, VKMAITCPIFYDVFFAVANG- 35 3835 4,56 ID Nr. 17 AS 1-34 NELLLDLSLTKVNAC Pept. 4 SEQ Kette 2, TE PERTAMKKIQDCYVENGLIS- 30 3382 4,93 ID Nr. 18 AS 35-63 RVLDGLVC Pept. 5 SEQ Kette 2, CMTTISSSKDCMGEAVQNT- 30 3246 4,78 ID Nr. 19 AS 64-92 VEDLKLNTLGR

Die fünf von Fel d 1 stammenden synthetischen Peptide haben ein Molekulargewicht im Bereich von 3246 bis 4083 Dalton und haben einen berechneten isoelektrischen Punkt von 4,30 bis 4,93. Alle fünf Peptide sind wasserlöslich und die Peptide 1, 2 und 3 können humane T-Zell-Epitope enthalten (Tabelle 7).

NACHGEREICHT - 76 - 99 • · 9 99 99 9 9 9 99 9 9 9 9 9 9 9 • 9 9 · 9 9 9 9 9 9 • · 9 · 9 999· 999 9 • 9 9 9 9 9 9 9 99 999 99 9 99 9999

Tabelle 8. Verringerte IgE-Reaktivität von von Fel d 1 stam-menden synthetischen Peptiden im Vergleich zu rFel d 1_

Patient Ge schlecht Al ter Gesamt- IgE (kU/1) Katzan-hautschup-pen-spezifisches IgE (MIA/1) rFel d 1 (O.D.) Peptid 1 (O.D.) Peptid 2 (O.D.) Peptid 3 (O.D.) Peptid 4 (O.D.) Peptid 5 (O.D.) 1 w 36 >2000 48,2 2,314 0,112 - - - 0,056 2 m 27 798 62,2 2,255 0,069 0,123 - - 0,140 3 m 33 153 9,48 1,394 - - - - - 4 m 25 122 13,2 1,194 1,998 0,113 0,186 - 0,073 5 w 42 267 42,1 1,793 0,074 - - - 0,677 6 w 35 494 37,0 2,007 - - - - 0,204 7 m 27 129 31,3 2,259 - - - - 0,149 8 m 36 1150 13,5 1,384 - - - - 0,130 9 w 32 580 17,3 0,569 - - - - - 10 w 22 189 4,65 0,553 0,051 - - - 0,057 11 w 53 >2000 >100 2,838 0,504 - - - 0,644 12 w 75 4567 47,3 2,519 - 0,060 - - 0,161 13 m 34 >2000 40,0 1,244 - - - - - 14 m n.d. n.d. 1,99 0,178 - - - - - NH 3 w 27 <2 <0,35 - - - - - -

Beispiel 20: Von Fel d 1 stammende synthetische Peptide weisen eine verringerte IgE-Reaktivität im Vergleich zu rFel d 1 auf, und von Fel d 1 stammenden synthetischen Peptiden fehlt eine allergene Aktivität

Die Serum-IgE-Reaktivität gegen die von Fel d 1-stammenden synthetischen Peptide wurde untersucht, um hypoallergene Peptide zu identifizieren, die für eine Impfung geeignet sind.

Die Diagnose der von IgE vermittelten Katzen-Allergie basierte auf einer Anamnese, einem Haut-Prick-Test (Allergopharma, Reinbek, Deutschland) und einer Messung des gesamten Serum-IgE sowie von Katzen-Hautschuppen-spezifischem Serum-IgE (CAP-FEIA, Pharmacia Diagnostics, Schweden). Nichtallergische Personen wurden zu Kontrollzwecken inkludiert. ·· t f· · *♦ ·· ······· ···· ·· #······ m • · ♦ * Ψ ··♦- ··· · «··*·· · ♦ ·· ··· ft · ·· ···· - 77 - 20.1. IgE-Bindungskapazität, in ELISA-Tests gemessen

Die IgE-Bindungskapazität der fünf von Fel d 1 stammenden synthetischen Peptide wurde mit jener des vollständigen rFel d 1 Allergens unter Verwendung von Seren von 14 gegen Katzen allergischen Patienten verglichen. ELISA-Platten (Nunc Maxisorb, Dänemark) wurden mit von Fel d 1 stammenden synthetischen Peptiden oder rFel d 1 als Kontrolle beschichtet (0,5 pg/Vertiefung), gewaschen und blockiert. Die Platten wurden dann über Nacht bei 4°C mit 1:5 verdünnten Seren von gegen Katzen allergischen Patienten und von einem nicht-atopischen Individuum inkubiert. Gebundene IgE-Antikörper wurden mit einem 1:2500 verdünnten, mit Horseradish-Peroxidase markierten anti-Human-IgE-Antikörper (KPL, USA) nachgewiesen.

Seren von 7 weiblichen und 7 männlichen, gegen Katzen allergischen Patienten im Alter von 22 bis 75 Jahren wurden CAP-FEIA-BeStimmungen unterzogen. Die gemessenen Gesamt-IgE-Mengen lagen im Bereich von 122 bis >4000 kU/1 und die für Katzen-Hautschuppen spezifischen IgE-Mengen von 1,99 bis >100 kUA/1 (Tabelle 7). In ELISA-Tests wurde die IgE-Reaktivität aller 14 getesteten Seren für das Hauptallergen der Katze, Fel d 1, bestätigt. Die Ergebnisse wurden als optische Dichten (OD) erhalten und lagen im Bereich von 0,178 bis 2,838 OD Einheiten. Die IgE-Reaktivität der 14 Seren gegenüber von Fel d 1 stammenden synthetischen Peptiden wurde im selben ELISA-Test gemessen. Es wurde festgestellt, dass die IgE-Bindung für die Peptide 1, 2, 3 und 5 beibehalten wurde. Eine IgE-Bindung wurde für 6/14 Seren gegen Peptid 1 für 3/14 Seren gegen Peptid 2, für 1/14 Seren gegen Peptid 3 und für 10/14 Seren gegen Peptid 5 beobachtet. Die gemessenen OD-Einheiten waren zwischen 0,051 und 1,998 für Peptid 1, zwischen 0,060 und 0,123 für Peptid 2, 0,186 für Peptid 3 und zwischen 0,056 und 0,677 für Peptid 5. Insgesamt waren alle gemessenen OD-Einheiten beträchtlich geringer als die jeweiligen für das ganze Fel d 1-Allergen gemessenen Werte.

Dies zeigt, dass von Fel d 1 stammende synthetische Peptide eine verringerte IgE-Reaktivität im Vergleich zum ganzen Fel d 1-Allergen haben. Die von Fel d 1 stammenden synthetischen Peptide können daher als hypoallergen angesehen werden, wobei sie den Vorteil verringerter IgE-vermittelter Nebenwirkungen vorsehen, wenn sie in SIT verwendet werden. 20.2 Spezifische Induktion der Expression der Oberflächen-

NACHGEREICHT • · • · · · · · ·

• •••·· · • · ···· ··· · • · · · · ··· ·· · «· ···· - 78 -

Marker CD203c und CD63 an humanen basophilen Zellen (Fig. 17)

Da die IgE-Bindung eine Voraussetzung, aber nicht ausreichend für die Induktion der allergischen Reaktionen vom Typ 1 ist, die auch eine Vernetzung von an Effektor-Zellen gebundenem spezifischen IgE erfordern, wurde die tatsächliche allergene Aktivität von von Fel d 1 stammenden synthetischen Peptiden in basophile Zellen-Aktivierungs-Tests untersucht. Diese Tests weisen eine Allergen-spezifische Hinaufregulierung der Oberflächen-Mar-ker CD203c und CD63 nach, die beide als Marker für eine basophile Zellen-Aktivierung anerkannt sind (Hauswirth et al., J.

Allergy Clin. Immunol. (2002) 110:102-109).

Heparinisierte Blutproben wurden von 5 gegen Katzen allergischen Patienten entnommen, nachdem eine Einverständniserklärung abgegeben worden war. Blut-Aliquots (100 μΐ) wurden mit seriellen Verdünnungen von rFel d 1, von Fel d 1 stammenden synthetischen Peptiden, als einzelne Komponenten oder als äquimolare Mischung, anti-IgE-Antikörper oder Puffer (PBS) 15 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen in PBS, das 20 mM EDTA enthielt, gewaschen. Die Zellen wurden dann mit 10 μΐ von mit PE konjugiertem CD203c mAb 97A6 und 20 μΐ von mit FITC konjugiertem CD63 mAb CLB-gran 12 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die Proben einer Ery-throzyten-Lyse mit 2 ml FACS™ Lysing Solution unterzogen. Die Zellen wurden dann gewaschen, in PBS resuspendiert und mittels Zweifarben-Durchflusszytometrie auf einem FACScan (Becton Dickinson, USA) unter Verwendung der Paint-a-Gate Software analysiert. Die Allergen-induzierte Hinaufregulierung von CD203c und CD63 wurde aus den mittleren Fluoreszenz-Intensitäten (MFIs) berechnet, die mit stimulierten (MFIstim) und nicht-stimulierten (MFIcontrol) Zellen erhalten wurden, und als Stimulations-Index ausgedrückt (MFIstim : MFIcontrol). Ein SI von mehr als 2,0 (d.h., mehr als 2-fache Hinaufregulierung) wurde als eine spezifische (diagnostische) Antwort anzeigend angesehen.

An basophilen Zellen von allen fünf untersuchten, gegen Katzen allergischen Patienten (RR, EB, KC, MG und SM) induzierte eine Stimulation mit rFel d 1 eine Allergen-spezifische Hinauf-regulie-rung der Oberflächen-Marker CD203c und CD63. Es wurde beobachtet, dass die Hinaufregulierung von CD203c und CD63 bei 4/5 Patienten (RR, KC, MG und SM) Dosis-abhängig war. Für diese Patienten lagen die CD203c-Stimulations-Indices im Bereich von

f NACHGEREICHT - 1,1 (SM) bis 3,2 (RR) für die niedrigste getestete Konzentration von 0,001 pg rFel d 1/ml und von 3,6 (KC) bis 6,2 (RR) für die höchste getestete Konzentration von 10 μg rFel d 1/ml. Die im selben Test bestimmten CD63-Stimulations-Indices lagen im Bereich von 1,1 (RR) bis 2,0 (MG) für die niedrigste getestete rFel d 1-Konzentration von 0,001 μg/ml und von 3,9 (RR) bis 7,3 (MG) für die höchste getestete rFel d 1-Konzentration von 10 μg/ml. Für den Patienten EB reichten 0,001 μg/ml Fel d 1 bereits aus, um eine hochgradige Hinaufregulierung der Oberflä-chen-Marker CD203c und CD63 zu induzieren, wodurch eine Beobachtung einer Dosis-Abhängigkeit der Oberflächen-Marker-Hin-aufregulierung verhindert wurde.

Basophile Zellen von allen fünf gegen Katzen allergischen Patienten wurden mit fünf zunehmenden Konzentrationen (0,005, 0,05, 0,5, 5 und 50 μg/ml) einer äquimolaren Mischung der fünf von Fel d 1 stammenden synthetischen Peptide versetzt. Basophile Zellen vom Patienten RR wurden zusätzlich mit fünf zunehmenden Konzentrationen der fünf einzelnen, von Fel d 1 stammenden synthetischen Peptide versetzt (0,001, 0,01, 0,1 1 und 10 pg/ml).

Es zeigte sich, dass die. Peptide unzulänglich bei der Hinaufregulierung der Oberflächen-Marker CD203c und CD63 waren. Die Peptide konnten keine gesteigerte Expression von CD203c und CD63 auf Zellen der Patienten RR, KC und SM induzieren. Eine geringe Hinaufregulierung von CD203c (SI=2,3) und von CD63 (SI=2,5) konnte für den Patienten MG nachgewiesen werden, jedoch nur für die höchste getestete Konzentration von 50 pg Peptid-Mischung/ml, wogegen die niedrigeren aufgebrachten Konzentrationen auch keine stimulierende Wirkung hatten. Eine stärkere Hinaufregulierung von CD203c (SI=4,2) und CD63 (SI=4,3) wurde beim Patienten EB beobachtet, jedoch wiederum nur für die höchste getestete Peptid-Mischungs-Konzentration. In beiden Fällen, bei Patient MG und EB, war die Rate der Hinaufregulierung nach Stimulation mit Peptiden beträchtlich niedriger als die entsprechenden Werte für die Stimulation mit dem ganzen Fel d 1-Allergen.

Dies zeigt, dass von Fel d 1 stammende synthetische Peptide den Vorteil einer geringeren allergenen Aktivität vorsehen als das ganze Fel d 1-Allergen. Dies ist für ein verringertes Risiko von IgE-vermittelten Nebenwirkungen relevant, wenn von Fel d 1 stammende synthetische Peptide in SIT verwendet werden.

NACHGEREICHT - 80 -

Beispiel 21: Eine Immunisierung mit von Fel d 1 stammenden synthetischen Peptiden induziert IgG-Antikörper, die mit dem ganzen rFel d l-Allercren reaktiv sind

Von Fel d 1 stammende synthetische Peptide erwiesen sich als unzureichend in der IgE-Bindung. Als Anwärter-Moleküle für eine Impfung, welche auf die Induktion von Allergen-spezifischen IgG-Antikörpern abzielt, müssen die Peptide spezifische Allergen-Strukturen beibehalten und müssen noch immer in der Lage sein, eine IgG-Immunantwort, die für das ganze Allergen spezifisch ist, zu induzieren. Um herauszufinden, ob von Fel d 1 stammende synthetische Peptide diesen Anforderungen entsprechen, wurden Immunisierungsversuche bei Kaninchen durchgeführt.

Kaninchen wurden mit ungekoppelten, von rFel d 1 stammenden und mit mit KLH gekoppelten, von Fel d 1 stammenden synthetischen Peptiden immunisiert. HPLC-gereinigte Peptide wurden an KLH über ihre Cystein-Reste gekoppelt, wobei ein Imject Maleimi-de Activated Immunogen Conjugation Kit (Pierce, USA) verwendet wurde.

Kaninchen (New Zealand White-Kaninchen) wurden mit den Immu-nogenen (200 pg/Injektion) immunisiert, wobei CFA (erste Immunisierung) und IFA (erste Booster-Injektion nach 4 Wochen; eine zweite Booster-Injektion mit unvollständigem Adjuvans wurde nach 7 Wochen gegeben) (Charles River Breeding Laboratories, Deutschland) verwendet wurden. Den Kaninchen wurde 8 Wochen nach der ersten Immunisierung und in vierwöchigen Intervallen danach Blut entnommen.

Die Induktion von Peptid- und rFel d 1-spezifischen Antikörpern wurde in ELISA-Tests überwacht. ELISA-Platten (Nunc Maxisorb, Dänemark) wurden mit rFel d 1 (0,5 pg/Vertiefung) beschichtet, gewaschen und blockiert. Platten-gebundenes rFel d 1 wurde dann in Duplikaten mit 1:1000 verdünnten Kaninchen-Antiseren und den entsprechenden Kaninchen-Präimmunseren versetzt, und gebundenes IgG wurde mit einem 1:2000 verdünntem, mit Hor-seradish-Peroxidase markiertem Ziegen-anti-Kaninchen-Antiserum (Jackson ImmunoResearch Inc., USA) nachgewiesen. Die Mittelwerte von Duplikaten wurden berechnet und zeigten Fehler von weniger als 5%.

Die Immunisierung mit von Fel d 1 stammenden synthetischen Peptiden induziert Fel d 1-reaktive IgG-Antikörper. Acht Wochen nach der ersten Immunisierung mit jedem der fünf von Fel d 1

NACHGEREICHT 81 stammenden synthetischen Peptide können IgG-Antikörper, die gegenüber dem ganzen Fel d 1-Allergen reaktiv waren, in jedem der fünf Kaninchen-Antiseren nachgewiesen werden. Die IgG-Antikör-per-Mengen blieben in den nachfolgenden Blutentnahmen auf vergleichbaren Höhen (Fig. 16).

Die Anti-Peptid 1-, Anti-Peptid 2-, Anti-Peptid 4- und Anti-Peptid 5-Kaninchen-Antiseren zeigten IgG-Reaktivitäten gegenüber Fel d 1 von etwa derselben Größe als das anti-Fel d 1-Kaninchen-Antiserum. Auch das Anti-Peptid-3-Kaninchen-Antiserum zeigte eine deutliche, jedoch etwas geringere IgG-Reaktivität gegenüber Fel d 1.

Dies zeigt an, dass alle 5 von Fel d 1 stammenden synthetischen Peptide Anwärter-Moleküle für die Induktion einer Fel d 1-spezifischen IgG-Antikörper-Antwort sind.

Beispiel 22: Von Fel d 1 stammende synthetische Peptide induzieren schwächere lvmphovroliferative Antworten als Fel d 1

Gewünschte Anwärter-Moleküle für verbesserte SIT bieten nicht nur den gewünschten Vorteil von verringerten, durch IgE vermittelten Nebenwirkungen, sondern auch von verringerten, durch T-Zellen vermittelten Nebenwirkungen. Um die T-Zell-akti-vierenden Eigenschaften von von Fel d 1 stammenden synthetischen Peptiden zu untersuchen, wurden lymphoproliferative Tests durchgeführt . PBMCs wurden von 7 gegen Katzen allergischen Patienten mittels Ficoll(Amersham Pharmacia Biotech, UK)-Dichtegradienten-Zentrifugation isoliert. Die PBMC (2 x 105) wurden in Triplikaten in Platten mit 96 Vertiefungen (Nunclone, Nalgene Nunc International, Dänemark) in 200 μΐ Serum-freiem Ultra Culture-Medium (Cambrex, Belgien), ergänzt mit 2 mM L-Glutamin (Sigma, USA), 50 μΜ ß-Mercaptoethanol (Sigma) und 0,1 mg Gentamicin pro ml (Sigma) bei 37°C unter Verwendung von 5% C02 in einer angefeuchteten Atmosphäre gezüchtet. Die Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen (5, 2,5, 1,25 und 0,6 pg/Vertiefung) von von rFel d 1 stammenden und von Fel d 1 stammenden synthetischen Peptiden als einzelne Komponenten oder als äquimolare Mischung und, für Kontrollzwecke, mit 4E Interleukin-2 oder mit Medium alleine stimuliert. Nach 6-tägigem Züchten wurden 0,5 pCi 3H-Thy-midin (Amersham Pharmacia Biotech) pro Vertiefung zugegeben, und 16 h danach wurde die inkorporierte Radioaktivität mittels Flüs-sigkeitsszintillationszählung unter Verwendung eines Mikrobeta- nachgereicht

Szintillationszählers (Wallac ADL, Deutschland) gemessen, und der mittlere cpm wurde aus den Triplikaten berechnet. Der Stimulations-Index (SI) wurde als der Quotient des cpm, das durch Antigen- oder Interleukin-2-Stimulierung und die nicht-stimulierte Medium-Kontrolle erhalten wurde, berechnet.

Die durch IL-2 stimulierte Proliferation von PBMC von allen 7 getesteten, gegen Katzen allergischen Patienten ergab Stimula-tions-Indices von 9,8 für RR, 5,2 für EB, 3,2 für KC, 6,7 für MG, 6,3 für SM, 15,7 für RA und 13,9 für AR.

Von Fel d 1 stammende synthetische Peptide induzierten niedrigere Stimulations-Indices (Tabelle 9).

Tabelle 9: Von Fel d 1 stammende synthetische Peptide, die auf äquimolarer Basis schwächere lymphoproliferative Antworten als Fel d 1 induzieren, können identifiziert werden. PBMCs von 7 gegen Katzen allergischen Patienten wurden mit seriellen Verdünnungen von von rFel d 1 oder von Fel d 1 stammenden synthetischen Peptiden als einzelne Komponenten stimuliert. Die spezifischen lymphoproliferativen Antworten sind als Stimulations-Indices gezeigt. 5pg/Ver- tiefung 2,5μg/Ver- 1,25pg/Ver-tiefung tiefung 0,6pg/Ver-tiefung Patient RR rFel d 1 2,6 1,8 1,5 1,9 Peptid 1 1,9 0,6 1,3 1,5 Peptid 2 2,1 1,3 2,0 1,6 Peptid 3 3,5 2,8 2,0 3,0 Peptid 4 2,5 2,4 1,5 0,8 Peptid 5 1,7 0,9 2,3 0,7 Patient EB rFel d 1 8,2 2,9 1,6 1,5 Peptid 1 1,3 0,9 1,0 1,2 Peptid 2 2,4 1,7 1,8 1,6 Peptid 3 1,1 1,2 1,4 1,7 Peptid 4 3,6 3,6 3,2 2,3 Peptid 5 2,2 2,1 1,4 2,1 Patient KC rFel d 1 0,8 1,2 1,3 5,2 Peptid 1 0,7 1,0 1,1 1,1 Peptid 2 1,2 1,5 1,0 1,1 NACHGEREiCi i. • · · * · · · · · ·

• · · · · ·· · · · · • · · · · · · · · · • · · · ····· ··· I ······ · · « + ··· ·# · ·# ···· - 83 -

Peptid 3 0, 6 0,5 0,5 0, 6 Peptid 4 1,6 1,4 1,3 1,1 Peptid 5 1,3 1,4 0,9 1,4 Patient MS rFel d 1 2,9 2,3 2,3 2,2 Peptid 1 1,8 1,4 1,4 1,1 Peptid 2 1,2 1,3 1,4 0,9 Peptid 3 1,1 0,5 0,6 0,7 Peptid 4 1,1 1,5 1,8 1,0 Peptid 5 1,5 1,2 1,6 0,8 Patient SM rFel d 1 2,3 1,6 1,8 1,1 Peptid 1 1,1 1,0 0,8 1,0 Peptid 2 1,8 1,1 1,3 1,2 Peptid 3 2,6 2,1 2,1 1,5 Peptid 4 1,9 1,6 1,7 1,1 Peptid 5 2,3 1,3 1,4 1,0 Patient RA rFel d 1 3,2 1,2 2,4 1,2 Peptid 1 0,8 0,7 1,3 1,1 Peptid 2 1,2 0,5 1,7 1,6 Peptid 3 2,0 2,3 1,6 0,9 Peptid 4 3,0 1,3 1,1 0,6 Peptid 5 0,4 0,6 0,9 0,9 Patient AR rFel d 1 1,4 0,6 0,9 1,0 Peptid 1 1,0 0,5 1,7 0,7 Peptid 2 0,7 0, 6 0,9 0, 6 Peptid 3 1,6 1,6 2,1 1,0 Peptid 4 1,0 0,7 0,7 0, 6 Peptid 5 0, 8 0,5 0,3 0,5

Beispiel 23: IgG-Antiköroer, die durch Immunisierung mit von Fel d 1 stammenden synthetischen Peptiden induziert wurden, inhibieren die Bindung des ΙσΕ von gegen Katzen allergischen Patienten an das ganze Fel d l-Alleraen

Die Fähigkeit von Peptid-induziertem Kaninchen-Ig, die Bindung von Allergiker-IgE-Antikörpern an vollständiges rFel d 1 zu inhibieren, wurde in ELISA-Kompetitions-Tests untersucht. ELISA-

NACHGEREICHT

• · · · • · • · ··· · 84

Platten (Nunc Maxisorb, Dänemark) wurden mit rFel d 1 (0,05 pg/Vertiefung) beschichtet, gewaschen und blockiert. An Platten gebundenes rFel d 1 wurde dann mit 1:100 verdünnten Ka-ninchen-Anti-Peptid-Antiseren (einzelne Anti-Peptid-Antiseren sowie eine Mischung aus Anti-Peptid-Antiseren wurden verwendet), Kaninchen-anti-rFel d 1-Antiserum und, für Kontrollzwecke, auch mit den entsprechenden Kaninchen-Präimmunseren vorinkubiert. Nachdem die Platten gewaschen worden waren, wurden sie mit 1:5 verdünnten Humanseren von gegen Katzen allergischen Patienten inkubiert. Gebundene IgE-Antikörper wurden mit einem 1:2500 verdünnten, mit Horseradish-Peroxidase markierten Anti-Human-IgE-Antikörper (KPL, USA) nachgewiesen. Die Prozent Inhibition der durch Vorinkubation mit den Anti-Peptid-Antiseren erreichten IgE-Bindung wurde wie folgt berechnet: % Inhibition der IgE-Bin-dung = 100 - O.D.j / O.D.P x 100, wobei O.D.! die gemessene optische Dichte nach Vorinkubation mit Kaninchen-Immunseren und O.D.P mit Kaninchen-Präimmunseren ist.

Die Präinkubation von an ELISA-Platten gebundenem Fel d 1 mit den 5 Anti-Peptid-Kaninchen-Antiseren ergab Inhibitionsmuster, die innerhalb der 14 verschiedenen getesteten Seren von gegen Katzen allergischen Patienten unterschiedlich waren. Anti-Peptid 1-Kaninchen-Antiserum blockierte die Bindung des Patien-ten-IgE an Fel d 1 bei 13/14 getesteten Patienten-Seren, Anti-Peptid 2-Kaninchen-Antiserum bei 8/14, Anti-Peptid 3-Kaninchen-Antiserum bei 13/14, Anti-Peptid 4-Kaninchen-Antiserum bei 9/14 und Anti-Peptid 5-Kaninchen-Antiserum bei 5/14.

Auch der Bereich der Inhibition variierte innerhalb der verschiedenen Antiseren. Unter den einzelnen getesteten Anti-Pep-tid-Kaninchen-Antiseren zeigte das Anti-Peptid 1-Kaninchen-Antiserum die besten Inhibitionsraten mit Inhibitionen von 0-55% (Durchschnitt: 29%). Mit dem Anti-Peptid 2-Kaninchen-Antiserum konnten Inhibitionsraten von 0-18% (Durchschnitt: 5%) erreicht werden, mit dem Anti-Peptid 3-Kaninchen-Antiserum von 0-29% (Durchschnitt: 11%), mit dem Anti-Peptid 4-Kaninchen-Antiserum von 0-24% (Durchschnitt: 8%) und mit dem Anti-Peptid 5-Kanin-chen-Antiserum von 0-18% (Durchschnitt: 4%).

Eine Mischung aus allen 5 Anti-Peptid-Kaninchen-Antiseren inhibierte die Bindung des IgE von Patienten an Fel d 1 am effizientesten, wobei Inhibitionen für alle Patienten-Seren und Inhibitionsraten von 25-84% erreicht wurden (Durchschnitt: 59%). nachgereicht • · 4

Diese Inhibitionen waren noch stärker als jene, die durch eine Vorinkubation mit dem Anti-Fel d 1-Kaninchen-Antiserum erreicht wurden (Tabelle 10) .

Tabelle 10: Kaninchen-Antiseren, die gegen von Fel d 1 stammende synthetische Peptide gezogen wurden, inhibieren die Bindung von Human-IgE an Fel d 1. Die Prozent Hemmung der IgE-Bindung an Fel d 1, die durch Vorinkubation von Fel d 1 mit Kaninchen-Antiseren erreicht wurde, sind für 14 Patienten und als Mittelwert gezeigt. Vorinkubationen wurden mit 5 Kaninchen-Antiseren, die gegen die 5 von Fel d 1 stammenden synthetischen Peptide (Anti-Peptide 1-5) gezogen wurden, mit einer Mischung der 4 Anti-Peptid-Antiseren (Mischung) und mit einem gegen Fel d 1 gezogenen Antiserum (Anti-rFel d 1) durchgeführt.

Patient Anti-Peptid 1 Anti-Peptid 2 Anti-Peptid 3 Anti-Peptid 4 Anti-Peptid 5 Mischung der 6 Anti-Peptid Antiseren Anti-rFel d1 1 48 18 29 20 18 78 64 2 24 0 8 0 0 67 43 3 55 11 5 17 8 84 74 4 38 7 11 24 8 66 49 5 10 5 5 12 0 54 48 6 33 0 12 5 0 68 46 7 6 1 10 5 0 58 45 8 44 3 17 10 0 60 53 9 26 17 12 15 16 53 43 10 0 0 10 0 0 31 26 11 38 0 0 0 0 52 56 12 47 0 22 0 7 75 51 13 27 2 8 0 0 56 41 14 16 0 6 5 0 25 25 Mittel 29 5 11 8 4 59 47

Wenn das Anti-Peptid 1-Kaninchen-Antiserum mit jedem der anderen Anti-Peptid-Antiseren kombiniert wurde, war die Inhibition der Bindung des IgE allergischer Patienten wesentlich erhöht und

NACHGEREICHT * ·

• · · · · • · f · · • · · · · tl - 86 - erreichte beinahe Werte (z.B. Anti-Peptid 1+4: 41%, Anti-Peptid 1+5: 42%), die mit anti-rFel d 1-Antikörpern (67%) erreicht wurden (Tabelle 11).

Tabelle 11

Patient Anti-Peptid 1 + Anti-Peptid 2 Anti-Peptid 1 + Anti-Peptid 3 Anti-Peptid 1 + Anti-Peptid 4 Anti-Peptid 1 + Anti-Peptid 5 Anti-rFel d 1 1 61 49 61 63 75 2 24 17 28 28 74 3 60 52 62 57 86 4 43 33 43 40 68 5 17 9 27 30 67 6 37 24 42 46 73 7 26 21 36 34 74 8 51 46 53 55 72 9 40 28 46 43 61 10 16 11 30 34 40 11 45 35 47 45 78 12 52 40 56 59 76 13 29 17 29 32 62 14 7 10 14 16 28 Mittel 36 28 41 42 67

Beispiel 24: Von Bet v 1 stammende Peptide induzieren für Bet v 1 spezifische IaG-Antworten, wobei sie T-Zellen-Hilfe von von Träger stammenden T-Zell-Epitopen erhalten, und verringern die für Bet v 1 spezifische T-Zell-Proliferation

Es wurde bereits gezeigt, dass von Bet v 1 stammende, Ober-flächen-exponierte B-Zell-Peptide eine protektive, Bet v 1-spe-zifische IgG-Antwort in einem Maus-Modell einer therapeutischen und prophylaktischen Impfung induzieren (Focke M. et al., Clin.

Exp. Allergy (2004) 34:1525-1533). Bei Focke M. et al. (2004) wurden 6 von Bet v 1 stammende Peptide vor der Immunisierung von Mäusen mit dem Träger-Molekül KLH gekoppelt. Im vorliegenden Beispiel wird gezeigt, dass die mit diesen Peptiden induzierte Bet v 1-spezifische IgG-Antwort (Tabelle 1) mit Hilfe der T-Zell-Epitope, die vom Träger stammen, angetrieben wird, aber nicht vom Bet v 1-Allergen. Überraschenderweise wurde festge-

NACHGEREICHT ·· 9 99 9 09 ··

·· ··· 99 9 99 9999 - 87 - stellt, dass keines der von Bet v 1 stammenden Peptide mit den Sequenzen LFPKVAPQAISSVENIEGNGGPGTIKKISF (SEQ ID Nr. 20), GPG-TIKKISFPEGFPFKYVKDRVDEVDHTN (SEQ ID Nr. 21) und VDHTNFKYNYS-VIEGGPIGDTLEKISNEIK (SEQ ID Nr. 22) relevante T-Zell-Antworten induzierte, und es konnte gezeigt werden, dass die Mehrheit der T-Zell-Antworten gegen das Trägermolekül, KLH, gerichtet war (Fig. 18 und 19). Diese Feststellung ist für die Verringerung von Nebenwirkungen während einer therapeutischen. Impfung und für die Verringerung der Gefahr einer potentiellen Sensibilisierung während einer prophylaktischen Impfung von großer Bedeutung. Es wurde in der Vergangenheit gezeigt, dass von einem Allergen stammende Peptide, welchen jegliche IgE-Reaktivität fehlt, die jedoch von Allergen stammende T-Zell-Epitope enthalten, Nebenwirkungen infolge einer T-Zell-Aktivierung induzierten. Von Allergen stammende Peptide, welchen die IgE- und T-Zell-Reaktivität fehlt, wie für die Bet v 1-Peptide beispielhaft gezeigt, induzieren während einer therapeutischen Impfung weder IgE- noch T-Zell-vermittelte Nebenwirkungen. Bei Verwendung für eine prophylaktische Impfung werden die Peptide eine Bet v 1-spezifische protektive IgG-Antwort induzieren, ohne Bet v 1-spezifische T-Zellen zu primen. Dies sollte die Gefahr eines „pre-priming" einer allergischen Immunantwort durch das Vakzin, welches den Weg für eine nachfolgende allergische Sensibilisierung ebnen könnte, auf ein Minimum reduzieren.

In diesem Beispiel wurden die Allergen- und Träger-spezifischen T-Zell-Antworten in einem Maus-Modell einer therapeutischen und prophylaktischen Allergen-Impfung zerlegt. Die von Bet v 1 stammenden Peptide 2, 3 und 6 (Focke M. et al. (2004)) wurden gewählt und dahingehend getestet, ob sie irgendwelche der bekannten Bet v 1-spezifischen T-Zell-Epitope in BALB/c-Mäusen enthalten. Die Mäuse wurden wie folgt immunisiert (Tabelle 10 zeigt das Sensibilisierungs- und das Behandlungs-Protokoll): Gruppen von BALB/c-Mäusen (n=5) wurden mit 10 pg rekombinantem Bet v 1 (Biomay, Österreich) und/oder mit einer Mischung der von synthetischem Bet v 1 stammenden Peptide 2, 3 und 6 (10 pg von jedem) immunisiert. Die Peptide waren, wie zuvor beschrieben, an KLH gekoppelt (Focke M. et al., (2004)). Zur Immunisierung wurden Bet v 1 und die Peptid-Mischung an Aluminiumhydroxid (Alu-Gel-S, Serva, Deutschland) in einem Gesamtvolumen von 150 pl/Maus adsorbiert.

NACHGEREICHT

Tabelle 12: Sensibilisierungs- und Behandlungs-Protokoll.

Gruppen (n=5i

Sensibilisierung (rBet v 11

Therapie (Peptide KLH)

Tag 0, 20,40 keine Sensibilisierung/keine Therapie (S-/T-) Sensibilisierung/keine Therapie (S+/T-) keine Sensibilisierung/Therapie (S-/T+)

Tag 60, 80,100

Prophylaxe Sensibilisierung (PeDtide KLH) (rBet v 1) keine Prophylaxe/Sensibilisierung (P-/S+) Prophylaxe/keine Sensibilisierung (P+/S-) Tag 0, 20,40 Tag 60, 80, 100 ProDhvIaxe/Sensibilisieruna (P+/S+) Taa 0. 20. 40 Taa 60. 80. 100

Die Allergen-, Peptid- und Träger-spezifische Lymphoprolife-ration wurde in einem T-Zell-Proliferations-Test analysiert. Die Milz wurde jeweils unter sterilen Bedingungen entfernt und homogenisiert. Nach der Lyse der Erythrozyten wurden die Zellen gewaschen und in vollständigem Medium (RPMI, 10% fötales Kälberserum, 0,1 mg/ml Gentamycin, 2 mM Glutamin) resuspendiert. Einzelzell-Suspensionen wurden in Rundboden-Platten mit 96 Vertiefungen mit einer Konzentration von 2 x 105 Zellen/Vertiefung ausplattiert und mit Concavalin A (0,5 pg/Vertiefung) als positive Kontrolle, rBet v 1 (2 pg/Vertiefung), KLH (2 pg/Vertie-fung), der Peptid-Mischung (0,34 pg von jedem Peptid/Vertiefung) oder dem Medium alleine 4 Tage lang stimuliert. Die Kulturen wurden mit 0,5 pCi/Vertiefung von mit Tritium behandeltem Thymidin 16 h lang gepulst und geerntet. Die Proliferations-Antworten wurden mittels Szintillationszählung gemessen. Das Verhältnis der mittleren Proliferation nach Antigen-Stimulation und den Me-dium-Kontrollwerten, d.h. der Stimulations-Index (SI), wurde berechnet.

Interessanterweise konnte gezeigt werden, dass eine therapeutische Impfung mit von Bet v 1 stammenden Peptiden die Bet v 1-spezifische Proliferation bei mit Bet v 1 sensibilisierten Mäusen (Gruppe S+/T+) im Vergleich zur sensibilisierten, jedoch unbehandelten Gruppe S+/T- verringern konnte. Bei der sensibilisierten und behandelten Gruppe konnte keine Peptid-spezifische

NACHGEREICHT • ···* · I « t · · • · ······· · • · · · ·»«·· ··· · *····· ·· ·· ··· ·· · ·· ···· - 89 -

Proliferation gemessen werden, jedoch wurde gemäß der Träger-Wirkung eine KLH-spezifische Proliferation beobachtet. Das Peptid-Vakzin alleine (Gruppe S-/T+) induzierte hauptsächlich KLH-spezifische T-Zellen, jedoch beinahe keine Bet v 1-spezifische T-Zell-Antwort (Fig. 18) .

Eine prophylaktische Impfung mit den Peptiden induzierte beinahe keine Bet v 1-spezifische Proliferation (Gruppe P+/S-) im Vergleich zur mit Bet v 1 sensibilisierten Gruppe P-/S+, jedoch eine KLH-spezifische Proliferation. Bei prophylaktisch geimpften und danach sensibilisierten Mäusen (Gruppe P+/S+) war die Bet v 1-spezifische Proliferation merklich verringert; weiters konnte bei keiner Mäuse-Gruppe eine Peptid-spezifische Antwort beobachtet werden (Fig. 19).

Somit konnte in einem Allergie-Maus-Modell gezeigt werden, dass eine prophylaktische Impfung mit Träger-gebundenen, von Allergen abstammenden B-Zell-Peptiden Peptid-spezifische T-Zellen nicht primete, beinahe keine Allergen-spezifischen, jedoch Träger-spezifische T-Zellen. Eine prophylaktische Impfung, die einer allergischen Sensibilisierung vorangeht, jedoch auch eine therapeutische Impfung von sensibilisierten Mäusen verringert die Allergen-spezifische T-Zell-Proliferation.

Eine prophylaktische Behandlung mit von Bet v 1 stammenden Peptiden induzierte Bet v 1-spezifische IgG-Antworten ohne Hilfe durch Bet v 1-spezifische T-Zellen. Eine prophylaktische Behandlung verstärkte weiters durch das Bet v 1-Allergen induzierte Bet v 1-spezifische IgG-Antworten bereits 20 und 40 Tage nach einer ersten Sensibilisierung (Fig. 20).

Diese Ergebnisse zeigen, dass das Peptid-Vakzin eine für Bet v 1 spezifische IgG-Antwort induziert, die durch Einwirken eines Allergens geboostert werden kann.

Beispiel 25: Von Der p 2 stammende Peptide, die eine verringerte IgE-BindungskaOazität aufweisen

Die IgE-Bindungskapazität von von Der p 2 stammenden Peptiden wurde, wie in den Beispielen 15.1 und 20.1 beschrieben, bestimmt, wobei die Peptide gemäß Tabelle 13 eingesetzt und Seren von Individuen, die an einer Hausstaubmilben-Allergie litten, verwendet wurden.

NACHGEREICHT

Tabelle 13: Von Der p 2 stammende Peptide

Peptid Position Sequenz SEQ ID Nr. Der p 2 Pep 1 1-33 DQVDVKDCANHEIKKVLVPGCHGSEPCIIHRGK 96 Der p 2 Pep 2 21-51 CHGSEPCIIHRGKPFQLEAVFEANQNSKTAK 97 Der p 2 Pep 3 42-73 EANQNSKTAKIEIKASIEGLEVDVPGIDPNAC 98 Der p 2 Pep 4 62-103 EVDVPGIDPNACHYMKCPLVKGQQYDIKYTWIVP- KIAPKSEN 99 Der p 2 Pep 5 98-129 APKSENWVTVKVMGDNGVLACAIATHAKIRD 100

Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass die von Der p 2 stammenden Peptide der vorliegenden Erfindung eine signifikant verringerte IgE-Bindungskapazität aufweisen.

Tabelle 14: Ergebnisse rDer p 2 Peptid 1 Peptid 2 Peptid 3 Peptid 4 Peptid 5 Mittel 1,080 0,010 0,015 0,004 0,031 0,006 (n=50)

NACHGEREICHT 1

SEQUENZPROTOKOLL <110> "Biomay" AG <120> Hypoallergene Moleküle <130> R 47891 <160> 140 <170> Patentin Version 3.3 <210> <211> <212> <213> 1 50 DNA Künstliche Sequenz <220> <22 3> Primer <400> 1 cggaattcat taatatgaac ccagttgaaa attatataga tagtgtatta 50

<210> 2 <211> 46 <212> DNA <21B> Künstliche Sequenz <220> <223> Primer <400> 2 cgattaattc agtggtggtg gtggtggtgg acgtttgtaa cggtaa 46 <210> 3 <211> 37

<212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Primer <400> 3 37 ctttaagaag gagatatact taagatgaac ccagttg <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Primer <400> 4 caactgggtt catcttaagt atai <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Primer <400> 5 cctgatgttt ttaccggtac aaacgtccac cac 37 33 • ·· ·· ··· ·· · 2 <210> 6 <211> 33

<212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Primer <400> 6 gtggtggacg tttgtaccgg taaaaacatc agg 33 <210> 7 <211> 34

<212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Primer <400> 7 34 cgcgcttaag atggtccgct acaccaccga gggc <210> 8 <211> 34

<212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Primer <400> 8 cgcgcttaag cttggactcg taggcggtgt egge 34 <210> 9 <211> 32

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Phi p 5 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 9

Cys Gly Ala Ala ser Asn Lys Ala Phe Ala Glu Gly Leu Ser Gly Glu 15 10 15

Pro Lys Gly Ala Ala Glii Ser Ser Ser Lys Ala Ala Leu Thr Ser Lys 20 25 30 <210> 10 <211> 34

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Phi p 5 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 10

Ala Asp Leu Gly Tyr Gly Pro Ala Thr Pro Ala Ala Pro Ala Ala Gly 15 10 15 3 ··

Tyr Thr Pro Ala Thr Pro Ala Ala Pro Ala Glu Ala Ala Pro Ala Gly 20 25 30

Lys Cys <210> 11 <211> 32

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Phi p 5 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 11

Ala Tyr Lys Leu Ala Tyr Lys Thr Ala Glu Gly Ala Thr Pro Glu Ala 15 10 15

Lys Tyr Asp Ala Tyr Val Ala Thr Leu Ser Glu Ala Leu Arg Ile Cys 20 25 30 <210> 12 <211> 31

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Phi p 5 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 12

Cys Glu Ala Ala Phe Asn Asp Ala Ile Lys Ala Ser Thr Gly Gly Ala 15 10 15

Tyr Glu Ser Tyr Lys Phe Ile Pro Ala Leu Glu Ala Ala val Lys 20 25 30 <210> 13 <211> 33 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Phi p 5 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 13 Thr val Ala Thr Ala Pro Glu val Lys Tyr Thr val Phe Glu Thr Ala 1 5 10 15

Leu Lys Lys Ala Ile Thr Ala Met Ser Glu Ala Gin Lys Ala Ala Lys 20 25 30

Cys <210> 14 <211> 38

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz • · · ·· ·· · ·· · • · · · ··· · ·· · ······ ··· · • · · ·· · ·· ·· ·· ·· ·· ··· ·· ···· 4 <220> <223> Phi p 5 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 14

Cys Ala Glu Glu Val Lys Val Ile Pro Ala Gly Glu Leu Gin Val Ile 15 10 15

Glu Lys Val Asp Ala Ala Phe Lys Val Ala Ala Thr Ala Ala Asn Ala 20 25 30

Ala Pro Ala Asn Asp Lys 35 <210> 15 <211> 35

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Fel d 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 15

Glu Ile Cys Pro Ala val Lys Arg Asp Val Asp Leu Phe Leu Thr Gly 15 10 15

Thr Pro Asp Glu Tyr val Glu Gin Val Ala Gin Tyr Lys Ala Leu Pro 20 25 30 val val cys 35 <210> 16 <211> 36

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Fel d 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 16

Leu Glu Asn Ala Arg Ile Leu Lys Asn Cys val Asp Ala Lys Met Thr 15 10 15

Glu Glu Asp Lys Glu Asn Ala Leu Ser Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Thr 20 25 30 ser Pro Leu Cys 35 <210> 17 <211> 35

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Fel d 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül » · · · · • · · ··· » · · · · 4

I · · I · I ·* ·· ·· <400> 17

Val Lys Met Ala Ile Thr Cys Pro Ile Phe Tyr Asp Val Phe Phe Ala 15 10 15

Val Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ser Leu Thr Lys Val 20 25 30

Asn Ala Cys 35

<210> 18 <211> 30 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Fel d 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 18

Thr Glu Pro Glu Arg Thr Ala Met Lys Lys Ile Gin Asp Cys Tyr val 15 10 15

Glu Asn Gly Leu Ile ser Arg Val Leu Asp Gly Leu Val cys 20 25 30 <210> 19 <211> 30

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Fel d 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 19

Cys Met Thr Thr Ile ser Ser Ser Lys Asp Cys Met Gly Glu Ala Val 15 10 15

Leu Asn Thr Leu Gly Arg 25 30 • · · I ·· 4 • · · • · · • ·· »··4

Gin Asn Thr Val Glu Asp Leu Lys 20 <210> 20 <211> 30

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Bet v 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 20

Leu Phe Pro Lys Val Ala Pro Gin Ala Ile ser ser val Glu Asn τΐο 1 5 10 15

Glu Gly Asn Gly Gly Pro Gly Thr Ile Lys Lys Ile Ser Phe 20 25 30 <210> 21 <211> 30 6..·· - ··: • * · S ·* « • · · · J · · <,/ ........... ** • · ·

<212> PRT <21Β> Künstliche Sequenz <220> <223> Bet v 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 21

Gly Pro Gly Thr Ile Lys Lys Ile Ser Phe Pro Glu Gly Phe Pro Phe 15 10 15

Lys Tyr Val Lys Asp Arg val Asp Glu val Asp His Thr Asn 20 25 30 <210> 22 <211> 30

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Bet v 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 22 val Asp His Thr Asn Phe Lys Tyr Asn Tyr Ser val Ile Glu Gly Gly 15 10 15

Pro Ile Gly Asp Thr Leu Glu Lys Ile Ser Asn Glu Ile Lys 20 25 30 <210> 23

<211> 40 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Alt a 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 23

Ala Pro Leu Glu Ser Arg Gin Asp Thr Ala Ser Cys pro Val Thr Thr 1 5 10 15

Glu Gly Asp Tyr val Trp Lys Ile ser Glu phe Tyr Gly Aro Lys Pro 20 25 30

Glu Gly Thr Tyr Tyr Asn Ser Leu 35 40 <210> 24 <211> 37

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Alt a 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 24

Gly Phe Asn ile Lys Ala Thr Asn Gly Gly Thr Leu Asp Phe Thr cys 1 5 10 K 15

Ser Ala Gin Ala Asp Lys Leu Glu Asp His Lys Trp Tyr Ser cys Gly 20 25 30

Glu Asn Ser Phe Met 35 <210> 25 <211> 30

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Alt a 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 25

Glu Asn Ser Phe Met Asp Phe Ser Phe Asp Ser Asp Arg Ser Gly Leu 15 10 15

Leu Leu Lys Gin Lys Val Ser Asp Asp Ile Thr Tyr Val Ala 20 25 30 <210> 26 <211> 37

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Alt a 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 26

Thr Ala Thr Leu Pro Asn Tyr Cys Arg Ala Gly Gly Asn Gly Pro Lys 15 10 15

Asp Phe Val Cys Gin Gly val Ala Asp Ala Tyr Ile Thr Leu Val Thr 20 25 30

Leu Pro Lys Ser Ser 35 <210> 27 <211> 40 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Alt a 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 27 Met His Ser Ser Asn Asn Phe Phe Lys Asp Asn Ile Phe Arg Ser Leu 1 5 10 15 ser Lys Glu Asp Pro Asp Tyr Ser Arg Asn Ile Glu Gly Gin val Ile 20 25 30

Arg Leu His Trp Asp Trp Ala Gin 35 40 8 » · · · · · • · ·· · · <210> 28 <211> 40 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Alt a 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 28 Leu Leu Met Leu Ser Ala Lys Arg Met Lys Val Ala Phe Lys Leu Asp 15 10 15

Ile Glu Lys Asp Gin Arg Val Trp Asp Arg Cys Thr Ala Asp Asp Leu 20 25 30

Lys Gly Arg Asn Gly Phe Lys Arg 35 40 Φ <210> 29 <211> 40 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Alt a 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 29 Cys Leu Gin 1

Phe Thr Leu Tyr Arg Pro Arg Asp Leu Leu Ser Leu Leu 5 10 15 • · · • ·· ·#«

Asn Glu Ala

Phe Phe Ser Ala Phe Arg Glu Asn Arg Glu Thr Ile Ile 20 25 30

Asn Thr Asp 35

Leu Glu Tyr Ala Ala 40

<210> 30 <211> 40 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Alt a 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 30 Lys Ser Ile Ser Met Ala Arg Leu Glu Asp Leu Trp Lys Glu Tyr Gin 15 10 15

Lys Ile Phe Pro Ser Ile Gin val ile Thr Ser Ala Phe Arg Ser Ile 20 25 30

Glu Pro Glu Leu Thr val Tyr Thr 35 40 <210> 31 <211> 30 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> 9 • · • · • · ·· ·· ί*#- 0 ι·* <223> Alt a 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 31

Cys Leu Lys Lys Ile Glu Ala Ser Phe Glu Leu Ile Glu Glu Asn Gly 15 10 15

Asp Pro Lys Ile Thr Ser Glu Ile Gin Leu Leu Lys Ala Ser 20 25 30 <210> 32

<211> 34 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Alt a 6 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 32

Met Thr Ile Thr Lys Ile His Ala Arg ser val Tyr Asp Ser Arg 1 5 10 15

Asn Pro Thr Val Glu Val Asp Ile Val Thr Glu Thr Gly Leu His Α·"9 20 25 30

Ala Ile <210> 33

<211> 40 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Alt a 6 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 33 val Thr Glu Thr Gly Leu His Arg Ala Ile Val Pro ser Gly Ala ser 15 10 15

Thr Gly ser His Glu Ala cys Glu Leu Arg Asp Gly Asp Lys ser 20 25 30

Trp Gly Gly Lys Gly val Thr Lys 35 40 <210> 34 <211> 42

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Alt a 6 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 34

Ala Pro Ala Leu Ile Lys Glu Lys Leu Asp val Lys Asp Gin ser Ala 15 10 15 10 • ·· ·· ··· ·· · • ·· ···· · ·· · ······ · · · · • ·· ·· · ·· · · ·· Μ ·· ··· ·· ····

Val Asp Ala Phe Leu Asn Lys Leu Asp Gly Thr Thr Asn Lys Thr Asn 20 25 30

Leu Gly Ala Asn Ala ile Leu Gly val ser 35 40 <210> 35 <211> 41

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Alt a 6 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 35 Glu Lys Gly 1 val pro 5

Leu Tyr Ala His Ile Ser Asp Leu Ala Gly Thr 10 15

Lys Lys Pro

Tyr val 20

Leu Pro val Pro Phe Gin Asn val Leu Asn Gly 25 30

Gly Ser His 35

Ala Gly

Gly Arg Leu Ala

<210> 36 <211> 40 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Alt a 6 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 36

Cys Glu Ala Pro Thr Phe Ser Glu Ala Met Arg Gin Gly Ala Glu val 1 5 10 15 Tyr Gin Lys Leu Lys Ala Leu Ala Lys Lys Thr Tyr Gly Gin ser Ala 20 25 30 Gly Asn Val Gly ASp Glu Gly Gly 35 40 <210> 37

<211> 40 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Alt a 6 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 37

Ile Lys Ile Ala Met Asp val Ala ser Ser Glu Phe Tyr Lys Ala Asp 15 10 15

Glu Lys Lys Tyr Asp Leu Asp Phe Lys Asn Pro Asp Ser Asp Lys Ser 20 25 30 11

Lys Trp Leu Thr Tyr Glu Gin Leu 35 40 <210> 38

<211> 40 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Alt a 6 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 38

Val Ser Ile Glu Asp Pro Phe Ala Glu Asp Asp Trp Glu Ala Trp Ser 15 10 15

Tyr Phe Phe Lys Thr Tyr Asp Gly Gin Ile Val Gly Asp Asp Leu Thr 20 25 30

Val Thr Asn Pro Glu Phe Ile Lys 35 40 <210> 39 <211> 40

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Alt a 6 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 39

Ala Lys Asp Ala Phe Gly Ala Gly Trp Gly Val Met Val Ser His Arg 15 10 15

Ser Gly Glu Thr Glu Asp val Thr Ile Ala Asp Ile Val val Gly Leu 20 25 30

Arg Ser Gly Gin Ile Lys Thr Gly 35 40 <210> 40 <211> 38

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Alt a 6 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 40

Ala Pro Ala Arg Ser Glu Arg Leu Ala Lys Leu Asn Gin Ile Leu Arg 15 10 15

Ile Glu Glu Glu Leu Gly Asp Asn Ala val Tyr Ala Gly Asn Asn Phe 20 25 30

Arg Thr Ala val Asn Leu 35 12

• ·· ·· · ·· ·· ·♦ ·· ·· ··· ·· ···· <210> 41 <211> 40

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Amb a 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 41

Glu Ile Leu Pro val Asn Glu Thr Arg Arg Leu Thr Thr Ser Gly Ala 1 5 10 15 Tyr Asn Ile Ile Asp Gly Cys Trp Arg Gly Lys Ala Asp Trp Ala Glu 20 25 30 Asn Arg Lys Ala Leu Ala Asp CVS 35 40 <210> 42

<211> 41 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Amb a 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 42

Gly Gly Lys Asp Gly Asp Ile Tyr Thr Val Thr Ser Glu Leu Asp Asp 15 10 15

Asp val Ala Asn pro Lys Glu Gly Thr Leu Arg Phe Gly Ala Ala Gin 20 25 30

Asn Arg Pro Leu Trp Ile Ile Phe Glu 35 40 <210> 43 <211> 31

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Amb a 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 43

Ile Arg Leu Asp Lys Glu Met Val Val Asn Ser Asp Lys Thr Ile Asp 15 10 15

Gly Arg Gly Ala Lys val Glu Ile Ile Asn Ala Gly Phe Thr Leu 20 25 30 <210> 44

<211> 41 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> 13 <223> Amb a 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 44

Asn val Ile Ile His Asn Ile Asn Met His Asp Val Lys val Asn Pro 1 5 10 15 Gly Gly Leu Ile Lys Ser Asn Asp Gly Pro Ala Ala Pro Arg Ala Gly 20 25 30 Ser Asp Gly 35 Asp Ala Ile Ser Ile 40 Ser <210> 45 <211> 39 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Amb a 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 45

Gly Thr Thr Arg Leu Thr Val Ser Asn Ser Leu Phe Thr Gin His Gin 15 10 15

Phe Val Leu Leu Phe Gly Ala Gly Asp Glu Asn Ile Glu Asp Arg Gly 20 25 30

Met Leu Ala Thr Val Ala Phe 35 <210> 46 <211> 37

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Amb a 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 46

Asn Thr Phe Thr Asp Asn Val Asp Gin Arg Met Pro Arg Cys Arg His 15 10 15

Gly Phe Phe Gin Val Val Asn Asn Asn Tyr Asp Lys Trp Gly Ser Tyr 20 25 30

Ala Ile Gly Gly Ser 35 <210> 47 <211> 46

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Amb a 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 47 14 • · • · 9 99 • · 9 9 • · • · 999 9 ·· 9 • · • · 9 · • • 9 9 • « • 9 99 ··· 99 9999

Ile Leu Ser Gin Gly Asn Arg Phe Cys Ala Pro Asp Glu Arg Ser Lys 15 10 15

Lys Asn Val Leu Gly Arg His Gly Glu Ala Ala Ala Glu Ser Met Lys 20 25 30

Trp Asn Trp Arg Thr Asn Lys Asp Val Leu Glu Asn Gly Ala 35 40 45

<210> 48 <211> 41 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Amb a 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 48

Gly val Asp Pro Val Leu Thr Pro Glu Gin Ser Ala Gly Met Ile Pro 15 10 15

Ala Glu Pro Gly Glu Ser Ala Leu Ser Leu Thr Ser Ser Ala Gly Val 20 25 30

Leu Ser Cys Gin Pro Gly Ala Pro cys 35 40

<210> 49 <211> 44 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Art v 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 49

Ser Lys Leu cys Glu Lys Thr Ser Lys Thr Tyr Ser Gly Lys Cys Asp 1 5 10 15 Asn Lys Lys cys 20 Asp Lys Lys cys Ile 25 Glu Trp Glu Lys Ala 30 Gl n Hi s Gly Ala cys His Lys Arg Glu Ala Gly Lys Glu ser 35 40 <210> 50 <211> 31 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Art v 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 50

Ser Cys Phe Cys Tyr Phe Asp Cys Ser Lys Ser Pro Pro Gly Ala Thr 15 10 15 15

·♦ ···

pro Ala Pro Pro Gly Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ala Gly Gly ser 20 25 30 <210> 51

<211> 41 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Art v 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 51

Ala Pro Pro Pro Ala Ala Gly Gly ser pro Ser Pro Pro Ala Asp Gly 15 10 15

Gly ser Pro Pro Pro Pro Ala Asp Gly Gly Ser Pro Pro val Asp Gly 20 25 30

Gly Ser Pro 35

Pro Pro Pro Ser Thr His 40 <210> 52 <211> 38

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Can f 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 52

Gin Asp Thr Pro Ala Leu Gly Lys Asp Thr val Ala Val ser Gly Lys 15 10 15

Trp Tyr Leu Lys Ala Met Thr Ala Asp Gin Glu Val Pro Glu Lys Pro 20 25 30

Asp Ser val Thr Pro Met 35 <210> 53 <211> 40

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Can f 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 53

Asp Ser Val Thr Pro Met Ile Leu Lys Ala Gin Lys Gly Gly Asn Leu 15 10

Glu Ala Lys Ile Thr Met Leu Thr Asn Gly Gin cys Gin Asn Ile Thr 20 25 30 val val Leu His Lys Thr Ser Glu 35 40 16 • · · · • · · · · · • · · · · <210> 54 <211> 41

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Can f 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 54

Cys Gin Asn Ile Thr Val Val Leu His Lys Thr Ser Glu Pro Gly Lys 15 10 15

Tyr Thr Ala Tyr Glu Gly Gin Arg Val Val Phe Ile Gin Pro Ser Pro 20 25 30

Val Arg Asp His Tyr Ile Leu Tyr Cys 35 40 <210> 55 <211> 40

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Can f 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 55

Gin Pro Ser Pro Val Arg Asp His Tyr Ile Leu Tyr cys Glu Gly Glu 15 10 15

Leu His Gly Arg Gin Ile Arg Met Ala Lys Leu Leu Gly Arg Asp Pro 20 25 30

Glu Gin Ser Gin Glu Ala Leu Glu 35 40 <210> 56

<211> 40 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Can f 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 56

Arg Asp Pro Glu Gin Ser Gin Glu Ala Leu Glu Asp Phe Arg Glu Phe 1 5 10 15

Ser Arg Ala Lys Gly Leu Asn Gin Glu Ile Leu Glu Leu Ala Gin Ser 20 25 30

Glu Thr cys Ser Pro Gly Gly Gin 35 40 <210> 57

<211> 40 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz • · · · · · • · · · ··· • · · · · · • · · · t · • · · · 0 0 0 17 <220> <223> Can f 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 57

Gin Glu Gly Asn His Glu Glu Pro Gin Gly Gly Leu Glu Glu Leu Ser 15 10 15

Gly Arg Trp His Ser Val Ala Leu Ala Ser Asn Lys Ser Asp Leu Ile 20 25 30

Lys Pro Trp Gly His Phe Arg Val 35 40 <210> 58 <211> 40

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> can f 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 58

Pro Trp Gly His Phe Arg val Phe Ile His Ser Met Ser Ala Lys Asp 15 10 15

Gly Asn Leu His Gly Asp Ile Leu Ile Pro Gin Asp Gly Gin Cys Glu 20 25 30

Lys Val Ser Leu Thr Ala Phe Lys 35 40 <210> 59 <211> 38

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Can f 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 59

Cys Glu Lys val Ser Leu Thr Ala Phe Lys Thr Ala Thr Ser Asn Lys 15 10 15

Phe Asp Leu Glu Tyr Trp Gly His Asn Asp Leu Tyr Leu Ala Glu val 20 25 30

Asp Pro Lys Ser Tyr Leu 35 <210> 60 <211> 39

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Can f 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül 18 ·· ···· <400> 60 Asn Asp Leu Tyr Leu Ala Glu Val Asp pro Lys Ser Tyr Leu Ile Leu 1 5 10 15 Tyr Met ile Asn Gin Tyr Asn Asp Asp Thr Ser Leu Val Ala His Leu 20 25 30

Met Val Arg Asp Leu Ser Arg 35

<210> 61 <211> 42 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <22 3> Can f 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 61

val Arg Asp Leu Ser Arg Gin Gin ASP Phe Leu Pro Ala Phe Glu Ser 1 5 10 15 val cys Glu Asp Ile Gly Leu His Lys Asp Gin ile val val Leu ser 20 25 30 Asp Asp i Asp Arg cys Gin Gly ser Arg Asp 35 40 <210> 62 <211> 34 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Fel d 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 62

Glu Ala His Gin Ser Glu Ile Ala His Arg Phe Asn Asp Leu Gly Glu 15 10 15

Glu His Phe Arg Gly Leu Val Leu Val Ala Phe Ser Gin Tyr Leu Gin 20 25 30

Gin cys <210> 63 <211> 35

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Fel d 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 63

Cys Thr Val Ala Ser Leu Arg Asp Lys Tyr Gly Glu Met Ala Asp cys 15 10 15 19

·· ·· • · · · • · ···· • · · · • · ·» ·· ·· • ·· ·· • · · · · · • ·· · • · · · • · · · ·♦· ·· ····

Gin His Lys 30

Cys Glu Lys Lys Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys php ι ol, 20 25

Asp Asp Asn 35 <210> 64 <211> 30

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Fel d 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 64

Asn Glu Gin Arg Phe Leu Gly Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Ara Ara 15 10 ις M

His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Tyr Tvr Ala Glu 20 25 * 30 <210> 65 <211> 31

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Fel d 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 65

Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gin 15 10 15

Asp Ser Ile Ser Thr Lys Leu Lys Glu Cys Cys Gly Lys Pro Val 20 25 30

<210> 66 <211> 30 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Fel d 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 66

Val Glu Asp Lys Glu val Cys Lys Asn Tyr Gin Glu Ala Lys Asp Val 15 10 15

Phe Leu Gly Thr Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arq Arg His Pro 20 25 30

<210> 67 <211> 30 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> 20 • # • ··· <223> Fel d 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 67

Leu Ala Lys Glu Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Thr Asp 15 10 15

Asp Pro Pro Ala Cys Tyr Ala His Val Phe Asp Glu Phe Lys 20 25 30 <210> 68 <211> 30

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Fel d 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 68

Glu Lys Gin Ile Lys Lys Gin Ser Ala Leu Val Glu Leu Leu Lys His 15 10 15

Lys Pro Lys Ala Thr Glu Glu Gin Leu Lys Thr val Met Gly 20 25 30 <210> 69 <211> 30

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Fel d 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 69

Val Asp Lys Cys Cys Ala Ala Glu Asp Lys Glu Ala Cys Phe Ala Glu 15 10 15

Glu Gly Pro Lys Leu Val Ala Ala Ala Gin Ala Ala Leu Ala 20 25 <210> 70 <211> 42 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Fel d 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 70 cys Pro Phe Glu Asp His val Lys Leu val Asn Glu val Thr Glu Phe 15 10 15

Ala Lys Gly cys val Ala Asp Gin Ser Ala Ala Asn Cys Glu Lys Ser 20 25 30

Leu His Glu Leu Leu Gly Asp Lys Leu Cys 35 40 21 ♦ · · ♦ ♦ · • · · · ··· ·♦ ···« <210> 71 <211> 41

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Fel d 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 71

Cys Phe Leu Gin His Lys Asp Asp Asn Pro Gly Phe Gly Gin Leu Val 15 10 15

Thr Pro Glu Ala Asp Ala Met Cys Thr Ala Phe His Glu Asn Glu Gin 20 25 30

Arg Phe Leu Gly Lys Tyr Leu Tyr Glu 35 40 <210> 72

<211> 42 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Fel d 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 72

Glu Glu Tyr Lys Gly Val Phe Thr Glu Cys Cys Glu Ala Ala Asp Lys 15 10 15

Ala Ala Cys Leu Thr Pro Lys Val Asp Ala Leu Arg Glu Lys val Leu 20 25 30

Ala Ser Ser Ala Lys Glu Arg Leu Lys cys 35 40

<210> 73 <211> 38 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Fel d 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 73 cys Ala Ser Leu Gin Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ser 15 10 15 val Ala Arg Leu Ser Gin Lys Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Ile 20 25 30

Ser Lys Leu val Thr Asp 35 <210> 74 <211> 38

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Fel d 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 74

Phe Ala Glu Ile Ser Lys Leu val Thr Asp Leu Ala Lys Ile His Lys 15 10 15

Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp 20 25 30

Leu Ala Lys Tyr Ile cys 35 <210> 75 <211> 38

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Fel d 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 75

Cys Gly 1 Lys Pro Val 5 Leu Glu Lys Ser His 10 Cys Ile Ser Glu Val 15 Glu Arg Asp Glu Leu 20 Pro Ala Asp Leu pro 25 pro Leu Ala val Asp 30 Phe val Glu Asp Lys Glu Val cys <210> 76 <211> 42

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Fel d 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 76

Cys Glu Leu Phe Glu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Phe Gin Asn Ala Leu 1 5 10 15 Leu val Arg Tyr Thr Lys Lys val Pro Gin val ser Thr Pro Thr Leu 20 25 30 val Glu val Ser Arg Ser Leu Gly Lys Val 35 40 <210> 77 <211> 39 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Fel d 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül 23 ·· ·· • · · · • · · ··· • · ♦ ♦ · • · · ♦ · ·· ·· • · · • · · • ·· ···· <400> 77 cys Thr His 1 Ser val val Ser Glu Arg 35

Pro Glu Ala Glu Arg Leu Ser cys Ala Glu Asp Tyr Leu 5 10 15

Leu Asn Arg Leu cys val Leu His Glu Lys Thr Pro val 20 25 30

Val Thr Lys cys

<210> 78 <211> 42 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Fel d 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 78

Cys 1 Thr Glu Ser Leu 5 Val Asn Arg Arg Pro 10 cys Phe Ser Ala Leu Gin 15 val Asp Glu Thr Tyr val Pro Lys Glu Phe Ser Ala Glu Thr Phe Thr 20 25 30 Phe His Ala Asp Leu cys Thr Leu Pro Glu 35 40 <210> 79 <211> 40 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Oie e 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 79

Glu Asp Ile Pro Gin Pro Pro val Ser Gin Phe His Ile Gin Gly Gin 1 5 10 15 val Tyr Cys Asp Thr cys Arg Ala Gly Phe Ile Thr Glu Leu Ser Glu 20 25 30 Phe Ile Pro Gly Ala Ser Leu Arg 35 40

<210> 80 <211> 31 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Oie e 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 80

Gly Ala Ser Leu Arg Leu Gin Cys Lys Asp Lys Glu Asn Gly Asp Val 15 10 15 24

Thr Phe Thr Glu Val Gly Tyr Thr Arg Ala Glu Gly Leu Tyr Ser 20 25 30

<210> 81 <211> 37 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Oie e 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 81

Ser Met Leu val Glu Arg Asp His Lys Asn Glu Phe cys 5 10 15

Gly Leu Tyr 1

Glu Ile Thr

Leu Ile Ser Ser Gly Arg Lys Asp Cys Asn Glu Ile Pro 20 25 30

Trp Ala

Thr Glu Gly 35 <210> 82 <211> 35 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Oie e 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 82

Gly Arg Lys Asp Cys Asn Glu Ile Pro Thr Glu Gly Trp Ala Lys Pro 15 10 15

Ser Leu Lys Phe Lys Leu Asn Thr Val Asn Gly Thr Thr Arg Thr val 20 25 30

Asn Pro Leu 35 <210> 83 <211> 39

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Oie e 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 83

Leu Asn Thr val Asn Gly Thr Thr Arg Thr val Asn Pro Leu Gly Phe 15 10 15

Phe Lys Lys Glu Ala Leu Pro Lys Cys Ala Gin val Tyr Asn Lys Leu 20 25 30

Gly Met Tyr Pro Pro Asn Met 35 ♦ · 25 <210> 84 <211> 30

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Par j 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 84

Gly Glu Glu Ala cys Gly Lys val val Gin Asp Ile Met Pro Cys Leu 15 10 15

His Phe val Lys Gly Glu Glu Lys Glu Pro Ser Lys Glu Cys 20 25 30 <210> 85 <211> 36

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Par j 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 85

Cys Leu His Phe val Lys Gly Glu Glu Lys Glu Pro Ser Lys Glu Cys 15 10 15 cys ser Gly Thr Lys Lys Leu Ser Glu Glu val Lys Thr Thr Glu Gin 20 25 30

Lys Arg Glu Ala 35 <210> 86 <211> 37

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Par j 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 86

Cys Cys Ser Gly Thr Lys Lys Leu Ser Glu Glu Val Lys Thr Thr Glu 15 10 15

Arg Ala Thr Lys Gly Ile 30

Gin Lys Arg Glu Ala Cys Lys Cys Ile Val 20 25

Ser Gly Ile Lys Asn 35 <210> 87 <211> 37

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> 26 • · · · · ·· · ♦ · · · ··· • · ♦ · · · <223> Par j 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 87

Glu Leu Val Ala Glu val Pro Lys Lys Cys Asp Ile Lys Thr Thr Leu 15 10 15

Pro Pro Ile Thr Ala Asp Phe Asp Cys Ser Lys Ile Gin Ser Thr Ile 20 25 30

Phe Arg Gly Tyr Tyr 35 <210> 88 <211> 30

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Der p 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 88

Thr Asn Ala Cys Ser Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu Ile Asp Leu 15 10 15

Arg Gin Met Arg Thr val Thr Pro Ile Arg Met Gin Gly Gly 20 25 30 <210> 89 <211> 33

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Der p 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 89

Asn Gin Ser Leu Asp Leu Ala Glu Gin Glu Leu val Asp Cys Ala Ser 1 5 10 15

Gin His Gly Cys His Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile 20 25 30

Gin <210> 90 <211> 31 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Der p 1 abgeleitetes 1 <400> 90 His Asn Gly val val Gin Glu 1 5 10 15' 27

Gin Ser Cys Arg Arg Pro Asn Ala Gin Arg Phe Gly Ile ser Asn 20 25 30 <210> 91 <211> 37 <212> prt <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Der p 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 91

Arg Glu Gin Ser Cys Arg Arg Pro Asn Ala Gin Arg Phe Gly Ile Ser 15 10 15

Asn Tyr cys Gin Ile Tyr Pro Pro Asn val Asn Lys Ile Arg Glu Ala 20 25 30

Leu Ala Gin Thr His 35 <210> 92 <211> 31

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Der p 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 92

Lys Asp Leu Asp Ala Phe Arg His Tyr Asp Gly Arg Thr Ile Ile Gin 15 10 15

Arg Asp Asn Gly Tyr Gin Pro Asn Tyr His Ala val Asn Ile Val 20 25 30 <210> 93

<211> 33 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Der p 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 93

Gly Arg Thr Ile Ile Gin Arg Asp Asn Gly Tyr Gin Pro Asn Tyr μ·;Γ 15 10 15 S

Ala Val Asn Ile val Gly Tyr Ser Asn Ala Gin Gly Val Asp Tyr 20 25 30 rp

Ile <210> 94 <211> 34

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> 28 <223> Der p 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 94

Val Gly Tyr Ser Asn Ala Gin Gly val Asp Tyr Trp Ile Val Arg Asn 15 10 15

Ser Trp Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr phe Ala Ala 20 25 30

Asn Ile <210> 95 <211> 35

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Der p 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 95 val Arg Asn Ser Trp Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr 15 10 15

Phe Ala Ala Asn Ile Asp Leu Met Met Ile Glu Glu Tyr Pro Tyr val 20 25 30

Val Ile Leu 35 <210> 96 <211> 33

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Der p 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 96

Asp Gin val Asp Val Lys Asp Cys Ala Asn His Glu Ile Lys Lys Val 15 10 15 20 25 Lys

Leu val Pro Gly Cys His Gly Ser Glu Pro cys Ile Ile His Arg Gly <210> 97 <211> 31

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Der p 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül

<400> 97 29 cys His Gly Ser Glu Pro cys Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe Gin 1 5 10 15 Leu Glu Ala val Phe Glu Ala Asn Gin Asn Ser Lys Thr Ala Lys 20 25 30 <210> 98 <211> 32

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Der p 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 98

Glu Ala Asn Gin Asn Ser Lys Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ser 15 10 15

Ile Glu Gly Leu Glu val Asp Val Pro Gly Ile Asp Pro Asn Ala Cys 20 25 30 <210> 99 <211> 42

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Der p 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 99

Glu val Asp Val Pro Gly Ile Q. 10 < Pro Asn Ala cys His Tyr Met Lys 1 5 10 15 cys Pro Leu val Lys Gly Gin Gin Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Ile 20 25 30 val Pro Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn 35 40

<210> 100 <211> 32

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Der p 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 100

Ala Pro Lys Ser Glu Asn val val Val Thr val Lys Val Met 1 5 10 Asn Gly val Leu Ala Cys Ala ile Ala Thr His Ala Lys He 20 25 30 <210> 101 <211> 35 15 30

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Der p 5 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 101

Met Glu Asp Lys Lys His Asp Tyr Gin Asn Glu Phe Asp Phe Leu Leu 15 10 15

Met Glu Arg Ile His Glu Gin Ile Lys Lys Gly Glu Leu Ala Leu Phe 20 25 30

Tyr Leu Gin 35 <210> 102 <211> 36

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Der p 5 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 102

Lys Lys Gly Glu Leu Ala Leu Phe Tyr Leu Gin Glu Gin Ile Asn His 15 10 15

Phe Glu Glu Lys Pro Thr Lys Glu Met Lys Asp Lys Ile Val Ala Glu 20 25 30

Met Asp Thr Ile 35 <210> 103 <211> 31

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Der p 5 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 103

Asp Gly Val Arg Gly val Leu Asp Arg Leu Met Gin Arg Lys Asp Leu 15 10 15

Asp Ile Phe Glu Gin Tyr Asn Leu Glu Met Ala Lys Lys Ser Gly 20 25 30 <210> 104 <211> 36

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Der p 5 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 104 ·♦ • * · · · • · · · ··· • · · · · · • · · · · · ·· ·· ·· 31 • · · • · · •t ····

Asp Leu Asp Ile Phe Glu Gin Tyr Asn Leu Glu Met Ala Lys Lys Ser 15 10 15

Gly Asp Ile Leu Glu Arg Asp Leu Lys Lys Glu Glu Ala Arg Val Lys 20 25 30

Lys Ile ! Glu Val 35 <210> 105 <211> 30 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Der p 7 abgeleitetes <400> 105 Asp Pro Ile His Tyr Asp Lys 1 5 Asp Glu i Ala val Ala Ala Ile 20 <210> 106 <211> 31 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Der p 7 abgeleitetes <400> 106 val Ala Ala Ile Glu Lys Ser 1 5 Asp His Ser Asp Lys Phe Glu 20 <210> 107 <211> 31 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Der p 7 abgeleitetes <400> 107 25 25 10 15 10 30 15 30

Leu Lys Gly Glu Leu Asp Met Arg Asn Ile Gin val Arg Gly Leu Lys 15 10 15

Gin Met Lys Arg val Gly Asp Ala Asn val Lys Ser Glu Asp Gly 20 25 30

<210> 108 <211> 36 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> 32 ·· Μ ·· • · · · · • · · · ··· • · · · · • · · · · ·· ·· ·· • ·· ·· ·· · · · · • ·· · • · · · • · · ♦ ··· ·· ···· <223> Der ρ 7 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 108 val His Asp Asp val Val Ser Met Glu Tyr Asp Leu Ala Tyr Lys Leu 15 10 15

Gly Asp Leu His Pro Asn Thr His val Ile Ser Asp Ile Gin Asp Phe 20 25 30

Val val Glu Leu 35 <210> <211> <212> <213> 109 31

PRT Künstliche Sequenz <220> <223> Der p 7 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 109

Leu Ser Leu Glu val ser Glu Glu Gly Asn Met Thr Leu Thr Ser Phe 15 10 15

Glu Val Arg Gin Phe Ala Asn Val val Asn His Ile Gly Gly Leu 20 25 30 <210> 110 <211> 34

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Der p 7 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 110

Leu Ser Asp Val Leu Thr Ala Ile Phe Gin Asp Thr val Arg Ala Glu 15 10 15

Met Thr Lys val Leu Ala Pro Ala Phe Lys Lys Glu Leu Glu Arg Asn 20 25 30

Asn Gin <210> 111 <211> 35

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Der p 10 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 111

Met Glu Ala ile Lys Lys Lys Met Gin Ala Met Lys Leu Glu Lys Asp 1 5 10 15 33 ·· ·· • · · · · • · · ♦ ··· • · · · · » • · · · « · ·· ·· ··

Asn Ala Ile Asp Arg Ala Glu Ile Ala Glu Gin Lys Ala Arg Asp Ala 20 25 30

Asn Leu Arg 35 <210> 112 <211> 35

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Der p 10 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 112

Ala Glu Lys Ser 1

Gin Ile Glu Asn 20 ·· «« ·# • · • ♦ ♦ · • • · • • # • ··«·

Glu Glu Glu val Arg Ala Leu Gin Lys Lys Ile Gin 5 10 15

Glu Leu Asp Gin Val Gin Glu Gin Leu Ser Ala Ala 25 30

Asn Thr Lys 35 <210> 113 <211> 40

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Der p 10 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 113

Leu Glu Glu Lys Glu Lys Ala Leu Gin Thr Ala Glu Gly Asp val Ala 15 10 15

Ala Leu Asn

Arg Arg Ile Gin Leu 20 ile Glu Glu Asp Leu Glu Arg Ser 25 30

Glu Glu Arg Leu Lys Ile Ala Thr 35 40 <210> 114 <211> 35

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Der p 10 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 114

Ala Lys Leu Glu Glu Ala Ser Gin Ser Ala Asp Glu Ser Glu Arg Met 15 10 15

Arg Lys Met Leu Glu His Arg Ser ile Thr Asp Glu Glu Arg Met Glu 20 25 30

• · · · • · 34

Gly Leu Glu 35 <210> 115 <211> 31

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Der p 10 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 115

Arg Met Glu Gly Leu Glu Asn Gin Leu Lys Glu Ala Arg Met Met Ala 15 10 15

Glu Asp Ala Asp Arg Lys Tyr Asp Glu Val Ala Arg Lys Leu Ala 20 25 30

<210> 116 <211> 31 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Der p 10 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 116

Asp Leu Glu Arg Ala Glu Glu Arg Ala Glu Thr Gly Glu Ser Lys Ile 15 10 15 val Glu Leu Glu Glu Glu Leu Arg Val val Gly Asn Asn Leu Lys 20 25 30 <210> <211> <212> <213> 117 41

PRT Künstliche Sequenz <220> <223> Der p 10 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 117

Ser Glu Glu Lys Ala Gin Gin Arg Glu Glu Ala His Glu Gin Gin Ile 15 10 15

Arg Ile Met Thr Thr Lys Leu Lys Glu Ala Glu Ala Arg Ala Glu Phe 20 25 30

Ala Glu Arg Ser val Gin Lys Leu Gin 35 40

<210> 118 <211> 35 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> 35 <223> Der p 10 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 118

Gin Lys Glu Val Asp Arg Leu Glu Asp Glu Leu Val His Glu Lys Glu 15 10 15

Lys Tyr Lys Ser Ile Ser Asp Glu Leu Asp Gin Thr Phe Ala Glu Leu 20 25 30

Thr Gly Tyr 35 <210> 119 <211> 35

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Der p 21 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 119

Met Phe Ile Val Gly Asp Lys Lys Glu Asp Glu Trp Arg Met Ala Phe 1 5 10 15 Asp Arg Leu Met Met Glu Glu Leu Glu Thr Lys Ile Asp Gin Val Glu 20 25 30 Lys Gly Leu 35 <210> 120 <211> 37

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Der p 21 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 120

Leu His Leu Ser Glu Gin Tyr Lys Glu Leu Glu Lys Thr Lys Ser Lys 15 10 15

Glu Leu Lys Glu Gin Ile Leu Arg Glu Leu Thr Ile Gly Glu Asn Phe 20 25 30

Met Lys Gly Ala Leu 35 <210> 121 <211> 31

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Der p 21 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 121

• · ···· • · · · • ·

• · 36

Gly Ala Leu Lys Phe Phe Glu Met Glu Ala Lys Arg Thr Asp Leu Asn 1 5 10 15 Met Phe Glu Arg Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys 20 25 30 <210> 122 <211> 33

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Der p 21 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 122

Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys Leu Leu Ile Lys Lys 15 10 15

Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Asn Pro Asp Glu Tyr 20 25 30

Tyr <210> 123 <211> 32

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Clone 30 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 123

Met Ala Asn Asp Asn Asp Asp Asp Pro Thr Thr Thr val His Pro Thr 15 10 15

Thr Thr Glu Gin Pro Asp Asp Lys Phe Glu Cys Pro Ser Arg Phe Gly 20 25 30 <210> 124 <211> 34

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Clone 30 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 124

Pro Thr Thr Thr Glu Gin Pro Asp Asp Lys Phe Glu Cys Pro Ser Arq 1 5 10 15 phe Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro His Lys Phe Tyr Ile Cvs 20 25 30

Ser Asn 37 ·· ·· · <210> 125 <211> 39

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Clone 30 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 125

Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro His Lys Phe Tyr Ile Cys Ser 15 10 15

Asn Trp Glu Ala Val 20

His Lys Asp Cys Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn 25 30

Glu Asp Glu Glu Thr cys Thr 35 <210> 126 <211> 30

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Bet v 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 126

Leu Phe Pro Lys Val Ala Pro Gin Ala Ile Ser Ser Val Glu Asn Ile 15 10 15

Glu Gly Asn Gly Gly Pro Gly Thr Ile Lys Lys Ile Ser Phe 20 25 30 <210> 127 <211> 30

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <223> Bet v 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 127

Gly Pro Gly Thr Ile Lys Lys Ile Ser Phe Pro Glu Gly Phe Pro Phe 1 5 10 15

Lys Tyr Val Lys Asp Arg val Asp Glu Val Asp His Thr Asn 20 25 30 <210> 128 <211> 30

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Bet v 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 128

Val Asp His Thr Asn Phe Lys Tyr Asn Tyr Ser Val Ile Glu Gly Gly 15 10 15 38 ·· • · · · · • · · · · ·· ·· • ·· ·· ·· · · · · • ·· · • · · · • · · · ··· ·· ····

Pro Ile Gly Asp Thr Leu Glu Lys Ile Ser Asn Glu Ile Lys 20 25 30

<210> 129 <211> 35 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Fel d 1 chain 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 129

Glu Ile Cys Pro Ala Val Lys Arg Asp Val Asp Leu Phe Leu Thr Gly 15 10 15

Thr Pro Asp Glu Tyr Val Glu Gin val Ala Gin Tyr Lys Ala Leu Pro 20 25 30

Val Val Cys 35 <210> 130 <211> 36

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Fel d 1 chain 1 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 130

Leu Glu Asn Ala Arg Ile Leu Lys Asn cys val Asp Ala Lys Met Thr 1 5 10 15 Glu Glu Asp Lys Glu Asn Ala Leu Ser Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Thr 20 25 30

Ser Pro Leu Cys 35 <210> 131 <211> 35

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Fel d 1 chain 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 131

Val Lys Met Ala Ile Thr cys Pro Ile Phe Tyr Asp val Phe Phe Ala 15 10 15

Val Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ser Leu Thr Lys val 20 25 30

Asn Ala Cys 35 39 • · · · ·· · » · · » · · ·· ···· • · · « · • · · · · • · · · · • · · · · ·· ·♦ <210> 132 <211> 30

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Fel d 1 chain 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 132

Thr Glu Pro Glu Arg Thr Ala Met Lys Lys Ile Gin Asp Cys Tyr Val 15 10 15

Glu Asn Gly Leu ile Ser Arg val Leu Asp Gly Leu Val Cys 20 25 30 <210> 133 <211> 30

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Fel d 1 chain 2 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 133

Cys Met Thr Thr Ile Ser Ser Ser Lys Asp Cys Met Gly Glu Ala val 15 10 15

Gin Asn Thr Val Glu Asp Leu Lys Leu Asn Thr Leu Gly Arg 20 25 30 <210> 134 <211> 32

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <223> Phi p 5 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 134

Cvs Glv Ala Ala Ser Asn Lys Ala Phe Ala Glu Gly Leu Ser Gly Glu 1 5 10 15

Pro Lvs Gly Ala Ala Glu Ser Ser Ser Lys Ala Ala Leu Thr Ser Lys 20 25 30 <210> 135 <211> 34 <212> PRT <213> Künstl <220> <22 3> Phi p <400> 135

Ala Asp Leu Gly Tyr Gly Pro Ala Thr Pro Ala Ala Pro Ala Ala Gly • · ·· ·· ·· • · · · · • I fl · ··· • · · · · • · · · · ·· ·* ·· *· ·· • · · · • I · « · · · • · · · ··· ·· ···· , 40

Tyr Thr Pro Ala Thr Pro Ala Ala Pro Ala Glu Ala Ala Pro Ala Gly 20 25 30

Lys Cys <210> 136 <211> 32

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Phi p 5 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 136

Ala Tyr Lys Leu Ala Tyr Lys Thr Ala Glu Gly Ala Thr Pro Glu Ala 15 10 15

Lys Tyr Asp Ala Tyr val Ala Thr Leu Ser Glu Ala Leu Arg Ile cys 20 25 30 <210> 137 <211> 31

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Phi p 5 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 137

Cys Glu Ala Ala Phe Asn Asp Ala Ile Lys Ala Ser Thr Gly Gly Ala 1 5 10 15

Tyr Glu Ser Tyr Lys Phe Ile Pro Ala Leu Glu Ala Ala Val Lys 20 25 30

<210> 138 <211> 33 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Phi p 5 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 138

Thr val Ala Thr Ala Pro Glu Val Lys Tyr Thr val Phe Glu Thr Ala 15 10 15

Leu Lys Lys Ala ile Thr Ala Met Ser Glu Ala Gin Lys Ala Ala Lys 20 25 30

Cys <210> 139 <211> 38

<212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> 41 <220> 41 ·· ·· *· #! #**· ·**· ······ ' ! ; . ......... η"Ί - Ί-1-r-ΊΓΓίΐίΐίιϋΜϋϋϋ <22B> Phi p 5 abgeleitetes hypoallergenes Molekül <400> 139

Cys Ala Glu Glu Val Lys val Ile Pro Ala Gly Glu Leu Gin val Ile 15 10 15

Glu Lys Val Asp Ala Ala Phe Lys Val Ala Ala Thr Ala Ala Asn Ala 20 25 30

Ala Pro Ala Asn Asp Lys 35 <210> 140 <211> 70

<212> PRT <213> Dermatophagoides pteronyssinus <220> <223> Clone 30 allergen <400> 140

Met Ala Asn Asp Asn Asp Asp Asp Pro Thr Thr Thr val His Pro Thr 1 5 10 15 Thr Thr Glu Gin pro Asp Asp Lys Phe Glu cys Pro Ser Arg Phe Gly 20 25 30 Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro His Lys Phe Tyr Ile Cys Ser Asn 35 40 45 Trp Glu Ala val His Lys Asp Cys Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn Glu 50 55 60 Asp Glu Glu Thr cys Thr 65 70

Claims (57)

1. λ

   * * » • · · · • · ··· ··

   - 91 - Patentansprüche: 1. Hypoallergenes Protein, bestehend aus mindestens einem von einem Allergen stammenden hypoallergenen Molekül, welches mit mindestens einem zweiten nicht-allergenen Protein oder Fragment desselben fusioniert oder konjugiert ist.
2. 2. Hypoallergenes Protein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine hypoallergene Molekül mit dem N-Terminus und/oder dem C-Terminus des mindestens einen zweiten Proteins oder Fragments davon fusioniert ist.
3. 3. Hypoallergenes Protein nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine zweite Protein ein Virus-, insbesondere RNA- oder DNA-Virus-, Bakterien-, Pilzoder Protozoen-Protein ist.
4. 4. Hypoallergenes Protein nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus-Protein ein Capsid-Protein ist.
5. 5. Hypoallergenes Protein nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Virus-Protein von einem humanpathogenen Virus, vorzugsweise einem Virus der Familie der Picornaviridae, stammt.
6. 6. Hypoallergenes Protein nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus der Familie der Picornaviridae von der Gattung der Rhinoviren, vorzugsweise von der Spezies der Human-Rhinoviren, insbesondere Human-Rhinovirus 89 oder 14, ist.
7. 7. Hypoallergenes Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Allergen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Hauptallergenen der Birkenpollen, insbesondere Bet v 1 und Bet v 4, den Hauptallergenen von Wiesenlieschgras-Pollen, insbesondere Phi p 1, Phi p 2, Phi p 5, Phi p 6 und Phi p 7, den Hauptallergenen der Hausstaubmilbe, insbesondere Der p 1 und Der p 2, den Hauptallergenen der Katze, Fel d 1 und Fel d 2, den Hauptallergenen der Biene, den Hauptallergenen der Wespe, Profilinen, insbesondere Phi p 12, den Oliven-Allergenen, insbesondere Oie e 1, den Parietaria judaica- NACHGEREO ;V ·· ·· ·· ·· ♦ · · ♦ · * # · · · · · · • · · ♦ · · · • · ·«·· ·#· · • · · · · ·· · «t ···· - 92 - Allergenen, insbesondere Par j 2, den Ambrosia-Allergenen, insbesondere Amb a 1, den Beifuß-Pollen-Allergenen, insbesondere Art v 1, und den Vorratsmilben-Allergenen, insbesondere Lep d 2.
8. 8. Hypoallergenes Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das hypoallergene Molekül eine verringerte IgE-Bindungskapazität aufweist.
9. 9. Hypoallergenes Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das hypoallergene Molekül eine verringerte T-Zell-Reaktivität aufweist.
10. 10. Hypoallergenes Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Allergen-Fragment zusammengesetzt ist aus den Aminosäuren 151 bis 177, 87 bis 117, 1 bis 30, 43 bis 70 oder 212 bis 241 von Phi p 1, den Aminosäuren 98 bis 128, 26 bis 58, 132 bis 162, 217 bis 246, 252 bis 283 oder 176 bis 212 von Phi p 5, den Aminosäuren 1 bis 34 oder 35 bis 70 der Kette 1 von Fel d 1, den Aminosäuren 1 bis 34, 35 bis 63 oder 64 bis 92 der Kette 2 von Fel d 1, den Aminosäuren 30 bis 59, 50 bis 79 oder 75 bis 104 von Bet v 1, den Aminosäuren 1 bis 33, 21 bis 51, 42 bis 73, 62 bis 103 oder 98 bis 129 von Der p 2, den Aminosäuren 1 bis 30, 20 bis 50, 50 bis 80, 90 bis 125, 125 bis 155 oder 165 bis 198 von Der p 7, den Aminosäuren 1 bis 35, 35 bis 72, 70 bis 100 oder 90 bis 122 von Der p 21, den Aminosäuren 1 bis 32, 15 bis 48 oder 32 bis 70 von Klon 30, den Aminosäuren 19 bis 58, 59 bis 95, 91 bis 120 oder 121 bis 157 von Alt a 1, den Aminosäuren 31 bis 60, 45 bis 80, 60 bis 96 oder 97 bis 133 von Par j 2, den Aminosäuren 1 bis 40, 36 bis 66, 63 bis 99, 86 bis 120 oder 107 bis 145 von Oie e 1, den Aminosäuren 25 bis 58, 99 bis 133, 154 bis 183, 277 bis 307, 334 bis 363, 373 bis 402, 544 bis 573, 579 bis 608, 58 bis 99, 125 bis 165, 183 bis 224, 224 bis 261, 252 bis 289, 303 bis 340, 416 bis 457, 460 bis 500 oder 501 bis 542 von Fel d 2, den Aminosäuren 19 bis 58, 52 bis 91, 82 bis 119, 106 bis 144 oder 139 bis 180 von Can f 2, den Aminosäuren 19 bis 56, 51 bis 90, 78 bis 118, 106 bis 145 oder 135-174 von Can f 1, den Aminosäuren 27 bis 70, 70 bis 100 oder 92 bis 132 von Art v 1, den Aminosäuren 31 bis 70, 80 bis 120, 125 bis 155, 160 bis 200, 225 bis 263, 264 bis 300 305 bis 350 oder 356 bis 396 von Amb a 1, den Aminosäuren 1 bis 34, 35 bis NACHGEREICHT ·· • ·· ·· · • · • · • · • · ··· ··

    93 74, 74 bis 115, 125 bis 165, 174 bis 213, 241 bis 280, 294 bis 333, 361 bis 400 oder 401 bis 438 von Alt a 6, den Aminosäuren 1 bis 40, 41 bis 80, 81 bis 120, 121 bis 160 von Alt a 2.
11. 11. Nukleinsäuremolekül, das für ein fusioniertes hypoallergenes Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 10 codiert.
12. 12. Vektor, umfassend ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 11
13. 13. Vektor nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein Expressionsvektor ist.
14. 14. Vektor nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein Bakterien-, Pilz-, Insekten-, Virus- oder Säuger-Vektor ist.
15. 15. Wirt, umfassend ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 11 oder einen Vektor nach einem der Ansprüche 12 bis 14.
16. 16. Antikörper, gerichtet gegen ein hypoallergenes Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 10.
17. 17. Antikörper nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein monoklonaler oder ein polyklonaler Antikörper ist.
18. 18. Vakzin-Formulierung, umfassend einen hypoallergenen Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder einen Antikörper nach Anspruch 16 oder 17.
19. 19. Formulierung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Formulierung weiters mindestens ein Adjuvans, einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten und/oder ein Konservierungsmittel umfasst.
20. 20. Formulierung nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Formulierung 10 ng bis 1 g, vorzugsweise 100 ng bis 10 mg, insbesondere 0,5 pg bis 200 pg des hypoallergenen Proteins oder Antikörpers umfasst. NACHGEREICH i ·· • ·· • ·· ·· ♦ · ·· • · • · 9 • · • • • • · • · · · • • • • • · ···· «ff • • • • • · • · • ·· ··· ·· • ·· ···· - 94 -
21. 21. Verwendung eines hypoallergenen Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder eines Antikörpers nach Anspruch 16 oder 17 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention einer Virusinfektion und/oder einer Allergie bei einem Menschen oder Tier.
22. 22. Verwendung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament weiters mindestens ein Adjuvans, einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten und/oder ein Konservierungsmittel umfasst.
23. 23. Verwendung nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament zur aktiven oder passiven Immunisierung verwendet wird.
24. 24. Verwendung nach Anspruch 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament 10 ng bis 1 g, vorzugsweise 100 ng bis 10 mg, insbesondere 0,5 pg bis 200 pg des hypoallergenen Proteins oder Antikörpers umfasst.
25. 25. Verwendung nach einem der Ansprüche 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament einem Individuum in der Menge von 0,01 mg/kg Körpergewicht bis 5 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise 0,1 mg/kg Körpergewicht bis 2 mg/kg Körpergewicht verabreicht wird.
26. 26. Verwendung eines hypoallergenen Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder eines Antikörpers nach Anspruch 16 oder 17 zur Diagnose einer Allergie und/oder einer Virusinfektion bei einem Individuum.
27. 27. Verwendung eines Virus-Capsid-Proteins von einem Virus der Familie der Picornaviridae als Träger bei Medikamenten oder Vakzinen oder zur Diagnostizierung einer Virusinfektion, insbesondere einer Erkältung.
28. 28. Verwendung nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus von der Spezies humaner Rhinoviren, insbesondere Hu-man-Rhinovirus 89 oder 14 ist. NACHGEREICHT

    ·· ·· • · · · • · · ··· · 95 • · ·· ····
29. 29. Hypoallergenes Molekül, das von Phi p 5 stammt und eine C-und/oder N-terminale Trunkierung hat und eine verringerte IgE-Bindungskapazität im Vergleich zum Wildtyp-Phl p 5 aufweist.
30. 30. Molekül nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass das trunkierte Molekül eine verringerte T-Zell-Reaktivität aufweist.
31. 31. Molekül nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass das trunkierte Phi p 5 aus den Aminosäuren 98 bis 128, 26 bis 58 oder 252 bis 283 von Phi p 5 zusammengesetzt ist.
32. 32. Molekül nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass das trunkierte Phi p 5 aus den Aminosäuren 132 bis 162, 217 bis 246 oder 176 bis 212 von Phi p 5 zusammengesetzt ist.
33. 33. Hypoallergenes Molekül, das von Fel d 1 stammt, eine C-und/oder N-terminale Trunkierung hat und eine verringerte IgE-Bindungskapazität aufweist.
34. 34. Molekül nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass das trunkierte Molekül eine verringerte T-Zell-Reaktivität aufweist.
35. 35. Molekül nach Anspruch 33 oder 34, dadurch gekennzeichnet, dass das trunkierte Fel d 1 aus den Aminosäuren 1 bis 34 oder 35 bis 70 der Kette 1 von Fel d 1, den Aminosäuren 1 bis 34, 35 bis 63 oder 64 bis 92 der Kette 2 von Fel d 1 zusammengesetzt ist.
36. 36. Hypoallergenes Molekül, welches von Der p 2 stammt, eine C-terminale und/oder N-terminale Trunkierung hat und eine verringerte IgE-Bindungskapazität aufweist.
37. 37. Molekül nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass das trunkierte Molekül eine verringerte T-Zell-Reaktivität aufweist.
38. 38. Molekül nach Anspruch 36 oder 37, dadurch gekennzeichnet, dass das trunkierte Der p 2 aus den Aminosäuren 1 bis 33, 21 bis 51, 42 bis 73, 62 bis 103 oder 98 bis 129 von Der p 2 zusammengesetzt ist. NACHGEREICHT ·· · ·· · ·« ·· ····+·· ···· • · · · · ···· «·· · ······ ·· ·· ··· ·· · «· ···· - 96 -
39. 39. Hypoallergenes Molekül, das von Der p 7, Der p 21, Klon 30, Alt a 1, Par j 1, Oie e 1, Fel d 2, Can f 1, Can f 2, Art v 1, Amb a 1, Alt a 2 oder Alt a 6 stammt, eine C-terminale und/oder N-terminale Trunkierung hat und eine verringerte IgE-Bindungskapazität aufweist und gegebenenfalls eine verringerte T-Zell-Reaktivität aufweist, wobei es vorzugsweise aus den Aminosäuren 1 bis 30, 20 bis 50, 50 bis 80, 90 bis 125, 125 bis 155 oder 165 bis 198 von Der p 7, den Aminosäuren 1-35, 36-70, 71-110, 111-145, 140-170, 175-205, 210-250 oder 250-284 von Der p 10, den Aminosäuren 1 bis 35, 35 bis 72, 70 bis 100 oder 90 bis 122 von Der p 21, den Aminosäuren 1 bis 32, 15 bis 48 oder 32 bis 70 von Klon 30, den Aminosäuren 19 bis 58, 59 bis 95, 91 bis 120 oder 121 bis 157 von Alt a 1, den Aminosäuren 31 bis 60, 45 bis 80, 60 bis 96 oder 97 bis 133 von Par j 2, den Aminosäuren 1 bis 40, 36 bis 66, 63 bis 99, 86 bis 120 oder 107 bis 145 von Oie e 1, den Aminosäuren 25 bis 58, 99 bis 133, 154 bis 183, 277 bis 307, 334 bis 363, 373 bis 402, 544 bis 573, 579 bis 608, 58 bis 99, 125 bis 165, 183 bis 224, 224 bis 261, 252 bis 289, 303 bis 340, 416 bis 457, 460 bis 500 oder 501 bis 542 von Fel d 2, den Aminosäuren 19 bis 58, 52 bis 91, 82 bis 119, 106 bis 144 oder 139 bis 180 von Can f 2, den Aminosäuren 19 bis 56, 51 bis 90, 78 bis 118, 106 bis 145 oder 135-174 von Can f 1, den Aminosäuren 27 bis 70, 70 bis 100 oder 92 bis 132 von Art v 1, den Aminosäuren 31 bis 70, 80 bis 120, 125 bis 155, 160 bis 200, 225 bis 263, 264 bis 300 305 bis 350 oder 356 bis 396 von Amb a 1, den Aminosäuren 1 bis 34, 35 bis 74, 74 bis 115, 125 bis 165, 174 bis 213, 241 bis 280, 294 bis 333, 361 bis 400 oder 401 bis 438 von Alt a 6, den Aminosäuren 1 bis 40, 41 bis 80, 81 bis 120, 121 bis 160 von Alt a 2 oder Fragmenten davon zusammengesetzt ist.
40. 40. Hypoallergenes Fusionsprotein, welches mindestens zwei Moleküle nach einem der Ansprüche 29 bis 39 umfasst, eine verringerte IgE-Bindungskapazität aufweist und gegebenenfalls eine verringerte T-Zell-Reaktivität aufweist.
41. 41. Fusionsprotein nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, dass die Moleküle in einer Reihenfolge miteinander fusioniert sind, die von der Reihenfolge der Fragmente im Wildtyp-Allergen verschieden ist, wenn die mindestens zwei Moleküle vom selben I NACHGEREICHT ' ·· · ·· · ·· ·· • ···· · · ι ·· · • · ······· · • · · · »··«· ··# · ····«· ·· ·· ··· ·· · ·· ···· - 97 - Allergen stammen.
42. 42. Nukleinsäuremolekül, das für ein hypoallergenes Molekül nach einem der Ansprüche 29 bis 39 oder für ein Fusionsprotein nach Anspruch 40 oder 41 codiert.
43. 43. Vektor, umfassend ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 42.
44. 44. Vektor nach Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein Expressionsvektor ist.
45. 45. Vektor nach Anspruch 43 oder 44, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein Bakterien-, Pilz-, Insekten-, Virus- oder Säuger-Vektor ist.
46. 46. Wirt, umfassend ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 18 oder einen Vektor nach einem der Ansprüche 43 bis 45.
47. 47. Antikörper, gerichtet gegen ein hypoallergenes Molekül nach einem der Ansprüche 29 bis 39 oder ein Fusionsprotein nach Anspruch 40 oder 41.
48. 48. Antikörper nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper ist.
49. 49. Vakzin-Formulierung, umfassend ein hypoallergenes Molekül nach einem der Ansprüche 29 bis 39, ein Fusionsprotein nach Anspruch 40 oder 41, oder einen Antikörper nach Anspruch 46 oder 47.
50. 50. Formulierung nach Anspruch 49, dadurch gekennzeichnet, dass die Formulierung weiters mindestens ein Adjuvans, einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten und/oder ein Konservierungsmittel umfasst.
51. 51. Formulierung nach Anspruch 49 oder 50, dadurch gekennzeichnet, dass die Formulierung 10 ng bis 1 g, vorzugsweise 100 ng bis 10 mg, insbesondere 0,5 pg bis 200 pg des hypoaller- I NACHGEREICHT ' ·· · ·· · 9* ♦· • ···· 9 · 9 9 9 · • · 9 · 9 9 * 9 9 9 • · 9 % 9·99· ··« 9 ······ 9 9 ·· ·9· 9· · ·· 9999 - 98 - genen Moleküls oder Antikörpers umfasst.
52. 52. Verwendung eines hypoallergenen Moleküls nach einem der Ansprüche 29 bis 39, eines Fusionsproteins nach Anspruch 40 oder 41, eines Nukleinsäuremoleküls nach Anspruch 42, eines Vektors nach einem der Ansprüche 43 bis 45 oder eines Antikörpers nach Anspruch 47 oder 48 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention einer Allergie bei einem Individuum.
53. 53. Verwendung nach Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament weiters mindestens ein Adjuvans, einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten und/oder ein Konservierungsmittel umfasst.
54. 54. Verwendung nach Anspruch 52 oder 53, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament 10 ng bis 1 g, vorzugsweise 100 ng bis 10 mg, insbesondere 0,5 pg bis 200 pg des immunogenen Moleküls, Nukleinsäuremoleküls, Vektors, Wirts oder Antikörpers umfasst.
55. 55. Verwendung nach einem der Ansprüche 52 bis 54, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament einem Individuum in der Menge von 0,01 mg/kg Körpergewicht bis 5 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise 0,1 mg/kg Körpergewicht bis 2 mg/kg Körpergewicht verabreicht wird.
56. 56. Verwendung nach einem der Ansprüche 52 bis 55, dadurch gekennzeichnet, dass das Individuum Gefahr läuft, eine Allergie zu bekommen.
57. 57. Verwendung eines hypoallergenen Moleküls nach einem der Ansprüche 29 bis 39, eines Fusionsproteins nach Anspruch 40 oder eines Antikörpers nach Anspruch 47 oder 48 zur Diagnostizierung einer Allergie oder Überwachung des Fortschritts einer Allergie-Therapie bei einem Individuum. I NACHGEREICHT