AT505251B1 - Verfahren zum umwandeln von xylose oder xylose enthaltenden substratlísungen - Google Patents

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AT505251B1 AT0084907A AT8492007A AT505251B1 AT 505251 B1 AT505251 B1 AT 505251B1 AT 0084907 A AT0084907 A AT 0084907A AT 8492007 A AT8492007 A AT 8492007A AT 505251 B1 AT505251 B1 AT 505251B1
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Description

tere:*sä'is patemt AT 505 251 B1 2009-09-15
Beschreibung [0001] Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Umwandeln von Xylose oder Xylose enthaltenden Substratlösungen, z.B. Hydrolysaten von Lignozellulosen, in Ethanol mittels Saccharomyces cerevisiae.
[0002] Im Bestreben neue Energiequellen aufzufinden, wird Bioethanol als wichtige, CO2 neutrale Alternative zu den heutzutage auf Erdöl basierenden Treibstoffen erachtet. Ethanol wird heutzutage hauptsächlich durch Vergärung von Glukose, gewonnen aus Stärke, die in pflanzlichen Materialien wie Weizen oder Mais enthalten ist, hergestellt. Alternativ wird auch Saccharose aus Zuckerrüben oder Zuckerrohr als Substrat für die Ethanolproduktion eingesetzt. Allerdings ist land- u. forstwirtschaftliches Abfallgut ein deutlich billigerer Grundstoff zur Bioethanolherstellung. Im Gegensatz zu der heute hauptsächlich verwendeten Biomasse mit hohem Glukosegehalt können diese pflanzlichen Abfallstoffe bis zu 30 % der Pentose Xylose enthalten. Die wirtschaftliche Verwendung der Xylosefraktion von lignozellulosischem Ausgangsmaterial ist für die Wirtschaftlichkeit der Ethanolproduktion kritisch. Der hauptsächlich für die industrielle Vergärung zu Bioethanol eingesetzte Mikroorganismus, nämlich Saccharomyces cerevisiae, kann leider in seiner Wildtypform Xylose nicht verwerten. Im Vergleich zu anderen Hefen, die zur Xylose-Vergärung in der Lage sind, wie zum Beispiel Pichia stipitis, Candida shehatea oder Candida parapsilosis, fehlt der Hefe Saccharomyces cerevisiae ein funktionaler Stoffwechselweg zur Assimilation von Xylose. Dieser Stoffwechselweg besteht aus dem Enzym Xylose Reduktase (XR) zur Reduktion von Xylose zu Xylit und der Xylit Dehydrogenase (XDH) zur Umwandlung von Xylit zu Xylulose. Ebenso ist bekannt, dass S. cerevisiae eine wenig wirksame Expression des Gens für Xylulose Kinase (XK) aufweist. XK ist für die Phosphorylierung von Xylulose zu Xylulose 5-Phosphat, welches dann in den Pentose-Phosphat Zyklus eintritt, notwendig.
[0003] Die bisher hauptsächlich verwendete wissenschaftliche Strategie zur Ermöglichung der Ethanolfermentation aus Xylose durch Saccharomyces cerevisiae war die heterologe Expression von Pichia stipitis Genen, die für Xylose Reduktase und Xylit Dehydrogenase kodieren, gemeinsam mit einer homologen Überexpression des Gens für Xylulose Kinase aus S. cerevisiae. Die ersten Stämme, die diese Enzyme beinhalteten (Ho et al. 1998, Eliasson et al. 2000, Toivari et al. 2001), zeigten eine Xylose-Umwandlung, jedoch war die Ethanol-Ausbeute in Vergleich zum theoretisch möglichen Wert und der Nebenproduktbildung gering, wobei hauptsächlich die Xylit- und Glycerin-Ausscheidung hoch war.
[0004] Seit damals wurden große Anstrengungen unternommen, mittels gezielter Veränderungen von Stoffwechselwegen („metabolic engineering") in der rekombinanten S. cerevisiae die Bildung von Ethanol zu erhöhen und die Ausbeute von Xylit und Glycerin zu verringern. (Übersichtsartikel: Jeffries 2006, Hahn-Hägerdal et al. 2007) Eine Hauptursache für die niedrigen Ethanolausbeuten liegt in der fehlenden Co-Faktor Recyclierung zwischen den Enzymen Xylose Reduktase und Xylose Dehydrogenase (Kötter und Ciriacy 1993). In den meisten Fällen ist XR ein NADPH spezifisches Enzym. Xylose Reduktasen aus einige Spezien wie Pichia stipitis, Candida sheatae, Pachysolen tannophilus und auch Candida tenuis zeigen duale Co-Faktor Spezifitäten, aber NADPH ist nach wie vor bevorzugt. Die einzige Xylose-Reduktase, die NADH bevorzugt, ist von C. parapsiolis (Lee et al. 2003). XDH ist immer NAD+ spezifisch. Daher wird in den ersten beiden Schritten des Xylose Stoffwechsels in der gentechnologisch hergestellten Hefe NADH akkumuliert und NADPH verbraucht. Als Reaktion der Zelle wird Xylit ausgeschieden, die Glycerin-Bildung angehoben und dadurch die Ethanol-Ausbeute verringert.
[0005] Verschiedene gentechnologische Strategien haben geholfen, dieses Co-Faktor-Ungleichgewicht zu beheben. Der Zusatz von externen Elektronenakzeptoren verdoppelte die Ethanol-Bildung und unterdrückte die Xylit-Produktion (Wahlbom et al. 2001). Dieses Ergebnis zeigt das hohe Verbesserungspotential in der Ethanolausbeute durch verbesserte NADH-Reoxidation, allerdings ist der industrielle Einsatz von Elektronenakzeptoren in der Fermentation nicht wirtschaftlich. Die Integration von Transhydrogenasen in Saccharomyces cerevisiae 1 /15 &t£S!iÄ»hi5 AT 505 251 B1 2009-09-15 zeigte, dass die Co-Faktor Interkonversion hauptsächlich von NAD+ und NADPH zur Bildung von NADH und NADP+ gesteuert wurde und nicht umgekehrt. Jeppsson et al. (2002, 2003a) verringerten den Fluss durch den NADPH-bildenden Teil des Pentose Phosphat Zyklus, was die Ethanol-Ausbeute um 32 % anhob, aber die Xylose-Aufnahmerate deutlich absenkte. Diese wurde durch Überexpression von Xylose Reduktase (Jeppson et al. 2003b) wiederhergestellt, allerdings sank dadurch die Ethanolausbeute wieder etwas ab. Verho et al. (2003) erhöhte die Ethanolbildung durch Expression von NADP+ spezifischen D-Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase und Deletion der NADPH bildenden G6PDH, allerdings war die Xylitbildung nach wie vor vergleichsweise hoch. Um die Co-Faktor-Verwendung zu verbessern, modifizierte Roca et al. (2003) die Ammoniak-Assimilation in rekombinanter S. cerevisiae durch Entfernung des Gens für die NADPH-abhängige Glutamat-Dehydrogenase und Überexprimieren der Gene für entweder NADH-abhängige Glutamat Dehydrogenase oder Glutamat Synthase zusammen mit Glutamin Synthase. Die Ethanol-Ausbeute in einer Co-Fermentation von Glucose und Xylose wurde um 16-19 % angehoben, was hauptsächlich durch die Reduktion der Xylitbildung um 44 % erzielt wurde.
[0006] Weiters ist es bereits bekannt, einen Phosphoketolase Zyklus in Saccharomyces cerevisiae einzubauen, um NADH zu reoxidieren. Durch die Kombination des Phosphoketolase-Zyklus mit einer Mutation von ald6, was die Acetat-Bildung reduzierte, wurde ein Stamm erzielt, der eine 20 % gesteigerte Ethanol-Ausbeute und eine 40 % höhere Xylose Fermentationsrate zeigt (Sonderegger et al. 2004).
[0007] In Bakterien und dem anaeroben Pilz Piromyces sp. wird Xylose Isoermase (XI) expri-miert, welche Xylose unter Vermeidung des Co-Faktor Ungleichgewichts direkt zu Xylulose umwandelt. Während die Expression von bakterieller XI nur zu einem Stamm mit einer niedrigen Ethanol-Produktion aus Xylose führte, (Wallfridsson et al. 1996) konstruierte Kuyper et al. (2005) einen Saccharomyces cerevisiae Stamm, der XI aus dem Pilz Piromyces exprimierte. Ein Stamm, der die XI Expression mit einer Überexpression von Xylulose Kinase und Enzymen des Pentose Phosphat Zykluses mit der Unterdrückung der GRE3 Aktivität in Saccharomyces cerevisiae kombiniert, zeigt hohe Ethanol-Ausbeuten, niedrige Xylit-Ausbeuten und anaerobes Wachstum auf Xylose hältigen Medien. Die guten Ergebnisse in der Ethanolausbeute unter Expression der redoxneutralen XI verdeutlichen die Wichtigkeit einer Abstimmung der Cofak-torspezifität von XR und XDH, um eine Cofaktorrecyklierung zu ermöglichen. Ein rekombinanter Hefestamm mit Expression von XR und XDH zeigt höhere Xyloseaufnahmeraten als ein Stamm mit Integration der obengenannten XI ohne andere gentechnologische Veränderung, ausgenommen der XK-Überexpression (Karhumaa et al. 2007).
[0008] Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass verschiedenste Strategien signifikante aber nicht zufriedenstellende Verbesserungen in der Ethanolausbeute lieferten. Die Vorhersage der erzielbaren Effekte ist problematisch, wie die Diversität in den Resultaten zeigt.
[0009] In Petschacher, B and B. Nidetzky (2005) wird die Charakterisierung vom Wildtyp und mehreren Varianten der Xylosereduktase aus Candida tenuis unter Bedingungen im Reagenzglas beschrieben, welche bezüglich der Konzentrationen an NADPH und NADH jenen in der lebenden Hefezelle nachempfunden sind. Es sind dabei auch die Varianten KSN->RSD unter den getesteten Enzymen. Obwohl die veröffentlichten Resultate positive Effekte vom KSN->RSD auf die Fermentation von Xylose erwarten lassen, ist aus dem Stand der Technik nicht klar und auch nicht nahe liegend, welche Effekte dies exakt sein werden.
[0010] Der vorliegenden Erfindung liegt nun die Aufgabe zu Grunde ein Verfahren und einen Hefestamm zum Umwandeln von Xylose oder Xylose enthaltenden Substraten in Ethanol mittels Saccharomyces cerevisiae zu entwickeln, mit welchem eine entsprechend hohe Ausbeute von Ethanol bezogen auf Xylose erzielt wird.
[0011] Erfindungsgemäß wird dies dadurch erreicht, dass zur Umwandlung ein rekombinanter Stamm von Saccharomyces cerevisiae eingesetzt wird, welcher das Gen für eine Mutante der pilzlichen Xylose Reduktase enthält, in der ein Sequenzmotiv Lys-Ser-Asn gegen Arg-Ser-Asp ausgetauscht wurde und die unter der Kontrolle eines starken konstitutiven Promotors expri- 2/15 tarssÄiies patemt AT 505 251 B1 2009-09-15 miert wird, und welcher den Wildtyp der Xylitdehydrogenase exprimiert, wobei der Hefestamm wenigstens eine zusätzliche Genkopie des Gens für Xylulosekinase enthält.
[0012] Diese Erfindung ergibt einen direkten Weg zur Behebung des Co-Faktor Ungleichgewichts zwischen XR und XDH durch Expression einer Xylose Reduktase Mutante mit einer Co-Faktor-Verwendung, welche eine Bevorzugung von NADH aufweist und damit einen höheren Grad des Co-Faktor Recyclings zwischen der XR- und der XDH-katalysierten Reaktion ermöglicht.
[0013] Vorteilhafterweise wird als pilzliche Xylose-Reduktase jene von Candida tenuis eingesetzt. Damit deckt die Erfindung die Expression einer Candida tenuis Xylose Reduktase K274R/N276D Mutante (Xylose Reduktase aus Candida tenuis, in der Lysin 274 gegen Arginin und Asparagin 276 gegen Aspartat ausgetauscht ist) und einer Galactocandida mastotermitis Xylit Dehydrogenase zusammen mit der Überexpression des Xylulose Kinase Gens aus S. cerevisiae ab. Die K274R/N276D Mutante hat sich dabei als beste Mutante aus einem ganzen Satz von mittels rationalen Designs entworfenen Mutanten, die in einer gründlichen Studie der Möglichkeiten des Wandels der Co-Faktor-Spezifität von CtXR (Candida tenuis Xylose Reduktase) von NADPH zu NADH geschaffen wurde (Petschacher et al. 2005). Die Candida tenuis Xylose Reduktase wurde als guter Startpunkt aufgrund der dualen Coenzym Spezifität der Wildtyp-Form ausgewählt. Die Coenzym Präferenz der K274R/N276D Mutante, die aufgrund der kinetischen Daten berechnet wurde, zeigt eine fünffache Bevorzugung von NADH im Vergleich zu einer 33-fachen Bevorzugung des NADPH in der Wildtyp-Form. Die Daten von einer in vitro Konversion einer Mischung von beiden Co-Faktoren und Xylose bei in vivo Konzentrationen weisen auf eine ähnliche Verwendung von NADPH und NADH hin (Petschacher et al. 2005). Da das Ausmaß des positiven Effekts der Integration dieser Mutante in Hefe schwer vorauszusehen war, konnte dieser nur nach der Konstruktion des rekombinanten Hefestammes BP10001 verifiziert werden, Die Ethanol-Ausbeute auf Xylose in einer Batch-Fermentation konnte um 43% erhöht werden, im Vergleich zu dem Stamm ΒΡ000, welcher das Candida tenuis XR Wildtyp-Enzym enthält.
[0014] Es wurde schon versucht in dem Stamm TMB3001 Pichia stipitis XR durch eine K274M Mutante zu ersetzen, die einen fünffach erhöhten Km-Wert für NADPH aufweist. Die Ethanol Fermentation verbesserte sich auf das 1, 2-fache von 0, 29 auf 0, 36 g/g Xylose in einer Batch-Fermentation auf 50g/L Xylose bei einem Kohlenstoffwiederfindungsrate von 99%.
[0015] Watenabe et al. (2004) schließlich haben den Wechsel der Cofaktor-Präferenz von XDH von NAD+ - auf NADP+ - spezifisch berichtet, jedoch ist nicht bekannt, dass dieses Enzym in S. cerevisiae inkludiert wurde.
[0016] Figur 1 zeigt schematisch die Cofaktorrecyklierung in den beiden ersten Schritten des Xylosemetabolismus von rekombinanter Hefe mittels NADH spezifischer XR.
[0017] Figur 2 zeigt im Vergleich die Gärungskurven des Stammes ΒΡ000 (Wild Typ XR) und BP10001 (erfindungsgemäß mit der K274R/N276D XR Mutante versehene Saccharomyces cerevisiae), wobei Diagramm A die Fermentation von ΒΡ000 und B das Diagramm der Gärung von BP10001 zeigt. In den Abbildungen bedeuten ausgefüllte Quadrate Xylose; Dreiecke Ethanol; Kreise Xylit; Sternchen Glycerin; und offene Vierecke Acetat. Das Zelltrockengewicht war bei etwa 1,5 g/L.
[0018] In den nachfolgenden Beispielen wird der Erfindungsgegenstand näher erläutert, wobei diese Beispiele nicht limitierend sind.
STÄMME UND PLASMIDE
[0019] Als bakterieller Wirt für das Subklonieren wurde der Escherichia coli-Stamm TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) verwendet. Die Matrizenplasmide für die Amplifizierung von XR waren pET11-CtXRWt, das das Xylose-Reduktase Gen von Candida tenuis (CBS4435, Hacker et al. 1999) trägt und pET11-CtXRDm welches das K274R/N276D mutante Gen von C. tenuis Xylose Reduktase trägt (Petschacher 2005). Das Galactocandida mastotermitis XDH Gen 3/15 wurde von pBTad (Habenicht 1999) amplifiziert. Das Plasmid pRS416GPD (Mumberg et al. 1995, ein Geschenk von Harald Pichler, Grazer Technische Universität) wurde für die Konstruktion der Genkassetten mit einem Hefepromotor und -terminator verwendet. Ylp5 (gekauft bei DSMZ, Braunschweig, Deutschland) wurde für die Konstruktion der Hefe integrierenden Plasmide verwendet, welche in Saccharomyces cerevisiae CEN. PK 113-5D transformiert wurden (MATa MAL2-8c SIC2 ura3, ein Geschenk von Jochen Förster, Fluxome Sciences, Dänemark). Für die Isolation der genomischen DNA wurde der Saccharomyces cerevisiae Stamm CEN. PK 113-7-D (MATa MAL2-8c SUC2, ein Geschenk von Jochen Förster, Fluxome Sciences, Dänemark) verwendet.
MEDIEN
[0020] Die transformierten Bakterien wurden auf Luria-Bertani Medium Agar Platten mit 112 mg/L Ampicillin selektiert. Die Hefezellen für die Transformation wurden in YPD Medium gezüchtet. Die Hefetransformanten wurden auf synthetischen Hefe-komplett-Medium-Agar-Platten selektiert, die aus Stickstoffbasis („yeast nitrogen base", Sigma, St. Louis, MO, USA) mit synthetischem Drop-out Medium Zusatz ohne Uracil (Sigma, St. Louis, MO, USA) hergestellt wurden. Für eine Sauerstoff begrenzte Batch-Fermentation wurde ein definiertes Mineralmedium ausgewählt, welches Vitamine und Spurenelemente (Jeppson 2006) enthält. Das Medium wurde mit 0, 01 g/L Ergosterol und 0, 42 g/L Tween 80, gelöst in kochendem 96 Vol. -% Ethanol und mit 100 mM Citrat Puffer pH 5, 5 ergänzt.
KONSTRUKTION VON HEFEINTEGRATIONSVEKTOREN WELCHE DIE GENE FÜR WTXR ODER DMXR, XDH UND XK ENTHALTEN
[0021] Restriktionsenzyme wurden von MBI Fermentas (ST. Leon-Roth, Deutschland) oder New England Biolabs (Beverly, MA, USA) bezogen, die Pfu-Polymerase von Promega (Madi-son, Wl, USA). Für die Plasmid-Herstellung wurde ein Quiaprep Spin Miniprep Kit von Quiagen (Quiagen GmbH, Hilden, Deutschland) verwendet und ein QUIAquick Gel Extraktions-Kit wurde für die DNA-Extraktion aus Agarose angewandt. Die Handhabung und Bearbeitung von Nukleinsäuren wurde gemäß Standardtechniken durchgeführt.
[0022] In einem ersten Schritt wurden die promotorlosen Gene der Candida tenuis Wildtyp und mutanten Xylose Reduktase, der Galctocandida mastotermitis XDH und der Saccharomyces cerevisiae XK von den Matrizen-Plasmiden pET11-CtXRWt, pET11-CtXRDm, pBTad und im Fall der XK von genomischer Saccharomyces cerevisiae DNA unter Verwendung von Primern mit einer BamHI Restriktionsstelle und reversen Primern mit einer Sali Restriktionsstelle amplifiziert, wobei beide Schnittstellen an dem 5'-Ende der Primer angefügt wurden (siehe Tabelle 1). Diese PCR-Produkte wurden mit BamHI und Sali verdaut und in die multiple Klonierungsstelle von pRS416GPD kloniert, welche zwischen dem GPD Promotor und dem CYC1 Terminator angeordnet ist. Dadurch wurden für XRWt, XRDm, XDH und XK Vektoren mit einer Genkassette konstruiert, welcher den starken konstitutiven Hefe GPD Promoter, das Zielgen und den CYC1 Terminator aufweist. Die korrekte Insertierung wurde durch Sequenzierung verifiziert. In einem zweiten Schritt wurden diese Genkassetten mit Primern amplifiziert, welche Restriktionsstellen an den 5'-Enden aufweisen, die in Ylp5 nur einmalig Vorkommen (siehe Tabelle 1). Es wurde zuerst die XK Genkassette in die Aatll Stelle kloniert, was den Vektor YK ergab. Als nächstes wurde die XDH Genkassette in die C1al Stelle von YXKD1 insertiert, was zu YGmXDH/XKS1 führte und schließlich wurde die Genkassette für entweder XRWt oder XRDm in die EcoRI Stelle von YGmXDH/XKS1 kloniert, was zu YCtXRWt/GmXDH/XKS1 und YCtXRDm/GmXDH/XK führte. Um die richtige Ausrichtung aller integrierter Genkassetten in jedem Schritt sicher zu stellen, wurden jene Plasmide für den weiteren Gebrauch ausgewählt, die positive PCR-Resultate ergaben, wenn ein Vorwärts-Primer verwendet wurde, der homolog zu einer Sequenz strangaufwärts der Klonierungsstelle im Zielvektor war, und eine Revers-Primer, der homolog zu einem Teil des Genes war.
[0023] Tabelle 1: Klonierungsstrategie für die Konstruktion von Hefeintegrationsplasmiden Y CtXR Wt/G mXD H/XKS1 und YCtXRDm/GmXDH/XKS1
AT 505 251 Bl 2009-09-15 tatictecfe
pittlM
Stufe Ziel-Sequenz Matrizen-Plasmid Primer Ziel-Plasmid Restriktions Resultierendes Plasmid (Restriktionsstellen unterstrichen) stelle 1 CtXRWtGen pET 11 -CtXRWt pET11- Fwd: 5'-GGTGGTGGATCCATGAGCGCAAGT ATCCCAGAC -3' Rev: 5'CT AGT G GGTCG ACTT AAACGAAGATT pRS416GPD BamHI.Sall pRS416G PD-CtXRWt CtXRDmGen CtXRDm GGAATGTTGTC -3' pRS416GPD BamHI, Sali pRS416GPD-CtXRDm GmXDH Gen pBTad Fwd:5'-GGTGGTGGATCCATGTCTACTCCTG AAAACTTATCT -3' Rev: 5'-CTAGTGGGTCGACTTACTCAGGGCC pRS416GPD BamHI, Sali pRS416GPD-GmXDH XKS1 Gen genomische S. cervisiae GTTAATGATG -3' Fwd: 5'-GGTGGTGGATCCATGTTGTGTTCA pRS416GPD BamHI, Sali pRS416GPD-XKSI DNA GTAATTCAGAGA -3' Rev: 5-GGTGGTGT CG ACTT AG AT G AGAGT CTTTTCCAGTTC -3' 2 Genkassette" XKS1 pRS416GPD-XKSI Fwd: 5-CATGGTGACGTCAGTTT AT CATT AT CAATACTCGCCATTTC-3' Rev: 5'-GGTGGTGAATTCGGCCGCAAATTAA AGCCTTCG-3' YiP5 Aatll YXKS1 3 Genkassette pRS416GPD-GmXDH Fwd: 5-CATGGT ATCGAT AGTTT AT CATT AT YXKS1 CM YGwXDH/XKSI GmXDH CAATACTCGCCATTTC-3'Rev: 5'- GGTGGTATCGATGGCCGCAAATTAA AGCCTTCG-3'
Genkassette CtXRWt pRS416G PD-CtXRWt Fwd: 5-GGTGGTGAATT CAGTTT AT CATT AT CAATACTCGCCATTTC-3' Rev: 5-GGTGGTGAATTCGGCCGCAAATTAA YGmXDH/XKS1 EcoRI Y CtXRWt/G mXH D/XKS1 Genkassette CtXRDm pRS416GPD-CtXRDm AGCCTTCG-3' YGmXDH/XKS1 EcoRI YCtXRD m/G mXH D/XKS1 a Genkassetten enthalten S. cerevisiae GPD Promoter - Zielgen -S. cerevisiae CYC1 Terminator 5/15 &t£S!iÄ»hi5 AT 505 251 B1 2009-09-15
TRANSFORMATION
[0024] Die Transformation von Plasmiden in E. coli TOP 10 Zellen wurde durch Elektroporation durchgeführt. Die in die Hefe zu integrierenden Plasmide YCtXRWt/GmXDH/XKS1 und YCtXRDm/GmXDH/XKS1 wurden mit Sdal innerhalb des UFJA3 Gens geschnitten. Der lineari-sierten Vektoren wurden für die Transformation von Saccharomyces cerevisiae CEN. PK 113-5D durch die Lithium Acetat-Methode (Gietz 1995) verwendet. So wurden der Stamm ΒΡ000, der die Wildtyp-CtXR exprimiert, und der Stamm BP10001, der die CtXR K274R/N276D Mutante exprimiert, gewonnen. Die funktionale Integration der XR, XDH und XK Genkassetten wurde durch in vitro Vergleich von XR, XDH und XK Aktivitäten aus Rohextrakten aus ΒΡ000 und BP10001 zu den Aktivitäten des Saccharomyces cerevisiae Cen. PK 113-7D Extraktes verifiziert. Die Stämme wurden in 15 % Glycerin bei -80°C gelagert. BATCH-FERMENTATION: [0025] Die Batch-Fermentationen wurden in mit Schikanen versehenen 300 mL Schüttelkolben ausgeführt, die mit einem Gummistopfen dicht verschlossen waren. Zwei Glasröhrchen wurden in die Stopfen eingeführt, wobei eines mit einem Ventil für das Durchspülen mit Stickstoff versehen ist. Das andere wurde mit einem am Ende verschmolzenem Schlauch abgeschlossen, welcher mit einem Schlitz in der Wandung zum Auslass der Fermentationsgase versehen ist. In den Kolben wurde ein Magnet eingesetzt.
[0026] Die Zellen für das Inokulum wurden in Minimalmedium mit 20g/L Glukose über Nacht bei 30°C, 110 U/min. gezüchtet, danach 10 min. bei 5000 rcf (relative Zentrifugenkraft) zentrifugiert und mit 0, 9 % NaCI zweimal gewaschen.
[0027] Die Zellen wurden in Schüttelkolben, die mit 280 mL Minimalmedium mit 15g/L Xylose gefüllt waren, transferiert, und ergaben eine End-OD600 von etwa 4. Das Medium in den Flaschen wurde mit Stickstoff 5. 0 15 min. vor und 5 min. nach der Inokulation gespült. Die Kolben wurden versiegelt und bei 30°C und bei 100 U/min. inkubiert. Die Proben wurden nach dem Mischen des Kolbeninhalts auf einem Magnetrührer unter Stickstoffspülung gezogen. Die Proben für die HPLC-Messungen wurden durch einen Satorius Minisart RC4 Filter (Satorius, Göttingen, Deutschland) gefiltert und bei -20°C für die weiteren Analysen gelagert. Die Batch-Fermentationen wurden für jeden Stamm in dreifacher Ausführung vorgenommen.
ANALYSEN
WACHSTUM UND ZELL-TROCKENGEWICHT
[0028] Das Zellwachstum wurde optisch bei 600 nm beobachtet. Das Zell-Trockengewicht wurde durch Filtern von 50 mL Fermentations-Brühe durch einen vorgetrockneten und gewogenen 0,45 pm Celluloseacetat Membranfilter (Satorius) und Trocknung desselben übernacht im Trockenschrank bei 105°C bestimmt.
EXTRAZELLULÄRE PRODUKTE
[0029] Glukose, Xylose, Xylit, Glycerin und Acetat wurden unter Verwendung eines Merck-Hitachi LaChrome HPLC Systems mit einer Aminex HPX-87H Säule (Biorad, Richmond, CA, USA) und einem Merck L-7490 RI Detektor bestimmt. 5mM Schwefelsäure wurde als Eluens mit einer konstanten Fließrate von 0, 6 mL/h und 65°C Betriebstemperatur verwendet.
ENZYM AKTIVITÄTEN
[0030] Zur Messung der Enzym-Aktivitäten wurden die Zellen aerob bei 120 U/min. und 30°C in definiertem Minimalmedium mit 20 g/L Glukose und 20 g/L Xylose als Kohlenstoffquelle bis zu einer OD6oo von 6 angezüchtet. Die Zellen aus 3 mL der Fermentationsbrühe wurden durch Zentrifugation bei 5000 rcf für 10 min. gewonnen und anschließend mit 250 pL des Y-PER Reagens (Pierce, Rockford, IL, USA) gemäß der Bedienungsanleitung lysiert. Der Proteingehalt 6/15 tarssÄiies patemt AT 505 251 B1 2009-09-15 des Rohextraktes wurde unter Verwendung einer Proteinbestimmung nach Bradford (Roti-Quant, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland) bestimmt, wobei BSA Fraktion 5 als Standard verwendet wurde. Die Xylose-Reduktase Aktivität wurde durch Anfangsgeschwindigkeitsmessung in einem photometrischen Untersuchungsansatz, der 700 mM D-Xylose und 300uM oder 7μΜ von entweder NADH oder NADPH enthielt, wie früher beschrieben (Petschacher 2005) ermittelt. Die Xylit Dehydrogenase Aktivität wurde gemäß einem veröffentlichten photometrischen Versuch (Mayer 2002) der 150 mM Xylit und 2mM NAD+ enthielt, gemessen. Die Xylulo-se Kinase Aktivität wurde wie bereits beschrieben (De Luccio et al. 2005) bestimmt. Der Standard Messansatz enthielt 5 mM ATP und 4. 3 mM D-Xylulose. Blindwerte aus der XDH Aktivität mit Xylulose wurden abgezogen.
BERECHNUNGEN
[0031] Für die Kohlenstoff-Wiederfindungsberechnungen wurde angenommen, dass 1 Mol C02 für jedesm Mol Ethanol und Acetat gebildet wird. Die Erträge wurden aus Proben, die nach 83 Stunden der Fermentationszeit genommen wurden, berechnet.
ERGEBNISSE
STAMMKONSTRUKTIONS- UND AKTIVITÄTSMESSUNGEN
[0032] Es wurden zwei rekombinante Saccharomyces cerevisiae Stämme konstruiert, die für die Ermöglichung der Xylose-Verwertung biotechnologisch verändert sind. Einfache Kopien für die Candida tenuis Xylose Reduktase und Galactocandida mastotermitis Xylit Dehydrogenase wurden in die URA3-Stelle des Hefegenoms zusammen mit einer zweiten Kopie des homologen Xylulose Kinase Gens insertiert. Im Stamm ΒΡ000 wurde die Wildtypform von CtXR eingebracht, wogegen im Stamm BP10001 eine K274R/N276D Mutante dieses Enzyms eingebracht wurde. Die Mutante CtXR zeigt einen Wechsel des Co-Faktor-Gebrauchs von einer 33-fachen Bevorzugung von NADPH in der Wildtypform zu einer 5-fachen Bevorzugung von NADH im mutanten Enzym, berechnet anhand der enzymatischen Effizienz. Der Wechsel der Co-Faktor-Präferenz beruht auf einer drastischen 43-fachen Erhöhung des Km-Wertes für NADPH in der Mutante und der 5-fachen Anhebung des Xylose Km-Wertes während diese Werte im Vergleich zwischen Wildtyp und Mutante für die NADH-Anwendung im wesentlichen unverändert blieben. Die funktionale Integration von diesen Genen ist durch die Fähigkeit aerob auf Xylose zu wachsen für beide Stämme verifiziert worden. Weiters wurde die Expression der Xylose Reduktase, der Xylit Dehydrogenase und der Xylulose Kinase durch die Messungen von photometrischer Aktivität aus Rohextrakten von Zellen, die aerob auf Glucose und Xylose gezüchtet wurden, validiert (siehe Tabelle 2). Die Messungen bei niedrigerNADPH Konzentration (7mM) bestätigen die Integration der Mutante, die einen höheren Km Wert für NADPH und daher niedrigere Aktivitäten (16% von v, max) bei niedrigen NADPH-Werten besitzen als der Wildtyp (79% von vmax).
[0033] Tabelle 2: XR und XDH Aktivitäten in Rohextrakten von ΒΡ000 und BP10001
Stamm XR Aktivität U/mga XDH Aktivität U/mg XK Aktivität U/mg ΒΡ000 NADH 0. 15±0. 00b 1. 1±0. 1 1. 7±0. 2 NADPH 0. 18±0. 00 BP10001 NADH 0. 26±0. 00 1. 3±0.1 2. 4±0. 1 NADPH 0. 33±0. 00 Cen. PK 113- NADH n. d. n. d. 0. 14±0. 04 7/15 tereöiisd'is AT 505 251 B1 2009-09-15
7D NADPH 0. 008±0. 003 a gemessen bei 350 μΜ Cofaktor and 700 mM Xylose b Abweichungen vom Mittelwert für Messungen mit Zellen aus zwei verschiedenen Schüttelkolbenansätzen sind angegeben [0034] Batch-Fermentationen von ΒΡ000 und BP10001 wurden in Sauerstoff limitierten Schüttelkolben mit definiertem Mineralmedium mit 15 g Xylose pro Liter ausgeführt. Die Flaschen wurden auf eine OD6oo von etwa 4 inokuliert. Tabelle 3 zeigt die Xylose-Aufnahmerate und die Erträge von Ethanol, Xylit, Glycerin und Acetat berechnet in Gramm pro Gramm Xylose. Die Kohlenstoff-Bilanz konnte auf 93 bzw. 94 % geschlossen werden, wobei das gebildete C02 aus Ethanol und Acetat berechnet wurde.
[0035] Tabelle 3: Ergebnisse von Sauerstoff-Iimitierten Batch-Fermentationen von zwei rekom-binanten S. cerevisiae Stämmen, die sich in ihrer Co-Faktor Spezifität unterscheiden, auf 20 g/L Xylose.
Stamm YEthanol YXylit YGlycerin YAcetat C-Wiederfindung ΒΡ000 0. 24±0. 00 0. 35±0. 002 0. 091 ±0. 002 0. 019±0. 002 93% BP10001 0. 34±0. 01 0. 17±0. 01 0. 063±0. 002 0. 031±0. 002 94% [0036] Die Werte wurden für einen Zeitraum von 83 Stunden aus in 3-facher Ausfertigung ausgeführten Fermentationen berechnet, wobei die Abweichung vom Durchschnittswert angezeigt ist. Die Beträge sind in Gramm pro Gramm Xylose angegeben. Bezüglich der Kohlenstoff-Bilanz wurde davon ausgegangen, dass ein Mol C02 pro Mol Ethanol oder Acetat gebildet wird.
[0037] Bei allen bisher bekannten Xylose fermentierenden rekombinanten Saccharomyces cerevisiae Stämmen wurde XR und XDH von Pichia stipitis integriert. In dem vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren bzw. dem erfindungsgemäßen Hefestamm wurden als erstes Gene für Enzyme von anderen Organismen nämlich Xylose Reduktase von Candida tenuis und Xylit Dehydrogenase von Galactocandia mastotermitis exprimiert. Die Expression der CtXR Doppel-Mutante K274R/N276D anstatt dem Wildtyp-Enzym führt zu einem Xylose fermentierenden Hefestamm Saccharomyces cerevisiae BP 10001. Mit der Herstellung von 0, 34 g Ethanol pro g Xylulose zeigte dieser Stamm einen 43 %-igen Anstieg in der Ethanolaubeute aus Xylose im Vergleich zu dem Stamm ΒΡ000, der die Wildtyp CtXR exprimierte, was eine der höchsten Steigerungen ist, die in der Literatur für Strategien, zur Anhebung der Ethanol-Im Produktion gefunden wurden. Sie wird durch den Abbau der Co-Faktor balance im Xylose-Metabolismus erzielt. Die Xylit-Produktion konnte deutlich um 53 % auf 0,17 g/g und die Glycerin-Produktion um 30 % auf 0,063 g/g reduziert werden. Die Acetat Bildung steigerte sich von 0,02 auf 0,03 g/g.
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SEQUENZPROTOKOLL <110> Vogelbusch Gesellschaft m. b. Η, A-1051 Wien (AT) <120> Verfahren zum Umwandeln von Xylose oder Xylose enthaltenden Substratlösungen <130> AT 505 251 A1 <140> A 849/2007 <141 > 2007-05-3030 <160> 22 <170> Patentin version 3. 3 <210> 1 <211 > 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> fwd Primer, verwendet für die Amplifikation von Candida tenuis XR mittels PCR, mit BamHI Restriktionsschnittstelle <400> 1 ggtggtggat ccatgagcgc aagtatccca gac 33
<210> 2 <211 > 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> rev Primer, verwendet für die Amplifikation von Candida tenuis XR mittels PCR, mit Sali Restriktionsschnittstelle <400>2 ctagtgggtc gacttaaacg aagattggaa tgttgtc 37 <210> 3 <211 >36
<212> DNA <213> Artificial <220> <223> fwd Primer, verwendet für die Amplifikation von Galactocandida mastotermitis XDH mittels PCR, mit BamHI Restriktionsschnittstelle 10/15
oiteüsäisd'is patenuimt AT 505 251 B1 2009-09-15 <400>3 36 ggtggtggat ccatgtctac tcctgaaaac ttatct <210 4 <211 >35 <212> DANN <213> Artificial <220> <223> rev Primer, verwendet für die Amplifikation von Galactocandida mastotermitis XDH mittels PCR, mit Salil Restriktionsschnittstelle <400 4 ctagtgggtc gacttactca gggccgttaa tgatg 35 <210> 5 <211 >36
<212> DNA <213> Artificial <220> <223> fwd Primer, verwendet für die Amplifikation von Saccharomyces cerevisisae XK mittels PCR, mit BamHI Restriktionsschnittstelle <400> 5 ggtggtggat ccatgttgtg ttcagtaatt cagaga 36 <210> 6 <211 >36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> rev Primer, verwendet für die Amplifikation von Saccharomyces cerevisisae XK mittels PCR, mit Sali Restriktionsschnittstelle <400> 6 ggtggtgtcg acttagatga gagtcttttc cagttc 36 <210> 7 <211> 41
<212> DNA <213> Artificial <220> <223> fwd Primer, verwendet für die Amplifikation der Genkasette bestehend aus GPD-Promotor, XK und Cyc1 -Terminator, mit Aatll Restriktionsschnittstelle <400>7 catggtgacg tcagtttatc attatcaata ctcgccattt c 41 <210> 8 <211 >33 11/15 ä®??ems AT 505 251 B1 2009-09-15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> rev Primer, verwendet für die Amplifikation der Genkasette bestehend aus GPD-Promotor, XK und Cyc1-Terminator, mit Aatll Restriktionsschnittstelle <400>8 ggtggtgacg tcggccgcaa attaaagcct tcg 33 <210> 9 <211> 41
<212> DNA <213> Artificial <220> <223> fwd Primer, verwendet für die Amplifikation der Genkasette bestehend aus GPD-Promotor, XDH und Cyc1-Terminator, mitClal Restriktionsschnittstelle <400>9 catggtatcg atagtttatc attatcaata ctcgccattt c 41 <210> 10 <211 >33
<212> DNA <213> Artificial <220> <223> rev Primer, verwendet für die Amplifikation der Genkasette bestehend aus GPD-Promotor, XDH und Cyc1-Terminator, mitClal Restriktionsschnittstelle <400> 10 ggtggtatcg atggccgcaa attaaagcct tcg 33 <210> 11 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> fwd Primer, verwendet für die Amplifikation der Genkasette bestehend aus GPD-Promotor, XR und Cyc1 -Terminator, mit EcoRI Restriktionsschnittstelle <400> 11 ggtggtgaat tcagtttatc attatcaata ctcgccattt c 41 <210> 12 <211 >33 <212> DNA <213> Artificial 12/15 <220>

Claims (8)

  1. <223> rev Primer, verwendet für die Amplifikation der Genkasette bestehend aus GPD-Promotor, XR und Cyc1-Terminator, mit EcoRI Restriktionsschnittstelle <400> 12 ggtggtgaat tcggccgcaa attaaagcct tcg 33 Patentansprüche 1. Verfahren zum Umwandeln von Xylose oder Xylose enthaltenden Substraten in Ethanol mittels Saccharomyces cerevisiae, dadurch gekennzeichnet, dass zur Umwandlung ein re-kombinanter Stamm von Saccharomyces cerevisiae eingesetzt wird, welcher das Gen für eine Mutante der pilzlichen Xylose Reduktase enthält, in der ein Sequenzmotiv Lys-Ser-Asn gegen Arg-Ser-Asp ausgetauscht wurde und die unter der Kontrolle eines starken konstitutiven Promotors exprimiert wird, und welcher den Wildtyp der Xylitdehydrogenase exprimiert, wobei der Hefestamm wenigstens eine zusätzliche Genkopie des Gens für Xy-lulosekinase enthält.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Mutante der pilzlichen Xylose Reduktase jene von Candida tenuis eingesetzt wird.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Xylitdehydrogenase jene von Galactocandida mastotermitis eingesetzt wird.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Xylulosekinase jene von Saccharomyces cerevisiae eingesetzt wird.
  5. 5. Hefestamm zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass Saccharomyces cerevisiae mit einem Vektor, der die Gene für eine Mutante der pilzlichen Xylose Reduktase enthält, in der ein Sequenzmotiv Lys-Ser-Asn gegen Arg-Ser-Asp ausgetauscht wurde, sowie für XDH (Xylit-Dehydrogenase) und XK (Xylulosekinase) trägt, transformiert ist.
  6. 6. Hefestamm nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor Genkassetten aufweist, die je einen starken konstitutiven Hefe GPD Promotor, das Zielgen und den CYC1 Terminator für jedes der XRWt, XRDm, XDH und XK enthalten.
  7. 7. Hefestamm nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass er der Stamm BP 10001, hinterlegt unter Nr. DSM 19303, ist.
  8. 8. Verfahren zur Herstellung eines im Verfahren nach Anspruch 1 einzusetzenden Hefestammes nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass zur Amplifi-zierung der in den Vektor einzusetzenden Sequenzen folgende Primer eingesetzt werden: für XRWt und für XRDm Fwd: 5-GGTGGTGGATCCATGAGCGCAAGTATCCCAGAC -3' (SEQ. ID No 1) Rev: 5'- CTAGTGGGTCGACTTAAACGAAGATTGGAATGTTGTC -3' (SEQ. ID No 2) für XDH: Fwd: 5-GGTGGTGGATCCATGTCTACTCCTGAAAACTTATCT -3' (SEQ. ID No 3) Rev: 5- CT AGT GGGT CGACTT ACT CAGGGCCGTT AAT GAT G -3' (SEQ. ID No 4) für XK: Fwd: 5'-GGTGGTGGATCCATGTTGTGTTCAGTAATTCAGAGA-3' (SEQ. ID No 5) Rev: S- GGTGGT GTCGACTT AGAT GAG AGT CTTTT CCAGTT C -3' (SEQ. ID No 6)
    AT 505 251 B1 2009-09-15 wobei für die Vorwärtsprimer (Fwd) eine BamHI und für die Rückwärtsprimer (Rev) eine Sall-Restriktionsstelle gewählt wird. Hierzu 1 Blatt Zeichnungen 14/15
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