AT505433A1

AT505433A1 - Plasmafiltration

Info

Publication number: AT505433A1
Application number: AT0104507A
Authority: AT
Original assignee: Technoclone Ges M B H
Priority date: 2007-07-06
Filing date: 2007-07-06
Publication date: 2009-01-15
Also published as: US20100203562A1; AT505433B1; WO2009006660A1; EP2167957A1

Description

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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Aufbereitung von Blutplasma vor der Bestimmung eines oder mehrerer Blutparameter, wie z.B. Gerinnungsparameter und Thrombinparameter, die Erfindung bezieht sich auch auf eine Vorrichtung, mit der das Verfahren durchgeführt werden kann. 5

Zur Durchführung verschiedener Analysen wird zunächst aus dem Blut eines Patienten Plasma gewonnen. Dies erfolgt in den meisten Fällen durch Zentrifugation. Das dabei erhaltene Plasma bildet im Stand der Technik die Grundlage für verschiedene Labortests. Der Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, dass im Blut vorhandene Mikropartikeln 10 durch die Zentrifugation nicht selektiert werden, sondern im Plasma verbleiben. Es hat sich nun herausgestellt, dass diese Mikropartikeln die Messwerte bei der Bestimmung von diversen Blutparametem verfälschen.

Es besteht somit der Bedarf an einer Lösung dieses Problems, eine zuverlässige und 15 reproduzierbare Bestimmung von Blutwerten zu erlangen, die von den Mikropartikeln nicht verfälscht sind.

Dieses Ziel wird mit einem Verfahren der eingangs genannten Art dadurch erreicht, dass das aus dem Blut erhaltene Plasma filtriert wird, bevor es auf einen bestimmten Parameter 20 hin analysiert wird.

Dieses Ziel wird durch eine Vorrichtung der eingangs genannten Art dadurch erreicht, dass ein Filter vorgesehen ist, durch den das Plasma in einen Auffangbehälter gelangt, und einer Vakuumpumpe, die ausgelegt ist, auf der einen Seite des Filters einen Unterdrück zu 25 erzeugen.

Bevorzugte Ausführungsformen beinhalten, dass das Filter für Mikropartikel im wesentlichen undurchlässig ist, ddas Filter eine Durchlassgrenze zwischen 0,05 und 1,5 pm (Mikrometer), vorzugsweise zwischen 0,1 bis 1,2 pm (Mikrometer) aufweist, dass der 30 Unterdrück -50 mbar bis -1000 mbar, vorzugsweise -300 mbar bis -600 mbar beträgt, dass das Beaufschlagen des Filters mit Unterdrück zwischen 30 Sekunden und 30 Minuten dauert. • · »··· ···· ···« • · · • · ··· • · · · t- · ·· ·· - ·

Die Vorrichtung zur Aufbereitung von Blutplasma für die Bestimmung eines oder mehrerer Blutparameter, insbesondere Gerinnungsparameter, ist dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung einen Filter, einen hinter dem Filter angeordneten Auffangbehälter und eine Vakuumpumpe aufweist, wobei die Vakuumpumpe mit dem Raum hinter dem 5 Filter verbunden ist.

Bevorzugte Ausfuhrungsformen beinhalten, dass das Filter eine Durchlassgrenze zwischen 0,05 und 1,5 pm (Mikrometer), vorzugsweise zwischen 0,1 bis 1,2 pm (Mikrometer) aufweist, dass der Auffangbehälter eine Mikrotitierplatte ist, dass der Auffangbehälter 10 Eppendorf Tubes sind, dass der Filter, der Auffangbehälter und die Vakuumpumpe in einer gemeinsamen Einheit integriert sind, dass unterhalb des Filters ein Kühlelement, vorzugsweise ein Peltierelement, zur Kühlung des Filtervorganges vorgesehen ist

Die Erfindung wird anhand der Zeichnung näher erläutert. Dabei zeigt 15 die Fig. 1 eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, die Fig. 2 eine erfindungsgemäße Vorrichtung im Detail.

Die Gewinnung von Plasma aus antikoaguliertem (Citrat 0,01 ImM) Vollblut erfolgt üblicherweise durch Zentrifugation nach DIN 58905 (15 min, bei mindestens 2500g). Das 20 hierbei erhaltene Plasma wird als thrombozytenarmes Plasma (PPP) beschrieben und zur Durchführung von verschiedenen Labortests, insbesondere von Gerinnungsanalysen verwendet. In diesem PPP sind jedoch unterschiedliche Mengen an Mikropartikeln (membranöse Vesikel aus Zellen, 0.1 bis lpm groß, in einer Anzahl von -4.000 bis ~60.000/pl) enthalten, die verschiedene Gerinnungsteste beeinflussen, insbesondere die 25 Thrombingenerierung. Es ist somit wünschenswert, für solche Laboranalysen mikropartikelfreies Plasma zu verwenden.

Mikropartikel können aus dem Plasma zwar durch Ultrazentrifugation des Plasmas (100.000 x g für 60 min1) entfernt werden. Diese Prozedur ist jedoch zeitaufwendig und 30 auch dadurch beeinträchtigt, dass nicht sichergestellt werden kann, dass beim Aufnehmen des mikropartikelfreien Plasmas unterschiedliche Mengen an Mikropartikel mit aufgenommen werden. Weiters sind Mikropartikel beschrieben, welche dieselbe Dichte wie Plasma haben und daher durch Zentrifugation nicht getrennt werden können2. ···· ···· ···« • ·

Für die Trennung von Plasma und Mikropartikeln allenfalls ersetzbare Filtrationseinheiten über welche eine größere Anzahl von Proben über Filterplatten in dazupassende Auffangplatten filtriert werden können sind zwar beschrieben, doch werden 5 hierzu diese Filtrationseinheiten an die in Labors üblichen Membranvakuumpumpen angeschlossen. Für die dazu nötigen Schlauchleitungen, Sicherheitsflaschen, die Pumpe selbst und Absperrhähnen wird relativ viel Platz gebraucht. Die für die Filtration verwendeten Parameter sind nicht standardisiert und bleiben dem Anwender überlassen. 10 Ziel der vorliegenden Erfindung ist es eine einfache Apparatur zu gestalten, die die rasche und standardisierte Trennung von Plasma und Mikropartikel gestattet.

In dem der Erfindung zugrunde liegenden Vorrichtung (Fig. 1) wird eine Filtrationseinheit bestehend aus einem Membranfilter, welches luftdicht auf einem Auffanggefäß aufliegt, so 15 mit einer Vakuumpumpe verbunden, dass in dem Auffanggefäß ein Unterdrück entsteht, mit dessen Hilfe das Plasma durch den Membranfilter gesaugt wird und das Filtrat in dem Auffanggefäß erhalten wird. Die Dauer der Filtration wird durch eine mit der Vakuumpumpe verbundene Steuereinheit festgelegt und der Filtrationsdruck durch ein die x Einstellung eines Ventils,. Zur Kontrolle des Filtrationsdruckes ist in dem System ein 20 Druckmesser eingebaut. Dadurch entsteht eine kompakte Bauweise, welche nur wenig Platz benötigt und durch die Festlegung von Zeit und Druck eine Standardisierung der Filtration ermöglicht. Die Vakuumpumpe ist unempfindlich gegenüber Flüssigkeiten und kann gegebenenfalls zusammen mit dem Schlauchsystem bei Bedarf mit einer Waschlösung gereinigt werden. Der Filteraufsatz und die Auffangplatte für die Proben 25 können bei Bedarf über ein Pelltierelement im Boden des Filteraufsatzes gekühlt werden.

Die Filtrationseinheit besteht aus einem Gehäuse mit seitlichen Abdeckungen, auf dem handelsübliche Filteraufsätze, z.B. von der Firma Pall, montiert werden können. Zur Stromversorgung der Pumpe und der übrigen Bauteile dient ein Netzgerät.

Das Gehäuse enthält folgende Bauelemente: Einen Schalter zum Starten des Filtrationsvorganges und eine Buchse zur Stromversorgung, eine Vakuumpumpe, die den Unterdrück für die Filtration erzeugt, Vakuumschläuche vom Filteraufsatz zur Pumpe und 30 ···♦ ···· ··#· • · ·

·· ·· • · · · • · · · • · · · • · · · ·· ·· von der Pumpe zur Auslassöffnung, ein elektronisches Bauelement zur Steuerung der Vakuumpumpe. In einer bevorzugten Ausführung ist ein P^tierelement zur Kühlung des Filteraufsatzes vorgesehen, das mit einem elektronischen Bauelement zu seiner Steuerung dient. Weiters kann ein Axiallüfter zur Kühlung des Kühlkörpers in die Gehäusewand 5 eingebaut sein, sowie ein lektronisches Bauelement zur Steuerung des Axiallüfters.

Ablaufbeschreibung einer Filtration:

Der Filteraufsatz wird mit Auffangplatte und Filterplatte bestückt. Die Proben werden in 10 die Filterplatte pipettiert, der Startknopf wird gedrückt und die Filtration startet automatisch. Nach Ende der Filtration wird der Druckausgleichsknopf betätigt, der Filterplattenhalter kann abgehoben und die Auffangplatte mit den Proben entnommen werden. 15 Sollte es zu einer Verschmutzung des Filteraufsatzes, der Schläuche oder der Pumpe kommen, kann die Verschmutzung bei laufender Pumpe mit einer Waschlösung aus dem Filteraufsatz zur Auslassöffnung äbgesaugt werden.

Die Fig. 1 zeigt in schematischer Weise eine erfindungsgemäße Plasmafiltriervorrichtung, 20 deren Elemente in einer gemeinsamen Einheit integriert sind.

Die Fig. 2 zeigt etwas detaillierter, in einem gemeinsamen Gehäuse integriert eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur Filterung von Blutplasma mit einem Filter, einem unterhalb des Filters angeordneten Auffangbehälters, einem Distanzblock und einer 25 Öffnung, über die der Bereich unterhalb des Filters mit Vakuum beaufschlagt werden kann.

Im unteren Teil der Einheit ist eine Vakuumpumpe untergebracht, die mit einer Steuerung verbunden ist. Im oberen Bereich des unteren Teils der Einheit befindet sich ein 30 Kühlelement, vorzugsweise ein Peltierelement, das mit Kühlrippen thermisch verbunden ist und zur Einstellung einer bestimmten Temperatur für das zu filternde Plasma mit der Steuerung verbunden ist. Ein Lufteinlass auf der linken Seite mit einem Ventilator sorgt dafür, dass die vom Peltierelement erzeugte Wärme weggeblasen werden kann. Über ein ·· ··

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Interface, beispielsweise eine Tastatur können die Parameter für das Verfahren eingestellt werden.

Bezugszeichen der Fig. 2: 5

Vorrichtung 1,

Multiwell-Filterplatte 2,

Filter 3,

Auffangbehälter 4, 10 Dichtung zwischen Ober- und Unterteil 5,

Absperrhahn 6,

Vakuumschlauch 7,

Distanzblock 8,

Alugehäuse 9, 15 Steuerung 10,

Vakuumpumpe 11,

Luiteinlass 12, Lüfter 13,

Interface 14 20 Peltierelement 15,

Temperatursensor 16,

Temperatursensor 17 25 Beispiele:

Wenn verschiedene normale Plasmen unter Zuhilfenahme des beschriebenen Gerätes von Mikropartikel getrennt werden, können typischerweise folgende Ergebnisse erhalten werden:

Probennummer Mikropartikelgehalt unfiltriert Mikropartikelgehalt filtriert Prozent der entfernte Mikropartikel % 1 33.454 1.531 95,42% 2 6.976 1.177 83,12% 3 62.895 1.391 97,78% 4 3.248 741 77,16% 5 8075 1.494 81,49% 6 20.202 4.272 78,85%

Einsatz von Mikropartikel freiem Plasma für Gerinnungsanalysen:

Die folgende Tabelle zeigt verschiedene Parameter, wobei unter PPP die Ergebnisse 5 aufgelistet sind, die sich auf das thrombozytenarme Plasma nach der Zentrifigation beziehen, und unter MPFP (micro particle filtered plasma) jene, die am gefilterten Plasma vorgenommen wurden:

Parameter PPP MPFP Differenz Fibrinogen mg/dl 285±73 290±74 ns aPTT (Reagenz 1) sec 38,9±2.9 39,5±2,3 ns aPTT (Reagenz 2) sec 36,9±3,9 38,2±3,4 ns aPTT (Reagenz 3) sec 36,0±3,5 38,2±3,4 p<0,05 FVIII % 127±30 126±30 ns PT (Reagenz 1) % 113±19 114±22 ns PT (Reagenz 2) % 157±31 161±32 ns PT (Reagenz 3) % 110±11 113±14 ns TGA Peak Thrombin nM 331±40 222±26 p<0,05 TGA AUC nM thrombin 4163±129 3641±233 p<0,05 Lupus LCA Index 47,4±7 34,8±6 p<0,05 10 Aus diesen Daten ergibt sich, dass die Messung der Parameter, insbesondere einzelne Gerinnungsparamter wie aPTT, Thrombingenerierung (TGA) und Lupus-Teste durch das Vorhandensein von Mikropartikel stark beeinflusst werden. Die Abweichungen zeigen, dass durch die Erfindung zuverlässigere Ergebnisse erreicht werden können, die nicht mehr vom Gehalt des Blutes bzw. Plasmas an Mikropartikeln äbhängen. • · · • · · • · · • · t

Mikropartikelfreies Plasma hergestellt mit einer erfindungsgemäßen Vorrichtung eignet sich ganz allgemein zum Einsatz in der Labordiagnostik, insbesondere in der Gerinnungsdiagnostik und zum Einsatz für die Bestimmung der Thrombingenerierung. 5

Referenzliste: (1) Jy W, Horstman LL, Jimenez JJ et al. Measuring circulating cell-derived microparticles. J Thromb Haemost. 2004;2:1842-1843. 10 (2) Horstman LL, Jy W, Jimenez JJ, Bidot C, Ahn YS. New horizons in the analysis of circulating cell-derived microparticles. Keio JMed. 2004;53:210-230.

Der Inhalt beider oben genannten Veröffentlichungen wird durch Bezugnahme vollständig in die vorliegende Beschreibung aufgenommen. 15

Claims

Patentansprüche 1. Verfahren zur Aufbereitung von Blutplasma für die Bestimmung eines oder mehrerer Blutparameter, insbesondere Gerinnungsparameter, dadurch gekennzeichnet, dass das Blutplasma mittels Unterdrück durch ein Filter gesaugt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Filter eine Durchlassgrenze zwischen 0,05 und 1,5 pm (Mikrometer), vorzugsweise zwischen 0,1 bis 1,2 pm (Mikrometer) aufweist.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Unterdrück -50 mbar bis -1000 mbar, vorzugsweise -300 mbar bis -600 mbar beträgt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Beaufschlagen des Filters mit Unterdrück zwischen 30 Sekunden und 30 Minuten dauert.
5. Vorrichtung zur Aufbereitung von Blutplasma für die Bestimmung eines oder mehrerer Blutparameter, insbesondere Gerinnungsparameter, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung einen Filter, einen hinter dem Filter angeordneten Auffangbehälter und eine Vakuumpumpe aufweist, wobei die Vakuumpumpe mit dem Raum hinter dem Filter verbunden ist.
6. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Filter eine Durchlassgrenze zwischen 0,05 und 1,5 pm (Mikrometer), vorzugsweise zwischen 0,1 bis 1,2 pm (Mikrometer) aufweist.
7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Auffangbehälter eine Mikrotitierplatte ist. ·♦ ·· • · · · • · · · • · · * • ·« · ·· ·· ···· ···· • · • ··· ····

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8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Auffangbehälter Eppendorf Tubes sind.
9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der 5 Filter, der Auffangbehälter und die Vakuumpumpe in einer gemeinsamen Einheit integriert sind.
10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass unterhalb des Filters ein Kühlelement, vorzugsweise ein Peltierelement, zur 10 Kühlung des Filtervorganges vorgesehen ist. 15