AT507363A1 - Verfahren zur herstellung eines zusatzstoffes für den enzymatischen abbau von mykotoxinen sowie zusatzstoff und verwendung desselben - Google Patents

Verfahren zur herstellung eines zusatzstoffes für den enzymatischen abbau von mykotoxinen sowie zusatzstoff und verwendung desselben Download PDF

Info

Publication number
AT507363A1
AT507363A1 AT0802409A AT80242009A AT507363A1 AT 507363 A1 AT507363 A1 AT 507363A1 AT 0802409 A AT0802409 A AT 0802409A AT 80242009 A AT80242009 A AT 80242009A AT 507363 A1 AT507363 A1 AT 507363A1
Authority
AT
Austria
Prior art keywords
enzymes
additive
enzyme
carboxylesterase
tau
Prior art date
Application number
AT0802409A
Other languages
English (en)
Other versions
AT507363B1 (de
Inventor
Wulf-Dieter Dr Moll
Doris Mag Hartinger
Karin Dipl Ing Griessler
Eva Maria Dr Binder
Gerd Dr Schatzmayr
Original Assignee
Erber Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Erber Ag filed Critical Erber Ag
Priority to AT0802409A priority Critical patent/AT507363B1/de
Publication of AT507363A1 publication Critical patent/AT507363A1/de
Application granted granted Critical
Publication of AT507363B1 publication Critical patent/AT507363B1/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/02—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description


  **4 * * 

  
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Zusatzstoffes für den enzymatischen Abbau von Mykotoxinen, insbesondere Fumonisinen, einen Zusatzstoff zum enzymatischen Abbau von Mykotoxinen, insbesondere Fumonisinen, in einem pflanzlichen Rohstoff und Mischungen, die pflanzliche Rohstoffe enthalten, sowie eine Verwendung von Genen. 

  
Mykotoxine treten auf landwirtschaftlichen, pflanzlichen Produkten sehr häufig auf und verursachen je nach Art der Mykotoxine schwere wirtschaftliche Schäden, insbesondere in den aus den landwirtschaftlichen Produkten hergestellten Nahrungsmitteln und auch bei mit derartigen Nahrungsmitteln ernährten Tieren und Menschen, wobei derartige Schäden äusserst vielfältig sind. Es wurden bereits zahlreiche Methoden entwickelt, mit welchen versucht wird, derartige Mykotoxine zu entgiften bzw. abzubauen oder unschädlich zu machen, um durch die Mykotoxine verursachte Schäden in den Bereichen von tierischer und menschlicher Ernährung, der Tierzucht, Verarbeitung von Futter- und Lebensmitteln und dgl. hintanzuhalten. 

  
Unter den bekannten Mykotoxinen existiert eine Vielzahl von untereinander strukturell verwandten Mykotoxinen, wie beispielsweise die Fumonisine, von welchen Fumonisin Bl das am häufigsten vorkommende Toxin der Gruppe ist. Jedoch sind zahlreiche Derivate und verwandte Moleküle bekannt, welche ebenfalls giftige Wirkungen bei Menschen und Tieren aufweisen. So ist es bekannt, dass die Fumonisine den SphingolipidstoffWechsel durch eine Wechselwirkung mit dem Enzym Ceramidsynthase behindern. Sphingolipide sind nicht nur Bestandteil von Zellmembranen, sondern spielen auch eine wichtige Rolle als Signal- und Botenmoleküle in vielen elementaren, zellulären Prozessen, wie dem Zellwachstum, der Zellwanderung und Zellanbindung, bei entzündlichen Prozessen und intrazellulären Transportvorgängen.

   Aufgrund dieser Behinderung des Sphingolipidstoffwechsels werden Fumonisine für die giftige Wirkung auf unterschiedlichste Tierarten und auch für den Menschen verantwortlich gemacht. So konnte nachgewiesen werden, dass   ** 

  
Fumonisine bei Nagetieren krebserregend wirken, und sie wurden durch epidemiologische Daten mit Speiseröhrenkrebs und dem Neuralrohrdefekt bei Menschen in Zusammenhang gebracht . Bei verschiedenen Tierarten, wie beispielsweise Schweinen, werden sie für die typische Toxikose durch Lungenödeme verantwortlich gemacht. Fumonisine sind in diesem Zusammenhang eine nahezu allgegenwärtige Kontamination auf verschiedensten Getreidearten und insbesondere auf Mais sowie auf Nüssen und Gemüse sind, ist dieser stark negative Effekt in bezug auf die Gesundheit von Menschen und Tieren nicht vernachlässigbar. 

  
Der mikrobielle Abbau von Fumonisinen wurde bereits in der EP-A 1 860 954 beschrieben, gemäss welcher Mikroorganismen zur Entgiftung von Fumonisinen und Fumonisinderivaten eingesetzt werden, bei welchen die detoxifizierenden Bakterien oder Hefen, gewählt aus genau definierten Stämmen zur Entgiftung von Fumonisinen, Futtermitteln zugesetzt werden. 

  
Auch wurden bereits katabolische Stoffwechselwege für den biologischen Abbau von Fumonisinen und die hiefür verantwortlichen Gene und Enzyme beschrieben. So beschreibt beispielsweise die EP 0 988 383 Fumonisin entgiftende Zusammensetzungen und Verfahren, wobei die eingesetzten, Fumonisin abbauenden Enzyme in erster Linie in transgenen Pflanzen produziert werden, bei welchen die Entgiftung von Fumonisinen mit Hilfe einer Aminooxidase, welche für ihre enzymatische Aktivität molekularen Sauerstoff benötigt, erfolgt . 

  
Des weiteren beschreibt die WO 2004/085624 Transaminasen, Deaminasen und Aminomutasen und Zusammensetzungen und Verfahren zur enzymatischen Detoxifizierung, wobei insbesondere aminierte Toxine, beispielsweise Fumonisine, entgiftet werden. In diesem Zusammenhang werden Polypeptide, welche eine Deaminaseaktivität besitzen, zur Entgiftung eingesetzt. 

  
Bisher bekannten Verfahren ist jedoch gemeinsam, dass sie für eine Detoxifizierung der Mykotoxine molekularen Sauerstoff für die beschriebenen, katabolischen Stoffwechselwege benötigen, wo <> -<> bei die insbesondere erforderlichen Aminooxidasen unter Sauerstoffunabhängigen Bedingungen nicht arbeiten können. Ein Einsatz von derartigen Genen und Enzymen zur Detoxifizierung von Futtermitteln, beispielsweise im Verdauungstrakt von Tieren, ist aufgrund des im wesentlichen Sauerstofffreien Milieus in dem Verdauungstrakt von Tieren nicht möglich bzw. zeigen die bekannten Gene und Enzyme keinerlei Wirkung. 

  
Die Erfindung zielt nun darauf ab, ein Verfahren zur Herstellung eines Zusatzstoffes für den enzymatischen Abbau von Mykotoxinen zur Verfügung zu stellen, mit welchem es gelingt, Mykotoxine und insbesondere Fumonisine sicher und zuverlässig zu toxikologisch unbedenklichen Substanzen abzubauen bzw. zu entgiften. 

  
Zur Lösung dieser Aufgaben ist das erfindungsgemässe Verfahren derart geführt, dass wenigstens eine Nukleinsäuresequenz von Genen entsprechend Sequenz ID-Nr. 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 und 24 vorgelegt wird, die wenigstens eine Nukleinsäuresequenz in prokaryotisehen oder eukaryotisehen Wirtszellen exprimiert wird und wenigstens ein dadurch hergestelltes Enzym entsprechend Sequenz ID-Nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 und 25 oder wenigstens ein kompletter, rekombinanter Wirtsorganismus sowie gegebenenfalls gemeinsam mit einem Cosubstrat in einem pflanzlichen Rohstoff eingesetzt werden. Dadurch, dass wenigstens eine Nukleinsäuresequenz von Genen entsprechend den nachfolgenden Sequenz ID-Nr. 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 und 24 vorgelegt wird, gelingt es, spezifische, Fumonisine bzw.

   Mykotoxine abbauende Gene zu klonieren und zu exprimieren, wobei beispielsweise die Expression in E. coli und Pichia pastoris unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt wird, bei welcher Expression Enzyme entsprechend den Sequenz IDNr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 und 25 oder auch ein kompletter, rekombinanter Wirtsorganismus gewonnen werden können, wobei das wenigstens eine Enzym gegebenenfalls gemeinsam mit einem Cosubstrat auf einem zu behandelnden Rohmaterial eingesetzt wird.

   Mit einem nach einem derartigen Verfahren hergestellten Zusatzstoff gelingt es, einerseits beispielsweise Mykotoxine direkt auf dem Rohmaterial vollständig und zuverlässig abzubauen, wobei die spezifischen bei diesem Verfahren produzierten Enzyme den Abbau von Fumonisinen und von Zwischenprodukten des Abbauweges katalysieren, und andererseits Mykotoxine beispielsweise auch direkt bei der Bioethanolherstellung in der Maische für die Alkoholherstellung abzubauen oder auch bei der Herstellung von Nahrungsmitteln direkt in dem Herstellverfahren abzubauen bzw. unschädlich zu machen. 

  
Mit einem derartigen Verfahren gelingt es weiterhin, den Sphingolipidstoff Wechsel , der durch eine Wechselwirkung der Fumonisine mit dem Enzym Ceramidsynthase behindert wird, aufrecht zu erhalten und gleichzeitig die Fumonisine biologisch zu nicht toxischen Substanzen abzubauen. Schliesslich können technologische Anwendungen der Detoxif izierung erzielt werden, da dieses Verfahren auch im grösseren technischen Massstab anwendbar ist, so dass mit dem erfindungsgemässen Verfahren sicher und zuverlässig mykotoxinfreie Produkte hergestellt werden können. 

  
Die in dem erfindungsgemässen Verfahren eingesetzten Nukleinsäuresequenzen bzw. die mittels dieser Nukleinsäuresequenzen in prokaryotisehen und eukaryoti sehen Wirtszellen exprimierten, in sauerstoffunabhängigem Milieu katalytisch wirkenden Enzyme sind nachfolgend aufgelistet . 

  
Nukleinsäuren Sequenzen: 

  
>Seq ID 1 (fum (Fumonisinkatabolismus) Gencluster, 15.420 bp) 

  
TGTCGGCGATCRGTAAACTTCTACCGTGGTCCTCGTTCGCCCACAKCATACÄTCACAGACRTCGGGATTTCCAACTGAAC 

  
GGGTCCCGGCCTGCCGGCCCACATTTCCCGGAACGCCATATGGGTGATTTCGAC[Alpha]ATCCGGTTCCÄGGCGAAGATGGGTG 

  
CGCCCCATTTAACCGCGGGTCGAAAGAGGTCGATCTGGTCTTGTCCCTGAAAGGTTTTTGGCGTGCAGGGATAAACGACA 

  
CCAAGTTGATGCT[Sigma]GGAC[Sigma]TTATTGCGACGAAGG[Sigma]AACCCCTTCGTGGCGTGCCGTCACGACTCCAGGCAGAAGGTTTGC 

  
CGTACCGGGACCCGGATTCGTGACÄATCGCGGCGACCTGTCCGGTGGTCTTGTAAATGCCCTCGGCCATATAGGCTGCGG 

  
CGGCCTCGTGCCGCÄCCGGGACGAACAATATCCCATTGTCTTCGAGC[Sigma]CAGCCAGGAGCGGATCCACCTCCGGCGACATG 

  
AGGCCGAAGACÄTACCGGACGCCTTCGACGGCCA[Upsilon][Lambda]CATCX3TGCCÄATAATTCTCCGCCCGTGAGGCGCATGACGATCTC 

  
<^GTACGAAAGGTGAGTGCC(^GGTTCCGGCAC[Alpha]TTCGCTGTGGTTAGTTGATGCGC[Gamma]GATCGGCCAACCGACTGAGTGG 

  
AGTTGGATGGCCGCÄCCTTACCCTGT[infinity]CGCÄTAACT^ 

  
CGGATCATAGGCÄGAGCTGGTCGGGCTGGAAAAACTGCTGGGGTCGTTCGTCGCTATTGGCGGATCTCGGTCGAACAAAT 

  
TATTGACCGATAGAAACAGCTGCTGCTTCTGGCCAAAAGCCGCGATGTCGAAGGTCAATGTCGCGTCGGTGTACCÄAACC 

  
GCCGGAGCGTGGTTCÄAATTCGTATCGACGCCC[Tau]CCACÄTTGTCGGCÄTTGAACACCGATGCTGCGATGAAGCGCTGCTG "[xi] -< > 

  
CACGAGAAGCGCCCÄA[Tau]CGTCGGTCGAATATCGCGCCTGGAAGTTGGCCGACCATTTTGGCGTGTCCGGTTGTCCGAGCG AACGGATGGGCGCCGAGCCGGTCGCGATGCGATAGGCÄGAGGTATGGTGCGTTGCCAGCGCACGAAGACTGAACG[Tau]GCCG CCGCCGACGGGGCGTGAGTAATAGGCCTCGAAGTCAATTCCCGCCGCTTTCTGGACÄGCCAGGTTGAGATTGGGACCCGT CACTGTGATGGTGCCGTCCGGATTCTCCGTTATGAGGTCGCAGAAGAAGGTGTTTCCTGCATCGCACGCGTCGATTTCCT GCTGGGGAAGGAGGAAATCGATCGCGCCCTTCACCTTCACCACATAGCGATCGACCGAAAACTGAAACCCCGGCACGAAG GCGGGGCGTAGCACCGCGCCGAATGTAAGGACGTCCGCCTTTTCAGGGCGCAAATCCGCGTTGCCGGCGGTAAAGAACCG CGTCTGCACAGCCTGTCCGCCATAAATTGAATTGAGCGTCGCCTGACGGCCGGGGTCGAATAGCTCGACAAGGCTTGGCC CGCGGATATCTCGCGAACGGGTCGCGCGGAACCTGAGGCCGTCGATCGGCTCATATTC[Tau]CCGCCCAGCTTCCAGGTTGTT ACTCCÄCCGGACTGGCTGTAATCGGCATATCGGACGGCGCCGTTTAAGTTCAGCGAACGTCCCAGCGCGCTGTCCTTCÄG AATCGGGACGCCGATTTCGACÄAAACC[Tau]TCCTTGATGTCATAGCTTCCCGAGAAGGGAAGTGGGTTGTAGAGATTGAAGC 

  CTCCAGGCCGACCTGCCTGCGCCGCCGGAGCCCCCCTGATTCCCGTGATCGAGGTCGTCGCCTGCGATATCGCG[Tau]CGGTT TCCTGCCGGGCCTTCTCCTTGCGATATTCGATACCAGCGGCGACCGAGACCGGGCCCGCGCCGAACGACAGGCTATCGCC GAGGTCGCCGGAAATCGTGAGTCCCGCCACÄTATTGCTCAAGCCTCAGCTGAGCGACGCCATCAGCGGTGACATAGTCGA TGGCCGACGCGCTCGGCGAGCCTGTGCCGAAGAGATTGAGCGGCACGCÄATCTTGGTCGAGGCCGGCCÄGTGTTGAACGG CAGACGATATTGCCCGCGGGATCGCGGACCGCATCGACGGCGGCGTAGAGATTGCGGTTGATGGTGAGATTGTTTTCACG AAGCTCGAGGTCCGTAAGGCCAAAGGAGGCCGAGCCÄTCGAGTTTCCAGCCATTGCCAATGTCTGCCCGGAAGCCGGCAG CGCCGCGGTAGACCTTTGCGAAATTCTCGATTTCGACCAAGGGAAAGTCGCTTGAGAAGCGACCGACAACGATCGAAGCC TGGGCATTTCTGTCCATGAGCGTCGCGAGTGGAGCCGGAAGGAAGGCGTTATCACGGAAGATCCGGAAATTATTCGAGCC ACCGACATGCGATATTACGAATGCACCCAGGT[Tau]GGTGTGGGAATAAGCATAGGTGCCCTCCGCATACACCTGCACAGTGT CGGACÄCATCATATGCGGCGCGTAGGAACGCGTTGTAGCGAAGC[Tau]GATCCGGGGCGAAGCCGATATTCACGCGCGGTCCA 

  [Tau]CGCCGCCGCTCTGGAACGACGAGCTCGTAAAATTCCCGTAGTCGAAGGTCCCTAGGACTCCTCCGGGCAAAAACGCGAT GCCTTTCAGAGGGCCGGACGTGACAAGTCCGCCGTAGGATCCGCGAGAACTGCGAATATCGGGCACGACCGTGACGCCTG TCGTAGCGCCGGGCÄCGGGATATTGGCCGGCGGCGATGTCGAACCAGCGGCGACCCGTTGCTTCATCGGCCCGGATTCCG TCCTGTCGAAAATATTCGAAGCTGCCGAGCAAGTGCAACCGGTCGTCGGCAAACGAAGTGCCGAAGGCGATCGAACCGCC GTAGGACGGGAGGTCGCCGCGGGTTGAAACACCCGACTGGAGCTCGGCCCTGATGCCTTCCAGATCTTCGTCGAGCACGA AGTTGATGACGCCCGAAACGGCATCGGAACCGTAGGCGGCCGAGGCGCCGCCCGTCACGACATCGACGCGCTTGACCAAC GCCTGCGGCAGCACGTTGATATCGACCGAGCCTGTGAAATTGGTCGCGACGAAACGGTTGCCGTTCAGCAGGACGAGGTT CCGGTTTGACCCGAGGCCGCGCATGTTGAGCAGGTTCTGACCGCTGTTCCCCGTTCCGGGTGTCGTGCCAGGGTTGGAGG 

  
TCTTCAAGCTGTCGTTGAACÄCGGGCAGCTGGTTGAGTGCGTCGGCAAGGTTGGTCGGAGATGCCTCCTTCÄACTGCTCG 

  
C[Tau]GGATACGGCTGTAACCGGCGTCGGCGAATTGAAGCCGTTCTGGAGGCGGCTGCCGGTCÄCGACGATTTCGCTCGTTCC CCGGTCCGTGTCCGCTTCGTCCGGC[Gamma]GACCTATCGATGCGGGATCGCTATCCTGAGCÄCTGGCAGAGACAGGAAATGCGA 

  
GGGTGCCGAGCGCTACTGCGCCGAGCAAACTATTTGCCTTGCCGGGCTTTTCGATTCTGAACTTCCGATACÄTCTGCAGT CCCTCCCGAATTGATAGGGACTCCGTTTGAGTCCCCTTGTTTCT[tau]GACGCCGCCGTCGCTCACCACGGTCCGGTCGGAGG CTAAGCGTCGGGCCTAAGGACCCGf^^TTTGAAC[Alpha]TCAAATGCAATGATCGGAGGC TCATTGCACTTCGCGCATAGACC GGCGCGGTAGCTGAAAGTGCCAATAATCAGGGA[tau]TTTGCTGAACAGTTGCGGCATGACGTCCGGCATCGGCCACGCGGTT GGCGGCATCGACGTGGCTT[tau]C[sigma]CGTCGCCGCCCCTCÄAGCACCGGCGAGTTGCATTAAAATGGGATGAGGCTGGAGAGAC GCAAAATCTCTGAGGACCGCGCTGAACGCGCGATCCGTCGCCTCGAGGGTCTCCGTTACATCGTCAACTGTATGGGCCGC AGAGAGAAACATATTGTGATAGGGATGAACATAGACGCCGCCCT[tau]CAGGCACGCCGCGGCCCÄCGCÄTAGCCGATCCGAA AATCGGGATCGTCCGCÄAAGAATATTTGCGGCATCTGCGCCGGGCCCGTCTGCT[tau]CAACTCAAGACCÄTGGCGCTGAGAC TGTGCCTCCÄGGCCTGCCCGCAGGGCGGCGCCGCTGGCGATCAGCG[tau]TTCGAGATAAGGCGTCTCTCGAATGATCCTGAG GGTTTCGATCGCGGCCGCCATCGGTACCGCAGAGAACCAGAAGGAGCCGGTCACÄAATATA[tau]CCCGCGCCGCATCGCGCG 

  CCTTGTTCGAGCC(ÄGCÄGGGCGK^GAT[alpha]3GATAGCC[Lambda]TTCGCAAAGCÄTTTTCCCC[Alpha]GCAACTGAGATCGGGTTCGATA CCCAAATGCGTCCAGCTGCAATCGCGCGCCACCCGGAAACCTGCGCGCACATCGTCAACGACCAGAAGCGCACCGGTCTC GTCÄCy[Lambda]CATTTTCGAGCGGTGCGCGCGAACTCl^GCTGGGCGAGGGCCTGGTCCTCAAATACTTCGTGTCGGAAAGGTG TGGCÄAAGACAGCCGCAATATCGCCATCGTGCGCCTTGAACGCGTCCGATAAGCTTTGGGCGTCGTTATAG[sigma]TATAATAT GCGACATGCACGCGATCGGAAGCGAGAATCCCGGCAGTATGCGGAGTGTTCCÄCGGGGAAGCGCCÄTGATAGGCGCCTTT 

  
GGCGCATAATATGGTTTTGCGCCCCGTATGGGCACGCGCGAGAACC^TCGCCGTTGAGGTGGCATCGCTGCCATTTTTGC AGAACATCGCCCAATCCGCATGACGGACCATGCCCACAAAGGCTTCGGCGAGGTTGACCATGATCTCCGAAGGACCGGTC ATGGTGTCGCCGAGAAGTCGCTGCGCATC[Alpha]GCCGCGGCTTCGATT[Tau]CGGATTGCCGGTAACCGAGCAAATTTGGCCCATA CGCGCACÄTATAGTCGATATAGGGCTGCTCGTCGGCGTCCC^^TTCGTGCCCCCÄGCGCGC[Alpha]CCTGAAGAACTGGGGGA ATTCTGGCGGCAGCÄACCGTGTCGACTCGTGGCCGTACÄTCCCGCCCGGAATGACCCGTTCGGCGCGTTCTCTGAGATCT TTCTGCCTTGTTCCGTTCGCCATAATGCACCTCTCGCGATAAATAATGGGTAAAAATCCACGAAATTCÄACGATTCGTGA TCTGAAAGAGATATATCTTGTAATATACTGTATAATTATACACAATGCGC[Iota]ATCGGACGA SGGATAGCGGGGCÄGGGAG GACGGGGAAATCTATGCGGAACGTCAGCGACAAGGCGCCGCCCCACGA[Sigma]ACGCTCACCGTAGTCGTCGCGGCAATGATCG TTGGCACGGCCGCCTTGATGGTGCTTGGAATACAGCCCATCCTTCTCGGCGCCCTTGTAGAGGAGGGGCGTATTCCCGCC GAG K[Iota]TTGGGATCGGCGGCAACGGTGGAAATACTGGCGATCGCGGCGGGAAC[Alpha]TGC[Alpha]TCGGACCCGTTCTTATGAAGAC 

  GGGATATCTGCGGGCGAAATGCGCGG<^CRCTGCTTAATGCTCGCCGCAAT[Alpha]^CTTCGGATTGACGTTGCCGG[Sigma]TTTCG ATTTGCCCÄTCGTGGCTTGCCGAGCGG(^GCGGGAGCCCTGGAAGGTC [Gamma]T[infinity]CTCAGCGCGGCGATCCTGATCATGACT CÄTAATCGGCGGCCGGACCGGCTGAGCGGAATATTTC GGGCGCGCAGACGATACCGCAGGTAATATCTGCTTAT[Tau]TGCT CCCGACGGAGATTATTCCGCGCTGGGGGAGCGCAGGOKICTTCACGATCCTGGGCÄTTCTCG[Alpha]SGCGATCGCCGCGATCG CGGCTCTGTGCCTCGTCGATCGCGTTGAGCTCGATCCGACGACCGTTAACGACGACTTGCAGTGGTCACCCGCGGCGATC GTCÄTTTCGATGGCGGCÄTTCGTTCAATTCTCGGGGGT[Alpha]MTGCCGCATGGAGCTATCTGGAG ^CT[Sigma]GCI^K:

  G[Alpha]GCA CGGATTTTCGGGAGAAACGATCGGTATCGCC[Alpha]RRTCCGG[Omega]AGTTTGCTTTGCCAGGTAGGCGGGGCTTGGCRGGC [Iota]CTT GGATCGGTGK3GCGGGTCGGATATCGCTTCGCCTTAATCGCTGGGAGCCTGCTTCAGGCGGGCAACGTGATCGCATTGGCG GTGGCCGATCAGCCÄAGCTGGTTTATTTCCGCTTCCTGTGCTTTCGGCCTGTTCTGGTTGGCGATGCÄGCCCTTCCÄAAT CCGCT CGCGATCX[Iota]CGATAGATAACAGCCGGCAGCTTGCTGTACTGCTGACGCCGATCGCCCTCGTCGGGTTGA[Sigma]CGCGG GGCCCTTGTTGCTCTCTCGCTTTGCCGGGGCGACCGACTTGCGCTGGA[Tau]CTTTGTGGGGAGTTCGACCTTGTTGCTGGCC AGCGCGCTTCTGTATCTTTGCGCTTCTCTGTTTCÄACCGCGCGGAAAGGTGATCGCTGAAACGGTGGACGTATGAAAAAG      

  
" ' ' 

  
"[delta] - ' ' 

  
ACGGATCGGGGTTCGCGATGACATCGCAGGTCAAGCTTCGTAGCGCGGCAAAGCGGCCGCGCAGTCCTAAAAGCGAGCGA 

  
GGTCTTGCTCGTTACGAGTCCTTGCTTGATGCGACCGACAGGCTGTTGGTCGATCTAGACCCCGATCAGGTCGGTCTCTA 

  
TCÄGATTGCAGAGGAAGCGGGTGCCTCACCGTCGTCCGTCTATCATTTCTTTCCGACCAAGGAAGTGGC[Tau]CATCTCGC[Tau]C 

  
TGATGCGCCGCTATCTGGAGGGGCTCCGGAATCTCGACGCGATGGAAGTCGACÄTCGGCCAGCTCGAAAGCTGGCAGGAC 

  
CTGATGAAGTTGGATCAGATCAGGGCGCGAGACTATTATAATAGCCACCCGCCCGCCCTCAAGCTTCTGTTCGGCGGATA 

  
TGGCGGGGTCGAGGCCAGAAAGCTTGACGAGCGATACTCCGAGGAAATCGTGAGCTCCATGTATGGCAGATACAACGGCA 

  
TTTTCCATATGCCGCAAATGGAGAATGAGGCTCTCATGTTCAC[Sigma]ATCTGCTTCGCAATTCTCGACGCGGTATGGGCCGTC 

  
TCCTTTCGCCGG[Tau]TCGGTGAAATTACGTCGGATTTTCTTCGGGAGGGGCAAGCGGCTTGCATTGCCTA[Tau]TGCCGACACTA 

  
TCTGCCCGAGCGAACGCCATCAGCGTGAATCCGTTCAACGATATGCAGGAATGTCCGTTGCGTTGAGTTCGGTTCTGAGT 

  
TCGGTCGGTTAGGAGGCCCCGCGATAAACCAACGCTCTTCTGTCGAAGGGATGTCGCCTGGTTCGACCAGGCCCTGCGAA 

  
GTC^GCCGCAATCT[Lambda]CGAGGCÄGATGTCAACGTGGCCAGCAAGTTCAACTGTGAGTTACTCGATCTGCGATCATTTGTTG 

  
CGGTGTATGAAACGCGAAGTTTTAGCCACGCCGCGCGGCTTCTGAA[Tau]CTIATCGCAGCCCGCGCTCAGCCGGAGAATCCAG 

  
CGCCTCGAGAGTC[Tau]CGTGGGCGGTCCGTTGTTCGAGCGGACCA[Sigma]TCGGTCGC[Tau]TGCCGAAACGGCGCTCGGCAAAGAGTT 

  
GCTCCCGGTCGCCCACCGAGCGTTGGAACTTGTCGATACGTCGCTGTTTGCGTCGCCCAATGTCCGGGAGTTCCGCTGGA 

  
CAGACATCACGATTGCCTGTGTACAGACCGCC[Sigma]CCTTCCATGTTCTCCCGCGAGCTGCGCGCTTGTACATGGATCAAAAT 

  
CCGAGGGTCCGACTCCGCATCCTTGACGTGCCGGCGGTCGAGGCTGCGGACCTGG[Tau]TGCGAGCGGCGAGGCGGAGTTCGG 

  
CÄTCAGCATTGAGAGCCTGTTGCCATCAAGCCTGCGGTTCGATGCGCTCCACGAGGACCCGTTCGGCCTGGCATGCCACC 

  
GAAGCCA[Tau]CCGCTGGCGTCGCTCGAGATCCTTGAATGGACGCAATTGAAAGGTGAAAGCCTGATCGCCGTTCACCGTGCG 

  
AGCCÖGAACCGCACGTTGCTCGATGCCGAACTCGCGCGCAACAATATCGCGCTGGAA[Tau]GGCGGTATGAGGTCGCGCATCT 

  
[Sigma]ACGACGGCGCTGGGATTGATCGATGCGCAATTGGGTGTCGCTGTTATGCCCCGCATGGTTATGCCCCGCTCGGGTCGGT 

  
CGGAGGTCGTCTGGCGCCCCGTCGTCGCGCCGGTCGTCCAACGCACGATCGGCATCGTTCAGCGCCGCACCGGCTCGATG 

  
CACCCTGCCGCACAGCAATTGCTTGCGCGGCTCCGCGCGGCCTGGTCGTCCGCCÄATCTGGGCGACATCGCGTCTCGCGA 

  
AGATGGGGCATCGTGACACGCGTTCTATGCGCCTGCAGCATCGATGCTCACGATCATTGC[Alpha]TTTGCTGAGAGACGAACGC 

  
GAAGATACCGCTGGGTCÄCAGGATATCAGTCCATCGAGGCGGGAGAGAAATGTGTGAAAGAGCACCÄATGCCGTGGCGGC 

  
CGGGCGTCCCCCGCTGCGCCCGCCACGTGGCT[Tau]GCGCGGATCAGCGTTTCCCGGGGGGCCTCCGCC[Alpha]TCGCCTGGACCTT 

  
CÄTGCTTGGCGCAACTGCCATTCCCGTGGCTGCGCAAACTGACGATCCGAAGCTCGTTCGTCATACCCAGTCGGGCGCCG 

  
TCGAGGGCGTCGAGGGCGACGTCGAGACTTTTTTGGGAATACCCTTCGCGGCTCCGCCGGTCGGCGACCTGCGATGGCGG 

  
CCGCCGGCTCCGCCGAGGGCGTGGGCGGGCACCAGGGACGGCC[Sigma]CCGCT[Tau]TGCGCCCGATTGCATCGGGAACGAGCGGCT 

  
TAGAGAGGGGAGCCGGGCTGCCGGGACGAGCGAAGACTGCCTCTATC[Tau]GAATATCTGGTCTCCCAAACAGGTCGGTAAGG 

  
GGGGGCTCCCCGTCATGATCTGGGTTTACGGCGGTGGGTTTAGCGGCGGTTCTGGCGCGGTGCCATATTATGACGGCTCT 

  
GCGCTCGCGCAGAAGGGCGTGGTGGTCGTCACGTTCAACTATCGCGCCGGGATTCTGGGCTTTCTTGCCCATCCGGCGCT 

  
TTCÄAAGGAAAGTCCGAATGGCGTGTCGGGCAACTATGGTCTTCTCGAC[Alpha]TGCTCGCGGCGTT[Alpha][Upsilon]^TGGGTTCÄGAACA 

  
ACA[Tau]AAGGGAGTTCGGCGGAGACCCGAACCG[Tau]GTCACGGTCTTTGGCGAGTCCGCCGGCGCGAGCGCGCTCGGACTGCTC 

  
CTGACCTCGCCGCTCAGTGAGAGCGCCTTCAATCÄGGCGATACTGCAAAGTCCGGGTCTGGCCÄGGCCGCTCGCCACGCT 

  
TTCTGAAAGCGAAGCGAATGGGCTGGAGCTGGGAGCCGATATTTCTGCTCTACGGCGTGC[Alpha]^TGCGGGCGAATTGACGA 

  
AGATCGCGCAATCGCGAATACCCATGTCGCGCCAGTTCÄCCAAGCCGCGGCCGATGGGTCCGATTCTGGACGGCTATG[Tau]T 

  
TTGCGCACCCTTGACGTCGATGCCTTCGCCAAGGGGGCCTTCCGCAAGATACCCGTTCTGG[Tau]CGGCGGAAACGCCGACGA 

  
AGGGCGCGCTTTTACGGATCGCCTGCCGGTCAAAACGGTCCTTGAATATCGAGCCTATCTCACAGAACAATTTGGTGACG 

  
AGGCGGACGCATGGGAGCGTTGTTATCCCGCGAACTCCGACGCCGACGTCCCCGCCGCCGTTGCCCGTCTTTTTGGGGAT 

  
AGTCÄGTTC^VA[Alpha]^CGGGATCGAGCTGCRCTCGGC[Alpha]GCCTTCGCGAAATGGCGAACGCCGCRTTGGAGATATCGCTTTAC 

  
GGGCÄTTCC[Alpha]GGAGCCGGCCGTCGCCCCGCCACGCATGGAGACGAAA[Tau]TCCCTATGTCTTCGCAAATCTGGGGCCGTCGT 

  
CCGTA[Tau]CTATGTTTGGGTCGCTCGAAGGCGGCGCCGGGGCG[Tau]CGGACÄTCAAACTTGCGACCGAAATG[Tau]CCGCGGCCTGG 

  
GTGAGCTTCGCGGTGCÄCGGGGTCCCCGATCAGGGCACGAAATCGCACTGGCCGCGCTTCGAGCGGCGAGGGGAGATCAT 

  
GACTTTTGGTTCGCÄGGTTGGCTCTGGGGAAGGTCTTGGAGTTTCGCCGAGCAAAGCCTGCCÄACCCTCAAAATAGCGCC 

  
CGGCCTGTGCGTGCTTCAGCACGCCGTCCCGCTTTGCGGGCGACGGGCTGTGCCCTCTGCCTAGAAGGAAGTAAGTTGCG 

  
CTACGACGTCGCGATAATTGGAGGTGGCAACGCTGCATTGACGGCAGCCGTGACGGCGCGTGAAGCGGGGGCCTCGGTTC 

  
TTGTGATCGAGCÄTGCGCCGCGCGCCATGCGCGGCGGCAACAGTCGTCACACÄCGCÄATATGCGTACGATGCACGAACGT 

  
CCCCTGTCGCCGTTGACCGGTGAATATTCG[Sigma]CGGACGAATATTGGAATGATCTTGTCCGCGTCACGGGGGGGCGCÄCCGA 

  
CGAAGAACTCGCGCGGCTCGTTATCCGCÄACACCACCGACGCTATTCCCTTCATGACGCGCTGCGGTGTGCGTTTCCAGC 

  
CCTCGCTGTCGGGCACGCTGAGTTTATCGCGAACCAACGCATTCTTCCTTGGCGGCGGGAAGGCGCTTGTAAACGCATAT 

  
TACGCCACGGCCGAACGGCTAGGCGTCGATATTCTCTATGATTCTGAGGTGACCGAGATCAACCTTCAGCAAGGCGTCGT 

  
GCAGCGTCTGCAATTGCGCAGCCGGGGATTCCCTGTCGAAGTGGAAGCCAAGGCTGCCATCGCCTCGTCCGGAGGATTCC 

  
AGGCÄAATCTTGACTGGCTCTCÄAGCGCATGGGGGCCRGCTG[Sigma]SGCGAACTTCATCGTACGGGGCACGCCATATGCGACT 

  
GGCACX3GTGCTO[Lambda]GAACCTGTTGGAGCÄAGGCGTCGCCTCGGTGGGAGATCCAACC[Alpha]Ü.TGCCATGCTGTCGCGATCGA 

  
TGGGCX3AGCGCCCA[Upsilon][Upsilon]-TACGACGGCXM(^TCGTCACA[Sigma]ÄCTGGACTGCGTTCCCTTCTCGATCGTCGTC[Iota][Lambda]CAAGGACG 

  
CCTTGCGCTTCTACGATGAAGGCGAAGATGTGTGGCCGAAGCGTTACGCCATATGG[Sigma]GTCGCTTGGTGGCÄCAGCAGCC[Tau] 

  
GATCAGATCGCTTTCAGCATAATCGATCGGCAG[Sigma]CCGAAGACCTCT[Tau]CATGCCGTCAGT[Sigma]TTCCCCCCCGTGCAAGCGGA 

  
CÄCGATCGOKX^TGGCCGAGAAACTC^TCTGAATCRC^ 

  
GCGTGCCCGGCGAATTCGGCGGCC^GATCTCGACGACCTC<^<^ 

  
CGACCGATTAT GTGCCCCCGTTCAGCGCCTATCCTCTCCGGCCCGGGATCACCTTC[Alpha]CCTATCTCGG[Alpha]STCAAGGTAGA 

  
CAGCCGTGCGCGGGT(^TCATGGAGACAGGTGAGCCGACAAAAAACCTGTTTGCTTCXX3GGGAAATAATGGCGGGC[Alpha]GCA 

  
TTCTCGGCCAAGGTTATCTCGCTGGATTTGGAATGGCGATTGGTACCGTATTCGGCCGCATCGCGGGTTGGGAGGCCGCA 

  
CGTCATGCAGGATTTTGATCTC[Sigma]TAAAAATGCTGTCTGACTTGCCGTCGGCGCCGGAGCTGGAA[Sigma]CCÄGGCGCGTTATGG 

  
AGGTGTGCÄACGCX3TGCCGCTATTG01AAGGGTTCTGCGCGGTATTTCCTGCAATGACCTTGCAGCGTCATTTC[Sigma]CCAGC 

  
GGCGATCTCAGCCÄCCTCGCCAATC[Tau]CTGCCACTCGTGCCÄAGGTTGCTATTACGCCTGCCAATACGCCCCTCCGCATGA 

  
GTTCGGAATAAACGTTCCAAAGGCGCTGTCGGAGTTGCGGCTCGAGAGCTACGAGCAGCATGCTTGGCCCCGGCCGGTCG 

  
CCGCTCTCTATCGCAAGAATGCGCTCATCATTTCCATCTTGTCGGCGGCATGCATAACCGGCGTCCTTCTGCTTGCCGCC 

  
ATCTTCAACGGGGATGCACTTTTCGCGAAACACGCATCGGTGCCCGGCGGCGGGTTTTACAACGTTATTCCTTATCAGGC GATGATTGCCGTCGCGGCGACCACATTTCTTTATTCCGCGCTGGCGCTGGCGATCAGTCTCGTTCGCTTTTCGCG[Sigma]ACGA TCGGTCTGGGAATTAAGGTTCTTTATCAGCACGTGCCGGTTCTTCGGGCGCTACGCGATGCGGC[Sigma]ACTCTGCGATATCTC GGCGGCÄGCGACGGCGAGGGGTGTAACGACGCGGACGAGACATTTTCGACGACCCGGCGAAAATTTCATCACGCCCTTGC CTATGGCTTCGGACTTTGTTTCGCGGCCACAGCCACGGGCACGATCTACGATCÄTATGTTCGGCTGGCCGGCGCCCTATG CGCTTTTCAGCTTGCCGGTCGTCCTAGGGACCGTTGGGGGGATCGGAATGGTCGTGGGCGCGATCGGCCTACTCTGGCTC AAGCTGGCCGGCGAAGACGCTCCTCGATCACCGGCACTGCTTGGGCCGGATGTTGCCCTGTTGGTGCTTCTGCTTGCCAT AGCGGCAACGGGCCTCCTCCTTTTAGCGGTCCGCAGCACCGAAGTCA[Tau]GGGCGTCGCGCTCGCCGTCCATC[Tau]CGGCGTCG TCTTGGCCTTCTTTTTGGTGATGCCATACAGCAAATTTGTCCACGGTATCTTCAGGCTCACGGCTCTCGTGCGCCÄTCÄT GCTGACCGCGAGGCAAGTAATGGCTTCGCCTCCAGCCCTCCCÄCGAAAAAGGGTTAAACAATGGAACATATGAAGTCCGT 

  TCGCGATCGCAGTAGCGTCATGCAGATCGTGAGAGTGGCGAGTGGCAAC[Tau]GTCTCGAGCAATATGATTTCTTCG[Tau]TTACG GCT[Tau]CTATGCGGCATATATTGCGAGAAGCTTTTTTCCGACCGGCGATAACGCGACATCGCTCATGCTTTCATTGGCCÄCT TTTGGCGCTGGTTTCCTCATGAGGCCCTTGGGGGCGATTTTTCTCGGGTCCTACATCGATCGCGTCGGGCGTCGGAAAGG CCTGATCGTGACACTCGCGATCA[Tau]GGCCGTCGGAACCCTCACCATTGCGATGACTCCAAGCTATGAGGCÄATTGGA[Tau]TAC TCGCACCGGTTATCGTGCTCGTCGGGCGACTTTTGCAGGGTTTTTCCGCTGGAGCAGAGTCGGGTGGCGTCTCAGTGTAC TTGGCGGAAATTGCGTCGCCCAAATCGAGAGGCTTCTTCACCTCGTGGCAGTCTGCCAGCCAGCAGGTGGCCGTCATGAT CGCCGCCGCGATCGGTCTTGCGCTGO^TCAACGCTTTCACCGGAGCAAATGAACGACTGGGGATGGCGGGTGCCCTTGT TGATCGGATGCTTGATTATCCCCGTGATACTCTGGCTGCGCCGGTCTCTCCCGGAAACGAAAGCCTATCTCCACAGGAG CACAAGGCGCATTCGATCGGCGAATCCCTCCGCGAATTGCAACAGAGCTGGGGGCTGATCTTGACGGGCATGGCGATGTC GATCCTCACGACGACCACCTTTTACATGATTACCGCCTATACGCCGACATTTGGCGAGAAAGCACTCGGACTGAGCCCGC 

  AAGATGTCCTGCTGGTTACCÄTCATGGTCGGCGTGTCGAACTTCCTGTGGCTTCCGATCGGGGGTGCTCTCTCGGATCGT ATCGGTAGAACCCCGATCCTACTGGTCGTGCCGGTCACCGTTCTCGCCÄTCGCCTTTCCCCTGATGAGCTGGCTCGTCGC GGCACCGACATTCGGAGCGCTTGCAGCT[Sigma]TTCTGCTGACTTTCTCCGCATGCTTTGGACTCTATAATGGGGCGCTCATCG 

  
CGAGACTCÄCCGAGATTATGCCTCCCGCCATTAGAACCCTTGGCTTCTCGCTGGCGTTCAGTCTCGCGACCTCGCTGTTC 

  
GGCGGCTTCACCCCATTGGTAAGTACGGCGCTAATCCACGCGACGGGCAGCAATTCCGCGCCTGCAATCTGGCTCTGTTT TGCGGCTTTCATCAGCTTCGTCGGTGTGGCCGCATCGACCCGGCTGAGCCGGCCAATCGCCGAAGGCGCCAGATAGGACA ATCAGAGAATGCCCGTGCGGCAATGAAGCGAGA[Tau]TCGGGCGGTAGGTGCGCTGGCGGCÄCTTCGCGAAGAGCCGTTGCGG ACGGCTGAAACGATGATGGTATGAATGGGCTAAGACATGAGAGCAGTAGTTTACCGAAATGGCGAACTTGTCCTGGGGGC CTATGCTGATCCGATACCCGCCGCCGGGCAGGTGC[Tau]CGTCAAGACCAGAGCATGCGGCATCTGCGGATCTGACCT[Tau]CATT TTTGCGATCATGCGCAGGCGTTTACGAACCTT[Sigma]CATCGCGGGCGGGTATCGCCTCTATGGAAGTTGATTTGTGTCGAGAC ATCGTTCTGGGGCÄTGAATTCTGTGGCGAGATTATGGAGTTCGGGCCCTCTGCGGATCGTCGCTTCAAACCCGGACÄGCT TGTGT[Sigma]CTCGCTGCCGCTGGCGATCGGTCCGACCGGAGCGCGGACGATTGGC[Tau]ACTCGGATGAGTATCCCGGCGGGCTCG GCGAATATATGGTC<^CACGGAAGCGCTC[Tau]TGCTGCCTGTTCCGAACGGCCTTCCGGCGACCTGCGCGGCGTTGACGGAG CCGATGGCGGTGGGATGGCATGCCGTCGAGATC[Sigma]CGCÄGGTTCAACCACATCACATCCCTGTGGTGATCG[Sigma]GTGCGGACC 

  GGTCGGGTTGGCA[Sigma]TCGTCGCTGCCCTGAAACATAAGCAAGTTGCTCCGATTATTGCGTCGGATCCATCGCCCGATCGGC GTGCTCTTGCTCTGCGGATGGGCGCCGACGCCGTTGTCGATCCGCGCGAAGAATCACCCTTTCGCCAGGCCGAGAAGATC GCACGCCCGGTCGGA[Alpha]\AGGTGGGGCCCTGTCCAGCTCATTGCTGTCAAAGTCTCAAATGATATTCGAAT[Sigma]CGTAGGGGT GCCGGGCATGCTTCGGCATGCGA[Tau]GGACGGCGCGTCCGACGGGTCCGAGATCATGGTCGTTGGCGCATGCATGCAGCCGG ACGCGATCGAGCCCATGATCGGGATGTTTAAAGCGC[Tau]CACGATCÄAATTCTCGCGAACTTACACGGGTGAGGAATTCGCC GCGGTGCTTCACÄTGATAGGTGAGGGCGCACTCGACGTATCTCCGCTCGTTACCGATGTGATTGGCCTGTCCGATGTCCC GTCCGCGTTTGAGGCTCTACGGAGTCCAGGCGCCCAAGCAAAAGTGATTGTGGACCCTTGGCGCTGAGCCTGAGGATGCC AAGGGTGCGACGTTGGGCÄTCGTCÄAAGAAGGCGACGT[Tau]GACCCGGTATGTGAACATCCCC[Alpha]TATTCTTCCGCÄGCTGAA GCAGTTGGTAAACÄTGCCÄAAATATGAACTGTAGTATTGCGTCGGGGTTCTCATTGTGGGGTTTGCCÄTTGTCATCGCTC GCACCCGGCGACAAAGATTAGATGTACTTCCGATAATCCGTGCTC[Tau]CGACCTGGCCTTCCTTCÄTATATTTCAGGACCTC 

  TCCGACCÄTGCGTGCGGCGCGGATCGGGATCGGCÄGGCGTTGGTTCATCTGGGTCGAGTTCCAGTTGATCTTCGTAAGAG AGAACACC[Tau]CCTCGGCTAACTGCGCCGCGGTACTATCGCAGGATCGTCTCGAGCGTYCGC 

  
>Seq ID 2 ( fumA) 

  
ATGCGGAACGTCÄGCGACÄAGGCGCCGCCCCACGAGACGCTCACCGTAG[tau]CGTCGCGGCAATGATCGTTG[sigma]CACGGCCGC 

  
CTTGATGGTGCTTGGAATACAGCCCA[tau]CCTTCTCGGCGCCCTTGTAGAGGAGGGGCGTATTCCCGCCGAGGGGTTGGGAT 

  
CGGCGGC^U.CGGTGGAAATACTGGCGATCGCGGCGGGAAC^TGCATCGGACCCGTTCTTATGAAGACGGGATATCTGCGG 

  
GCGAAATGCGCGGCÄCTCTGCTTAATGCTCGCCGCAATCAACTTCGGATTGACGTTGCC[sigma]GGTTTCGATTTGCCCATCGT 

  
GGCT GCCGAGCGGCAGCGGGAGCCC GGAAGGTCTTTCGCTCAGCGCGGCGATCCTGATCATGACTCATAATCGGCGGC 

  
CGGACCGGCTGAGCGGAATAT[tau]TCTGGGCGCGCAGACGATACCGCÄGGTAATATCTGCTTATTTGCTCCCGACGGAGAT[tau] 

  
ATTCCGCGCTGGGGGAGCGCAGGCGGCTTCACGATCCTGGGCATTCTC[sigma]CGGCGATCGCCGCGATCGCGGCTC[tau]GTGCCT 

  
CGTCGATCGCGTTGAGCTCGATCCGACGACCGTTAACGACGACTTGCAGTGGTCÄCCCGCGGCGATC[sigma]TCÄTTTCGATGG 

  
CGGCA[tau]TCGTTCAATTCTCGGGGGTCGGTGCCGCA[tau]GGAGCTATCTGGAGCGACTGGCTGCGCAGCACGGATTTTCGGGA 

  
GAAACGATC[sigma]GTATCGCCATTTCCGGGAGTTTGCTTTGCCAGGTAGGCGGGGCTTGGCTGGCCGCTTGGATCGGTGGGCG 

  
GGTCGGATATCGCTTCGCCTTAATCGCTGGGAGCCTGCTTCÄGGCGGGCAACGTGATCGCÄTTGGCGGTG[sigma]CCGATCAGC 

  
C^GCTGGTTTATTTCCGCTTCCTGTGCTTTCGGCCT^ 

  
GCGATAGATAACÄGCCGGCAGCTTGCTGTACTGCTGACGCCGATCGCCCTCGTCGGGTTGAGCGCGGGGCCCTTGTTGCT 

  
CTCTCGCTTTGCCGGGGCGACCGACTTGCGCTGGATCTTTGTGGGGAGTTCGACCTTGTTGCTGGCCAGCGCGCTTCTGT 

  
ATCTTTGCGCTTCTCTGTTTCÄACCGCGCGGAAAGGTGATCGCTGAAACGGTGGACGTA 

  
>Seq ID 4 ( fumB) 

  
ATGACATCGCAGGTCAAGCTTCGTAGCGCGGCAAAGCGGCCGCGCAGTCCTAAAAGCGAGCGAGGTCT[tau]GCTCGTTACGA GTCCT[tau]GCTTGATGCGACCGACAGGCTGTTGGTCGATCTAGACCCCGATCAGGTCGGTCTCTATCÄGATTGCAGAGGAAG - 8 - 

  
CGGGTGCCTCACCGTCGTCCGTCTATCATTTCTTTCCGACCAAGGAAGTGGCTCÄTCTC[Sigma]CTCTGATGCGCCGCTATCTG GAGGGGCTCCGGAATCTCGACGCGATGGAAG[Tau]CGACATCGGCCAGCTCGAAAGCTGGCAGGACCTGATGAAGTTGGATCA GATCAGGGCGCGAGACTATTATAATAGCCACCCGCCCGCCCTCAAGCTTCTGTTCGGCGGATATGGCGGGGTCGAGGCCA GAAAGCTTGACGAGCGATACTCCGAGGAAATCGTGAGCTCCATGTATGGCAGATACAACGGCATTTTCCATATGCCGCAA ATGGAGAATGAGGCTCTCATGTTCACGATCTGCTTCGCAATTCTCGACGCGGTATGGGCCGTCTCCTTTCGCCGGTTCGG TGAAATTACGTCGGATTTTCTTCGGGAGGGGCÄAGCGGCTTGCATTGCCTATTGCCGAC[Alpha]CTATCTGCCCGAGCGAACGC CATCAGCGTGA 

  
>Seq ID 6 (fumC) 

  
GTGGCCAGCAAGTTCAACTGTGAGTTACTCGATCTGCGATCATTTGTTGCGGTGTATGAAACGCGAAGTTTTAGCCÄCGC 

  
CGCGCGGCTTCTGAATCAATCGCAGCCCGCGCTCAGCCGGAGAATCCAGCGCCTCGAGAGTC[Tau]CGTGGGCGGTCCGTTGT TCGAGCGGACCAGTCGGTCGCTTGCCGAAACGGCGCTCGGCAAAGAGTTGCTCCCGGTCGCCCACCGAGCGTTGGAACTT GTCGATACG[Tau]CGCTGTTTGCGTCGCCCAATGTCCGGGAGTTCCGCTGGACÄGACATCACGATTGCCTGTGTACAGACCGC CGCCTTCCATGTTCTCCCGCGAGCTGCGCGCTTGTACATGGATCAAAATCCGAGGGTCCGACTCCGCATCCTTGACGTGC CGGCGGTCGAGGCTGCGGACCTGGTTGCGAGCGGCGAGGCGGAGTTCGGCATCAGCÄTTGAGAGCCTGTTGCCATCAAGC CTGCGGTTCGATGCGCTCCACGAGGACCCGTTCGGCCTGGCATGCCACCGAAGCCATCCGCTGGC[Sigma]TCGCTCGAGATCCT TGAATGGACGCAATTGAAAGGTGAAAGCC[Tau]GATCGCCGTTCACCGTGCGAGCCGGAACCGCACGTTGCTCGATGCCGAAC TCGCGCGCAACAATATCGCGCTGGAATGGCGGTATGAGGTCGCGCATCTGACGACG[Sigma]CGCTGGGATTGATCGATGCGCAA T[Tau]GGGTG[Tau]CGCTGTTATGCCCCGCATGGTTA[Tau]GCCCC[Sigma]CTCGGGTCGGTCGGAGGTCGTCTGGCGCCCCGTCGTCGCGCC GGTCGTCCAACGCACGATCGGCÄTCGTTCAGCGCCGCÄCCGGCTCGATGCACCCTGCCGCACAGCÄATTGCTTGCGCGGC 

  TCCGCGCGGCCTGGTCGTCCGCCAATCTGGGCGACATCGCGTCTCGCGAAGATGGGGCÄTCGTGA 

  
>Seq ID 8 (fumD) 

  
GTGAAAGAGCACCÄATGCCGTGGCGGCCGGGCGTCCCCCGCTGCGCCCGCCACGTGGCT[Tau]GCGCGGATCAGCGTTTCCCG 

  
GGGGGCCTCCGCCATCGCCTGGACCTTCATGCTTGGCGCAACTGCCATTCCCGTGGCTGCGCÄAACTGACGATCCGAAGC 

  
CCGCCGGTCGGCGACCTGCGATGGCGGCCGCCGGCTCCGCCGAGGGC[Sigma]TGGGCGGGCACCAGGGACGGCCGCCGCTTTGC 

  
GCCCGATTGCATCGGGAACGAGCGGCTTAGAGAGGGGAGCCGGGCTGCCGGGACGA[Sigma]CGAAGACTGCCTCTATCTGAATA 

  
TCTGGTCTCCCAAACÄGGTCGGTAAGGGGGGGCTCCCCGTCATGATCTGGGTTTACGGCGGTGGGTTTAGCGGCGGTTCT 

  
GGCGCCÖTGCCATATTATGACGGCTCTGCGCTCGCGCAGAAGGGCGTGG[Tau]GGTCGTCACGTTCAACTATCGCGCCGGGAT 

  
TCTGGGCTTTCTTGCCC[Alpha]TCCGG[infinity]CTTTCÄAAG^ 

  
TCGCGGCGTTCÄAATGGGTTCAGAACÄACÄTAAGGGAGTTCGGCGGAGACCCGAACCGTGTC[Alpha]CGGTCTTTGGCGAGTCC 

  
GCCGGCGCGAGCGCGCTCGGACTGCTCCTGACCCGCCGCTC[Alpha]GTGAGAGCGCCTT[Alpha][Upsilon].TCAGGCGATACRGCAAAGTCC 

  
GGGTCTGGC(^GGCCGCTCGCCÄ[Alpha]XTTTCTGAAAGCGÄAGC^ 

  
GGCGTGCCGATGCGGGCGAATTGACGAAGATCGCGCAATCGCGAATACCCATGTCGCGCCÄGTTCACCAA[Sigma]CCGCGGCCG 

  
ATGGGTCCGATTCTGGACGGCTATGTTTTGCGCÄCCCTTGACGTCGATGCCTTCGCCAAGGGGGCCT CCGCAAGATACC 

  
CGTTCTGGTCGGCGGAAACGCCGACGAAGGGCGCGCT TTA[Alpha]BGATCGCCTGCCGGTCÄAAACGGTCCTTGAATATCGAG 

  
CCTATCTCACAGAACAATTTGGTGACGAGGCGGACGCATGGGAGCGTTGTTATCCCGCGAACTCCGACGCCGACGTCCCC 

  
GCCGCCGTTGCCCGTCTTTTTGGGGATAGTCAGTTC^[Lambda]CT[Lambda]CGGGAT[Alpha][Iota]AGCTGCRCTCGGC[Alpha]GCCTTCGCGAAATGGCG

  
AACGCCGCTTTGGAGATATCGCTTTACGGGCATTCCAGGAGCCGGCCGTCGCCCCGCCACGCATGGAGACGAAATTCCCT 

  
ATGTCTTCGCÄAATCTGGGGCCGTCGTCCGTATCTATGTTTGGGTC[Sigma]CTCGAAGG[Alpha]BGCGCCGGGGCGTCGGACÄ[Tau]CAAA 

  
CTTGCGACCGAAATGTCCGCGGCCTGGGTGAGCTTCGCGGTGCÄCGGGGTCCCCGATCAGGGCACGAAATCGCACTGGCC 

  
GCGCTTCGAGCGGCGAGGGGAGATCATGACTTTTGGTTCGCAGG[Tau]TGGCTCTGGGGAAGGTCTTGGAGT[Tau]TCGCCGAGCA 

  
AAGCCTGCCAACCCTCAAAATAG 

  
>Seq ID 10 (fumE) 

  
TTGGAGTTTCGCCGAGCÄAAGCCTGCCAACCCTCAAAATAGCGCCCGGCCTGTGCGTGCTTCAGCACGCCGTCCCGCTTT 

  
GCGGGCGACGGGCTGTGCCCTCTGCCTAGAAGGAAGTAAGTTGCGCTACGACGTCGCGATAATTGGAGGTGGCAACGCTG 

  
CATTGACGGCAGCCGTGACGGCGCGTGAAGCGGGGGCCTCGGTTCTTGTGATCGAGCATGCGCCGCGCGCCATGCGCGGC 

  
GGCAACAGTCGTCACACACGCAATATGCGTACGATGCACGAACGTCCCCTGTCGCCGTTGACCGGTGAATA[Tau]TCGGCGGA 

  
CGAATATTGGAATGATCTTGTCCGCGTI^CGGGGGGGCGCACCGACGAAGAACTCGCGCGGCTCGTTATCCGCAACACCA 

  
CCGACGCTATTCCCTTCATGACGCGCTGCGGTGTGCGTTTCCÄGCCCTCGCTGTCGGGCACGCTGAGTTTATCGCGAACC 

  
AACGCÄTTC TCCTTGGCGGCGGGAAGGCGCTTGTAAA[Alpha]X^TATTACGCCACGGCCGAACGGCTAGGCGTCGATATTCT TATGATTCTGAGGTGACCGAGATCAACCTTC^G[Alpha][Lambda]GGCGTCGTGCAGCGTCTGCAATTG[Alpha]SCAGCCGGGGAT[Tau]CCCTG 

  
TCGAAGTGGAAGCC^GGCTGCCÄTCGCCTCGTCCGGAGGATTCCAGGCAAA^ 

  
CCTGCIX3CXMCGAACTTCATCGTACGGGG<^CGC^ 

  
CGCCTCGGTGGGAGATCCAACCCAATGCCATGCTGTCGCGATCGATGGGCGAGCGCCCAAATACGAC[Sigma]GCGGCATCGTCA 

  
C[Alpha]CGACTGGAC[Pi][Omega]CGTTCCCTTCTCGATCGTCGTC^ 

  
CCGAAGCGTTACGCCATATGGGGTCGCTTGGTGG<^CÄGC[Alpha]GRC^ 

  
CGAAGACCTCTTCÄTGCC[Omega]TC[Alpha]GTGTTCCCCCCCGTC^ 

  
ATCCCGTAACCCTGGAACGCACGGTGGCCGAATTCÄACGCCGCATGCGTGCCCGGCX5AATTCGGCGGCCAAGATCTCGAC 

  
GACCTCCÄ(ÄCCGAGGGAATCGAACCÄAAGAAATCCA -CTGGGCCCGACCGATTATTGTGCCCCCGTTCAGCGCCTATCC 

  
TCTCCGGCCCGGGATCACCTTCACCTATCTCGGCGTCAAGGTAGACÄGCCGTGCGCGGGTCATCATG[Sigma]AGACAGGTGAGC 

  
CGA<^[Lambda]AAAACCTGTTTGCTTCGGGGGAAATAATGGCGGGCAGCA[Tau]TCTCGGCCÄAGGTTATCTCGCTGGAT[Tau]TGGAATG 

  
GCGATTGGTACCGTATTCGGCCGCATCGCGGGTTGGGAGGCCGCACGTCATGCAGGATTTTGA 

  
       

  
- 9 

  
   [phi]      

  
>Seq ID 12 (fu F) 

  
ATGCAGGATTTTGATCTCGTAAAAATGCTGTCTGACTTGCCGTCGGCGCCGGAGCTGGAAGCC[Alpha]GGCGCGTTATGGAGGT 

  
GTGCAACGCGTGCCGCTATTGCGAAGGGTTCTGCGCGGTATTTCCTGCAATGACCTTGCAGCGTCATTTCGCCAGCGGCG 

  
ATCTCAGCCACCTCGCCAATCTCTGCCACTCGTGCCAAGGTTGCTATTACGCCTGCCAATACGCCCCTCCGCATGAGTTC 

  
GGAATAAACGTTCCÄAAGGCGCTGTCGGAGTTGCGGCTCGAGAGCTACGAGCAGCATGCTTGGCCCCGGCCGGTCGCCGC 

  
TCTCTATCGCAAGAATGCGCTCATCÄTTTCCATCTTGTCGGCGGCATGCATAACCGGC[Sigma]TCCTTCTGCTTGCCGCCATCT 

  
TCÄACGGGGATGCACTTTTCGCGAAACACGCATCGGTGCCCGGCGGCGGGTTTTACAACGTTATTCCTTATCAGGCGATG 

  
ATTGCCGTCGCGGCGACCÄCATTTCTTATTCCGCGCTGGCGCTGGCGATCAGTCTCGTTCGC[Tau]TTTCGCGGACGATCGG 

  
TCTGGGAATTAAGGTTCTTTATCÄGCACGTGCCGGTTCTTCGGGCGCTACGC[Sigma]AT[Sigma]CGGCGACTCTGCGATATCTCGGCG 

  
GCA[Sigma]CGACGGCGAGGGGT[Sigma]TAACGACGCGGACGAGACÄTTT[Tau]CGACGACCCG[Sigma]CGAAAATTTCATCACGCCCT[Tau]GCCTAT 

  
GGCTTCGGACTTTGTTTC[Sigma]CGGCCACAGCCACGGGCACGATCTACGATCATATGTTCGGCTGGCCGGCGCCCTATGCGCT 

  
TTTC[Alpha]GCTTGCC[Sigma]GTCGTCCTAGGGACC[Sigma]TTGGGGGGA[Tau]CGGAATG[Sigma]TCGTGGGCGCGATCGGCCTAC[Tau]CTGGCTCAAGC 

  
TGGCCGGCGAAGACGCTCCTCGATCACCGGC[Alpha]CTGCTTGGGCCGGATGTTGCCCTGTTGGTGCTTCTGCTTGCCATAGCG 

  
GCAACGGGCCTCCTCCTTTTAGCGGTCCGCAGCACCGAAGTCATG[Sigma]GCGTCGCGCTCGCCGTCCÄTCTCGGCGTCGTCTT 

  
[Sigma]GCCTTCTTTTTGGTGATGCCATACAGCAAATTTGTCCACGGTATCTTCAGGCTCACGGCTCTCGTGCGCCATCATGCTG 

  
ACCGCGAGGCAAGTAATGGCT[Tau]CGCCTCCAGCCCTCCCACGAAAAAGGGTTAA 

  
>Seq ID 14 (fumG) 

  
ATGGAACATATGAAGTCCGTTCGCGATCGCAGTAGCGTCÄTGCAGATCGTGAGAGTGGCGAGTGGCAACTGTCTCGAGCA ATATGATTTCTTCGTTTACGGCTTCTATGCGGCÄTATATTGCGAGAAGCTTTTTTCCGACCGGCGATAACGCGACATCGC TCATGCTTTCÄTTGGCCACTTTTGGCGCTGGTTTCCTCATGAGGCCCTTGGGGGCGATTTTTCTCGGGTCCTACATCGAT CGCGTCGGGCGTCGGAAAGGCCTGATCGTGACACTCGCGATCÄTGGCCGTCGGAACCCTCACCATTGCGA[tau]GACTCCAAG CTATGAGGCAATTGGATTACTCGCACCGGTTATCGTGCTCGTCGGGCGACTTTTGCAGGGTTTTTCCGCTGGAGCAGAGT CGGGTGGCGTCTCAGTGTACTTGGCGGAAATTGCGTCGCCCÄAATCGA[sigma]AGGCTTCTTCACCTCGTGGCAGTCTGCCAGC CÄGCAGGTGGCCGTCATGA[tau]CGCCGCCGCGATCGGTCTTGCGCTGCAATCAACGCTTTCACCGGAGCAAATGAACGACTG GGGATGGCGGGTGCCCTTGTTGATCGGATGCTTGATTATCCCCGTGATACTCTGGCTGCGCCGGTCTCTCCCGGAAACGA AAGCCTATCTCCACATGGAGCACAAGGCGCATTCGATCGGCGAATCCCTCCGCGAATTGCAACAGAGCTGGGGGCTGATC TTGACGGGCÄTGGCGATGTCGATCCTCACGACGACCACCTTTTACATGATTACCGCCTATACGCCGACATTTGGCGAGAA 

  AGC^CTCGGACTGAGCCCGCAAGATGTCCTGC[tau]GGTTACCÄTCATGGTCGGCGTGTCGAACTTCCTGTGGCTTCCGATCG GGGGTGCTCTCTCGGATCGTATCGGTAGAACCCCGATCCTACTGGTCGTGCCGGTCACCGTTCTCGCCATCGCCTTTCCC CTGATGAGCTGGCTCGTCGCGGCÄCCGACATTCGGAGCGCTTGCÄGCrGTTCTG(^[sigma]ACTTTCTCCGCATGC[tau]TTGGACT CTATAATGGGGCGCTCATCGCGAGACTCACCGAGATTATGCCTCCCGCCATTAGAACCCTTGGCTTCTCGCTGGCGTTCA GTCTCGCGACCTCGCTGTTCGGCGGCTTCÄCCCCA[tau]TGGTAAGTACGGCGCTAATCCACGCGACGGGCÄGCAATTCCGCG CCTGCAATCTGGCTCTGTTTTGCGGCTTTCATCAGCTTCGTCGGTGTGGCCGCATCGACCCGGCTGAGCCGGCCAATCGC CGAAGGCGCCAGATAG 

  
>Seq ID 16 {fumH) 

  
ATGAGAGCAGTAGTTTACCGAAATGGCGAACTTGTCCTGGGGGCCTATGCTGATCCGATACCCGCCGCCGGGCAGGTGCT CGTC^^GACCÄGAGCÄTGCGGC[Alpha]TCTGCGGATCTGACCTTCATT[tau]TTGCGATCATGCGCAGGCGTTTACGAACCTTGCÄT CGCGGGCGGGTATCGCCTCTATG[sigma]AAGTTGATT[tau]GTGTCGAGACATCG[tau] C[tau]GGGGCATGAATTCTGTGGCGAGA[tau]TATG GAGTTCGGGCCCTCTGCGGATCGTCGCTTCAAACCCGGACÄGCTTGTGTGCTCGCTGCCGCTGGCGATCGGTCCGACCGG AGCGCGGACGATTGGCTACTCGGATGAGTATCCCGGCGGGCTCGGCGAATATATGGTCCTCÄCGGAAGCGCTCTTGCTGC CTG[tau]TCCGAACGGCCTTCCGGCGACCTGCGCGGCGTTGACGGAGCCGATGGCGGTGGGATGGCATGCCGTCGAGATCGCG CÄGGTTCAACCAf^TC[Alpha]C^TCCCTGTGGTGATCGGGTGCGGACCGGTCGGGTTGGCAG[tau]CGTCGCTGCCC[tau]GÄAACATAA GCAAGTTGCTCCGATTATTGCGTCGGATCCATCGCCCGATCGGCGTGCTCTTGC[tau]CTGCGGATGGGCGCCGACGCCGTTG TCGATCCGCGCGAAGAATCACCCTTTCGCCÄGGCCGAGAAGAT[infinity]<^CGCCCGGTCGGACÄAGGTGGG[sigma]CCCTGTCC[Alpha]GC TC^TTGCTGTCAAAGTCTCÄAATGATATTCGAATGCGTAGGGGTGCCGGGCATGCTTCGGCATGCGATGGACGGCGCGTC 

  CGACGGGTCCGAGATCATGGTCGTTGGCGCATGCATGCÄGCCGGACGCGATCGAGCCCATGATCGGGATGTTTAAAGCGC TCACGATCAAATTCTCGCGAACTTACACGGGTGAGGAATTCGCCGCGGTGCTTCACAT[sigma]ATAGGT[sigma]AGGGCGCACTCGAC GTATCTCCGCTCGTTACCGATGTGATTG[sigma]CCTGTCCGATGTCCCGTCCGCGTTTGAGGCTCTACGGAGTCCAGGCGCCCA AGCAAAAGTGATTGTGGACCCTTGGCGCTGA 

  
>Seq ID 18 (fuml) 

  
ATGGCGAACGGAAOiAGGCÄGAAAGATCT<^GAGAACGCGCCGAACGGGTCATTCCGGGCX3GGATGTACGGCCACGAGTCGACACGG 

  
TTGCTGCCGCCAGAATTCCCCCAGTTCTTCAGGCGCGCGCTGGGGGCACGAATTTGGGACGCCGACGAGCAGCCCTATATCGACTAT 

  
ATGT[sigma] 3<^TATGGGCCAAATTTGCTCGGTTACCGGCAATCCGAAATCGAAGCCGCGGCTGATGCGCÄ[sigma]CGACTTCTCGGCGACACC 

  
ATGACCGGTCCTTCGGAGATC[Alpha]TGGTCAACCTCGCC[Omega]^^ 

  
AATGGCÄGCGATGCCACCTCAACGGO^TGGTTCTCG[infinity]^^ 

  
CATGG[infinity]CTTCCCOSTGGAAC[Alpha]CTCCGCATACTGCCGGGATTCTCGCTTCCGATCGCGTGCATGTCGCATATTATACCTATAACGAC 

  
GCCCÄAAGCTTATCGGACGCGTTC^GGCG<^CGATGGCGATATTGC^ 

  
GACCAGGCCCTCGCCCÄGC[Gamma]TGAGTTCGCGCGC^ 

  
C[Sigma]CGCAGGTTTCCGGGTGGCGCGCGATTGCAGCTGGACGCÄTTTGGGTATCGAACCCGATC[Tau]CAGTTGCTGGGGAAAATGCTTTGCG AATGGCTATCCGATCTCCGCCCTGCTGGGCTCGAACÄAGGCGCGCGATGCGGCGCGGGATATATTTGTGACCGGCTCCTTC[Tau]GGTTC TCTGCGGTACCGATGGCGGCCGCGATCGAAACCCTCAGGATCATTCGAGAGACGCCTTATCTCGAAACGCTGATCGCCAGCGGCGCC - 10 - 

  
GCCCTGCGGGCAGGCCTGGAGGCÄCAGTCTCAGCGCCATGG[Tau]CTTGAGTTGAAGCAGACGGGCCCGGCGCAGATGCCGCAAATATTC TTTGC[Sigma]GACGATCCCGATTTTCGGATCGGCTATGCGTGGGCCGCGGCGTGCCTGAAGGGCGGCGTCTATGTTCATCCCTATCACAAT ATGTTTCTCTCTGCGGCCCATACAGTTGACGATGTAACGGAGACCCTCGAGGCGACGGATCGCGCGTTCAGCGCGGTCCTC[Alpha]GAGAT TTTGCGTCTCTCCAGCCTCATCCCATTTTAATGCAACTCGCCGGTGCTTGA 

  
>Seq ID 20 (fumJ) 

  
A[Tau]GTATCGGAAGTTCAGAATCGAAAAGCCCGGCAAGGCAAA[Tau]AGTTTGCTCGGCGCAGTAGCGCTCGGCACCCTCGCATTTCCTGTC 

  
TCTGCCAGTGCTCAGGATAGCGATCCCGCATCGATAGGTCAGCCGGACGAAGCGGACÄCGGACCGGGGAACGAGCGAAATCG[Tau]CGTG 

  
ACCGGCAGCCGCCTCCAGAACGGCTTCAATTCGCCGACGCCGGTTACÄGCCG[Tau]ATCCAGCGAGC[Alpha]GTTGAAGGAGGCATCTCCGACC 

  
AACCTTGCCGACGCACRCAACCAGCTGCCCGTGTTCAACGACAGCTTGAAGACCTCCAACCCTGGCACGACACCCG[Sigma]AACGGGGAAC 

  
AGCGGTCÄGAACCTGCTCAACATGCGCGGCCTCGGGTCAAACCGGAACCTCGTCCTGCTGAACX3GCÄACCGTTTCGTCGCGACCAAT 

  
TTCACÄ[Sigma]GCTCGGTCGATATCAACGTGCTGCCGCAGGCGTTGGTCAAGCGCGTCGATGTCGTGACGGGCGGCGCCTCGGCCGCCTAC 

  
GGTTCCGATGCCGTTTCGGGCGTC[Alpha]T[Alpha]^CTTCGTGCTCGACGAAGATCTGGAAGGCATCÄG[Sigma]GCCGAGCTCCAGTCGGGTG[Tau]TTCA 

  
ACCCGCGGCGACCTCCCGTCCTACGGCGGTTCGATCGCCTTCGGCACTTCGTTTGCCGACGACCGGTTGCÄCT GCTCGGCAGCTTC 

  
GAATA[Tau]TTTCGACAGGACGGAATCCGGGCCGATGAAGCAACGGGTCGCCGCTGGTTCGACATCGCCGCCGGCCÄATATCCCGTGCCC 

  
GGCGCTACGACAGGCGTCACGGTCGTGCCCGATATTCGCAGTTCTCGCGGATCCTACGGCGGACTTGTC[Alpha]CGTCCGGCCCTCTGAAA 

  
GGCATCGCGTTT[Tau]TGCCCGGAGGAGTCCTA[Sigma]GGACCTTCGACTACGGGAATT[Tau]TACGAGCTCGTCGTTCCAGAGCGGCGGCGATGGA 

  
CCGCGCGTGAATATCGGCTTCGCCCCGGATCAGCTTCGCTACÄACGCGTTCCTACGCGCCGCÄTATGAT[Sigma]TGTCCGACACTGTGCAG 

  
GTGTATGCGGAGGGCACCTATGCTTATTCCCACACCAACCTGGGTGCATTCGTAATATCGCÄT[Sigma]TCGGTGGCTCGAATAATTTCCGG 

  
ATCTTCCGTGATAACGCCTTCCTTCCGGCTCCACTCGCGACGCTCÄTGGACAGAAATGCCCAGGCTTCGATCGTTGTCGGTCGCTTC 

  
TCAAGCGACTTTCCCTTGGTCGAAATCGAGAAT[Tau]TCGCAAAGGTCTACCGCGGCGCTGCCGGCTTCCGGGCAGACATTGGCAATGGC 

  
TGGAAACTCGATGGCTCGGCCTCCTTTGGCCTTACGGACCTCGAGC[Tau]TCGTGAAAACAATCTCACCATCAACCGCÄATCTCTACGCC 

  
GCCGTCGATGCGGTCCGCGATCCCGCGGGCAATATCGTCTGCCGTTCAACACTGGCCGGCCTCGACCÄAGATTGCGTGCCGCTCAAT 

  
CTCTTCGGCACÄGGCTCGCCGAGCGCGTCGGCCATCGACTATGTCACCGCTGATGGCGTCGCTCÄGCTGAGGCTTGAGCAATATGTG 

  
GCGGGACTCACGATTTCCGGCGACCTCGGCGATAGCCTGTCGTTCGGCGCGGGCCCGGTCTCGGTCGCCGCTGGTATCGAATATCGC 

  
AAGGAGAAGGCCCGGC^GGAAACCGACGCGATATCGCÄGGCGACGACCTCGATC[Alpha]CGGGAATC[Alpha]GGGGGGCTCCGGCGGCGC[Alpha]GGCÄ 

  
GGTCGGCCTGGAGGCTTCAATCTCTACAACCCACTTCCCTTCTCGGGAAGCTATGAC[Alpha]TC[Alpha]AG[Sigma]AAGGTTTTGTCGAAATCGGCGTC 

  
CCGATTCTGAAGGACÄGCGCGCTGGGACGTTCGCTGAACTTAAACGGCGCCGTCCGATATGCCGATTACAGCCAGTCCGGTGGAGTA 

  
ACAACCTGGAAGCTGGGCGGAGAATATGAGCCGATCGACGGCCTCAGGTTCCGCGCGACCCGTTCGCGAGA[Tau]ATCCGCGGGCCAAGC 

  
CTTGTCGAGCTATTCGACCCCGGCCGTCAG[Sigma]CGACGCTCAATTCAATTTATGGCGGACAGGCTGTGCAGACGCGGTTCTTTACCGCC 

  
GGCÄACGCGGATTTGCGCCCTGAAAAGGCGGACGTCCTTACATTCGGCGCGGTGCTACGCCCCGCCTTCG[Tau]GCCGGGGTTTCAGTTT 

  
TCGGTCGATCGCTATGTGGTGAAGGTGAAGGGCGCGATCGATTTCCTCCTTCCCCÄGCÄGGAAATCGACGCGTGCGATGCAGGAAAC 

  
ACCTTCTTCTGCGACCTCATAACGGAGAATCCGGACGGCÄC<^T 

  
GC[Sigma]GGAATTGAC[Tau]TCGAGGCCTATTACTCACGCCCCGTCGGCGGCGGCACGTTCAGTCTTCGTGCGCTGGCÄACGCACCATACCTCT 

  
GCCTATCGCÄTCGCGACCGGCTCGGCGCCC^TCCGTTCGCTCGGACAACCGGA(^CGCCAAAATGGTCGGCCÄACTTCCAGGCGCGA 

  
TATTO^CCGACGATTGGGCGCTTCTCGTGCÄGCÄGCGCTTCATCGC[Alpha]GCÄTCGGTGTTCÄATGCCGACÄATGTGGAGGGCGTCGAT 

  
ACGAATTTGAACCACGCTCCGGCGGTTTGGTACÄCCGACGCGACATTGACCTTCGACATCGCGGCTTTTGGCCAGAAGC[Alpha]GCAGCTG 

  
TTTCTATCGGTCAATAATTTGTTCGACCGAGATCCGCCAA[Tau]AGCGACGAACGACCCCAGCAGTTTTTCCAGCCCGACCÄGCTCTGCC 

  
TATGATCCGGTCGGCCGCTATTTTAATGTCGGGGTCCGTTTCCGGATCTGA 

  
>Seq ID 22 (fumK) nicht vollständig 

  
ATGCGCCTCACGGGCGGAGAATTATTGGCACGATGTTTGGCCGTCGAAGGCGTCCGGTATGTCTTCGGCCTCATGTCGCCGGAGGTG 

  
GATCCGCTCCTGGCTGCGCTCGAAGACAATGGGATATTGTTCGTCCCGGTGCGGCACGAGGCCGCCGCAGCCTATATGGCCGAGGGC 

  
ATTTACAAGACCACCGGACÄGG[tau]CGCCGCGATTGTCACGAATCCGGGTCCCGGTACGGCAAACCTTCTGCCTG[sigma]AGTCGTGACGGCÄ 

  
CGCC[Alpha]CGAAGGGGTTCCCTTCGTCG<^TAACGTCCCAGCAT 

  
CAAGACCAGATCGACCTCTTTCGACCCGCGGT[tau]AAATGGGGCGCACCCATCTTC[sigma]CCTGGAACCGGATTGTCGAAATCÄCCCÄTATG 

  
GCGTTCCGGGAAATGTGGGCCGGCÄGGCCGGGACCCGTTCAGTTGGAAATCCCGARGTCTGTGATGTATGKTGTGGGCGAACGAGGA 

  
CCACGGTAGAAGTTTACRGATCGCCGACA... 

  
>Seq ID 24 

  
A[Tau]GGAATTGAGCCGCCAACGAGACCAGGCCTTGAGGGAGCGCGCCCAAGCGGTGATCCCGGGCGGGATGTACGGTCACGAGTCGACC 

  
TATCTGATGCCCGAGGGCACGCCÄCAGTTCT[Tau]CAGTCGCGGCAAAGGCGCCCGACTTTGGGACGCCGACGGCAACGAGTATGTCGAT 

  
TACÄTGTGCGCCTATGGCCC[Alpha]^CCTGCTGGGTTACGGCTTCGAACCCGTCGAAGCGGCCGCCGCÄGCC(^-GCÄAGCCCGGGGCGAT 

  
ACCCTGACCGGGCCGTCGGAGGTGATGGTGCÄGTTGGCGGAAGACTT[infinity]TCGCGCAAATCAGCCÄCGCGGACTGGGCCATGT[Tau]CTGC 

  
AAGAAC[Sigma]GCACÄGACGCCACCTCÄATG[Sigma]CX^TGGTCA[Tau]CGCGCGCGCACACACCGGCCGGAAGACGATCCTCTGCGCGAAAGGCGCC 

  
TATC[Alpha]TGGGGCCGCGCCITGGTGCÄCGCCGATCCTGGC 

  
GACGCCCAAAGCCTCGTCGACGCC TCGAGGCCC[Alpha]TCAGGACGACGTCGCGGCGATCTTCGCCACCCCTCACCGTCACGAGGTGTTC 

  
AG ^CCAGATCGATCCTGATCCGGAATATGOSGCCAGCGTGCGGGCGCTCTGCGACA^GAGCGGCGCCCTGCTCGTCGTCGACGAA 

  
GTTCGÄGCCGGGTTCÄGGATTOCGCGCGACTGCAGCTGGGC^ 

  
GCCAA[infinity]GCTATCCGATCTCGGCGGTCCTAGGGGGCGAAAAGGTC^ 

  
TTCTCGGCCACGCCCATGGCCGC[Alpha]GCCGTCGAAACCCTGAAGCÄAATCCGCX3AGACCGACTATCTCGAGCX3GATCAACGCGGCCGGG 

  
ACCCGCCTGCGCGAGKMCCTGCAGC^G<ÄGGCTGCTCÄ<^ 

  
CTCTTCGAGGAAGATCCCGATTTTCGGGTCGGCTACGGCTGGG[Tau]TCGCGAATGCCTGAAGCGAGGGGTGTACTTCAGCCCCTACCAT 

  
AACATGTTCCTGTCGGCGGCCCATAGC[Sigma]AGGCGGACCTGGCCAAGACCCTTGCGGCTACCGGCGACGCCTTCGTCGAGCTACGCGCC 

  
AAGCTTCCGAGCCTAGAAATCCACCAACCCCTCCTCGCCCTGAGAGCGGCCTAA 

  
        

  
Enzyme 

  
Sequenzen : 

  
>Seq ID 3 (FumA) 

  
MRNVSDKAPPHETLTVWAAMIVGTAALMVLGIQPILLGALVEEGRIPAEGLGSAATVEI LAIAAGTCIGPVLMKTGYLRAKCAALCLMLAAINFGLTLPGFDLPIVACRAAAGALEGLS LSAAILIMTHNRRPDRLSGIFLGAQTIPQVISAYLLPTE11PRWGSAGGFTILGILAAIA AIAALCLVDRVELDPTTVNDDLQWSPAAIVISMAAFVQFSGVGAAWSYLERLAAQHGFSG ETIGIAISGSLLCQVGGAWLAAWIGGRVGYRFALIAGSLLQAGNVIALAVADQPSWFISA SCAFGLFWLAMQPFQIRFAIAIDNSRQLAVLLTPIALVGLSAGPLLLSRFAGATDLRWIF VGSSTLLLASALLYLCASLFQPRGKVIAETVDV 

  
>Seq ID 5 (FumB) 

  
MTSQVKLRSAAKRPRSPKSERGLARYESLLDATDRLLVDLDPDQVGLYQIAEEAGASPSS VYHFFPTKEVAHLALMRRYLEGLRNLDAMEVDIGQLESWQDLMKLDQIRARDYYNSHPPA LKLLFGGYGGVEARKLDERYSEEIVSSMYGRYNGIFHMPQMENEALMFTICFAILDAVWA VSFRRFGEITSDFLREGQAACIAYCRHYLPERTPSA 

  
>Seq ID 7 (FumC) 

  
VASKFNCELLDLRSFVAVYETRSFSHAARLLNQSQPALSRRIQRLESLVGGPLFERTSRS 

  
LAETALGKELLPVAHRALELVDTSLFASPNVREFRWTDITIACVQTAAFHVLPRAARLYM 

  
DQNPRVRLRILDVPAVEAADLVASGEAEFGISIESLLPSSLRFDALHEDPFGLACHRSHP 

  
LASLEILEWTQLKGESLIAVHRASRNRTLLDAELARNNIALEWRYEVAHLTTALGLIDAQ 

  
LGVAVMPRMVMPRSGRSEWWRPWAPWQRTIGIVQRRTGSMHPAAQQLLARLRAAWSS 

  
ANLGDIASREDGAS 

  
>Seq ID 9 (FumD) 

  
VKEHQCRGGRASPAAPATWLARISVSRGASAIAWTFMLGATAIPVAAQTDDPKLVRHTQS 

  
GAVEGVEGDVETFLGIPFAAPPVGDLRWRPPAPPRAWAGTRDGRRFAPDCIGNERLREGS 

  
RAAGTSEDCLYLNIWSPKQVGKGGLPVMIWVYGGGFSGGSGAVPYYDGSALAQKGWWT 

  
FNYRAGILGFLAHPALSKESPNGVSGNYGLLDMLAAFKWVQNNIREFGGDPNRVTVFGES 

  
AGASALGLLLTSPLSESAFNQAILQSPGLARPLATLSESEANGLELGADISALRRADAGE 

  
LTKIAQSRIPMSRQFTKPRPMGPILDGYVLRTLDVDAFAKGAFRKIPVLVGGNADEGRAF 

  
TDRLPVKTVLEYRAYLTEQFGDEADAWERCYPANSDADVPAAVARLFGDSQFNNGIELLS 

  
AAFAKWRTPLWRYRFTGIPGAGRRPATHGDEIPYVFANLGPSSVSMFGSLEGGAGASDIK 

  
LATEMSAAWVSFAVHGVPDQGTKSHWPRFERRGEIMTFGSQVGSGEGLGVSPSKACQPSK 

  
>Seq ID 11 (FumE) 

  
LEFRRAKPANPQNSARPVRASARRPALRATGCALCLEGSKLRYDVAIIGGGNAALTAAVT 

  
AREAGASVLVIEHAPRAMRGGNSRHTRNMRTMHERPLSPLTGEYSADEYWNDLVRVTGGR 

  
TDEELARLVIRNTTDAIPFMTRCGVRFQPSLSGTLSLSRTNAFFLGGGKALVNAYYATAE 

  
RLGVDILYDSEVTEINLQQGWQRLQLRSRGFPVEVEAKAAIASSGGFQANLDWLSSAWG 

  
PAAANFIVRGTPYATGTVLKNLLEQGVASVGDPTQCHAVAIDGRAPKYDGGIVTRLDCVP 

  
FSIWNKDALRFYDEGEDVWPKRYAIWGRLVAQQPDQIAFSIIDRQAEDLFMPSVFPPVQ 

  
ADTIAGLAEKLGLNPVTLERTVAEFNAACVPGEFGGQDLDDLHTEGIEPKKSNWARPIIV 

  
PPFSAYPLRPGITFTYLGVKVDSRARVIMETGEPTKNLFASGEIMAGSILGQGYLAGFGM 

  
AIGTVFGRIAGWEAARHAGF 

  
>Seq ID 13 (FumF) MQDFDLVKMLSDLPSAPELEARRVMEVCNACRYCEGFCAVFPAMTLQRHFASGDLSHLAN - 12 

  
LCHSCQGCYYACQYAPPHEFGINVPKALSELRLESYEQHAWPRPVAALYRKNALIISILS AACITGVLLLAAIFNGDALFAKHASVPGGGFYNVIPYQAMIAVAATTFLYSALALAISLV RFSRTIGLGIKVLYQHVPVLRALRDAATLRYLGGSDGEGCNDADETFSTTRRKFHHALAY GFGLCFAATATGTIYDHMFGWPAPYALFSLPWLGTVGGIGMWGAIGLLWLKLAGEDAP RSPALLGPDVALLVLLLAIAATGLLLLAVRSTEVMGVALAVHLGWLAFFLVMPYSKFVH GIFRLTALVRHHADREASNGFASSPPTKKG 

  
>Seq ID 15 (FumG) 

  
MEHMKSVRDRSSVMQIVRVASGNCLEQYDFFVYGFYAAYIARSFFPTGDNATSLMLSLAT 

  
FGAGFLMRPLGAIFLGSYIDRVGRRKGLIVTLAIMAVGTLTIAMTPSYEAIGLLAPVIVL 

  
VGRLLQGFSAGAESGGVSVYLAEIASPKSRGFFTSWQSASQQVAVMIAAAIGLALQSTLS 

  
PEQMNDWGWRVPLLIGCL11PVILWLRRSLPETKAYLHMEHKAHSIGESLRELQQSWGLI 

  
LTGMAMSILTTTTFYMITAYTPTFGEKALGLSPQDVLLVTIMVGVSNFLWLPIGGALSDR 

  
IGRTPILLWPVTVLAIAFPLMSWLVAAPTFGALAAVLLTFSACFGLYNGALIARLTEIM 

  
PPAIRTLGFSLAFSLATSLFGGFTPLVSTALIHATGSNSAPAIWLCFAAFISFVGVAAST 

  
RLSRPIAEGAR 

  
>Seq ID 17 (FumH) 

  
MRAWYRNGELVLGAYADPIPAAGQVLVKTRACGICGSDLHFCDHAQAFTNLASRAGIAS 

  
MEVDLCRDIVLGHEFCGEIMEFGPSADRRFKPGQLVCSLPLAIGPTGARTIGYSDEYPGG 

  
LGEYMVLTEALLLPVPNGLPATCAALTEPMAVGWHAVEIAQVQPHHIPWIGCGPVGLAV 

  
VAALKHKQVAP 11 ASDPS PDRRALALRMGADAWDPREES PFRQAEKI ARPVGQGGALS S 

  
SLLSKSQMIFECVGVPGMLRHAMDGASDGSEIMWGACMQPDAIEPMIGMFKALTIKFSR 

  
TYTGEEFAAVLHMIGEGALDVSPLVTDVIGLSDVPSAFEALRSPGAQAKVIVDPWR 

  
>Seq ID 19 (FumI) 

  
MANGTRQKDLRERAERVIPGGMYGHESTRLLPPEFPQFFRRALGARIWDADEQPYIDYMC 

  
AYGPNLLGYRQSEIEAAADAQRLLGDTMTGPSEIMVNLAEAFVGMVRHADWAMFCKNGSD 

  
ATSTAMVLARAHTGRKTILCAKGAYHGASPWNTPHTAGILASDRVHVAYYTYNDAQSLSD 

  
AFKAHDGDIAAVFATPFRHEVFEDQALAQLEFARTARKCCDETGALLWDDVRAGFRVAR 

  
DCSWTHLGIEPDLSCWGKCFANGYPISALLGSNKARDAARDIFVTGSFWFSAVPMAAAIE 

  
TLRIIRETPYLETLIASGAALRAGLEAQSQRHGLELKQTGPAQMPQIFFADDPDFRIGYA 

  
WAAACLKGGVYVHPYHNMFLSAAHTVDDVTETLEATDRAFSAVLRDFASLQPHPILMQLA 

  
GA 

  
>Seq ID 21 (FumJ) 

  
MYRKFRIEKPGKANSLLGAVALGTLAFPVSASAQDSDPASIGQPDEADTDRGTSEIWTG 

  
SRLQNGFNSPTPVTAVSSEQLKEASPTNLADALNQLPVFNDSLKTSNPGTTPGTGNSGQN 

  
LLNMRGLGSNRNLVLLNGNRFVATNFTGSVDINVLPQALVKRVDWTGGASAAYGSDAVS 

  
GVINFVLDEDLEGIRAELQSGVSTRGDLPSYGGSIAFGTSFADDRLHLLGSFEYFRQDGI 

  
RADEATGRRWFDIAAGQYPVPGATTGVTWPDIRSSRGSYGGLVTSGPLKGIAFLPGGVL 

  
GTFDYGNFTSSSFQSGGDGPRVNIGFAPDQLRYNAFLRAAYDVSDTVQVYAEGTYAYSHT 

  
NLGAFVISHVGGSNNFRIFRDNAFLPAPLATLMDRNAQASIWGRFSSDFPLVEIENFAK 

  
VYRGAAGFRADIGNGWKLDGSASFGLTDLELRENNLTINRNLYAAVDAVRDPAGNIVCRS 

  
TLAGLDQDCVPLNLFGTGSPSASAIDYVTADGVAQLRLEQYVAGLTISGDLGDSLSFGAG 

  
PVSVAAGIEYRKEKARQETDAISQATTSITGIRGAPAAQAGRPGGFNLYNPLPFSGSYDI 

  
KEGFVEIGVPILKDSALGRSLNLNGAVRYADYSQSGGVTTWKLGGEYEPIDGLRFRATRS 

  
RDIRGPSLVELFDPGRQATLNSIYGGQAVQTRFFTAGNADLRPEKADVLTFGAVLRPAFV 

  
PGFQFSVDRYWKVKGAIDFLLPQQEIDACDAGNTFFCDLITENPDGTITVTGPNLNLAV 

  
QKAAGIDFEAYYSRPVGGGTFSLRALATHHTSAYRIATGSAPIRSLGQPDTPKWSANFQA 

  
RYSTDDWALLVQQRFIAASVFNADNVEGVDTNLNHAPAVWYTDATLTFDIAAFGQKQQLF 

  
        

  
- 13 

  
LSVNNLFDRDPPIATNDPSSFSSPTSSAYDPVGRYFNVGVRFRI 

  
>Seq ID 23 (FumK) nicht vollständig 

  
MRLTGGELLARCLAVEGVRYVFGLMS PEVDPLLAALEDNGI LFVPVRHEAAAAYMAEGI Y KTTGQVAAIVTNPGPGTANLLPGWTARHEGVPFVAITSQHQLGWYPCTPKTFQGQDQI DLFRPAVKWGAP I FAWNRI VE I THMAFREMWAGRPGPVQLE I PXS VMYWGERGPR - KFX DRR . . . . 

  
>Seq ID 25 

  
MELSRQRDQALRERAQAVIPGGMYGHESTYLMPEGTPQFFSRGKGARLWDADGNEYVDYM 

  
CAYGPNLLGYGFEPVEAAAAAQQARGDTLTGPSEVMVQLAEDFVAQISHADWAMFCKNGT 

  
DATSMAMVIARAHTGRKTILCAKGAYHGAAPWCTPILAGTLPEDRAFWYYDYNDAQSLV 

  
DAFEAHQDDVAAIFATPHRHEVFSDQIDPDPEYAASVRALCDKSGALLWDEVRAGFRIA 

  
RDCSWAKIGVAPDLSTWGKCFANGYPISAVLGGEKVRSAAKAVYVTGSFWFSATPMAAAV 

  
ETLKQIRETDYLERINAAGTRLREGLQQQAAHNGFTLRQTGPVSMPQVLFEEDPDFRVGY 

  
GWVRECLKRGVYFSPYHNMFLSAAHSEADLAKTLAATGDAFVELRAKLPSLEIHQPLLAL 

  
RAA- 

  
Gemäss einer bevorzugten Weiterbildung wird das erfindungsgemässe Verfahren so geführt, dass di-e Mykotoxine, insbesondere Fumonisine, sauersto funabhängig bzw. anaerob abgebaut werden. Dadurch, dass die Mykotoxine, insbesondere Fumonisine sauerstoffunabhängig abgebaut werden, gelingt es, das erfindungsgemässe Verfahren so weiterzubilden, dass die Nukleinsäuresequenzen von Genen bzw. Enzyme ohne Zusatz von molekularem Sauerstoff sicher und zuverlässig die Abbaureaktionen durchführen, wodurch der so hergestellte Zusatzstoff in sämtlichen sauerstoffunabhängigen bzw. anaeroben Medien, wo Mykotoxine möglicherweise abgebaut werden müssen, zum Einsatz gelangen kann, wie beispielsweise in Nahrungsmitteln für Menschen und Tiere, der Bioethanolherstellung, aber auch zur Herstellung bzw. Produktion von gentechnisch veränderten, landwirtschaftlichen Nutzpflanzen. 

  
Gemäss einer Weiterbildung wird das erfindungsgemässe Verfahren so geführt, dass vor Einsatz der Enzyme in dem pflanzlichen Ausgangsmaterial diese mittels molekulargenetischer Methoden, Mutagenese oder molekularer Evolution verändert werden. Indem das Verfahren so geführt wird, dass die Enzyme vor ihrem Einsatz in dem pflanzlichen Ausgangsmaterial mittels molekulargenetischer Methoden, Mutagenese oder molekularer Evolution verändert werden, 

  
  -      

  
- 14 

  
gelingt es, die Enzyme in noch stabilerer und an den späteren Einsatzzweck angepasster Form herzustellen, wodurch der sauerstoffunabhängige Abbau von Mykotoxinen, insbesondere Fumonisinen, noch weiter verbessert bzw. vervollständigt werden kann. 

  
Gemäss einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung wird das Verfahren so geführt, dass die Enzyme isoliert werden. Durch eine derartige Verfahrensführung können insbesondere Fumonisine vollständig und sauerstoffunabhängig abgebaut werden. 

  
Gemäss einer weiteren bevorzugten Weiterbildung der Erfindung wird das Verfahren so geführt, dass die Enzyme in einer Schutzhülle verkapselt werden. Durch Verkapseln der Enzyme in einer Schutzhülle gelingt es, die Enzyme ohne Veränderung, insbesondere ohne Abbau und Schädigung an ihren Einsatzort, insbesondere beispielsweise in den Verdauungstrakt, zu transportieren, so dass erst nach Auflösung der Schutzhülle, beispielsweise im MagenDarm-Trakt von Menschen oder Tieren, die Enzyme zu wirken beginnen, wodurch ein noch gezielterer, rascherer und vollständiger Abbau der Mykotoxine im sauerstoffunabhängigen Milieu des MagenDarm-Trakts erzielt werden kann, und gleichzeitig Mykotoxine, insbesondere Fumonisine, daran gehindert werden können, ihre schädliche Wirkung auf diejenigen Lebewesen auszuüben, welche diese mit der Nahrung aufgenommen haben. 

  
Gemäss einer bevorzugten Weiterbildung wird das erfindung[epsilon]gemässe Verfahren so geführt, dass die Enzyme aus Permease ID-Nr. 3, Carboxylescerase ID-Nr. 9, Tricarballylat-Dehydrogenase ID-Nr. 11, Citratverwertungsprotein ID Nr. 13, Alkohol-Dehydrogenase IDNr. 17, Aminotransferase ID-Nr. 19 und/oder Acetolactat-Synthase ID-Nr. 23 gewählt werden. Durch eine derartige Verfahrensführung können insbesondere Fumonisine glatt und vollständig im sauerstoffunabhängigen Milieu abgebaut werden. In diesem Fall wird bei den aus dem Gencluster der Nukleinsäuresequenz mit der ID-JSTr. 1, welche aus einem prokaryotisehen Stamm mit der Hinterlegungsnummer DSM 16254 stammt, isolierten Fum-Genclustern die Transkription der offenen Leserahmen durch einen bidirektionalen Promotor 

  
 *  

  
- 15 

  
gesteuert bzw. geregelt, der zwischen FumA und FumI, wie dies der nachfolgenden Tabelle 1 entnehmbar ist, angeordnet ist. Die Cluster codieren für Proteine, welche in der Regulierung der Genexpression, wie beispielsweise FumB und FumC, bei der Substratabtastung und dem Transport, wie beispielsweise FumA, FumJ, FumG und in dem Substratkatabolismus, wie beispielsweise FumD, FumE, FumF, FumH, FumI, FumK involviert sind. Aus diesen Nukleinsäuresequenzen, welche für spezielle Gene bzw. Enzyme codieren, wurden gemäss einer bevorzugten Weiterbildung des Verfahrens gemäss der Erfindung die Gene ausgewählt, welche für den Substratkatabolismus verantwortlich sind, wodurch die entsprechenden gebildeten Enzyme das Substrat, nämlich Fumonisine vollständig katabolisieren können. 

  
In diesem Fall werden beispielsweise aus dem Geneluster der Nukleinsäuresequenz mit der ID-Nr. 1 ausgewählte, offene Leserahmen in prokaryotisehen oder eukaryotisehen Wirtszellen zur Expression gebracht. Im bakteriellen Stamm mit der Hinterlegungsnummer DSM 16254 erfolgt die Transkription der im Geneluster mit der ID-Nr. 1 enthaltenen, offenen Leserahmen, gesteuert bzw. geregelt durch einen bidirektionalen Promotor, der zwischen fumA und fuml, wie dies der nachfolgenden Fig. 1 entnehmbar ist, angeordnet ist. Die Gene codieren für Proteine, welche in der Regulierung der Genexpression, wie beispielsweise FumB und FumC, bei der Substraterkennung und dem Transport, wie beispielsweise FumA, FumJ, FumG, und im Substratkatabolismus, wie beispielsweise FumD, FumE, FumF, FumH, FumI und FumK, involviert sind. 

  
In der nachfolgenden Tabelle 1 ist die Bezeichnung der Gene des fumonisinkatabolischen Genclusters aufgeführt, wobei 0 die Orientierung, nämlich f forward und r reverse, bedeuten. 

  
 *      *  

  
Tabelle 1 

  
Gen Sequenz 0 Start Ende Länge Bezeichnung ID fumA 2 f 5214 6395 1182 Permease fumB 4 f 6418 7068 651 tetR-artiger Transkriptionsregulator fumC 6 f 7232 8176 945 lysR-artiger Transkriptionsregulator fumD 8 f 8294 9916 1623 Carboxylesterase fumE 10 f 9876 11378 1503 Tricarballylatdehydrogenase fumF 12 f 11494 12537 1044 Citratverwertungsprotein B fumG 14 f 12541 13836 1296 Tricarballylatprotonensymport fumH 16 f 13957 15027 1071 Alkoholdehydrogenase f ml 18 r 5063 3795 1269 Aminotransferase fumJ 20 r 3513 679 2835 TonB-abhängiger Rezeptor fumK 22 r 551 ? <->? Acetolactatsynthase (teilweise)
 <EMI ID=16.1> 
 

  
Indem das erfindungsgemässe Verfahren bevorzugt so geführt wird, dass ein Enzym eingesetzt wird, welches wenigstens 90 % Sequenzidentität mit wenigstens einem der Enzyme ID-Nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 oder 25 aufweist, kann ein noch vollständigerer Abbau der Fumonisine sichergestellt werden, wobei gleichzeitig nicht nur Fumonisine, sondern auch verwandte bzw. strukturell ähnliche Mykotoxine vollständig insbesondere im anaeroben bzw. sauerstoffunabhängigen Milieu entgiftet werden können, wie zum Beispiel das AAL Toxin. 

  
Indem das Verfahren bevorzugt so geführt wird, dass bei Einsatz von Aminotransferase ID-Nr. 19 als Cosubstrat ein Keton, insbesondere eine [alpha]-Ketosäure, eingesetzt wird, kann insbesondere beim Abbau der Aminogruppe von Fumonisin und gleichzeitigem Einsatz von einer [alpha]-Ketosäure, wie beispielswe *ise Brenztraubensäure, die Aminogruppe an dem Fumonisinmolekül durch eine Ketogruppe er - 17 - 

  
setzt werden, wobei als Nebenprodukt dieser Reaktion Alanin entsteht, welches vollständig unschädlich ist, so dass ein vollständiger Abbau von Fumonisinen zu unschädlichen Substanzen sichergestellt ist. 

  
Gemäss einer bevorzugten Weiterbildung kann das erfindungsgemässe Verfahren auch so geführt werden, dass bei Einsatz von Carboxylesterase ID-Nr. 9 zusätzlich wenigstens ein Adsorbens, insbesondere gewählt aus Tonmineralien, eingesetzt wird. Indem bei Einsatz von Carboxylesterase ID-Nr. 9 zusätzlich wenigstens ein Adsorbens, insbesondere gewählt aus Tonmineralien, eingesetzt wird, kann auch ohne Zusatz von weiteren Enzymen ein vollständiges Unschädlichmachen der Mykotoxine, insbesondere Fumonisine erzielt werden, indem in einem ersten Schritt durch die Carboxylesterase aus dem Fumonisinmolekül die zwei Tricarballylsäure-Seitenketten abgespalten werden und sogenanntes hydrolysiertes Fumonisin gebildet wird.

   Hydrolysiertes Fumonisin, welches ein im wesentlichen kettenförmiges Molekül is , kann in weiterer Folge beispielsweise an Tonerdemineralien adsorbiert werden, so dass auch in einem einstufigen, enzymatischen Abbauverfahren ein vollständiges Unschädlichmachen der Mykotoxine, insbesondere Fumonisine, erzielt werden kann. 

  
Gemäss einer bevorzugten Weiterbildung wird das erfindungsgemässe Verfahren so geführt, dass der damit hergestellte Zusatzstoff in einem zu vergärenden, pflanzlichen Ausgangsmaterial bzw. in einer Maische zur -BioefekanolherStellung eingesetzt wird. Indem der mit dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte Zusatzstoff in einem zu vergärenden, pflanzlichen Ausgangsmaterial bzw. in einer Maische zur Bioethanolherstellung eingesetzt wird, gelingt es, dass bei der Ethanolherstellung anfallende Coprodukte, nämlich den Trester, d.h. die getrockneten Körnerreste und unlösliche Bestandteile oder die Trockenschlempe (Dried Distiller's Grains with Solubles - DDGS) , von Fumonisinen bzw. Mykotoxinen insbesondere in einem sauerstoffunabhängigen Milieu zu befreien. 

  
        

  
- 18 

  
Die Erfindung zielt weiterhin auf einen Zusatzstoff zum enzymatischen Abbau von Mykotoxinen, insbesondere Fumonisinen, ab, mit welchem es sicher und zuverlässig gelingt, derartige Mykotoxine insbesondere sauerstoffunabhängig abzubauen bzw. zu detoxifizieren. 

  
Zur Lösung dieser Aufgaben ist ein derartiger Zusatzstoff dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein Enzym der Sequenz IDNr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 und 25 oder wenigstens ein kompletter, rekombinanter Wirtsorganismus zur Expression der entsprechenden Gene sowie gegebenenfalls zusätzlich wenigstens ein Cosubstrat für wenigstens eines bzw. einige der eingesetzten Enzyme und ein inerter Träger enthalten sind. 

  
Ein derartiger Zusatzstoff, in dem wenigstens ein Enzym oder ein kompletter, rekombinanter Wirtsorganismus zur Expression dieses Enzyms sowie gegebenenfalls zusätzlich wenigstens ein Cosubstrat für wenigstens eines bzw. einige der eingesetzten Enzyme und ein inerter Träger enthalten sind, zeichnet sich dadurch aus, dass er zielgerichtet Mykotoxine, insbesondere Fumonisine, abbaut und somit detoxifizier .

   Durch den Einsatz eines erfindungsgemässen Zusatzstoffes, welcher im wesentlichen aus isolierten Enzymen sowie gegebenenfalls deren Cosubstraten und Trägern besteht, ergibt sich der Vorteil, dass diese ihre katalytische Aktivität in einer Umgebung und unter Bedingungen beibehalten, in welchem beispielsweise komplette Mikroorganismen nicht oder nur wenig aktiv wären, wobei gleichzeitig eine bedeutend höhere, spezifische Aktivität erzielt werden kann, sowie definierte Reaktionen unter Vermeidung von unerwünschten Nebenreaktionen katalysiert werden können. 

  
Darüber hinaus können Probleme, welche gemäss dem Stand der Technik durch den Einsatz vermehrungsfähiger Keime auf landwirtschaftlichen Rohprodukten entstanden sind, mit Sicherheit hintangehalten werden und überdies weisen Zusatzstoffe, welche nur isolierte Enzyme enthalten, sowohl eine bessere Eignung zur Formulierung für eine gezielte und kontrollierte Aktivierung, d.h. 

  
   *   

  
      

  
- 19 - 

  
beispielsweise an einer bestimmten Stelle des Verdauungstrakts, als auch die Vermeidung von unerwünschtem, erhöhtem Substratverbrauch auf. Um die Spezifität noch weiter zu erhöhen, ist der Zusatzstoff gemäss der vorliegenden Erfindung dahingehend bevorzugt weitergebildet, dass durch molekulargenetische Methoden, Mutagenese oder molekulare Evolution veränderte Enzyme eingesetzt sind.

  
Gemäss einer bevorzugten Weiterbildung ist der Zusatzstoff so ausgebildet, dass ein Enzym eingesetzt ist, welches wenigstens 90 % Sequenzidentität mit einem Enzym der ID-Nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23 oder 25 aufweist. Wenn ein Enzym eingesetzt ist bzw. wird, welches wenigstens 90 % Sequenzidentität mit einem Enzym mit der ID-Nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 oder 25 aufweist, gelingt es, neben den bevorzugt abzubauenden Fumonisinen auch weitere Mykotoxine sicher und zuverlässig sauerstoffunabhängig abzubauen, wodurch eine weitgehende Entgiftung der beispielsweise auf pflanzlichen Rohprodukten vorhandenen Mykotoxine, insbesondere Fumonisine, erzielt werden kann. 

  
Indem der Zusatzstoff so ausgebildet ist, wie dies einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung entspricht, dass die Enzyme, veränderten Enzyme und/oder zu wenigstens 90 % identen Enzyme mit einer Schutzhülle ummantelt eingesetzt sind, kann sichergestellt werden, dass die Enzyme, die zu wenigstens 90 % identen Enzyme oder veränderten Enzyme vor einem vorzeitigen Aktivitätsverlust gesichert sind und sicher und zuverlässig an der vorgesehenen Stelle beispielsweise im Magen-Darm-Trakt ihre Wirkung entfalten. 

  
Indem der Zusatzstoff bevorzugt so weitergebildet ist, dass die Enzyme aus einer Carboxylesterase ID-Nr. 9, TricarballylatDehydrogenase ID-Nr. 11, einem Citratverwendungsprotein ID Nr. 13, Alkohol-Dehydrogenase ID-Nr. 17, Aminotransferase ID-Nr. 19 und/oder ID-Nr. 25 und/oder Acetolactat-Synthase ID-Nr. 23 gewählt sind, werden im wesentlichen die zum Substratkatabolismus befähigten Enzyme zum Einsatz gebracht, so dass neben einer geringeren Menge an einzusetzenden Enzymen auch sichergestellt werden 

  
       

  
kann, dass keine unerwünschten Nebenreaktionen bei Einsatz der Enzyme auftreten. 

  
Gemäss einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung ist der Zusatzstoff so ausgebildet, dass eine Carboxylesterase ID-Nr. 9, eine Aminotransferase ID-Nr. 19 oder ID-Nr. 25, eine [alpha]-Ketosäure als Cosubstrat und ein inerter Träger enthalten sind. Indem der Zusatzstoff eine Carboxylesterase, eine Aminotransferase und eine [alpha]-Ketosäure als Cosubstrat neben einem inerten Träger aufweist, gelingt es insbesondere, Fumonisine, welche in Nahrungsmitteln enthalten sind, zuerst zu hydrolysieren, indem von den Fumonisinen Tricarballylsäurereste mit Hilfe einer Carboxylesterase abgespalten werden, und das so gebildete hydrolysierte Fumonisin in weiterer Folge unter Einwirkung der Aminotransferase und der [alpha]Ketosäure als Cosubstrat, im vorliegenden Fall bevorzugt Brenztraubensäure, weiter umzusetzen,

   indem eine Aminogruppe von dem hydrolysierten Fumonisinmolekül durch eine Ketogruppe ersetzt wird, so dass ein für beispielsweise Säuger völlig ungefährliches 2-Keto-hydrolysiertes Fumonisin entsteht, welches unverändert ausgeschieden werden kann, und als Nebenprodukt Alanin gebildet wird, welches ebenfalls keinerlei negative Eigenschaften beispielsweise auf einen Organismus ausübt bzw. aufweist. 

  
Gemäss einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung ist der Zusatzstoff derart weitergebildet, dass eine Carboxylesterase IDNr. 9, wenigstens ein Adsorbens, insbesondere wenigstens ein Tonmineral, sowie gegebenenfalls ein inerter Träger enthalten sind. Bei Einsatz von lediglich einer Carboxylesterase ID-Nr. 9 und wenigstens ein Adsorbens kann die Detoxifizierung der Fumonisine auch so geführt werden, dass lediglich die Tricarballylsäurereste abgespalten werden und das so gebildete, hydrolysierte Fumonisin an dem Adsorbens adsorbiert wird. Indem die Tricarballylsäurereste durch den Einsatz der Carboxylesterase abgespalten werden, entsteht ein im wesentlichen langkettiges Molekül, welches leicht und zuverlässig adsorbiert werden kann, so dass lediglich durch einen gezielten Einsatz eines einzigen Enzyms eine vollständige - 21 

  
Detoxifizierung durch insbesondere sauerstoffunabhängigen Abbau des Fumonisins und anschliessende Adsorption sichergestellt werden kann. 

  
Indem gemäss einer Weiterbildung der Erfindung der Zusatzstoff in einem sauerstoffunabhängigen Milieu bei der Bioethanolherstellung, insbesondere gemeinsam mit einer Maische bzw. einem pflanzlichen Ausgangsmaterial, eingesetzt ist, indem der Zusatzstoff so gewählt ist, dass die darin enthaltenen Enzyme vollständig aus Bakterien stammen, die den Katabolismus von Fumonisinen über einen hochspezifischen Abbauweg katalysieren, gelingt es, sie mit hoher Spezifität, Aktivität und Effizienz einzusetzen, wodurch der Zusatzstoff auch in einem sauerstoffunabhängigen Milieu technologisch angewandt werden kann. 

  
Schliesslich zielt die vorliegende Erfindung auf die Verwendung von Genen, wie sie in den Sequenzen ID-Nr. 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 und 24 dargestellt sind, oder kompletten, rekombinanten Wirtsorganismen zur Expression dieser Gensequenzen sowie gegebenenfalls von Cosubstraten zur Herstellung eines Zusatzstoffes 4für den Abbau von Mykotoxinen, insbesondere Fumonisinen, bei der Verarbeitung oder Verwendung von pflanzlichen Rohstoffen ab. Mit einem derart hergestellten Zusatzstoff gelingt ein vollständiger und zuverlässiger Abbau von Mykotoxinen, insbesondere Fumonisinen, insbesondere in einem sauerstoffunabhängigen Milieu. 

  
In bevorzugter Weise werden gemäss der vorliegenden Erfindung eine Carboxylesterase ID-Nr. 9, eine Aminotransferase ID-Nr. 19, ID-Nr. 25, eine [alpha]-Ketosäure als Cosubstrat sowie ein inerter Träger eingesetzt, mit welcher Verwendung insbesondere Fumonisine sicher und zuverlässig beispielsweise in pflanzlichen Rohstoffen bzw. Ausgangsmaterialien zur Gänze zu unschädlichen Bestandteilen abgebaut werden können. 

  
Eine weitere bevorzugte Verwendung ist dadurch gekennzeichnet, dass eine Carboxylesterase, wenigstens ein Adsorbens, insbesondere Tonmineral, sowie gegebenenfalls ein inerter Träger ein- 

  
       

  
gesetzt werden. Unter Verwendung einer Carboxylesterase und wenigstens eines Adsorbens gelingt es, Mykotoxine, insbesondere Fumonisine, sicher und zuverlässig durch lediglich den Einsatz eines einzigen Enzyms zu entgiften, indem mit diesem Enzym bzw. mit Hilfe dieses Enzyms die Tricarballylsaure-Seitenreste von dem Fumonisin abgespalten werden und das dabei gebildete, langkettige, hydrolysierte Fumonisin in der Folge an dem Adsorbens adsorbiert wird, wodurch das Toxin sicher und zuverlässig unschädlich gemacht wurde. 

  
Gemäss einer bevorzugten Verwendung wird der Zusatzstoff gemäss der Erfindung zur sauerstoffunabhängigen bzw. anaeroben Behandlung eines pflanzlichen Ausgangsmaterials bzw. einer Maische in der Bioethanolherstellung eingesetzt. In diesem Fall gelingt es, die in dem pflanzlichen Ausgangsmaterial bzw. Rohstoff enthaltenen Mykotoxine während der Bioethanolherstellung im sauerstoffunabhängigen Milieu sicher und zuverlässig unschädlich zu machen, so dass der Rückstand aus der Ethanolproduktion, nämlich der Trester oder die Trockenschlempe, nachfolgend entweder direkt oder nach Trocknung und Pelletierung ohne weitere Verarbeitung, insbesondere Detoxifizierung, als Futtermittel, welches frei von Mykotoxinen bzw. insbesondere Fumonisinen ist, eingesetzt werden kann. 

  
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen sowie Figuren näher dargestellt. In diesen zeigt: 

  
Fig. 1 den Fumonisin-katabolischen Geneluster, 

  
Fig. 2 die Michaelis-Menten-Kurve für Fumonisin-Carboxylesterase FumD, 

  
Fig. 3 eine Abbaukurve von hydrolysiertem Fumonisin Bi, 

  
Fig. 4 die Umwandlung von Fumonisin FBI in hydrolysiertes Fumonisin HFB 1 nach Zugabe von Carboxylesterase ID-Nr. 9 zeigt, und 

  
Fig. 5 den Abbau von hydrolysiertem Fumonisin HFB1 durch Zusatz von Aminotransferase ID-Nr. 19. , In Fig. 1 ist ein Fumonisin katabolischer Geneluster als Teilsequenz von 15420 Basenpaaren eines mikrobiellen Stammes mit der Hinterlegungsnummer DSM 16254 dargestellt. In dem fum-Gencluster des prokaryotisehen Stammes DSM 16254 wird die Transkription der offenen Leserahmen durch einen bidirektionalen Promotor gesteuert bzw. geregelt, welcher zwischen fumA und fuml angeordnet ist. Der Cluster codiert Proteine, welche in der Regulierung der Genexpression, wie beispielsweise FumB und FumC, in der Substraterkennung und dem Transport, wie beispielsweise FumJ, FumA und FumG und in einem Substratkatabolismus, wie beispielsweise FumD, FumE, FumF, FumH, FumI und FumK involviert sind. 

  
Beispiele 

  
Beispiel 1: Die Enzymkinetik von Fumonisincarboxylesterase . 

  
Das fumD Gen (Sequenz ID-Nr. 8) , welches eine Fumonisincarboxylesterase codiert, wurde kloniert und in Pichia pastoris unter Verwendung von Standardverfahren exprimiert. Das his-getaggte Enzym wurde rückgewonnen und aus der überstehenden Lösung der Kultur durch Affinitätschromatographie gereinigt. Die Enzymkonzentration wurde bestimmt und die enzymkinetischen Parameter wurden mit sieben unterschiedlichen Substratkonzentrationen im Bereich zwischen 50 [mu]g bis 25 mg FBi pro Liter und einer Enzymkonzentration von 0,33 ng/ml bestimmt. Die Reaktionen wurden in 20 mM Tris-Cl (pH 8,0) Puffer mit 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin gepuffert und bei 30 [deg.]C inkubiert. Proben wurden nach 0, 30, 60 120 und 240 Minuten Inkubation genommen und durch HPLC-MS/MS analysiert.

   Fumonisin Bx (FBi) und hydrolysiertes Fumonisin Bi wurden quantifiziert basierend auf einer Kalibrierung mit den gereinigten Referenzsubstanzen und einem vollständig <13>C markierten, internen FBI Standard. 

  
Fig. 2 zeigt die Michaelis-Menten-Kurve für die Hydrolyse von Fumonisin Bl (FBI) durch Fumonisin-Carboxylesterase FumD, welcher bei einer Enzymkonzentration von 0,33 ng/ml in Tris-Cl Puffer (pH 8,0) bestimmt wurde, wobei anfängliche Enzymgeschwindigkeiten gegen die Substratkonzentration aufgetragen wurden. Die Michaelis-Menten-Kurve zeigt einen Abfall bei höheren Substratkonzentrationen, da die Enzymgeschwindigkeit basierend auf dem Produkt, d.h. hydrolysierter FBi-Bildung berechnet wurde. Da hydrolysiertes FBi aus FBi in einer zweistufigen Reaktion über partiell hydrolysiertes FBi mit lediglich einer TricarballylsäureSeitenkette, die zurückbehalten wurde, und einer Seitenkette ausgebildet wird, die abgespalten wurde, war die Endproduktbildung bei hohen Substratkonzentrationen verzögert.

   Die Michaelis-Menten-Konstante KM wurde als 0,90 [mu]mol/1 berechnet, was 650 ppb äquivalent ist, und die Umwandlungszahl war 900 pro Sekunde. 

  
Aus Fig. 2 ergibt sich, dass Fumonisine mit der Carboxylesterase in den relevanten Konzentrationsbereichen rasch und vollständig hydrolysiert werden können. 

  
Beispiel 2 : Die katalytische Aktivität von HFB1 (hydrolysiertes Fumonisin Bl) Aminotransferase 

  
Sequenzen ID-Nr. 18 und 24 wurden unter Verwendung von Standardverfahren kloniert und in E. coli exprimiert unter Steuerung bzw. Regelung eines Bakteriophagen T7 Promotors. Die Bakterienzellen wurden gesammelt in 50 mM Natriumphosphatpuffer, neuerlich suspendiert und durch Ultraschall lysiert. Hydrolysiertes Fumonisin wurde hinzugefügt und die Proben wurden bei 25 [deg.]C inkubiert. Proben wurden in Zeitintervallen genommen und durch HPLC-MS/MS analysiert. Es wurde keine Reduktion der hydrolysierten FBi Konzentration beobachtet. Wenn ein Cosubstrat, wie beispielsweise eine [alpha]-Ketosäure, wie Brenztraubensäure oder Oxalacetat, zu der Reaktion hinzugefügt wurde, konnte ein vollständiger Abbau des hydrolysierten Fumonisins zu 2-Keto-HFB[iota] beobachtet werden, wie dies in Fig. 3 dargestellt ist. Diese Substanz ist für Säuger vollständig unschädlich. - 25 - 

  
Beispiel 3: Enzymaktivität in Darmmilieu 

  
Zur Überprüfung der enzymatischen Aktivität von FUM-Carboxylesterase im Verdauungstrakt wurden schlachtfrische Schweinedärme verwendet und unter Ausschluss von Sauerstoff ins Labor transportiert und in einer anaeroben Sterilwerkbank untersucht. Etwa 10 cm lange Stücke von Duodenum und Jejunum wurden abgebunden und herausgeschnitten. Mit Kanülen wurde Fumonisin Bl in konzentrierter wässriger Lösung auf eine Endkonzentration von etwa 10 pp verdünnt eingespritzt und mit Darminhalt vermischt. Anschliessend wurden 5 [mu]g Fumonisin-Carboxylesterase in wässriger Lösung, bzw. dasselbe Volumen Wasser in den Negativkontrollen, eingespritzt und eingemischt. Die Darmabschnitte wurden bei 39 [deg.]C inkubiert. Mit Hilfe von Kanülen wurden Proben gezogen und durch HPLC-MS/MS analysiert .

   Dabei zeigte sich, dass Fumonisin Bl im Duodenum und Jejunum zum Zeitpunkt der ersten Probenahme nach zwei Stunden bereits vollständig hydrolysiert war. 

  
Beispiel 4: Ermittlung des Temperaturbereichs der Aktivität von Fumonisin-Carboxylesterase 

  
Zur Ermittlung des Temperaturbereichs, in dem Fumonisin-Carboxylesterase aktiv ist, wurden 1,6 ng/ml FUM-Carboxylesterase in 20 mM Tris-Cl Puffer, pH 7,0, mit 0,1 mg/ml BSA und 10 ppm Fumonisin Bl bei unterschiedlichen Temperaturen inkubiert. Dabei zeigte sich, dass das Temperaturoptimum für das Enzym bei 30 [deg.]C lag. Auch bei 40 [deg.]C und sogar 50 [deg.]C wurde enzymatische Aktivität noch eindeutig festgestellt. Somit ist diese FUM-Carboxylesterase zur Anwendung unter den Temperaturbedingungen wie im Verdauungstrakt, oder im Zuge von Prozessschritten der Lebens- oder Futtermittelherstellung, die bei erhöhter Temperatur stattfinden, geeignet. 

  
          

  
- 26 

  
Beispiel 5: Bestimmung des pH-Bereichs der Aktivität von Fumonisin-Carboxylesterase 

  
Zur Bestimmung des pH-Bereichs, in dem Fumonisin-Carboxylesterase aktiv ist, wurde Teorell-Stenhagen-Puffer verwendet. Dieser Puffer lässt sich durch die Kombination von Citrat, Phosphat und Borat über einen Bereich von 10 pH Einheiten mit gleicher Pufferkapazität einstellen. FUM-Carboxylesterase wurde in einer Konzentration von 3,3 ng/ml mit 10 ppm Fumonisin Bl bei verschiedenen pH-Werten in diesem Puffer bei 25 [deg.]C inkubiert. Die höchste Aktivität zeigte sich bei pH 8,0, aber es konnte im gesamten Bereich von pH 5 bis pH 10 Aktivität festgestellt werden. Durch die Aktivität in diesem breiten pH-Bereich wird die technologische Anwendung des Enzyms als Futtermittelzusatz bzw. im Zuge der Verarbeitung von Lebens- und Futtermitteln ermöglicht. 

  
Beispiel 6 : Fütterungsversuch mit Ferkeln 

  
Der Versuch wurde in einem Versuchsstall mit 12 Buchten für jeweils 10 Tiere durchgeführt. Der Stall war ausgestattet mit Spaltenboden, Schalentränkern und einem computergesteuerten Fütterungssystem. Die Automaten waren entlang der Buchtenwände angeordnet. Das Stallklima wurde täglich automatisch aufgezeichnet und die Temperatur nach den Standardempfehlungen zur Ferkelaufzucht eingestellt. 

  
120 gemischt-geschlechtliche Absetzferkel (Alter: ca. 4 Wochen, durchschnittliches Einstellgewicht 8,21 kg) wurden für diesen Versuch eingesetzt. Jedes Ferkel wurde mit einer Ohrmarke versehen und einzeln gewogen. Die 120 Ferkel wurden auf 12 Buchten zufällig verteilt. Alle Ferkel entstammten dem österreichischen Zuchtprogramm ÖHYB (= (Edelschwein x Landrasse) x Pietrain) . 

  
Direkt nach dem Absetzen wurden die Ferkel für 2 Tage mit einem Starterfutter gefüttert, nach dieser Eingewöhnungsphase er- 

  
        

  
folgte die Umstellung auf das Versuchsfutter. Die Fütterung erfolgte 2-phasig: Absetzphase Tag 1 - 14, Aufzuchtphase Tag 15 42. Das Versuchsfutter wurde buchtenindividuell über die SpotmixFütterungsanlage gemischt und je nach Anzahl der Ferkel, Gewichtsentwicklung und Futterverzehr zweimal täglich trocken zugeteilt. Wasser stand zur Aufnahme ad libitum zur Verfügung. Die 12 Buchten wurden in vier verschiedene Applikationsgruppen zu je drei Wiederholungen geteilt und erhielten die folgenden Einmischungen ins oben beschriebene Futter: 

  
Gruppe 

  
Negativ-Kontrolle Keine Toxine, kein Enzymzusatz 

  
Positiv-Kontrolle 4 - 5,5 ppm Fumonisin Bl 

  
Versuchsgruppe 1 4 - 5,5 ppm Fumonisin Bl + Enzymmix 1 (Carboxylesterase, Aminotransferase, Pyruvat) 0,5 kg/t Futter 

  
Versuchsgruppe 2 4 - 5,5 ppm Fumonisin Bl + Enzymmix 1 (Carboxylesterase, Aminotransferase, Pyruvat, inerter Carrier) 1 kg/t Futter
 <EMI ID=27.1> 
 

  
In der Positiv-Kontrolle wurden bei fast der Hälfte der Tiere respiratorische Probleme beobachtet, wobei es auch zu einem Ausfall kam. Alle anderen Gruppen erschienen gesund. 

  
Leistungsdaten 

  
Gruppe Anzahl Anfangsgewicht Endgewicht Ausfälle der (Durchschnitt , (Durchschnitt , 

  
Tiere kg) kg) 

  
Negativ- 30 8,34 26,82 Kontrolle 

  
Positiv- 30 8,17 24,77 1 Kontrolle 

  
Versuchsgruppe 1 30 8,08 26,69 

  
Versuchsgruppe 2 30 8,25 27,03
 <EMI ID=27.2> 
  4 

  
28 - 

  
Beispiel 7 : Enzymatischer Abbau von Fumonisinen in der Bioethanolmaische 

  
Proben von Maismaische zur Bioethanolherstellung wurden genommen und bei 30 bis 65 [deg.]C unter Rühren inkubiert, wobei der Abbau von Fumonisin Bl nach Zugabe von 770 Units Carboxylesterase ID-Nr. 9 pro Kubikmeter Maische unter Rühren (Rührzeit in Minuten) untersucht wurde. Proben wurden nach der Probennahme durch Aufkochen inaktiviert und danach für die Analytik abzentrifugiert und ein Aliquot des Überstandes abgedampft. Der Rückstand wurde in 200 [mu]l Probenpuffer, der C13-markierten, internen Fumonisin-Standard enthielt, aufgenommen, 1,5 min geschüttelt, abzentrifugiert und dann einer LC-MS-Analyse unterzogen. Hieraus ergibt sich, dass, wie dies in Fig. 4 dargestellt ist, Fumonisin FBI vollständig in hydrolysiertes Fumonisin HFB1 umgewandelt wird.

   Nach Zusatz von Aminotransferase ID-Nr. 19 wird das hydrolysierte Fumonisin HFB1 vollständig zu unschädlichen Bestandteilen abgebaut, wie dies in Fig. 5 dargestellt ist. 

  
Beispiel 8: Abbau von Fumonisinen und ihren Derivaten in Maistortillabrei und Cornflakesbrei 

  
Die Wirksamkeit der Fumonisin-abbauenden Enzyme wurde in Maisbreiproben ("com grits") für die Maistortilla- und CornflakesHerstellung untersucht. Fumonisin-kontaminierter Mais (ca. 1 ppm) wurde zu Maismehl vermählen, mit Wasser versetzt und aufgekocht. Für die Tortilla-Herstellung wurde der auf ca. 50 bis 60 [deg.]C abgekühlte Maisbrei mit einer Mischung von Proteinasen in alkalischer Lösung versetzt. Nach 30 bis 180 min, wenn der pH unter 9, vorzugsweise unter pH 8, gefallen ist, wurde eine Mischung aus Carboxylesterase und Aminotransferase (jeweils 500 - 1000 Units/m<3>) hinzugefügt und für weitere 30 bis 60 min inkubiert. Im Falle der Cornflakes-Herstellung wurde ein Maisbrei aus gemahlenem Mais und - 29 

  
       # 

  
Gerstenmalz für ca. eine Stunde im Druckgefäss aufgekocht; nach Abkühlung unter 60 [deg.]C (vorzugsweise 50 [deg.]C) wurde eine Enzymmischung, bestehend aus Carboxylesterase und Aminotransferase (jeweils 500 - 1000 Units/m<3>) , hinzugefügt und für weitere 30 bis 60 min inkubiert. Aus dieser Mischung wurden dann Proben gezogen und auf FBI- bzw. HFB1-Rückstände wie in Beispiel 7 untersucht. HFBl-Levels waren in sämtlichen Proben unter 80 ppb, offensichtlich wurde das aus FBI entstandene HFB1 kontinuierlich weiter umgesetzt. Die gemessenen Werte für FBI sind in der u.a. Tabelle angeführt. 

  
Tabelle: Enzymatischer Abbau von FBI und HFB1 in Maisbrei; Fumonisinkonzentration in ppb ([mu]g/kg) 

  
Behandlungszeit Tortillabrei (40 Tortillabrei Cornflakesbrei Cornf1akesbrei mit Enzymmix [deg.]C, 500 Units) (50 [deg.]C, 1000 (35 [deg.]C, 500 (40 [deg.]C, 1000 (min) Units) Units) Units) 

  
0 852 866 912 1053 

  
10 116 134 51 97 

  
30 32 71 17 37
 <EMI ID=29.1>

Claims (22)

[phi] - 30 - A n s p r ü c h e
1. Verfahren zur Herstellung eines Zusatzstoffes für den enzymatischen Abbau von Mykotoxinen, insbesondere Fumonisinen, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine Nukleinsäuresequenz von Genen entsprechend Sequenz ID-Nr. 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 und 24 vorgelegt wird, die wenigstens eine Nukleinsäuresequenz in prokaryotisehen oder eukaryotischen Wirtszellen exprimiert wird und wenigstens ein dadurch hergestelltes Enzym entsprechend Sequenz ID-Nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 und 25 oder wenigstens ein kompletter, rekombinanter Wirtsorganismus gegebenenfalls gemeinsam mit einem Cosubstrat in einem pflanzlichen Rohstoff eingesetzt werden.
1. Verfahren zur Herstellung eines Zusatzstoffes /für den enzymatischen Abbau von Mykotoxinen, insbesondere Fumonisinen, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine Nukleinsäuresequenz von Genen entsprechend Sequenz ID-Nr. 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 und 24 vorgelegt wird, die wenigstens eine Nukleinsäuresequenz in prokaryotisehen oder eukaryotisehen Wirtszellen exprimiert wird und wenigstens ein dadurch hergestelltes Enzym entsprechend Sequenz ID-Nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 und 25 oder wenigstens ein kompletter, rekombin[alpha]r'l\v-?r Wirt[epsilon]organismus sowie gegebenenfalls gemeinsam mit einem Cosubstrat in em.eu p Icr.zlichei[alpha] Rohstoff eingesetzt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Mykotoxine, insbesondere Fumonisine, sauerstoffunabhängig abgebaut werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Mykotoxine, insbesondere Fumonisine, sauerstoffunabhängig abgebaut werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass vor Einsatz der Enzyme in dem pflanzlichen Rohstoff diese mittels molekulargenetischer Methoden, Mutagenese oder molekularer Evolution verändert werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass vor Einsatz der Enzyme in dem pflanzlichen Rohstoff diese mittels molekulargenetischer Methoden, Mutagenese oder molekularer Evolution verändert werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3 , dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme isoliert werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme isoliert werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme in einer Schutzhülle verkapselt werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme in einer Schutzhülle verkapselt werden.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme aus Permease ID-Nr. 3, Carboxylesterase ID-Nr. 9, Tricarballylat-Dehydrogenase ID-Nr. 11, Citratverwertungsprotein ID Nr. 13, Alkohol-Dehydrogenase ID-Nr. 17, Aminotransferase ID-Nr. 19 und/oder 25 und/oder AcetolactatSynthase ID-Nr. 23 gewählt werden.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme aus Permease ID-Nr. 3, Carboxylesterase ID-Nr. 9, Tricarballylat-Dehydrogenase ID-Nr. 11, Citratverwertungsprotein ID Nr. 13, Alkohol-Dehydrogenase ID-Nr. 17, Aminotransferase ID-Nr. 19 und/oder 25 und/oder AcetolactatSynthase ID-Nr. 23 gewählt werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass ein Enzym eingesetzt wird, welches wenigstens
NACHGEREICHT 90 % Sequenzidentität mit wenigstens einem der Enzyme ID-Nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 oder 25 aufweist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass ein Enzym eingesetzt wird, welches wenigstens
- 31 -
90 % Sequenzidentität mit wenigstens einem der Enzyme ID-Nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 oder 25 aufweist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass bei Einsatz von wenigstens einer Aminotransferase ID-Nr. 19 oder ID-Nr. 25 als Cosubstrat ein Keton, insbesondere eine [alpha]-Ketosäure, eingesetzt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass bei Einsatz von wenigstens einer Aminotransferase ID-Nr. 19 oder ID-Nr. 25 als Cosubstrat ein Keton, insbesondere eine [alpha]-Ketosäure, eingesetzt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass bei Einsatz von Carboxylesterase ID-Nr. 9 zusätzlich wenigstens ein Adsorbens, insbesondere gewählt aus Tonmineralien, eingesetzt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass bei Einsatz von Carboxylesterase ID-Nr. 9 zusätzlich wenigstens ein Adsorbens, insbesondere gewählt aus Tonmineralien, eingesetzt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Zusatzstoff in einem zu vergärenden, pflanzlichen Rohstoff bzw. in einer Maische zur Bioethanolherstellung eingesetzt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Zusatzstoff in einem zu vergärenden, pflanzlichen Rohstoff bzw. in einer Maische zur Bioethanolherstellung eingesetzt wird.
11. Zusatzstoff zum enzymatischen Abbau von Mykotoxinen, insbesondere Fumonisinen, in einem pflanzlichen Rohstoff und Mischungen, die pflanzliche Rohstoffe enthalten, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein Enzym der Sequenz ID-Nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 und 25 oder wenigstens ein kompletter, rekombinanter Wirtsorganismus zur Expression dieser Enzymgensequenzen sowie gegebenenfalls zusätzlich wenigstens ein Cosubstrat für wenigstens eines bzw. einige der eingesetzten Enzyme und ein inerter Träger enthalten sind.
11. Zusatzstoff zum enzymatischen Abbau' von Mykotoxinen, insbesondere Fumonisinen, in einem pflanzlichen Rohstoff und Mischungen, die pflanzliche Rohstoffe enthalten, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein Enzym der Sequenz ID-Nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 und 25 oder wenigstens ein kompletter, rekombinanter /Wirtsorganismus zur Expression dieser Enzymgensequenzen sowie gegebenenfalls zusätzlich wenigstens ein Cosubstrat für wenigstens eines bzw. einige der eingesetzten Enzyme und ein inerter Träger enthalten sind.
12. Zusatzstoff nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass durch molekulargenetische Methoden, Mutagenese oder molekulare Evolution veränderte Enzyme eingesetzt sind.
12. Zusatzstoff nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, d ss durch molekulargenetische Methoden, Mutagenese oder molekulare Evolution veränderte Enzyme eingesetzt sind.
13. Zusatzstoff nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass ein Enzym eingesetzt ist, welches wenigstens 90 % Sequenzidentität mit einem Enzym der ID-Nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23 oder 25 aufweist.
13. Zusatzstoff nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass ein Enzym eingesetzt ist, welches wenigstens 90 % Sequenzidentität mit einem Enzym der ID-Nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23 oder 25 aufweist.
14. Zusatzstoff nach Anspruch 11, 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme, veränderten Enzyme und/oder zu wenigstens 90 % identen Enzyme mit einer Schutzhülle ummantelt eingesetzt sind.
NACHGEREICHT - [beta]%2
14. Zusatzstoff nach Anspruch 11, 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme, veränderten Enzyme und/oder zu wenigstens 90 % identen Enzyme mit einer Schutzhülle ummantelt eingesetzt sind.
15. Zusatzstoff nach einem der Ansprüche 11 bis <14>, da<d>urch gekennzeichnet, dass die Enzyme aus einer Carboxylesterase I<D>-<N>r. 9, Tricarballylat-Dehydrogenase ID-Nr. 11, einem Citratverwertungsprotein ID Nr. 13, Alkohol-Dehydrogenase ID-<N>r. 17, <A>mino transferase ID-Nr. 19 oder ID-Nr. 25 und/oder Acetolactat-Synthase ID-Nr. 23 gewählt sind.
-->15. Zusatzstoff nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme aus einer Carboxylesterase ID-Nr. 9, Tricarballylat-Dehydrogenase ID-Nr. 11, einem Citratverwertungsprotein ID Nr. 13, Alkohol-Dehydrogenase ID-Nr. 17, Aminotransferase ID-Nr. 19 oder ID-Nr. 25 und/oder Acetolactat-Synthase ID-Nr. 23 gewählt sind.
16. Zusatzstoff nach einem der Ansprüche 11 bis 1<5>, dadurch gekennzeichnet, dass eine Carboxylesterase ID-Nr. <9>, wenigstens eine Aminotransferase ID-Nr. 19 oder ID-Nr. 25, eine [alpha]-Ketosäure als Cosubstrat und ein inerter Träger enthalten sind.
16. Zusatzstoff nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass eine Carboxylesterase ID-Nr. 9, wenigstens eine Aminotransferase ID-Nr. 19 oder ID-Nr. 25, eine [alpha]-Ketosäure als Cosubstrat und ein inerter Träger enthalten sind.
17. Zusatzstoff nach einem der Ansprüche 11 bis 1<6>, dadurch gekennzeichnet, dass eine Carboxylesterase ID-Nr. <9>, wenigstens ein Adsorbens, insbesondere wenigstens ein Tonmineral, sowie ge gebenenfalls ein inerter Träger enthalten sind.
17. Zusatzstoff nach einem der Ansprüche 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass eine Carboxylesterase ID-Nr. 9, wenigstens ein Adsorbens, insbesondere wenigstens ein Tonmineral, sowie gegebenenfalls ein inerter Träger enthalten sind.
18. Zusatzstoff nach einem der Ansprüche 11 bis 1<7>, dadurch gekennzeichnet, dass der Zusatzstoff in einem sauerstoffunabhän gigen Milieu bei der Bioethanolherstellung, insbesondere gemein sam mit einer Maische bzw. einem pflanzlichen Ausgangsmaterial, eingesetzt ist.
18. Zusatzstoff nach einem der Ansprüche 11 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Zusatzstoff in einem sauerstoffunabhängigen Milieu bei der Bioethanolherstellung, insbesondere gemeinsam mit einer Maische bzw. einem pflanzlichen Ausgangsmaterial, eingesetzt ist.
19. Verwendung von Genen, wie sie in den Sequenzen ID-Nr. 1, 2/ 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 und 24 dargestellt sind, oder kompletten, rekombinanten Wirtsorganismen zur Expression von Enzymsequenzen ID-Nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 1<9>, <21>, 2<3> und 25 sowie gegebenenfalls von Cosubstraten zur Herstellung eines Zusatzstoffes für den Abbau von Mykotoxinen, insbesondere Fumoni sinen, in einem pflanzlichen Material.
19. Verwendung von Genen, wie sie in den Sequenzen ID-Nr. 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 und 24 dargestellt sind, oder kompletten, rekombinanten Wirtsorganismen \ zur Expression dieser Gensequenzen sowie gegebenenfalls von Cosubstraten zur
Herstellung eines Zusatzstoffes für den Abbau von Mykotoxinen, insbesondere Fumonisinen, in einem pflanzlichen Material.
20. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass ein Cosubstrat gewählt aus der Gruppe einer Carboxylesterase IDNr. 9, einer Aminotransferase ID-Nr. 19 oder ID-Nr. 25, einer [alpha]Ketosäure und ein inerter Träger eingesetzt werden.
20. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass eine Carboxylesterase ID-Nr. 9, eine Aminotransferase ID-Nr. 19 oder ID-Nr. 25, eine [alpha]-Ketosäure als Cosubstrat sowie ein inerter Träger eingesetzt werden.
21. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass eine Carboxylesterase, wenigstens ein Adsorbens, insbesondere Tonmineral, sowie gegebenenfalls ein inerter Träger eingesetzt werden.
NACHGEREICHT
21. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass eine Carboxylesterase, wenigstens ein Adsorbens, insbesondere Tonmineral, sowie gegebenenfalls ein inerter Träger eingesetzt werden.
33
22. Verwendung nach einem der Ansprüche 19, 20 oder 21 zur sauerstoffunabhängigen Behandlung eines pflanzlichen Ausgangsmaterials bzw. einer Maische in der Bioethanolherstellung.
Wien, 1 SEP.2008
Erber Aktiengesellschaft durch:
Patentanwälte Miksovsky & <EMI ID=33.1>
- -
P a t e n t a n s p r ü c h e
-->22. Verwendung nach einem der Ansprüche 19, 20 oder 21 zur sauerstoffunabhängigen Behandlung eines pflanzlichen Ausgangsmaterials bzw. einer Maische in der Bioethanolherstellung.
Wien, 3. September 2009
Erber Aktiengesellscha t durch:
Patentanwälte
Mik[delta]ovsky & OG <EMI ID=37.1>
NACHGEREICHT
AT0802409A 2008-09-18 2008-09-18 Verfahren zur herstellung eines zusatzstoffes für den enzymatischen abbau von mykotoxinen sowie zusatzstoff und verwendung desselben AT507363B1 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT0802409A AT507363B1 (de) 2008-09-18 2008-09-18 Verfahren zur herstellung eines zusatzstoffes für den enzymatischen abbau von mykotoxinen sowie zusatzstoff und verwendung desselben

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT0802409A AT507363B1 (de) 2008-09-18 2008-09-18 Verfahren zur herstellung eines zusatzstoffes für den enzymatischen abbau von mykotoxinen sowie zusatzstoff und verwendung desselben

Publications (2)

Publication Number Publication Date
AT507363A1 true AT507363A1 (de) 2010-04-15
AT507363B1 AT507363B1 (de) 2011-05-15

Family

ID=42083869

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
AT0802409A AT507363B1 (de) 2008-09-18 2008-09-18 Verfahren zur herstellung eines zusatzstoffes für den enzymatischen abbau von mykotoxinen sowie zusatzstoff und verwendung desselben

Country Status (1)

Country Link
AT (1) AT507363B1 (de)

Also Published As

Publication number Publication date
AT507363B1 (de) 2011-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2326713B1 (de) Verfahren zur herstellung eines zuatzstoffes für den enzymatischen abbau von mykotoxinen sowie zusatzstoff und verwendung desselben
EP3495476B1 (de) Verfahren zur hydrolytischen spaltung von zearalenon und/oder zearalenon-derivaten mittels eines polypeptids sowie verwendung
EP3262163B1 (de) Fusariumtoxine spaltende polypeptidvarianten, zusatzstoff enthaltend dieselben und verwendung derselben sowie verfahren zur spaltung von fusariumtoxinen
EP1860954B1 (de) Mikroorganismus zur entgiftung von fumonisinen sowie verwendung desselben, verfahren zum entgiften von fumonisinen und futtermittelzusatz, enthaltend den mikroorganismus
EP3273802A1 (de) Verwendung einer trichothecene transformierenden alkoholdehydrogenase, verfahren zur transformation von trichothecenen sowie trichothecene transformierender zusatzstoff
EP2582851B1 (de) Neuer stamm von lactobacillus plantarum s, die verwendung vom stamm lactobacillus plantarum s sowie die herstellung von futtersilage
EP2326714B1 (de) Verfahren zur herstellung eines futtermittelzusatzes zum sauerstoffunabhängigen, enzymatischen abbau von mykotoxinen sowie futtermittelzusatz und verwendung desselben
WO2014146881A1 (de) Mikroorganismenstamm und verfahren zur fermentativen herstellung von c4-verbindungen aus c5-zuckern
AT507363A1 (de) Verfahren zur herstellung eines zusatzstoffes für den enzymatischen abbau von mykotoxinen sowie zusatzstoff und verwendung desselben
DE102004032216A1 (de) Polypeptide mit Tannase- und/oder Lipase-Aktivität
AT507364B1 (de) Verfahren zur herstellung eines futtermittelzusatzes zum sauerstoffunabhängigen, enzymatischen abbau von mykotoxinen sowie futtermittelzusatz und verwendung desselben
CN111820322A (zh) 一种对喷浆玉米皮中黄曲霉毒素的生物降解方法
JP2024542419A (ja) 組成物中のアピシジン濃度を低下させるための手段及び方法
KR20120059209A (ko) 새로운 왕겨 발효 방법 및 그 발효 왕겨를 포함하는 사료 첨가제 조성물