AT527241A2

AT527241A2 - Acetogenic fermentation of carbon monoxide gas

Info

Publication number: AT527241A2
Application number: ATA50333/2023A
Authority: AT
Inventors: Hocq Rémi; Pflügl Stefan; Horvath Josef
Original assignee: Circe Biotechnologie Gmbh
Priority date: 2023-05-03
Filing date: 2023-05-03
Publication date: 2024-11-15
Also published as: WO2024228166A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Konditionierung und damit zur Mutation eines Acetogens für acetogene Fermentation von CO-Gas ("CO-Einsatzgas"), um dadurch ein mutiertes Acetogen für die acetogene Fermentation von CO-Gas zu erhalten, wobei das Verfahren die Kultivierung eines nicht mutierten Stammes eines Acetogens, das für die acetogene Fermentation von CO-Einsatzgas konditioniert und somit mutiert werden soll, umfasst, in einem Fermentationsmedium ohne Hefeextrakt und Vitamine für mindestens drei aufeinanderfolgende Wachstumszyklen auf CO-Gas ("CO-Behandlungsgas") als Haupt- oder einziger Kohlenstoffquelle, wobei die CO-Konzentration in dem CO-Behandlungsgas über die drei Wachstumszyklen schrittweise erhöht wird, wodurch ein konditioniertes Acetogen für die acetogene Fermentation von CO-Einsatzgas erzeugt wird.

Description

[0002] Die vorliegende Erfindung betrifft die acetogene Gasfermentation, insbesondere von Kohlenmonoxid (CO), das typischerweise in Synthesegas oder industriellen Abgasen in schwankenden Mengen enthalten ist, unter Verwendung von Acetogenen (acetogenen Bakterien), wie Thermoanaerobacter kivui (T. kivun). Die Erfindung findet insbesondere Anwendung bei der industriellen Fermentation der gasförmigen C1-Substrate CO und CO»

sowie H2 und beliebiger Gemische davon in Bioreaktoren.

[0003] Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Konditionierung von Acetogenen, wie z. B. T. kivui, für die acetogene Fermentation von CO-haltigen Gasen, wie z. B. Biomassevergasung, Abfallvergasung, Hochofengas und anderen industriellen Abgasen, die schwankende Mengen an CO enthalten, bereit, so dass sie in der Lage sind, nebencoz undm2 auch nicht konstante Gasströme mit hohem CO-Gehalt zu verwerten. Die Erfindung erstreckt sich auf konditionierte Acetogene, wie T. kivui, die durch die Durchführung des Verfahrens hergestellt werden. Die Erfindung stellt auch mutierte Stämme von Acetogenen, wie z. B. T. kivur, gegebenenfalls zur Verwendung bei der Durchführung der acetogenen Fermentation von CO-Gas bereit. Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur acetogenen Fermentation von CO-Gas bereit. Die Erfindung sieht auch die Verwendung von mutierten Stämmen von Acetogenen, wie 7. kivui, bei der Durchführung der acetogenen Fermentation

von CO-Gas vor.

[0004] HINTERGRUND DER ERFINDUNG

[0005] ACETOGENESIS ist, allgemein gesprochen, ein Prozess, bei dem

Mikroorganismen, die als Acetogene bekannt sind, Kohlendioxid (CO2) oder Kohlenmonoxid

(CO) entlang des Wood-Ljungdahl-Wegs in Acetat umwandeln, typischerweise über Acetyl-

CoA.

[0006] Entlang dieses Weges wird das CO, im Falle von CO, zunächst durch eine CODehydrogenase in einer biologischen Wasser-Gas-Shift-Reaktion zu CO» oxidiert. Das CO» wird dann durch eine bifunktionelle CO-Dehydrogenase/Acetyl-CoA-Synthetase an eine Methylgruppe gebunden und mit einem weiteren Molekül von enzymgebundenen CO zu Acetyl-CoA fusioniert. CO kann als alleinige Kohlenstoff- und Energiequelle dienen,

während CO» als Kohlenstoffquelle H2 zur Energiebereitstellung benötigt.

[0007] Die acetogene Fähigkeit von Acetogenen findet nützliche Anwendung bei der Behandlung von CO»- und/oder CO-haltigen Gasen wie Syngas (Synthesegas) oder industriellen Abgasen wie Hochofengas oder Rauchgasen aus Verbrennungsprozessen, um aus diesen Gasen nützliche Produkte wie Essigsäure und Ethanol herzustellen. Dieses

Verfahren wird als acetogene Gasfermentation bezeichnet.

[0008] Acetogene sind von Natur aus in der Lage, CO über den Wood-LjungdahlStoffwechselweg (oder reduktiven Acetyl-CoA-Stoffwechselweg) zu verstoffwechseln, um autotroph zu wachsen und Acetyl-CoA zu produzieren. Ein solches Wachstum wird jedoch häufig durch die Anwesenheit hoher CO-Konzentrationen aufgrund der CO-Toxizität gehemmt. Dies schränkt das biosynthetische Potenzial von Acetogenen in industriellen Anwendungen ein. Industrielle Anwendungen können Gase mit hohem CO-Gehalt enthalten, und dieser CO-Gehalt kann auch im Laufe der Zeit schwanken, z. B. bei nicht

konstantem Ausgangsmaterial (Biomasse, Abfälle) und/oder bei Durchsatzschwankungen.

[0009] Die Herausforderung, die die CO-Toxizität bei der Nutzung von Acetogenen für

die Behandlung von Gasen mit hoher CO-Konzentration darstellt, wurde von Erfindern in der

Nr. 11, 1680-1699.

[0010] Nach Erfahrung des Antragstellers gibt es zwar mäßige Erfolge bei der Konditionierung von Acetogenen für die CO-Metabolisierung, aber es besteht ein ungedeckter Bedarf, dies auf eine Art und Weise zu tun, die Mikroorganismenwachstumsraten erzielt, die für die Industrie kommerziell attraktiv sein könnten (z. B. höhere Wachstumsraten, um den mikrobiellen Katalysator wirtschaftlicher zu machen). Ein weiterer ungedeckter Bedarf besteht darin, Acetogene für die COMetabolisierung zu konditionieren, ohne dass teure Hefeextrakte, Vitamine und andere kostspielige Zusatzstoffe benötigt werden. Ein solches hefeextrakthaltiges Medium wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung als "komplexes Medium” oder "undefiniertes Medium” bezeichnet, im Gegensatz zu einem chemisch definierten Medium ohne Hefe und

Nährstoffe.

[0011] T. kivul ist ein thermophiles, anaerobes Acetogener, von dem bekannt ist, dass e autotrophes Wachstum unter Verwendung von CO,/Wasserstoff (H») als Kohlenstoff- und Energiesubstrat zeigt. Ursprünglich wurde davon ausgegangen, dass T. kivui in einer hohen CO-Konzentration oder, genauer gesagt, in einem 100%igen Substrat nicht autotroph wächst, doch wurde später festgestellt, dass es für eine Konditionierung empfänglich ist, die die CO-Metabolisierung und das autotrophe Wachstum in einem Substrat mit hoher CO-

Konzentration oder sogar in einem 100%igen CO-Substrat ermöglicht, wenn auch mit

unattraktiv niedrigen Wachstumsraten sowohl in chemisch definierten Medien als auch in

komplexen Medien.

[0012] Die vorliegende Erfindung findet Anwendung bei der Verbesserung der Wachstumsrate von Acetogenen, wie z. B. T. kivui, in Substraten mit hoher CO-

Konzentration und insbesondere in einem Substrat mit 100 % CO. [0013] ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

[0014] GEMÄSS EINEM ERSTEN, WEITGEFASSTEN ASPEKT DER ERFINDUNG WIRD EIN VERFAHREN ZUR Konditionierung und damit Mutation eines Acetogens für die acetogene Fermentation von zu fermentierendem Kohlenmonoxid (CO)-Gas (d.h. COFeedgas), wobei das Verfahren die Kultivierung eines nicht mutierten Stammes des Acetogenen in einem Fermentationsmedium ohne Hefeextrakt und Vitamine für mindestens drei aufeinanderfolgende Wachstumszyklen mit CO-Gas (d.h. CO-Behandlungsgas), das von CO-Feedgas verschieden ist, als Haupt- oder einzige Kohlenstoffquelle einschließt, wobei die CO-Konzentration in dem CO-Behandlungsgas über die drei Wachstumszyklen schrittweise erhöht wird. Somit wird die CO-Konzentration im CO-Behandlungsgas über die

aufeinanderfolgenden Wachstumszyklen schrittweise erhöht.

[0015] Wenn hier von "Haupt- oder einziger Kohlenstoffquelle" die Rede ist, sollte dies so verstanden werden, dass auf molarer Basis mindestens 50 % des Biomassewachstums des Acetogenen und/oder der Produktion des Fermentationsprodukts, auf das hier Bezug

genommen wird, durch den Acetogenen aus der Metabolisierung von CO stammen.

[0016] Ein auf diese Weise hergestellter konditionierter Acetogene kann im Vergleich zu dem Acetogenen, der der Konditionierung unterzogen wird (d. h. dem nicht mutierten

Acetogenen), mindestens eine Mutation aufweisen, die aus der Konditionierung resultiert.

oder hauptsächlicher Kohlenstoffquelle wachsen.

[0018] Der Acetogene, der der Konditionierung unterzogen wird, und der konditionierte Acetogene können insbesondere aus 7. kivui und Mutanten davon ausgewählt werden, aber die Erfindung erstreckt sich auf den Acetogenen, der der Konditionierung unterzogen wird, und den konditionierten Acetogenen, der jeder thermophile Acetogene sein kann. Am wünschenswertesten sind thermophile Acetogene, auf die sich die Erfindung erstreckt, solche, die Wachstumseigenschaften, optimale und/oder robuste Wachstumsbedingungen und andere Wachstumseigenschaften aufweisen, die denen von T7. kivuinahe kommen.

Dazu kann ein Wachstumsoptimum bei einer Temperatur von 55-70°C gehören.

[0019] Sowohl das hier beschriebene Konditionierungsverfahren als auch das hier beschriebene Verfahren zur Fermentierung von CO-Feedgas können in Bezug auf das Wachstum des Acetogenen von der fühlbaren Wärme des CO-Gases profitieren, sei es als CO-Feedgas oder als CO-Behandlungsgas. Mit anderen Worten, das Speisegas bzw. das Behandlungsgas kann zumindest einen Teil der Wärme liefern, die zum Erreichen einer optimalen Wachstumstemperatur für den Acetogenen, der der Konditionierung unterzogen

wird, oder der konditionierte Acetogene erforderlich ist.

[0020] DER ERSTE BREITE ASPEKT DER ERFINDUNG ERSTRECKT SICH AUF die Verwendung des so gewonnenen konditionierten Acetogenen in einem Verfahren zur Fermentation eines CO-Feedgases und zur Herstellung eines Fermentationsprodukts, das weiter unten unter Bezugnahme auf den vierten Aspekt der Erfindung näher beschrieben

wird. Das Verfahren kann Teil eines CO-Feedgas-Fermentationsprozesses sein, der

zusätzlich zu dem Verfahren stromaufwärts und stromabwärts gerichtete Vorgänge umfasst,

wie hierin ausführlicher beschrieben.

[0021] Das Fermentationsprodukt kann in fester, flüssiger oder gasförmiger Form vorliegen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist es ein flüssiger oder gasförmiger

Alkohol oder Säure, ein- oder zweiwertig.

[0022] Das CO-Feedgas kann ein beliebiges CO-haltiges Gas sein, einschließlich COhaltiger Industriegase, z. B. ein CO-haltiges Industrieabgas oder ein Synthesegas (z. B.

hergestellt in einem Vergasungsprozess von z. B. Biomasse oder Abfall).

[0023] Das Fermentationsprodukt kann in erster Linie Essigsäure umfassen, aber die Erfindung dehnt die Bedeutung des Begriffs "Fermentationsprodukt" auf nachgeschaltete Produkte aus, die durch die Fermentation des CO-Feedgases oder durch die Weiterverarbeitung von direkt durch die Fermentation erzeugten Produkten hergestellt werden, z. B. einschließlich ein- oder zweiwertiger Alkohole oder Milchsäure und/oder

weiterer oder anderer Produkte, wie nachstehend umfassender beschrieben.

[0024] Die Durchführung des Verfahrens kann die Verwendung eines Reaktors umfassen. Mit anderen Worten, das Verfahren kann unter Verwendung eines Reaktors durchgeführt werden. Ein solcher Reaktor kann beispielsweise aus einem Fermenter oder Rührkessel im industriellen Maßstab, einem Airlift-Reaktor, einem Blasensäulenreaktor oder

einem Schlaufenreaktor (Pfropfenströmung) ausgewählt werden.

[0025] Das Gasfermentationsverfahren kann kontinuierlich durchgeführt werden, d. h. als Teil eines kontinuierlichen Prozesses. Eine solche kontinuierliche Durchführung des Verfahrens kann die kontinuierliche Bereitstellung von frischem CO-Feedgas für den

konditionierten Acetogenen umfassen, der für die Fermentation verwendet wird, während

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das Fermentationsprodukt, das (in einer bevorzugten Ausführungsform extrazellulär) von

dem konditionierten Acetogenen erzeugt wird, kontinuierlich aufgefangen wird.

[0026] Die kontinuierliche Auffangung des von dem konditionierten Acetogenen erzeugten Fermentationsprodukts kann die kontinuierliche Extraktion oder Abtrennung des Fermentationsprodukts aus dem Fermentationsmedium umfassen. Eine solche Extraktion oder Abtrennung kann zum Beispiel die Verwendung von Membranverfahren, Verdampfung

oder Lösungsmittelextraktion, typischerweise {n situ, umfassen.

[0027] Im Zusammenhang mit einem kontinuierlichen Verfahren, das die Durchführung des Verfahrens unter Verwendung eines Reaktors einschließt, kann ein solches Verfahren daher die Zufuhr von frischem CO-Feedgas in den Reaktor und die kontinuierliche

Auffangung des im Reaktor erzeugten Fermentationsprodukts einschließen.

[0028] Eine solche kontinuierliche Rückgewinnung kann entweder in situ im Reaktor durchgeführt werden oder sie kann die Entnahme von fermentationsproduktreichem Fermentationsmedium aus dem Reaktor, die Gewinnung von Fermentationsprodukt aus dem fermentationsproduktreichen Fermentationsmedium zur Herstellung von rückgewonnenem Fermentationsprodukt und Fermentationsprodukt-armem oder -freiem Fermentationsmedium und die kontinuierliche Rückführung des Fermentationsprodukt-

armen oder -freien Fermentationsmediums zum Reaktor umfassen.

[0029] Das Verfahren kann durchgeführt werden, um das gesamte CO aus dem COFeedgas, das der Fermentation unterzogen wird, zu entfernen. Daher kann die Erfindung zur Gewinnung eines Zielprodukts, aber auch zur biologischen Reinigung eines Gasstroms,

z. B. eines Abgases, angewendet werden.

wie z. B. Methan, zu fermentieren, die in dem Speisegas vorhanden sein können.

[0031] INSBESONDERE, GEMÄSS DES ERSTEN ASPEKTS DER ERFINDUNG, WIRD EIN VERFAHREN ZUR Konditionierung eines Acetogenen, wie Thermoanaerobacter kivui (T. kivul), für die acetogene Fermentation von Kohlenmonoxid (CO)-Gas (d. h. CO-

Einspeisungsgas) VORGESTELLT, wobei das Verfahren folgendes umfasst

sukzessives Kultivieren des Acetogenen auf CO-Gas (CO-Behandlungsgas), dessen COKonzentration in jeweiligen Wachstumszyklen progressiv erhöht wird (d. h. unter Verwendung jeweiliger aufeinanderfolgender gasförmiger Substrate aus COBehandlungsgas mit erhöhter CO-Konzentration), wobei die CO-Konzentrationen in den CO-Behandlungsgasen schrittweise von etwa 30% v/v auf 100% v/v erhöht werden ("CO-

Wachstumsschritt"),

wodurch ein konditionierter Acetogene für die acetogene Fermentation von CO-Feedgas

erzeugt wird.

[0032] Das Verfahren kann einen vorherigen Schritt der Kultivierung des Acetogenen für mindestens einen Wachstumszyklus auf (d. h. unter Verwendung eines gasförmigen Substrats aus) Synthesegas mit hohem CO-Gehalt ("Syngas”") ("Syngas-Wachstumsschritt")

umfassen.

[0033] Das Verfahren kann auch einen vorherigen Schritt der Kultivierung des

Acetogenen für mindestens einen Wachstumszyklus auf (d.h. unter Verwendung eines

gasförmigen Substrats, das) ein Wasserstoff (H2)- und Kohlendioxid (CO2)-Gas umfasst, das

im Wesentlichen frei von CO ist ("CO-freier Wachstumsschritt"), umfassen.

[0034] Vorzugsweise umfasst das Verfahren die aufeinanderfolgende Durchführung erstens des CO-freien Wachstumsschritts ("erste Wachstumsstufe"), zweitens des SyngasWachstumsschritts ("zweite Wachstumsstufe") und drittens des CO-Wachstumsschritts

("dritte Wachstumsstufe").

[0035] Der erste der Wachstumsschritte kann mit CO-freiem Gas durchgeführt werden, und der Wachstumsschritt kann mit einem nicht mutierten Stamm des Acetogenen durchgeführt werden. Wenn also der CO-freie Wachstumsschritt die erste Wachstumsstufe ist, dann kann der CO-freie Wachstumsschritt mit einem nicht mutierten Stamm des

Acetogenen durchgeführt werden.

[0036] In dieser Beschreibung bezeichnet der Begriff "Wachstumszyklus" einen einzelnen Teilungszyklus zur Bildung einer neuen Generation eines Acetogenen, wie z. B. T. kivui, aus einer vorangegangenen Generation, so dass in einem Wachstumszyklus aus einer einzigen Zelle zwei Zellen hervorgehen, so dass sich die Zellpopulation von Acetogenen verdoppelt. Ein solcher "Wachstumszyklus" kann auch als "Durchgang" einer

Kultur verstanden werden, der mehrere Generationen exponentiellen Wachstums umfasst.

[0037] Darüber hinaus bezeichnet der Begriff "CO-Gas" in dieser Beschreibung jedes Gas, das CO enthält oder aus CO besteht, also auch 100 % v/v CO und Gas mit niedrigeren CO-Konzentrationen, es sei denn, es wird im Text ausdrücklich angegeben, dass 100 % v/v CO oder Gas mit einer niedrigeren CO-Konzentration verwendet wird; in diesem Fall hat der Begriff eine entsprechende, eingeschränktere Bedeutung. In diesem Sinne umfassen die

CO-Gase, auf die die Erfindung Anwendung findet, insbesondere im Hinblick auf die

hohem CO-Gehalt, typischerweise in Kombination mit CO» und H2, zu metabolisieren.

[0038] In dieser Spezifikation umfasst der Begriff "Acetogen" auch alle mesophilen oder thermophilen Bakterien, wie z. B. T. kivui, die in der Lage sind, Acetat als Endprodukt der anaeroben Fermentation von Kohlendioxidgas zu erzeugen, in der Regel in Gegenwart von

Wasserstoffgas.

[0039] Der Temperaturbereich des Mediums, in dem solche mesophilen und thermophilen Bakterien zur Fermentation verwendet werden, kann 15 bis 44°C, insbesondere 15 bis 37°C, und 37 bis 85°C, insbesondere 45 bis 85°C, betragen. Thermophile Bakterien werden bevorzugt, weil sie die fühlbare Wärme im Feedgas nutzen

können, z. B. wenn es aus einem thermischen Prozess stammt.

[0040] Der erfindungsgemäßen Fachperson ist bekannt, dass acetogene Bakterien (d. h. Acetogene) eine vielfältige Gruppe von Bakterien sind, die in der Lage sind, Acetat als metabolisches Endprodukt zu produzieren. Die vorliegende Erfindung findet insbesondere Anwendung in Bezug auf thermophile Bakterien (d. h. thermophile Acetogene). Einige Beispiele für solche thermophilen acetogenen Bakterien, auf die sich die vorliegende Erfindung bezieht (d. h. die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Konditionierung

eines Acetogenen für die Metabolisierung von CO konditioniert werden können), sind

Moorella thermoacetica DSM 521; Moorella thermoacetica ATCGC 39073; Moorella thermoacetica ATCC 49707; Moorella thermoacetica DSM 6867; Moorella thermoacetica ATCC 31490; Moorella thermoacetica ATCC 35608; Moorella thermoacetica DSM 2955; Moorella thermoacetica DSM 12993; Moorella thermoacetica DSM 12797; Moorella thermoacetica DSM 11768; Moorella thermoacetica ATCC 33924; Moorella thermoacetica DSM 103132; Moorella thermoacetica DSM 103284; Moorella thermoacetica DSM 21394; Moorella thermoacetica Y72; Moorella thermoautotrophica DSM 7417; Moorella glyerini DSM 11254 Moorella stamsii DSM 26217 Moorella perchloratireducens An10 Moorella mulderi DSM 14980 Moorella humiferrea DSM 23265

Thermoanaerobacter kivui LKT-1 DSM 2030

Thermoacetogenium phaeum DSM 12270.

[0041] Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung wissen, dass acetogene Bakterien nach ihrer Fähigkeit benannt sind, Acetat zu produzieren, das ihr primäres Stoffwechselendprodukt ist. Acetat ist eine vielseitige Chemikalie, die zahlreiche industrielle und kommerzielle Anwendungen hat, wie zum Beispiel bei der Herstellung von

Lösungsmitteln, Kunststoffen und Lebensmittelzusatzstoffen.

[0042] Es gibt mehrere andere Produkte, die aus Acetat hergestellt werden können, sei es durch fortgesetzte Fermentation oder weitere Verarbeitung, auf die sich die vorliegende

Erfindung in Bezug auf Fermentationsprodukte erstreckt. Solche Produkte können sein

einwertige Alkohole: Ethanol; n-Propanol; Isopropanol; n-Butanol; 2-Butanol; Isobutanol; Pentanol; Hexanol; Heptanol; Oktanol;

zweiwertige Alkohole:

Apfelsäure;

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[0043] Andere Verbindungen, die Acetogene herstellen können und die in den Bereich der Fermentationsprodukte fallen, beinhalten Aceton, Wasserstoff, Kohlenhydrate, Proteine

und Kohlenwasserstoffe.

[0044] Die Fermentationsprodukte können als intrazelluläre oder extrazelluläre Produkte

hergestellt werden und können gasförmig, flüssig oder fest sein.

[0045] In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Fermentationsprodukte als extrazelluläre Produkte hergestellt. Optisch reine Produkte im

Falle von Enantiomeren werden bevorzugt.

[0046] Die Fermentationsprodukte können als chemische Bausteine, Futtermittel,

Lebensmittel oder Brennstoffe nützlich sein.

[0047] "Unmutiert" im hierin verwendeten Sinne bedeutet unmutiert in Bezug auf die Mutationen, die durch die Durchführung des erfindungsgemäßen Konditionierungsverfahrens vermittelt werden und durch den mutierten Acetogenen der Erfindung verkörpert werden. Wird auf einen "nicht mutierten" Acetogenen Bezug genommen, So kann dieser Bezug daher Acetogene mit Mutationen einschließen, die aus anderen Behandlungen als der des erfindungsgemäßen Konditionierungsverfahrens resultieren. Gentechnisch veränderte Mikroorganismen fallen ebenfalls unter den Begriff "nicht mutiert" und solche Mikroorganismen können daher ebenfalls der Konditionierung nach dem erfindungsgemäßen Konditionierungsverfahren unterzogen werden. Eine

gentechnische Nachkonditionierung ist ebenfalls nicht ausgeschlossen.

[0048] Der (nicht mutierte) Stamm des Acetogenen, der der Konditionierung unterzogen

wird, kann ein Wildtyp-Stamm des Acetogenen sein.

[0049] Bei dem Acetogenen kann es sich insbesondere um T. kivui handeln. In diesem Fall kann der 7. kivui-Stamm, der der Konditionierung gemäß dem Verfahren des ersten Aspekts der Erfindung unterzogen wird, ein Wildtyp-T. kivur! LKT-1-Stamm sein,

insbesondere DSM 2030 (ATCC 33488).

[0050] Die erste Wachstumsstufe kann vorzugsweise mindestens drei aufeinanderfolgende Wachstumszyklen umfassen, wobei nach Abschluss eines jeden

Wachstumszyklus ein frisches gasförmiges Substrat aus H» und CO»2-Gas bereitgestellt wird.

[0051] Die zweite Wachstumsstufe kann vorzugsweise mindestens zwei aufeinanderfolgende Wachstumszyklen umfassen, wobei nach jedem Wachstumszyklus ein

frisches gasförmiges Substrat aus Syngas mit hohem CO-Gehalt bereitgestellt wird.

[0052] Die dritte Wachstumsstufe kann vorzugsweise ein sukzessives Wachstum des Acetogenen, z. B. 7. kivui, aus der zweiten Wachstumsstufe für mindestens einen Wachstumszyklus auf jedem von fünf CO-Behandlungsgasen mit jeweils ansteigender COKonzentration umfassen (d. h. unter Verwendung jeweiliger aufeinanderfolgender gasförmiger Substrate von CO-Behandlungsgas), wobei die CO-Konzentrationen in den jeweiligen CO-Behandlungsgasen (d.h. in den aufeinanderfolgenden gasförmigen Substraten von CO-Behandlungsgas) aus 30% v/v, 40% vv, 50% v/v, 60% v/v bzw. 100%

v/v ausgewählt werden oder bevorzugt sind.

[0053] In der dritten Wachstumsstufe kann nach jedem Wachstumszyklus ein frisches

CO-Behandlungsgas (d. h. ein gasförmiges Substrat) bereitgestellt werden.

das in einem nachfolgenden Wachstumszyklus verwendet werden soll.

[0055] Das Synthesegas mit hohem CO-Gehalt kann ein Synthesegas sein, das einen größeren Volumenanteil an CO-Gas enthält. So kann das Syngas mit hohem CO-Gehalt

volumenmäßig mehr CO als jedes andere Gas enthalten.

[0056] Zum Beispiel kann das Syngas mit hohem CO-Gehalt 50 % v/v oder mehr CO enthalten. In einer Ausführungsform der Erfindung kann das Synthesegas mit hohem COGehalt etwa 52 % v/v CO enthalten. Typischerweise kann das Synthesegas mit hohem CO-

Gehalt zusätzlich zu CO auch H> und CO-> enthalten.

[0057] Die erste, zweite und dritte Wachstumsstufe kann jeweils die Kultivierung des Acetogenen in einem flüssigen Wachstumsmedium (d. h. Fermentationsmedium) umfassen.

Das flüssige Wachstumsmedium kann zum Beispiel ein synthetisches Serummedium sein.

[0058] Die erste, zweite und dritte Wachstumsstufe und damit die Wachstumszyklen können die Kultivierung des Acetogenen in einem chemisch definierten Minimalwachstumsmedium (d. h. Fermentationsmedium) umfassen, d. h. einem Wachstumsmedium, das Wachstumsstimulanzien ausschließt und insbesondere keine

Vitamine, komplexen Nährstoffe, Hefeextrakt und/oder Pepton enthält.

[0059] Das Verfahren kann auch die Isolierung eines Stammes von konditionierten

Acetogenen aus dem dritten Wachstumsstadium umfassen.

deutsch Einzelnukleotid-Polymorphismus)

[0061] Handelt es sich bei dem Acetogenen um T. kivui, so kann das konditionierte T. kivui und damit der isolierte Stamm des konditionierten T. kivur im Vergleich zum Wildtyp 7. kivui (DSM 2030) mindestens eine Mutation, Deletion und/oder Duplikation aufweisen, so

dass es sich um mutiertes 7. kivui im Vergleich zum Wildtyp T. kivui (DSM 2030) handelt.

[0062] Die Mutationen können insbesondere SNP-Mutationen umfassen, sind aber nicht auf diese beschränkt. Genauer gesagt können die Mutationen zusätzlich zu SNPMutationen mindestens eine Deletion und optional, aber vorzugsweise, mindestens eine

Duplikation umfassen.

[0063] SNP-Mutationen, die einbezogen werden können, können eine oder mehrere,

typischerweise alle, sein von -

cbiQ, Kobalt-ECF-Transporter-T-Komponente;

moC, DNA-gesteuerte RNA-Polymerase-Untereinheit beta’;

dapA, 4-Hydroxy-Tetrahydrodipicolinat-Synthase;

phoU, Phosphat-Signalkomplex-Protein;

hypF, Carbamoyltransferase; und

acsV, Corrinoid-Aktivierungs-/Regenerationsprotein.

[0064] Noch spezifischer können die SNP-Mutationen, die einbezogen werden können, insbesondere unter Bezugnahme auf das NCBI-Genom mit der Zugangsnummer

NZ_CP009170.1, eine oder mehrere, typischerweise alle, sein von

cbiQ, Kobalt-ECF-Transporter-T-Komponente an Position 341.995;

mMoC, DNA-gesteuerte RNA-Polymerase-Untereinheit beta’ an den Positionen 1.969.972 und 1.970.146; und

dapA, 4-Hydroxy-tetrahydrodipicolinat-Synthase an Position 818.980.

[0065] Darüber hinaus können die SNP-Mutationen, die einbezogen werden können, insbesondere unter Bezugnahme auf das NCBI-Genom mit der Zugangsnummer

NZ_CP009170.1, eine oder mehrere, typischerweise alle, sein von

phoU, Phosphat-Signalkomplex-Protein an Position 1.459.688;

hypF, Carbamoyltransferase, an Position 136.300; und

acsV, Corrinoid-Aktivierungs-/Regenerationsprotein, an Position 1.903.679.

[0066] Insbesondere kann die mutierte 7. kivui-Sequenz von einem klonalen Stamm von T. kivui mit der Bezeichnung CO-1 stammen, der eine Nukleotidsequenz von einem,

typischerweise allen, der folgenden Elemente umfasst

cbiQ, Kobalt-ECF-Transporter-T-Komponente, wie in SEQ ID NO: 1 dargelegt;

mMoC, DNA-gesteuerte RNA-Polymerase-Untereinheit beta’, wie in SEQ ID NO: 2 dargelegt; und

dapA, 4-Hydroxy-tetrahydrodipicolinat-Synthase, wie in SEQ ID NO: 3 dargestellt.

[0067] Zusätzlich kann die mutierte 7. kivui-Sequenz von einem klonalen Stamm von T. kivui mit der Bezeichnung CO-1 stammen, der eine weitere Nukleotidsequenz umfasst von

einem, typischerweise allen, von

phoU, Phosphat-Signalkomplex-Protein, wie in SEQ ID NO: 4 dargelegt;

hypF, Carbamoyltransferase, wie in SEQ ID NO: 5 dargelegt; und

acsV, Corrinoid-Aktivierungs-/Regenerationsprotein, wie in SEQ ID NO: 6 dargelegt.

[0068] Die Nukleotidsequenz kann mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder mehr Identität mit den Nukleotidsequenzen gemäß SEQ ID NOs: 1 bis 6 aufweisen oder eine Sequenz sein, die unter stringenten Bedingungen mit dem umgekehrten Komplement der

Nukleotidsequenzen gemäß SEQ ID NOs: 1 bis 6 hybridisiert.

[0069] Deletionen, die eingeschlossen werden können, können vollständige oder

partielle Deletionen einer oder mehrerer der folgenden Sequenzen sein:

N-Acetyltransferase der GNAT-Familie;

DUF881-Domäne-enthaltendes Protein; und

hypothetisches Protein.

[0070] Genauer gesagt, können Deletionen, insbesondere mit Bezug auf das NCBIGenom mit der Zugangsnummer NZ_CP009170.1, vollständige oder partielle Deletionen

von einer oder mehreren der folgenden Substanzen sein

N-Acetyltransferase der GNAT-Familie (partielle Deletion von Position 233,431 bis 234,484);

235,260); und

hypothetisches Protein (Teildeletion von Position 235.425 bis 235.869).

[0071] Insbesondere kann die mutierte 7. kivui-Sequenz von einem klonalen Stamm von T. kivui mit der Bezeichnung CO-1 stammen, der eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 7 umfasst. Die Nukleotidsequenz kann mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder mehr Identität mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 7 aufweisen oder eine Sequenz sein, die unter stringenten Bedingungen mit dem umgekehrten Komplement der

Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 7 hybridisiert.

[0072] Beiden Duplikationen, die einbezogen werden können, kann es sich, insbesondere mit Bezug auf das NCBI-Genom mit der Zugangsnummer NZ_CP009170.1, um eine oder beide

der folgenden handeln

mindestens eine, optional zwei, Duplikationen von mindestens einer der Regionen

zwischen 1.841.579 bis 1.901.680 und 1.910.027 bis 1.935.735; und

der Region von 1.917.220 bis 1.932.727.

[0073] Die Duplikation in der Region von 1.917.220 bis 1.932.727 kann Wasserstoffabhängige CO2-Reduktase (HDCR) sein. Eine solche Duplikation kann in der Region von

1.921.445 bis 1.922.281 liegen, insbesondere an der Position 1.921.445.

1.900.304 befinden.

[0075] Die Duplikation/en im Bereich von 1.910.027 bis 1.935.735 kann/können mindestens eine, vorzugsweise alle, von Acetyl-CoA-Decarbonylase/Synthase-KomplexUntereinheit alpha (ACDS), IpdA, Methylen-THF-Reduktase, Methylen-THFDehydrogenase, Formiat-Tetrahydrofolat-Ligase, Transporterprotein der Formiat/NitritFamilie, wasserstoffabhängige CO2-Reduktase (HDCR) und KohlenmonoxidDehydrogenase-Accessory-Protein CooC. Diese Duplikationen können sich an den Positionen 1.910.148 bis 1.911.086, 1.911.897 bis 1.913.282, 1.913.298 bis 1.914.839 befinden, 1.914.852 bis 1.916.379, 1.917.220 bis 1.918.899, 1.919.741 bis 1.920.616,

1.921.445 bis 1.927.301, und 1.934.883 bis 1.935.659.

[0076] Insbesondere kann die mutierte 7. kivui-Sequenz mit Duplikation(en) von einem klonalen Stamm von T. kivui mit der Bezeichnung CO-1 stammen, der eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 8 aufweist. Die Nukleotidsequenz kann mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder mehr Identität mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 8 aufweisen oder eine Sequenz sein, die unter stringenten Bedingungen mit dem

umgekehrten Komplement der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 8 hybridisiert.

SEQ ID NO: 9 hybridisiert.

[0078] Die Hybridisierung kann unter stringenten Bedingungen erfolgen, die eine Hybridisierung in 6x Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei 40 bis 45 °C umfassen, gefolgt

von einem Waschvorgang in 0,1 bis 0,2x SSC bei etwa 60 °C bis etwa 65 °C.

[0079] Die Verdopplung im Bereich von 1.917.220 bis 1.932.727 kann durch die Konditionierung in Syngas mit hohem CO-Gehalt entstehen. Eine oder beide der Verdopplungen in den Bereichen von 1.841.579 bis 1.901.680 und 1.910.027 bis 1.935.735

können aus der Konditionierung in 100% CO stammen.

[0080] Typischerweise kann bei der Konditionierung mit 100 % CO im Anschluss an die Konditionierung mit Syngas mit hohem CO-Gehalt die Duplikation im Bereich von 1.917.220 bis 1.932.727 durch eine oder beide der Duplikationen in den Bereichen von 1.841.579 bis 1.901.680 und 1.910.027 bis 1.935.735 ersetzt werden. Daher können die Duplikationen in den Regionen zwischen 1.841.579 bis 1.901.680 und 1.910.027 bis 1.935.735 unter

Ausschluss der Duplikation in der Region von 1.917.220 bis 1.932.727 existieren.

[0081] Die Duplikation/en in der Region von 1.917.220 bis 1.932.727 können eine Größe von 15.507 bp haben. Duplikation/en in der Region von 1.841.579 bis 1.901.680 und 1.910.027 bis 1.935.735 können eine Größe/en von 60.101 bp bzw. 25.708 bp oder eine

Einzelgröße von 85.809 bp haben.

[0082] In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung können die SNP-Mutationen, die Deletionen und die Duplikationen im Genom, insbesondere unter Bezugnahme auf das NCBI-Genom mit der Zugangsnummer NZ_CP009170.1, eine oder mehrere, und

typischerweise alle, von -

die aus der zweiten Wachstumsphase in CO-reichem Synthesegassubstrat stammen:

SNP-Mutationen von:

cbiQ, Kobalt ECF Transporter T-Komponente an Position 341,995;

rp0C, DNA-gesteuerte RNA-Polymerase-Untereinheit beta' an den

Positionen 1.969.972 und 1.970.146;

dapA, 4-Hydroxy- Tetrahydrodipicolinat-Synthase an Position

818.980;

Verdoppelung von:

der Region zwischen 1.917.220 und 1.932.727;

aus dem dritten Wachstumsstadium in 100% CO-Substrat:

24 / 682

SNP-Mutationen von:

cbiQ, Kobalt-ECF-T-Komponente an Position 341.995

(typischerweise aus der zweiten Wachstumsphase);

rp0C, DNA-gesteuerte RNA-Polymerase-Untereinheit beta' an den Positionen 1.969.972 und 1.970.146 (typischerweise von der zweiten

Wachstumsstufe übriggeblieben)

dapA, 4-Hydroxy-tetrahydrodipicolinat-Synthase an Position

818.980 (r typischerweise aus der zweiten Wachstumsphase);

phoU, Phosphat-Signalkomplex-Protein an Position 1.459.688.

Deletionen:

N-Acetyltransferase der GNAT-Familie (partielle Deletion von

Position 233,431 bis 234,484);

DUF881 domain-containing protein (vollständige Deletion von

Position 234,523 bis 235,260);

hypothetisches Protein (partielle Deletion von Position 235.425 bis

235.869);

Duplikation von:

Regionen zwischen 1.841.579 bis 1.901.680 und 1.910.027 bis 1.935.735 (typischerweise Ersatz der Duplikation der Region zwischen

1.917.220 und 1.932.727, die aus der zweiten Wachstumsstufe stammt).

[0083] Das Verfahren kann das Klonen der durch das Verfahren erzeugten 100%-igen CO-

Population und die Isolierung einzelner Klone daraus umfassen.

[0084] Zusätzlich können die SNP-Mutationen, die Deletionen und die Duplikationen im Genom, die typischerweise aus der Konditionierung mit 100 % CO (d. h. dem dritten Wachstumsstadium) stammen, insbesondere unter Bezugnahme auf das NCBI-Genom mit

der Zugangsnummer NZ_CP009170.1, eine oder beide der folgenden Mutationen umfassen

hypF, Carbamoyltransferase, an Position 136.300; und

acsV, Corrinoid-Aktivierungs-/Regenerationsprotein, an Position 1.903.679.

[0085] DIE ERFINDUNG ERSTRECKT SICH, ALS ZWEITEN ASPEKT, auf einen konditionierten und daher mutierten Acetogenen, wie T. kivui, der nach dem Verfahren des

ersten Aspekts der Erfindung hergestellt wurde.

[0086] Der mutierte Acetogene kann ein mutierter Stamm des Acetogenen sein, der aus dem gemäß dem Verfahren des ersten Aspekts der Erfindung hergestellten Acetogenen isoliert wurde. Der mutierte Acetogene kann wie vorstehend unter Bezugnahme auf den

ersten Aspekt der Erfindung beschrieben sein.

[0087] Gemäß einem dritten Aspekt der Erfindung wird ein mutierter Stamm eines Acetogenen, wie z. B. 7. kivui, bereitgestellt, der im Vergleich zu einem Wildtyp des Acetogenen, wie z. B. T. kivui (DSM 2030), mindestens eine SNP-Mutation, mindestens

eine Deletion und gegebenenfalls mindestens eine Duplikation im Genom aufweist.

[0088] Die mindestens eine SNP-Mutation, mindestens eine Deletion und mindestens eine Duplikation können aus der Konditionierung eines Wildtyps des Acetogenen gemäß

dem Konditionierungsverfahren des ersten Aspekts der Erfindung entstehen.

[0089] SNP-Mutationen, die einbezogen werden können, können eine oder mehrere,

typischerweise alle, sein von -

cbiQ;

mOoC;

dapA;

phoU;

hypF; und

acsV.

[0090] Genauer gesagt, können SNP-Mutationen, die einbezogen werden können, eine

oder mehrere, typischerweise alle, sein von -

cbiQ, Kobalt-ECF-Transporter-T-Komponente;

mMoC, DNA-gesteuerte RNA-Polymerase-Untereinheit beta’;

dapA, 4-Hydroxy-tetrahydrodipicolinat-Synthase;

phoU, Phosphat-Signalkomplex-Protein;

hypF, Carbamoyltransferase; und

acsV, Corrinoid-Aktivierungs-/Regenerationsprotein.

[0091] Noch spezifischer können die SNP-Mutationen, die eingeschlossen werden können, insbesondere unter Bezugnahme auf das NCBI-Genom mit der Zugangsnummer NZ_CP009170.1, eine oder mehrere, typischerweise alle, sein von -

cbiQ, Kobalt-ECF-Transporter-T-Komponente an Position 341.995;

moC, DNA-gesteuerte RNA-Polymerase-Untereinheit beta’ an den Positionen 1.969.972 und 1.970.146; und

dapA, 4-Hydroxy-tetrahydrodipicolinat-Synthase an Position 818,980.

[0092] Darüber hinaus können die SNP-Mutationen, die einbezogen werden können, insbesondere unter Bezugnahme auf das NCBI-Genom mit der Zugangsnummer

NZ_CP009170.1, eine oder mehrere, typischerweise alle, sein von -

phoU, Phosphat-Signalkomplex-Protein an Position 1.459.688; hypF, Carbamoyltransferase, an Position 136.300; und

acsV, Corrinoid-Aktivierungs-/Regenerationsprotein, an Position 1.903.679.

[0093] Insbesondere kann es sich bei dem mutierten 7. kivui-Stamm um einen klonalen Stamm von T. kivui mit der Bezeichnung CO-1 handeln, der eine Nukleotidsequenz von einem, typischerweise allen, von

cbiQ, Kobalt-ECF-Transporter-T-Komponente, wie in SEQ ID NO: 1 dargelegt;

dapA, 4-Hydroxy-tetrahydrodipicolinat-Synthase, wie in SEQ ID NO: 3 dargelegt.

[0094] Darüber hinaus kann der mutierte T. kivui-Stamm ein klonaler 7. kivui-Stamm mit der Bezeichnung CO-1 sein, der eine weitere Nukleotidsequenz eines, typischerweise aller, der folgenden Elemente enthält

phoU, Phosphat-Signalkomplex-Protein, wie in SEQ ID NO: 4 dargelegt; hypF, Carbamoyltransferase, wie in SEQ ID NO: 5 dargelegt; und

[0095] Die Nukleotidsequenz kann mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder mehr

Identität mit den Nukleotidsequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 bis 6 aufweisen oder eine

Sequenz sein, die unter stringenten Bedingungen mit dem umgekehrten Komplement der

Nukleotidsequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 bis 6 hybridisiert.

[0096] Deletionen, die einbezogen werden können, können vollständige oder partielle Deletionen einer oder mehrerer der folgenden Sequenzen sein: N-Acetyltransferase der GNAT-Familie; DUF881-Domäne-enthaltendes Protein; und

hypothetisches Protein.

[0097] Genauer gesagt, können Deletionen, die eingeschlossen werden können, insbesondere mit Bezug auf das NCBI-Genom mit der Zugangsnummer NZ_CP009170.1,

vollständige oder partielle Deletionen von einem oder mehreren der folgenden Proteine sein

N-Acetyltransferase der GNAT-Familie (Teildeletion von Position 233,431 bis 234,484);

DUF881-Domäne-enthaltendes Protein (vollständige Deletion von Position 234,523 bis 235,260); und

hypothetisches Protein (partielle Deletion von Position 235.425 bis 235.869).

[0098] Insbesondere kann der mutierte 7. kivui-Stamm ein klonaler Stamm von T. kivu[ mit der Bezeichnung CO-1 sein, der eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 7 umfasst. Die Nukleotidsequenz kann mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder mehr Identität mit der

Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 7 aufweisen oder eine Sequenz sein, die unter

stringenten Bedingungen mit dem reversen Komplement der Nukleotidsequenz gemäß SEQ

ID NO: 7 hybridisiert.

[0099] Duplikationen, die einbezogen werden können, insbesondere mit Bezug auf das NCBIGenom mit der Zugangsnummer NZ_CP009170.1, können eine oder beide der folgenden

sein

mindestens eine, optional zwei, Duplikationen von mindestens einer der Regionen

zwischen 1.841.579 bis 1.901.680 und 1.910.027 bis 1.935.735; und

der Region von 1.917.220 bis 1.932.727.

[0100] Die Duplikation/en in den Regionen zwischen 1.841.579 bis 1.901.680 und 1.910.027 bis 1.935.735 können unter Ausschluss der Duplikation der Region von

1.917.220 bis 1.932.727 bestehen.

[0101] Die Duplikation/en in der Region von 1.917.220 bis 1.932.727 können eine Größe von 15.507 bp haben. Die Duplikation/en in der Region von 1.841.579 bis 1.901.680 und 1.910.027 bis 1.935.735 können eine Größe/en von 60.101 bp bzw. 25.708 bp oder eine

Einzelgröße von 85.809 bp haben.

1.921.445 bis 1.922.281 liegen, insbesondere an der Position 1.921.445.

[0103] Die Duplikation/en im Bereich von 1.841.579 bis 1.901.680 können eine, vorzugsweise beide, von elektronenverzweigender Hydrogenase (EBH) und energieerhaltendem Hydrogenase-2-Komplex (Ech-Hydrogenase) sein. Solche Verdoppelungen können sich an den Positionen 1.883.375 bis 1.887.553 bzw. 1.893.535 bis

1.900.304 befinden.

[0104] Bei der/den Duplikation(en) in der Region von 1.910.027 bis 1.935.735 kann es sich um mindestens eine, vorzugsweise alle, der folgenden Substanzen handeln: AcetylCoA-Decarbonylase/Synthase-Komplex-Untereinheit alpha (ACDS), IpdA, Methylen-THFReduktase, Methylen-THF-Dehydrogenase, Formiat-Tetrahydrofolat-Ligase, Transporterprotein der Formiat/Nitrit-Familie, wasserstoffabhängige CO2-Reduktase (HDCR) und Kohlenmonoxid-Dehydrogenase-Accessory-Protein CooC. Diese Duplikationen können sich jeweils an den Positionen 1.910.148 bis 1.911.086, 1.911.897 bis 1.913.282, 1.913.298 bis 1.914.839, 1,914,852 bis 1,916,379, 1,917,220 bis 1,918,899, 1,919,741 bis 1,920,616,

1,921,445 bis 1,927,301, und 1,934,883 bis 1,935,659 befinden.

[0105] Insbesondere kann der mutierte T. kivui-Stamm mit Duplikation(en) ein klonaler

Stamm von T. kivui mit der Bezeichnung CO-1 sein, der eine Nukleotidsequenz der SEQ ID

Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 8 hybridisiert.

[0106] Der mutierte 7. kivui-Stamm mit Duplikation/en kann ein klonaler Stamm von 7. kivui mit der Bezeichnung CO-1 sein, der weitere oder alternative Duplikation(en) und eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 9 aufweist. Die Nukleotidsequenz kann mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder mehr Identität mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 9 aufweisen oder eine Sequenz sein, die unter stringenten Bedingungen mit dem

umgekehrten Komplement der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 9 hybridisiert.

[0107] Die Hybridisierung kann unter stringenten Bedingungen erfolgen, die eine Hybridisierung in 6x Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei 40 bis 45 °C umfassen, gefolgt

von einem Waschvorgang in 0,1 bis 0,2x SSC bei etwa 60 °C bis etwa 65 °C.

[0108] INSBESONDERE GEMÄSS EINEM DRITTEN ASPEKT DER ERFINDUNG wird ein mutierter Stamm eines Acetogenen, wie T. kivui, bereitgestellt, der im Vergleich zu einem Wildtyp des Acetogenen, wie T. kivui (DSM 2030), insbesondere unter Bezugnahme auf das NCBI-Genom mit der Zugangsnummer NZ_CP009170.1, eine oder mehrere der folgenden

Eigenschaften aufweist

partielle Deletion der N-Acetyltransferase der GNAT-Familie;

SNP-Mutation von cbiQ, einer Komponente des Kobalt-ECF-Transporters T; vollständige Deletion des DUF881-Domäne-enthaltenden Proteins; partielle Deletion eines hypothetischen Proteins;

SNP-Mutation von dapA, 4-Hydroxy-Tetrahydrodipicolinat-Synthase an Position 818.980;

SNP-Mutation von phoU, Phosphat-Signalkomplex-Protein an Position 1.459.688;

SNP-Mutation von m0C, DNA-gesteuerte RNA-Polymerase-Untereinheit beta’ an den Positionen 1969972 und 1970146;

SNP-Mutation von hypF, Carbamoyltransferase, an der Position 136.300; und

SNP-Mutation von acsV, Corrinoid-Aktivierungs-/Regenerationsprotein, an der Position

1.903.679.

[0109] Insbesondere kann der mutierte Stamm eines oder mehrere der folgenden

Elemente enthalten

cbiQ, Kobalt-ECF-Transporter-T-Komponente an Position 341,995 (SNP-Mutation);

DUF881 domain-containing protein (vollständige Deletion von Position 234,523 bis 235,260);

hypothetisches Protein (partielle Deletion von Position 235,425 bis 235,869) (SNPMutation);

dapA, 4-Hydroxy-tetrahydrodipicolinat-Synthase an Position 818,980 (SNP-Mutation);

phoU, Phosphat-Signalkomplex-Protein an Position 1.459.688 (SNP-Mutation);

mMoC, DNA-gesteuerte RNA-Polymerase-Untereinheit beta’ an den Positionen 1969972 und 1970146 (SNP-Mutation);

hypF, Carbamoyltransferase, an der Position 136.300 (SNP-Mutation); und

acsV, Corrinoid-Aktivierungs-/Regenerationsprotein, an der Position 1.903.679 (SNPMutation).

[0110] Der mutierte Stamm kann mindestens enthalten -

cbiQ, Kobalt ECF Transporter T Komponente, an Position 341.995 (SNP-Mutation);

und

phoU, Phosphat-Signalkomplex-Protein an Position 1.459.688 (SNP-Mutation).

[0111] Vorzugsweise umfasst der mutierte Stamm auch -

hypF, Carbamoyltransferase, an Position 136.300 (SNP-Mutation); und

acsV, Corrinoid-Aktivierungs-/Regenerationsprotein, an Position 1.903.679 (SNP-

Mutation)

[0112] Vorzugsweise umfasst der mutierte Stamm außerdem -

hypothetisches Protein (partielle Deletion von Position 235,425 bis 235,869) (SNPMutation).

[0113] Am meisten bevorzugt, umfasst der mutierte Stamm alle -

cbiQ, Kobalt-ECF-Transporter-T-Komponente an Position 341.995 (SNP-Mutation);

dapA, 4-Hydroxy-tetrahydrodipicolinat-Synthase an Position 818,980 (SNP-Mutation); phoU, Phosphat-Signalkomplex-Protein an Position 1.459.688 (SNP-Mutation);

hypF, Carbamoyltransferase, an der Position 136.300 (SNP-Mutation); und

[0114] Der Acetogene kann insbesondere 7. kivui sein, und daher kann der mutierte Stamm ein mutierter Stamm von T. kivui sein, der im Vergleich zum Wildtyp T. kivui (DSM

2030) mutiert ist.

[0115] Der mutierte Stamm kann durch Konditionierung des Wildtyps von T. kivur mutiert worden sein, indem das Verfahren des ersten Aspekts der Erfindung durchgeführt

wurde.

[0116] Der mutierte Stamm kann zur Verwendung bei der Durchführung der acetogenen

Fermentation von CO-Feedgas bestimmt sein.

[0117] Gemäß einem vierten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur acetogenen Fermentation von zu fermentierendem CO-Gas (d. h. CO-Feedgas) bereitgestellt, wobei das Verfahren das Wachsen eines mutierten Stammes eines Acetogenen, wie z.B. T. kivul, gemäß dem zweiten oder dritten Aspekt der Erfindung auf zu fermentierendem CO-Gas (d.h. CO-Feedgas) als Haupt- oder einziger Kohlenstoffquelle einschließt, wodurch ein

Fermentationsprodukt erzeugt wird.

[0118] Die Züchtung des mutierten Stammes kann die Kultivierung des Acetogenen in

einem flüssigen Wachstumsmedium (d. h. Fermentationsmedium) umfassen. Bei dem

Vitamine, Nährstoffe und Hefeextrakte enthält.

[0119] Das CO-Feedgassubstrat kann aus 100 % v/v CO bestehen. Alternativ kann das CO-Feedgassubstrat weniger als 100 % v/v CO umfassen, zum Beispiel in einem Bereich

von 50 % v/v CO bis zu 100 % v/v CO.

[0120] Das Verfahren des vierten Aspekts der Erfindung ist ferner durch die Merkmale des Gasfermentationsverfahrens gekennzeichnet, die unter Bezugnahme auf den ersten

umfassenden Aspekt der Erfindung beschrieben sind.

[0121] Gemäß einem fünften Aspekt der Erfindung wird die Verwendung eines mutierten Acetogenen, WIE T. KIVUI, oder eines mutierten Stammes eines Acetogenen, wie T. kivui, gemäß dem zweiten oder dritten Aspekt der Erfindung bei der acetogenen

Fermentation von zu fermentierendem CO-Gas bereitgestellt.

[0122] Die Verwendung kann nach dem Verfahren des vierten Aspekts der Erfindung erfolgen. Das CO-Gas kann auch wie unter Bezugnahme auf den vierten Aspekt der

Erfindung beschrieben sein.

[0123] Gemäß einem sechsten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, um einen thermophilen Acetogenen in die Lage zu versetzen, 100 % CO-Gas zu metabolisieren, wobei das Verfahren die Einführung einer oder mehrerer genetischer Modifikationen gemäß dem zweiten oder dritten Aspekt der Erfindung in den thermophilen

Acetogenen umfasst.

[0124] EXPERIMENTELL

[0125] DIE ERFINDUNG WIRD JETZT unter Bezugnahme auf experimentelle Daten, die bei der Durchführung einer vergleichenden Konditionierung von T. kivul und einer vergleichenden acetogenen Gasfermentation unter Verwendung von so konditioniertem 7. kivui gesammelt wurden, ausführlicher beschrieben. Die Erfindung ist auch auf andere Acetogene anwendbar, insbesondere auf Thermophile, und die in Bezug auf T. kivu[ dargestellten experimentellen Daten werden daher nur als nicht einschränkendes Beispiel

dargestellt.

[0126] Genauer gesagt wurde 7. kivui (DSM 2030) in Serumflaschen mit einem Kulturvolumen von 20 ml gemäß der Methode des ersten Aspekts der Erfindung und alternativen Methoden konditioniert. Anschließend wurden die konditionierten Stämme auf ihre Fähigkeit zur acetogenen Gasfermentation in verschiedenen Substraten durch

Kultivierung in einem DasGip ® DASbox ® Mini-Bioreaktorsystem (geliefert von der

Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland) untersucht. Die Genomeigenschaften und die

Leistung wurden unter den nachstehend beschriebenen Bedingungen und Verfahren

analysiert. [0127] Wachstumsmedien und Kultivierung der Organismen [0128] Zwei verschiedene Varianten eines synthetischen Wachstumsmediums (d. h.

Fermentationsmedium) wurden für Serumflaschen bzw. Bioreaktoren verwendet.

[0129] Genauer gesagt wurden die Medien für Serumflaschen und Bioreaktoren von Moon et al. modifiziert (Moon, J., Jain, S., Müller, V., Basen, M., 2020. Homoacetogenic Conversion of Mannitol by the Thermophilic Acetogenic Bacterium Thermoanaerobacter

kivui Requires External CO». Front. Microbiol. 11, 571736).

[0130] Die spezifischen Zusammensetzungen der jeweiligen Wachstumsmedien sind in

Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle 1: Zusammensetzung der Wachstumsmedien

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41 / 682

[0131] Das Agarmedium wurde nach dem Rezept für das Serumflaschenmedium hergestellt, mit zusätzlich 2 g/L Hefeextrakt und 10 g/L Nobleagar (geliefert von Carl-Roth,

Schoemperlenstraße 3-5, D-76185 Karlsruhe).

[0132] Die Kultivierung von T. kivui (DSM 2030) zur Anpassung (Konditionierung)

erfolgte bei 66°C in 125 mL Serumflaschen mit 20 mL Kulturvolumen.

[0133] Die Serumflaschen wurden in einem Wasserbadschüttler bei mittlerer Schüttelgeschwindigkeit inkubiert, während die Bioreaktoren in ein statisches Wasserbad

bei 66 °C gestellt wurden.

[0134] Die Gase für die Serumflaschen wurden mit Massendurchflussreglern der Serie Brooks 4800 gemischt, mit Ausnahme von CO, das separat zugegeben wurde, und die

Konzentration wurde über den Druckanteil eingestellt.

[0135] Für die Bioreaktoren wurden vorgemischte Gase verwendet, die von Messer

Austria GmbH, Gumpoldskirchen, Österreich, geliefert wurden.

[0136] Für die Serumflaschen wurde routinemäßig 1 ml der Zellkultur bei jedem der

unten beschriebenen Adaptionsschritte (Konditionierung) transferiert.

[0137] Die Bioreaktoren wurden bis zu einer ODeoo von 0,1 aus 500 mL Serumflaschen

mit 100 mL Kulturvolumen beimpft.

[0138] Bioreaktorkultivierungen [0139] Die im Folgenden beschriebenen Bioreaktorkultivierungen wurden, wie oben

erwähnt, in einem DASbox ® Mini-Bioreaktorsystem durchgeführt.

[0140] Es wurden Bioreaktoren mit einem maximalen Volumen von 250 mL und einem

Arbeitsvolumen von 200 ml bei einer Temperatur von 66 °C verwendet.

[0141] Der pH-Wert wurde zunächst auf 6,4 eingestellt, mit einer EasyFerm Plus K8 120 pH-Elektrode (Hamilton, Reno, NV, USA) überwacht und durch Zugabe von 5 M KOH mit

einem MP8-Multipumpenmodul (Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland) gesteuert.

[0142] Der Bioreaktor wurde mit 0,05 vvm (0,6 sLh-1) Gas gespült, das von Messer Austria GmbH, Gumpoldskirchen, Österreich, vorgemischt gekauft wurde. Zur Verbesserung

des Gastransfers in die flüssige Phase wurden Mikrosparger aus Sintermetall mit einer

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Porengröße von 10 um (Sartorius Stedim Biotech GmbH, Göttingen, Deutschland)

verwendet.

[0143] Vor der Inokulation wurde das Reaktormedium mindestens 3 Stunden lang mit

dem entsprechenden Gas gespült.

[0144] Bei der kontinuierlichen Kultivierung wurde im Gegensatz zur Batch-Kultivierung das anaerobe Wachstumsmedium dem Wachstumsmedium im Bioreaktor kontinuierlich mit der vorgegebenen Verdünnungsrate mit dem MP8-Pumpenmodul zugeführt. Um das Reaktionsvolumen konstant zu halten, wurde die Kulturbrühe kontinuierlich mit Hilfe von Peristaltikoumpen (Ismatec SA, Glattburg, Deutschland) und einem Tauchrohr entnommen,

wobei das Kulturvolumen bei etwa 200 mL gehalten wurde.

[0145] Die Futterflaschen wurden anaerob gehalten, indem mit N» und einem

Druckminderer ein Überdruck von 0,1 bar auf den Kopfraum ausgeübt wurde.

[0146] Steady-State-Bedingungen wurden nach mindestens 4 Volumenwechseln

untersucht, und die OD600 wurde regelmäßig gemessen.

[0147] Zur Bestimmung der trockenen Biomasse wurde die Kulturbrühe 5 Minuten lang bei 10.000 g zentrifugiert und zweimal mit 0,9 % NaCl gewaschen, bevor sie in ein

Glasröhrchen mit RO-Wasser (Umkehrosmose) überführt wurde.

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[0148] Der Überstand der Kulturbrühe wurde für die HPLC-Analyse verwendet.

[0149] HPLC-Analyse

[0150] Die Substrate und Produkte im flüssigen Medium wurden mit einer Aminex HPX87H-Säule (300 x 7,8 mm) von Bio-Rad, Hercules, CA, USA, unter Verwendung eines Ultimate 3000-Systems von Thermo Scientific, Waltham, MA, USA, analysiert. Als mobile Phase wurde 4 mM H2S04 verwendet, und die Säule wurde bei 60°C mit einer Flussrate

von 0,6 ml min-1 für 20 min betrieben.

[0151] Eine 10 ul Probe wurde auf die Säule injiziert. Die Detektion erfolgte mit einem Brechungsindex (Refractomax 520, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA und einem Diodenarray-Detektor (Ultimate 3000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Zur Steuerung, Überwachung und Auswertung der Analyse wurde Chromeleon 7.2.6

Chromatography Data System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) verwendet.

[0152] 540 ul des Kulturüberstandes wurden mit 60 ul 40 mM H2S04 gemischt und 5 min bei 14.000 U/min (21.913 g) bei 4°C zentrifugiert. Der verbleibende Überstand wurde für

die weitere Analyse verwendet. Standards mit definierten Acetat- und

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Glukosekonzentrationen wurden auf die gleiche Weise behandelt. Für die Quantifizierung

wurde eine Fünf-Punkte-Kalibrierung verwendet.

[0153] Genom-Sequenzierung [0154] Die Zellen wurden bis zur späten log-Phase (OD600 » 1) gezüchtet, durch

Zentrifugation geerntet und bei -80°C eingefroren.

[0155] CO-Adaptation (Konditionierung)

[0156] Wildtyp T. kivui (DSM2030) wurde für die CO-Metabolisierung gemäß dem Verfahren des ersten Aspekts der Erfindung adaptiert (konditioniert), indem T. kivur für drei Wachstumszyklen im ersten Wachstumsstadium, zwei Wachstumszyklen im zweiten Wachstumsstadium und fünf Wachstumszyklen im dritten Wachstumsstadium in jeweils

30% v/v CO, 40% v/v CO, 50% v/v CO, 60% v/v CO bzw. 100% v/v CO gezüchtet wurde.

[0157] Die Konditionierung erfolgte ohne Zusatz von Wachstumsstimulanzien, d. h. frei

von Vitaminen oder Hefeextrakt.

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[0158] Zu Vergleichszwecken wurde der Stamm nach drei Passagen (Wachstumszyklen) mit H,/CO» zweimal mit zwei verschiedenen H2/CO2/CO-Mischungen, die erfindungsgemäß als "Syngas mit niedrigem CO-Gehalt" (30 % CO, 9 % CO», 58 % Ho, 3 % N») und "Syngas mit hohem CO-Gehalt" (52 % CO, 21 % CO», 24 % Ho, 3 % N2) bezeichnet werden, kultiviert und anschließend in entsprechende Serumflaschen mit 30 %

CO im Kopfraum überführt.

[0159] Genauer wurde, wie in Abbildung 1 gezeigt, der Wildtyp von T. kivur, ausgehend von einer mixotrophen Kultur, dreimal nur in der H,/CO,-Gasphase gezüchtet, um anschließend Klone zu isolieren und Gene zu sequenzieren. Der Stamm aus demselben Gefäß wurde, wie oben beschrieben, in zwei verschiedene synthetische Synthesegasmischungen, nämlich Syngas mit niedrigem CO-Gehalt und Syngas mit hohem

CO-Gehalt, überführt.

[0160] Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass nach dem zweiten Transfer auf das Syngasgemisch mit hohem CO-Gehalt das Wachstum auf 30 % CO bereits erleichtert wurde, während der Transfer von Syngas mit niedrigem CO-Gehalt kein Wachstum auf 30 % CO ergab (Daten nicht angegeben). Die CO-Konzentration konnte bei jedem Transfer von T. kivui, das auf dem Syngas mit hohem CO-Gehalt gezüchtet wurde, in 10 %-Schritten von 30 auf 60 % erhöht werden, wobei jedoch ein kontinuierliches Wachstum zu

beobachten war.

[0161] Mit einem Stamm aus der 60 %-Kultur war der Transfer und das Wachstum auf

100 % CO-Gasphase in einem einzigen Schritt möglich. Daher wurde die Anpassung in

insgesamt zehn Transfers durchgeführt, nämlich drei auf H2/CO» und sieben auf CO-haltiges

Gas, davon fünf auf CO allein.

[0162] Überraschenderweise wurde bei dieser schrittweisen Konditionierungsmethode eine starke Disposition des Wildtyp-Stammes beobachtet, auf reinem CO zu wachsen. Dies

war vor den Experimenten nicht erwartet worden.

[0163] Die H2/CO»-, CO-armen und CO-reichen Syngas-Stämme sowie der zu 100 % auf CO gewachsene Stamm wurden ausgeplattiert und einzelne Kolonien zur weiteren

Charakterisierung und Gensequenzierung isoliert.

[0164] Es stellte sich heraus, dass nur die mit hohem CO-Gehalt gezüchtete Kultur in der Lage war, mit 30 % CO zu wachsen, und dass sie anschließend in vier weiteren Transfers zum Wachstum mit 100 % CO gebracht werden konnte. In diesem Zusammenhang wird auch auf Abbildung 1 verwiesen, die schematisch ein Flussdiagramm

der angewandten Anpassungs- (Konditionierungs-) Schritte zeigt.

[0165] Wie die nachfolgende Analyse zeigt (siehe insbesondere Tabelle 4), wurde der als CO-1 identifizierte T. kivui-Stamm, ein klonaler Stamm, der von T. kivui gewonnen wurde, der durch die Durchführung des Verfahrens des ersten Aspekts der Erfindung

angepasst wurde, überraschenderweise als fähig befunden, H» und CO bei

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und noch mehr ihre Kombination.

[0166] Die Anpassung führte zu vier verschiedenen Populationen, die an H»/CO>», Syngas mit niedrigem und hohem CO-Gehalt sowie an 100 % CO angepasst waren. Die Anpassung wurde durch einen Anstieg der OD600 im Vergleich zu Kontrollkulturen mit demselben H2/CO»2-Gehalt im Kopfraum, aber unter Verwendung von N» anstelle von CO festgestellt. In diesem Zusammenhang wird auf Abbildung 2 verwiesen, die die optischen Dichten der Syngaslinien mit hohem bzw. niedrigem CO-Gehalt sowie der reinen CO-Linie

aus Abbildung 1 zeigt.

[0167] Wie aus Abbildung 2 ersichtlich ist, ermöglichte die Erhöhung der COKonzentration im Kopfraum der Serumflaschen ein dichtes Wachstum von T. kivur auf 100 % CO in insgesamt sieben Durchgängen (H2/CO»> —> hohes CO-Syngas — schrittweise

Erhöhung um 10 % von 30 % auf 60 % und dann ein Sprung auf 100 % CO im Kopfraum).

[0168] Von den H2/CO»- und CO-adaptierten Kulturen wurden die Populationen ausgeplattiert und einzelne Kolonien geerntet, um genetisch einheitliche Stämme zu

erhalten.

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[0169] Die Kolonie aus der H2/CO»2-angepassten Population wird als G1 bezeichnet, und drei klonale Stämme aus der CO-angepassten Population werden als CO-1, CO-2 und CO-

3 bezeichnet. Jeder wurde einer Genomanalyse unterzogen.

[0170] Genomanalyse [0171] Die angepassten (konditionierten) Populationen (Syngas mit niedrigem CO-

Gehalt, Syngas mit hohem CO-Gehalt, 100% CO) wurden direkt einer Genom-

Mutationsanalyse unterzogen.

[0172] Von der reinen CO-Population wurden außerdem Kolonien auf einem Medium mit Noble-Agar (10 g/L) isoliert und auf ihre Fähigkeit untersucht, auf 100 % CO zu wachsen. Es wurden drei verschiedene klonale Stämme gewonnen und zur

Genomsequenzierung eingereicht, die als CO-1, CO-2 bzw. CO-3 bezeichnet wurden.

[0173] Die Sequenzierungsdaten wurden zur Durchführung von SNP-Analysen verwendet. Tabelle 2 zeigt eine Zusammenfassung der verschiedenen Mutationen, die in den Stämmen identifiziert wurden, die aus den Populationen mit niedrigem CO-Gehalt, hohem CO-Gehalt und 100 % CO gewonnen wurden. Tabelle 3 zeigt eine

Zusammenfassung der verschiedenen Mutationen, die in den klonalen Stämmen CO-1, CO-

2 und CO-3 identifiziert wurden, wobei nur Mutationen mit einer Häufigkeit von >90%

angegeben sind und stumme Mutationen herausgefiltert wurden.

Tabelle 2: Mutationen in Syngas mit niedrigem CO-Gehalt, Syngas mit hohem CO-Gehalt und Stämmen

mit 100 % CO-Konditionierung.

CO-arme Syngaspopulation

verwandtes Protein

DNA-gesteuerte RNA-

DUF881-Domäne- Deletion TKV_RS01125 234579 |CT C 80% 1|6.0 enthaltendes Protein (V228fs)

Intergenic - 759157 |CA CC |NA 12% 11.2 Penicillin-bindendes Einfügung TKV_RS04390 873559 IT TA 10% 1|0.7 Protein 2 (M576fs)

Intergenic - 1134756 |G T J- 30% 1|1.6

Untereinheit beta

DNA-gesteuerte RNA-

Kobalt-ECFEinfügung TKV_RS01675 | Transporter T- 341995 |T C 99% 1|1.4 (X207fs) Komponente cbiQ ATP-bindende Missense TKV_RS01680 | Kassettendomäne 342421 C T 17% 10.8 (P92S)

enthaltendes Protein

ATP-bindende CT | Einfügung TKV_RS01680 | Kassettendomäne 342777 IC 37% 1|6.3 A |(K215fs) enthaltendes Protein

ATPase GspE

nickelabhängige

Missense TKV_RS09610 | Hydrogenase große 1899612 |G T 62% |(H109N) Untereinheit Intergenic - 1900320 |G GC |- 14% |DNA-gesteuerte RNAMissense TKV_RS10070 | Polymerase- 1969972 |C T 74% |(G1002E) Untereinheit beta DNA-gesteuerte RNAMissense TKV_RS10070 | Polymerase- 1970146 |G T 26% |(A944D) Untereinheit beta Intergenic - 2268120 |G GC |- 31% 1|3.4 Phosphoesterase der Missense TKV_RS11995 2376288 |A T 31% 11.0 DHH-Familie (M82K)

Tabelle 3: Mutationen in CO-1, CO-2 und CO-3. Es wurde ein Frequenz-Cutoff von 10 % verwendet und

stille Mutationen wurden herausgefiltert.

CO-1

Locus Tag Produkt Position | Ref. | Alt. | Mutationstyp Freq. | FCwr Carbamoyltransferas

TKV_RS00680 136300 |G IC | Missense (G22A) 100% | e hypF Kobalt-ECF-

TKV_RS01675 | Transporter T- 341995 IT C | Einfügung (X207fs) 100% | 1.4

Komponente cbiQ

4-HydroxyTKV_RS04105 | Tetrahydrodipicolinat |818980 IC G | Missense (A93P) 100% | 50.9

-Synthase

TKV_RS05745 | TIM-Tonnenprotein |1146134 |IG |C | Missense (S269T) 100% | -

Protein der YlzJTKV_RS06280 1239704 IC A |Missense (M1l) 100% | ähnlichen Familie

PhosphatTKV_RS07415 | Signalkomplex- 1459688 |C 1|T | Missense (D215N) 100% | -

Protein PhoU

Typ | GlyceraldehydTKV_RS07960 | 3-phosphat- 1559965 |T C | Missense (N35D) 100% | 1.0

Dehydrogenase

Stalk-DomäneTKV_RS08050 1576833 |C G |Missense (E349D) 100% | enthaltendes Protein

CorrinoidAktivierungs-

TKV_RS09640 1903679 |C 1|G | Missense (G411A) 100% | /Regenerationsprotei

n AcsV

DNA-gesteuerte TKV_RS10070 | RNA-Polymerase- 1970146 |G IT | Missense (A944D) 100% | -

Untereinheit beta

Intergenic - 2268120 |G IC |- 100% | 11.0

CO-2

Komponente cbiQ

4-HydroxyTKV_RS04105 | Tetrahydrodipicolinat |818980 IC G | Missense (A93P) 99% | 50.5

-Synthase

TKV_RS04565 | Acyl-CoA-Ligase 903470 |G |T |Nonsense (G383X) 99% |-

Deacetylase der

TKV_RS05260 1055168 |G [|A | Missense (T193M) 100% | PIG-L-Familie

TKV_RS07415 | Signalkomplex- 1459688 |C 1|T | Missense (D215N) 100% | -

Protein PhoU

Intergenic - 1528260 |G |A |- 100% | -

Typ | GlyceraldehydTKV_RS07960 | 3-phosphat- 1559965 |T C |Missense (N35D) 100% | 1.0

Dehydrogenase

Untereinheit beta

Intergenic - 2268120 |G IC |- 100% | 11.0

CO-3

Locus Tag Produkt Position | Ref. | Alt. | Mutationstyp Freq. | FCwr

Intergenic - 303329 |T A |- 100% | 8.073501

ECF-Transporter S-

TKV_RS01555 322778 |TG |T | Deletion (G128fs) 97% |Komponente Kobalt-ECF-

TKV_RS01675 | Transporter T- 341995 IT C | Einfügung (X207fs) 100% | 1.399329

Komponente cbiQ

Flagellar-ExportTKV_RS02415 486030 |G [|T |Missense (A116S) 100% | Chaperon FIliS

4-Hydroxy-

TKV_RS04105 | Tetrahydrodipicolinat |818980 IC G | Missense (A93P) 100% | 50.9 -Synthase

TKV_RS05625 | Ribonuklease J 1125479 |G [|A [| Missense (M51l) 100% | -

PhosphatTKV_RS07415 | Signalkomplex- 1459688 |C 1|T | Missense (D215N) 100% | -

Protein PhoU

Typ | GlyceraldehydTKV_RS07960 | 3-phosphat- 1559965 |T C | Missense (N35D) 100% | 1

Dehydrogenase

Untereinheit beta

[0174] Zur Ergänzung der Punktmutationsanalyse wurde die Illumina-Leseabdeckung für die verschiedenen entwickelten Mutanten (niedrige, hohe Syngas- und reine COPopulationen sowie klonale CO-1-, CO-2- und CO-3-Stämme) analysiert. Der Vergleich mit der Leseabdeckung des Wildtyps zeigt eine ungleichmäßige Verteilung der Lesewerte entlang des Genoms, mit deutlichen Unterschieden an zwei spezifischen Loci (Abbildung 3). Der erste Locus (Abbildung 3A) weist in den reinen CO-Populationen sowie in den abgeleiteten Klonen (CO-1, CO-2, CO-3) eine Deletion von ca. 2,5 kb auf (Positionen 233.431 bis 235.869). Diese Deletion ist in den Populationen mit niedrigem und hohem Syngasgehalt nicht vorhanden. Sie inaktiviert/deletiert zwei Gene mit unbekannten Funktionen sowie eine N-Acetyltransferase der GNAT-Familie, die an der

posttranslationalen Genregulation beteiligt sein könnte.

[0175] Der zweite Locus (Abbildung 3B) zeigt eine erhöhte Verteilung von Reads über zwei große Genomregionen in unmittelbarer Nähe (Region 1: Positionen 1.841.579 bis 1.901.680, 60.101 bp; Region 2: Positionen 1.910.027 bis 1.935.735, 25.708 bp). In diesen Regionen ist die Leseabdeckung etwa doppelt so hoch wie im restlichen Genom (mittlere Leseabdeckung + SD in CO-1 NGS-Daten: Region 1: 1686,1 + 253,4 Reads; Region 2: 1642,1 + 218,9 Reads; Gesamtgenom: 718,0 + 217,6 Reads). Dies deutet darauf hin, dass diese beiden Regionen im Genom dupliziert worden sind. Dieses Muster ist auch im reinen CO-Populationsdatensatz zu erkennen, nicht jedoch im Datensatz mit niedrigem

Synthesegasgehalt. Im Datensatz mit hohem Synthesegasanteil kann nur ein Teil der

den abgeleiteten Klonen die Fähigkeit verleiht, mit 100 % CO zu wachsen.

[0176] Abbildung 4 zeigt die endgültigen optischen Dichten und Acetat-Titer der

adaptierten Populationen, die in dreifacher Ausführung in Serumflaschen gezüchtet wurden.

Es ist ein deutlicher Anstieg der OD bei höherer Energieverfügbarkeit in der Gasphase zu erkennen (gleichfarbige Balken mit Asterisken stehen für t-Tests mit zwei Stichproben und angenommenen ungleichen Varianzen: * steht für p<=0,05 ** steht für p<=1*10-2 *** steht für p<=1*10-3). Danach besteht ein signifikanter Unterschied in den optischen Dichten zwischen allen Gaszusammensetzungen. Dieser Unterschied zeigt sich nicht in den Acetattitern, wo der einzige signifikante Unterschied zwischen Syngas mit niedrigem CO-

Gehalt und H2/CO» festgestellt wurde.

[0177] Kulturen, die mit CO gezüchtet wurden, weisen insgesamt eine höhere Variabilität und signifikant höhere optische Dichten auf als die anderen Gasmischungen. Die endgültige OD600, die auf 100% CO gezüchtet wurde, wurde mit 1,14 + 0,14 bestimmt, was 2,43x höher ist als die endgültige OD600, die in Weghoff et al. (2016) mit 0,47 angegeben wurde. In ähnlicher Weise ist der Acetat-Titer von 5,44 + 1,10 g/L 2,1-fach höher als der

berichtete Acetat-Titer von 2,65 g/L auf 70 % CO (100 % CO ist nicht angegeben).

[0178] Die Zell- und Acetattiter des erworbenen Stammes sind bemerkenswert hoch, und die Wachstumsrate bei Kohlenmonoxid ist ebenfalls signifikant für die acetogene Gasfermentation (Tabelle 4). E. limosum und C. carboxidivorans sind als schnell wachsende Stämme auf CO bekannt (die beide auf komplexem Medium wachsen). C. autoethanogenum, das auch in kontinuierlichen Kulturen am schnellsten wächst, wird in industriellen Anwendungen eingesetzt und hat zahlreiche Generationen adaptiver Evolution

in Bioreaktoren durchlaufen.

Tabelle 4: Vergleich der Wachstumsraten verschiedener Acetogene auf CO oder dessen Derivaten (* =

berechnet anhand der von den Erfindern zur Verfügung gestellten Daten)

Stamm Quelle Karbonquelle | Synthetisches | Kulturbedingungen | Max. Medium Wachstumsrate [h”]

T. kivut CO1 Vorliegen | 100% CO X Bioreaktor, Batch- 0.25 +/- 0.03

de Kultur

Erfindung T. kivut CO1 Vorliegen | Syngas mit X Bioreaktor, Batch- 0.20 +/- 0.03

de hohem CO- Kultur

Erfindung | Gehalt

T. kivul Vorliegen | Syngas mit X Bioreaktor, 0.18 de hohem CO- kontinuierliche Kultur

Erfindung | Gehalt

T. kivui (Weghoff | 100% CO Serum-Flaschen 0.021 and Müller, 2016)

E. limosum (Jin et 66% CO Serum-Flaschen 0.11 al., 2022)*

E. limosum (Kanget | 44% CO Serum-Flaschen 0.089 al., Syngas 2020)°

E. limosum (Pregnon | 200 mM X Serum-Flaschen 0.076 et al., MeOH 2022)*

H. pseudoflava (Grenz et | 40% CO X Serum-Flaschen 0.06 al., Syngas 2019)° C. jungdahlii (Zhu et 80% CO Serum-Flaschen 0.094 +/- 0.008 al., 2020)*® C. (Lanzillo | 100% CO Serum-Flaschen 0.100 + 5.5 x 107*

carboxidivorans | etal.,

2020)” C. (de Lima | 60% CO X Bioreaktor, 0.12 autoethanogenu | et al., kontinuierliche Kultur m 2022)®

Weghoff, M.C., Müller, V., 2016. CO Metabolism in the Thermophilic Acetogen Thermoanaerobacter kivui. Appl.

Environ. Microbiol. 82, 2312-2319

Jin, S., Kang, S., Bae, J., Lee, H., Cho, B.-K., 2022. Development of CO gas conversion system using high CO tolerance

biocatalyst. Chem. Eng. J. 449, 137678

Kang, S., Song, Y., Jin, S., Shin, J., Bae, J., Kim, D.R., Lee, J.-K., Kim, S.C., Cho, S., Cho, B.-K., 2020. Adaptive

Laboratory Evolution of Eubacterium limosum ATCC 8486 on Carbon Monoxide. Front. Microbiol. 11, 402

Pregnon, G., Minton, N.P., Soucaille, P., 2022. Genome Sequence of Eubacterium limosum B2 and Evolution for Growth

on a Mineral Medium with Methanol and CO: as Sole Carbon Sources. Microorganisms 10, 1790

Grenz, S., Baumann, P.T., Rückert, C., Nebel, B.A., Siebert, D., Schwentner, A., Eikmanns, B.J., Hauer, B., Kalinowski, J., Takors, R., Blombach, B., 2019. Exploiting Hydrogenophaga pseudoflava for aerobic syngas-based production of

chemicals. Metab. Eng. 55, 220-230

Zhu, H.-F., Liu, Z.-Y., Zhou, X., Yi, J.-H., Lun, Z.-M., Wang, S.-N., Tang, W.-Z., Li, F.-L., 2020. Energy Conservation and

Carbon Flux Distribution During Fermentation of CO or H2/CO2 by Clostridium ljungdahlii. Front. Microbiol. 11, 416

Lanzillo, F., Ruggiero, G., Raganati, F., Russo, M.E., Marzocchella, A., 2020. Batch Syngas Fermentation by Clostridium

carboxidivorans for Production of Acids and Alcohols

preiswert ist und recycelt werden kann, ist eine kontinuierliche Aufbereitung vorteilhaft.

[0180] Batch-Fermentation

[0181] T. kivui wurde in zwei verschiedenen Batches in doppelter Ausführung gezüchtet. T. kivui wurde sowohl mit 100% CO als auch mit Syngas mit hohem CO-Gehalt (52% CO, 21% CO», 24% Ho) kultiviert, um das hohe Potenzial des Stammes, in CO zu wachsen,

sowie die Fähigkeit, H2 und CO gemeinsam zu verwerten, zu demonstrieren.

[0182] Abbildung 5 zeigt die Acetattiter und optischen Dichten, die während des BatchProzesses bei 100 % CO gemessen wurden. Die Kultur zeigte eine Lag-Phase von etwa 12 Stunden, gefolgt von zwei unterschiedlichen Wachstumsphasen (Abbildung 4 und Tabelle

5). Die in diesem Experiment erreichten Titer sind im Vergleich zur Syngasfermentation

deutlich höher, und es wurde eine OD600 von 4,85 (= 2,03 gCDM L-1) (CDM =

Zelltrockenmasse) und ein Acetattiter von 32,48 g/L beobachtet.

[0183] Bemerkenswert ist auch, dass die Zellen nach 40 Stunden eine Wasser-GasShift-Reaktion katalysierten, bei der kein Wachstum stattfand (Abbildung 6). Die COAufnahme der Zellen ist über den gesamten Versuchszeitraum annähernd konstant. Nach Beendigung des Wachstums und der Acetatproduktion wandelten die Zellen CO katalytisch in H2 und CO» um, wie die negativen Aufnahmeraten (d. h. Produktionsraten) für H2 und CO»

nach 40 Stunden Kultivierung zeigen (Abbildung 5).

Tabelle 5: Parameter der Wachstumsphasen in Batches mit Syngas mit hohem CO-Gehalt und 100% CO

im Vergleich. W Durchschnitt [h'] Wachstumsphase | Periode [h-h] | Syngas (070) Syngas (070) 1 6-13 0.20 0.18 | 0.32 0.21 2 13-19 0.13 0.25 | 0.68 0.46 3 20-38 0.03 0.05 | 0.53 0.69 [0184] Abbildung 7 zeigt das Wachstum und die Acetatproduktion in Syngas mit hohem

CO-Gehalt. Der Spitzenwert der OD600 lag bei 2,89 (= 1,28 gCDM L-1) und der Acetat-Titer bei durchschnittlich 19,9 g/L. Diese Werte entsprechen 63,1 bzw. 61,2 % der Titer, die beim Wachstum mit 100 % CO erreicht werden, was zeigen könnte, dass die erzielten Titer eine

Funktion des Energiegehalts im Gassubstrat sind, und auch zeigt, wie Acetatproduktion und

Wachstum direkt gekoppelt sind.

[0185] Die Aufnahmeraten des Batch-Prozesses (Abbildung 8) mit Synthesegas weisen die gleiche Gasverschiebungsreaktion auf, allerdings nur in einem Reaktor. Der

Mechanismus dahinter und warum nur ein Reaktor zu katalysieren schien, ist unbekannt.

[0186] Kontinuierlicher Prozess

[0187] Da Syngas ein wahrscheinlicheres Szenario für die Produktion von Acetat aus Prozessdämpfen ist, wurde ein kontinuierlicher Prozess mit unterschiedlichen

Produktionsparametern durchgeführt.

[0188] Zwei hochproduktive kontinuierliche Prozesse wurden mit 7. kivur auf Synthesegas stabil etabliert. Einer wurde durchgeführt, um eine bestimmte Wachstumsrate zu erreichen (hohe Verdünnungsrate) und der andere, um den Acetattiter zu maximieren

(hoher Titer). Beide erreichten ungefähr die gleichen Produktivitäten (Tabelle 6).

Tabelle 6: Schlüsselparameter des kontinuierlichen Prozesses mit T. kivul, angepasst an 100% CO.

Hohe Verdünnungsrate Hoher Titer

Input

Verdünnungsrate [1/h] 0.179 0.074

Begasungsrate [vvm] 0.068 0.066 Rührerdrehzahl [rpm] 1200 900 pH 6.4 6.4 Output

CDM [g/L] 0.41 0.51 ODseoo 1.24 1.78 Cacetate [9/L] 5.73 12.94 Facetate [9/L/h] 1.022 0.953 H2 UR [mmol/L/h] 22.1101 0.9782 CO UR [mmo//L/h] 60.4105 59.4268 CO2 UR [mmol//L/h] -2.0783 -5.7367

UR = Aufnahmerate; vvm = Gefäßvolumen pro Minute. Rom = Rührerdrehzahl, Umdrehungen

pro Minute. [0189] DISKUSSION [0190] Die folgenden Ausführungen erörtern relevante Merkmale der Erfindung und

charakterisieren die Erfindung weiter.

[0191] Konditionierung

[0192] Abgrenzung zu Weghoff und Müller (2016):

nutzen.

[0194] Erst nach diesem anfänglichen Konditionierungsschritt wurde der Stamm einem starken Selektionsdruck ausgesetzt, indem er in Gegenwart von CO als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle wuchs (wobei keine anderen Quellen über Hefeextrakt bereitgestellt wurden). Eine schrittweise Erhöhung des CO-Gehalts ermöglichte überraschenderweise eine Anpassung der Zellen an die Verwendung von CO als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle (anstelle von H2/CO», das vom Wildtyp verwendet wird). Bei 60% CO in der Gasphase setzten die Erfinder die Zellen erneut einem starken Selektionsdruck aus, indem sie die CO-Konzentration innerhalb einer Passage auf 100%

erhöhten.

[0195] Die Erfinder nutzten außerdem einen Umweg über Synthesegas, um T. kivui an das

Wachstum auf reinem CO anzupassen.

[0196] Darüber hinaus stellten die Erfinder überraschenderweise fest, dass sie einen ausreichend starken Selektionsdruck ausübten, um die Anpassung zu erzwingen. Zum Beispiel fanden die Erfinder heraus, dass der Transfer von T. kivui, der auf Syngas mit niedrigem CO-Gehalt gewachsen war, auf 30 % reines CO erfolglos war. Die Erfinder hatten nur dann Erfolg mit der Anpassung, wenn sie einen starken Selektionsdruck

ausübten, indem sie nacheinander H2/CO>» auf Syngas mit hohem CO-Gehalt, Syngas mit

7217682

100 % reines CO).

[0197] Signifikanterweise stützten sich die Erfinder auch auf die Verwendung eines chemisch

definierten Mediums ohne Vitamine und Hefeextrakt. [0198] Abgrenzung zu anderen Studien mit Syngas:

[0199] In anderen Studien, die den Erfindern bekannt sind, wurde Syngas allein verwendet, um Acetogene an das Wachstum auf Syngas anzupassen (z. B. C. autoethanogenum, 142

Generationen, Ingelman et al., 2023), E. imosum, 400 Generationen, Jin et al., 2022).

[0200] Der Ansatz, den die Erfinder verfolgten und der überraschenderweise zu den hier besprochenen Ergebnissen führte, bestand darin, zuerst Synthesegas und dann CO zu verwenden. Dies führte nicht nur zu Zellen, die in 100 % CO gut wachsen können, sondern

auch zu höheren spezifischen Wachstumsraten auf Synthesegas.

[0201] Allgemein

[0202] Überraschenderweise wurde eine viel schnellere Anpassung von T. kivui (>31 Generationen) an das Wachstum auf reinem CO und Synthesegas bei höheren Wachstumsraten (Uu= 0,2-0,24 h-1) im Vergleich zu C. autoethanogenum (142 Generationen,

U = 0,12 h-1) und E. limosum (400 Generationen, u = 0,11 h-1) beobachtet.

[0203] Die Erfinder sind der Ansicht, dass die erfindungsgemäße Methode mit UV- oder chemischer Mutagenese (z.B. mittels EMS) kombiniert werden kann, um die

Mutageneserate zu erhöhen. EMS steht für Ethylmethansulfonat, ein chemisches Mutagen,

eingesetzt, um die Gesamtmutationsrate im Genom eines Organismus zu erhöhen.

[0204] Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße Verfahren in kontinuierlichen Gasfermentationen angewandt werden, um überlegene Phänotypen (z. B. Edukt- oder

Produkttoleranz) zu erzielen, wenn ein geeigneter Selektionsdruck ausgeübt wird.

[0205] Die Subkultivierung des mutierten 7. kivui-Stammes auf Glukose über 40 Generationen

führte nicht zu einer Reversion des Phänotyps.

[0206] Die angepassten Stämme erwiesen sich als robust in Bezug auf das CO-Wachstum, d. h. wenn sie erneut Gasen mit niedriger CO-Konzentration und dann wieder Gasen mit hohem CO-Gehalt ausgesetzt wurden, konnten sie immer noch hohe Wachstumsraten

aufweisen, so dass die Anpassungen als langlebig/permanent angesehen wurden.

[0207] In weiteren Experimenten wurde festgestellt, dass das Verfahren und die Stämme robust gegenüber Verunreinigungen sind, wie sie in Synthesegas aus der Biomasse- und

Abfallvergasung vorkommen, z. B. Staub, Teer und schwefelhaltige Verbindungen.

[0208] Es wurde festgestellt, dass das in dieser Spezifikation beschriebene Verfahren mit

Rein- und Mischkulturen in einem Bioreaktor funktioniert, wobei alle Stämme anaerob sind.

[0209] Für das Downstream-Processing können die aus dem Stand der Technik bekannten Methoden angewandt werden, wie z. B. die Zentrifugation zur Gewinnung von Biomasse im

Falle intrazellulärer Produkte. Für extrazelluläre Produkte sind in-situ-Verfahren besonders

vorteilhaft. Verbindungen mit niedrigem Siedepunkt wie Aceton können bei thermophilen Fermentationen verdampft werden. Für die Produktgewinnung bieten sich auch Membranverfahren an, z. B. Elektrodialyse oder Dialyse. Auch die Extraktion mit

Lösungsmitteln, z. B. mit ionischen Flüssigkeiten, kann angewandt werden.

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Claims

ANSPRÜCHE

1. Verfahren zum Konditionieren und somit Mutieren eines Acetogenen für die acetogene Fermentation von CO-Gas ("CO-Behandlungsgas"), um dadurch einen mutierten Acetogenen für die acetogene Fermentation von CO-Gas zu erhalten, wobei das Verfahren das Kultivieren eines nicht mutierten Stammes eines Acetogenen, das für die acetogene Fermentation von CO-Behandlungsgas konditioniert und somit mutiert werden soll in einem Fermentationsmedium ohne Hefeextrakt und Vitamine für mindestens drei aufeinanderfolgende Wachstumszyklen auf CO-Gas ("CO-Behandlungsgas”") als Haupt- oder einziger Kohlenstoffquelle, wobei die CO-Konzentration in dem CO-Behandlungsgas über die drei Wachstumszyklen schrittweise erhöht wird, wodurch ein konditionierter Acetogener für die

acetogene Fermentation von CO-Feedgas erzeugt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, das die sukzessive Kultivierung des Acetogenen mit CO-Behandlungsgas einschließt, dessen CO-Konzentration in den jeweiligen Wachstumszyklen schrittweise erhöht wird, wobei die CO-Konzentration in dem CO-Behandlungsgas schrittweise

von etwa 30 % v/v auf 100 % v/v erhöht wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, das einen vorherigen Schritt der Kultivierung des Acetogenen für mindestens einen Wachstumszyklus mit Synthesegas mit hohem CO-Gehalt

("Syngas") umfasst.

4. Verfahren nach Anspruch 3, das einen vorherigen Schritt der Kultivierung des

Acetogenen für mindestens einen Wachstumszyklus mit einem Wasserstoff (H»)- und

Kohlendioxid (CO»2)-Gas, das im Wesentlichen frei von CO ist, umfasst.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das Folgendes umfasst in einer ersten Wachstumsstufe die Kultivierung des nicht mutierten Stammes des Acetogenen für mindestens einen ersten Wachstumszyklus mit einem Gas aus Wasserstoff (H2) und Kohlendioxid (CO»), das im wesentlichen frei von CO ist;

in einer zweiten Wachstumsstufe Kultivierung des Acetogenen aus der ersten Wachstumsstufe für mindestens einen zweiten Wachstumszyklus mit Synthesegas mit hohem CO-Gehalt ("Syngas”"); und

in einer dritten Wachstumsstufe sukzessives Kultivieren des Acetogenen aus der zweiten Wachstumsstufe mit CO-Behandlungsgas, wobei die CO-Konzentration in dem COBehandlungsgas in mindestens drei Wachstumszyklen schrittweise von etwa 30% v/v auf 100%

v/v erhöht wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die erste Wachstumsstufe mindestens drei aufeinanderfolgende Wachstumszyklen umfasst, wobei nach Abschluss eines jeden

7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die zweite Wachstumsstufe mindestens zwei aufeinander folgende Wachstumszyklen umfasst, wobei nach jedem Wachstumszyklus ein

8. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die dritte Wachstumsstufe das

aufeinanderfolgende Wachstum des Acetogenen aus der zweiten Wachstumsstufe für

mindestens einen Wachstumszyklus auf jedem von fünf CO-Behandlungsgasen mit jeweils

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zunehmender CO-Konzentration umfasst, wobei die CO-Konzentrationen in den jeweiligen CO-

Behandlungsgasen jeweils 30 % v/v, 40 % v/v, 50 % v/v, 60 % v/v und 100 % v/v betragen.

9. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der nicht mutierte Stamm des Acetogenen,

der der Konditionierung unterzogen wird, ein Wildtyp-Stamm des Acetogenen ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Acetogene, der der Konditionierung unterzogen wird, ein thermophiler Acetogener ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der Acetogene, das der

Konditionierung unterzogen wird, der Wildtyp-Stamm von T. kivui (DSM 2030) ist.

12. Isolierter mutierter Stamm eines Acetogenen, hergestellt nach dem Verfahren

eines der Ansprüche 1 bis 11.

13. Isolierter, mutierter Stamm von T. kivui, der für das Wachstum auf Syngas mit hohem CO-Gehalt adaptiert ist, gegebenenfalls hergestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, der, bezogen auf einen Wildtyp von T. kivui (DSM 2030), Folgendes umfasst mindestens eine SNP-Mutation, vorzugsweise alle SNP-Mutationen, ausgewählt aus mindestens cbiQ, Kobalt-ECF-Transporter-T-Komponente an Position 341.995; rp0C, DNA-gesteuerte RNA-Polymerase-Untereinheit beta' an den Positionen 1.969.972 und 1.970.146; und

dapA, 4-Hydroxy-tetrahydrodipicolinat-Synthase an Position 818.980.

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eine Duplikation von 15.507 bp in der Region von 1.917.220 bis 1.932.727.

15. Isolierter, mutierter Stamm von T. kivu[, der an ein Wachstum auf 100 % CO-Gas adaptiert ist, gegebenenfalls hergestellt nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, der zusätzlich zu den SNP-Mutationen gemäß Anspruch 13 im Vergleich zu einem Wildtyp von T. kivui (DSM 2030) mindestens eine SNP-Mutation, vorzugsweise alle SNP-Mutationen, umfasst, die ausgewählt ist aus mindestens

phoU, Phosphat-Signalkomplex-Protein an Position 1.459.688;

hypF, Carbamoyltransferase, an der Position 136.300; und

acsV, Corrinoid-Aktivierungs-/Regenerationsprotein, an Position 1.903.679.

16. Isolierter, mutierter Stamm von T. kivui, adaptiert für das Wachstum auf 100 % CO-Gas, gegebenenfalls hergestellt durch das Verfahren gemäß eines der Ansprüche 1 bis 11, der zusätzlich zu den SNP-Mutationen gemäß den Ansprüchen 13 und 15 im Vergleich zu einem Wildtyp von T. kivui (DSM 2030) Folgendes umfasst

mindestens eine, gegebenenfalls zwei, Duplikationen von mindestens einer der

Regionen zwischen 1.841.579 bis 1.901.680 und 1.910.027 bis 1.935.735.

17. Isolierter, mutierter Stamm von T. kivui! gemäß Anspruch 16, wobei die

Duplikation/en in der Region von 1.841.579 bis 1.901.680 und 1.910.027 bis 1.935.735 eine

Größe/en von 60.101 bp bzw. 25.708 bp oder eine Einzelgröße von 85.809 bp haben.

18. Isolierter Stamm von T. kivui, der an das Wachstum auf 100 % CO-Gas adaptiert ist, gegebenenfalls hergestellt nach dem Verfahren gemäß eines der Ansprüche 1 bis 11, der zusätzlich zu den SNP-Mutationen gemäß den Ansprüchen 13 und 15 und der/den Duplikation/en gemäß den Ansprüchen 16 und 17mindestens eine partielle oder vollständige Deletion, vorzugsweise alle partiellen oder vollständigen Deletionen, umfasst, die zumindest, bezogen auf einen Wildtyp von T. kivui (DSM 2030), ausgewählt sind aus -

N-Acetyltransferase der GNAT-Familie, partielle Deletion von Position 233,431 bis 234,484;

DUF881 domain-containing protein, vollständige Deletion von Position 234,523 bis 235,260; und

hypothetisches Protein, partielle Deletion von Position 235,425 bis 235,869.

19. Verfahren zur acetogenen Fermentation von zu fermentierendem CO-Gas ("COEinspeisungsgas”") zur Herstellung eines Fermentationsprodukts, wobei das Verfahren das Züchten eines mutierten Stammes eines Acetogenen gemäß einem der Ansprüche 13 bis 18 auf CO-Einspeisungsgas als Haupt- oder einzige Kohlenstoffquelle einschließt, wodurch ein

Fermentationsprodukt hergestellt wird.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das CO-Feedgas ein CO-haltiges

Industrieabgas ist.

21. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das CO-Feedgas ein Synthesegas aus

einem Vergasungsprozess ist.

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22. Verfahren nach Anspruch 19, wobei es sich bei dem Fermentationsprodukt um

Essigsäure oder einen ein- oder zweiwertigen Alkohol oder eine Säure handelt.

23. Verfahren nach Anspruch 19, wobei es sich bei dem Fermentationsprodukt um Milchsäure handelt.

24. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Fermentation in einem Reaktor durchgeführt wird, der ausgewählt wird aus einem Rührtankreaktor, einem

Lufthebeblasensäulenreaktor oder einem Schlaufenfermentationsreaktor.

25. Verfahren nach Anspruch 26, wobei die Fermentation kontinuierlich durchgeführt wird und die kontinuierliche Einspeisung von frischem CO-Einspeisungsgas in den Reaktor umfasst, während kontinuierlich fermentationsproduktreiches Fermentationsmedium aus dem Reaktor abgezogen wird und Fermentationsprodukt aus dem fermentationsproduktreichen Fermentationsmedium aufgefangen wird, um aufgefangenes Fermentationsprodukt und fermentationsproduktarmes oder freies Fermentationsmedium herzustellen, das dann

kontinuierlich in den Reaktor zurückgeführt wird.

26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Auffangung des Fermentationsprodukts aus fermentationsproduktreichem Fermentationsmedium zur Herstellung von fermentationsproduktarmem oder freiem Fermentationsmedium unter Verwendung eines Membranverfahrens, eines Verdampfungsverfahrens oder eines

Lösungsmittelextraktionsverfahrens durchgeführt wird.

27. Verfahren nach Anspruch 19, wobei durch die Fermentation des CO-Feedgases im Wesentlichen das gesamte CO aus dem CO-Feedgas entfernt wird, indem im Wesentlichen

der gesamte CO-Gehalt des CO-Feedgases metabolisiert wird.

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