AT528175A2 - Methanothermobacter strain and method using the same - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung stellt einen Stamm von Methanothermobacter bereit, der eine Prolinproduktionsrate aufweist, die niedriger als die Prolinproduktionsrate von Methanothermobacter marburgensis DSM 2133 ist, und/oder eine Glycinproduktionsrate aufweist, die höher als die Glycinproduktionsrate von Methanothermobacter marburgensis DSM 2133 ist. Der Stamm weist bevorzugt eine Argininosuccinatlyase (ASL) auf, wobei es sich bei dem Aminosäurerest 51 um Leucin, Isoleucin, Valin oder Alanin handelt. Insbesondere ist der Stamm Methanothermobacter marburgensis bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) unter der Hinterlegungsnummer DSM 34858 hinterlegt. Verfahren und Verwendung von Zellen des Stammes zur industriellen Herstellung von Aminosäuren, insbesondere Glycin.

Description

Das Gebiet der vorliegenden Erfindung betrifft Stämme der Archaea-Gattung Methanothermobacter und deren biotechnologische

Verwendungen. HINTERGRUND

Methanogene Archaeen sind für die Fähigkeit bekannt, Methan (CH) als Endprodukt ihres Energiestoffwechsels zu erzeugen (siehe z. B. Mand & Metcalf, 2019). Einige von ihnen sind in der Lage, autotroph, hydrogenotroph zu wachsen, indem sie Kohlendioxid (CO,) mit molekularem Wasserstoff (H,) zu CH, reduzieren, und spielen eine entscheidende Rolle im globalen Kohlenstoffkreislauf (Lyu et al. 2018). Entsprechend ihrem Substratnutzungsspektrum können Methanogene in verschiedene Stoffwechselgruppen eingeteilt werden: hydrogenotroph (H,, Formiat oder einfache Alkohole), acetoklastisch (Acetat), methylotroph (Verbindungen, die eine Methylgruppe enthalten), H;abhängige methylotroph (methylierte Verbindungen mit H, als Elektronendonor) und methoxydotroph (methoxylierte aromatische Verbindungen) (Mayumi et al. 2016, Kurth et al. 2020). Die Biologie der methanogenen Archaeen wird auch in älteren Publikationen wie Zeikus, 1977 diskutiert. Eine standardisierte

Taxonomie der Archaea ist in Rinke et al, 2021 offenbart.

Rittmann et al, 2021, betrifft generell den Einsatz von

Archaeen in der Biotechnologie.

Mehrere Studien diskutieren den Einsatz von methanogenen Archaeen in der erneuerbaren Energieerzeugung durch Reduktion von CO, mit H, zu CH, (Pappenreiter et al. 2019, Rittmann et al. 2018, Mauerhofer et al. 2018, Abdel Azim et al. 2018, Abdel Azim et al. 2017, Rittmann 2015, Mauerhofer et al. 2021, Rittmann et al, 2012, Martin et al., 2013). Liu et al., 2021, befassen sich mit den Auswirkungen verschiedener Aminosäuren und ihrer Konfigurationen auf die Methanausbeute und die Biotransformation von Zwischenmetaboliten während der anaeroben Verdauung. WO 2012/110256 Al offenbart ein Verfahren zur Umwandlung von Kohlendioxid und Wasserstoff zu Methan durch methanogene Mikroorganismen. WO 2014/128300 Al betrifft ein Verfahren und

System zur Herstellung von Methan unter Verwendung von

Stickstoffkonzentrationen in der flüssigen Phase.

WO 2017/070726 Al betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Kulturstatus von Mikrobenkulturen, wie beispielsweise Kulturen

mit hydrogenotrophen methanogenen Mikroorganismen.

Hoffarth et al, 2019, betrifft die Wirkung von N, auf die biologische Methanisierung in einem kontinuierlichen

Rührkesselreaktor mit Methanothermobacter marburgensis.

US 2011/281333 Al bezieht sich auf die Methanproduktion aus einzelligen Organismen, wie Methanogenen. Das Wachstum von Methanogenen umfasst den Verbrauch von Kohlendioxid, um Methan zu produzieren. Verfahren zur Steigerung des Wachstums werden offenbart.

US 2018/0179559 Al betrifft ein biologisches und chemisches Verfahren, bei dem chemoautotrophe Mikroorganismen zur chemosynthetischen Fixierung von Kohlendioxid und/oder anderen anorganischen Kohlenstoffquellen in organischen Verbindungen und zur Erzeugung zusätzlicher nützlicher Produkte verwendet werden. Die Mikroorganismen können aus vielen verschiedenen Bakterien-

und Archaeenspezies ausgewählt werden.

Die EP 2 192 170 Al betrifft einen aminosäureproduzierenden Mikroorganismus und ein Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren. Offenbart ist ein Mikroorganismus (bevorzugt ausgewählt aus Gamma-Proteobakterien, coryneformen Bakterien oder Bakterien, die zu den Gattungen Alicyclobacillus, Bacillus oder des Hefepilzes Saccharomyces gehören), der die Fähigkeit hat, eine L-Aminosäure zu produzieren, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus L-Lysin, L-Threonin, L-Tryptophan, LPhenylalanin, L-Valin, L-Leucin, L-Isoleucin und L-Serin besteht, und der so modifiziert wurde, dass die Aktivität von

Pyruvatsynthase oder Pyruvat:NADP'-Oxidoreduktase erhöht wird. WO 2016/179545 Al und US 2018/0163240 Al offenbaren

Zusammensetzungen und Verfahren zur biologischen Produktion von

Methionin.

US 2019/0194630 Al und US 2017/0130211 Al betreffen Zusammensetzungen und Verfahren zur biologischen Produktion von

Aminosäuren in hydrogenotrophen Mikroorganismen. Insbesondere

Methanosarcina ausgewählt sein.

Die WO 2020/252335 Al betrifft Verfahren und Anlagen zur fermentativen Herstellung von Produkten. Insbesondere wird ein Verfahren offenbart, das Folgendes umfasst: (a) Zuführen eines gasförmigen Gemisches, das CO, und H, umfasst, wobei x 1 oder 2 ist, einer Stickstoffquelle und gegebenenfalls einer Schwefelquelle zu einem Bioreaktor, der hydrogenotrophe Mikroorganismen enthält, unter solchen Bedingungen, dass die hydrogenotrophen Mikroorganismen mindestens ein Fermentationsprodukt erzeugen, das aus einer Aminosäure, einem Alkohol, Aldehyd oder Keton, einer Carbonsäure oder einer Hydroxyl- oder Ketosäure ausgewählt ist; (b) Entfernen eines Gasstroms aus dem Bioreaktor, wobei der Gasstrom mindestens eine Verbindung aufweist, die aus einer schwefelhaltigen Verbindung, einer stickstoffhaltigen Verbindung, H,, CO, und einer Kohlenwasserstoffverbindung ausgewählt ist, wobei x 1 oder 2 ist; (c) Entfernen eines flüssigen Stroms aus dem Bioreaktor, der Fermentationsbrühe, hydrogenotrophe Mikroorganismen und Fermentationsprodukt umfasst; und (d) Abtrennen der hydrogenotrophen Mikroorganismen aus dem flüssigen Strom und Rückführen der hydrogenotrophen Mikroorganismen in den Bioreaktor. Die hydrogenotrophen Mikroorganismen können aus

methanogenen Archaeen ausgewählt werden.

WO 2023/247740 Al, WO 2023/247741 Al und WO 2023/247742 AL betreffen Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren mit methanogenen Mikroorganismen in einem Bioreaktor. Grob gesagt offenbaren die Dokumente ein Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren durch Fermentation in einem Bioreaktor, wobei der Bioreaktor methanogene Mikroorganismen in einer Fermentationsbrühe umfasst, wobei das Verfahren mindestens den Schritt des Zuführens einer gasförmigen Kohlenstoffquelle, die Kohlendioxid und/oder Kohlenmonoxid umfasst, einer Stickstoffquelle, die Stickstoffgas umfasst, und bevorzugt einer Schwefelquelle in den Bioreaktor unter solchen Bedingungen umfasst, dass die methanogenen Mikroorganismen die Aminosäuren produzieren. Bevorzugte methanogene Mikroorganismen sind z.B. Archaeen ausgewählt aus Methanothermobacter, Methanothermococcus

und Methanococcus.

Die WO 2023/247743 Al betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Norvalin. Insbesondere offenbart das Dokument ein Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren durch Fermentation in einem Bioreaktor, wobei der Bioreaktor methanogene Mikroorganismen in einer Fermentationsbrühe umfasst, wobei das Verfahren mindestens den Schritt des Zuführens einer gasförmigen Kohlenstoffquelle, die Kohlendioxid und/oder Kohlenmonoxid umfasst, einer Stickstoffquelle und bevorzugt einer Schwefelquelle zu dem Bioreaktor unter solchen Bedingungen umfasst, dass die methanogenen Mikroorganismen die Aminosäuren

produzieren, wobei die Aminosäuren Norvalin umfassen.

Taubner et al, 2023, stellen eine Lipidomik und vergleichende Metabolitenausscheidungsanalyse von methanogenen Archaeen bereit. Das Dokument präsentiert das Lipidom und eine umfassende quantitative Analyse der proteinogenen Aminosäureausscheidung sowie der Methan-, Wasser- und Biomasseproduktion der drei autotrophen, hydrogenotrophen Methanogene: Methanothermobacter marburgensis, Methanothermococcus okinawensis und Methanocaldococcus Villosus bei unterschiedlichen Temperaturen und Nährstoffversorgungen. Die Muster und Produktionsraten der ausgeschiedenen Aminosäuren und des Lipidoms sind für jedes getestete Methanogen einzigartig und können durch Variation der Inkubationstemperatur bzw. Substratkonzentration moduliert werden. Dem Dokument zufolge wird die Fähigkeit, Aminosäureproduktionsprozesse unter Verwendung eines kostengünstigen Substrats (H,/CO,) zu skalieren, die Verwendung von Methanogenen der industriellen

Kommerzialisierung näher bringen.

Folglich besteht ein Bedarf an Methanogenen, die besser an die Produktionsbedingungen im industriellen Maßstab, insbesondere für die Aminosäureproduktion, und die spezifischen

Bedürfnisse solcher Umgebungen angepasst sind.

Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, solche Methanogenstämme und biotechnologische Verfahren zu ihrer Verwendung, insbesondere zur Herstellung von Aminosäuren, bereitzustellen. Diese Verfahren sollten in hohem Maße für die industrielle Aminoproduktion geeignet sein und/oder einen oder mehrere Nachteile von im Stand der Technik bekannten

Methanogenstämmen überwinden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Stamm von Methanothermobacter mit einer Prolinproduktionsrate, die niedriger ist als die Prolinproduktionsrate von Methanothermobacter marburgensis, hinterlegt bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) unter der Hinterlegungsnummer DSM 2133 (Methanothermobacter marburgensis DSM 2133), und/oder mit einer Glycinproduktionsrate, die höher ist als die Glycinproduktionsrate von Methanothermobacter marburgensis DSM 2133 (wenn beide Stämme unter den vergleichbaren Bedingungen, bevorzugt unter den gleichen Bedingungen, kultiviert werden). Die Produktionsrate kann auf einer molaren Basis oder einer Gewichtsbasis berechnet werden. Bevorzugt wird die

Produktionsrate auf Gewichtsbasis (z. B. mg L”* h”) berechnet.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Stamm von Methanothermobacter mit einem Prolinanteil an den insgesamt sekretierten Aminosäuren, der niedriger ist als der Prolinanteil an den insgesamt sekretierten Aminosäuren von Methanothermobacter marburgensis DSM 2133, und/oder einem Glycinanteil an den insgesamt sekretierten Aminosäuren, der höher ist als der Glycinanteil an den insgesamt sekretierten Aminosäuren von Methanothermobacter marburgensis DSM 2133 (wenn beide Stämme unter den vergleichbaren Bedingungen, bevorzugt unter den gleichen Bedingungen, kultiviert werden). Der Anteil kann auf molarer Basis oder auf Gewichtsbasis berechnet werden.

Bevorzugt wird der Anteil auf Gewichtsbasis berechnet.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Stamm von Methanothermobacter, der eine Argininosuccinatlyase (ASL) aufweist, wobei es sich bei dem Aminosäurerest 51 um Leucin, Isoleucin, Valin oder Alanin, insbesondere Leucin oder

Isoleucin, handelt.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Stamm von Methanothermobacter marburgensis, der am 21. November 2023 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) unter der Hinterlegungsnummer DSM 34858 hinterlegt wurde (hierin auch als Methanothermobacter

marburgensis Arkeon bezeichnet).

einen Bioreaktor, der die Fermentationsbrühe umfasst.

In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung solcher Stämme zur Herstellung von Aminosäuren (bevorzugt Glycin), insbesondere einer (einzigen) Aminosäure, bevorzugt einer (einzigen) kanonischen Aminosäure wie Glycin, in einer Reinheit von mehr als 50 Gew.-% (Gew.-%), bevorzugt mehr als 60 Gew.-%, weiter bevorzugt mehr als 70 Gew.-%, noch weiter

bevorzugt mehr als 80 Gew.-%, insbesondere mehr als 90 Gew.-%.

In noch einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren in einem Bioreaktor. Der Bioreaktor enthält Zellen des erfindungsgemäßen Stammes in einer Fermentationsbrühe. Dieses Verfahren umfasst mindestens die Schritte des Zuführens einer gasförmigen Kohlenstoffquelle, die Kohlendioxid und/oder Kohlenmonoxid umfasst, einer Stickstoffquelle und bevorzugt einer Schwefelquelle zu dem Bioreaktor unter solchen Bedingungen, dass die methanogenen Mikroorganismen die Aminosäuren produzieren; und Ernten mindestens eines Teils der Aminosäuren aus der Fermentationsbrühe. Dieser Teil kann nur eine einzige Aminosäure oder mehrere Aminosäuren (wie Glycin) umfassen. In Ausführungsformen kann die Aminosäure in einer Reinheit von mehr als 50 Gew.-%, bevorzugt mehr als 60 Gew.-%, bevorzugter mehr als 70 Gew.-%, noch bevorzugter mehr als 80

Q

Gew.-%, insbesondere mehr als 90 Gew.-% vorliegen.

Die Erfinder fanden heraus, dass ein Stamm von Methanothermobacter mit einer Prolinproduktionsrate, die niedriger ist als die Prolinproduktionsrate von Methanothermobacter marburgensis DSM 2133 und/oder mit einer Glycinproduktionsrate, die höher ist als die Glycinproduktionsrate von Methanothermobacter marburgensis DSM 2133, für die industrielle Aminosäureproduktion gut geeignet ist. Insbesondere aufgrund der niedrigeren Prolinproduktionsrate (siehe Fig. 1) ist es möglich, die Produktion anderer Aminosäuren in höherer Reinheit zu erreichen. Der Stamm bildet auch eine ausgezeichnete Grundlage, um die Aminosäureproduktion weiter zu verschieben, um die Produktion einer einzelnen

Aminosäure (wie Glycin) bei höheren Reinheiten zu erreichen, z.

Glycin beobachtet (siehe Fig. 4). DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die nachstehende detaillierte Beschreibung bezieht sich auf alle oben genannten Aspekte der Erfindung, sofern sie nicht

ausdrücklich ausgeschlossen werden.

Aminosäuren werden in einer Vielzahl von Bereichen eingesetzt: Lebens- und Futtermittel, Landwirtschaft, Arzneimittel und sogar Verpackungen und Gehäuse. Die Biosynthese proteinogener Aminosäuren ist ein wichtiger Zweig der Biotechnologie (Becker und Wittmann 2012). Das metabolische Potenzial von Archaeen hinsichtlich der Aminosäureproduktion

wurde Jedoch bisher stark übersehen (Pfeifer et al. 2021).

Das Enzym ASL (EC 4.3.2.1) katalysiert den Abbau von Argininosuccinat in Fumarat und Arginin. Es ist bei allen Spezies an der Biosynthese von Arginin beteiligt. In Archaeen und Bakterien wird es vom argH-Gen kodiert. Es wurde eine funktionelle Konservierung zwischen archäaler ASL und den entsprechenden bakteriellen und eukaryalen Genen beobachtet (Cohen-Kupiec, et al, 1999).

Mehrere ASL-Sequenzen von Methanothermobacter wurden in öffentlichen Sequenzdatenbanken hinterlegt, darunter in UniProt mit den folgenden Identifikatoren 026369.1 (Methanothermobacter thermautotrophicus) und D9PVR6.1 ( Methanothermobacter

marburgensis).

Untypischerweise ist der ASL-Rest mit der Position 51 (Methanothermobacter-Konsensussequenz: .„.MLA*XEXII°X°*... (SEQ ID NO: 4); wobei jede hochgestellte Zahl die Position in der

Serin, Aspartat oder Asparagin handeln kann.

Auffallend ist, dass die Argininproduktion metabolisch eng mit der Prolinproduktion verbunden ist. Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, wird die Hypothese aufgestellt, dass diese ungewöhnliche Aminosäuresubstitution in ASL zumindest teilweise die strukturelle Grundlage für den anderen Phänotyp des erfindungsgemäßen Stamms im Vergleich zu Methanothermobacter marburgensis DSM 2133 (d. h. die niedrigere Prolinproduktionsrate, die den erfinderischen Schritt zu einem günstigeren Ausgangspunkt für die Verschiebung der Aminosäureproduktion in Richtung anderer Aminosäuren bei höheren Reinheiten macht) bildet.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Aminosäurerest an Position 51 der ASL um Leucin oder

Isoleucin, insbesondere Leucin.

Der erfindungsgemäße Stamm DSM 34858 erwies sich als am engsten verwandt mit Methanothermobacter marburgensis Marburg (DSMZ-Hinterlegungsscode 2133). Abgesehen von Methanothermobacter marburgensis ist diese Aminosäuresubstitution an Position 51 der ASL jedoch auch in anderen Methanothermobacter-Hintergründen nützlich. Dementsprechend ist in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Stamm von Methanothermobacter defluvii, Methanothermobacter wolfeii, Methanothermobacter thermautotrophicus, Methanothermobacter crinale, Methanothermobacter thermoflexus, Methanothermobacter thermophilus, Methanothermobacter sp. CaT2 (siehe z.B. Kosaka et al, 2013), Methanothermobacter sp. DP (siehe z.B. Prabhaharan, et al, 2023), Methanothermobacter sp. KEPCO-1 (siehe z.B. Jeon, et al, 2020), Methanothermobacter sp. THM-1 (siehe z.B. Jeon, et

al, 2021 ) oder Methanothermobacter tenebrarum.

Die ASL-Protein- und argH-Gensequenz, die im Stamm DSM 34858 gefunden wurden, waren die folgenden: > SEQ ID NO: 1

MNLRAGRLKRGMEDEAAEFTSSLTFDHHIFEADVDCNIAHTTMLAHEGIILEEVADKIIEALETLREEGVEALDMDP SVEDIHMAVENYVTARIGEEAGFMHTGKSRNDQVATDLRLALREKIKLISHELLDFIDRIAEMALEHTGTVMVGYTH LQHAQPTTLAHHLMAYAHSLKRDYERLQDTLKRIDINPLGSAAMTTTTFPINRELTTELLGFSDYMRNSMDAVSARD FIAEAIFDLSVLAVNLSRISEEMILWSTYEFGMIEIPDEFSSTSSIMPOKKNPDVAEIARAKTSTVQGALFSVLGIM KALPYTYNRDLQEITPHLWRATDTALSMIRVVRGMLLGIRVNRDRALELAGANFATATDLADILVRERGIPFRVAHR IVGRLVTRAIADGLGPSDIDSEYLDEVSLEVTGKRLELDQELVRRALDPLENVRMRMVPGGPAPEMVRAAIDDIRAF VESERTT

> SEQ ID NO: 2

TTGAACCTGAGGGETGGCAGATTAAAGAGGGGTATGGAGGATGAGGCAGEGGAGT TTACETCATECETCACATTCGA CCACCACATATTCGAGGEGGATGTTGACTGTAACATTGCACACACAACGATGETGGECCATGAGGGTATAATACTGG AGGAAGTGGCAGATAAGATCATAGAAGCECETTGAAACCCTCAGGGAGGAGGGTGTCGAGGECETTGACATGGACCCG TCGGTGGAGGATATCCACATGGETGTTGAGAACTACGTGACAGECAGGATAGGTGAGGAAGECGGGTTCATGCACAC AGGTAAATCCAGGAACGACCAGGTTGCAACTGACETTEGECETGGECETGAGGGAGAAGATAAAATTAATCAGECACG AACTCCTTGATTTTATTGATAGGATAGETGAAATGGCACTTGAGCACACAGGGACTGTCATGGTTGGETACACCECAC CTCCAGCATGECCAGECAACAACCETTGECECACFCACETCATGGECTATGECCACETECCTGAAAAGGGACTATGAGAG GETCECAGGACACCCTGAAGAGGATTGACATCAACCCGETGGGTTECGEGGECATGACAACCACAACATTECCGATAA ACAGGGAACTCACAACGGAACTTECTGGGTTTETETGATTACATGAGGAACTCCATGGACGEGGTGAGTGEAAGGGAC TTCATAGCAGAGGCAATATTTGACCETCETCAGTGETGGEGGTGAACETCAGCAGGATECTCAGAGGAGATGATACTCTG GAGCACCTACGAGTTTGGCATGATAGAGATCCCTGATGAATTETCATCAACATCATCGATAATGECCCAGAAGAAGA ACCCETGACGTTGECGAGATAGECAGGGEAAAGACETECCACGGTTCAGGGGGEAETETTETETGTACTTGGAATCATG AAGGECEETEEECTACACCETACAACAGGGACEETECCAGGAGATCACACECCACETETGGAGGGECACCGACAETGEALET GTCAATGATCCGTGTCGTGAGGGGGATGETECTGGGEAT CAGGGT TAACCGGGACAGGGCACT TGAACTTGCAGGGG CCAACTTTGCAACCGCAACAGACETTGEAGATATECTTGTCAGGGAGEGEGGEATACECETTCAGGGTGGECCACAGA ATAGTTGGAAGGCETGGTCACAAGGGECATTGECGATGGAETEGGGEEETETGACATAGAT TCAGAGTACCETTGATGA GGTGAGECTEGAGGTCACCGGGAAGAGACTTGAACTTGACCAGGAACTTGTGAGGAGGGEEETTGATECCACTTGAGA ATGTCAGGATGAGGATGGTTCCAGGTGGACCGGCEACETGAGATGGTCAGGGEGGECATTGATGATATCAGGGEETTT GTGGAGTCTGAGAGGACAACCTAA

Dementsprechend weist der Stamm in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform eine (funktionelle oder aktive) ASL

auf, die eine Sequenz mit mindestens 80 %, bevorzugt mindestens

85 %, bevorzugter mindestens 90 %, noch bevorzugter mindestens 95 % oder sogar mindestens 97,5 %, noch bevorzugter mindestens

Q

98 % oder sogar mindestens 99 % Identität, insbesondere mindestens 99,5 % oder sogar mindestens 99,75 % Identität zu der gesamten durch SEQ ID NO: 1 identifizierten Sequenz umfasst, mit der Maßgabe, dass es sich bei dem Aminosäurerest 51 um Leucin,

Isoleucin, Valin oder Alanin handelt.

Alternativ oder zusätzlich dazu weist der Stamm bevorzugt ein ASL (oder argH) -Gen auf, das eine Sequenz mit mindestens 70 %, bevorzugt mindestens 75 %, bevorzugter mindestens 80 %, noch

Q

bevorzugter mindestens 85 % oder sogar mindestens 90 %, noch

Q Q

bevorzugter mindestens 95 % oder sogar mindestens 97,5 %

Q

Identität, insbesondere mindestens 99 % oder sogar mindestens 99,5 % Identität zu der gesamten durch SEOQ ID NO: 2 identifizierten Sequenz umfasst, mit der Maßgabe, dass das ASLGen für eine ASL mit dem Aminosäurerest 51 Leucin, Isoleucin,

Valin oder Alanin kodiert.

Noch bevorzugter ist ein Stamm mit einer ASL, die die durch SEO ID NO: 1 identifizierte Sequenz umfasst oder aufweist (bevorzugt bestehend aus der durch SEO ID NO: 1 identifizierten

Sequenz).

Gemäß einem weiteren Vorzug weist der Stamm ein ASL-Gen (auf einem Chromosom oder einem Plasmid) auf, das die durch SEQ ID NO: 2 identifizierte Sequenz umfasst oder aufweist (bevorzugt

bestehend aus der durch SEQ ID NO: 2 identifizierten Sequenz).

Es wurde festgestellt, dass der Stamm DSM 34858 die folgende 165-RNA aufweist: > SEQ ID NO: 3

GTTTGATCCTGGEGGAGGETACTGETATTGGGGT TEGAT TAAGECATGCAAGTCGAACGAACETTGTGTTEGTGGEG AACGGCETCAGTAACACGTGGATAACCETGECETTGGGACTGGGATAACCCCGGGAAACTGGGGATAAACCETGGATAGG TGATGCEGGECTGGAATGGTGETTCACCGAAACACCECTTEGGGGTGECCAAGGATGGGTETGEGGECGAT TAGGTAGT TGGTAGGGTAACGGECTACCAAGECCATCATCGGTACGGGTTGTGAGAGCAAGAGECCGGAGATGGAACCETGAGACA AGGTTCCAGGECCETACGGGGEGEAGEAGGEGEGAAACETECGEAATGEACGEAAGTGEGACGGGGGAACCCECCAAGTG CCACTCETTAACGGGGTGGETTTTCAGAAGTGTAAAAAGETTETGGAATAAGGGETGGGEAAGAECGGTGECAGECGE CGCEGGTAACACCGGCEAGETCAAGTGGTAGECGETTTTATTGGGECTAAAGEGTECGTAGECGGTETGATAAGTETET GGTGAAATCCCGCAGETTAACTGTGGGAATTGETGGAGATACTATCATGACTCGAGGTCGGGAGAGGETGGAGGTAC TCCCAGGGTAGGGGTGAAATCECTGTAATECTGGGAGGACCACETGTGGEGAAGGEGTECAGETGGAACGAACETGAC

GGTGAGGGACGAAAGCCAGGGGEGEGAACCGGAT TAGATACCCGGGTAGTECTGGECGTAAACGATGTGGACTTGGT GTTGGGATGGETTEGAGETGECECAGTGECGAAGGGAAGETGT TAAGTECACCGECTGGGAAGTACGGEEGEAAGEC TGAAACTTAAAGGAATTGGCGGGGGAGCACCACAACGEGTGGAGECTGEGGTTTAATTGGATTCAACGECGGACATC TCACCAGGGGEGACAGCAGTATGATGGECAGGTTGATGACETTGECTGACGAGETGAGAGGAGGTGCATGEECGECG TCAGCETCEGTACCGTGAGGEGTECTGTTAAGTCAGGEAACGAGEGAGACCCACGEEETTAGTTACCAGEGGGAECETT TGGGGTTGECGGGEACACTAAGGGGACCGECAGTGATAAACTGGAGGAAGGAGTGGACGACGGTAGGTECGTATGEC CCGAATECCCTGGGEAACACGEGGGEETACAATGGEECTGGACAATGGGT TECGACACTGAAAGGTGGAGGTAATECEC TAAACCAGGTCGTAGTTCGGATCGAGGGETGTAACTEGECETEGTGAAGETGGAATGEGTAGTAATCGEGTGTCATT ATCGECGEGGTGAATACGTEEETGETEETTGEACACACCGEEEGTCACGECACCCAAAAAGGGET TGGATGAGGECAC AGTATTTTGCTGTGGTECGAATECTGGGTTETTTGAGGAGGGEGAAGTCGTAACAAGGTAGECGTAGGGGAACCETGEGG CTGGATCACCETECTT

Daher weist die 165 ribosomale RNA des erfindungsgemäßen Stamms in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform die durch SEO ID NO: 3 identifizierte Sequenz auf.

Der erfindungsgemäße Stamm (insbesondere der als DSM 34858 hinterlegte Stamm) kann unter Bedingungen kultiviert werden, wie sie im Stand der Technik bekannt sind (siehe z. B. Taubner et

al, 2023) oder wie im Beispielabschnitt offenbart.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Verfahren ein kontinuierlicher Prozess mit oder ohne Zellretention, ein FedBatch-Prozess, ein Batch-Prozess, ein Closed-Batch-Prozess, ein Repetitive-Batch-Prozess, ein Repetitive-Fed-Batch-Prozess oder ein Repetitive-Closed-Batch-Prozess, bevorzugt ein kontinuierlicher Prozess, ein Fed-Batch-Prozess oder ein Repetitive-Fed-Batch-Prozess, insbesondere ein kontinuierlicher Prozess. Besonders bevorzugt ist, dass der kontinuierliche Prozess (Kultur) ein Chemostatprozess (Kultur) ist, insbesondere

mit kontrolliertem pH-Wert (mit oder ohne Zellretention).

Insbesondere für kontinuierliche Kultur kann der Schritt des Erntens das Entfernen eines flüssigen Stroms aus dem Bioreaktor, wobei der flüssige Strom Fermentationsbrühe, methanogene Mikroorganismen (d. h. Zellen des Stamms) und produzierte Aminosäuren (z. B. im Überstand der Fermentationsbrühe) umfasst, das Abtrennen der methanogenen Mikroorganismen aus dem flüssigen Strom (z. B. durch Filtration) und das Rückführen der

methanogenen Mikroorganismen in den Bioreaktor beinhalten. Die

geernteten Aminosäuren (die in einer flüssigen Fraktion der Fermentationsbrühe vorhanden sein können) werden dann bevorzugt weiter gereinigt, z. B. durch im Stand der Technik bekannte

Verfahren wie Chromatographie.

Der erfindungsgemäße Stamm erwies sich während der Kultivierung als relativ robust. Es ist daher sehr bevorzugt, dass mindestens 50 %, bevorzugt mindestens 60 %, weiter bevorzugt mindestens 70 %, noch weiter bevorzugt mindestens 80 %, insbesondere mindestens 90 % oder sogar mindestens 95 % der methanogenen Mikroorganismen (d. h. Zellen des erfindungsgemäßen Stamms) vor und während der Ernte lebensfähig und/oder intakt bleiben. Dies gilt insbesondere für die methanogenen Mikroorganismen, die in einem aus dem Bioreaktor entnommenen Flüssigkeitsstrom vorhanden sind (z. B. in kontinuierlicher Kultur). Die methanogenen Mikroorganismen können dann wieder in

den Bioreaktor zurückgeführt werden.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beträgt die Gesamtaminosäurekonzentration im Überstand der Fermentationsbrühe (eingesetzt im Ernteschritt) mindestens 1 umol/L, bevorzugt mindestens 5 umol/L, weiter bevorzugt mindestens 10 umol/L oder sogar mindestens 25 umol/L, noch weiter bevorzugt mindestens 50 umol/L oder sogar mindestens 100 umol/L, insbesondere mindestens 150 umol/L. Besonders bevorzugt ist es, wenn der Überstand eine Gesamtaminosäurekonzentration von mindestens 200 umol/L, bevorzugt mindestens 500 umol/L, insbesondere mindestens 1000 umol/L (oder noch höhere

Untergrenzen) aufweist.

Die biologische Fixierung von molekularem Stickstoff (N,) ist ein Schlüsselprozess im globalen Stickstoffkreislauf, wo sie eng mit dem Kohlenstoffkreislauf verbunden ist. Mit 16 Mol ATP pro Mol N, fix ist es einer der teuersten Stoffwechselprozesse (Thamdrup 2012; Hu und Ribbe 2012). Bestimmte Stämme von Archaeen, aber auch Bakterien, sind in der Lage, N, zu fixieren (Fernandez et al. 2019). Dieser biologische Prozess wird als Diazotrophie bezeichnet. Diazotrophes Wachstum wurde erstmalig 1984 bei Archaeen berichtet, als gezeigt wurde, dass Methanosarcina barkeri (Murray und Zinder 1984) und Methanococcus thermolithotrophicus (Belay et al. 1984) in der

Lage waren, N, zu fixieren. Die für die Reduktion von N,

benötigten Enzyme sind Nitrogenasen, die im nif-Gencluster

kodiert werden (Raymond et al. 2004).

Jones & Stadtman, 1977, befasst sich mit den Auswirkungen von Selen und Wolfram auf das Wachstum von Methanococcus vannielii. Das Dokument lehrt, dass das Wachstum des Mikroorganismus auf Formiat durch Selen und Wolfram deutlich stimuliert wird. In ähnlicher Weise beziehen sich Dridi et al., 2012, auf das wolframverstärkte Wachstum von Methanosphaera stadtmanae. Ferner betrifft Lobo & Zinder, 1988, Diazotrophie und Nitrogenase-Aktivität im Archaeon Methanosarcina barkeri 227.

Der erfindungsgemäße Stamm erwies sich als in der Lage, Aminosäuren unter stickstofffixierenden Bedingungen zu produzieren. Insbesondere kann die Stickstoffquelle Stickstoffgas umfassen. (Alternativ oder zusätzlich kann die Stickstoffquelle bevorzugt Ammoniakgas, Ammonium- und/oder

Stickstoffgas umfassen).

Wenn die Stickstoffquelle Stickstoffgas umfasst, hat sich ein bestimmter Ammoniumkonzentrationsbereich als besonders vorteilhaft für die Energieerzeugung erwiesen (unter N,fixierenden Bedingungen). So ist es bevorzugt, dass die Ammoniumkonzentration in der Fermentationsbrühe 0,1 mmol/L bis 200 mmol/L, bevorzugt 2 mmol/L bis 100 mmol/L, bevorzugter 4 mmol/L bis 40 mmol/L, noch bevorzugter 5 mmol/L bis 35 mmol/L, noch bevorzugter 6 mmol/L bis 30 mmol/L, insbesondere 7 mmol/L bis 25 mmol/L, oder sogar 10 mmol/L bis 20 mmol/L beträgt. Für den Fachmann ist ersichtlich, dass insbesondere bei kontinuierlicher Kultur die Konzentration in der Brühe Schwankungen unterliegen kann (bis ein Steady-State erreicht ist). Es ist jedoch bevorzugt, dass die Ammoniumkonzentration für mindestens 5 min, bevorzugt mindestens 10 min, noch bevorzugter mindestens 20 min, noch bevorzugter mindestens 1 ıh, insbesondere mindestens 5 h oder sogar mindestens 10 h (oder mindestens 20 h oder mindestens 40 h) in einem der vorgenannten Bereiche (z. B. 0,1 mmoL/L bis 200 mmol/L oder 10 mmol/L bis 20 mmol/L) bleibt.

Darüber hinaus ist es bevorzugt, wenn die Wolframatkonzentration (insbesondere die Orthowolframat-, d.h.

WO, ”-Konzentration) in der Fermentationsbrühe unter 0,1 umol/L,

bevorzugt unter 0,01 umol/L, speziell unter 0,001 umol/L liegt (insbesondere, wenn die Fermentationsbrühe im Wesentlichen wolframatfrei ist). Es stellte sich heraus, dass dies eine

effizientere Aminosäureproduktion ermöglicht.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein für die methanogenen Mikroorganismen (d. h. Zellen des erfindungsgemäßen Stamms) geeigneter Elektronendonor (oder Elektronendonorverbindung) dem Bioreaktor zugeführt. Insbesondere werden dem Bioreaktor Wasserstoffgas (d.h. molekularer Wasserstoff oder H,), Acetat, eine Methylverbindung, bevorzugt ausgewählt aus Methylaminen, Methylsulfiden und Methanol, ein beliebiger anderer Alkohol, bevorzugt ein sekundärer Alkohol wie 2-Propanol oder 2-Butanol, eine methoxylierte aromatische Verbindung und/oder Formiat (als Elektronendonorverbindungen) zugeführt. Besonders bevorzugt sind Wasserstoffgas, Acetat, Methanol oder Kombinationen davon (z. B. Methanol und Acetat).

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird Methan (produziert von den methanogenen Mikroorganismen) aus dem

Bioreaktor geerntet.

Die Aminosäuren, die durch die hier offenbarten Verfahren und Verwendungen hergestellt werden, können entweder das D- oder das L-Isomer oder beide sein. Die Aminosäure kann z.B. 2Aminobutyrat, Alanin, Beta-Alanin, Arginin, Aspartat, Carnitin, Citrulin, Cystin, Dehydroalanin, Glutamat, Glutamin, Glycin, Hydroxyprolin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Norleucin, Norvalin, Ornithin, Phenylalanin, Prolin, Pyroglutamat, Pyrroprolin, Pyrrolysin Selenocvystein, Selenomethionin, Serin, Homoserin, Threonin, Tryptophan, Tyramin, Tyrosin oder Valin sein. Die Herstellung von Glycin (bevorzugt zusätzlich zu anderen Aminosäuren oder als einzelne Aminosäure, z. B. in den

hier offenbarten Reinheiten) ist besonders bevorzugt.

Die (geernteten) Aminosäuren umfassen bevorzugt mindestens eine, bevorzugt mindestens zwei oder sogar mindestens drei, weiter bevorzugt mindestens vier oder sogar mindestens fünf, noch weiter bevorzugt mindestens sieben oder sogar mindestens neun, noch weiter bevorzugt mindestens 12 oder sogar mindestens 15, noch weiter bevorzugt mindestens 17 oder sogar mindestens

18, insbesondere alle der 20 kanonischen Aminosäuren (d.h. Asp,

Glu, Asn, Ser, His, Gln, Gly, Thr, Arg, Ala, Tyr, Val, Met, Trp, Ile, Phe, Leu, Lys, Cys und Pro). Besonders bevorzugt ist es, wenn die (geernteten) Aminosäuren eine oder mehrere der folgenden umfassen: essentielle Aminosäuren (essentiell für den menschlichen Verzehr), verzweigtkettige Aminosäuren (BCAAs) und Glutamat, wobei bevorzugt mindestens 50 Mol-%, bevorzugt mindestens 60 Mol-%, insbesondere mindestens 70 Mol-% der (produzierten oder geernteten) Aminosäuren essentielle Aminosäuren, verzweigtkettige Aminosäuren (BCAAs) oder Glutamat

sind.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beträgt die Gesamt-Aminosäureproduktionsrate pro Volumen (des Überstands) der Fermentationsbrühe mindestens 0,01 umol L”* h”, bevorzugt mindestens 0,05 umol L”7* h”, weiter bevorzugt mindestens 0,1 umol L”* h”, noch weiter bevorzugt mindestens 0,5 umol L”* h”*, noch weiter bevorzugt mindestens 1,0 upmol L7”* h”, insbesondere mindestens 5 umol L”* h” oder sogar mindestens 10 umol L”* h”* (oder noch höher, bevorzugt mindestens 100 umol L”* h”, weiter bevorzugt mindestens 1000 umol L”* h”, insbesondere mindestens 10000 ıumol L” *h7).

Gemäß noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beträgt die Gesamt-Aminosäureproduktionsrate pro Biomasse mindestens 0,1 umol g”* h”, bevorzugt mindestens 0,5 umol g” h”*, bevorzugter mindestens 1,0 umol g”* h”, noch bevorzugter mindestens 5 umol g7”* h”, noch bevorzugter mindestens 10 umol g”* h”, insbesondere mindestens 50 umol g” h”* oder sogar mindestens 100 umol g” h”* (oder noch höher, wie etwa mindestens 1000 umol g7 *h*).

Der erfindungsgemäße Stamm kann natürlich (z. B. natürliche Isolate oder daraus gewonnene Laborstämme) oder genetisch manipuliert sein. Beispielsweise steht dem Fachmann eine genetische Manipulation in methanogenen Archaeen wie eine auf ortsgerichteter Mutagenese basierende Manipulation, selektierbare Marker, Transformationsmethoden und Reportergene zur Verfügung, siehe z. B. Sarmiento et al. 2011. Fink et al,., 2023, berichten über die Verwendung von Suizidvektorkonstrukten zur ortsspezifischen genomischen Deletion in Methanothermobacter. CRISPR-basierte Geneditierung und andere

CRISPR-basierte genetische Werkzeuge stehen dem Fachmann

ebenfalls zur Verfügung, siehe z. B. Adalsteinsson et al, 2021

und Mougiakos et al, 2017.

Auch eine (definierte) Co-Kultur von methanogenen Mikroorganismen im Bioreaktor hat sich als vorteilhaft erwiesen. Dementsprechend umfassen die methanogenen Mikroorganismen (im Bioreaktor) bevorzugt mindestens zwei verschiedene Spezies (von

denen eine vom erfindungsgemäßen Stamm ist).

Es ist sehr bevorzugt, dass die Fermentation mit den methanogenen Mikroorganismen (d.h. Zellen des erfindungsgemäßen Stammes) in chemisch definiertem Fermentationsmedium gestartet

wird.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die

Fermentation unter anaeroben Bedingungen durchgeführt.

Wenn das Verfahren ein kontinuierliches Verfahren (kontinuierliche Kultur) ist, ist es bevorzugt, dass die Verdünnungsrate D 0,001 h” bis 1,5 h”, bevorzugt 0,01 h” bis 0,5 h”!, insbesondere 0,0125 h” bis 0,1 h” beträgt.

Als vorteilhaft haben sich stickstofffixierende Bedingungen und/oder kohlenstofffixierende Bedingungen erwiesen: So werden gemäß einem weiteren Vorzug mindestens 50 %, bevorzugt mindestens 60 %, weiter bevorzugt mindestens 70 %, noch weiter bevorzugt mindestens 80 %, noch weiter bevorzugt mindestens 90 % oder noch weiter bevorzugt mindestens 95 %, insbesondere mindestens 99 % oder sogar mindestens 99,9 % aller dem Bioreaktor zugeführten Stickstoffatome aller Stickstoffquellen dem Bioreaktor in Form von Stickstoffgas zugeführt. In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden mindestens 50 %, bevorzugt mindestens 60 %, weiter bevorzugt mindestens 70 %, noch weiter bevorzugt mindestens 80 %, noch weiter bevorzugt

Q

mindestens 90 % oder noch weiter bevorzugt mindestens 95 %, insbesondere mindestens 99 % oder sogar mindestens 99,9 % aller dem Bioreaktor zugeführten Kohlenstoffatome aller Kohlenstoffquellen in Form von Kohlendioxidgas und/oder

Kohlenmonoxidgas dem Bioreaktor zugeführt.

Typischerweise wird auch eine Schwefelquelle dem Bioreaktor zugeführt. Diese Quelle umfasst bevorzugt Cystein (insbesondere L-Cystein) und/oder Sulfid, insbesondere wobei die

Fermentationsbrühe Sulfid in einer Konzentration von 0,001 - 150

mg/L, bevorzugt 0,01 - 100 mg/L, insbesondere 1 bis 80 mg/L umfasst und/oder wobei die Sulfidzufuhrrate oder Cysteinzufuhrrate 0,0001 - 0,2 mol L”*h”, bevorzugt 0,001 - 0,05 mol L”* h”* beträgt.

Eine Vielzahl von verschiedenen Bioreaktoren kann in den hier offenbarten Verfahren und Verwendungen verwendet werden. Flüssigphasenbioreaktoren (z. B. Rührkessel, Festbett, eine flüssige Phase, zwei flüssige Phasen, Hohlfasermembran) sind im Stand der Technik gut bekannt. Mehrphasige Bioreaktoren (z. B. Blasensäulenbioreaktor, Rieselbettbioreaktor (Fest- oder gepacktes Bett), Wirbelbettbioreaktor) können ebenfalls verwendet werden. Der Bioreaktor besteht typischerweise teilweise aus (rostfreiem) Stahl, Kunststoff und/oder Glas. Üblicherweise enthält der Bioreaktor mindestens einen Einlass, der den Eintritt eines Gases oder Gasgemisches ermöglicht, und mindestens zwei Auslässe. Ein Auslass ermöglicht die Entfernung eines flüssigen Stroms, der das eine oder die mehreren Fermentationsprodukte (d. h. Aminosäuren) enthält, und der andere Auslass ermöglicht die Entfernung eines Gasstroms (wie zZ. B. Methan, das von den methanogenen Mikroorganismen, d. h. Zellen des erfindungsgemäßen Stamms, produziert wird). In

Ausführungsformen ist der Bioreaktor ein Chemostat.

Hierin bezieht sich „UniProt“ auf Universal Protein Resource. UniProt ist eine umfassende Ressource für Proteinsequenz- und Annotationsdaten. UniProt ist eine Zusammenarbeit zwischen dem European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI), dem SIB Swiss Institute of Bioinformatics und Protein Information Resource (PIR). In den drei Instituten sind mehr als 100 Personen durch verschiedene Aufgaben wie Datenbankkuratierung, Softwareentwicklung und Support

involviert. Website: http://www.uniprot.org/

Einträge in den UniProt-Datenbanken sind durch ihre Hinterlegungscodes gekennzeichnet (hierin z. B. als „UniProtHinterlegungscode“ oder kurz als „UniProt“, gefolgt vom Hinterlegungscode), in der Regel ein Code aus sechs alphanumerischen Buchstaben (z. B. „D9PVR6“). Wenn nicht anders angegeben, ist der UniProt-Datenbankstatus für alle hierin referenzierten Einträge der 1. März 2023 (UniProt/UniProtKB Release 2023 01).

"Prozent (%) Aminosäuresequenzidentität" oder "zu X% identisch" (wie "zu 70 % identisch") in Bezug auf ein Referenzpolypeptid oder eine Proteinsequenz ist definiert als der Prozentsatz der Aminosäurereste in einer Kandidatensequenz, die mit den Aminosäureresten in der Referenzpolypeptidsequenz identisch sind, nachdem die Sequenzen ausgerichtet und gegebenenfalls Lücken eingeführt wurden und keine konservativen Substitutionen als Teil der Sequenzidentität berücksichtigt wurden. Die Ausrichtung zum Zwecke der Bestimmung der prozentualen Aminosäuresequenzidentität kann auf verschiedene Weise erreicht werden, die im Rahmen des Fachgebiets liegen, zum Beispiel unter Verwendung Öffentlich verfügbarer Computersoftware wie BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2, Megalign (DNASTAR) oder der paarweisen "Needle"-Sequence-AlignmentAnwendung des EMBOSS-Softwarepakets. Der Fachmann kann geeignete Parameter zum Ausrichten von Sequenzen bestimmen, einschließlich etwaiger Algorithmen, die erforderlich sind, um eine maximale Ausrichtung über die gesamte Länge der verglichenen Sequenzen zu erreichen. Für die Zwecke hierin werden Jedoch % Aminosäuresequenzidentitätswerte unter Verwendung der Sequenzausrichtung des Computerprogramms „Needle“ des EMBOSSSoftwarepakets berechnet (5Effentlich erhältlich bei European

Molecular Biology Laboratory; Rice et al., 2000).

Das Needle-Programm kann unter der Website http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss _needle/ aufgerufen oder für die lokale Installation als Teil des EMBOSS-Pakets von http://emboss.sourceforge.net/ heruntergeladen werden. Es läuft auf vielen weit verbreiteten UNIX- und UNIX-ähnlichen

Betriebssystemen wie Linux.

Um zwei Proteinsequenzen auszurichten, wird das Needle-

Programm bevorzugt mit den folgenden Parametern ausgeführt:

Befehlszeile: needle -auto -stdout -asequence SEQUENCE_ FILE _A -bsequence SEQUENCE FILE _B -datafile EBLOSUM62 gapopen 10.0 -gapextend 0.5 -endopen 10.0 -endextend 0.5 aformat3 pair -proteinl -protein2 (Align format: pair Report _file: stdout)

Die prozentuale Aminosäuresequenzidentität einer bestimmten Aminosäuresequenz A zu, mit oder gegen eine bestimmte

Aminosäuresequenz B (die alternativ als eine bestimmte

Aminosäuresequenz A formuliert werden kann, die eine bestimmte prozentuale Aminosäuresequenzidentität zu, mit oder gegen eine bestimmte Aminosäuresequenz B aufweist oder umfasst) wird wie

folgt berechnet: 100 x der Bruch X/Y

wobei X die Anzahl der Aminosäurereste ist, die von der Needle des Sequence-Alignment-Programms in der Ausrichtung von A und B dieses Programms als identisch eingestuft wurden, und wobei Y die Gesamtzahl der Aminosäurereste in B ist. Es versteht sich, dass, wenn die Länge der Aminosäuresequenz A nicht gleich der Länge der Aminosäuresequenz B ist, die prozentuale Aminosäuresequenzidentität von A bis B nicht gleich der prozentualen Aminosäuresequenzidentität von B bis A ist. In Fällen, in denen "die Sequenz von A mehr als N% identisch mit der gesamten Sequenz von B ist", ist Y die gesamte Sequenzlänge von B (d. h. die gesamte Anzahl der Aminosäurereste in B). Sofern nicht ausdrücklich anders angegeben, werden alle hierin verwendeten % Aminosäuresequenzidentitätswerte wie im unmittelbar vorhergehenden Absatz beschrieben unter Verwendung des Needle-Computerprogramms erhalten.

Q

"Prozent (%) Sequenzidentität" in Bezug auf eine Referenznukleotidsequenz ist definiert als der Prozentsatz von Nukleotiden in einer Kandidatensequenz, die mit den Nukleotiden in der Referenzsequenz identisch sind, nachdem die Sequenzen ausgerichtet und gegebenenfalls Lücken eingeführt wurden und keine konservativen Substitutionen als Teil der Sequenzidentität berücksichtigt wurden. Lücken führen zu mangelnder Identität. Die Ausrichtung zum Zwecke der Bestimmung der prozentualen Nukleotidsequenzidentität kann auf verschiedene Arten erreicht werden, die im Rahmen des Fachgebiets liegen, zum Beispiel unter Verwendung Öffentlich verfügbarer Computersoftware wie BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2, Megalign (DNASTAR) oder der paarweisen "Needle"-Sequence-Alignment-Anwendung des EMBOSS-Softwarepakets. Der Fachmann kann geeignete Parameter zum Ausrichten von Sequenzen bestimmen, einschließlich etwaiger Algorithmen, die erforderlich sind, um eine maximale Ausrichtung über die gesamte Länge der verglichenen Sequenzen zu erreichen. Für die Zwecke hierin werden Jedoch % -Nukleotidsequenzidentitätswerte unter

Verwendung der Sequenzausrichtung des Computerprogramms „Needle“

des EMBOSS-Softwarepakets (Effentlich erhältlich bei European Molecular Biology Laboratory; Rice et al, 2000) berechnet.

Das Needle-Programm kann unter der Website http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss _needle/nucleotide.html aufgerufen oder für die lokale Installation als Teil des EMBOSSPakets von http://emboss.sourceforge.net/ heruntergeladen werden. Es läuft auf vielen weit verbreiteten UNIX- oder UNIX-

ähnlichen Betriebssystemen wie Linux.

Um zwei Nukleotidsequenzen auszurichten, wird das Needle-

Programm bevorzugt mit den folgenden Parametern ausgeführt:

Befehlszeile: needle -auto -stdout -asequence SEQUENCE_ FILE _A -bsequence SEQUENCE FILE _B -datafile EDNAFULL gapopen 10.0 -gapextend 0.5 -endopen 10.0 -endextend 0.5 aformat3 pair -snucleotidel -snucleotide2 (Align format: pair Report _file: stdout)

Die prozentuale Nukleotidsequenzidentität einer bestimmten Nukleotidsequenz A zu, mit oder gegen eine bestimmte Nukleotidsequenz B (die alternativ als eine bestimmte Nukleotidsequenz A formuliert werden kann, die eine bestimmte prozentuale Nukleotidsequenzidentität zu, mit oder gegen eine bestimmte Nukleotidsequenz B aufweist oder umfasst) wird wie

folgt berechnet: 100 x der Bruch X/Y

wobei X die Anzahl der Nukleotide ist, die von der Sequenzausrichtungsprogrammnadel in der Ausrichtung von A und B dieses Programms als identische Übereinstimmungen bewertet werden, und wobei Y die Gesamtzahl der Nukleotide in B ist. Es versteht sich, dass, wenn die Länge der Nukleotidsequenz A nicht

Q

gleich der Länge der Nukleotidsequenz B ist, die % Nukleotidsequenzidentität von A bis B nicht gleich der % Nukleotidsequenzidentität von B bis A ist. In Fällen, in denen "eine Sequenz von A mindestens N% identisch mit der gesamten Sequenz von B ist", ist Y die gesamte Länge von B. Sofern nicht ausdrücklich anders angegeben, werden alle hierin verwendeten % -Nukleotidsequenzidentitätswerte wie im unmittelbar vorhergehenden Absatz beschrieben unter Verwendung des Needle-

Computerprogramms erhalten.

Für Nukleotidsequenzen gelten "Sequenzähnlichkeit", "Sequenzidentität", "Teilen einer Sequenz" und ähnliche Begriffe auch für das umgekehrte Komplement einer Sequenz, d. h. der

Q

Ausdruck "Sequenz A ist zu 80 % identisch mit Sequenz B" gilt

auch, wenn "Sequenz A zu 80 % identisch mit dem umgekehrten

Komplement (oder der Antisense-Sequenz) von Sequenz B ist",

Während die hierin offenbarten Nukleotidsequenzen als DNASequenzen aufgeführt sind, versteht es sich, dass das umgekehrte Komplement der DNA-Sequenzen vom Fachmann leicht bestimmt werden kann. Es versteht sich auch, dass die hierin als DNA-Sequenzen offenbarten Sequenzen von einer DNA-Sequenz in eine RNA-Sequenz umgewandelt werden können, indem jedes Thymidinnukleotid durch ein Uridinnukleotid ersetzt wird. Dementsprechend ist immer dann, wenn sich die vorliegende Erfindung auf eine DNA-Sequenz bezieht, auch die entsprechende RNA-Sequenz und das umgekehrte Komplement der DNA-Sequenz in Bezug auf den Schutzumfang zu verstehen.

Wenn hierin auf eine „Reinheit einer Aminosäure“ (z. B. in Gew.-%) Bezug genommen wird, bezieht sich die Reinheit auf die relative Reinheit, d. h. die relative Menge der Aminosäure unter allen vorhandenen Aminosäuren. Zum Beispiel kann die Reinheit einer Aminosäure X in Gew.-% berechnet werden, indem die Gesamtmenge von X durch die Gesamtmenge aller vorhandenen Aminosäuren (auf Gewichtsbasis) dividiert wird. Mit anderen Worten hat die Anwesenheit von anderen Verbindungen als Aminosäuren keinen Einfluss auf die Berechnung der

Aminosäurereinheit, wie hierin verwendet.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die folgenden

Ausführungsformen:

Ausführungsform 1. Ein Stamm von Methanothermobacter mit einer Prolinproduktionsrate, die niedriger ist als die Prolinproduktionsrate von Methanothermobacter marburgensis, hinterlegt bei der DSMZ unter der Hinterlegungsnummer DSM 2133 (Methanothermobacter marburgensis DSM 2133) und/oder mit einer Glycinproduktionsrate, die höher ist als die Glycinproduktionsrate von Methanothermobacter marburgensis DSM 2133.

Ausführungsform 2. Stamm nach Ausführungsform 1, wobei der Stamm einen Prolinanteil an den insgesamt sekretierten Aminosäuren aufweist, der niedriger ist als der Prolinanteil an den insgesamt sekretierten Aminosäuren von Methanothermobacter marburgensis DSM 2133, und/oder wobei der Stamm einen Glycinanteil an den insgesamt sekretierten Aminosäuren aufweist, der höher ist als der Glycinanteil an den insgesamt sekretierten

Aminosäuren von Methanothermobacter marburgensis DSM 2133.

Ausführungsform 3. Ein Stamm von Methanothermobacter, der eine ASL mit einem Aminosäurerest 51 aufweist, bei dem es sich um Leucin, Isoleucin, Valin oder Alanin handelt, bevorzugt der

Stamm der Ausführungsform 1 oder 2.

Ausführungsform 4. Stamm nach einer der Ausführungsformen 1 bis 3, wobei es sich bei dem Aminosäurerest 51 von ASL um Leucin

oder Isoleucin handelt.

Ausführungsform 5. Stamm nach einer der Ausführungsformen 1 bis 4, wobei der Stamm von Methanothermobacter marburgensis, Methanothermobacter defluvii, Methanothermobacter wolfeii, Methanothermobacter thermautotrophicus, Methanothermobacter crinale, Methanothermobacter thermoflexus, Methanothermobacter thermophilus, Methanothermobacter sp. CaT2, Methanothermobacter sp. DP, Methanothermobacter sp. KEPCO-1, Methanothermobacter sp. THM-1 oder Methanothermobacter tenebrarum ist; bevorzugt Methanothermobacter marburgensis, Methanothermobacter defluvii, Methanothermobacter wolfeii, Methanothermobacter thermautotrophicus, Methanothermobacter crinale, Methanothermobacter thermoflexus, Methanothermobacter thermophilus oder Methanothermobacter tenebrarum; insbesondere Methanothermobacter marburgensis, Methanothermobacter defluvii, Methanothermobacter wolfeii, Methanothermobacter

thermautotrophicus oder Methanothermobacter tenebrarum.

Ausführungsform 6. Stamm nach einer der Ausführungsformen 1 bis 5, wobei der Stamm eine ASL aufweist, die eine Sequenz mit mindestens 80 %, bevorzugt mindestens 85 %, bevorzugter mindestens 90 %, noch bevorzugter mindestens 95 % oder sogar mindestens 97,5 %, noch bevorzugter mindestens 98 % oder sogar mindestens 99 % Identität, insbesondere mindestens 99,5 % oder sogar mindestens 99,75 % Identität zu der gesamten durch SEQ ID

NO: 1 identifizierten Sequenz umfasst, mit der Maßgabe, dass es

sich bei dem Aminosäurerest 51 um Leucin, Isoleucin, Valin oder Alanin handelt.

Ausführungsform 7. Stamm nach einer der Ausführungsformen 1 bis 6, wobei der Stamm ein ASL-Gen aufweist, das eine Sequenz mit mindestens 70 %, bevorzugt mindestens 75 %, bevorzugter mindestens 80 %, noch bevorzugter mindestens 85 % oder sogar mindestens 90 %, noch bevorzugter mindestens 95 % oder sogar

Q Q

mindestens 97,5 % Identität, insbesondere mindestens 99 % oder sogar mindestens 99,5 % Identität zu der gesamten durch SEO ID NO: 2 identifizierten Sequenz umfasst, mit der Maßgabe, dass das ASL-Gen für ein ASL mit dem Aminosäurerest 51 Leucin, Isoleucin,

Valin oder Alanin kodiert.

Ausführungsform 8. Stamm nach einer der Ausführungsformen 1 bis

7, wobei der Stamm von Methanothermobacter marburgensis ist.

Ausführungsform 9. Stamm nach Ausführungsform 8, wobei der Stamm eine ASL aufweist, die die durch SEO ID NO: 1 identifizierte

Sequenz umfasst.

Ausführungsform 10. Stamm nach Ausführungsform 8 oder 9, wobei der Stamm ein ASL-Gen aufweist, das die durch SEO ID NO: 2

identifizierte Sequenz umfasst.

Ausführungsform 11. Ein Stamm von Methanothermobacter marburgens, der am 21. November 2023 bei der DSMZ unter der Hinterlegungsnummer DSM 34858 hinterlegt wurde.

Ausführungsform 12. Stamm nach einer der Ausführungsformen 1 bis 11, wobei die 16S ribosomale RNA des Stamms die durch SEQ ID

NO: 3 identifizierte Sequenz aufweist.

Ausführungsform 13. Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren durch Fermentation in einem Bioreaktor, wobei der Bioreaktor Zellen des Stammes nach einer der Ausführungsformen 1 bis 12 in einer Fermentationsbrühe umfasst, wobei das Verfahren mindestens

die Schritte umfasst

- Zuführen einer gasförmigen Kohlenstoffquelle, die Kohlendioxid und/oder Kohlenmonoxid umfasst, einer Stickstoffquelle und bevorzugt einer Schwefelquelle zu dem Bioreaktor unter solchen Bedingungen, dass die Zellen die

Aminosäuren produzieren; und

- Ernten mindestens eines Teils der Aminosäuren aus der

Fermentationsbrühe.

Ausführungsform 14. Verfahren nach Ausführungsform 13, wobei der Teil eine einzelne Aminosäure, bevorzugt eine einzelne kanonische Aminosäure, in einer Reinheit von mehr als 50 Gew.-%, bevorzugt mehr als 60 Gew.-%, bevorzugter mehr als 70 Gew.-%, noch bevorzugter mehr als 80 Gew.-%, insbesondere mehr als 90

Q

Gew.-% umfasst.

Ausführungsform 15. Verfahren nach Ausführungsform 13, wobei dieser Teil mindestens zwei, bevorzugt mindestens drei, weiter bevorzugt mindestens vier oder sogar mindestens fünf, noch weiter bevorzugt mindestens sieben oder sogar mindestens neun, noch weiter bevorzugt mindestens 12 oder sogar mindestens 15, noch weiter bevorzugt mindestens 17 oder sogar mindestens 18, insbesondere alle 20 kanonischen Aminosäuren umfasst; wobei dieser Abschnitt bevorzugt mindestens Arginin und/oder Aspartat

umfasst.

Ausführungsform 16. Verfahren nach einer der Ausführungsformen 13 bis 15, wobei das Verfahren ein kontinuierlicher Prozess mit oder ohne Zellretention, ein Fed-Batch-Prozess, ein BatchProzess, ein Closed-Batch-Prozess, ein Repetitive-Batch-Prozess, ein Repetitive-Fed-Batch-Prozess oder ein Repetitive-ClosedBatch-Prozess ist, bevorzugt ein kontinuierlicher Prozess, ein Fed-Batch-Prozess oder ein Repetitive-Fed-Batch-Prozess, insbesondere ein kontinuierlicher Prozess mit oder ohne

Zellretention.

Ausführungsform 17. Verfahren nach einer der Ausführungsformen 13 bis 16, wobei die Stickstoffquelle Ammoniakgas, Ammoniumund/oder Stickstoffgas umfasst.

Ausführungsform 18. Verfahren nach Ausführungsform 17, wobei die Stickstoffquelle Stickstoffgas umfasst; bevorzugt wobei mindestens 50 %, bevorzugt mindestens 60 %, weiter bevorzugt mindestens 70 %, noch weiter bevorzugt mindestens 80 %, noch weiter bevorzugt mindestens 90 % oder noch weiter bevorzugt mindestens 95 %, insbesondere mindestens 99 % oder sogar mindestens 99,9 % aller dem Bioreaktor zugeführten Stickstoffatome aller Stickstoffquellen dem Bioreaktor in Form

von Stickstoffgas zugeführt werden.

Ausführungsform 19. Verfahren nach einer der Ausführungsformen 13 bis 18, wobei mindestens 50 %, bevorzugt mindestens 60 %, weiter bevorzugt mindestens 70 %, noch weiter bevorzugt

Q

mindestens 80 %, noch weiter bevorzugt mindestens 90 % oder noch

Q

weiter bevorzugt mindestens 95 %, insbesondere mindestens 99 % oder sogar mindestens 99,9 % aller dem Bioreaktor zugeführten Kohlenstoffatome aller Kohlenstoffquellen in Form von Kohlendioxidgas und/oder Kohlenmonoxidgas dem Bioreaktor

zugeführt werden.

Ausführungsform 20. Verfahren nach einer der Ausführungsformen 13 bis 19, wobei die Schwefelquelle dem Bioreaktor zugeführt wird, wobei die Schwefelquelle bevorzugt Sulfid, Cystein oder

Cystein und Sulfid umfasst.

Ausführungsform 21. Verfahren nach einer der Ausführungsformen 13 bis 20, wobei Wasserstoffgas, Acetat, eine Methylverbindung, bevorzugt ausgewählt aus Methylaminen, Methylsulfiden und Methanol, ein beliebiger anderer Alkohol, bevorzugt ein sekundärer Alkohol wie 2-Propanol oder 2-Butanol, eine methoxylierte aromatische Verbindung und/oder Formiat dem Bioreaktor zugeführt werden; wobei bevorzugt Wasserstoffgas, Acetat, Methanol oder Kombinationen davon dem Bioreaktor

zugeführt werden.

Ausführungsform 22. Verfahren nach Ausführungsform 21, wobei das Ernten Entfernen eines flüssigen Stroms aus dem Bioreaktor umfasst, wobei der flüssige Strom Fermentationsbrühe, Zellen des Stamms und produzierte Aminosäuren umfasst, Trennen der Zellen des Stamms von dem flüssigen Strom und Rückführen von Zellen des

Stamms zurück in den Bioreaktor.

Ausführungsform 23. Verfahren nach Ausführungsform 22, ferner umfassend den Schritt des Reinigens der hergestellten

Aminosäuren aus dem Flüssigkeitsstrom.

Ausführungsform 24. Verwendung des Stammes nach einer der Ausführungsformen 1 bis 12 zur Herstellung von Aminosäuren,

insbesondere Glyvcin.

Ausführungsform 25. Fermentationsbrühe, die Zellen des Stamms

gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 12 umfasst.

Ausführungsform 26. Ein Bioreaktor, der die Fermentationsbrühe

der Ausführungsform 25 umfasst.

Die vorliegende Erfindung wird ferner durch die folgenden Figuren und Beispiele veranschaulicht, ohne darauf beschränkt zu

sein.

Figur 1: Die Aminosäureproduktion durch Methanothermobacter marburgensis Arkeon (DSM 34858) wurde mit der Aminosäureproduktion durch Methanothermobacter marburgensis DSM 2133 (Stamm Marburg) unter den gleichen Kulturbedingungen verglichen. Die (A) Prolinproduktionsrate und (B) ihr Anteil an den Gesamtaminosäuren ("AA") war für DSM 34858 signifikant

niedriger.

Figur 2: Multiple-Sequence-Alignment von argH, das für ASL kodiert, von mehreren Methanothermobacter-Genomen (ArgH _Arkeon: argH von Methanothermobacter marburgensis DSM 34858, ArgH_DSMZ: argH von Methanothermobacter marburgensis DSM 2133; ArgH_CaT2: argH von Methanothermobacter sp. DSM 24414; ArgH_deltaH: Methanothermobacter thermautotrophicus Delta H; ArgH_wolfei: Methanothermobacter wolfei). Die ersten beiden Nukleotide des Codons, das für den Aminosäurerest 51 von ASL kodiert, sind zwischen den bisher bekannten Methanothermobacter-Genomen hoch konserviert. Im Gegensatz dazu ist das zweite Nukleotid des Codons (hervorgehoben) im erfindungsgemäßen Stamm DSM 34858 mutiert, was zu einem Wechsel von Prolin zu Leucin an Position 51 von ASL führt.

Figur 3: Multiple-Sequence-Alignment von Methanothermobacter ASL-Sequenzen, veröffentlicht in UniProt (UniProtHinterlegungsnummern in blau angegeben) und Methanothermobacter marburgensis DSM 34858 ("DSM 34858"). Im Allgemeinen ist Position 51 (hervorgehoben) hoch konserviert. Im Gegensatz dazu ist im erfindungsgemäßen Stamm DSM 34858 die Position 51 von ASL

Leucin.

Figur 4: Die Aminosäureproduktion durch Methanothermobacter marburgensis Arkeon (DSM 34858) wurde mit der Aminosäureproduktion durch Methanothermobacter marburgensis DSM 2133 (Stamm Marburg) unter den gleichen Kulturbedingungen

verglichen. Die (A) Glycinproduktionsrate und (B) ihr Anteil an

den Gesamtaminosäuren ("AA") war für DSM 34858 signifikant höher.

Beispiele

Beispiel 1: Aminosäureproduktion und aktive Sekretion durch

Methanothermobacter marburgensis Arkeon (DSM 34858)

Kontinuierliche Kultur von Methanothermobacter marburgensis Arkeon (hinterlegt bei der DSMZ unter der Hinterlegungsnummer DSM 34858 am 21. November 2023) zur Aminosäureproduktion wurde

erfolgreich etabliert. MM-Medium wurde verwendet.

MM Medium: NH.C1l 2,1 g/L und KH,PO: 6,8 g/L in ddH,O. 200x zuzugebende Spurenelement (TE)-LöÖösung (z.B. bis zu einer Konzentration von 5 ml pro L MM-Medium): Titriplex I 9 g/L, 800 ml H,O zugeben und mit 5 mol/L NaOH-Lösung auf pH 6,5 einstellen, dann zugeben (bis zur Zielkonzentration): MgCl,-6H,0 8 g/L, FeCl,-4H;0 2 g/L, CoCl2:6H,0 40 mg/L, NiCl1,:-6H,;O0 240 mg/L, NaMoO,-2H,0 40 mg/L, dann mit 1 mol/L NaOH und ddH, O auf pH 7,0 und Volumen von 1 L einstellen. Das Medium kann ferner z. B. 3,6 g/L NaHCOz3 als Kohlenstoffquelle enthalten. Als Schwefelquelle können z. B. 2 ml 0,5 mol/L Na,S-9H‚,0 pro Liter nach

Anaerobisierung und Autoklavierung zugegeben werden.

Das gleiche Medium wurde als Zufuhrmedium für den

kontinuierlichen Kultivierungsmodus verwendet.

Experimente wurden in 2 L Bioreaktoren (Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland) und in einem 15 L Bioreaktor (Biostat C+, Sartorius Stedim Biotech AG, Göttingen, Deutschland) durchgeführt.

Um anaerobe Bedingungen im Reaktionsgefäß zu gewährleisten, wurde das gesamte System vor der Beimpfung 10 Minuten lang mit einem H,/CO,-, N,- oder H,/CO,/N,-Gemisch gespült.

Die Kultivierung erfolgte bei 65°C und einer Rührerdrehzahl von 100 bis 1200 U/min (Parallelbioreaktorsystem DASGIP, Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland) und von 100 bis 1500 U/min (Biostat C+, Sartorius Stedim Biotech AG, Göttingen, Deutschland). Der pH-Wert wurde mit einer pH-Sonde (Mettler Toledo GmbH, Wien, Österreich oder Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz,

Schweiz) gemessen und konstant bei einem Wert von 7,0 gehalten.

Das Oxidationsreduktionspotential (ORP) wurde mit einer Redoxsonde (Mettler Toledo GmbH, Wien, Österreich) gemessen. Eine 0,5 mol/L Na‚,S-9H,0-Lösung wurde als Schwefelquelle verwendet und dem Bioreaktor konstant mit z. B. 0,2 ml/h bis 1,32 ml/h zugeführt. Das MM-Medium wurde mit einer analogen peristaltischen Pumpe aufgetragen. Die MM-Mediumzufuhrrate, die Natrium-Na,S: 9H,0-Zufuhrrate und die Titration wurden gravimetrisch aufgezeichnet oder durch die Pumpendrehzahl eingestellt. Das Bioreaktorvolumen wurde konstant gehalten, indem Kultursuspension über ein Tauchrohr mit einer peristaltischen Pumpe entnommen wurde, die auf ein festes Bioreaktorgewicht geregelt wurde, oder indem ein Rohr in einer festen Höhe als Niveauregelsystem verwendet wurde. Die entnommene Suspension wurde in einer Ernteflasche aufgefangen und deren Volumen gravimetrisch erfasst. Alle Lösungen wurden durch Spülen mit N,, H,/CO, oder H,/CO,/N, anaerobisiert. Um die anaeroben Bedingungen aufrechtzuerhalten, wurden alle Flaschen mit N, unter Druck gesetzt. Als Substrat wurde reines H,/CO, (4:1) verwendet. Der CO,-Gasfluss wurde über die MX4/4-Anlage (Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland) gesteuert. Der H,-Gasfluss wurde über die C100L-Einheit (Sierra Instruments, Monterey, USA)

gesteuert.

Mehrere Durchläufe kontinuierlicher Kulturen von M., marburgensis Arkeon wurden unter anaeroben Bedingungen durchgeführt. Das Volumen eines Durchlaufs reichte von 1,6 L bis 10,29 L. Die Verdünnungsrate (D) wurde zwischen den Durchläufen variiert, insbesondere mit Werten für D von 0,0125 h” bis 0,05 h” *, Volumengas pro Volumen Flüssigkeit pro Minute (vvm) wurde auch zwischen den Durchläufen variiert, z. B. von 0,125 bis 0,5. Die Rührung (U/min) wurde auch zwischen den Durchläufen variiert, beispielsweise von 375 bis 1500. Als Schwefelquelle wurden 0,5 mol/L Na,»S von z.B. 0,2 ml/h bis 1,32 ml/h zugeführt. Typischerweise wurde die Ammoniumkonzentration zwischen 15 mmol/L und 35 mmol/L gehalten.

Die Produktion und Sekretion der folgenden Aminosäuren (in Kombination) in den Kulturüberstand wurde typischerweise beobachtet: Asp, Glu, Asn, Ser, His, Gln, Gly, Thr, Arg, Ala, Tyr, Val, Met, Norvalin (Nva), Trp, Ile, Phe, Leu, Lys. Einzelne

Aminosäureproduktionsraten wurden bis zu etwa 40 umol L”* h”*

(volumetrisch) und bis zu etwa 900 umol h7”!g” (spezifisch pro

Biomasse) beobachtet. Cys und Pro wurden aufgrund analytischer Einschränkungen nicht erkannt, aber es wird erwartet, dass sie

ebenfalls produziert und sekretiert werden.

Zusammenfassend wurde eine zuverlässige Produktion von

Aminosäuren in kontinuierlicher Kultur beobachtet.

Beispiel 2: Genomische und physiologische Analyse von

Methanothermobacter marburgensis Arkeon (DSM 34858)

Wir fanden heraus, dass Methanothermobacter marburgensis Arkeon (DSM 34858) Methanothermobacter marburgensis DSM 2133 (Stamm Marburg) auf genomischer Ebene sehr ähnlich war. Da der M, marburgensis Stamm Marburg diesem neuen Stamm am nächsten kam, verglichen wir die beiden Stämme auf einer detaillierten genomischen Ebene (SNPs, Deletionen, Insertionen) und in Bezug

auf Aminosäuresekretion und spezifische Wachstumsrate. METHODEN Genomische DNA-Extraktion

Als ersten Schritt haben wir Zellen von M. marburgensis Stamm Arkeon geerntet. Daher zentrifugierten wir anaerob schrittweise 12 ml einer Übernachtkultur, die bis zu einer OD600 von etwa 0,4 wuchs. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 300 ul anaeroben sterilen Wachstumsmedien resuspendiert. Zu der Zellsuspension wurden 5 ul des zellwandabbauenden Enzyms PeiW [c= 5 ug/ml] gegeben und bei 65 °C für etwa 1 h inkubiert, bis eine vollständige Lyse eintritt. Wir haben dieses Lysat von M, marburgensis für die genomische DNA-Extraktion über das Promega Wizard® Genomic DNA Purification Kit verwendet. Extrahierte genomische DNA wurde für kurze Zeit bis zum Versand bei 4 °C gelagert. Reinheit und Ausbeute wurden mit dem Qubit-

Hochempfindlichkeitstest gemessen. Nanoporen-Sequenzierung

Natives Barcoding genomischer DNA NBE_ 9065 _v109 revAMProtokoll mit Kits SOL-LSK109 mit nativen BarcodingErweiterungen 1-12 EXP-NDB104 und FLO-Min106 (R9.4.1) FlLowZellen. Kurz gesagt, End-Repair für das Adapter-Attachment, Ligation nativer Barcodes, Ligatsequenzierungsadapter, PrimeFlow-Zelle und Laden der DNA auf die Flow-Zelle. Standard-

Sequenzierbetrieb.

Illumina-Sequenzierung

100 ng hochmolekulare DNA in einer Konzentration von mindestens 10 ng/uL wurden an die Eurofins NGSSequenzierungsanlage in Konstanz, Deutschland, geschickt. Die Bibliotheksvorbereitung und Illumina-Sequenzierung wurde von der

NGS-Sequenzierungsanlage von Eurofins durchgeführt. Genomassemblierung und Alignment an Referenzgenomen

Es wurde ein Hybridaufbau durchgeführt, um das Genom für M, marburgenis Stamm Arkeon zu generieren. Dies beinhaltete einen hochtiefen Satz von Nanopore-Lesungen sowie Daten aus einem Illumina-Sequenzierungslauf. Zuerst wurden mehrere verschiedene Assembler (Flye, Miniasm, Canu und Raven) verwendet, um reine Nanopore-Assemblierungen zu erstellen, die jeweils unterschiedliche Teilmengen der Auslesungen verwendeten. Trycycler wurde verwendet, um das Genom zu zirkularisieren, indem diese Ergebnisse kombiniert wurden, und die IlluminaAuslesungen wurden verwendet, um die endgültige Sequenz aufzupolieren (unter Ausnutzung der höheren Genauigkeit der Illumina-Plattform). Das endgültige Genom von M, marburgensis Stamm Arkeon hatte eine hohe Identität (>99,9%) sowohl zu dem ursprünglichen Genom M, marburgenis DSM 2133, hinterlegt bei NCBI, als auch zu dem kürzlich bei der Universität Tübingen

hinterlegten M, marburgenis DSM 2133. Identifikation von SNPs, Deletionen und Insertionen

Um mögliche Variationen des interessierenden Stamms zu identifizieren, wurden die Sequenzierungsdaten den Genomen von M, marburgenis DSM 2133 (einschließlich des ursprünglich auf NCBI hochgeladenen Genoms sowie eines aktuellen Genoms der Universität Tübingen) unter Verwendung von BowTie2 zugeordnet, das von der Geneious-Plattform unter Verwendung von Standardparametern gestartet wurde. Variationen, einschließlich SNPs, wurden mit dem integrierten Annotationstool in Geneious identifiziert. Eine Mindestvariantenhäufigkeit von 25% wurde verwendet, um mögliche heterozygote Effekte zu ermöglichen,

ansonsten waren Standardparameter ausreichend. Vorbereitung von Wachstumsmedien

Ein L Medien bestand aus 2,1 g Ammoniumchlorid, 6,8 g Kaliumdihydrogenphosphat, 3,6 g Natriumbicarbonat, 1 ml 0,025%

iger Resazurin-Stammlösung und 1 ml Spurenelementlösung. Der pHWert des Mediums wurde mit 10 mol/L Natronlauge auf 7,2 eingestellt. Ein Liter Spurenelementlösung bestand aus 90 g Nitrilotriessigsäure, 40 g Magnesiumchlorid-Hexahydrat, 10 g Eisen(II)chlorid-Tetrahydrat, 0,2 g Kobaltchlorid-Hexahydrat, 1,2 g Nickelchlorid-Hexahydrat und 0,2 g NatriummolybdatDihydrat. Der pH-Wert wurde mit 1 mol/L Natronlauge auf 7 eingestellt. Nach Abwiegen der Chemikalien wurde das Medium 40 min mit N,/CO, (20% CO, in N,) begast. Dann wurde das Medium in die anaerobe Kammer übertragen und mit 2 mlı 0,5 mol/L Natriumsulfid-Nonahydrat-Lösung reduziert. Das reduzierte Medium wurde ä 25 ml in 125 ml Serumflaschen abgefüllt. Die Flaschen wurden mit blauen Butylgummistopfen (Chemglass Inc.) verschlossen und mit Aluminiumkappen gecrimpt. Anschließend wurde der Kopfraum der Serumflaschen in drei Gas-Vakuum-Zyklen gegen H,/CO, (20% CO, in H,) ausgetauscht. Der Endüberdruck wurde auf 1,8 bar eingestellt. Im letzten Schritt wurden alle fertigen Medienflaschen 20 min bei 121 °C und 2 bar Überdruck

autoklaviert. Phänotypischer Charakterisierungsansatz

Für beide M. marburgensis Stämme wurde eine Vorkultur im gleichen Medium hergestellt, wie für die phänotypische Charakterisierung verwendet wurde. Beide Stämme wurden auf die gleiche optische Dichte beimpft, basierend auf der optischen Dichte der Vorkultur in der anaeroben Kammer (5 % H, in N,) um 18 Uhr. Nach Inkubation bei 65 °C über Nacht wurden die Kulturen mit H,/CO, (20% CO, in H,) auf ein Volumen von 1,8 bar Überdruck nachbehandelt und bei 65 °C weiter inkubiert. Dieser Vorgang wurde in den nächsten 8 h noch 3 mal wiederholt. Damit konnte ein Zeitverlaufsexperiment mit exponentiellem Wachstum durchgeführt werden. Jede Probenahme bestand aus der Messung der optischen Dichte bei 600 nm und anschließender Zentrifugation der Proben für 4 min, 16000 g bei Raumtemperatur. Während das Pellet verworfen wurde, wurde der Überstand zur Aminosäurequantifizierung mittels HPLC-MS übergeben. Eine fünfte Probe wurde am nächsten Morgen entnommen, um eine Probe aus der späten stationären Wachstumsphase aus Vergleichsgründen zur

exponentiellen Wachstumsphase zu erhalten.

ERGEBNISSE

Genom-Assemblierung

Für den Produktionsstamm M. marburgensis Arkeon (DSM 34858) wurde ein neuer Genomstandard zusammengestellt. Die Assemblierung dieses Genoms war aus mehreren Gründen signifikant. Erstens gibt es einen neuen Standard für zukünftige Analysen, basierend auf dem Stamm Arkeon. Zweitens liefert es Hinweise auf genomische Stabilität im Stamm sowie Informationen zu wahrscheinlichen Mutationen im Genom. Dies ermöglicht es der Einheit, Verhaltensunterschiede im Vergleich zu M. marburgensis DSM 2133 (d. h. demjenigen, das mit dem ursprünglichen Genom verbunden ist, das bei NCBI gespeichert ist; NC_014408) zu bewerten. Schließlich ist es unseres Wissens das erste Genom eines M, marburgensis-Stamms, das mit Hybridsequenzierung zusammengesetzt ist und sowohl die Sequenzierungsplattformen von Illumina als auch Oxford Nanopore Technology (ONTs) verwendet,

um ein strukturell und pro Basenpaar genaues Genom zu erzeugen.

Wir haben das Arkeon-Genom mit dem oben erwähnten NCBI-Genom von M, marburgensis DSM 2133 und einem kürzlich von Casini et al. (2023) von der Universität Tübingen veröffentlichten Genom von M, marburgensis DSM 2133 verglichen. Das Arkeon-Genom war 1.634.309 Basenpaare lang, verglichen mit 1.634.695 (NCBI) und 1.634.705 (Tübingen). Darüber hinaus wurde eine paarweise Übereinstimmung zwischen allen drei Genomen erzielt, wenn sie mit Mauve ausgerichtet wurden. Mit anderen Worten, die Genome sind sehr identisch, was darauf hindeutet, dass unsere Anordnung

eine sehr hohe Genauigkeit aufweist (Tabelle 1).

Tabelle 1: Vergleich der Genome. Arkeon bezieht sich auf das Genom von M, marburgensis Arkeon, NCBI auf das Genom, das mit

Hinterlegung NC_ 14408 bei NCBI gespeichert ist, und Tübingen

bezieht sich auf das von Casini et al. (2023) veröffentlichte Genom.

Genom % Identität Arkeon vs. NCBI 99,96

Arkeon vs. Tübingen 99,97

NCBI vs. Tübingen 99,99

Arkeon vs. Tübingen vs. NCBI 99,97

Schließlich wurde Prokka verwendet, um Gene zu benennen, einschließlich Protein-kodierender, tRNA- und rRNA-Gene. Prokka identifizierte 1.736 Protein-kodierende Gene, 38 tRNA-Gene und 7 FrRNA-Gene. EggNOG 6.0 wurde verwendet, um funktionelle Annotationen der Protein-kodierenden Gene zu verbessern und ein gutes Bild der metabolischen Fähigkeiten des Organismus zu

vermitteln. Beurteilung von Mutationen

Die Genom-Alignments wurden untersucht, um potenzielle interessante Mutationen zu bestimmen, die im ArkeonProduktionsstamm aufgetreten sein könnten. Es scheint, dass es relativ wenige Mutationen gibt, und von denen, die identifiziert wurden, ist ein signifikanter Anteil wahrscheinlich auf Assemblierungsfehler kleinen Ausmaßes zurückzuführen. Insbesondere sogenannte Homopolymere (d. h. Abschnitte des Genoms, in denen sich derselbe Buchstabe mehrfach wiederholt) sind insbesondere in Bezug auf ihre Länge eine Herausforderung für moderne Sequenzierungsplattformen. Wir identifizierten 42 Unterschiede zwischen dem Tübinger Genom und dem Arkeon-Genom, von denen 16 Längenänderungen von Homopolymeren und 26 nachgewiesene Unterschiede waren, die in Tabelle 2 aufgeführt sind, wie Deletionen und SNPs, die zu stillen oder bedeutungsvollen Mutationen in offenen Leserahmen führten. Darüber hinaus identifizierten wir 102 Unterschiede zwischen dem NCBI-Genom und unserem, von denen 10 Veränderungen der Homopolymerlänge waren. Wir glauben, dass das Arkeon-Genom sowie das Tübingen-Genom höhere Assemblierungsgenauigkeiten aufweisen als das ursprüngliche NCBI-Genom, das vor über 10 Jahren mit

älteren Technologien assembliert wurde.

Tabelle 2: SNPs und Deletionen im Arkeon-Genom im Vergleich zu

DSM 2133 (Tübinger Sequenzierung)

a U hate Tyan] em Position im Länge : säure- : Nukleotidänderung : Änderun ; Polymorphie-Typ : effekt häufiskeit Anmerkungen Arkeon-Genom ; änderung : : 8 : 8 NT N EEE BE 587% > N Tritt zwischen Genen auf - wahrscheinlich 454.963 18 * TCTTTCCATGGTTEGATE : ; Deletion : 67 9% zwischen den TATA-Boxen, wahrscheinlich : : ; : 7 minimale Auswirkungen auf die Expression 491.708 1 GSX "SNP (Transition) 96,50% Stumm ; ; : i Deletion 87.4% -> Einzelcodon-Deletion, 15 AA vom Ende des 1.494.011 3 : A-> : (TGC)3 -> (TGC)2 : GCA -> ; (Tandemwiederh : Deletion 89 % Gens (Atmungskettenkomplex I, Untereinheit ; : : ; olung) ; a 1) 427.099 1 : : 7 : ; Deletion © Frame Shift 95.90% Möglicher Frameshift bei 1/3 von hdrB, was ) : : ; ; ; 7A zu einem frühen Stopp-Codon führt Potenzieller Frameshift im letzten „1/4 des ; ; ; { ; Proteins, ändert die Sequenz und führt zu 1.146.087 1 : : -C : : Deleti IF Shift 93,50 % ) ; ; : ; SIEHON : Fame SA A einem leicht frühen Stop-Codon im Protein der Transglutaminase-Familie ; ; : i : 94.0% -> Potenzieller Frameshift in den ersten -1/4 des 1.222.672 2 ; ; -TT ; ; Deletion Frame Shift 99 9% Proteins, was zu einem frühen Stop-Codon

führt

: : : ; ; Potentieller Frameshift 1/2 Weg durch 1.343.294 1 : : -T : ; Deletion : Frame Shift 94,30 % Protein, führt zu frühem Stop-Codon (DUF11; ; : ; ; Domänen-enthaltendes Protein)

Potenzieller Frameshift im letzten 1/4 des

; ; ; i . ; . Proteins, was zu einem frühen Stopp-Codon 1.354.592 1 : : -A : ; Deleti UF Shift 90,90 % : : : ; CIEHON ; Fame SM 70 führt (Klasse | SAM-abhängige DNAMethyltransferase) : : 3 TAC-> i a ; . 903.826 1 : C->T 5 54T SNP (Transition) : Keine 99,80 % Stumm 1.169.849 1 ; G->A i GGG-> | SNP (Transition) ; Keine 95,50 % Stumm : : PL GGA :

SNP (Transition) : Substitution 100,00 % ORC1-Typ DNA-Replikationsprotein Cdc6-1

282.089 1.3 G>R C->T : ve G ? SNP (Transition) : Substitution 100,00 % Kobalt-ECF-Transporter T-Komponente CbiQ : : i CAC-> | u : nn - . . 389.110 1 : H->Y G->A ; TAC 1 SNP (Transition) : Substitution 97,60 % 3H-domänenhaltiges Protein ET EA N a 507.380 1 : L->P : A->G : CCA 1 SNP (Transition) ; Substitution 92,80 % MFS-Transporter : : i GTC-> SNP : in rn 577.283 105 V>L C->G So cte (Transversion) ; Substitution 33,50 % Homoisocitrat-Dehydrogenase 652.060 1 PL CT ; CCA -> ; SNP (Transition) ; Substitution 95.00% GTP-abhängiges Dephospho-CoA-Kinase. ; ; ii CTA : ’ Familie-Protein : : i CCG-> | u : nn 2 .

652.762 1 P->L C->T 5 c1ie ; SNP (Transition) : Substitution 97,50 % Argininosuccinatlyase (ASL) TTETNUUNTENTTTNNTENUUNUNUU EU ACEI> mem U Coenzym F420 Hydrogenase/Dehydrogenase, 661.870 1 : T->A : T->C : ; SNP (T ti : Substituti 96,50 % . . . N

; ; ai GCC (Transition) : UDSEEUMON ) beta-Untereinheit C-terminale Domäne : : i AGG-> | N : nn nn . 833.823 1 ; R->K C->T © AG SNP (Transition) : Substitution 97,50 % ATP-abhängige DNA-Helikase 965.067 1 ; E->K G->A : ; SNP (Transition) : Substitution 97,50 % hypothetisches Protein A EUTIN NUN GGT IS UT ee 1.027.633 1 i G->D : C->T : GAT i SNP (Transition) : Substitution 100,00 % hypothetisches Protein : : i GAC-> i LG nn N 1.182.802 1 1 D->N : C->T ; AAC ; SNP (Transition) : Substitution 99,80 % Transkriptionsinitiationsfaktor IIB : : : -> : 8 _ 1.204.471 1° 1>M A->G ; ATA-> NP (Transition) : Substitution | 99,90% Formylmethanofuran-Dehydrogenase : ; ; ATG ; : Untereinheit B 1.253.160 1 H->Y G->A : CAT -> ; SNP (Transition) : Substitution 94,10 % Lactaldehyd-Dehydrogenase

; ; ; PATE SNP ; Sees al Protein der AA X Ende pentd ae 1.441.536 2° 1 1 M>R i A->C 5 ; . Substitution 97,50% © YP 8 PSP | ; : ; AGG 2? (Transversion) i ; | Familie

Phänotypischer Vergleich

Die Wachstumskurve von DSM 2133 und dem Arkeon-Stamm variierte bis auf den Zeitpunkt 1 um 16,5 h nicht. Danach war das Wachstumsverhalten relativ ähnlich. Da die Aminosäuresekretion in Closed-Batch-Experimenten einer linearen Korrelation zur optischen Dichte folgt. Alle Proben wurden über einen Koeffizienten auf die mittlere optische Dichte pro

Zeitpunkt eingestellt.

Die Aminosäureproduktion durch DSM 34858 wurde mit der Aminosäureproduktion durch DSM 2133 verglichen. Die Prolinproduktionsrate und ihr Anteil an den Gesamtaminosäuren

war für DSM 34858 signifikant niedriger (siehe Fig. 1).

Umgekehrt war die Glycinproduktionsrate und ihr Anteil an den Gesamtaminosäuren für DSM 34858 signifikant höher (siehe Fig. 4).

Während für Glycin keine vermeintliche genetische Grundlage für diesen Unterschied sofort identifiziert wurde, war dies für Prolin anders, da eine Aminosäuresubstitution im Enzym ASL (das an der Argininbiosynthese beteiligt ist, die eng mit der Prolinbiosynthese verbunden ist) gefunden wurde. Siehe Fig. 2 und 3.

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Claims (10)

ANSPRÜCHE

1. Stamm von Methanothermobacter mit einer Prolinproduktionsrate, die niedriger ist als die Prolinproduktionsrate von Methanothermobacter marburgensis, hinterlegt bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) unter der Hinterlegungsnummer DSM 2133 (Methanothermobacter marburgensis DSM 2133) und/oder mit einer Glycinproduktionsrate, die höher ist als die Glycinproduktionsrate von Methanothermobacter marburgensis DSM 2133.

2. Stamm nach Anspruch 1, der eine Argininosuccinatlyase (ASL) mit einem Aminosäurerest 51, ausgewählt aus Leucin, Isoleucin,

Valin und Alanin, aufweist.

3. Stamm nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei es sich bei

dem Aminosäurerest 51 von ASL um Leucin oder Isoleucin handelt.

4, Stamm nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Stamm von Methanothermobacter marburgensis, Methanothermobacter defluvii, Methanothermobacter wolfeii, Methanothermobacter thermautotrophicus, Methanothermobacter crinale, Methanothermobacter thermoflexus, Methanothermobacter thermophilus, Methanothermobacter sp. CaT2, Methanothermobacter sp. DP, Methanothermobacter sp. KEPCO-1, Methanothermobacter sp. THM-1 oder Methanothermobacter tenebrarum ist; bevorzugt Methanothermobacter marburgensis, Methanothermobacter defluvii, Methanothermobacter wolfeii, Methanothermobacter thermautotrophicus, Methanothermobacter crinale, Methanothermobacter thermoflexus, Methanothermobacter thermophilus oder Methanothermobacter tenebrarum; insbesondere Methanothermobacter marburgensis, Methanothermobacter defluvii, Methanothermobacter wolfeii, Methanothermobacter

thermautotrophicus oder Methanothermobacter tenebrarum.

5. Stamm nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Stamm eine ASL aufweist, die eine Sequenz mit mindestens 80 %, bevorzugt

mindestens 85 %, bevorzugter mindestens 90 %, noch bevorzugter

Q

mindestens 95 % oder sogar mindestens 97,5 %, noch bevorzugter

Q

mindestens 98 % oder sogar mindestens 99 % Identität,

Q Q

insbesondere mindestens 99,5 % oder sogar mindestens 99,75 %

Identität zu der gesamten durch SEO ID NO: 1 identifizierten Sequenz umfasst, mit der Maßgabe, dass es sich bei dem Aminosäurerest 51 um Leucin, Isoleucin, Valin oder Alanin handelt.

6. Stamm nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Stamm ein ASL-Gen aufweist, das eine Sequenz mit mindestens 70 %, bevorzugt mindestens 75 %, bevorzugter mindestens 80 %, noch bevorzugter mindestens 85 % oder sogar mindestens 90 %, noch bevorzugter mindestens 95 % oder sogar mindestens 97,5 % Identität, insbesondere mindestens 99 % oder sogar mindestens 99,5 % Identität zu der gesamten durch SEOQ ID NO: 2 identifizierten Sequenz umfasst, mit der Maßgabe, dass das ASLGen für eine ASL mit dem Aminosäurerest 51 Leucin, Isoleucin,

Valin oder Alanin kodiert.

7. Stamm von Methanothermobacter marburgensis, der am 21. November 2023 bei der DSMZ unter der Hinterlegungsnummer DSM 34858 hinterlegt wurde.

8. Stamm nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die 165 ribosomale RNA des Stammes die durch SEQ ID NO: 3 identifizierte

Sequenz aufweist.

9. Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren durch Fermentation in einem Bioreaktor, wobei der Bioreaktor Zellen des Stammes nach einem der Ansprüche 1 bis 8 in einer Fermentationsbrühe

umfasst, wobei das Verfahren mindestens die Schritte umfasst

- Zuführen einer gasförmigen Kohlenstoffquelle, die Kohlendioxid und/oder Kohlenmonoxid umfasst, einer Stickstoffquelle und bevorzugt einer Schwefelquelle zu dem Bioreaktor unter solchen Bedingungen, dass die Zellen die

Aminosäuren produzieren; und

- Ernten mindestens eines Teils der Aminosäuren aus der

Fermentationsbrühe.

10. Verwendung des Stammes nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur

Herstellung von Aminosäuren, insbesondere Glyvcin.