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Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die genetische Diagnose von Hämochromatose sowie Sonden für die genetische Diagnose von Hämochromatose.
Hereditäre Hämochromatose (HH) /11/ ist eine sehr häufige autosomal rezessive Erkran- kung, welche durch eine Störung im Eisenstoffwechsel des menschlichen Körpers, die zu einer Eisenüberladung führt, gekennzeichnet ist. Das überschüssige Eisen wird in ver- schiedenen Organen in erster Linie in der Leber, im Herz und in der Bauchspeicheldrüse abgelagert und verursacht irreversible Schäden und Krankheiten, wie Leberzirrhose, Dia- betes, Arthritis, Kardiomyopathie und vorzeitigen Tod. Bei frühzeitiger Diagnose und Be- handlung mit therapeutischer Phlebotomie kann dem Organschaden vollständig vorge- beugt werden und die Lebenserwartung der Patienten ist normal.
Da klinische Symptome von Hämochromatose oft nicht vor einem Alter von 40, 50 oder älter auftreten, wenn irreversible Schäden der Organe bereits vorhanden sind, wird eine präsymptomatische Diagnose bevorzugt.
Eine Anzahl von Punktmutationen in einem neuen MHC Klasse 1-ähnlichem Gen, genannt HFE (locus 6p), wurde identifiziert und mit HH in Verbindung gebracht /1,7,9/. Dieses Gen kodiert ein Protein, das mit einem Trasferrinrezeptor (TFRC) zusammenwirkt und negativ die zelluläre Eisenaufnahme aus Transferrin beeinflusst /36/. Das HFE-Gen wurde 1996 identifiziert und ursprünglich wurden zwei Mutationen C282Y und H63D beschrieben /1/.
Diese beiden Mutationen werden derzeit für die genetische Diagnose von Hämochromatose verwendet.
H63D ist eine C-G-Mutation im Codon 63, die die Aminosäure 63 von Histidin in Asparaginsäure verwandelt. Da die Häufigkeit dieser Mutation bei der allgemeinen Bevölkerung hoch ist, ist ihre Rolle in Bezug auf die Diagnose von Hämochromatose unsicher.
Ein weitaus besseres Kriterium für die Diagnose von Hämochromatose ist die C282YMutation, die in 65 bis 95% der betroffenen Patienten gefunden wird. Sie ist eine G#A Mutation am Nukleotid 845 der HFE cDNA-Sequenz, die die Aminosäure 282 von Cystein in Tyrosin verwandelt. Die meisten HH-Patienten sind homozygot für C282Y /1, 13, 14, 15/. Unter den HH-Untersuchten sind etwa 5 bis 7% der Fälle C282Y/H63D-gemischt heterozygot /1, 16/, und weisen ebenso wie die seltenen H63D-homozygoten Fälle meist ei-
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ne abgeschwächte Form der Hämochromatose auf /17/. Ein geringer Anteil der Fälle mit
HH-Phänotyp ist heterozygot für C282Y oder H63D oder weder für C282Y noch für H63D.
Diese Fälle scheinen in Südeuropa häufiger zu sein als in Nordeuropa /18, 19/. D. h., der
Prozentsatz der Hämochromatosepatienten, die keine C282Y-Mutation aufweisen, variiert und ist z. B. in Italien höher als in nordeuropäischen Ländern. In einer kolaborativen Studie an 188 italienischen Patienten mit HH-Phänotyp konnte in 28% auf einem der Chromoso- men keine Mutation identifiziert werden /19/. Das Vorliegen von anderen HFE-Mutationen oder anderen 6p-assoziierten Mutationen oder aber das Vorhandensein einer anderen
Form genetisch bedingter Eisenüberladung, welche nicht auf Chromosom 6 lokalisiert sind, wurde in manchen dieser Fälle vermutet /19, 20,21/.
Drei neue HFE-Mutationen wurden heterozygot und gemeinsam mit C282Y in einzelnen Fällen mit klassischer HH ge- funden : eine Splicemutation (IVS3 + 1G#T) verbunden mit dem obligaten Ausfall von
Exon 3 /22/ und zwei Missensemutationen (1105T und G93R) in der a1-Domäne, welche vermutlich die Bindung des HFE-Proteins an den Transferrinrezeptor beeinflussen /23/.
Die Missensemutation S65C wurde gehäuft auf sowohl C282Y als auch H63D negativem
HH-Chromosomen lokalisiert gefunden und es wird vermutet, dass S65C im Zusammen- hang mit C282Y oder H63D die Ursache für eine weitere milde Form von HH ist /9/. Weite- re Missensemutationen wurden beschrieben, aber ihre Bedeutung für die Pathogenese von HH ist nicht bekannt /7/.
Während man beobachten kann, dass die Mehrheit der HH-Patienten kaukasischen Typs homozygot für C282Y ist und dies als Ursache für die Krankheit gut erkennbar ist, ist der diagnostische Wert anderer HFE-Mutationen noch nicht bestimmt. Es ist daher von be- sonderem Interesse, krankheitsverursachende Mutationen in jenen HH-Patienten zu bestimmen, die nicht für C282Y homozygot sind.
Es ist daher wichtig, jene weiteren genetischen Ursachen im HFE-Gen oder anderen Ge- nen, abgesehen von den bekannten Mutationen, zu finden, die zu einer Eisenüberladung in den Patienten führen können.
Daher ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, weitere Möglichkeiten für die Diagnose genetischer Ursachen von Hämochromatose zu finden.
Die Aufgabe wird dadurch gelöst, dass eine biologische Probe auf Vorliegen einer G#A Mutation am Nukleotid 506 und/oder einer G#A Mutation am Nukleotid 502 der HFE
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cDNA-Sequenz untersucht wird. Solche Mutationen wurden bei Untersuchungen von fünf nicht verwandten italienischen Patienten, die heterozygot für C282Y waren, mit klassi- schem Hämochromatose-Phänotyp gefunden. Die Mutationen (nt 506 G#A oder W169X und nt 502 G#T oder E168X) wurden in Exon 3 des C282Y negativen Chromosoms ge- funden.
Die G#A Mutation am Nukleotid 506 bewirkt die Umwandlung der entsprechen- den Aminosäure 169 von Tryptophan in ein Stopcodon (W169X), sowie die G#T Mutation am Nukleotid 502 eine Umwandlung der entsprechenden Aminosäure 168 von Glutamin- säure in ein Stopcodon (E168X) bewirkt.
Die Aufgabe wird ebenso gelöst, indem eine biologische Probe auf Vorliegen einer G#C
Mutation am Nukleotid 502 der HFE cDNA-Sequenz untersucht wird. Diese Exon 3 Muta- tion (nt 502 G#C oder E168Q) wurde bei einer 79 Jahre alten weissen Frau aus Südafrika identifiziert. Sie war auch für die H63D Mutation heterozygot und ihr Serumferritin war zum Zeitpunkt der Untersuchung leicht erhöht (242 ng/ml; ref. Werte : 12-119ng/ml). Sie zeigte keine nennenswerten klinischen Symptome, hatte aber eine Familiengeschichte, der so- wohl Herkzkrankheiten als auch verschiedene Krebsarten entnehmbar waren. Die E168Q
Mutation wurde anfänglich durch Single-strand-conformation-polymorphism (SSCP)-
Analyse /7/ identifiziert und anschliessend durch DNA Sequenzieren bestätigt.
Die G#C
Mutation am Nukleotid 502 bewirkt eine Umwandlung der entsprechenden Aminosäure
168 von Glutaminsäure in Glutamin (E168Q).
Die Aufgabe wird weiters gelöst, indem eine biologische Probe auf Vorliegen einer C#G
Mutation am Nukleotid 750 der TFR2 cDNA-Sequenz untersucht wird. Diese Mutation in
Exon 6 (nt 750 C#G oder Y250X) wurde in sechs betroffenen Patienten von zwei nicht verwandten Familien sizilianischen Ursprungs identifiziert. Alle von ihnen waren homozygot für Y250X. Die C#G Mutation an der Position 750 der cDNA-Sequenz ersetzt Tyrosin mit einem Stopcodon bei der Aminosäure 250 (Y250X). Die Position dieser Mutation liegt in 7q22. Und dieser Locus wird in Folge HFE3 genannt (HFE: Locus 6p; HFE2: Locus 1q juvenile Hämochromatose /26/).
Die Rolle des TFR2-Gens im Eisenstoffwechsel ist schwer verständlich. Dem TFR2-Gen fehlen Eisenzugangselemente und es zeigt nicht die eisenabhängigen Posttranskriptionsregeln, die bei anderen Schlüsselgenen des Eisenstoffwechsels vorhanden sind. Es wurden zwei Transkripte identifiziert /37/. Das a-Transkript ist ein Transmembranprotein, das hauptsächlich in der Leber exprimiert wird /37/. Das TFR2 #-Transkript ist das Resultat ei-
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nes alternativen Spllcings; sein Proteinprodukt kann ein intrazelluläres Protein und daher weit verbreitet sein, und wird bei niedrigen Niveaus exprimiert. Die Y250X Mutation befin- det sich in einer Region, die beide Transkripte enthalten.
Ein Phänotyp mit Eisenüberla- dung in Kombination mit dem Nichtvorliegen eines funktionellen Gens lässt vermuten, dass
TFR2 eher in der Eisenregulierung (wie bei HFE) als bei der Eisenaufnahme beteiligt ist.
Es ist auch unwahrscheinlich, dass TFR2 bei der Eisenabgabe beteiligt ist, da die unter- suchten Patienten eine Eisenerschöpfung durch Phlebotomien erreichten, so dass über- schüssiges Eisen von der Leber mobilisiert werden konnte. Obwohl TFR2 in der Erythroid
K562 Zelllinie hoch exprimiert wird /37/, zeigte keiner der Patienten Erythozytabnormitä- ten. Vielmehr wurden Langzeitphlebotomien ohne Entwicklung von Anämien toleriert.
Die Aufgabe wird weiters dadurch gelöst, dass eine biologische Probe auf Vorliegen einer T#A Mutation am Nukleotid 515 der TFR2 cDNA-Sequenz untersucht wird. Diese Muta- tion in Exon 4 (nt 515 T#A oder M172K) wurde in einem einzigen Patienten mit non-HFE
Hämochromatose gefunden, der aus Mittelitalien (Region Lazio) stammt. Die T-- > A Muta- tion an der Position 515 der cDNA-Sequenz resultiert in einer Lysin/Methionin-Substitution bei Aminosäure 172 (M172K).
Die Aufgabe wird weiters dadurch gelöst, dass eine biologische Probe auf Vorliegen einer
Frameshift-Mutation durch Einbringen eines Cytosins in einen PolyC-Trakt bei den
Nukleotiden 84 bis 88 der TFR2 cDNA-Sequenz untersucht wird. Diese Mutation in Exon 2 (84-88 insC oder E60X) wurde in sechs betroffenen Patienten eine grossen Familie aus Campania in der Region südlich von Neapel identifiziert. Die Cytosineinbringung in den PolyC-Trakt an den Positionen 84 bis 88 der TFR2 cDNA-Sequenz resultiert in einem Frameshift, dem ein frühzeitiges Stopcodon bei Aminosäure 60 (E60X) folgt.
Vorzugsweise wird die biologische Probe zusätzlich auf Vorhandensein einer G#A Muta- tion am Nukleotid 845 und/oder einer C#G Mutation am Nukleotid 187 der HFE cDNA- Sequenz untersucht, so dass eine Diagnose von Hämochromatose stattfinden kann, selbst wenn nur eine dieser bekannten Mutationen gefunden wird.
Die Aufgabe wird weiters dadurch gelöst, dass eine biologische Probe auf Vorliegen von Nukleinsäuren übeprüft wird, die für HFE-Produkte kodieren mit einer Substitution von Va- lin mit Methionin an der Aminosäure 53 oder 59 (V53M, V59M) und/oder von Histidin mit Asparginsäure an der Aminosäure 63 (H63D) und/oder von Serin mit Cystein an der Aminosäure 65 (S65C) und/oder von Glutamin mit Histidin an der Aminosäure 127
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nosäure 65 (S65C) und/oder von Glutamin mit Histidin an der Aminosäure 127 (Q127H) und/oder von Glutaminsäure mit Glutamin oder einem Stopcodon an der Aminosäure 168 (E168Q, E168X) und/pder von Tryptophan mit einem Stopcodon an der Aminosäure 169 (W169X) und/oder von Cystein mit Tyrosin an der Aminosäure 282 (C282Y) und/oder von
Glutamin mit Prolin an der Aminosäure 283 (Q283P)
oder dass die biologische Probe auf das Vorliegen eines HFE-Genproduktes mit einer Substitution von Valin mit Methionin an der Aminosäure 53 oder 59 (V53M, V59M) und/oder von Histidin mit Asparginsäure an der
Aminosäure 63 (H63D) und/oder von Serin mit Cystein an der Aminosäure 65 (S65C) und/oder von Glutamin mit Histidin an der Aminosäure 127 (Q127H) und/oder von Gluta- minsäure mit Glutamin oder einem Stopcodon an der Aminosäure 168 (E168Q, E168X) und/oder von Tryptophan mit einem Stopcodon an der Aminosäure 169 (W169X) und/oder von Cystein mit Tyrosin an der Aminosäure 282 (C282Y) und/oder von Glutamin mit Prolin an der Aminosäure 283 (Q283P) untersucht wird.
Die Aufgabe wird weiters dadurch gelöst, dass eine biologische Probe auf Vorliegen einer
Nukleinsäuren untersucht wird, die für TFR2-Produkte kodieren mit einer Substitution von
Glutaminsäure mit einem Stopcodon an der Aminosäure 60 (E60X) und/oder von Methio- nin mit Lysin an der Aminosäure 172 (M172K) und/oder von Tyrosin mit einem Stopcodon an der Aminosäure 250 (Y250X) oder dass eine biologische Probe auf Vorliegen eines TFR2-Genproduktes mit einer Substitution von Glutaminsäure mit einem Stopcodon an der Aminosäure 60 (E60X) und/oder von Methionin mit Lysin an einer Aminosäure 172 (M172K) und/oder von Tyrosin mit einem Stopcodon an der Aminosäure 250 (Y250X) un- tersucht wird.
Die Punktmutationen, welche aus dem Stand der Technik bekannt sind, und jene gemäss der vorliegenden Erfindung, die oben beschrieben sind, und die Frameshift-Mutation der vorliegenden Erfindung, wie oben beschrieben, verursachen bestimmte Aminosäurensub- stitutionen und wurden bei Patienten, die durch Hämochromatose betroffen sind, gefun- den. Die oben beschriebenen Aminosäuresubstitutionen können jedoch auch durch Muta- tionen verursacht werden, die von den bekannten Mutationen oder den Mutationen ent- sprechend der Erfindung verschieden sind und führen dennoch zu einer Erkrankung oder einem Trägerstatus.
Die Untersuchung einer biologischen Probe auf das Vorhandensein von einer oder mehreren der obigen Aminosäuresubstitutionen gibt daher die Information, ob der Patient, von dem die biologische Probe stammt, durch Hämochromatose betroffen ist oder ein Träger von Hämochromatose ist.
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Als biologische Probe kann Blut, Gewebsbiopsie, Mundenhöhlenabstrich, Fruchtwasser oder dgl. verwendet werden, wobei die biologische Probe je nach Auswahl des an sich bekannten Untersuchungsverfahrens ebenfalls bekannten Vorbehandlungen unterworfen wird.
Wenn die biologische Probe auch auf das Vorhandensein von Nukleinsäuren untersucht wird, die die genannten Mutationen oder Aminosäuresubstitutionen in ihrem HFE-Gen oder ihrem TFR2-Gen oder entsprechenden Gen-Produkten nicht aufweist, kann nachge- wiesen werden, ob die Mutationen heterozygot oder homozygot vorliegen.
Die Untersuchung kann in bekannter Weise durch Sequenzanalyse der Nukleinsäuren, die aus der biologischen Probe erhalten wurden, durchgeführt werden.
Oder die Nukleinsäuren der biologischen Probe werden in Kontakt mit zumindest einer
Sonde gebracht, die fähig ist, mit einem Bereich der Nukleinsäuren entsprechend einem
Bereich der HFE cDNA-Sequenz zu hybridisieren, der das Nukleotid 506 enthält, wenn eine G#A Mutation an der Position 506 der HFE cDNA-Sequenz existiert und/oder der das Nukleotid 502 enthält, wenn eine G#T Mutation an der Position 502 der HFE cDNASequenz existiert und/oder der das Nukleotid 502 enthält, wenn eine G#C Mutation an der Position 502 des HFE Gens existiert und/oder die fähig ist, mit einem Bereich der Nukleinsäuren entsprechend einem Bereich der TFR2 cDNA-Sequenz zu hybridisieren, enthaltend Nukleotid 750, wenn eine C-+G Mutation an Position 750 der TFR2 cDNASequenz existiert und/oder enthaltend Nukleotid 515,
wenn eine T#A Mutation an Position 515 der TFR2 cDNA-Sequenz existiert und/oder enthaltend die Nukleotide 84 bis 88, wenn eine Frameshift-Mutation durch Einbringung eines Cytosins in einen PolyC-Trakt bei den Nukleotiden 84 bis 88 der TFR2 cDNA-Sequenz existiert und es wird eine Untersuchung durchgeführt, ob die entsprechenden Hybridisierungsprodukte gebildet wurden. Von der biologischen Probe werden Nukleinsäuren (genomische DNA und/oder RNA, getrennt oder als Mischung) zugänglich gemacht, indem entsprechende Verfahren des Standes der Technik verwendet werden.
Wenn die biologische Probe auch auf das Vorliegen der bekannten C282Y und/oder H63D Mutationen untersucht wird, werden die Nukleinsäuren der biologischen Probe auch mit zumindest einer weiteren Sonde in Kontakt gebracht, die fähig ist, mit einem Bereich der
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Nukleinsäuren entsprechend einem Bereich der HFE cDNA-Sequenz zu hybridisieren, enthaltend Nukleotid 845, wenn eine G#A Mutation am Nukleotid 845 existiert und/oder enthaltend Nukleotid 187 , wenn eine C#G Mutation am Nukleotid 187 der HFE cDNA-
Sequenz existiert und es wir eine Untersuchung durchgeführt, ob entsprechende Hybridi- sierungsprodukte entstanden sind.
Um zu unterscheiden, ob eine oder mehrere Mutationen heterozygot oder homozygot vor- liegen, werden die Nukleinsäuren der Proben vorzugsweise auch in Kontakt mit zumindest einer weiteren Sonde gebracht, die fähig ist, mit einem Bereich der Nukleinsäuren zu hybridisieren, die einem Bereich der HFE oder TFR2 cDNA-Sequenz entspricht, die zu- mindest eine der genannten Nukleotide enthält, wenn keine Mutation vorliegt und es wird eine Untersuchung durchgeführt, ob entsprechende Hybridisierungsprodukte erzeugt wur- den.
Derzeit wird eine Vielzahl von Verfahren zur Analyse von Mutationen verwendet, unter an- derem restriction fragment length polymorphism (RFLP), PCR mit sequence-specific pri- mers (PCR-SSP), allelespecific oligonucleotide hybridization, single-strand conformation polymorphism (SSCP), denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), oligonucleotide ligation assay (OLA), Echtzeitfluoreszenz PCR, und DNA-Sequenzierung /1, 2,3, 4,5, 6,
7, 8, 9/. Wenn RNA untersucht wird, kann das z.B. mittels sogenannten "NASBA" erfolgen oder es kann auch RNA mittels reverser Transkription in cDNA umgeschrieben werden, dann mit PCR amplifiziert und anschliessend charakterisiert werden. All diese bekannten Analyseverfahren können für das erfindungsgemässe Diagnoseverfahren herangezogen werden.
Die erfindungsgemässe Sonde zur Diagnose von Hämochromatose anhand von Mutatio- nen im HFE-Gen ist fähig, mit Nukleinsäuren einer biologischen Probe in einem Bereich zu hybridisieren, der dem Bereich der HFE cDNA-Sequenz entspricht, enthaltend Nukleo- tid 506, wenn eine G#A Mutation an der Position 506 der HFE cDNA-Sequenz existiert und/oder enthaltend Nukleotid 502, wenn eine F#T Mutation an der Position 502 der HFE cDNA-Sequenz existiert und/oder enthaltend Nukleotid 502, wenn eine G#C Mutation an der Position 502 der HFE cDNA-Sequenz existiert.
Die erfindungsgemässe Sonde für die Diagnose von Hämochromatose anhand von Mutati- onen im TFR2 Gen ist fähig mit Nukleinsäuren einer biologischen Probe in einem Bereich
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entsprechend einem Bereich der TFR2 cDNA-Sequenz zu hybridisieren, enthaltend
Nukleotid 750, wenn eine C#G Mutation an der Position 750 der TFR2 cDNA-Sequenz existiert und/oder enthaltend Nukleotid 515, wenn eine T#A Mutation an der Position 515 der TFR2 cDNA-Sequenz existiert und/oder enthaltend die Nukleotide 84 bis 88, wenn ei- ne Frameshift-Mutation durch Einbringung eines Cytosin in einen PolyC-Trakt bei den
Nukleotiden 84 bis 88 der TFR2 cDNA-Sequenz existiert.
Die folgenden Beispiele beschreiben Ausführungsmöglichkeiten für das erfindungsgemä- #e Verfahren zur Diagnose von Hämochromatose. Die beilegenden Zeichnungen helfen, die Beispiele zu illustrieren. Die grafische Darstellung der Fig. 1 zeigt einige Farbreakti- onsmuster, die unter Verwendung von reverser Hybridisierung, wie im Beispiel 2 be- schrieben, mit DNA-Proben erhältlich sind, die verschiedene mutierte und wild-type HFE oder TFR2 Allele tragen. Die Fig. 2a, 2b, 2c und 2d zeigen die Stammbäume der vier ent- sprechend Beispiel 4 in Hinblick auf HFE3 (Y250X, M172K, E60X) untersuchten Familien (gefüllte Symbole betroffen, nichtgefüllte Symbole nicht betroffen).
Die Fig. 3a, 3b und 3c zeigen Sequenzchromatografien von Sequenzen des TFR2 Gens in Exon 2 im Bereich der von der E60X Mutation stammenden C-Einbringung, in Exon 4 im Bereich der M172K
Mutation an Position 515 und in Exon 6 im Bereich der Y250X Mutation an Position 750.
Fig. 4 zeigt eine schematische Darstellung der TFR2 Struktur in der 5'Region des Gens.
BEISPIEL 1: DNA Isolation und Amplifikation: DNA wurde aus antikoaguliertem Blut unter Verwendung herkömmlicher Extraktionsver- fahren/10/ oder kommerziell erhältlichen Reagenzien (GenXtract DNA extraction System, ViennaLab) isoliert. Die Exon 3 Sequenzen des HFE Gens wurden in einer PCR Reaktion unter Verwendung der Primer 5'-GGA TTG GAG AGC AGC AGA AC-3'und 5'-AAA CTC CAA CCA GGG ATT CC-3' amplifiziert. Jeder Primer wurde mit einer Endkonzentration von 0,4 uM in 1xPCR Puffer enthaltend 1,5 mM Mg2+, 200 uM dNTPs (Epicentre, Madi- son WI) und 0,02 U/ l AmpliTaq DNA Polymerase (PE Biosystems, Foster City, CA) ver- wendet. Ein Thermozyklierprogramm mit 30 Zyklen {94 C für 15s, 58 C für 30s und 72 C für 30s) wurde durchgeführt mit dem GeneAmp PCR System 2400 (PE Biosystems).
Sequenzieren : Die PCR Produkte wurden mit "Centricon-100" Säulen entsprechend den Empfehlungen des Herstellers gereinigt. Die amplifizierte und gereinigte DNA wurde mit UV-
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Spektrofotometrie quantifiziert und anschliessend sequenziert unter strikter Einhaltung des
Protokolles aus "BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit - with Ampli-
Tag DNA Polymerase, FS" (PE Applied Biosystems) für die ABI Prism instrumentation (PE
Applied Biosystems).
BEISPIEL 2 :
Im folgenden wird über die erfolgreiche Anwendung der reversen Hybridisierung berichtet, um einen Screening-Test zum Auffinden einiger bekannter Mutationen und einiger der
HFE und TFR2 Punktmutationen sowie der TFR2 Frameshift-Mutation gemäss der Erfin- dung zu schaffen. Der Test basiert auf Multiplex-DNA-Amplifikation und ist ein Fertig- membran-Teststreifen, der Oligonukleotidsonden für jede Wild-type- und Mutationsallele enthält, die als eine Reihe paralleler Linien immobilisiert sind. Der Test ist schnell, einfach durchzuführen und der Automatisation an kommerziell erhältlichen Ausrüstungen zugäng- lich und der Teststreifen kann durch Hinzufügen neuer Sonden einfach an die zunehmen- de Anzahl von Mutationen angepasst werden.
DNA Isolation und Amplifikation:
DNA wurde aus antikoaguliertem Blut mittels Standardexttraktionsmethoden /10/ oder unter Verwendung kommerziell erhältlicher Reagenzien (GenXtract DNA extraction system, ViennaLab) isoliert. HFE Gensequenzen aus den Exons 2,3 und 4 und TFR2 Gensequenzen aus den Exons 2,4 und 6 wurden in einer einzelnen Multiplex PCR Reaktion mit 5'-biotinylierten Primem (/1,31, 32/; Tabelle 3) amplifiziert. Jeder Primer wurde in einer Endkonzentration von 0,4 uM in 1xPCR Puffer zuzüglich 1,5 mM Mg2+, 200 uM dNTPs (Epicentre, Madison WI), und 0,02 U/ l AmpliTag DNA Polymerase (PE Biosystems, Foster City, CA) eingesetzt. Ein Thermozyklierprogramm von 30 Zyklen (94 C für 15s, 58 C für 30s und 72 C für 30s) wurde auf einem GeneAmp PCR System 2400 (PE Biosystems) durchgeführt.
Herstellung der Teststreifen: Das Prinzip des enzymatischen Verlängems (tailing) und Immobilisierens von sequenzspezifischen Hybridisierungssonden wurde bereits früher beschrieben /34/. Sonden (16- 24 Nukleotide lang), die spezifisch entweder für das wild-type oder das mutierte Allel jeder Mutation sind, wurden aus HFE und TFR2 Datenbanksequenzen (GenBank Zugangsnummern : HFE-Z92910, TFR2-AF067864) ausgewählt und mittels eines Phosphoramiditstandardverfahrens synthetisiert. Ein 3'-poly(dT)-Schwanz (tail) (300 bis 500
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Nukleotide) wurde enzymatisch durch Inkubation der Oligonukleotide (200 pmol) in Ge- genwart von 60 U terminaler Deoxynukleotidyl-Transferase (Amersham Pharmacia, Bu- ckinghamshire, UK) und 150 nmol dTTP (Epicentre) für 8h bei 37 C angehängt.
Die Reak- tion wurde durch Zugabe von 10 mM EDTA beendet und die Tailingeffizienz mittels Aga- rose-Gelelektrophorese überprüft. Poly(dT)-getailte Sonden wurden mittels einer speziell angefertigten Schlitzapparatur als parallele Linien von 1 mm Breite auf Nitrozellulose-
Membranblätter (Whatman, Maidstone, UK) aufgetragen, getrocknet und über Nacht bei
60 C fixiert (Backen). Ein 5'-biotinyliertes Kontroll-Oligonukleotid wurde zur Überprüfung der Detektionsreagenzien aufgenommen. Die fertigen Membranblätter wurden schliesslich in 3 mm breite Fertigteststreifen geschnitten.
Reverse Hybridisierung und Detektion:
Die gesamte Hybridisierung und Detektion wurde in individuellen Vertiefungen einer dünnwandigen Plastik-Inkubationswanne (Bio-Rad, Hercules, CA) durchgeführt. Gleiche
Volumina (10 l) an PCR-Produkt und Denaturierungslösung (400 mM NaOH, 10 mM ED-
TA) wurden gemischt und für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Das alkalische Reak- tionsgemisch wurde mit Natriumphosphatpuffer, pH 7, neutralisiert, ein Teststreifen wurde eingelegt und für 30 min bei 45 C in einem Schüttelwasserbad hybridisiert. Nach drei stringenten Waschschritten bei 45 C wurden gebundene PCR-Fragmente mittels Strepta- vidin-Alkalischer-Phosphatase und Farbsubstraten (NBT/BCIP) nachgewiesen. Im Falle einer positiven Reaktion war nach 15 min Inkubationsdauer bei Raumtemperatur eine vio- lette Färbung sichtbar.
Ergebnisse : Ein Multiplex-PCR System wurde eingerichtet, um biotinylierte DNA-Fragmente, umfas- send die Exons 2,3 und 4 des HFE Gens und die Exons 2,4 und 6 des TFR2 Gens in ei- ner einzigen Amplifikationsreaktion zu erhalten. Um mögliche Fehler beim Typisieren der C282Y Mutation aufgrund eines intronischen Polymorphismus (5569G-+A) an der Bin- dungsstelle des ursprünglichen reversen Primers von Feder et al. (1996) /1/ zu vermei- den, wurde das Exon 4 Fragment gemäss Jeffrey et al. (1999) /32/ modifiziert.
Zur Entwicklung des Revers-Hybridisierungstests wurden von Individuen, die folgende e- xonische Mutationen trugen DNA Proben gesammelt : V53M, V59M, H63D, H63H, S65C, Q127H, E168Q, E168X, W169X, C282Y, Q283P; TFR2 : E60X, M172K und Y250X (Tabelle 1)
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TABELLE 1 Linie Spezifität der Sonde Mutation Zitat
EMI11.1
<tb> 1 <SEP> (Kontrolle)
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EMI11.2
EMI11.3
<tb> 7 <SEP> nt <SEP> 381 <SEP> A#C <SEP> Exon <SEP> 3 <SEP> HFE <SEP> Q127H <SEP> Villiers <SEP> et <SEP> al.
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<tb> 8 <SEP> nt <SEP> 502 <SEP> G#C <SEP> Exon <SEP> 3 <SEP> HFE <SEP> E168Q <SEP> vorliegende <SEP> Erfindung
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<tb> 9 <SEP> nt <SEP> 502 <SEP> G#T <SEP> Exon <SEP> 3 <SEP> HFE <SEP> E168X <SEP> vorliegende <SEP> Erfindung
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<tb> 10 <SEP> nt <SEP> 506 <SEP> G#A <SEP> Exon <SEP> 3 <SEP> HFE <SEP> W169X <SEP> vorliegende <SEP> Erfindung
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<tb> 11 <SEP> nt <SEP> 845 <SEP> G#A <SEP> Exon <SEP> 4 <SEP> HFE <SEP> C282Y <SEP> Feder <SEP> et <SEP> al, <SEP> /1/
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<tb> 11 <SEP> nt <SEP> 848 <SEP> A#C <SEP> Exon <SEP> 4 <SEP> HFE <SEP> Q283P <SEP> Rubini <SEP> et <SEP> al.
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<tb> 12 <SEP> nt <SEP> 84-88insC <SEP> Exon <SEP> 2 <SEP> TFR2 <SEP> E60X <SEP> vorliegende <SEP> Erfindung
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<tb> 13 <SEP> nt <SEP> 515 <SEP> T#A <SEP> Exon <SEP> 4 <SEP> TFR2 <SEP> M172K <SEP> vorliegende <SEP> Erfindung
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<tb> 14 <SEP> nt <SEP> 750 <SEP> C#G <SEP> Exon <SEP> 6 <SEP> TFR2 <SEP> Y250X <SEP> vorliegende <SEP> Erfindung
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<tb> 15 <SEP> HFE <SEP> wild-type <SEP> codon <SEP> 53
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<tb> 16 <SEP> HFE <SEP> wild-type <SEP> codon <SEP> 59
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<tb> 17 <SEP> HFE <SEP> wild-type <SEP> codon <SEP> 63-65
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<tb> 18 <SEP> HFE <SEP> wild-type <SEP> codon <SEP> 168-169
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 19 <SEP> HFE <SEP> wild-type <SEP> codon <SEP> 282-283
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 20 <SEP> TFR2 <SEP> wild-type <SEP> codon <SEP> 60
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 21 <SEP> TFR2 <SEP> wild-type <SEP> codon <SEP> 172
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 21 <SEP> TFR2 <SEP> wild-type <SEP> codon <SEP> 250
<tb>
Eine Reihe von möglichen Sonden zwischen 16 und 24 Nukleotiden in Länge, spezifisch entweder für das wild-type oder das mutierte Allel jeder Mutation wurden aus den Gen- Bank-Sequenzen für HFE und TFR2 ausgewählt. Nach enzymatischen poly(dT)-Tailing wurden die Oligonukleotide auf eine Nitrozellulosemembran als Anordnung paralleler Li- nien aufgetragen und mittels Backen fixiert. Schliesslich wurden einzelne Teststreifen aus dem Membranblatt geschnitten.
Amplifizierungsprodukte der verschiedenen DNA-Proben, welche alle 14 Mutationen umfassten, wurden mit diesen vorläufigen Teststreifen unter identen und exakt kontrollierten Stringensbedingungen hybridisiert. Gebundene biotinylier- te Sequenzen wurden mittels Streptavidin-Enzymkonjugat und Farbreaktion nachgewie- sen. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde der endgültige Teststreifen geschaffen, indem Sonden ausgewählt wurden, die unter gleichen und standardisierten Bedingungen spezi- fisch entweder das wild-type oder das mutierte Allel erkannten. Eine biotinylierte Kontroll- sonde, welche unabhängig von der Anwesenheit hybridisierender DNA ein positives Test- ergebnis liefern sollte, wurde zur Überprüfung der Detektionsreagenzien zusätzlich aufge-
<Desc/Clms Page number 12>
nommen.
Die grafische Darstellung der Fig. 1 zeigt mögliche Farbreaktionsmuster von
DNA-Proben, die verschiedene mutierte und wild-type HFE oder TFR2 Allele tragen. Die folgenden Proben wurden verwendet:
1. keine Mutation
2. HFE:V53M heterozygot
3. HFE:V59M heterozygot
4. HFE:H63D homozygot
5. HFE :H63H 6. HFE :S65C 7. HFE:S65C homozygot 8. HFE :H63D HFE :S65C heterozygot 9. HFE :H63D +HFE:Q127H gemischt heterozygot 10. HFE :H63D +HFE:E168Q gemischt heterozygot 11. HFE :H63D HFE :W169X heterozygot 12. HFE:E168X + HFE :C282Y heterozygot
13. HFE :C282Y 14. HFE :H63D HFE :C282Y heterozygot 15. HFE :S65C HFE :C282Y heterozygot 16. HFE :C282Y +HFE:Q283P gemischt heterozygot
17. HFE :C282Y 18. TFR2 :E60X 19. TFR2:M172K heterozygot
20. TFR2 :Y250X 21.
TFR2 :Y250X 22. negative PCR-Kontrolle Die meisten der bekannten Techniken sind in ihrer Kapazität mehr als eine Mutation pro Ansatz nachzuweisen sehr beschränkt, wodurch eine umfassende genetische Analyse sehr arbeitsaufwendig werden kann. Andererseits sind informativere Methoden, wie z.B.
DNA-Sequenzierung für routinediagnostische Laboratorien mit hohem Probendurchsatz ungeeignet. Mit dem oben beschriebenen Test wurde die Technik der reversen Hybridisie- rung erfolgreich angewandt, um 14 verschiedene Mutationen (11 HFE Mutationen, 3 TFR2 Mutationen) gleichzeitig in einem einzigen Ansatz nachzuweisen. In der Vergangenheit wurde diese Methode bereits öfters zur Genotypisierung von komplexen Erbkrankheiten,
<Desc/Clms Page number 13>
wie etwa zystischer Fibrose /30/ und Thalassemie /33/ sowie infektiösen Agenzien, wie
Hepatitis C Virus/35/ verwendet.
Das Farbreaktionsmuster einer mutanten und der dazugehörigen wild-type Sonde erlaubt die Unterscheidung von drei möglichen Genotypen : Mutation liegt vor, wenn nur die wild-type Sonde gefärbt ist, in heterozygoten sind beide Signale sichtbar, während in ho- mozygot mutierten Proben ausschliesslich die mutante Sonde positiv ist. Dasselbe gilt für die Mehrzahl von gemischt heterozygoten für zwei Mutationen (Fig. 1, Linien 8 bis 12,14-
16). Das HFE Gen enthält allerdings zumindest zwei Regionen, eine davon in Exon 2 (Nukleotide 187 - 193) und die andere in Exon 3 (Nukleotide 502-506), innerhalb derer mehrere Mutationen in unmittelbarer Nachbarschaft gefunden worden waren. Da die Hybridisierungssonden in diesem Bereich mehr als eine Mutation abdecken, ist kein wild-type Signal sichtbar, wenn zwei Mutationen aus der gleichen Region (z. B.
H63D und S65C) auf unterschiedlichen Chromosomen in derselben Probe vorkommen (Fig. 1, Linie 8). Das Auftreten von zwei benachbarten Mutationen auf einem einzigen Chromosom würde wiederum zu einem anderen Muster führen, wurde bisher allerdings noch nicht beobachtet.
Der hier beschriebene Revers-Hybridisierungstest ist geeignet, ein wertvolles Hilfsmittel für die Routinediagnostik von unterschiedlichen HFE und/oder TFR2 Mutationen zu werden. Durch die Verwendung einer einzigen Multiplexamplifikationsreaktion und vorproduzierter Fertigteststreifen ist die Methode einfach und zuverlässig und kann von der Blutabnahme bis zum fertigen Resultat innerhalb weniger Stunden durchgeführt werden. Für hohen Probendurchsatz kann die Testung mit Hilfe im Handel erhältlicher Geräte, wie z.B. dem profiBlot II T (TECAN AG, Hombrechtikon, Schweiz) automatisiert werden. Die Zahl der vom gegenwärtigen Test erfassten Mutationen lässt sich leicht erhöhen, indem die gleiche Strategie für die Auswahl neuer zusätzlicher Hybridisierungssonden angewandt wird.
BEISPIEL 3 : Fünf italienische, von HH betroffene Probanden, die heterozygot für C282Y und negativ für H63D waren, wurden untersucht. Sie alle zeigten die klassischen, phänotypischen Kriterien für homozygote HH:
1. Erhöhte Transferrinsättigung ( > 50% nach Fasten) und erhöhte Konzentration von
Serumferritin;
2. hepatozelluläre Hemosiderinablagerungen III. und IV. Grades nach Scheuer et al.
/24/ ;
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3. Leber-Eisenindex ¯2.
Eisenaufnahmeanämie, chronische Hepatitits B und C sowie überdurchschnittlicher Alko- holkonsum sowie Bluttransfusionen konnten ausgeschlossen werden. Von allen Patienten und deren Verwandten lagen Einverständniserklärungen zur Studie vor.
Bei klinischen Untersuchungen wurde das Vorhandensein von Fibrosen und Zirrhosen durch Biopsie der Leber befundet. Alle Zirrhosen waren vom Typ A nach Child. Das Vor- liegen von klinischen Symptomen einer HH wurde nach vorbeschriebenen Kriterien befun- det /25/. Die Transferrinsättigung und Serumferritin wurden nach Standardmethoden be- stimmt. Leber-Eisen-Konzentrationen (HIC) (hepatic iron concentration) wurden mittels
Atomabsorptionsspektrofotometrie bestimmt (Perkin-Elmer S2380, Norwak, CT) bestimmt und daraus der Leber-Eisen-Index (HII) (hepatic iron index) (Verhältnis von HIC [ mol/g
Trockengewicht] zu Alter [Jahre] ) berechnet. Die Gesamtmenge an durch Phlebotomie entferntem Eisen (IR) wurde, wie vorbeschrieben, abgeschätzt 1251. Die geografische Ab- stammung der Patienten wurde bis in die vierte Eltemgeneration ermittelt.
Bei molekularen Untersuchungen wurde genomische DNA aus peripheren Blutzellen iso- liert. Die C282Y und H63D Mutationen wurden mittels Standardpolymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction PCR) mit dem Restriktionsenzymverdau mit Rsa I bzw. Bei untersucht /18/. Die Mikrosatellitenmarker D6S265, D6S105 und D6S1281 wurden, wie vorbeschrieben, eingesetzt /26/. Die HLA-A Antigene wurden in Mikrolymphotoxitätstests bestimmt. Haplotypen wurden entsprechend den Verteilungen der Marker in den Familien erstellt.
Die vollständige kodierende Sequenz sowie die Exon-fntrongrenzen des HFE Gens wur- den mittels PCR amplifiziert, wie von Carella et al. /18/ beschrieben. Die Nukleotidsequenz beider DNA Stränge wurde in allen Probanden und in jenen Verwandten mit identen C282Y negativen Chromosomen bestimmt mittels Dideoxykettenbestimmungsreaktion, mit Sequenase 2. 0 (USB Amersham, Cleveland, Ohio) und 35S-a-dATP, nach dem Protokoll des Herstellers. Die Reakionsansätze wurden über 6%ige denaturierende Polyacrylamid- gele elektrophoresisch aufgetrennt und autoradiographiert. Die gleichen Primer wurden sowohl für die PCR als auch für die Sequenzreaktion eingesetzt.
Als weitere Bestätigung für die neuen Mutationen (siehe Ergebnisse) wurde ein Restrikti- onsfragment-Längenpolymorphismus durchgeführt (restriction fragment length poly-
<Desc/Clms Page number 15>
morphism) (RFLP). Da die beiden Mutationen weder eine Schnittstelle für Restriktionsenzyme generierten noch zerstörten, wurde der die Mutationen tragende Abschnitt von Exon 3 mit PCR amplifiziert, und zwar unter Verwendung von Oligonukleotiden mit veränderter Ausrichtung entsprechend jeder Mutation (Bria-F: 5' TGGCCCACCAAGCTGGACT 3'; Dom-F : 5' GCCTGGCCCACCAAACTG 3'), so dass dabei für jede Mutation eine informative Restriktionsenzymschnittstelle BsrSI in der wild-type HFE Sequenz entstand. Der Antisens-Primer war gleich für die Sequenzreaktion. Die Ergebisse sind in der folgenden Tabelle 2 gezeigt.
TABELLE 2
Daten der durch Hämochromatose betroffenen 5 Probanden
EMI15.1
<tb> Sex <SEP> Alter <SEP> TS <SEP> SF <SEP> Scheuer's <SEP> HIC <SEP> HII <SEP> IR <SEP> klinische
<tb>
<tb>
<tb> Jahre <SEP> % <SEP> g/L <SEP> Grad <SEP> mol/g <SEP> Symptome
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1 <SEP> M <SEP> 48 <SEP> 96 <SEP> 694 <SEP> 4 <SEP> 238 <SEP> 4,9 <SEP> 4 <SEP> keine
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2 <SEP> M <SEP> 47 <SEP> 79 <SEP> 1206 <SEP> 4 <SEP> 359 <SEP> 7,6 <SEP> 23 <SEP> C
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3 <SEP> M <SEP> 42 <SEP> 86 <SEP> 608 <SEP> 3 <SEP> 144 <SEP> 3,4 <SEP> 3,6 <SEP> keine
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 4 <SEP> M <SEP> 50 <SEP> 106 <SEP> 2740 <SEP> 4 <SEP> 425 <SEP> 8,5 <SEP> 21 <SEP> C, <SEP> H, <SEP> D
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 5 <SEP> M <SEP> 66 <SEP> 100 <SEP> 1351 <SEP> 4 <SEP> 421 <SEP> 5.4 <SEP> - <SEP> C. <SEP> H. <SEP> A.
<SEP> D
<tb>
Legende : TS = Transferrin-Sättigung ; = Serumferritin;
HIC = Leber-Eisenkonzentration; HII = Leber-Eisenindex; IR = ausgeschiedenes Eisen ; = Leberzirrhose; H = Hypogonadismus; A = Arthropathie ; = Diabetes In Tabelle 2 sind die klinischen Daten und die Eisenwerte der 5 Probanden dargestellt.
Drei Patienten (1, 2 und 3) stammen aus demselben Tal im Nordwesten (Ossola) und zwei (4 und 5) aus der Umgebung von Monza (Brianza). Durch Sequenzanalyse des HFE Gens der Probanden wurden zwei neue Nonsens-Mutationen im Exon 3 im heterozygoten Sta- tus identifiziert. Die erste, eine G#T Mutation, am Nukleotid 502 der HFE cDNA Sequenz
EMI15.2
Die zweite, eine G#A Mutation am Nukleotid 506 der HFE cDNA Sequenz (codon 169)
EMI15.3
Mutationen wurden deshalb HFE-Ossola und HFE-Brianza nach der Herkunft der Proban- den benannt.
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In einer Familie wurde ein betroffener Bruder mit gleichem Chromosom 6p Haplotyp und den gleichen HFE Mutationen wie der Proband befundet. Sein HIC war 176,2 mol/g und der HII war 3,92.
Die zwei neuen Mutationen waren im vollständigen Kopplungsungleichgewicht mit den
C282Y und H63D Mutationen. HFE-Ossola war mit dem Haplotyp D6S265-3, HLA-A24,
D6S105-5 und D6S1281-6 in zwei Familien assoziiert, während in der dritten Familie der
Haplotyp in den Markern D6S265 und HLA-A abwich, was auf ein Rekombinationsereignis zwischen HLA-A und D6S105 schliessen lässt. HFE-Brianza war mit Haplotyp D6S265-3,
HLA-A24. D6S105-6 und D6S1281-6 assoziiert.
Die beiden Mutationen führen zu einem Stopcodon an den Nukleotiden 502 und 506 des open reading frame (nt 502 GAG#TAG und nt 506 TGG-TAG) und in weiterer Folge zu
Proteinen mit Fehlen der a3 Domäne, der transmembralen Domäne und des cytopfasti- schen Abschnittes. Diese Mutationen bewirken vermutlich im Gegensatz zu C282Y eine vollständige Funktionsstörung des HFE Proteins, vergleichbar mit der partiellen Deletion von Exon 4 in HFE-defizienten Mäusen /27, 28/. Folglich könnten die so mutierten Allele die Funktion von Null-Allelen tragen. Es wird vermutet, dass die Kombination dieser Muta- tionen im gemischt heterozygoten Zustand mit C282Y zu einem stark ausgeprägten Phä- notyp führt.
Drei der fünf Probanden (2,4 und 5) wiesen auch schwere Krankheitsbilder auf mit hohem Ausmass an Eisenüberladung und HH bedingten klinischen Beschwerden.
Der Proband 3 wies einen weniger ausgeprägten Phänotyp auf, vermutlich da er seit zehn Jahren regelmässig Blut spendete, während Proband 1 und sein betroffener Bruder eben- falls einen weniger ausgeprägten Phänotyp ohne offensichtlich schützende Faktoren, wie Blutverlust oder verschlechterte Absorption aufwiesen.
Es besteht also eine Phänotypvariabilität bei diesen Patienten, die sowohl auf Umweltfak- toren als auch auf genetischen Faktoren beruhen kann. Die Existenz von den Phänotyp in C282Y homozygoten Patienten modulierenden Genen in der Region um D6S105 wurde postuliert /25, 29/, aber weitere Studien sind notwendig, um den Genotyp-Phänotyp- Zusammenhang in HH Patienten besser erklären zu können.
Sowohl HFE-Ossola als auch HFE-Brianza heterozygote Patienten wiesen keine erhöhten Serum-Eisen-Indizes auf, was darauf hinweist, dass keine der Mutationen zu einer Eisen- überladung im heterozygoten Zustand führt. Auch die drei gemischt heterozygoten Zu-
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stände aus HFE-Ossola und HFE-Brianza und H63D zeigten keine Zeichen von Eisen- überladung. Da aber diese Probanden Frauen oder sehr jung waren, kann nicht ausge- schlossen werden, dass, wie bei C282Y die Kombination einer dieser beiden Nonsens-
Mutationen mit H63D oder einer anderen nicht ausgeprägten HFE Mutation zu einem HH
Phänotyp mit niedrieger Penetranz führt /17/.
Dies ist die erste Beschreibung von Nonsens-Mutationen im HFE Gen und auch der erste
Befund über mehrere nicht verwandte von HH betroffenen Trägem einer heterozygoten
C282Y mit einer anderen Mutation als H63D. Die beiden hier beschriebenen Mutationen entstanden wahrscheinlich in den beiden genannten nördlichen Regionen Italiens und ha- ben sich vermutlich durch einen "Founder"-Effekt verbreitet. Da in den beiden geografi- schen Regionen zwischen den betroffenen Familien bis in die vierte Generation keine
Blutsverwandschaft vorliegt, sollten die beiden Mutationen vor weit mehr als 100 Jahren entstanden sein.
Die Untersuchung der Häufigkeit der HFE Genotypen in HH Probanden aus diesen beiden italienischen Regionen Ossola und Brianza zeigten, dass die gemischt heterozygote Kombination von C282Y mit HFE-Brianza oder HFE-Ossola gleich häufig oder häufiger ist als mit H63D (Daten nicht dargestellt). Tatsächlich wurde der
C282Y/HFE-Ossola gemischt heterozygote Zustand in 25% der Probanden aus Ossola gefunden (gegenüber 8,3% C282Y/H63D) und C282Y/HFE-Brianza und C282Y/H63D gemischt heterozygoter Zustand jeweils in 8,4% der HH Probanden in der Brianza Region.
Während die geringe Häufigkeit von C282Y/H63D gemischt heterozygoter Zustände mit einer niedrigen Penetranz dieses Genotyps assoziiert ist (von 0,44% bis 1,5% in unter- schiedlichen Populationen) /17/ wird angenommen, dass die Genotypen C282Y/HFE- Ossola oder HFE-Brianza eine 100%ige Penetranz aufweisen aufgrund der Schwere der beiden Mutationen. Diese Ergebnisse bestätigen, dass HH in Italien nicht so homogen ist wie in Nordeuropa und weist auf das mögliche Vorhandensein anderer HFE Mutationen, die in unterschiedlichen Ländern verschieden relevant sind, hin. Das Erkennen dieser Mu- tationen kann wichtige Konsequenzen für die Diagnose und das Screening von HH haben.
BEISPIEL 4 : Vier verschiedene Familien mit Hämochromatose, die keinen Bezug zu HFE hat, wurden untersucht. Sechs Patienten gehörten zu zwei sizilianischen Familien (Familie 1 und 2).
Die Stammbäume der Familien 1 und 2 sind in den Fig. 2c und 2d gezeigt (gefüllte Sym- bole betroffen, nicht gefüllte Symbole nicht betroffen, ND= nicht festgestellt). Vier Patien- ten gehörten einer grossen aus Campania, einer Region in Süditalien, stammenden In-
<Desc/Clms Page number 18>
zuchtfamilie (Familie 3) an. Der Stammbaum der Familie 3 ist in Fig. 2a gezeigt (gefüllte
Symbole betroffen, nicht gefüllte Symbole nicht betroffen, NE = nicht untersucht). Ein
43jähriger Mann mit schwerer Eisenüberladung, verschiedenen klinischen Symptomen und einem wild-type HFE Genotyp gehört zu einer Familie (Familie 4), die aus Lazio in
Mittelitalien stammt.
Der Stammbaum der Familie 4 ist in Fig. 2b gezeigt (gefüllte Symbole betroffen, nicht gefüllte Symbole nicht betroffen, * = Mitvererbung von #-Thalassemie). Als normale Probanden dienten 50 Blutspender mit normalen Eisenwerten aus Süditalien.
Bei molekularen Untersuchungen wurde DNA aus peripheren Blutzellen oder Lympho- blastoidzelllinien der Patienten durch Standardphenolchloroformextraktion /38/ hergestellt.
Die C282Y und H63D Mutationen in HFE wurden anhand genomischer DNA unter Ver- wendung von PCR basierenden Tests und Restriktionsenzymsverdau mit Rsal und Mbol (New England Biolabs, Berkeley, MA) untersucht/18/. Eine Verbindung zum HFE3 Locus wurde in Familie 3 durch Analyse der Mikrosatelliten D7S651, D7S2498, D7S662, D7S477, D7S1588 Allelevererbung und zwei TFR2 intragenetische Wiederholungen (R1 und R2) festgestellt. Eine Pairwise Linkageanalyse wurde unter Verwendung des MLINK- Programmes von LINKAGE computer package, wie vorbeschrieben, /39/ durchgeführt.
PCR wurde in einem Thermozykliergerät unter Verwendung von 10 pMol jedes Primers mit einem Protokoll von 32 Zyklen (Denaturierung: 94 C 30", Annelierung: 56 C 45", Aus- dehnung : 72 C 45") und 1 U AmpliTaq DNA Polymerase (Perkin Eimer) durchgeführt. Die PCR Primer für die TFR2 Exon-Amplifikation wurden von Datenbanken erhalten und sind in Tabelle 3 angeführt.
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Tabelle 3 : BeiPCR-Reaktionen verwendete TFR2Primer-Sequenz
EMI19.1
<tb> Fragment-
<tb>
<tb> Exons <SEP> Sequenz <SEP> länge
<tb>
<tb>
<tb> exon <SEP> 1 <SEP> F <SEP> 5' <SEP> cctgccaggactgataaggg <SEP> 3' <SEP> 250 <SEP> bp
<tb>
<tb>
<tb> R <SEP> 5' <SEP> ggtgggaagaagcgaggtca <SEP> 3' <SEP>
<tb>
EMI19.2
EMI19.3
<tb> R <SEP> 5' <SEP> aaggctggcgggtggcaaga <SEP> 3'
<tb>
<tb> exon <SEP> 3 <SEP> F <SEP> 5' <SEP> gatttctggggtccagaggt <SEP> 3' <SEP> 370 <SEP> bp
<tb>
EMI19.4
EMI19.5
<tb> Ozon <SEP> 4 <SEP> F <SEP> 5' <SEP> acgtctctggcatccttccct <SEP> 3' <SEP> 276 <SEP> bp
<tb>
<tb>
<tb>
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<tb> R <SEP> 5' <SEP> ggtgagcgccccgagccgcg <SEP> 3'
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<tb> exons <SEP> 5/6 <SEP> F <SEP> 5' <SEP> cgcggctcggggcgctcacc <SEP> 3' <SEP> 450 <SEP> bp
<tb>
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<tb> R <SEP> 5'
<SEP> cctgaacgattctcactggc <SEP> 3'
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<tb> exons <SEP> 7/8 <SEP> F <SEP> 5' <SEP> ctcctgcccttatgaatcggg <SEP> 3' <SEP> 447 <SEP> bp
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<tb> R <SEP> 5' <SEP> gcgggaggcaatgtctgcac <SEP> 3'
<tb>
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<tb> exon <SEP> 9 <SEP> F <SEP> 5' <SEP> agcgatctggagccagaaag <SEP> 3' <SEP> 350 <SEP> bp
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<tb> R <SEP> 5' <SEP> ctatcttgccagggtgtat <SEP> 3'
<tb>
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<tb>
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<tb> exon <SEP> 10 <SEP> F <SEP> 5' <SEP> gggctgagagacacaggcag <SEP> 3' <SEP> 340 <SEP> bp <SEP>
<tb>
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<tb> R <SEP> 5' <SEP> caggtacaatgtggatgccg <SEP> 3'
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<tb> exons <SEP> 11/12 <SEP> F <SEP> 5' <SEP> cctcgctaagcctgtcctcc <SEP> 3' <SEP> 325 <SEP> bp
<tb>
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<tb>
<tb>
<tb>
<tb> R <SEP> 5'
<SEP> cccagaggcaagggtggacc <SEP> 3'
<tb>
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<tb>
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<tb> exons <SEP> 13/14/15 <SEP> F <SEP> 5' <SEP> tgagccctgagcctg <SEP> 3' <SEP> 522 <SEP> bp
<tb>
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<tb> R <SEP> 5' <SEP> gccaggacagggtggacgctgg <SEP> 3' <SEP>
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<tb> exon <SEP> 16 <SEP> F <SEP> 5' <SEP> cccagcgtccaccctgtcctggc <SEP> 3' <SEP> 368 <SEP> bp
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<tb> R <SEP> 5' <SEP> ctggattgccagagaggacc <SEP> 3'
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<tb>
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<tb> exon <SEP> 17 <SEP> F <SEP> 5' <SEP> gggtcctggcccctgccgccag <SEP> 3' <SEP> 258 <SEP> bp <SEP>
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<tb> R <SEP> 5' <SEP> aggtccaggaggtggag <SEP> 3'
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<tb> exon <SEP> 18 <SEP> F <SEP> 5' <SEP> cctttgctcccgagccagagcc <SEP> 3' <SEP> 375 <SEP> bp
<tb>
<tb>
<tb>
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<tb>
<tb>
<tb>
<tb> R
<SEP> 5' <SEP> agcagaggagctcttgactg <SEP> 3'
<tb>
<Desc/Clms Page number 20>
Mael Enzym wurde verwendet, um die Y250X Mutation am Amplifikationsprodukt des
Exon 6 zu finden. Eine Restriktionsenzymanalyse der PCR Produkte wurde nach den
Empfehlungen des Herstellers durchgeführt.
RNA-SSCP wurde nach zuvor beschriebenen Protokollen /38, 40/ durchgeführt. Nach der
PCR Reaktion wurde die Transkription mit 10U T7RNA Polymerase in einem Endvolumen von 10 l, enthaltend 10mM DTT, 40mM Tris pH 7,5,6 mM MgCI, 2mM Spermidin, 10mM
NaCl, 5 nmol jedes Ribonukleosids, 10U RNAse und 0,2 l S35 UTP durchgeführt. Nach der Elektrophorese wurden die Gele getrocknet und einer Autoradiographie unterworfen.
Bänder, die eine elektrophoresisch geänderte Mobilität zeigten, wurden direkt sequenziert.
Für die Direktsequenzierung wurden die PCR Produkte auf 1 % Agarosegel aufgebracht unter Verwendung von QUIAquick PCR purification kit (QIAGEN, Valencia, CA) gereinigt und unter Verwendung von Thermo-Sequenase Cy5. 5 dye terminator cycle sequencing kit sequenziert. Nach der Reinigung von nicht aufgenommenem Farbstoff mit Autoseq G-50
Säulen wurden die Sequenzprodukte in einem automatischen Sequenzierer (Applied Bio- system 373A) entsprechend dem Protokoll des Herstellers einer Elektrophorese unterwor- fen.
Gesamt RNA wurde durch Standardmethoden aus peripheren Blutzellen hergestellt und unter Verwendung von RNA GeneAmp kit (Roche Molecular System Inc., Branchburg, NJ) retrotranskribiert. Die für die Diskrimination von a und # Transkripten verwendeten Primer waren wie berichtet /37/.
Die Ergebnisse bei den molekularen Untersuchungen zeigten, dass keine Patienten ho- mozygot für C282Y waren, aber dass der Patient II-3 der Familie 2 homozygot für H63D war. Nachdem eine Verbindung zu HFE2 (juvenile Hämochromatose/26/) ausgeschlossen wurde, wurde bei allen betroffenen Individuen beider Linien der Familie 1 untersucht, ob ein homozygoter Zustand vorliegt. Pairwise Linkage-Analysen zeigten einen maximalen lod score von 4,09 (0 = 0,0) für Marker D7S477 und D7S647 in 7q. Dieses Intervall wurde weiter untersucht, wobei der Zusammenhang bestätigt wurde und homozygote Bereiche von weniger als 1 cM in beiden Familien gefunden wurden.
Das Gen TFR2 wurde bereits isoliert und durch Strahlungshybride in 7q22 lokalisiert /37/.
TFR2 zeigt eine 66%ige Homologie mit dem Transferrin Receptor (kodiert durch TFRC) in
<Desc/Clms Page number 21>
seiner extrazellulären Domäne, bindet Transferrin und regelt vermutlich die zelluläre Ei- senaufnahme/37/. Unter Verwendung verfügbarer Sequenzinformation wurden zwei intra- genetische, polymorphe Wiederholungen (R1 und R2) identifiziert und es wurde der ho- mozygote Zustand für diese Marker in allen betroffenen Individuen festgestellt. TFR2 wur- de in der homozygoten Region lokalisiert. Die TFR2 kodierende Sequenz und die Exon-
Intron Grenzen wurden nach Mutationen gescannt und eine C#G Mutation wurde in Exon
6 an der Position 750 der cDNA Sequenz gefunden, die Tyrosin (TAC) mit einem Stop- signal (TAG) an Position 250 (Y250X) ersetzt.
Die Fig. 3c zeigt Sequenzchromatografien der vorderen Sequenz von Exon 6 umfassend die C750G (Y250X) Mutation. Subjekt V-11 (+/+) und VII-1 (+/+) sind in Vergleich zu einer normalen Kontrolle gezeigt. Die Mutation ist mit einem Pfeil bezeichnet. Die Y250X Substitution erzeugt eine Mael-Stelle. Das amplifi- zierte TFR2 Exon 6 wurde mit Mael verdaut, um die Vererbung der Mutation in Familie 1 zu analysieren. Alle betroffenen Mitglieder der Familie 1 waren homozygot für Y250X, während die obligaten Träger heterozygot waren. Der Patient II=3 der Familie 2 (von der keine Blutsverwandschaft aufgezeichnet war) war homozygot für Y250X. Die Y250X Muta- tion wurde in 100 normalen Chromosomen oder in 12 Patienten, die keine Mutationen in
HFE hatten, nicht gefunden.
Wie aufgrund der Blutsverwandtheit erwartet waren die Patienten VI-4, VI-5, VI-7 und VI-8 der Familie 3 homozygot in Bezug auf die TFR2 intragenetischen Wiederholungen und die anderen Mikrosatellitmarkem aus 7q (nicht gezeigt). Basierend auf dem Prinzip von homozygoten Zuständen war das Lokalisieren dieser Ergebnisse naheliegend durch die Verbindung zu diesem genomischen Bereich. Als die DNA anderer Familienmitglieder zur Verfügung stand, wurde eine Pairwise Linkage Analyse beurteilt. Es wurde für die intragenetische Wiederholung R1 ein lod score von 3,19 bei e =0,0 erzielt. Die gesamte kodierende Sequenz und intron-exon Grenzen von TFR2 wurden nach Mutationen unter Verwendung von Direktsequenzieren in den Subjekten VI-7 und VI-8 gescannt. Die Einbringung eines Cytosins im homozygoten Zustand wurde in Exon 2 in einem polyC Trakt {84- 88 insC) identifiziert.
Diese Mutation führt zu einem Frameshift, dem ein vorzeitiges Stopcodon an der Aminosäure 60 (E60X) im Protein folgt. Fig. 3a zeigt Sequenzchromatographien der vorderen Sequenz des Exon 2, enthaltend die C Einbringung, die von der E60X Mutation stammt. Die Subjekte VI-6 (+/+) und VI-2 (+/-) sind im Vergleich zu einer normalen Kontrolle (-/-) gezeigt. Die Position der Einbringung ist mit einem Pfeil gekennzeichnet. Die C Einbringung wurde durch Sequenzieren von DNA aller Familienmitglieder, sofern vorhanden, untersucht. Die Subjekte V-2, VI-3, IV-4 und IV-5 hatten die Mutation in
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einem homozygoten Zustand (Tabelle 4) und die Subjekte V-4, VI-1, VI-2, VI-6, VII-3 und
VII-4 hatten die Mutation im heterozygoten Zustand (Tabelle 5). Dieselbe Mutation wurde in 50 normalen DNA Proben , welche mit RNA-SSCP untersucht wurden, nicht gefunden.
Patient II-2 der Familie 4 hatte eine schwere Erkrankung. HFE2 (juvenile Hämochromato- se /26/) wurde ausgeschlossen, indem die intrafamiliäre Vererbung von Markerallele des
Chromosoms 1q untersucht wurde, da der Patient haploidentisch zu einer normalen
Schwester (nicht dargestelt) war. Blutsverwandschaft war in dieser Familie nicht übermit- telt. Es wurde jedoch eine homozygote T#A Mutation in Exon 4 an der Position 515 der
TFR2 cDNA identifiziert. Fig. 3b zeigt Sequenzchromatografien der vorderen Sequenz von
Exon 4 enthaltend die T515A (M172K) Mutation. Die Subjekte II-2 (+/+) und I-2 (+/-) sind im Vergleich zu einer normalen Kontrolle (-/-) gezeigt. Die Mutation ist mit einem Pfeil ge- kennzeichnet. Dieser Nukleotidaustausch führt zu einer Lysin-Methionin-Substitution an
Position 172 des Proteins (M172K).
Die T515A Vererbung in der Familie wurde durch direktes Sequenzieren untersucht. I-2, 111-1 und III-2 waren heterozygot für die Mutation und 11-1 hatte den normalen Genotyp. Dieselbe Mutation wurde in 50 normalen Kontrollen, die mit RNA-SSCP untersucht wurden, nicht gefunden.
RT-PCR wurde in Gesamt RNA aus peripheren Blutzellen und Lymphoplastoidzelllinien (LCL) von Patienten mit verschiedenen TRF2 Substitutionen und in einer normalen Kon- trolle durchgeführt. Wie erwartet, waren aufgrund des beschränkten Expressionsmusters des a-Transkripts, Versuche die a-Transkripte durch RT-PCR unter Verwendung von RNA aus Blutzellen oder LCL zu amplifizieren, nicht erfolgreich. Fragmente entsprechend dem #-Transkript wurden in der normalen Kontrolle und in allen Patienten ausser den Y250X homozygoten (nicht gezeigt) gefunden.
Die klinischen Daten von allen HFE3 Patienten mit einer gefundenen Mutation in TFR2 sind in Tabelle 4 zusammengefasst. Kein Patient war C282Y homozygot oder heterozygot.
Der Patient II-3 der Familie 2 war H63D homozygot. In Familie 3 wurde ein sehr veränder- licher Phänotyp beobachtet : beiden Probanden (VI-7 und VI-8) hatten typische Be- schwerden mit einem stärkeren Phänotyp beim jüngeren Patienten. VI-5 hatte eine mässi- ge Leberfibrose, einen bemerkenswerten Grad der Steatose und vermehrte Lebereisen- flecken. Der Lebereisenindex war grenzwertig (1,99) und etwa 5 g Eisen mussten entfernt werden, um eine Eisenerschöpfung zu erreichen. Patient VI-3, eine 45 Jahre alte Frau, zeigte nur erhöhte Transferrinsättigung und erhöhtes Serumferritin. Die Patienten VI-4 und
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V-2 wurden nicht diagnostiziert und ihre Identifikation als E60X homozygote wurde durch
Familienuntersuchung erzielt (Tabelle 4).
Patient VI-4, eine premenopausale Frau, hatte bemerkenswert geringe Transferrinsättigung und Serumferritin. Das Auffinden von Eisen- mangel ohne Anämie war unerwartet in einem homozygot mutierten Subjekt. Eine geringe dietische Eisenaufnahme und langanhaltende Blutverluste während der Menstruation oh- ne Eisenergänzung wurden als Ursache für den Eisenmangel identifiziert. Die Geschich- te zeigte keine anderen Blutverluste oder das Vorhandensein eines Hemostasisdeffektes, aber die Patientin verweigerte eine ausführliche gastrointestinale Endoskopieuntersu- chung. V-2 hatte geänderte Eisenwerte, abnormale Leberfunktionstests und starke Arthri- tis, aber hatte nie Phlebotomien erhalten. Sein älterer Bruder (V-1) war für die Studie nicht verfügbar, aber hatte berichtet, dass er unter regelmässiger Phlebotomiebehandlung steht.
II-2 der Familie 4 zeigte einen schlechten Zustand mit Zirrhose, Hypogonadismus und Herzerkrankung. Wie in Fig. 2b gezeigt, hat der Patient #-Thalessemie im heterozygoten Zustand von seiner Mutter geerbt.
HFE3 Träger waren Eltern oder Kinder der Patienten und/oder Geschwister mit einer dokumetierten TFR2 Mutation. Die klinischen Daten und Eisenwerte der 15 HFE3 heterozygoten sind in Tabelle 5 dargestellte. Alle Träger hatten normale Transfeninsättigung und Serumferritin ausser V-9 der Familie 1. Dieses Subjekt, das erhöhte Transferrinsättigung und erhötes Serumferritin zeigte, war durch HCV chronische Hepatitis betroffen und stand unter gelegentlicher Phlebotomie. In allen anderen Fällen war der HFE3 heterozygote Zustand selbst in Kombination mit H63D im heterozygoten Zustand (1 Fall) oder mit #Thalessemieeigenschaft (3 Fälle) nicht mit Eisenüberladung assoziiert.
Diese Ergebnisse bestätigen die Rolle des TFR2 als HFE3 Gen. Beim Scannen der kodierenden Sequenz von TFR2 nach Mutationen wurde eine C Einbringung (84-88 insC), die ein vorzeitiges Stopcodon (E60X) in Exon 2 verursacht, im homozygoten Zustand in einer Inzuchtfamilie bei fünf betroffenen Subjekten und bei einer Frau gefunden, die Eisenmangel zeigte und bei der die Erkrankung nicht zum Ausdruck kam. Ein T515A Austausch in Exon 4, der ein Missensaustausch (M172K) im Protein bewirkt, wurde im homozygoten Zustand in einem einzelnen nicht familiären Fall gefunden. Das Vorliegen von homozygoten, in zwei aufeinanderfolgenden Generationen in Familie 3 beweist den hohen Grad an Inzucht.
Die Homozygot-Heterozygot-Verbindung zwischen V-2 und V-4) erklärt die Ab-
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wesenheit von wild-type TFR2 in der letzten Generation und die offensichtlich dominante Vererbung in diesem Zweig der Familie.
Die Identifizierung von 13 Subjekten mit homozygoter Mutation in TFR2 erlaubt eine vorläufige Genotyp/Phänotypkorrelation. Alle klassischen Symptome der Hämochromatose wurden unter den HFE3 Patienten gefunden, wenn auch die Schwere des Phenotyps variabel war, insbesondere in Familie 3. Wie in HFE assoziierten Erkrankungen kann die intrafamiliäre Variation des klinischen Phänotyps sowohl Umweltbedingungen als auch modifikaten Genen zugeschrieben werden. Überraschend hatte das Subjekt IV-4 der Familie 3 Eisenmangel ohne Anämie, die aufgrund starker menstrualer Verluste und einer geringen diätetischen Eisenaufnahme beruhte.
Bei einem konsistenten Anteil der C282Y homozygoten Frauen kommt die Störung während der fruchtbaren Jahre nicht zum Ausdruck, obwohl ein Eisenmangel sehr selten sowohl in der Literatur als auch in der Erfahrung vorkommt.
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TABELLE 4 Klinische Daten von HFE3 Patienten m
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Es wird die Hypothese aufgestellt, dass verschiedene Wirkungen der Mutationen am ko- dierten Protein die Schwere des Phenotyps beeinflussen.
Theoretisch wie in Fig. 4 ge- zeigt, ist die Wirkung der beschriebenen Mutationen auf TRF2 Transkripten verschieden.
Die beiden Transkripte, die wahrscheinlich von den beiden alternativen Splicingvarianten entsprechend Kawabata et al /37/ resultieren, sind in Fig. 4 gezeigt. Beim #-Transkript fehlt Exon 1-3 und es hat zusätzlich Nukleotide an seinem 5'Ende (gepunkteter Abschnitt) verglichen mit dem a-Transkript. Die Position der identifizierten Mutationen und ihre mög- liche Wirkung auf die Proteine sind gezeigt. av zeigt die Variante mit dem Aminosäuren- tausch M172K an. E60X tritt in Exon 2 auf und bricht das erwartete a-TFR2-Transkript ab, beeinträchtigt jedoch nicht, im Gegensatz zu Y250X, das #-Transkript. T515A verursacht einen Missensaustausch im a-Protein (M172K). Das Methionin an Position 172 wird in der Maus konserviert und die Substitution einer basischen für eine neutrale Aminosäure kann die a-Proteineigenschaften ändern.
Jedoch betrifft dieselbe Nukleotidsubstitution auch das vermeintliche Anfangscodon der #-Variante und verhindert seine Translation. Es wird vermutet, dass das Fehlen von #-TRF2 mit einem schweren Phänotyp in Y250X und M172K-Homozygoten assoziiert ist, wohingegen seine Fortdauer verantwortlich sein kann für eine teilweise Funktion des Proteins in E60X-Homozygoten. Um jedoch festzustellen, ob #-TRF2 irgendeine physiologische Bedeutung hat, benötigt es weitere Untersuchun- gen. Zurzeit sind Antikörper gegen TRF2, die helfen könnten, unsere Hypothese zu bestä- tigen, nicht verfügbar. Vorläufige Ergebnisse aus RT-PCR von RNA aus peripherem Blut oder LCL zeigten ein Fehlen von #-TRF2 nur in Y250X-Homozygoten. Ein Ergebnis, wel- ches in Übereinstimmung mit einer raschen Degradierung von Nonsens-Transkript ist.
Ei- ne solche Degradierung wird für M172K nicht erwartet, das das #-TRF2 Anfangscodon beeinflusst und auch nicht für E60X, welches das #-Transkript nicht betrifft.
Ein Beitrag von #-Thalessemieeigenschaften zur Schwere des Phänotyps kann bei II-2 der Familie 4 nicht ausgeschlossen werden, da beobachtet wurde, dass die Mitvererbung von #-Thalessemieeigenschaften die Phänotypexpression in C282Y HFE-Homozygoten verschlimmert.
Mutationen des TFR2 im heterozygoten Zustand wurden üblicherweise gut toleriert. Wie bei C282Y HFE heterozygoten Mutanten beobachtet, entwickeln Individuen mit heterozy- goten Mutationen von TFR2 in Verbindung mit #-Thalessemieeigenschaften keine Eisen- überladung (Tabelle 5)
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Die Resultate können praktische Implikationen für molekulare Diagnose von Hämochro- matose haben. Die Genotypisierung des HFE Gens ist in den Krankendiagnoseprotokol- len beinhaltet, jedoch in allen berichteten Serien hatte eine Minderheit von Patienten wildtype oder unvollständige HFE Genotypen (C282Y im heterozygoten oder H63D im heterozygoten oder homozygoten Zustand). Man vermutet, dass sie durch untypische Formen der Hämochromatose oder durch sekundäre Eisenüberladung betroffen sind.
Unsere Daten zeigen, dass eine andere nicht-HFE Determinante in diesen Fällen vorhanden sein kann, wie bei dem Patienten 11-3 der Familie 2 gezeigt. Daher ist das Screenen nach Mutationen von TFR2 ein neues diagnostisches Werkzeug, das den Patienten ohne HFE Mutationen oder mit unvollständigem HFE Genotyp angeboten werden kann.
Schliesslich ist die Identifikation von TRF2 als das HFE3 Gen relevant für die Frage von modifikaten Genen in Hämochromatose. Das Vorhandensein modifikater Gene, die den Phenotyp verändern (entweder verbessern oder verschlechtern) können, wurde bei Mäusen nachgewiesen und wird für Menschen vorausgesagt. TRF2 ist der erste offensichtliche Modifikator, der in C282Y-Homozygoten zu untersuchen ist.
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