<Desc/Clms Page number 1>
Anticorps monoclonaux et antigène du carcinome pulmonaire humain à cellules non petites et de certains autres carcinomes humains.
La presente invention a pour objet un nouvel anticorps monoclonal, et des procédais pour la production et l'utilisation de ce nouvel anticorps monoclonal spécifique des antigènes de carcinomes. Plus précisément,
EMI1.1
l'anticorps monoclonal de la presente invention est immunospécifique pour et/ou immunoréactif avec un antigène protéique au humain associéä cellules non petites (C'PCNP) et à certains autres carcinomes humains comprenant certains carcinomes du sein, du colon, etc.
L'anticorps monoclonal de la presente invention est réactif avec un déterminant d'un antigene glycoprotéique associé aux cellules du CPCNP et également avec d'autres carcinomes comprenant des carcinomes du sein, du colon et le carcinome pulmonaire Åa petites cellules. L'anticorps monoclonal de la présente invention possède des caractéristiques et aptitudes distinc- tives qui rendent cet anticorps convenable des fins de diagnostic clinique in vivo et in vitro. En outre, l'anticorps de la présente invention convient pour des utilisations thérapeutiques.
Par exemple, le nouvel anticorps peut être utilise comme support ä sélectivité pour une cible de divers agents aui possedent des effets anti-tumoraux comprenant, mais ä titre non limitatif : des medicaments de chimiothérapie, des toxines, des agents modificateurs de reponse immunologique et des radio-isotopes. De plus, les hybridomes qui produisent cet anticorps peuvent etre modifiés en utilisant la technologie de l'ADN recombinant afin que les anticorps résultants puissent effectuer une mediation de la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps ou puissent etre cytolytiques vis-à-vis des cellules tumorales en presence des constituants du complément.
<Desc/Clms Page number 2>
EMI2.1
1. 1.
CARCINOME PULMONAIRE HUMAIN
I. es carcinomes pulmonaires sont responsables de la majorité des décès dûs au cancer chez l'homme et surpassent les carcinomes du sein comme cause la plus frequente de décès dus au cancer chez la femme.
Cette maladie peut etre divisée en quatre types histologiques principaux : (1) épidermolde ou squameux (30 %). (2) adenocarcinome (35 %), (3) indifférencié grandes cellules (15 X) et (4) ä petites cellules (20%).
L'expression "carcinome pulmonaire Åa cellules non petites" ("CPCNP") comprend les types cellulaires suivants : les cellules de carcinome épidermolde, les cellules dad, 6no- carcinome et les cellules de carcinome indifférencié ä grandes cellules.
La plupart des cas de carcinomes pulmonaires ne peuvent être guéris par chimiothérapie et radiothera- pie. Les carcinomes pulmonaires ä petites cellules peuvent répondre à 1a chimiothérapie et à la radiothérapie par une diminution de volume, mais cela ne permet pas une guérison totale. L'ablation chirurgicale totale de la tumeur se révèle la seule thérapeutique efficace.
Cependant, malheureusement, moins de 30 % des patients atteints de cancer du poumon présentent des tumeurs qui peuvent etre totalemtne réséquées après diagnostic.
Parmi ceux-ci, moins d'un tiers survit 5 ans après l'ablation chirurgicale apparemment totale de la tumeur. Par consequent, il existe un grand besoin de procédés rendant possible un diagnostic précoce du cancer du poumon, une meilleure definition du degre de propagation du cancer et une thérapeutique plus efficace. t. 2. ANTICORPS MONOCLONAUX
Les anticorps monoclonaux representant des molécules d'anticorps homogenes qui se lient à un seul
EMI2.2
site moléculaire (à savoir un epitop) sur un antigene avec une constante de liaison ou d'affinite
<Desc/Clms Page number 3>
sont prepares par trois procédés connus dans la pratique.
Les anticorps monoclonaux peuvent être prepares par des techniques de production d'hybridomes conçues par Kohler et Milstein (1975, Nature 256 : 495 ; 1976, Eur. J. Immunol. : 511). En fusionnant des cellules productrices d'anticorps (lymphocytes spléniques) et des cellules de myélomes, Kolher et Milstein ont cree des cellules hybrides donnant naissance à des lignées cellulaires immortelles possédant l'aptitude ä produire un anticorps et l'aptitude ä croltre de manière permanente en culture cellulaire. Les hybridomes sécrètent un seul type d'immunoglobuline de spécificité antigenique predefiniedependant de l'antigène auquel les lymphocytes
EMI3.1
ont été préalablement exposes.
En variante, les anticorps monoclonaux peuvent etre produits par transformation in vitro de lymphocytes B de sang périphérique de mammifere, par exemple avec le virus d'Epstein-Barr (VEB). Le virus rend les lymphocytes producteurs d'anticorps immortels. Des techniques permettant cette transformation sont connues dans la pratique (voir, par exemple, Steinmetz et collaborateurs, 1977, Nature 269 : 420 ; Crawford et collaborateurs, 1983, The Lancet. i : 386).
Enfin, les anticorps monoclonaux peuvent etre produits en utilisant des techniques qui associent l'immortalisation par le VEB et la fusion cellulaire ou la technologie de production d'hybridomes. Cole et collaborateurs (1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan Liss, Inc., pages 77-96) décrivent des techniques pour la fusion d'un plasmocytome humain ou d'un membre de fusion de lignees cellulaires de lymphoblastofde humain avec des lymphocytes donneurs transformes avec le VEB qui ont été prealablement établis comme une lignee cellulaire. Dans un tel système, les
<Desc/Clms Page number 4>
deux lignées cellulaires parentales sont immortelles.
Par consequent, le membre de fusion doit posséder des marqueurs medicamenteux appropries pour s'opposer aux lignees parentales lorsque l'hybridome obtenu par fusion est cultive. Les hybridomes-VEB résultants produisent des anticorps ayant la spécificité de la lignée cellulaire de lymphocyte-VEB utilisée.
Les anticorps monoclonaux peuvent être produits en grandes quantités par culture cellulaire in vitro d'hybridomes particuliers ou de lignées cellulaires transformees. En outre, l'inoculation d'une lignée cellulaire d'hybridome dans la cavité péritonéale de mammi- feres présentant une compatibilité, tels que des souris, a pour résultat une tumeur qui secrete des concentrations élevées (1 ä 20 mg/ml) d'anticorps monoclonal dans le liquide d'ascite de la tumeur. En prelevant le liquide d'ascite et en purifiant l'anticorps monoclonal, une seule souris peut donner une quantité suffisante d'anticorps pour l'utilisation dans des milliers d'analyses de diagnostic.
1. 3. ANTICORPS MONOCLONAUX ET ANTIGENS
ASSOCIES AU CANCER DU POUMON
Les anticorps monoclonaux contre les antigènes du cancer pulmonaire humain ont été décrits par Sikora et collaborateurs, 1981, Brit. J. Cancer 43 : 696 ; Cuttita et collaborateurs, 1981, Proc. Nat'l Acad.
Sei. USA 78 : 4591 ; Moody et collaborateurs, 1981, Science 214 : 1246 ; Minna et collaborateurs, 1981, In Vitro 12 : 1058 ; Kennel et collaborateurs, 1981, Cancer Res. 41 : 3465 ; Chem. Abst. 95 (15) : 1308502 ; Baylin et collaborateurs, 1982, Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 79:4650 : Carney et collaborateurs, 1982, Pathobiology Annual 12 : 115 : Gazdar et collaborateurs, 1983, Seminars in Oncology 10 : 3 ; Hollinshead et collaborateurs, 1983, Cancer Detect.
Prevent : 185 ; Mulshine et collaborateurs, 1983, J.
<Desc/Clms Page number 5>
EMI5.1
Immunol. 131 1983, Arch.
Biochem. Blophys. 220 Saji et collaborateurs, 1984. Hybridoma Abst. 79005569 Bosslet et collaborateurs, Behring. Inst. Mitt. Chem.
Abst. AC101 et collaborateurs, 1984, Cancer Res. 44 : Ast. 79023605 ; et collaborateurs, 1982, Cancer Res. 42 et collaborateurs, Cancer Res. et collaborateurs, 1982, Cancer Res. 42 et collaborateurs, 1982, Fed. Proc. 41. et collaborateurs, 1985 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan Liss, Inc., pages 77-96 ; et Varki et collaborateurs, 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan Liss, Inc., page 207.
Les demandes de brevets des Etats-Unis d'Amerique NO 667 521 déposée le 2 Novembre 1984 et NO 177 déposée le 7 Octobre 1985, et les demandes NO 684 759 déposée le 21 Décembre 1984 et NO 776 321 déposée le 18 Octobre et la demande NO 612 déposée le 28 Mai 1985 font connattre certains anticorps monoclonaux contre le carcinome pulmonaire humain ä cellules non petites.
Les anticorps monoclonaux peuvent etre utilises pour des procedes qui rendent possible un diagnostic précoce du cancer du poumon, une meilleure definition de l'étendue du cancer, et des procédais plus efficaces de therapie du cancer du poumon. Cependant, une condition prealable est la découverte d'anticorps contre des antigens qui sont plus fortement exprimes dans le cancer du poumon que dans les tissus adultes normaux.
Eu egard à l'hétérogenéité connue des populations de cellules tumorales, la présence de plusieurs déterminants sur la même molécule d'antigène, les différences prévues entre des antigenes en ce qui concerne leur stabilité comme marqueurs de diagnostic et cibles thérapeutiques,
<Desc/Clms Page number 6>
et les caracteristiques biologiques différenties des différents anticorps contre le même antigene, un certain nombre d'anticorps differenta contre un certain nombre d'antigènes différents peut être nécessaire.
La présente invention a pour objet une nouvelle classe d'anticorps monoclonaux, illustrée par le L20, qui est spécifique pour un site de déterminant sur un antigène.. glycoprotérique associé aux cellules du carcinome pulmonaire humain ä cellules non petites (CPCNP). L'expression "cellules de CPCNP"comprend les cellules de carcinome épidermofde, les cellules d'adénocarcinome et les cellules de carcinome indifférencié à grandes cellules. Le site de déterminant peut également etre trouve sur des antigènes de quelques autres carcinomes, par exemple, quelques carcinomes du sein et du colon et le carcinome pulmonaire à petites cellules.
Ainsi, l'anticorps de la presente invention se lie egalement : à des cellules d'autres carcinomes et est utile pour le diagnostic et la therapie de toutes les autres tumeurs effectuant l'expression de l'antigène identifie par l'anticorps L20. L'anticorps monoclonal de l'invention se lie beaucoup moins aux cellules adultes normales qu'aux cellules tumorales. L'expression"se lie beaucoup
EMI6.1
moins"signifie que la liaison n'est pas du tout detectable, ou bien est detectable seulement sous forme d'une coloration tres faible lorsque des techniques immunohistologiques sont utilisees. Ainsi, l'anticorps possäde un degré élevé de spécificité pour un antigene caractéristique du CPCNP et de certains autres carcinomes.
La présente invention comprend egalement le nouvel antigene L20 identifie par l'anticorps L20 et la classe des anticoros qui se lient ä, sont immunospecifi- ques pour ou immunoreactifs avec cet antigene. Elle comprend en outre les procédés d'utilisation de l'antigene L20 purifié ou cloné comme vaccin pour l'immunisation contre certains carcinomes.
<Desc/Clms Page number 7>
La présente invention concerne également certains procédées de diagnostic utilisant l'anticorps monoclonal de l'invention. Par exemple, l'anticorps peut etre utilise dans des procédés destinés ä déterminer la présence de 'état malin dans le tissu puJmonaire humain et d'autres tissus humains. Les procédés consistent ä examiner le tissu pour mettre en évidence un antigene ayant les caracceristiques d'une glycoproceine de 110 000 daltons, ce qui définit l'anticorps L20.
Par exemple, le tissu peut être mis en contact avec un anticorps qui définit un site de déterminant sur un antigene cellulaire associe ayant les caracteristiques de l'antigene défini par l'anticorps L20, un äquivalent fonctionnel ou un fragment de cet anticorps, et toutes les interactions dudit anticorps et des determinants antigeniques sont détectées. Un tel procédé comprend la determination de la presence de cellules de CPCNP chez un sujet sus- peut6 de contenir ces cellules. Le sujet est mis en contact avec l'anticorps monoclonal, qui est capable de distinguer ces cellules des autres types cellulaires qui peuvent être présents chez le sujet. Le contact est effectué dans des conditions permettant la liaison de l'anticorps ä ces cellules.
Apres le contact, la présence ou l'absence de liaison de l'anticorps aux cellules chez le sujet est determinee. Cette liaison depend de la presence ou de l'absence des cellules de CPCNP chez le sujet. Généralement, le sujet est mis en contact avec un membre de liaison spécifique marque de l'anticorps monoclonal. Ce marqueur est capable de produire un signal détectable.
Un autre procédé de diagnostic comprend la localisation in vivo d'une tumeur par administration un patient d'un anticorps purifie ou fragment d'anticorps de la présente invention marque avec un agent qui donne un signal détectable. La localisation est
<Desc/Clms Page number 8>
alors detectie en utilisant la scintigraphie externe, la tomographie d'emission ou la radiographie nucleaire. Ce procédé peut également offrir de meilleurs moyens pour determiner l'état de patients atteints de cancer en ce qui concerne l'étendue de la maladie et pour contrôler les variations de réponse à une therapeutique.
La présente invention possede également des applications therapeutiques, puisque l'anticorps L20 et les anticorps similaires peuvent réagir avec l'antigène L20 qui est exprimé à de fortes concentrations ä la surface des cellules tumorales. Par consequent, les anticorps peuvent être utilisés comme supports de divers agents qui possèdent un effet anti-tumoral, com- pre na nt, mais Åa ti t re non limitatif, des médicaments chinmiothérapeutiues, des toxines, des agents modificateurs de reponse immunologique et des radio-isotopes.
En outre, l'anticorps L20 peut etre modifie afin qu'il puisse servir de médiateur dans la cytotoxi- cite cellulaire dépendant des anticorps (CCDA), c'est- a-dire qu'il puisse tuer les cellules de CPCNP en presence de lymphocytes ou macrophages humains ou bien qu'il devienne cytolytique vis-à-vis des cellules tumorales en présence de complement humain.
Cette modification peut etre obtenue, par exemple, par des techniques récemment mises au point pour la production "d'anticorps chimeres". En consequence, des genes codant pour la région variable de la molécule d'anticorps L20 sont épissés avec des genes humains codant pour la region Fc d'un anticorps d'activité biologique appropriée (telle que l'aptitude à activer le complément humain et ä effectuer la médiation de la CCDA). De nouveaux anticorps d'origine humaine ou provenant de la souris peuvent également être produits contre l'antigène L2D, qui possèdent les fonctions biologiques appropriées.
<Desc/Clms Page number 9>
La présente invention a pour objet un nouvel anticorps monoclonal, appelle L20, qui est immunospécifi- que pour et/ou immunoréactif avec un antigene présent sur les cellules de CPCNP humain et des cellules provenant de plusieurs autres carcinomes humains, comprenant le carcinome du colon, le carcinome du sein et le carcinome pulmonaire petites cellules, des procédés de production de ce nouvel anticorps monoclonal, et certains procédés de diagnostic et procédés thérapeutiques utilisant l'anticorps.
La présente invention a en outre pour objet un nouvel antigene cellulaire de surface caractéris- tique du CPCNP humain et de certains autres carcinomes humains du sein, du colon et du poumon, et des procédés d'utilisation de ce nouvel antigene.
2. 1. PROCEDES DE PRODUCTION D'ANTICORPS MONOCLONAL
CONTRE LE CPCNP
Des anticorps monoclonaux contre le CPCNP humain et certains autres carcinomes humains peuvent etre prepares par des techniques de fusion d'hybridomes, par transformation par VEB de lymphocytes humains producteurs d'anticorps, ou par des techniques qui associent la fusion cellulaire et des technologies d'immortalisation par VEB.
2. 1. 1. TECHNIQUES DE FUSION
Conformément a une forme de réalisation de la présente invention, des anticorps monoclonaux contre le CPCNP sont prepares en utilisant des techniques de production d'hybridomes par fusion cellulaire. Par exemple, des cellules de carcinome pulmonaire humain provenant d'épanchements pleuraux, des cellules cultivées provenant de tumeurs de CPCNP humain obtenues par explantation, ou des cellules provenant d'un poumon foetal normal, ou bien des lysats de ces cellules, sont utilises comme agent immunogene.
Dans un exemple illustratif,
<Desc/Clms Page number 10>
des cellules explantées provenant d'un CPCNP, l'adeno- carcinome pulmonaire humain NO 3082, ont été utilisées comme agent immunogène (voir section 3. 1). Par exemple, les cellules sont injectees a une souris et, au bout d'une durée suffisante, la souris est sacrifiée et des lymphocytes somatiques producteurs d'anticorps sont obtenus. Les cellules productrices d'anticorps peuvent etre obtenues à partir des ganglions lymphatiques, de la rate et du sang périphérique d'animaux induits. Les cellules de la rate sont préférées. Les lymphocytes de souris donnent un pourcentage supérieur de fusions stables, avec les myélomes de souris décrits ci-dessous.
L'utilisation de cellules somatiques de rats, de lapins et de grenouilles est Les chromosomes de cellules de la rate codant pour les immunoglobulines désirées sont immortalises par fusion des cellules de rate et de cellules de myélome, généralement en presence de polyethylene-glycol. Plusieurs lignées cellulaires de myelome peuvent etre utilisées pour la production d'hybrides cellulaires fusionnés, comprenant NSI-Ag4/1,
EMI10.1
X63-Ag8. MPC11-45. et S194jXXO. obtenus chez la souris, et 210.
6TG1. 7, X63-Ag. 653, Sp2/0-Ag14, FoAgi. 2. 3. U-226AR et GM1500GTGAL2 obtenus chez le rat, (Hammerling et collaborateurs, 1981, "Monoclonal Antibodies and T-cell hybridomas"in Research Monographs in Immunology, volume 3, J. L. Turk, ed ; Elsevier/North Holland Biomedical Press. New York). Dans un autre exemple illustratif, des cellules de NS1 ont ete utilisees (voir section 3. 1). On laisse les cellules resultantes, qui comprennent les hybridomes obtenus par fusion, croitre dans un milieu sélectif, tel que le milieu HAT, et on cultive les cellules survivantes dans un tel milieu en utilisant des conditions limitantes de dilution.
On cultive les cellules dans un récipient convenable, par exemple des cuvettes de galement possible. émicrotitriérie, et le
<Desc/Clms Page number 11>
surnageant. est examine en ce qui concerne la presence d'anticorps monoclonaux ayant la spécificité désirée.
Divers procedes classiques existent pour l'isolement et la purification des anticorps monoclonaux, de manière ä les debarrasser des autres protéines et d'autres impuretés.
2. 1. 2. TECHNIQUES DE TRANSFORMATION PAR VEB
Conformément ä une autre forme de réalisation de la presente invention, des anticorps monoclonaux contre le CPCNP sont préparés en utilisant des techniques de transformation par VEB. Par exemple, des lymphocytes provenant de sang périphérique, de ganglions lymphatiques drainant la tumeur, de ponctions de moelle osseuse, de tumeurs ou d'épanchements pleuraux provenant de patients atteints d'un CPCNP sont immortalisés en utilisant le VEB suivant des procédés conçus par Cole et collaborateurs, 1984, Cancer Res. 44 :
2750. Comme l'indiquent Cole et collaborateurs, les lymphocytes B specifiques des antigènes tumoraux sont rares chez les patients atteints de cancer du poumon. 11 est donc particulièrement important d'augmenter le nombre de lymphocytes producteurs d'anticorps par une présélection des lymphocytes produisant l'anticorps contre l'antigene concerne. Ainsi, les techniques de transformation par VEB comprennent deux étapes ; (1) enrichissement des cellules en récepteurs pour l'antigene concerne, ä savoir l'antigene L20 décri t dans le paragraphe 4. 2, et (2) immortalisation de ces cellules par infection avec le VEB.
2. 1. 3. TECHNIQUES DE PRODUCTION D'HYBRIDOMES
EN UTILISANT LE VEB
Conformément à une autre forme de réalisation de la présente invention, des anticorps monoclonaux contre le CPCNP sont prepares en utilisant une association des techniques de transformation par VEB et de
<Desc/Clms Page number 12>
production d'hybridomes par fusion, telle que décrite par Cole et collaborateurs, 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. ; pages 77-96. Par exemple, une lignee cellulaire de myélome est fusionnee avec des lymphocytes donneurs provenant de patients atteints de CPCNP qui ont été préalablement transformes par le VEB et fixés comme une lignée cellu- laire capable de croitre et de se développer en culture.
Afin de pouvoir sélectionner les lignees cellulaires obtenues par fusion de VEB et d'hybridomes, il est nécessaire que le membre de fusion possède des marqueurs médicamenteux appropries dominants pouvant être choisis tels que la résistance ä l'ouabalne ou â la neomycine afin que les cellules parentales ne se développent pas lors de la culture des 1ignées cellulaires d'hybridomes fusionnes.
Une 1ignée convenable est la 1ignée cellulaire lymphoblastolde résistante ä l'ouabaine, GM-150 résistante à la thioguamine, appelée KR-4, decrite par Cole et collaborateurs, ci-dessus. Les hybridomes obtenus sont clones au moyen de techniques classiques.
2. 1. 4. MULTIPLICATION CELLULAIRE ET PRODUCTION
D'ANTICORPS
Une fois les hybrides cellulaires fusionnes désirés ou les lignées cellulaires transformées selec- tionnes et clones dans des lignées cellulaires productrices d'anticorps particuliers, la multiplication de chaque lignee cellulaire peut etre effectuée suivant l'une de deux manières classiques. La multiplication de la lignée cellulaire particuliere peut etre effectuée in vitro, par exemple dans des recipients de culture de laboratoire, et le milieu de culture contenant des concentrations élevées d'un seul anticorps monoclonal specifique peut etre recueilli par décantation, filtration ou centrifugation.
En variante, le rendement en anticorps monoclonal peut être accru en injectant un
<Desc/Clms Page number 13>
échantillon de l'hybridome dans un animal présentant une histocompatibilité, du type utilise pour obtenir les cellules somatiques et les cellules de myélome pour la fusion initiale. Des tumeurs sécrétant l'anticorps monoclonal spécifique produit par l'hybride cellulaire obtenu par fusion se développent chez l'animal ayant subi l'injection. Les liquides corporels de l'animal, tels que le liquide d'ascite ou le sérum, donnent des anticorps monoclonaux en des concentrations (levées.
Tel qu'examiné par Cole et collaborateurs ci-dessus, lorsque des hybridomes humains ou des hybridomes-VEB sont utilises, il est necessaire d'éviter le rejet de la xénogreffe injectée dans des animaux tels que des souris. On peut utiliser des souris immunodeficientes ou nues, oubien on peut faire passer l'hybridome tout d'abord dans des souris nues irradiées comme une tumeur sous-cutanée solide, le cultiver in vitro, puis l'injecter par voie intrapéri tonéa1e dans des souris nues irradiées, conditionnées au pristane, qui developpent des tumeurs ascitiques sécrétant de grandes quantités d'anticorps monoclonaux humains specifiques (voir Cole et collaborateurs, ci-dessus).
2. 2. ANTICORPS MONOCLONAUX
L'anticorps de la présente invention se lie ä un nouvel antigene glycoproteique de surface cellulaire, appelé antigène L20, caractéristique des cellules de CPCNP humain et des cellules de certains autres carcinomes humains (voir paragraphe 2. 2. 1). L'antigene glycoproteique possède un poids moleculaire d'environ 110 000 daltons lorsqu'il est soumis ä une immunoprecipi- tation par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (voir pa13graphe 3. 3). La digestion de l'antigene L20 avec de la glycanase a montré qu'il contient des chaines oligosaccharidiques liees par l'azote.
<Desc/Clms Page number 14>
EMI14.1
Comme exemple illustratif de la présente invention, l'anticorps L20 est produit par l'hybridome murin L20 décrit dans le paragraphe 3.
L20 sente (voir paragraphe 3.
8 possède une avidité d'approximativement 3 x ne se lie pas de manière detectable ä des cellules normales, telles que les fibroblastes, les cellules endothéliales ou les cellules épithéliales dans les organes L'expression se lie pas de manière détectable" fie que seule une coloration tres faible ou bien pas la moindre coloration n'est détectée par immunohistologie.
Des fragments de liaison utiles de l'anticorps monoclonal tel que les fragments Fab, F , entrent galement dans le cadre de la presente invention. Les fragments d'anticorps sont obtenus par des techniques classiques. Par exemple, des fragments de liaison utiles peuvent etre prepares en effectuant la digestion de l'anticorps au moyen d'une peptidase, comme la papaine ou la pepsine.
Des anticorps similaires, comprenant des anticorps d'isotypes différents, d'affinités différentes et ayant des fonctions biologiques nouvelles, telles que l'aptitude ä tuer des cellules tumorales en presence de complement ou de cellules effectrices telles que les lymphocytes ou les macrophages, entrent également dans le cadre de la presente invention. Bien que l'exemple particulier ci-dessus du nouvel anticorps de la présente invention concerne un anticorps se liant a un site de determinant specifique sur l'antigène respectif et appartenant â la sous-classe IgG1 d'origine murine, cela n'est pas limitatif.
L'anticorps ci-dessus et les anticorps fonctionnellement équivalents à l'anticorps cidessus, qu'ils soient d'origine murine ou proviennent d'un autre mammifère, y compris l'homme, ou d'autres sources, ou de leurs associations, entrent dans le cadre
<Desc/Clms Page number 15>
de la présente invention, de même que des anticorps d'autres isotypes.
L'expression "fonctionnellement qui- valent" isgnifie que l'anticorps est capable de se lier au site de determinant décrit ci-dessus et est capable d'entrer en competition pour un tel site avec un anti- corps. particulier de la présente invention. C'est-a- dire que cet anticorps, lorsqu'il est associé ä un 6chan- tillon contenant une cellule ou un fragment cellulaire possédant un tel site de determinant, se lie ä ce site de determinant et bloque la liaison d'un anticorps de la présente invention a un tel site.
En outre, puisque l'antigene de la présente invention peut posséder plus d'un site de determinant, la présente invention comprend des anticorps monoclonaux qui définissent des sites de determinants autres que les sites de déterminants définis par l'anticorps monoclonal mentionne ci-dessus et qui peuvent être identifies par des analyses d'immuno- precipitation sequentielle, connues dans la pratique.
La presente invention comprend également des anticorps prepares en reponse des sites de liaison d'antigènes, ou des idiotypes de l'anticorps L20, puisque ces anticorps anti-idiotypiques peuvent être utilises pour analyser la réponse immunitaire à des antigenes tumoraux à des fins de diagnostic et pour induire des reponses immunitaires ä des fins therapeutiques ou pro- phylactiques (Nepom et collaborateurs, 1984, Proc. Nat'l
EMI15.1
Acad. Sei.
: 2664).2. 2. 1 ANTIGENE 1. 20 RECONNU PAR LES
ANTICORPS MONOCLONAUX
L'antigene reconnu par les anticorps monoclonaux de la presente invention comprend un nouvel antigène glycoprotéique de surface cellulaire carac- éristique des cellules de CPCNP, et de certains autres carcinomes, comprenant le carcinome du sein, le carcinome du colon et le carcinome pulmonaire à petites cellules.
<Desc/Clms Page number 16>
L'antigène possede un poids moléculaire d'environ 110 000 daltons.
La sequence amino terminale des amino-acides du nouvel antigene glycoproteique est la suivante :
1 5 10 15 20 L-X-v-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-T-D-A-X-L séquence dans laquelle X représente u-n amino-acide qui n'a pas té identifié jusqu'S present, et le reste des lettres représente les abréviations classiques utilisant une seule lettre, pour les amino-acides. Une comparai- son de cette sequence ä celles accumulees dans la base de données concernant les protéines courantes (PIR Release 6, 0, Novembre 1985) ne révèle aucune homologie signifi- cative de séquence avec toutes les autres sequences connues.
EMI16.1
2. 3. UTILISATIONS DES ANTICORPS MONOCLONAUX ET DE L'ANTIGENE L20
2. 3. 1. APPLICATIONS DE DIAGNOSTIC
Les anticorps monoclonaux de la presente invention peuvent être utilisés comme sondes la détection d'antigènes discrets dans le CPCNP humain et d'autres tumeurs humaines. Un procédé de la presente invention comprend la détermination de la présence d'un état malin dans le tissu pulmonaire et d'autres tissus humains par examen du tissu en ce qui concerne l'expression ou l'absence d'expression d'un antigene glycoprotei- que ayant les caractéristiques de l'antigène L20. L'expression "ayant les caractéristiques de" signifie que l'antigène est réactif avec un anticorps qui reconnaît l'antigène L20.
L'expression ou l'absence d'expression de cet antigene peut donner une information cliniquement exploitable qui ne peut être obtenue avec des techniques histopathologiques classiques.
<Desc/Clms Page number 17>
Les anticorps monoclonaux de la présente invention peuvent être utilisés, par exemple, pour dites- ter des cellules de carcinome pulmonaire ä cellules non petites dans des échantillons histologiques et cytoJogiques. Par exemple, en utilisant la technique de coloration ä l'immunoperoxydase décrite dans le paragraphe 3. 4., des échantillons tissulaires excisés de carcinome du poumon du type adénocarcinome, carcinome épidermoide et carcinome Åa petites cellules ont présenté une coloration positive intense. Des échantillons normaux de poumon, de rate, de sein, de colon, de rein, de foie, de cerveau, de coeur, de peau, de thyroid, de testicule, de vagin, et des lymphocytes normaux étaient nega- tifs.
Une autre application importante de diagnostic in vitro des anticorps monoclonaux de la presente invention est l'évaluation de carcinomes autres que le CPCNP. L'anticorps a été utilise pour détecter l'epitope dans des carcinomes du sein, du colon et dans le carcinome pulmonaire ä petites cellules. Des échantillons normaux de ces tissus n'ont pas effectue l'expression du déterminant. Ainsi, l'anticorps monoclonal est utile pour détecter dans ces carcinomes un déterminant antigénique qui est associé à la tumeur. L'anticorps monozonal peut donc être un reactif de diagnostic utile pour le carcinome du sein, le carcinome du colon et le carcinome pulmonaire à petites cellules.
En variante, des techniques d'immunofluorescence peuvent être utilisées pour examiner des echantillons de tissus humains avec les anticorps monoclonaux de la présente invention. Dans un protocole classique, des lames portant des coupes effectuées en cryostat d'échantillons de biopsie tissulaire congelés, non fixes, des échantillons de tumeurs excisés ou des frottis cytologiques sont seches à l'air et mis ä incuber avec l'anti-
<Desc/Clms Page number 18>
corps monoclonal dans une chambre humide à température ambiante.
Les frottis cytologiques comprennent des chantillons de cellules exfo]1atives. Le terme"exfoliative" signifie que l'échantillon comprend des cellules isolees ou des agrégats cellulaires obtenus par raclage ou lavage de la surface du. tissu, cellules qui sont prélevées isolement ou sous forme de squames ou de lames. L'echan- tillon-de cellules exfoliatives doit être d1fférencié du tissu excisé tel qu'obtenu à la biopsie. Le procédé peut etre utile dans la détection d'un etat malin chez des échantillons de cellules exfoliatives provenant du poumon tels qu'un échantillon d'expectoration, provenant des bronches, du tractus gastro-intestinal, comprenant la region orale du pharynx, la bouche, un frottis cervical, etc.
Après sechage, les lames sont recouvertes d'une preparation d'anticorps contre l'anticorps monoclo- nal, habituellement un type quelconque d'anti-immunoglobuline de souris si l'anticorps monoclonal utilisé provient de la fusion d'un lymphocyte de rate de souris et d'une lignée de myélome de souris. Cette anti-immunoglobuline de souris est conjuguée en utilisant des techniques connues avec un composé tel que l'isothiocyanate de fluorescéine ou de rhodamine qui emet une fluorescence Åa une longueur d'onde particulière. Le profil de coloration et les intensites concernant l'échantillon sont alors déterminés par microscopie en lumiere fluorescente et éventuellement photographies.
La description ci-dessus concerne essentiellement l'utilisation des anticorps de la presente invention dans des techniques d'immunofluorescence. Cependant, les anticorps de la présente invention peuvent être utilises dans la plupart des analyses faisant intervenir des reactions antigène-anticorps. Les analyses peuvent être homogènes ou hétérogènes. Dans une analyse homogene, l'échantillon peut être un tissu lyse et clari-
<Desc/Clms Page number 19>
fi pour éliminer les debris. La réaction immunologique comprend habituellement l'anticorps spécifique, un analyte servant de marqueur et 1" échantillon intéressant.
Le signal provenant du marqueur est modifié, directement ou indirectement, par la liaison de l'anticorps ä l'analyte marqué. La reaction immunologique et la détection de l'importance de cette réaction sont conduites en solution homogene. Les marqueurs immunochimiques qui peuvent être utilises comprennent des radicaux libres, des colorants fluorescents, des enzymes, des bactériophages, des co-enzymes, etc.
Dans une methode d'analyse heterogene, les réactifssonthabituellementl'échantillon, l'anticorps spécifique et un système destine ä produire un signal detectable. Un support solide ou une phase solide sont habituellement revêtus de l'anticorps monoclonal. L'echan- tillon en liquide est alors mis en contact avec l'anticorps en phase solide. Le support en phase solide est alors sépare de la phase liquide, et la phase solide ou la phase liquide est examinee en ce qui concerne un signal detectable en utilisant des systemes destinés à produire ce signal. Le signal est lie ä la presence de l'analyte dans l'échantillon. Les systemes de production d'un signal detectable comprennent l'utilisation de marqueurs radio-actifs, de substances fluorescentes, d'enzymes, etc.
Des exemples d'analyses immunologiques hétérogènes sont l'analyse radio-immunologique, les méthodes d'immunofluorescence, les analyses immunologiques par liaison enzymatique, etc.
Pour une discussion plus en détail des techniaues d'analyse immunologique ci-dessus, voir"EnzymeImmunoassay", par Edward T. Maggio, 1980, CRC Press, Inc., Boca Raton, Floride. Voir egalement, par exemple, les brevets des ETats-Unis d'Amérique N 3 690 834 ; NO 3 791 932 ; NO 3 817 837 ; No 3 850 578 ; NO 3 853 987 ;
<Desc/Clms Page number 20>
EMI20.1
NO 3 867 517 ; NO 901 654 ; NO 3 935 074 ; NO 984 533 ; NO 3 996 345 et NO 4 098 876 dont l'énumération pas destinee ä être exhaustive.
Les anticorps de la présente invention peuvent également etre utilises pour des applications de diagnostic in vivo. Par exemple, des anticorps ou des fragments prepares ä partir des anticorps, par exemple les fragments Fab et F(ab')2, peuvent être utilisés pour visualiser des tumeurs, comprenant des dépôts metastatiques chez des patients humains présentant un CPCNP, d'une manière analogue ä celle decrite pour le mélanome malin dans Larson et collaborateurs, 1983, J. Nucl.
Med. 24 : 123 et dans Larson et collaborateurs, 1983, J. Clin. Invest. 72 : 2101. L'anticorps purifiä ou ses fragments sont marqués avec un agent donnant un signal
EMI20.2
131 détectable, par exemple un radio-isotope tel que I, et est administre à un patient dans un véhicule convenable, par exemple par voie intraveineuse. La localisation de l'antic. orps lié â 1a tumeur est détectée par scinti- graphie externe, tomographie d'emission ou radiologie nucleaire, en utilisant, par exemple, une camera gamma.
2. 3. 2. APPLICATIONS THERAPEUTIQUES
Les anticorps de la présente invention peu- vent également être utilisés en therapeutique. Les anti- corps monoclonaux peuvent être utilisés en association avec un large spectre de medicaments ou d'agentscyto- toxiques. Par exemple, un anticorps peut etre lié ä une toxine afin de former une immunotoxine (Jansen et colla- borateurs, 1982, Immunol. Rev. 62 : 185) ou à une matière radio-active, par exemple 125E, 131E, etc. 9Order, 1984, Compr. Ther. 10 : 9 ; Larson et collaborateurs, 1983, J. Clin. Invest. 72 : 2101 ; Carrasquillo et collaborateurs, 1984, Cancer Treatment Reports, 68 : 317). ou bien à un médicament (Rowland et collaborateurs, 1985, Cancer Immunol.
Immunother. 12 : 1) afin de former une substance
<Desc/Clms Page number 21>
radiopharmaceutique ou pharmaceutique. Des anticorps conjugues peuvent être administres a des patients afin d'obtenir des effets anti-tumoraux accrus par l'action cytotoxique de l'agent chimiotherapeutique délivré à la tumeur, sur la base de l'affinité de liaison de la portion anticorps.
Des molécules, appelées "anticorps chimère" peuvent etre préparées ä partir de l'anticorps de la
EMI21.1
présente invention, molecules contenant de liaison Åa l'antigene de souris avec des domaines un domaineconstants chez l'homme (Morrison et collaborateurs, 1984, Proc. Nat'l Acad. Sei. U. S. A. 8n : 6851 ; Takeda et collaborateurs, 1985, Nature, 314 : 452) et cette voie peut être utilisée pour elaborer de nouvelles molécules d'anticorps ayant des fonctions d'effecteur avantageuses telles que l'aptitude ä activer le complement humain et à effectuer la mediation de la CCDA (Neuberger et collaborateurs, 1984, Nature 312 : 604).
Une autre utilisation thérapeutique des anticorps monoclonaux de la présente invention est la preparation d'anticorps anti-idiotypique en utilisant l'anticorps L20 comme agent immunogene (voir, par exemple, Nepom et collaborateurs, 1984. Proc. Nat'l Acad. Sei.
U. S. A.. : 2864 i Lee et collaborateurs, 1985, Proc.
EMI21.2
Nat'l Acad. Sei. 82
Un aspect interessant de la presente invention est la possibilité d'associer les anticorps de l'invention ä d'autres anticorps contre le CPCNP ou d'autres tumeurs, telles que celles décrites dans les demandes de brevets des Etats-Unis d'Amérique NO 667 521. déposée le 2 Novembre 1984, N 684 759, déposée le 21 Décembre 1984 et NO 738612. déposée le 28 Mai 1985. L'association est efficace pour détecter les types de carcinomes pulmonaires Åa cellules non petites mentionnes ci-dessus, ä savoir le carcinome pulmonaire indifferencie
<Desc/Clms Page number 22>
EMI22.1
à grandes cellules, l'adénocarcinome et le carcinome épidermolde.
Les anticorps monoclonaux de la présente invention définissent egalement des sites de determi- nants sur un antigene associé Åa d'autres carcinomes tels que les carcinomes du sein, les carcinomes du colon et le carcinome pulmonaire ä petites cellules (voir paragraphe 3. tableau I). En consequence, les anticorps de l'invention peuvent trouver une application dans des procédés thérapeutiques et des produits thérapeutiques destines Åa ces carcinomes.
Le nouvel antigène de la presente invention, applé antigène L20, peut également être utilise pour des applications thérapeutiques. L'antigène peut être purifié ä partir de tumeurs ou produit par la technologie
EMI22.2
de l'ADN recombinant (Brown et collaborateurs, demande de brevet des E.
U. A NQ 827 3î3 déposée conjointementle 7 Février 1996, cite en référence dans le présent memoire. Le gène codant pour l'antigène L20 peut être clone par des procedés qui comprennent tout d'abord l'enrichissement de l'ARNm de l'antigene L20. Par un tel procede, des polysomes (consistant en ARNm, ribosomes et chaines polypeptidiques naissantes) peuvent être purifies par chromatographie d'immuno-affin1té avec un anticorps qui reconnaft le déterminant antigénique L20 sur la chafnenaissante. l'ARNm est isolé par immunoprécipitation avec, par exemple, l'anticorps L20 et l'ADNc est clone dans un vecteur d'expression approprie.
En variante, l'anticorps L20 ou un anti-serum contre l'antigène L20 peut etre utilise pour selectionner une banque d'ADNc en utilisant un vecteur d'expression. L'antigène L20 purifie ou cloné peut etre administre seul comme agent immunogene ou associé à un adjuvant immunologique convenable.
En variante, le gene codant pour l'antigene peut être
<Desc/Clms Page number 23>
inséré dans le gène codant pour un virus, tel que le virus vaccinal, pour produire un ADN recombinant destine a être utilisé comme agent immunogène (Brown et collaborateurs, demande de brevet des E. U. A. ? 827 313 déposée conjointement le 7 février 1986).
2. 4. KITS DE DIAGNOSTIC La présente invention comprend également des kits de diagnostic destines ä mettre en oeuvre les procedes décrits ci-dessus. Dans une forme de réalisation, le kit de diagnostic comprend (a) un anticorps monoclonal défini plus précisément ci-dessus et (b) un conjugué d'un membre de liaison spécifique pour l'anticorps monoclonal et un marqueur capable de produire un signal détectable. Les réactifs peuvent également comprendre des agents auxiliaires tels que des agents tampons et des agents stabilisant les protéines, par exemple des polysaccharides, etc. Le kit de diagnostic peut comprendre en outre, lorsque cela est nécessaire, d'autres constituants du système producteur de signal, comprenant des agents destinés ä diminuer l'interférence due au bruit de fond, des réactifs témoins, un appareil destiné effectuer un essai, etc.
Dans une autre forme de realisation, le kit de diagnostic comprend un conjugué d'un anticorps monoclonal de la presente invention et un marqueur capable de produire un signal detectable. Des agents auxiliaires, tels que mentionnes ci-dessus, peuvent également être presents.
3. EXEMPLES I. a presente invention est en outre démontrée par les exemples illustratifs non limitatifs suivants.
3. 1. PREPARATION DES ANTICORPS MONOCLONAUX Des anticorps monoclonaux ont été produits en utilisant des techniques de fusion d'hybridomes decrites précédemment par Yeh et collaborateurs, 1979,
<Desc/Clms Page number 24>
EMI24.1
Int. J. Cancer 29 Une souris Balb/c âgée de trois mois a été immunisée en utilisant des cellules cultivées obtenues par explantation partir d'un adénocarcinome pulmonaire humain appelé 3082, comme agent immunogène.
Les souris ont reçu quatre injections intrapéritonéales d'environ 107 cellules. Trois jours apres la dernière immunisation, la rate a été prélevée, mise en suspension dans un milieu de culture et les cellules ont ete fusionnées à des cellules de myelome NS1 de souris (Kohler et Milstein, ci-dessus). Le melange a été ensemencé pour former des cultures de faible densite provenant des seules cellules fusionnees (clones).
Les surnageants provenant des cellules hybrides ont ete examinés en ce qui concerne l'activité de liaison directe sur des lignées cellulaires de cancer du poumon en utilisant une analyse par immunosorbant lie un enzyme ("ELISA") et une analyse autoradiographi- 125 que indirecte de proteine A marquee par I (Brown et collaborateurs, 1979, J. Immunol. Meth., 31 : 201). Des extraits de membranes cellulaires provenant de la tumeur utilisée pour l'immunisation ont et6 prepares en utili-
EMI24.2
sant un procéde et collaborateurs, 1981, Cancer Res. ; Yeh et collaborateurs, ci-dessus. Les tissus ont été lavés avec du tampon physiologique phosphate et les cellules provenant de tumeurs intactes ont été mises en suspension par pression ä travers un tamis en acier inoxydable.
Ensuite, 1 mM de NaHC02 contenant 1 mM de fluorure de phenylethylsulfonyle (Calbiochem-Behring Corp., San Diego, Californie) a été ajouté, et la matière a été alors homo- geneisee sur de la glace, avec 50 oscillations du pilon B d'un homogénéiseur Dounce. Apres centrifugation pendant 15 minutes Åa 27 000 x g, le surnageant a été éliminé, et La pastille a été remiseen suspension dans du tampon physiologique phosphate, a été traitée par sonication
<Desc/Clms Page number 25>
pendant 1 minute et a été entreposée à -70 C.
Les hybridomes qui ont produit des anticorps se liant aux extraits de membranes cellulaires ont été clones, développes in vitro et essayés de nouveau en ce qui concerne la spécificité de l'anticorps. Les hybri- domes qui ont produit un anticorps ayant une reelle spécificité pour le cancer pulmonaire humain ont été reclonés, développés et injectes dans des souris Balb/c âgées de trois mois, conditionnées au pristane, où ils se sont développés sous forme de tumeurs ascitiques.
En suivant ce procédé, une lignée cellulaire d'hybridome L20 a été obtenue, clonee et injectée dans des souris afin qu'elles se développent sous forme de tumeurs ascitiques. L'anticorps sécrété dans l'ascite a té purifié sur du protéine A-Sepharose (Ey et collabo- rateurs, 1978, Immunochemistry, : 429) ou par filtration sur gel dans du Sephacryl S-300. L'anticorps purifié a été utilisé pour une caractérisation ultérieure.
3. 2. CARACTERISATION DE L'ANTICORPS MONOCLONAL L20 3. 2. 1. DETECTION ET LIAISON DE L'ANTICORPS L20
A DES CELLULES EN CULTURE
La localisation subcellulaire de l'antigène a été determinee en mesurant la liaison de l'anticorps ä des cellules avant ou apres perméabilisation avec un détergent non ionique. Les anticorps se liant à la surface de cellules intactes en culture ont té identi- fiés par des analyses de liaison directe avec un anti-
125 corps marque par I (Brown et collaborateurs, 1981, Proc. Nat'l Acad. Sei. U. S. A., 78 : 539) ou bien par fluo- rescence indirecte en utilisant le trieur de cellules activées par fluorescence (TCAF) II.
Les anticorps se liant à des emplacements intracellulaires ont été deter-
EMI25.1
125 mines par liaison directe d'anticorps marqué des cellules après fixation au para-formaldéhyde et permeabilisation ultérieure avec le détergent non ionique NP-40.
<Desc/Clms Page number 26>
Pour les analyses de liaison effectuées en utilisant des anticorps radiomarques (Brown et collaborateurs, ci-dessus), des cellules en culture (106) ont
EMI26.1
été sur de la glace pendant 30 minutes avec 6 10 cpm d'anticorps marqué par 1 dans 100 pl de tampon de liaison. La suspension a été étalée sur 0, 2 ml de dinonylphtalate : dibutylphtalate (dans le rapport 1 : 1 en volume/volume) et a été centrifugée. Un comptage
EMI26.2
125 du 1251 a la pastilleetla phase aqueuse. eté effectué surPour mesurer la liaison non specifique, des incubations ont été effectuées en parallele avec un anticorps non marqué comme compétiteur (Brown et collaborateurs, cidessus).
EMI26.3
TABLEAU I
EMI26.4
<tb>
<tb> LIAISON <SEP> D'ANTICORPS <SEP> L20 <SEP> RADIOMARQUE <SEP> A <SEP> L'IODE <SEP>
<tb> A <SEP> DES <SEP> CELLULES <SEP> EN <SEP> CULTURE
<tb> CELLULES <SEP> LIAISON <SEP> SPECIFIQUE
<tb> Adénocarcinome <SEP> pulmonaire <SEP> Calu-1 <SEP> 45 <SEP> 400
<tb> Adénocarcinome <SEP> pulmonaire <SEP> H3082 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> Adénocarcinome <SEP> pulmonaire <SEP> H2981 <SEP> 64 <SEP> 100
<tb> Adénocarcinome <SEP> pulmonaire <SEP> H2984 <SEP> 119 <SEP> 300
<tb> Carcinome <SEP> du <SEP> sein <SEP> MCF7 <SEP> 78 <SEP> 800
<tb> Melanome <SEP> 3017 <SEP> 2200
<tb> Cellules <SEP> T <SEP> normales <SEP> 200
<tb> Leucemie <SEP> T <SEP> de <SEP> Jurkat <SEP> 200
<tb> Lymphome <SEP> B <SEP> de <SEP> Daudi <SEP> 200
<tb>
EMI26.5
3. 2.
DE L'ISOTYPE DE L'ANTICORPS L20 Afin de determiner la classe d'immunoglobu- lines produites par la lignée cellulaire d'hybridomes L20, les techniques suivantes ont été utilisées : (a) Immunodiffusion d'Ouchterlony Une portion aliquote de surnageant de cellules d'hybridomes particulières a été placée dans le godet central d'une plaque de gélose ä 25 %. Des isotypes d'anticorps monospécifiques de lapin anti-Ig de souris
<Desc/Clms Page number 27>
(Southern Biotechnology, Birmingham, AL) ont été places dans les godets extérieurs et la plaque a été mise à incuber pendant Z heures à température ambiante et pendant une nuit ä 4 C.
(b) Détermination de l'isotype par EISA
Des plaques à 96 godets Dynatech Immuolon ont té recouvertes avec chaque anti-sérum à une concentration de 1 g/ml, 50 \. 11 par godet dans du PBS et ont été laissées recouvertes pendant une nuit à 4 C.
EMI27.1
Les plaques ont été lavées avec un mélange PBS/Tween 20, 0, et ont été remplies avec 100 III de milieu par godet pendant 1 heure ä temperature ambiante. Après lavage des plaques, les surnageants provenant de l'hybri- dome L20 ont été ajoutés et l'incubation a été effectuée à température ambiante pendant 1 heure.
Apres lavage
EMI27.2
avec du PBS, des plaques contenant de la sérum-albumine bovine (SAB) ont été mises ä incuber à 37 C pendant 2 heures avec des isotypes d'anticorps monospecifiquesde lapin anti-Ig de souris couples à de la peroxydase (Zymed). Après lavage, les plaques ont été incubées avec 1 mg/ml d'ortho-phenylenediamine et 0,03% de H2O2 dans 0, 1 M de tampon au citrate à pH 4,5. La densité optique ä 630 nm a été déterminée sur un lecteur de plaque ELISA Dynatec.
L'anticorps monoclonal L20 présente l'isotype IgGl.
3. 3. ANTIGENE RECONNU PAR L'ANTICORPS L20
Afin d'identifier des antigenes proteiques, des cellules de carcinome pulmonaire ont été radiomar- queers en surface ä l'iode ou marquees mdtaboliquement avec de la 35 S-méthionine. Les antigènes ont été isolés à partir de lysats cellulaires par incubation avec un anticorps monoclonal, addition d'anticorps de chèvre anti-IgG de souris et adsorption sur Staphylococcus aureus.
Les immuns précipités ont été laves et soumis
<Desc/Clms Page number 28>
à une electrophorese präparative sur gel de polyacrylamide au dodécycsulfate de sodium (SDS-PAGE) sur du gel d'acrylamide ä 10-20 %. Après electrophorese, le gel a été colore avec du bleu brillant de coomassie (0, 5 % en poids pour 10 % d'acide acétique et, 30 % d'isopropanol) et a té décoloré dans une solution d'acide acétique (5 % en volume/volume) et de méthanol (17 % en volume/volume). La bande. d'antigène L20 coloré a été prélevée avec une lame de rasoir et a été immédiatement soumise ä une electro-elution avec un électro- eluteur/concentrateur ECU-040 (C. B. S.
Scientific Co., San Diego, Californie) suivant des procedes décrits par Hunkapiller et collaborateurs, 1983, Methods in Enzymol. 21 : 227-236.
Une dégradation automatique d'Edman a été effectuee avec approximativement 23 pmoles d'antigène L20 (sur la base du rendement en L-1 identifie) dans un séquenceur en phase gazeuse (modèle 470A, Applied Biosystems, Inc., Foster City, Californie). Les dérivés d'amino-acides formes avec la phénylthiohydantoïne ont été realises par chromatographie en phase liquide Åa haute performance (CLHP) avec inversion de phase en utilisant un appareil de CLHP en ligne modèle 120A (Applied Biosystems, Inc. ) avec une colonne PTH-C18 (2, 1 x 220 mm, Applied Biosystems, Inc. ) et un gradient acetate de sodium/tétrahydrofuranne/acétonitrile pour l'elution.
La sequence amino terminale des amino-acides est la suivante :
EMI28.1
dans laquelle X représente un amino-acide qui n'a pas été identifié.
La comparaison de cette séquence avec celles conservées dans la base de données sur les protéines
<Desc/Clms Page number 29>
classiques (PIR Release, 6, 0, Novembre 1985) n'a révélé aucune homologie significative de sequence avec n'importe quelle autre séquence connue.
L'antigene reconnu par l'anticorps L20 est un antigene glycoprotéique ayant un poids moléculaire d'environ 110 000 daltons.
3. 4. APPLICATION IMMUNOHISTOLOGIQUE IN VITRO
La technique utilisant un anticorps non marqué de Sternberger, 1979, in Immunochemistry, John Wiley & Sons, New York, pages 104-169, telle que modifiée par Garrigues et collaborateurs, 1982, Int. J. Cancer : 511, a été utilisée pour des études immunohistologiques sur des coupes congelées. Les tissus servant de cibles pour ces essais ont été obtenus par chirurgie et congelés dans les 4 heures suivant le prélèvement dans de l'isopentane, refroidi préalab1ement dans de l'azote liquide. Les tissus ont été alors entreposes dans de l'azote liquide ou bien à -70 C jusqu'à uti lisation.
Une anti- (IgG de souris) de lapin (SternbergerMeyer Immunochemicals, Inc., Jarettsville, MD) a été utilisée a une dilution de 1/50. Des complexes peroxydase de souris-anti-peroxydase (PAP, Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc. ) contenant 2 mg/ml de PAP purifié soigneusement ont ete utilises ä une dilution de 1/80. Des coupes congelées ont été preparees, séchées, traitees avec de 1'acétone et déshydratées (Garrigues et collaborateurs, ci-dessus).
Les coupes devant être utilisees pour un essai histologique ont ete colorées avec de l'hematoxyline. Pour diminuer les bruits de fond non spécifiques. la pré-incubation des coupes a ete effec- tuée avec du serum humain normal dilue au 1/5 (Garrigues et collaborateurs, ci-dessus). Les anticorps de souris, l'anti-(IgG de souris) dechevreetle PAP de souris ont été dilues dans une solution de sérum humain normal ä 10 % et de sérum de lapin ä 3 %.
<Desc/Clms Page number 30>
Le procédé de coloration consistait ä traiter des coupes seriees avec un anticorps spécifique ou un anticorps témoin pendant 2, 5 heures, à effectuer l'incubation pendant 30 minutes avec de 1'anti-(IgG souris) de lapin diluée au 1/50 et ä effectuer la mise en contact
EMI30.1
avec du complexe PAP de souris au 1/80 pendant 30 minutes. Après chaque traitement avec un anticorps, les lames ont été lavées deux reprises dans du PBS. réaction a ete developpee avec du tetrachlorhydrate dilue(Sigma, St. Louis, MO) et h2O2 à 0,01 % dans du tampon tris 0,05 M. à pH 7,6, pendant 8 minutes. En outre, l'exposition Åa une solution de ost, ä 1 % dans de l'eau distill$e pendant 20 minutes a permis d'intensifier la coloration.
Les coupes ont été rincees ä l'eau, deshydratées dans l'alcool, éclaircies au xylene et montées sur lames.
Les lames ont été chacune evaluees après numérotation et les échantillons numérotés ont été contrees par un chercheur indépendant. Les lames caractéristiques ont été photographiees en utilisant une optique à contraste interférentiel différentiel (Zeiss-Nomarski). Le degré de coloration de l'anticorps a été évalué comme etant égal à 0 (aucune réactivité),
EMI30.2
+ (quelques cellules légèrement positives), ++ (au moins un tiers de cellules positives), +++ (la plupart des cellules positives), (approximativement toutes les cellules fortement positives). Puisque les differen- ces entre la coloration + et la coloration 0 etaient moins tranchées qu'entre la coloration + et la coloration ++, une coloration classée comme étant égale ou supérieure à ++ a ete considérée comme "positive".
Des cellules néoplastiques et des cellules de stroma ont été observées dans des echantillons de tumeurs. La coloration observée est celle des cellules tumorales, puisque les
<Desc/Clms Page number 31>
cellules de stroma n'jetaient pas colorées du tout, ou bien étaient colorées beaucoup plus faiblement que les cellules tumorales.
EMI31.1
TABLEAU 11 COLORATION PAR IMMUNOPEROXYDASE D'ECHANTILLONS DE
TUMEURS ET DE TISSU NORMAL AVEC L'ANTICORPS
MONOCLONAL L20 TYPE DE TISSU NOMBRE POSITIF/NOMBRE ESSAYE*
EMI31.2
<tb>
<tb> Carcinome <SEP> pulmonaire <SEP> : <SEP>
<tb> adénocarcinome <SEP> 18/20
<tb> epidermolde <SEP> 3/3
<tb> bronchique <SEP> 0/1
<tb> à <SEP> petites <SEP> cellules <SEP> 4/4
<tb> Carcinome <SEP> pulmonaire <SEP> :
<SEP>
<tb> lignées <SEP> cellulaires <SEP> 3/3
<tb> Carcinome <SEP> du <SEP> sein <SEP> 4/7
<tb> Carcinome <SEP> du <SEP> colon <SEP> 5/8
<tb> Mélanome <SEP> 5/8
<tb> Carcinome <SEP> renal <SEP> 1/1
<tb> I. <SEP> iposarcome <SEP> 0/1 <SEP>
<tb> Poumon <SEP> normal <SEP> coloration <SEP> lagere <SEP> de <SEP> 1 <SEP> des <SEP> 3
<tb> échantillons <SEP> essayés
<tb> Rate <SEP> normale <SEP> négatif
<tb> Sein <SEP> normal <SEP> négatif
<tb> Colon <SEP> normal <SEP> negatif
<tb> Rein <SEP> normal <SEP> négatif
<tb> Foie <SEP> normal <SEP> négatif
<tb> Cerveau <SEP> normal <SEP> négatif
<tb> Coeur <SEP> normal <SEP> negatif
<tb> Peau <SEP> normale <SEP> négatif
<tb> Thyrolde <SEP> normale <SEP> négatif
<tb> Testicule <SEP> normal <SEP> négatif
<tb> Vagin <SEP> normal <SEP> negatif
<tb> Culot <SEP> de <SEP> lymphocytes
<tb> normaux <SEP> negatif
<tb>
* Tous les
echantillons examines étaient des coupes congelées de tissus obtenus après chirurgie. Voir le texte pour la description en détail des procédés immunohistologiques. Une coloration de 2 + {représentant au moins un tiers de cellules positives) a été considérée comme positive.
<Desc/Clms Page number 32>
11 va de soi que la presente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre.
Une Jignée cellulaire L20, teIle que décrite dans le présent mémoire, a été déposée ä l'American Type Tissue Culture Collection, Rockville, Maryland, et il lui a été attribue le numéro de dépôt ATCC HB8913.
Le cadre de l'invention décrite et revendiquee dans le présent mémoire n'est pas limite par la lignée cellulaire déposée puisque la forme de réalisation déposée est simplement proposée comme illustration d'un aspect de l'invention et n'importe quelle lignée cellulaire équivalente qui produit un anticorps monoclonal fonctionnellement äquivalent entre dans le cadre de la présente invention. En fait, diverses modifications de l'invention, outre celles présentées et décrites dans le present mémoire, seront évidentes pour l'homme de l'art d'après la description précédente.