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Microbilles de verre à propriétés bactériostatiques et procédé de fabrication de telles microbilles
La presente invention concerne des microbilles de verre à propriétés bactériostatiques, leur procédé de fabrication et leur application dans les lits fluidités d'hôpitaux destinés au traitement des brûlés.
Les propriétés bactériostatiques et bactéricides d'un certain nombre de produits de synthèse ou naturels ont été étudiées de longue date et certains de ceux-ci font partie de la pharmacopée traditionnelle tels les anti-biotiques ou les désinfectants.
Depuis quelques années sont apparus dans les hôpitaux, des lits spéciaux pour le traitement des personnes atteintes de brûlures graves qui comprennent une literie fluidisée c'est à dire un matelas ou des coussins formes de particules mises en fluidisation dans un gaz tel que I'air et maintenues en place sous une toile perméable au gaz. Parfois, le lit est aussi simplement constitué d'une cuve en acier contenant les fines particules solides. Le socle comprend une soufflerie qui aspire de l'air de la pièce au travers d'un filtre. Cet air est comprimé
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et réchauffe à une température de l'ordre de 31 à 38 C. L'air pénètre dans la couche de fines particules, épaisse de 25 cm environ, et les met en fluidisation. Les particules sont emprisonnées dans une toile, par exemple en polyester, perméable au gaz.
Les liquides qui s'écoulent du patient forment avec certaines particules des agglomérats que l'on retire périodiquement à l'aide d'un tamis placé au fond de la cuve.
11 est évident qu'une telle literie ne peut contenir ou favoriser la présence de souches microbiennes ou de bactéries. C'est pourquoi. selon la demande de brevet FR 2. 523. 841, on a proposé d'ajouter à des particules telles que des microbilles de verre formant ie milieu fluidisé, des particules d'une autre matière ayant des propriétés bactéricides. Ces particules sont des particules de métal tel que le calcium, le magnésium, l'aluminium, le bismuth ou des particules de silicium.
Outre la complexité que constitue le choix de la granulométrie de telles particules pour les rendre fluidisables sans ségrégation avec les microbilles de verre, il va sans dire qu'une teile solution présente un danger d'utilisation certain (danger d'inflammation en présence d'humidité, d'un point chaud ou même à température ambiante pour le calcium). ü s'avere préférable de trouver d'autres moyens pour conférer A ladite literie des propriétés bactéricides ou bactériostatiques, qui soient plus simples et plus sûrs.
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Selon la présente invention, des microbilles de verre sont caractérisées en ce qu'elles portent un revêtement de protéines, liées au verre de façon covalente, et qui confèrent à ces billes des propriétés bactériostatiques.
La présente invention répond ainsi à la demande de literies à propri- étés bactéricides et bactériostatiques puisqu'elle permet, entre autres, de mettre dans les lits fluidisés d'hôpitaux, une seule espèce de particules : des microbilles de verre qui possèdent par elles-mêmes des propriétés bactériostatiques et qui peuvent être recyclées et régénérées.
Les microbilles selon l'invention, auxquelles sont fixées de manière covalente des protéines qui leur assurent un pouvoir bactériostatique conservent leurs propriétés au cours du temps : ces propriétés sont maintenues si les billes sont stockées dans de bonnes conditions (emballage. hermétique, sec) pendant plusieurs mois avant utilisation et conservent leur pouvoir bactériostatique pendant une durée compatible avec leur utilisation dans les lits fluidisés, c'est à dire pendant plusieurs jours voire plusieurs semaines d'exposition à l'air. Ce pouvoir bactériostatique est maintenu lorsque les billes sont dans une atmosphère humide
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ou lorsqu'elles sont soumise à une température modérée (par exemple inférieure OL 60 ou 70 C).
Le pouvoir bactériostatique est préservé même lorsque les billes sont soumises entre elles à de l'abrasion lors de leur manutention et manipulation. On pense que ceci est dû à la liaison covalente qui existe entre les protéines et le verre. De façon tout à fait inattendue, on constate que malgré que les dites pro- téines soient fixées au verre par un lien covalent, celles-ci conservent leurs propri- étés et sont capables de conférer celles-ci aux microbilles qui les supportent.
Comme indiqué déjà précédemment, nos microbilles présentent des propriétés bactériostatiques et dans de nombreux cas, elles sont aussi bactéricides, en foncdon de la nature des protéines et de leur concentration. A titre d'exemple, il est très aisé de les rendre capables de tuer ou de limiter la croissance et la multiplication de bactéries telles que Escherichia Coli, Salmonellas, Pseudomonas, Légionellas et Staphylocoques dorés.
Les microbilles selon l'invention peuvent etre utilisées en contact direct avec la peau, par exemple dans des pansements et dans ce cas on choisira de préférence un verre spécial biodégradable. On peut envisager aussi de fixer sur les microbilles des protéines qui les rendent actives, du point de vue bactéricide, dans le tube digestif des etres humains et des animaux. On peut les utiliser aussi pour créer un milieu stérile hors de contact du corps, comme c'est le cas pour la literie fluidisée. Etant donné l'importance de cette dernière application, c'est surtout à celle-ci que se refère la présente description mais il est entendu que notre inven-
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tion ne se limite pas exclusivement à cette seule application.
Lorsque les microbilles selon l'invention ont été utilisées pendant un cer, tain temps, il peut s'avérer nécessaire ou utile de régénérer celles-ci. Par exem- ple, il sera en général nécessaire de changer les microbilles dans un lit fluidisé pour traitement des brutes lors d'un changement de patient On peut facilement stériliser des microbilles usagées par traitement thermique. On peut par exemple les traiter à une température de l'ordre de 100 C pendant un temps suffisant. Ce traitement élimine aussi les protéines mais il est facile de recouvrir les billes d'un nouveau revêtement de protéines liées de manière covalente de sorte qu'elles
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soient réutilisables.
Dans les formes préférées de réalisation de l'invention, les microbilles ont une surface non-poreuse. L'adoption de cette caractéristique présente des avantages considérables au point de vue hygiénique. Tous fluides, corporels ou autres, qui entrent en contact avec des microbilles dont la surface est poreuse peuvent facilement y être adsorbés. Quoiqu'on puisse facilement stériliser cette matière adsorbee de la manière signalée ci-dessus, il est extrêmement difficile de l'éliminer de microbilles poreuses, de sorte qu'un risque de contamination persiste, même après stérilisation et fixation de protéines bactériostatiques sur les billes. Si le revêtement bactériostatique de microbilles poreuses venait à faillir, la matière adsorbée peut constituer un milieu de croissance fertile pour les microorganismes.
Tel n'est pas le cas de microbilles à surfaces non poreuses. On a
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trouvé qu'une quantité très faible, sinon nulle de teile matière peut etre adsorbée, et celle qui serait adsorbée est facilement éliminée pendant l'opération de sterilsation ; de la sorte, il est possible de réutiliser les microbilles avec beaucoup moins de risque pour le patient. Des microbilles pourvues de surfaces non poreuses présentent en outre l'avantage sur des billes à surfaces poreuses, qu'elles sont en général plus faciles, et donc moins coûteuses, à produire.
De preference, les protéines qui sont fixées aux microbilles de verre sont des enzymes. Le choix d'enzymes permet d'éliminer ou d'empecher la croissance ou la multiplication de bactéries selon un mécanisme spécifique tout à fait sélectif permettant de créer in situ une entité nuisible aux bactéries. Les enzymes préférés pour l'application aux lits fluidisés sont les peroxydases qui catalysent l'oxydation de divers ions présents dans des liquides tels que plasma ou sérum en créant des entités bactéricides.
On peut fixer aux billes des protéines telles que la transferrine ou la myeloperoxydase mais on préfère toutefois choisir des protéines telles que la lactoferrine ou la lactoperoxydase. La lactoferrine capte les ions de fer et crée
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ainsi un milieu impropre au développement des bactéries. La lactoperoxydase constitue avec un oxydant tel que le peroxyde d'hydrogène (fourni par le métabolisme ou par action de la glucose oxydase sur le glucose) et les ions SCN-, un milieu contenant des ions OSCN- qui détruisent les bactéries.
L'action des protéines bactériostaiques étant très efficace, il n'est nullement nécessaire de revetir complètement la surface des billes au moyen de protéines. De préférence, ces protéines sont présentes à raison de moins de 0, 1% en poids, vis à vis du poids du verre. Une quantité aussi faible que 0, 05% en poids est efficace et il suffit souvent d'utiliser une quantité de 0, 02%.
Comme indiqué précédemment, un grand avantage des microbilles selon rinvention réside dans le fait que celles-ci conservent leurs propriété-s bactériostatiques ou bactéricides malgré les sollicitations mécaniques et thermiques qu'elles peuvent subir. Ceci est vraisemblablement lié à l'existence d'une liaison covalente entre les protéines et le verre. Pour faciliter l'accrochage covalent des protéines au verre, on préfère utiliser un agent de couplage capable de créer en surface du verre des sites d'accrochage préférentiels pour les groupements réactifs des protéines. Ces groupements réactifs sont constitués d'acides aminés.
On peut utiliser comme agent de couplage, un titanate organique mais on préfère toutefois choisir un agent de couplage silané car la gamme des silanes offre un large choix de substances capables de réagir directement avec les acides aminés.
A titre de variante, il peut etre preferable de fixer les protéines au moyen d'un silane et d'un second agent de couplage. Dans ce cas le silane crée une surface de verre aminée que l'on lie aux protéines par l'intermediaire d'un couplage du type"Michael", à la glutaraldéhyde, du type amide, par exemple avec l'anhydride succinique ou du type azo, par exemple avec du chlorure de nitrobenzoyle. On peut aussi créer dans la chaine de couplage, une liaison thioester qui a l'avantage de se couper facilement si l'on désire séparer les billes des protéines en vue d'un recyclage. Le couplage à la glutaraldéhyde est avantageux car il permet la fixation rapide au verre d'une large gamme de protéines ou d'enzymes différents.
De préférence, les microbilles selon l'invention sont hydrophobes.
Cette propriété leur permet de garder leur intégrité en présence d'humidité ou de divers liquides physiologiques et permet surtout d'éviter qu'elles ne s'agglomèrent en prdsence de ces liquides. Les microbilles hydrophobes conformes à l'invention doivent de préférence leur caractère hydrophobe à la présence d'un revêtement de silicone. On choisit de préférence une silicone qui polymérise A la surface libre du
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verre sans s'y fixer par des liaisons covalentes. On utilise par exemple un copolymère aminofonctionnel polydiméthylsiloxane tel que le produit Dow Corning MDX4-4159 qui polymérise à température ambiante ou modérée.
Une teile silicone est compatible avec la présence des protéines et, de façon surprenante, ne modifie pas ou de façon négligeable, l'activité bactériostatique des microbilles vis à vis de microbilles identiques mais recouvertes de protéines seulement.
Les microbilles de verre selon l'invention sont des microbilles de verre pleines ou des microbulles creuses. Pour l'utilisation dans les lits fluidités
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d'hôpitaux, il est préférable que ces microbilles aient une densité supérieure à 1 pour faciliter la sustentation du patient, quoique des microbilles creuses présentent l'avantage de nécessiter une plus faible quantité d'air de fluidisation, avec pour conséquence un dessèchement moindre de t'atmosphere de t1uidisation.
On choisit de préférence des microbilles dont la répartition granulemétrique est étroite, ce qui facilite leur fluidisation sans ségrégation. On choisit par exemple des microbilles de verre dont le diamètre se situe entre 65 et 110 microns. On peut utiliser des microbilles ayant un diamètre moyen qui se situe entre 80 et 100 microns et de préférence entre 85 et 90 microns. De telles billes ne nécessitent pas trop d'énergie pour leur fluidisation et ne sont pas susceptibles de traverser les mailles des toiles utilisées pour les lits d'hôpitaux uuidisés. On peut choisir, pour cette application particulière, des microbilles de verre pleines ou des microbulles creuses.
La présente invention couvre également des microbilles à propriétés bactériostatiques mises en suspension dans un gaz de fluidisation et s'étend à un lit
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pour le traitement des brûlés comprenant un système de fluidisation contenant des telles La présente invention concerne encore un procédé pour conférer des microbillespropriétés bactériostatiques à des microbilles de verre caractérisé en ce que l'on fixe sur celles-ci un revetement de protéines liées au verre de façon covalente. Un tel procédé présente l'avantage d'obtenir une matière particulaire finement divisée, aisément fluidisable qui possède et conserve des propriétés bactériosta-
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tiques efficaces.
Le procédé comporte une étape au cours de laquelle les micro- billes sont mises en contact avec des protéines par exemple sous forme de suspension ou de poudre.
Avantageusement, l'étape de mise en contact des microbilles avec les
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protéines est précédée d'une etape de fixation d'un agent de coùplage à la surface du verre. L'agent de couplage est de préférence un silane qui se dépose aisément sur la surface du verre à partir d'une solution, d'une suspension ou d'une poudre, à
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temperature ambiante. On peut ainsi greffer par exemple en surface du verre des fonctions aminée ou oxyrane susceptibles de réagir avec les acides aminés des protéines.
Dans certains cas, il peut etre utile de traiter le verre avec un second agent de couplage. Cest le cas par exemple si la silanisation du verre crée à la surface de celui-ci des fonctions aminées. Dans ce cas, on fixe la protéine par l'intermédiaire d'un couplage du type "Michael" à la glutaraldéhyde, ou du type amide ou du type azo. Pour éviter la dénaturation des protéines, il est recommandé d'effectuer la fixation des protéines au verre en mettant celui-ci en contact avec un milieu contenant les dites protéines dont le pH ne dépasse pas 7. On choisit de préférence un milieu contenant les protéines dont le pH est compris entre 4 et 5.
De préférence, après avoir fixé les dites protéines au verre, on met les microbilles en contact avec un milieu contenant une silicone pour déposer ainsi de la silicone sur les billes. Les billes ainsi traitées sont hydrophobes et ne présentent aucune tendance à s'agglomérer Le milieu contenant la silicone a de preference un pH compris entre 4 et 5. Le déport de silicone se fait à température ambiante ou modérée.
En général, pour ne pas dénaturer les protéines, il est recommandé de déposer et, le cas échéant polymériser, la silicone à une température qui ne
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dépasse pas 60 à 700C
Lorsque les microbilles ont été utilisées pendant un certain temps, par exemple lors du changement de patient dans un lit fluidité pour traitement des brûlés, il peut s'avérer nécessaire de régénérer celles-ci. A cette fin, il est souhai-
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table de stériliser au préalable les billes usagées. Ces billes peuvent être stérilisées facilement par traitement thermique, par exemple en les traitant à une température de l'ordre de 100 C pendant plusieurs heures. Ce traitement élimine les protéines mais conserve la silicone à la surface du verre.
Dès lors, l'invention s'étend aussi à un procédé pour restaurer des propriétés bactériostatiques de microbilles de verre caractérisé en ce que les microbilles qui ont été stérilisées par traitement thermique sont ensuite traitées par un procédé de fixation covalente de protéines tel que mentionné ci-dessus.
La présente invention sera expliquée plus en détails au moyen des exemples qui suivent
Exemple 1
Des microbilles de verre pleines sodocalciques sont sélectionnées par
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tamisage de manière A elimineer les billes inférieures à 65 u et supérieures à 106 u.
Le diamètre moyen (en poids) des billes sélectionnées est de 85 p.
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On traite ces microbilles au moyen de -glycidoxypropyl-tnmethoxysilane (A 187 de Union Carbide) en solution alcoolique, à temperature ordinaire, à raison de 0, de silane par kilo de billes, ce qui correspond à environ 100. de silane par kilo de billes.
On fixe ensuite de manière covalente de la lactoferrine sur les biUes.
La lactoferrine se lie par l'intermédiaire de ses acides amines aux fonctions epoxy du silane. Cette opération a lieu à température par mise en contact des billes silanes avec une solution aqueuse à 10% de lactoferrine de bovidés commercialisée par 0léofina, à pH compris entre 4 et 5. Il a ainsi environ 0, en poids de produit actif. vis du poids du verre.
Ensuite, on chauffe légèrement les microbilles en veillant à ne pas dépasser 60"C et on les met en contact avec une silicone fluide. La silicone choisie est un copolymère arninofonctionnel polydiméthylsiloxane MDX4-4159 de Dow Corning qui esi utilisé raison de 0, par kilo de verre, ce qui correspond à environ 200 mgr de silane par kilo de billes.
Le pouvoir bactériostatique de ces microbilles est identique à celui de la lactoferrine en solution, c'est A dire non immobilisée. On a constate par exemple que ces microbilles inhibent la croissance d'une souche de Escherichia Ces microbilles sont hydrophobes et peuvent être stockées, manipulées et utilisées sans risque d'agglomération.
Exemple 2 Des microbilles de verre sodocalcique semblables à celles de l'exemple 1 de Union Carbide, en solution alcoolique, à raison de 0,1 de silane par kilo de verre, ce qui correspond à environ 100 mgr de silane par kilo de verre. On active ensuite la surface des billes en faisant réagir le silane avec de la glutaraldéhyde, à pH inférieur à 6, en proportions stoechiometriques.
On fixe ensuite de la lactoperoxydase sur les en mettant cellesci en contact avec une solution aqueuse de lactoperoxydase commercialisée par Oléoffna On fixe ainsi, de manière covalente, 0, en poids de lactoperoxydase vis à vis du poids de verre. On dépose ensuite sur la surface des billes une silicone identique à celle de l'exemple 1.
On a constate que la lactoperoxydase gardait son activité enzymatique malgré sa fixation covalente au verre. On a dosé cette activité enzymatique par la méthode à l'o-phénylène-diamine et on a trouvé valeur de 350 U/mg de lactoperoxydase fixée au verre tandis que cette meme méthode
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1 ccappliquée a une quantité équivalente de lactoperoxydase en solution avait une activité d'environ 400 U/mg d'enzyme (U/mg = unité d'activité spécifique de la protéine par mg ; une unité d'activité est la quantité d'enzyme qui produit, en une minute, une augmentation d'absorbance A la longueur d'onde 490 nm de 0.1, à 37 C, pH5 et avec l'o-phénylène-diamine et H202 comme substrat)
On a aussi examiné le pouvoir bactériostatique des microbilles.
Ce pouvoir bactériostatique a été evalué vis à vis d'une souche de Eschehchia Coli sensible à l'action de des ions OSCN-. On examine 1'évolution au cours du temps de la densité optique à une longueur d'onde de 660 nm, d'une telle culture.
L'augmentation de la densité optique témoigne de la prolifération des bactéries.
En l'absence de lactoperoxydase, un échantillon témoin montre une augmentation de densité optique correspondant à une multiplication de la valeur de départ par un facteur de l'ordre de 100, après 6 heures à 37 C. Par contre en présence de 8 gr
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de billes traitées selon le présent exemple, par litre (ce qui correspond à 500 U de lactoperoxydase par litre de milieu de culture), la densité optique n'est pas modifiée après 6 heures ce qui démontre le blocage de la croissance bactérienne.
A titre de comparaison, on a également mis en présence d'une meme souche de Eschérichia Coli, des microbilles traitées comme indiqué ci-dessus mais ne portant pas de silicone. On constate que l'activité des billes revetues de lactoperoxydase et de silicone, pour une quantité de lactoperoxydase identique fixée
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sur les billes est pratiquement identique à celle des billes non silicones. 11 n'y a donc, de façon surprenante, pas d'interference entre l'activité de l'enzyme immobilisé et la présence de la silicone.
On constate des résultats semblables avec d'autres bactéries teiles que des Pseudomonas et des Staphylocoques dores.
Exemple 3
Sur des microbilles de verre identiques à celles de l'exemple 1, on fixe tout d'abord du γ-glycidoxypropyl-triméthoxysilane, comme indiqué d l'exemple 1 et ensuite, on fixe directement 0, 05% en poids de lactoperoxydase sur les microbilles. On termine le traitement par depot de silicone identique à celui mentionné aux exemples 1 et 2.
On a répété le test de culture de bactéries de l'exemple 2 et on a constaté que 7 gr de billes par litre de milieu de culture suffisaient pour bloquer la croissance des bactéries.