BE1000913A3

BE1000913A3 - Composition et procede pour determiner le taux de magnesium de liquides.

Info

Publication number: BE1000913A3
Application number: BE8701049A
Authority: BE
Inventors: Joseph D Artiss; Bennie Zak; Michael C Wimmer
Original assignee: Univ Wayne State
Priority date: 1987-09-17
Filing date: 1987-09-17
Publication date: 1989-05-16

Abstract

Composition et procédé pour déterminer le taux de magnésium existant dans des liquides, cette composition comprenant essentiellement : de la glycérol kinase; de la alpha-glycérophosphate oxydase; une substance à activité de peroxydase; de l'adénosine 5'-triphosphate; du glycérol; un co-substrat oxydable par peroxydase; un agent de combinaison-co-substrat indicateur; un tampon capable de maintenir un pH de solution compris entre environ 6,0 et environ 8,0; et de l'eau.

Description

"Composition et procédé pour déterminer

le taux de magnésium de liquides".

La présente invention est relative au titrage des taux de magnésium existant dans des liquides aqueux. La présente invention se rapporte plus particulièrement à des procédés de détermi-

oxydase.

La détermination rapide et précise, dans le sérum du sang, des quantités et des taux d'activité de divers minéraux et enzymes constitue un moyen de diagnostic médical important. Le magnésium est le second cation intercellulaire le plus abondant, existant dans le corps humain, et il sert d'activateur pour de nombreuses enzymes importantes. Son importance en physiologie humaine est bien connue. De ce fait, un titrage précis du magnésium du sérum constitue un moyen de diagnostic d'une valeur exceptionnelle.

On a proposé de nombreuses techniques spectrophotométriques pour le titrage du magnésium, en utilisant de la calmagite, du bleu de méthylthymoi, du jaune de titane ou du suflonate de Magon. Ces méthodes sont d'une précision limitée car elles sont basées sur des réactions de chélation et, par conséquent, elles sont sujettes à des degrés variables d'interférences par d'autres cations présents dans l'échantillon. Des analyses d'absorption atomique

et d'activation neutronique ne présentent pas ces erreurs mais elles sont très complexes et sont coûteuses, au point d'être prohibitives, pour la plupart des laboratoires cliniques courants.

On a constaté que le magnésium se combine avec l'adénosine diphosphate (ADP) ou l'adénosine triphosphate (ATP) pour former un complexe moléculaire. Comme signalé dans 31 Clinical Chemistry, pages 703 à 705 (1985), Tabata et col. ont proposé un titrage de magnésium enzymatique utilisant les enzymes hexokinase et glucose-6-phosphate déshydrogénase. Dans leur titrage à réaction arrêtée, la quantité de (NAD(P)H) produite sur une période de 15 minutes est déterminée par arrêt de la réaction d'hexokinase avec du EDTA tétrasodique et en mesurant l'absorbance à 340 nm. Cette absorbance finale dépendant de la vitesse est proportionnelle à la quantité du complexe Mg.ATP présent et, de ce fait, à la concentration de magnésium dans le sérum.

Cette méthode de titrage de magnésium enzymatique exige une incubation préalable de l'échantillon et une période prolongée de réaction, ce qui la rend inappropriée pour une analyse par un appareillage automatisé.

La méthode de Tabata suppose un certain nombre de limitations inhérentes. En premier lieu, elle exige des spectrophotomètres à bande étroite, relativement coûteux, capables de pratiquer des mesures dans la région de l'ultraviolet, pour donner l'absorbance réelle de l'indicateur coenzymatique. En second lieu, ce titrage subit une interférence significative de la part de la lipémie car les effets de diffusion de la lumière de cette substance sont fortement renforcés à des longueurs d'onde inférieures à 400 nm. En troisième lieu, la sensibilité du titrage est limitée du fait de l' absorptivité molaire relativement basse de la substance indicatrice employée. En quatrième lieu, les titrages sont perturbés par des blancs élevés de réactif. En cinquième lieu, la nécessité d'arrêter la réaction réduit fortement la possibilité d'automatiser le processus.

De ce fait, il serait désirable de développer un procédé qui assurerait la détermination rapide et précise des taux de magnésium dans le sérum du sang. Il serait également désirable de prévoir une méthode qui donnerait une détermination colorimétrique d'une sensibilité accrue. Il serait également désirable de prévoir une méthode donnant des résultats décelables à une longueur d'onde supérieure à 340 nm afin de réduire au minimum les effets de dispersion de la lumière dues à la turbidité du sérum et provoqués dans des échantillons lipémiques.

Suivant l'invention, on prévoit une méthode et une composition associée pour la détermination des quantités de magnésium existant . dans un milieu aqueux. Le milieu aqueux peut être une substance quelconque d'origine biologique ou non biologique.

Des exemples de milieux de ce genre sont le sang complet, le plasma, le sérum du sang, des solutions tamponnées, etc.

La présente invention est basée sur la découverte que l'absorbance finale créée à la suite de la réaction basique dans laquelle du glycérol est phosphorylé et mis en réaction en présence

être amenée à être proportionnelle à la quantité d'un complexe formé entre le ATP et le magnésium.

La méthode de détermination des taux de magnésium dans des échantillons aqueux comprend les phases suivantes :

de l'échantillon avec une quantité déterminée de : (a) une solution de réactifs, ou (b) des solutions contenant des réactifs et des enzymes, pour déclencher une réaction séquentielle qui finalement formera une espèce décelable, telle qu'un chromogène; et

Il. La mesure de l'espèce décelable ainsi formée.

La composition de la présente invention contient

kinase, de l'adénosine 5'-triphosphate (ATP), du glycérol et des cosubstrats indicateurs spécifiques. On a constaté qu'une mise en contact d'un échantillon avec les réactifs énumérés et une composition enzymatique déclenche une série ordonnée de réactions qui finalement sont dépendantes de la vitesse d'après la concentration du magnésium présent dans la solution d'échantillon.

La séquence ordonnée de réactions se développe de la façon suivante :

A. Le magnésium présent dans l'échantillon réagit mutuellement avec le ATP venant de la solution de réactifs pour former un complexe de magnésium-ATP (Mg.ATP);

B. le complexe Mg.ATP crée une phosphorylation du glycérol avec catalyse par glycérol kinase pour former du glycérol3-phosphate et un complexe de magnésium-adénosine 5'-diphosphate
(Mg.ADP), le glycérol et la glycérol kinase étant fournis par la composition de la présente invention;

C. le glycérol-3-phosphate ainsi produit réagit avec l'oxygène ambiant pour donner du peroxyde d'hydrogène dans une réaction catalysée par la o(-glycérophosphate oxydase présente dans la composition de la présente invention; et

D. le peroxyde d'hydrogène produit peut être déterminé directement par des techniques traditionnelles ou il réagit encore avec les co-substrats indicateurs dans une réaction catalysée par peroxydase pour former un chromogène décelable à la vue, les co-substrats et la peroxydase présents dans la composition de la présente invention.

Pour mieux comprendre la présente invention, on se référera à la description détaillée suivante et aux exemples présentés.

L'invention est basée sur la découverte que le magnésium présent dans des fluides biologiques a une affinité pour les adénosine polyphosphates et forme un complexe avec ceux-ci. On a également constaté que la vitesse de la séquence de réactions mise en évidence par le Tableau 1 dépend de la complexation du. magnésium avec le ATP, et non pas simplement de la présence du ATP seul. Le complexe de Mg.ATP constitue de ce fait le réactif limitateur dans la formation du glycérol-3-phosphate et dans toutes les réactions ultérieures de la séquence.

La méthode de détermination des taux de magnésium existant dans un échantillon aqueux comprend de ce fait les phases suivantes :

d'échantillon avec une quantité prédéterminée de : (a) une solution de réactifs, ou (b) des solutions contenant des réactifs et des enzymes, pour déclencher la réaction séquentielle qui forme finalement une espèce décelable, telle qu'un chromogène; et

Il. la mesure de l'espèce décelable ainsi formée.

La séquence ordonnée de réactions se développe de telle sorte que le magnésium présent dans l'échantillon est transformé en complexe avec le ATP. Le complexe de Mg.ATP fournit un groupe phosphate dans la phosphorylation, catalysée par glycérol kinase, du glycérol en glycérol-3-phosphate. Le glycérol-3-phosphate en présence de l'oxygène ambiant et de o(-glycérophosphate oxydase, réagit pour former du peroxyde d'hydrogène qui peut être converti en un chromogène décelable par l'intermédiaire d'une réduction catalysée par peroxydase.

Pour mettre en oeuvre la méthode suivant la présente invention, on prévoit une composition de réactifs, qui contient tous les réactifs et toutes les enzymes, nécessaires pour former un complexe avec le magnésium de l'échantillon en vue d'amorcer

sition de réactifs peut être une solution en une seule partie ou une solution en plusieurs parties suivant le désir. La composition de réactifs comprend essentiellement :
(a) de la glycérol kinase;
(b) de la Ot-glycérophosphate oxydase;
(c) un composé ayant une activité de peroxydase;
(d) de l'adénosine 5'-triphosphate;
(e) du glycérol;
(f) un co-substrat oxydable par peroxydase;

(g) un agent de combinaison - co-substrat indicateur;

(h) un tampon capable d'entretenir un pH de solution compris

entre environ 6,0 et environ 8,0; et

(i) de l'eau.

Il entre dans le cadre de l'invention d'ajouter individuellement ou suivant une combinaison quelconque, les produits chimiques et les enzymes qui déclencheront la séquence de réactions

produits chimiques et enzymes peuvent donc être maintenus dans des solutions tamponnées séparées et utilisés suivant les nécessités. Suivant une forme de réalisation, le glycérol et le co-substrat indicateur sont maintenus dans une solution tamponnée, séparément d'une solution tamponnée contenant les constituants restants. Dans cette forme de réalisation, la solution contenant les constituants restants est mélangée avec l'échantillon pour permettre la formation du complexe de Mg.ATP. On laisse réagir les réactifs et l'échantillon <EMI ID=8.1>

pendant une période comprise entre environ 5 secondes et environ
10 minutes. Pour assurer un contact intime, le mélange peut être soumis à agitation. La solution tamponnée de glycérol est ensuite ajoutée au mélange. L'addition du glycérol déclenche la séquence ordonnée de réactions et permet un titrage de la concentration en magnésium de l'échantillon.

Dès que tous les composants ont été mélangés avec l'échantillon, l'absorbance du mélange résultant est surveillée pendant un intervalle de temps allant jusqu'à environ 5 à environ
15 minutes à une longueur d'onde spécifiée, comprise entre environ
450 et environ 650 nm, de préférence à 510 nm, suivant les cosubstrats indicateurs utilisés. Un témoin de réactifs contenant une quantité mesurée d'eau peut également être préparé pour déterminer l'absorbance de base de l'eau employée dans la préparation des solutions de réactifs. Le changement dans l'absorbance au cours

de l'échantillon.

La composition de la présente invention contient du ATP en une concentration comprise entre environ 0,05 et environ 2,0 mmoles par litre. Le ATP dans cette gamme de concentrations formera un complexe avec le magnésium présent dans un échantillon de fluide biologique pour assurer une détermination efficace du taux de magnésium dans l'échantillon, allant jusqu'à environ 2,5 mmoles de magnésium par litre. Des concentrations de magnésium supérieures à 2,5 mmoles/litre peuvent être déterminées par une dilution mesurée de l'échantillon avec des solutions salines normales traditionnelles, sans magnésium, et un nouveau titrage. Du ATP est disponible sur le marché auprès de la société Sigma Chamical Corp., St. Louis, MO.

Dès que le complexe de Mg.ATP s'est formé dans la solution aqueuse, un contact avec du glycérol en présence de glycérol kinase assurera la phosphorylation du glycérol pour former du glycérol-3-phosphate et du Mg.ADP. Dans la méthode et la composition suivant la présente invention, on utilise du glycérol en une concentration comprise entre environ 0,05 et environ 20 mmoles par litre, avec une préférence pour des concentrations comprises entre environ 0,2 et environ 7 mmoles par litre. Le glycérol peut être obtenu sur le marché. auprès de la société Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri.

D'une manière ,générale, on peut employer de la glycérol kinase provenant de n'importe quelle source, dans la mise

<EMI ID=12.1> de la glycérol kinase dérivant de Streptomyces canus (E.C. 2.7.1.30). On peut obtenir cette glycérol kinase de la société Finnsugar Bio-

on utilise avec succès de la glycérol kinase en des quantités d'environ
10 U à environ 150 U par litre de tampon.

Le glycérol-3-phosphate produit de la réaction catalysée par enzyme du Mg.ATP avec du glycérol réagit en présence

acétone et du peroxyde d'hydrogène.

La o(-gtycérophosphate oxydase utilisée peut dériver de toute une série d'espèces microbiennes pouvant provenir de toute une variété de sources. Les propriétés de cette enzyme dérivant de certaines sources sont plus avantageuses que les propriétés d'enzymes provenant d'autres sources, dans le cas de la méthode de la présente invention. On préfère l'enzyme obtenue de Aerococcus viridans car elle montre une plus grande activité sur une plus large

phosphate oxydase obtenue de cette source peut être utilisée avec succès dans la présente invention en des quantités allant d'environ 2,0 kU à environ 18,0 kU par litre. Pour la facilité de la manipulation, la (X-gtycérophosphate oxydase peut être présente dans la solution initiale contenant le ATP.

Pour quantifier les produits formés par la séquence de réactions, déclenchée au départ par la créatine kinase, le peroxyde d'hydrogène produit est mesuré directement ou peut être encore mis en réaction pour former un chromogène décelable dans une réaction catalysée par une peroxydase ou une substance ayant une activité de peroxydase.

Les peroxydases sont des protéines conjuguées contenant de la porphyrine de fer. On peut utiliser avec succès dans le cadre de la présente invention, les peroxydases que l'on trouve dans le raifort, les pommes de terre, la sève de figuier, le navet, le lait, les globules blancs du sang et les micro-organismes. Certaines peroxydases synthétiques, telles que décrites par Theorell et Machly dans Acta Chem. Scand., Vol. 4, pages 422-434 (1950), sont également satisfaisantes. Sont moins satisfaisantes des substances telles que :
hémine, méthémoglobine, oxyhémoglobine, hémoglobine, hémochromogène, hématine alcaline, dérivés d'hémine, et certains autres composés qui montrent une activité de peroxydase ou semblable à celle de la peroxydase, c'est-à-dire la capacité de catalyser l'oxydation d'une autre substance grâce au peroxyde d'hydrogène et d'autres peroxydes.

D'autres substances qui ne sont pas des enzymes mais qui présentent une activité de peroxydase et que l'on peut employer dans la présente invention sont : sulfosuccinate de fer, tannate de fer, ferrocyanure ferreux, sels chromiques (tels que le sulfate chromique de potassium), en absorption dans un gel de silice, etc. Ces substances ne sont pas aussi satisfaisantes que la peroxydase en soi mais sont également intéressantes.

Dans la méthode suivant la présente invention, on préfère la peroxydase provenant de raifort (E.C. 1.11.1.7) que l'on peut obtenir de la société Finnsugar Biochemicals. Dans la méthode suivant la présente invention, on peut employer des quantités d'enzyme peroxydase comprises entre environ 0,5 kU et 20 kU par litre.

Lorsque le peroxyde d'hydrogène produit est immédiatement réduit en présence d'une peroxydase, il est amené à réagir avec un substrat ou co-substrat oxydable par peroxydase et un cosubstrat-agent de combinaison pour donner un chromogène décelable. La peroxydase et le co-substrat oxydable par peroxydase sont de préférence présents dans la solution tamponnée de ATP. Le cosubstrat-agent de combinaison peut être présent dans la solution contenant le glycérol pour réduire au minimum une auto-combinaison ou une auto-oxydation non spécifiques durant le stockage.

Les co-substrats oxydables par peroxydase, que l'on peut employer avec succès, sont généralement ceux qui réagissent pour former un chromogène décelable. Le co-substrat oxydable par peroxydase est capable de subir une condensation oxydante avec des agents de combinaison, tels que ceux qui contiennent des groupes phénoliques. Des exemples de ces composés oxydables sont le benzidène et ses homologues, les p-phénylènediamines, les p-aminophénols, le 4-amino-antipyrène, la 3-méthyl-2-benzothazolinone hydrazone, etc., ainsi que leurs mélanges.

Le co-substrat-agent de combinaison est choisi dans le groupe comprenant l'ammoniac ou les sels alcalins de 2hydroxy-3,5-dichlorobenzènesulfonate (HDCBS), ou d'autres amines et alcools aromatiques, et leurs mélanges. Le co-substrat-agent de combinaison est de préférence du HDCBS présent en une concentration comprise entre environ 0,1 mmole et, environ 5,0 mmoles par litre.

Le chromogène qui résulte de la combinaison du HDCBS et de la 4-aminoantipyrine est une molécule stable, de couleur rouge, ayant une absorbance comprise entre environ 450 et 525 nm, avec un maximum à 510 nm. On a constaté que l'absorptivité molaire du chromogène résultant est de quatre fois celle des indicateurs traditionnels. L'utilisation de la longueur d'onde plus importante apporte l'avantage supplémentaire de réduire au minimum les effets de dispersion de la lumière, créés par la turbidité dans des échantillons lipémiques.

La séquence de réactions se développe de façon. optimale à un pH compris entre environ 5,5 et environ 9,2. On peut donc employer des agents tampons dans la composition de la présente invention, pour maintenir le pH dans cet intervalle désiré, de préférence entre environ 6,5 et environ 7,2.

L'agent tampon employé doit être un agent qui ne perturbera pas la séquence de réactions du Tableau I. Des tampons appropriés sont : acide N,N-bis-(2-hydroxyéthyl)-2-aminoéthanesulfonique (BES); acide 3-(N-morpholino)-2-hydroxypropanesulfonique
(MOPSO); acide 3-N-morpholinopropanesulfonique (MOPS); acide N-(2-acétamido)-2-aminoéthanesulfonique (ACES), pipérazine-N,N-

méthylamino]propane(bis-tris-propane), tris-(hydroxyméthyl)-aminométhane/acide chlorhydrique (Tris/HCI), imidazole/acide chlorhydrique, phosphate alcalin, imidazole/acide chlorhydrique ou leurs mélanges. On emploie de préférence du tris/HCl en une concentration propre à donner entre environ 0,01 et 1,0 mole par litre dans la composition de la présente invention.

Pour iliustrer et expliquer encore la présente invention, on présente les Exemples suivants. Ces exemples sont destinés à des besoins d'illustration seulement et ne constituent donc nullement une limitation quelconque du cadre de la présente invention.

EXEMPLE 1

Détermination de la concentration de magnésium

On a préparé une série de solutions de travail contenant du magnésium, présentant des concentrations de 0,5, de 1,0, de 1,5 et de 2,0 mmoles/1, par une dilution appropriée d'une solution mère de 10 mmoles/i d'acétate de magnésium.

Pour obtenir un graphique de la concentration

chaque solution de travail a été analysée suivant la méthode ci-après.

Une portion de 0,9 ml du réactif de Mg.ATP, tel que défini dans le Tableau IIA, a été introduite dans un tube d'essai de 12 x 75 mm et incubée dans un bain-marie à 37[deg.]C pendant 2

introduite dans le tube et on a procédé au mélange par tourbillonnement. Une portion de 0,1 mi de la solution de glycérol, présentée

on a procédé au mélange par tourbillonnement. Le contenu a ensuite été transféré dans une cuvette et le changement d'absorbance à
510 nm a été mesuré pendant 1 à 10 minutes, par rapport à un témoin

sur un spectrophotomètre Gilford, modèle 300-N.

Les solutions restantes et les échantillons ont été également testés et le changement d'absorbance au cours du temps est illustré par le graphique présenté par la Figure I. Une analyse de régression linéaire de la courbe standard typique de la <EMI ID=21.1> de Mg ++ , a donné l'équation :

EXEMPLE Il

On a récolté des échantillons de sérum et on les a préparés pour analyse dans les 24 heures de la récolte. Les sérums ont été séparés des caillots dans les 10 minutes de la centrifugation pour empêcher une fausse élévation de la teneur du sérum en magnésium, en provenance d'érythrocytes séquestrés. On a rejeté les échantillons de sérum visiblement hémolysés.

Chaque échantillon a été testé suivant le procédé défini dans l'Exemple 1. Le changement d'absorbance au cours du temps a été calculé pour chaque échantillon à partir de la portion linéaire de la courbe. On a constaté qu'après une phase de retard de 2 à 3 minutes, les vitesses de réaction étaient linéaires pendant au moins 10 minutes. Le titrage lui-même était linéaire jusqu'à une concentration en magnésium d'au moins 2,0 mmoles/l. Les concentrations de magnésium supérieures à cette dernière peuvent être diluées avec une solution saline normale sans magnésium, et être retitrées de façon satisfaisante.

EXEMPLE III

On a analysé des échantillons de sérum de cent patients à la fois par la méthode suivant l'invention et par la méthode au bleu de méthylthymol telle qu'appliquée au produit ACA de Dupont et à une méthode manuelle au sulfonate de Magon, voir Baginaki et col., Magnésium in Biological Fluids, Selected Methods of Clinical Chemistry, Vol. 19 (1982) pages 277-281 et Baginski et col., Microdetermination of Magnésium in Biological Fluids, 27 Microchem (1982) pages 141-150.

Les résultats obtenus sur les échantillons ont été comparés. On a atteint une excellente corrélation des résultats avec les deux méthodes, et ce comme illustré par la Figure II. Les résultats appropriés de régression linéaire sont :

(y) proposé = 1,007(Magon) - 0,03(mmole/1),(r=0,952)

REVENDICATIONS

1. Composition pour déterminer le taux de magnésium dans un fluide aqueux, caractérisée en ce qu'elle comprend essentiellement :

de la glycérol kinase;

une substance ayant une activité du type peroxydase;

de l'adénosine 5'-triphosphate;

du glycérol;

un co-substrat oxydable par peroxydase;

un agent de combinaison-co-substrat indicateur;

un tampon capable de maintenir un pH de solution compris entre environ 5,5 et environ 9,2; et

de l'eau.

Claims

2. Composition suivant la revendication 1, caractérisée en ce que le tampon est du tris(hydroxyméthyl)aminométhaneacide chlorhydrique.

3. Composition suivant t'un.5 ou l'autre des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend deux solutions aqueuses de réactifs, la première solution comprenant essentiellement : entre environ 0,01 et environ 1,0 mole du tampon par litre d'eau; entre environ 0,05 et environ 2,0 mmoles d'adénosine 5'-triphosphate par litre d'eau; entre environ 0,05 et environ 10,0 mmoles du co-substrat oxydable par peroxydase par litre d'eau; entre <EMI ID=27.1>

litre d'eau; entre environ 0,5 kU et environ 20 kU de la substance ayant une activité du type peroxydase par litre d'eau; et entre environ 10 U et environ 150 U de glycérol kinase par litre d'eau.

4. Composition suivant la revendication 3, caractérisée en ce que la seconde solution de réactifs comprend essentiellement : entre environ 0,05 et environ 1 mole de tampon par litre d'eau; entre environ 0,01 et environ 5,0 mmoles de l'agent de combinaison -co-substrat indicateur par litre d'eau; et entre environ 0,05 et environ 20,0 mmoles de glycérol par litre d'eau. 5. Composition suivant la revendication 1, caractérisée en ce que le co-substrat oxydable par peroxydase est choisi dans le groupe comprenant : benzidène, p-phénylènediamines, p-amino-

<EMI ID=28.1>

mélanges.

<EMI ID=29.1>

risée en ce que l'agent de combinaison-co-substrat indicateur est choisi dans le groupe comprenant les sels d'ammoniac de 2-hydroxy3,5-dichlorobenzènesulfonate, les sels alcalins de 2-hydroxy-3,5dichlorobenzènesulfonate, et leurs mélanges.

7. Composition suivant la revendication 1, caractérisée en ce que la glycérol kinase est dépendante du magnésium et dérive de Streptomyces canus.

8. Composition suivant la revendication 1, caractérisée en ce que la glycérol kinase est dépendante du magnésium et dérive de Bacillus stearothémophilia.

<EMI ID=30.1>

viridans.

10. Procédé de détermination du magnésium se trouvant dans un échantillon liquide, comprenant les phases suivantes :

(a) la mise en contact d'un échantillon du liquide aqueux avec une composition comprenant essentiellement :

(1) de la glycérol kinase;

<EMI ID=31.1>

(3) de la peroxydase;

(4) de l'adénosine 5'-triphosphate;

(5) du glycérol;

(6) un co-substrat oxydable par peroxydase;

(7) un agent de combinaison-co-substrat indicateur;

(8) un tampon capable de maintenir un pH de solution compris

entre environ 6,0 et environ 8,0; et

(9) de l'eau; et

(b) la détection quantitative de la présence d'un produit de réaction formé dans la phase (a). 11. Procédé suivant la revendication 10, caractérisé en ce que le produit de réaction formé est du peroxyde d'hydrogène.

<EMI ID=32.1>

en ce que le produit de réaction est un chromogène coloré.

13. Procédé suivant la revendication 12, caractérisé en ce que le chromogène coloré formé a une absorbance comprise entre environ 450 et environ 650 nm.

14. Procédé suivant la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend en outre la phase d'observation de la formation du produit de réaction sur une période allant jusqu'à environ 5 à

<EMI ID=33.1>

15. Procédé suivant la revendication 10, caractérisé en ce que la phase de contact se fait à un pH compris entre environ 6,5 et environ 7,5.

16. Procédé suivant la revendication 10, caractérisé en ce que la composition utilisée dans la phase de contact est une solution de réactifs en deux parties, comprenant :

- une première solution de réactifs, comprenant essentiellement de la glycérol kinase, de l'adanosine 5'-triphosphate, le co-substrat oxydable par peroxydase, de la 0(-glycérophosphate oxydase, la substance ayant une activité de peroxydase, de la glycérol kinase, de l'eau et un tampon capable de maintenir le pH entre environ 6,0 et environ 8,0; et - une seconde solution de réactifs, comprenant essentiellement l'agent de combinaison-co-substrat indicateur, le giycérol, l'eau et un tampon capable de maintenir le pH de la solution entre 6,0 et 8,0.

17. Procédé suivant la revendication 16, caractérisé en ce que la première solution de réactifs comprend essentiellement :

(a) de l'eau; (b) de l'adénosine 5'-triphosphate en une quantité allant d'environ 0,1 à environ 1,0 mmole par litre d'eau; (c) du 4-aminoantipyrène en une quantité comprise entre environ 0,5 et environ 2,0 mmoles par litre d'eau; (d) de la o(-glycérophosphate oxydase en une quantité allant d'environ 2,0 à environ 10 U/I; (e) de la peroxydase en une quantité comprise entre environ 0,5 kU <EMI ID=34.1>

(g) un agent tampon en une quantité suffisante pour maintenir le

pH entre environ 6,0 et environ 8,0.

18. Procédé suivant la revendication 17, caractérisé en ce que la seconde solution de réactifs comprend essentiellement

(a) de l'eau; (b) du 2-hydroxy-3,5-dichlorobenzènesulfonate de sodium en une quantité comprise entre environ 0,05 et environ 2,0 mmoles par litre d'eau; (c) du glycérol en une quantité comprise entre environ 0,2 et 10 mmoles par litre; et (d) un agent tampon en une quantité suffisante pour maintenir le pH entre environ 6,0 et environ 8,0.

19. Procédé suivant la revendication 18, caractérisé en ce que la phase de contact comprend les étapes suivantes :

- l'incubation d'une portion mesurée de la première solution de réactifs à une température comprise entre environ 20[deg.]C et environ 45[deg.]C; - l'addition d'un échantillon mesuré du liquide à titrer; - le mélange des deux matières; et - l'addition d'une portion mesurée de la seconde solution de réactifs.