JPH11504808A - 糖化タンパク質の測定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 次の過程(ｉ)〜(iii)を含むことを特徴とする試料中の糖化タンパク質の測定法が特に開示される:(ｉ)プロテイナーゼとペルオキシダーゼを含有する第１試薬を試料と混合することによって、ケトアミンオキシダーゼによる酸化を可能にする基質を生成させ、(ii)ケトアミンオキシダーゼを含有する第２試薬を添加し、次いで(iii)生成する過酸化水素または消費される酸素を測定することによって、糖化タンパク質の検出および／または定量をおこなう。

Description

【発明の詳細な説明】 糖化タンパク質の測定 この発明は糖化タンパク質の測定に関するもので、より詳細にはペルオキシダ ーゼと同じ試薬中にプロテイナーゼを含有させることを含む糖化タンパク質の測 定法および該測定法用キットに関する。 ワサビダイコンペルオキシダーゼは酸化還元酵素である(供与体:過酸化水素酸 化還元酵素;ＥＣ１．１１．１．７)。このペルオキシダーゼは生命科学において はインジケーター酵素として広く使用されており[例えば、Essays in Biochem istry、第２８巻、第１２９頁〜第１４６頁(１９９４年)参照]、該酵素はペルオ キシダーゼファミリーの１つである。この酵素の特に有用な特徴はキャリア(例 えば、抗体や他の酵素)に対する容易な結合性、広範囲の基質に対する高い活性 度および良好な熱安定性である。この酵素は３０８個のアミノ酸を含む単一のポ リペプチドから成っており、その相対分子マスは４４,０００であり、ヘミン配 合群と結合して褐色呈色を示す。この酵素は４つのジスルフィド架橋と２つのカ ルシウムイオンを有しており、これらの除去によって安定性が低下する。 この酵素は水素供与体から水素受容体への水素の移動を触媒する。水素受容体 としては過酸化メチルや過酸化エチルを用いてもよいが、通常は過酸化水素が用 いられる。過酸化水素は次式によって還元される: Ｈ₂Ｏ₂ ＋ ＡＨ₂ → ２Ｈ₂Ｏ ＋ Ａ 広範囲の水素供与体が使用され、例えばフェノール類、アミノフェノール類、 インドフェノール類、ジアミン類およびロイコ染料等が挙げられる。この種の化 合物から水素を除去する酸化過程において生成する生成物は視覚的に検知するか 、または分光光度計によって定量してもよい。その他の検知法としては蛍光光度 法、発光光度法および電気化学法が例示される。 酵素は他のタンパク質、例えば抗体やそのフラグメント等に物理的に結合させ てもよく、これによって抗体の特異的結合特性を利用して分析物を測定するか、 または抗原の位置を組織学的に同定してもよい。この酵素をオキシダーゼ酵素と 化学的に結合させることによってオキシダーゼの基質を定量してもよい。特異的 オキシダーゼを用いて測定してもよい多くの分析物があるが、このうちのいくつ かは生物学的液体中に含まれており、該液体の分析は臨床的に有用である。オキ シダーゼ−ペルオキシダーゼに結合した色素原としてフェノールおよびアミノア ンチピレンを使用することは古くから知られている[例えば、Ａnn．Ｃlin．Ｂio chem．、第６巻、第２４頁〜第２７頁(１９６９年)参照]。比較的最近になって フェノールの代りにＮ−エチル−Ｎ−(２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル)− m−トルイジン(ＴＯＯＳ)等が感度がより高くて広いpＨ領域にわたって呈色する ことが提案されている[例えば、Ｃhem．Ｐharm．Ｂull．、第３０巻、第２４９ ２頁〜第２４９７頁(１９８２年)参照]。 この種の分析物の１つは糖化タンパク質またはフルクトサミンである。この分 析物は、グルコースまたは他の糖がタンパク質の遊離アミノ基と縮合生成物を形 成する非酵素反応の生成物である[例えば、Ｃlin．Ｃhem．、第３３巻、第２１ ５３頁〜第２１６３頁(１９８７年)参照]。血液中の主要な糖化タンパク質はア ルブミン(この化合物においては、露出したリジン残基は遊離アミノ基をもたら す)およびヘモグロビン(この化合物においては、Ｎ−末端バリンアミノ酸はグル コースとも反応する)である。糖尿病患者においては、血液中のタンパク質成分 の濃度はかなり狭い限界内で変化するが、グルコースの濃度は短時間の間に著し く変化する。糖尿病患者にみられる多くの病理学的変化は、タンパク質に長期間 さらされることによってグルコースの濃度が増大することに起因する。従って、 タンパク質の寿命におけるグルコースの平均暴露時間の評価においては糖化タン パク質の測定は臨床的に有用である。 全糖化タンパク質を測定するためにはいくつかの方法が利用されている。現在 の標準的な方法はフロシン法(furosine procedure)である[例えば、Ｊ．Ｃlin. Ｃhem．Ｃlin．Ｂiochem．、第１９巻、第８１頁〜第８７頁(１９８１年)参照] 。この方法には、タンパク質を６モル塩酸を用いて９５〜１００℃で１８時間消 化させる過程が含まれる。フロシンはこのような処理条件下での糖化リジンの生 成 物であり、ＨＰＬＣで測定してもよい。この方法は慣例的な方法として使用する には複雑すぎて時間もかかる。チオバルビツール酸法は酸による消化時間が短い ので(２〜５時間)幾分簡単な方法である。この酸消化によって得られる５−ヒド ロキシメチルフルフラールはチオバルビツール酸と反応して４４３nmにおいて最 大吸光度を示す誘導体を与える。別の方法はフェニルボロネートアフィニティー クロマトグラフィーを用いる方法である。アルカリ性条件下では、フェニルボロ ネートは糖のシス−ジオール基と錯体を形成する。しかしながら、温度制御を厳 密におこなうと共にグルコースをあらかじめ除去したとしても、この方法の精度 は低い。 血清糖化タンパク質を測定するための最も簡単で最も広く利用されている方法 はアルカリ性溶液中におけるフルクトサミンのニトロブルーテトラゾリウム(Ｎ ＢＴ)の還元能に基づく方法である[例えば、Ｃlin．Ｃhem．Ａcta、第１２７巻 、第８７頁〜第９５頁(１９８２年)参照]。この方法の大きな利点は自動化が容 易なことである。この方法はタンパク質濃度、脂質および尿酸による干渉を低減 させるために改良されている[例えば、Ｃlin．Ｃhem．、第３７巻、第５５２頁 〜第５５６頁(１９９１年)参照]。しかしながら、普通の糖尿病患者または十分 に管理された糖尿病患者において測定される還元活性のわずかに約半分が糖化タ ンパク質に起因する[例えば、Ｃlin．Ｃhem．、第３４巻、第３２０頁〜第３２ ３頁(１９８８年)]。 ＮＢＴ法の場合にみられる特異性が劣るという問題を回避するために、酵素法 が開発されている[例えば、ヨーロッパ特許出願ＥＰ−Ａ−５２６ １５０号明 細書参照]。この二液試薬系においては血清タンパク質を分解させるプロテイナ ーゼを使用した後、糖化フラグメントに作用するケトアミンオキシダーゼを使用 する。このオキシダーゼは、発色量が試料中の糖化タンパク質の量に比例する終 点の決定においてペルオキシダーゼと色素原系に結合する。入手源の異なる酵素 を用いる類似の方法が提案されている[例えば、ヨーロッパ特許出願ＥＰ−Ａ− ５７６ ８３８号明細書参照]。しかしながら、これらの方法は新鮮な試料に適 用する場合にはアスコルビン酸塩とビリルビンの著しい干渉を受けやすく、また 第２試薬にペルオキシダーゼを含有させるので試薬のブランク補正が必要となる 。 フザリウム属またはジッベレラ属の菌株の培養によって得られるフルクトシル アミノ酸オキシダーゼを利用する方法も提案されている[ヨーロッパ特許出願Ｅ Ｐ−Ａ−６７８ ５７６号明細書参照]。 第１試薬中のプロテイナーゼは糖化タンパク質に対する高い活性とケトアミン オキシダーゼに対する基質の放出能を示さなければならない。基質を迅速に放出 させるためには、異なるペプチド結合の開裂能を示すことが有利である。非特異 的ないくつかのプロテイナーゼ(例えば、プロナーゼおよびプロテイナーゼＫ)お よび多数の入試源から得られた異なる特異性を示すその他のプロテイナーゼ群が 知られており、これらは単独で使用するか、または併用してもよい。 血液タンパク質の高い分解性と非特異的プロテイナーゼが要求されるために、 同じ溶液中でプロテイナーゼとしての酵素活性を保持することはほとんど考えら れない。従って、ペルオキシダーゼは二液試薬の第２試薬に含有させなければな らないので、プロテイナーゼにペルオキシダーゼがさらされるのは、第２試薬の 添加後のクベット内での比較的短い時間である。クベットの吸光度は第２試薬の 添加直前に測定し、さらにケトアミンオキシダーゼ／ペルオキシダーゼ系による 呈色後に測定される。試料についてのこれらの２回の測定における吸光度の変化 は試料中の糖化タンパク質の含有量だけでなく、第２試薬自体の吸光度にも起因 する。従ってブランク試料を分析して補正をしなければならない。 臨床的な方法として広く受け入れられるためには、所望の分析物以外の基質に よる干渉を最少限にすることが重要である。オキシダーゼ−ペルオキシダーゼ系 に干渉することが知られている２種の化合物はビリルビンとアスコルビン酸塩で ある[例えば、Ａnn．Ｃlin．Ｂiochem．、第２１巻、第３９８頁〜第４０４頁( １９８４年)]。正常な血清中の糖化タンパク質の濃度は約０．１mmol／Ｌである 。正常な濃度よりも過剰(３mml／Ｌ)の分析物(例えば、グルコースまたはコレス テロール)に比べて比較的低濃度の分析物による干渉はより重大である。多量の ビ タミンＣの経口投与はコレステロールアッセイにおいてさえも重大な干渉をもた らす[例えば、Ｃlin．Ｃhem．、第３８巻、第２１６０頁(１９９２年)参照]。 ビリルビンによる干渉を低減させるために別の試みがなされている。このよう な試みには反応時のpＨを６．１に低下させる方法が含まれる[例えば、Ｃlin． Ｃhem．、第２７巻、第３７５頁〜第３７９頁(１９８１年)参照]。必要な酵素は より高いpＨを要求するので、この方法は糖化タンパク質の酵素的測定法として は不適である。あるいは、ペルオキシダーゼおよびビリルビンを酸化する過酸化 水素を用いて試料を前処理する方法も知られている[例えば、Ｃlin．Ｃhem．、 第３８巻、第２４１１頁〜第２４１３頁(１９９２年)参照]。しかしながら、こ の方法では余分の試薬を使用するのでその後のオキシダーゼ反応が干渉を受けや すい。ビリルビンオキシダーゼはビリルビンの除去に使用されている[例えば、 Ｃlin．Ｃhem．、第３０巻、第１３８９頁〜第１３９２頁(１９８４年)]。しか しながら、糖化タンパク質アッセイの第１試薬中においてビリルビンオキシダー ゼの活性をプロテイナーゼの存在下で保持することはできないので余分の試薬が 必要となる。 尿酸のアッセイにおいて、１７０μmol／Ｌまでのビリルビンによる干渉効果 を取り除くためにフェロシアン化カリウムが使用されている[例えば、Ｃlin．Ｃ hem．、第２６巻、第２２７頁〜第２３１頁(１９８０年)]。しかしながら、この 場合には、該干渉の除去効果は大きいが、フェロシアン化カリウムを二液試薬系 の第１試薬に配合するために試薬の安定性が悪くなる[例えば、Ｅur．Ｊ．Ｃlin ．Ｃhem．Ｃlin．Ｂiochem．、第３１巻、第８６１頁〜第８６８頁(１９９３年) 参照]。以下において説明するように、本発明によれば、糖化タンパク質のアッ セイ用二液試薬の第１試薬にフェロシアン化カリウムを添加することによって４ ００μmol／Ｌまでのビリルビンの干渉効果を取り除くことができると共に、液 状試薬が４℃で数週間にわたって安定であることが判明した。 オキシダーゼ／ペルオキシダーゼ系をアスコルビン酸塩による干渉から保護す るためのいくつかの方法が知られている。最も一般的に用いられている手段はア スコルビン酸塩オキシダーゼである[例えば、Ｃlin．Ｃhem．、第２６巻、第２ ２７頁〜第２３１頁(１９８０年)参照]。しかしながら、この酵素はプロテイナ ーゼを含有する試薬中に添加すると急速に分解するので不適当である。活性炭を 用いる前処理法[例えば、Ｃlin．Ｃhem．、第３５巻、第２３３０頁〜第２３３ ３頁(１９８９年)参照]は不便である。 アスコルビン酸塩の酸化還元電位と同等またはこれよりも大きくかつ発色性物 質の酸化還元電位よりも小さな酸化還元電位を有する金属を用いてアスコルビン 酸塩による干渉効果を除去する方法も知られている。銅を含むこの種の金属とし ては周期表のVIII族、Ｉ−Ｂ族、II−Ｂ族およびIV−Ａ族の金属が挙げられる[ 例えば、米国特許第３,４１１,８８７号明細書参照]。金属イオンの酸化還元電 位が発色性物質の酸化還元電位よりも低いことが重要であり、そうでないと金属 イオン自体が目的とする分析物の不存在下で発色する。類似のオキシダーゼ／ペ ルオキシダーゼ系における銅の効果も検討されているが、銅の濃度を３０mmol／ Ｌのような高濃度にしてもその効果は極めて小さいことが判明している[例えば 、Ｃlin．Ｃhem．、第２８巻、第５７８頁〜第５８８頁(１９８２年)参照]。 驚くべきことには、本発明によれば、以下に説明するように、糖化タンパク質 を測定するためのオキシダーゼ／ペルオキシダーゼ法におけるアスコルビン酸塩 による干渉効果が０．１mmol／Ｌよりも低い濃度の銅の使用によって除去できる 。さらに、この系においては、血清や血漿以外の試料として水を使用するときに は、銅は色素原系を直接酸化する。従って、銅の酸化還元電位は色素原系の酸化 還元電位よりも高くなければならない。血清または血漿試料の分析において銅が 干渉しない理由は、血液タンパク質のプロテイナーゼ消化による生成物と銅の結 合に起因すると考えられる。 本発明の目的は、ペルオキシダーゼをプロテイナーゼと同じ試薬に配合する生 物学的試料中の糖化タンパク質の酵素的測定法を提供することである。驚くべき ことには、ペルオキシダーゼの活性はプロテイナーゼによって影響を受けない。 第２試薬の他の成分はクベットの吸光度に著しい影響を与えないので、ブランク 試料を用いる補正は不要である。吸光度変化は所定量の糖化タンパク質を含有す る検量液(calibrant)を用いた場合の吸光度変化と単に比較すればよい。 本発明の別の目的は、試料中に存在する可能性のあるアスコルビン酸塩または ビリルビンに起因する糖化タンパク質測定に対する干渉を防御することである。 アスコルビン酸塩による干渉効果はペルオキシダーゼを第２試薬ではなくて第１ 試薬に配合することによっても十分に取り除くことができる。 本発明はペルオキシダーゼを必要とするプロセスであって、ペルオキシダーゼ をプロテイナーゼと混合することが有利な種々のプロセスに一般的に適用できる 。分析物をタンパク質から除去してオキシダーゼを用いて測定する場合、または 無傷タンパク質が干渉する場合にも本発明は適用できる。本発明方法は生物学的 液体中の特異的糖化成分の測定または糖化ヘモグロビンの測定にも適している。 本発明は次の過程(ｉ)〜(iii)を含むことを特徴とする試料中の糖化タンパク 質の測定法を提供する: (ｉ)プロテイナーゼとペルオキシダーゼを含有する第１試薬を試料と混合する ことによって、ケトアミンオキシダーゼによる酸化を可能にする基質を生成させ 、 (ii)ケトアミンオキシダーゼを含有する第２試薬を添加し、次いで (iii)生成する過酸化水素または消費される酸素を測定することによって、糖 化タンパク質の検出および／または定量をおこなう。 本発明は(ｉ)プロティナーゼおよびペルオキシダーゼを含有する第１試薬、(i i)ケトアミンオキシダーゼを含有する第２試薬および(iii)随意の生成過酸化水 素または消費酸素の測定手段を具有することを特徴とする糖化タンパク質測定用 キットも提供する。 一般的には、本発明方法は体液、例えば血清または血漿等を含有する生物学的 試料に適用できる。 本発明によれば、プロテイナーゼは一般的にはプロテイナーゼＫ、好ましくは トリチラキウム・アルブム(Ｔritirachium album)由来のプロテイナーゼＫであ り、ペルオキシダーゼは一般的にはワサビダイコンペルオキシダーゼである。好 ましくは、ケトアミンオキシダーゼはクレブシエラ属の細菌、フザリウム属もし くはアクレモニウム属の真菌またはデバリオマイセス属の酵母から入手されるが 、特にフザリウム属の真菌から入手されるものが好ましい。(ケトアミンオキシ ダーゼは糖化タンパク質の糖部分の１位の炭素原子の酸化とこれによるアミン結 合の加水分解的開裂を触媒してアミノ酸から糖オゾンと過酸化水素を発生させる 。) 一般に、必要な測定には随意に改変されたトリンダー反応(「ＰＡＰ」法とも呼 ばれることがある)または酸素電極の使用が含まれる。 本発明の好ましい態様においては、アスコルビン酸塩による干渉は第１試薬に 銅(II)化合物(好ましくは、酢酸銅(II))並びに随意のコール酸および／またはバ ソフェナントロリンジスルホン酸を配合することによって阻止することができ、 および／またはビリルビンによる干渉は第１試薬および／または第２試薬にフェ ロシアン化塩(好ましくはフェロシアン化カリウム)を配合することによって阻止 することができる。さらに、ケトアミンオキシダーゼの活性維持の観点から第２ 試薬にエチレンジアミン四酢酸および／またはマンニトールを添加してもよい。 本発明の好ましい態様においては、トリチラキウム・アルブム由来のプロテイ ナーゼＫのクベット中での使用濃度は１〜１０g／Ｌであり、ワサビダイコンペ ルオキシダーゼのクベット中での使用濃度は０．０１〜１g／Ｌである。 本発明を以下の実施例によってさらに説明する。 実施例１ 糖化タンパク質測定用の２種の試薬対を調製した。一方の試薬対は第１試薬中 にペルオキシダーゼとプロテイナーゼを含有し、他方の試薬対は第２試薬中にペ ルオキシダーゼを含有する。第一の試薬対の場合には、第１試薬は(Ｎ−２−ヒ ドロキシエチル)ピペラジン−Ｎ'−(３−プロパンスルホン酸)(ＥＰＰＳ)を１０ ０mmol／Ｌの濃度で含有する緩衝液(pＨ８．５)に溶解させた４−アミノアンチ ピレン(３．０mmol／Ｌ)、プロテイナーゼＫ(１２g／Ｌ)およびワサビダイコン ペルオキシダーゼ(０．４g／Ｌ)を含有し、第２試薬は１００mmol／ＬのＥＰＰ Ｓ緩衝液(pＨ８．５)に溶解させたＴＯＯＳ(２６．６mmol／Ｌ)およびケトアミ ンオキシダーゼ(１００００Ｕ／Ｌ)を含有する。第二の試薬対の場合には、第１ 試薬は１００mmol／ＬのＥＰＰＳ緩衝液(pＨ８．５)に溶解させた４−アミノア ンチピレン(３．０mmol／Ｌ)およびプロテイナーゼＫ(１２g／Ｌ)を含有し、第 ２試薬は１００mmol／ＬのＥＰＰＳ緩衝液(pＨ８．５)に溶解させたＴＯＯＳ(２ ６．６mmol／Ｌ)およびワサビダイコンペルオキシダーゼ(１．３３g／Ｌ)および ケトアミンオキシダーゼ(１００００Ｕ／Ｌ)を含有する。 これらの試薬はコバス・ミラ社製のＳ型自動分析器を用いて試験した。プロテ イナーゼ含有試薬１００μＬをプラスチック製クベット内において糖尿病患者か ら採取したヒト血清１０μＬおよび希釈水４０μＬと混合して該試料管の内側を 洗浄処理した。３７℃で７分間インキュベートした後、第２試薬３０μＬおよび 希釈水２０μＬを該クベット内へ添加して内容物を混合した。クベットの５５０ nmにおける吸光度を、第２試薬を添加してから２５秒間隔で１．５分間測定した 。自動分析器は第２試薬を添加したときの希釈を考慮して吸光度の測定結果を自 動的に補正する。 第２試薬への添加によってペルオキシダーゼがプロテイナーゼから保護される 配合処方によって得られた結果を図１に示す。血清試料中の糖化タンパク質に起 因する吸光度変化を計算するためには、添加したペルオキシダーゼの色に起因す る水試料の吸光度変化を最初に差し引かなければならない。 ペルオキシダーゼを第１試薬の一成分として添加した配合処方によって得られ た結果を図２に示す。第２試薬の添加によっても水試料は吸光度の増加を示さな かった。プロテイナーゼとペルオキシダーゼの存在にもかかわらず、血清試料の 場合にみられた吸光度変化は水ブランクを差し引いた図１の結果と同様であった 。 実施例２ １００mmol／ＬのＥＰＰＳ緩衝液(pＨ８．５)に溶解させた４−アミノアンチ ペレン(２．２５mmol／Ｌ)およびワサビダイコンペルオキシダーゼ(０．２g／Ｌ )のほかにプロテイナーゼＫ(１２g／Ｌ)を含有するか、または含有しない試薬を 調製した。これらの試薬は室温で保存した。各々の試薬中のペルオキシダーゼの 活性はピロガロールと過酸化水素からのプルプロガリンの生成能として、試薬の 調製から０．５時間後および２４時間後に測定した。結果を以下に示す。 プロテイナーゼＫは試薬溶液を室温で２４時間保存してもワサビダイコンペル オキシダーゼの活性を低下させなかった。 実施例３ 糖化タンパク質測定用の二液試薬を調製して４℃で保存した。第１試薬は７５ mmol／ＬのＥＰＰＳ緩衝液(pＨ８．０)に溶解させた酒石酸ナトリウム(１.２mmo l／Ｌ)、酢酸銅(３００μmol／Ｌ)、フェロシアン化カリウム(１００μmol／Ｌ) 、ＴＯＯＳ(８mmol／Ｌ)、ペルオキシダーゼ(０．４g／Ｌ)およびプロテイナー ゼＫ(１２g／Ｌ)を含有する。第２試薬は８３mmol／ＬのＥＰＰＳ緩衝液(pＨ８ ．０)に溶解させた４−アミノアンチピレン(１０mmol／Ｌ)およびケトアミンオ キシダーゼ(１００００Ｕ／Ｌ)を含有する。 これらの試薬は４℃で保存する前と２２日間保存した後において２種の血清試 料を用いて試験した。試験は実施例１で用いたコバス・ミラ社製の自動分析器に よっておこなった。血清試料はアリコートとして凍結保存し、分析の直前に解凍 したアリコートを各々の分析に供した。試料中の糖化タンパク質に起因する吸光 度変化は、第２試薬の添加直前の吸光度を該試薬の添加から２．１分間後に測定 した吸光度から差し引くことによって計算した。結果を以下に示す。 吸光度変化 従って、オキシダーゼ／ペルオキシダーゼアッセイが完全におこなわれるなら ば、試薬を４℃で２２日間保存してもプロテイナーゼＫによるワサビダイコンペ ルオキシダーゼの分解に起因するシグナル低下はみられなかった。 実施例４ アスコルビン酸塩およびビリルビンによる干渉の除去能に対するペルオキシダ ーゼの効果を例証するために糖化タンパク質測定用の二液試薬を３種類調製した 。試薬系Ａにおいては、第１試薬は７５mmol／ＬのＥＰＰＳ緩衝液(pＨ８．０) に溶解させたＴＯＯＳ(８mmol／Ｌ)、ペルオキシダーゼ(０．４g／Ｌ)およびプ ロテイナーゼＫ(１２g／Ｌ)を含有し、第２試薬は８３mmol／ＬのＥＰＰＳ緩衝 液(pＨ８．０)に溶解させた４−アミノアンチピリン(１０mmol／Ｌ)およびケト アミンオキシダーゼ(１００００Ｕ／Ｌ)を含有する(この試薬系は該干渉に対抗 する成分は含有しない)。試薬系Ｂは第１試薬にフェロシアン化カリウム(１００ μmol／Ｌ)、酢酸銅(３００μmol／Ｌ)および酒石酸ナトリウム(１．２mmol／Ｌ )を添加する以外は試薬系Ａと同様である。これらの添加物はビリルビンとアス コルビン酸塩による干渉効果を低減させる成分である。試薬系Ｃは第１試薬にペ ルオキシダーゼを配合せず、また第２試薬に配合するペルオキシダーゼの濃度を １．３３g／Ｌにする以外は試薬系Ｂと同様である。従って、実施例１の場合の ようにして分析器内において試料、試薬および希釈液を混合した後では、クベッ ト内のペルオキシダーゼの濃度は３種類の試薬系において同一である。 上記の３種類の試薬系を次の４種類の試料中の糖化タンパク質のアッセイに使 用した:(１)水、(２)対照血清希釈液(血清４部に対して水１部)、(３)アスコル ビン酸塩の保存溶液を用いて同じようにして希釈した血清希釈液(アスコルビン 酸塩の濃度:４００μmol／Ｌ)、(４)非複合化ビリルビンの保存溶液を用いて希 釈した血清希釈液(ビリルビンの濃度:４００μmol／Ｌ)。試薬系Ｃを用いて得ら れた結果の計算に際しては、血清試料によって得られた吸光度変化から水試料に よって得られた吸光度変化を差し引くことによって第２試薬中のペルオキシダー ゼに起因する吸光度に対して補正した。 以下の表においては、アスコルビン酸塩およびビリルビンによる干渉効果は、 対照血清によって得られた吸光度変化に対する百分率として表示される該干渉に よって得られる吸光度変化として示される。 血清における回復百分率 ビリルビン(４００μmol／Ｌ)は試薬系Ａと併用する場合には対照試料の７２ ％まで吸光度変化を小さくする。しかしながら、試薬系Ｂ(第１試薬にペルオキ シダーゼを配合)および試薬系Ｃ(第２試薬にペルオキシダーゼを配合)における 干渉効果はフェロシアン化物、銅および酒石酸塩を第１試薬に配合することによ ってほとんどなくなる。 アスコルビン酸塩による干渉効果は試薬系Ａにおいて特に大きく、シグナルの ９０％以上が消失する。試薬系Ｂの付加的な成分によってこの効果は５％以下ま で低減される。しかしながら、等量のペルオキシダーゼを第２試薬に添加した試 薬系Ｃの場合には、吸光度変化は著しく増大する。従って、この系においては、 アスコルビン酸塩による干渉効果の除去は第１試薬中へのペルオキシダーゼの添 加に左右される。 実施例５ 実験効率を最大にするためには、試験は自動分析器を用いて出来るだけ短時間 でおこなうべきである。しかしながら、一部の分析者は３分間よりも長い最初の インキュベーション時間内に二液試薬の化学反応をおこなうことができない。試 料を第１試薬を用いてインキュベートする時間を短縮することによってアスコル ビン酸塩による干渉効果の除去能にもたらされる有害な効果を試薬系Ａを用いて 以下に説明する。しかしながら、試薬系Ｂは干渉効果の除去能を著しく改良する 添加成分を含有する。 試薬系Ａにおいては、第１試薬は７５mmol／ＬのＥＰＰＳ緩衝液(pＨ８．０） に溶解させた酒石酸ナトリウム(１．０mmol／Ｌ)、酢酸銅(２５０μmol／Ｌ)、 フェロシアン化カリウム(２０μmol／Ｌ)、ＴＯＯＳ(８mmol／Ｌ)、ペルオキシ ダーゼ(０．４g／Ｌ)およびプロテイナーゼＫ(６g／Ｌ)を含有する。第２試薬は ８３mmol／ＬのＥＰＰＳ緩衝液(pＨ８．０)に溶解させた４−アミノアンチピレ ン(１０mmol／Ｌ)およびケトアミンオキシダーゼ(１００００Ｕ／Ｌ)を含有する 。この試薬系は異なるインキュベーション時間(２．９分間および７分間)を用い て試験した。 試薬系Ｂにおいては、第１試薬は７５mmol／ＬＥＰＰＳ緩衝液(pＨ８．０)に 溶解させたバソフェナントロリンジスルホン酸(１７５μmol／Ｌ)、ポリオキシ エチレン１０トリデシルエーテル(１％w／v)、コール酸(２％w／v)、酢酸銅(１ ００μmol／Ｌ)、フェロシアン化カリウム(１００μｍｏｌ／Ｌ)、ＴＯＯＳ(８ ｍｍｏｌ／Ｌ)、ペルオキシダーゼ(０．４g／Ｌ)およびプロテイナーゼＫ(６g／ Ｌ)を含有する。第２試薬は試薬系Ａの場合と同じ組成を有する。 ２種類の試薬系を用いて次の３種類の試料中の糖化タンパク質をアッセイした :(１)対照血清希釈液(血清４容量部に対して水１容量部)、(２)アスコルビン酸 塩の保存溶液を用いて同じようにして希釈した血清希釈液(アスコルビン酸塩の 濃度:３００μmol／Ｌ)および(３)非複合化ビリルビンの保存溶液を用いて希釈 した血清希釈液(ビリルビンの濃度:３００μmol／Ｌ)。 試料、試薬および希釈液を実施例１の場合のようにして分析器内において混合 した(但し、この場合には試料と第１試薬のインキュベーションは２．９分間ま たは７分間おこなった)。 以下の表においては、アスコルビン酸塩およびビリルビン干渉剤の効果は対照 血清によって得られる吸光度変化に対する百分率として表示されるこれらの干渉 剤によって得られる吸光度変化として示される。 実施例６ 上述の干渉効果を除去する試薬を用いる場合において試料と第１試薬のインキ ュベーション時間を短くすることによる不利な点は、試料として水を使用したと きに反応が進行することである。このバックグラウンド反応は血清が試料のとき には明確ではないが、上記の方法は血清以外の試料を用いておこなうのが好まし い。 試薬系Ａにおいては、第１試薬は７５mmol／ＬのＥＰＰＳ緩衝液(pＨ８．０) に溶解させた酢酸カルシウム(５mmol／Ｌ)、バソフェナントロリンジスルホン酸 (１４４μmol／Ｌ)、ポリオキシエチレン１０トリデシルエーテル(１.２％w／v) 、コール酸(１．８％w／v)、酢酸銅(９０μmol／Ｌ)、フェロシアン化カリウム( ９０μmol／Ｌ)、ＴＯＯＳ(５．６mmol／Ｌ)、ペルオキシダーゼ(０．２８g／Ｌ )およびプロテイナーゼＫ(４g／Ｌ)を含有する。第２試薬は５０mmol／ＬのＥＰ ＰＳ緩衝液(pＨ８．０)に溶解させた４−アミノアンチピレン(１０．５mmol／Ｌ )およびケトアミンオキシダーゼ(１３０００Ｕ／Ｌ)を含有する。 試薬系Ｂは、第２試薬にＥＤＴＡ二ナトリウム(３０mmol／Ｌ)を添加する以外 は試薬系Ａと同じ試薬系である。 ２種類の試薬系を用いて次の試料中の糖化タンパク質をアッセイした:(１)水 、(２)糖尿病患者から採取した血清および(３)糖尿病患者から採取した血漿。 試薬系はコバス・ミラ社製のＳ型自動分析器を用いて試験した。プロテイナー ゼを２５０μＬ含有する試薬をプラスチック製クベット内において試料２０μＬ と希釈水３０μＬと混合することによって該試料管の内部を洗浄処理した。３７ ℃で２．９分間インキュベートした後、第２試薬５０μＬと希釈水１０μＬを同 じクベット内で混合した。クベットの５５０nmにおける吸光度は第２試薬の添加 時から２５秒間隔で１．５分間測定した。 試薬系ＡおよびＢを用いて得られた吸光度のプロフィールを図３および図４に それぞれ示す。水が試料のときに第２試薬の添加後に得られる吸光度の増大は、 第２試薬中にＥＤＴＡが存在する場合には阻止される。血清および血漿試料によ って得られるシグナルは第２試薬中にＥＤＴＡが存在する場合よりも１５％大き い。これらの効果はいずれもＥＤＴＡによる銅のキレート化に起因すると考えら れる。銅は色素原の共存下でシグナルを発生し、また、ケトアミンオキシダーゼ 活性を部分的に阻害する。 実施例７ 第２試薬はマンニトールの添加によって安定化させることができる。２種類の 第２試薬ＡおよびＢを調製した。第２試薬ＡはＥＰＰＳ緩衝液(５０mmol／Ｌ;p Ｈ８．０)、アミノアンチピレン(１０．５mmol／Ｌ)、ＥＤＴＡ(３０mmol／Ｌ) およびケトアミンオキシダーゼ(６０００Ｕ／Ｌ)を含有する。第２試薬Ｂはマン ニトールを５％含む以外は第２試薬Ａと同じ組成を有する。これらの試薬は凍結 乾燥後に脱塩水で溶いた後、いずれも２５℃で２１日間保存し、次いで対照とし て−２０℃で凍結させた。 マンニトール含有試薬およびマンニトール不含試薬の安定性は実施例６のコバ ス・ミラ社製自動分析器のプロトコルに従って血清試料と次の成分を含有する第 １試薬を用いて試験した:６０mmol／ＬのＥＰＰＳ緩衝液(pＨ８．０)に溶解させ た酢酸カルシウム(５mmol／Ｌ)、バソフェナントロリンジスルホン酸(１４４μm ol／Ｌ)、ポリオキシエチレン１０トリデシルエーテル(１．２％)、コール酸(１ ．８％)、酢酸銅(９０μmol／Ｌ)、フェロシアン化カリウム(９０μmol／Ｌ)、 ＴＯＯＳ(５．６mmol／Ｌ)、ペルオキシダーゼ(０．２８g／Ｌ)およびプロテイ ナーゼＫ(３g／Ｌ)。結果は、第２試薬の添加から２．５分間後に測定した５５ ０nmにおける吸光度から第２試薬の添加直前の５５０nmにおけるクベットの吸光 度 を差し引くことによって計算した。 ２１日後の吸光度変化は次の通りである。 ２５℃で３週間保存後では、試薬Ａを用いたときに得られるシグナルは対照凍 結試薬の７７％までに低下した。しかしながら、マンニトールを含有する試薬Ｂ は安定であった。 実施例８ 糖化タンパク質の酵素的測定法および実用化されているニトロブルーテトラゾ リウム法[ロシェ(Ｒoche)カタログ番号０７３６６９４]をフロシン標準法と比較 することによって試験した。この方法には酸加水分解およびその後でおこなうタ ンパク質糖化に対して特異的なフロシンのＨＰＬＣによる定量が含まれる。フル クトシルリジンを基準として用いた。 酵素試薬の配合組成は次の通りである。第１試薬は６０mmol／ＬのＥＰＰＳ緩 衝液(pＨ８．０)に溶解させた酢酸カルシウム(５mmol／Ｌ)、バソフェナントロ リンジスルホン酸(１４４μmmol／Ｌ)、ポリオキシエチレン−１０−トリデシル エーテル(０．２５％)、コール酸(１．８％)、酢酸銅(３０μmol／Ｌ)、フェロ シアン化カリウム(９０μmol／Ｌ)、ＴＯＯＳ(５．６mmol／Ｌ)、ペルオキシダ ーゼ(０．２８g／Ｌ)およびプロテイナーゼＫ(４g／Ｌ)を含有する。第２試薬は ５０mmol／ＬのＥＰＰＳ緩衝液(pＨ８．０)に溶解させたマンニトール(３％)、 ケトアミンオキシダーゼ(９０００Ｕ／Ｌ)、ＥＤＴＡ(３０mmol／Ｌ)およびアミ ノアンチビレン(１０．５mmol／Ｌ)を含有する。 第１試薬２５０μＬをプラスチック製クベット内において試料２０μＬおよび 希釈水３０μＬと混合することによって該試料管の内側を洗浄した。３７℃で５ 分間のインキュベーション処理をおこなった後、同じクベット内において第２試 薬５０μＬおよび希釈水１０μＬと混合した。５５０nmにおけるクベットの吸光 度を２５秒間隔で１０分間にわたって測定した。試料中の糖化タンパク質に起因 する吸光度変化は第２試薬の添加から５分間後に測定した吸光度から第２試薬の 添加直前に測定した吸光度を差し引くことによって計算した。 糖尿病患者から採取した血清試料５６種に含まれる糖化タンパク質を３種類の 方法によってアッセイした。酵素法およびＮＢＴ法はそれぞれγ＝０．９５およ びγ＝０．９６で標準法と良好な相関性を示した(図５参照)。ＮＢＴ法は９５μ mol／Ｌまたは見積られた標準上限の３４％の正の偏りを示したが、酵素法の場 合には、回帰線は原点の非常に近くを通る。このことは次のことを示すものであ る。即ち、酵素法とＮＢＴ法はいずれも同じ分析物を測定するが、前者は血清中 に存在する非特異的なバックグラウンドの還元活性の影響を受けない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ポラー，サラ・キャサリン イギリス、エムイー15・８エルダブリュ ー、ケント、メイドストーン、ベアステッ ド、マートン・ロード176番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．次の過程(ｉ)〜(iii)を含むことを特徴とする試料中の糖化タンパク質の 測定法： (ｉ)プロテイナーゼとペルオキシダーゼを含有する第１試薬を試料と混合する ことによって、ケトアミンオキシダーゼによる酸化を可能にする基質を生成させ 、 (ii)ケトアミンオキシダーゼを含有する第２試薬を添加し、次いで (iii)生成する過酸化水素または消費される酸素を測定することによって、糖 化タンパク質の検出および／または定量をおこなう。 ２．試料が体液、好ましくは血清または血漿を含有する請求項１記載の方法。 ３．プロテイナーゼがプロテイナーゼＫ、好ましくはトリチラキウム・アルブ ム由来のプロテイナーゼＫである請求項１または２記載の方法。 ４．ペルオキシダーゼがワサビダイコンペルオキシダーゼである請求項１から ３いずれかに記載の方法。 ５．ケトアミンオキシダーゼがクレブシエラ属の細菌、フザリウム属またはア クレモニウム属の真菌またはデバリオマイセス属の酵母(好ましくはフザリウム 属の真菌)から入手されるケトアミンオキシダーゼである請求項１から４いずれ かに記載の方法。 ６．測定過程に随意に改変したトリンダー反応の利用または酸素電極の使用を 含む請求項１から５いずれかに記載の方法。 ７．アスコルビン酸塩干渉を、第１試薬に銅(II)化合物(好ましくは酢酸銅(II ))および随意のコール酸および／またはバソフェナントロリンジスルホン酸を配 合することによってカウントする請求項１から６いずれかに記載の方法。 ８．ビリルビン干渉を第１試薬および／または第２試薬にフェロシアニド塩( 好ましくはカリウムフェロシアニド)を配合することによってカウントする請求 項１から７いずれかに記載の方法。 ９．ケトアミンオキシダーゼの活性を維持するために第２試薬にエチレンジア ミン四酢酸および／またはマンニトールを配合する請求項１から８いずれかに記 載の方法。 １０．(ｉ)プロテイナーゼとペルオキシダーゼを含有する第１試薬、(ii)ケト アミンオキシダーゼを含有する第２試薬および(iii)随意の生成過酸化水素また は消費酸素の測定手段を具有することを特徴とする糖化タンパク質測定用キット 。