BE1001692A5

BE1001692A5 - Polypeptides a action immunologique, leur procede de preparation, et leur utilisation pour la preparation de vaccins antipaludeens et de trousses de diagnostic pour la detection d'anticorps antisporozoaires.

Info

Publication number: BE1001692A5
Application number: BE8701373A
Authority: BE
Inventors: Bernardi Adriano; Bonelli Fabio; Pessi Antonello; Silvio Verdini Antonio
Original assignee: Eniricerche Spa
Priority date: 1986-12-04
Filing date: 1987-12-02
Publication date: 1990-02-13
Also published as: SE8704765D0; GR871850B; GB2199038B; FR2607703B1; DE3741183C2; DE3741183A1; AR247405A1; US4843146A; ATA319087A; IT1198225B; CH672491A5; ES2005753A6; IT8622560A0; AT398426B; GB8728000D0; FR2607703A1; CA1304888C; GB2199038A; ZA878903B; NL8702921A

Abstract

Polypeptides à activité immunologique, constitués, du côté de l'extrémité N-terminale, d'une séquence (Asn-Val-Asp-Pro-Ala-Asn-Pro) répétée trois fois et, du côté de l'extrémité C-terminale, d'au moins trois quadruplets de séquence (Asn-Ala-Asn-Pro), avec une liaison amide entre la proline finale de la première séquence et l'asparagine initiale du premier quadruplet. Ces polypeptides reproduisent presque exactement la structure séquentielle de la protéine circumsporozoaire de P. falciparum, et ils sont utiles pour la préparation de vaccins contr le paludisme et de trousses de diagnostic pour la détection d'anticorps antisporozoaires dans des échantillons cliniques provenant de personnes atteintes de paludisme.

Description


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  DESCRIPTION 
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 Polypeptidea & action itnlunologique, leur proc. gdä de präparatioo, et leur utilisation pour la préparation de vaccine antipaludéens et de   touages   de diagnostic pour la détection d'anticorps anti- sporozoaires. 



   La   prcaante   invention concerne des polypeptides à action immunologique, qui sont utiles pour la préparation de vaccins antipaludéens et de trousses de diagnostic pour la détection d'anticorps antisporozoaires dans ded échantillons cliniques provenant de personnesattaintesdepaludisme. 



   L'invention concerne en outre un procède de preparatioa desdits polypeptide. 



   L'agent étiologique du paludisme eat un parasite protozoaire appartanant au genre plasmodium, qui présente un cycla vital 
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 alternant entre un h3ta J. nveft6br8, dan. s laquel U preaente uoe forme sexuel da reproduction, et ua h5ca vect6bre, a l'interieur duquel il sä multiplic par. simpJ. e Hchizogonie. 



   Parmi as centaines d'espèces de plasmodium axistant dans La nature, quatre seulement sont pathogène pour l'homma : P. ovala, P. vivax, P. taulariae, et P.   faJciparum.   En particulier ; ce dernier 
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 reprsoento I'agent Stiologique da la forma la plus sérieuse du paludiame, celle qua l'on appelle "f1ivre tieree maligne". 



  Actuellement le paludiame reprSaente pour 1'homme l'une des plua sêrieusee maladies parasta1rea. On estima an effet qua cette maladie frappe chaque ann & a de 200 a 400 mlllions de personnes, provoquant un taux de mortalit6 ati bas age qui paut 2tre ausai glev6 qua 50% des cas. 

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 11. ast donc ndcesaaire de développer un vaccin antipaluden efficace, ctest-à-dire un vaccin qui puisse simuler la production d'anticorps capablea d'attaquer et de neutraliser le   parasitez   et da développer une immunité protectrice permanente. 



   Chez l'homme, l'infection paludéenne commence avec la piqûre d'un moustique anophèle, qui inocule un certain nombre de   aporo-   zoaires dans le courant sanguin. En une heure, cheque sporozoaire atteint und cellule hépatique dans laquelle il provoque la formation de 20 000 mérozosires ou plus. Ensuite, chaque   merozoa. ire   envahit un   erythrocyte,   dans lequel il se multiplie de façon asexuée, de corps annulaire en   schizotits.   Un schizont mature contient des mérozoaires 
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 individualiaea, qui na sont pas encore capables d'envahir d'autres. érythrocytes. Lorsque l'érythrocyte éclate, il libère de 10 à 20 mérozosires matures, dont quelques-une   6voJuent en gametocytes, qui   représentent la forme infectant le mostique. 



   La   Htructure oomplexe   du cycle vital des parasites paludéens a 
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 rendu difficUe, jusqu'ä aujourd'hui, la miae au point d'un vaccin doué des capaetssristiquea souhaitées. kan effet ces parasites évoluent selon un cycle a 6tapes multiples, on exposant l'organiame h$te A un très grand nombre d'agents antigènes, différents l'un de l'autre et spécifique d'un stade particulier. Seul. une petite fraction de ces 
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 agenta antignea provoque des r6ponaeM immuno-protectrices, tandia que lea autres fractions ne sont pas importantes en ce qui concerne la protection immunitalre 0) t bien atlmulent cha : : 1'hSte des réponses non aouhaitab1ea. 



  Une vaccination utilieant le parasite entier eat done une approche qui n'est ni pertinente ni praticable, du fait que   1 ton ne   peut pas obtenir les parasites paludéens an quantité suffisamment 
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 grande ou A un niveau de purete satisfaisant. Il faut done bager I. a strategie pour 1a mise au point d'un vaccin asti-paludéen our 1'identifJ. cation et la cafaHterisatiOtl des aeula antigSnes parasltairea qui provoquent specifiqussmeut des rdponses imtunoprotectrices. 



  Lorsque la sequence d'acideM amina de la proteina naturelle aura 6t6 identifie, J'etape auivanta conoistera ä pr6parer une mol Scule active, at/ou dea fragments actifs de celle-ci, au moyen de precede de syntlii) se chimique ou de gcnie gnetique. 

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  Au cours des derniers anales, en tentant d'identifier les antigens paludéens protecteurs, les chercheurs se sont surtout intéresses aux formes extracel1úla1rea t mérozoa1res, sporozoaires at gametocytes, coules formea expoaeeti au aystema immunitaire. 



  En particulier, on a effectué de nombreuses etudes au l'identification Ht Ja caractssrisation des antigene8 asaocies aux sporozoaires. En effet, la mise au point d'un vaccin contre cette forme du psrasite est particuli & rmetit souhaitable, car al. ce vaccin cU3t efficace chez J'hoinins, il pourra inhiber le passage au stade suivant, responsable de la maladie et de l, a tratiamission-de l'infection. 



  Récemment, on a montr6 qua l'antigone principal da la membrane du sporozoaire de P. falciparum eat une proteine, appelêe "proté1ne cit-eumsporozoaire", ou"CS", qui recouvre toute la surface du sporozoaire. On a trouva que cetta protdine est conatitusse de 412 acides amines. et'w'el1e comport un domaine cettC: etl uunstituS de tXt-ttpcpH. deM prsssenran la aequence Asn'-Ala-Aan-Pro rcpetée 37 fois et de 4 totrapeptidau prcaentant la adquence Asn-Val-Asn-Pro (Dame et al., Science, 1984, , 593 ; Nusaenzwef. g et al.. Cell, 19H5, 42, 401). 



  Dan M la JittSrature tectmique et la litterature de brevet, on décrit des procdëa. de 9ynthès da prot inas comportant des séquencea Asn-Al11-Aan-Pro repSt6es, aussi bion par synthssae chimique que par la technique d'ADN recombinant. Lee proessdSs qui utilisent les techniques du génie gt ! n6tique pr6i3entent cependant quelques inconnicnta, comme l'ut. llisation du microorganism pathogène K. coli, et l'obtantion d'une proteine de fusion, c'eBt-ä-dire une protéine conatituco par la proteiue CS et utte 86quenee h & terologua d'achtes aminés. 



  Un procède par synthÖHe chlmique est decrit dans la demande de brevet italien associe nO 21 718 AlBS, qui décrit et revendique une sÅaquencc peptidique constituée d'un mélange de peptides, où la sequence (Asn-Ala-Aan-Pro) est rgpr--tde n fois. D'aprës les etudea effectuées dans le but de determiner les proprietors iaimunologiquea de cette composition et de determiner sa capacity 11 provoquer une 

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   immunity   protectrice, on a observe qua le segment peptidique comportant une moyenne de 40 quadruplets (Aun-Ala-Asn-'Pro), bien   qu'il soit hautement immunogène, provoque une réponse immunitaire   génétiquement restreinte. En effet, chez des souria de laboratoire, souls quelques clones de cellules T sont stimulés par ce segment. 



  Cacl constitue un inconvenient pour la mise au point   d t un vaccin   
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 antipaludeen, en ce qu'il n'eat pas efficace chez tous les patients. 



  La demanderesse a trouve maintenant qu'iJ est pOasible de surmonter lea inconvenieuts de l'art anterieur, au moyen de polypaptides immunologiquement actifs, qua l'on peut obtenir sous forme pure par un procssde almp]. e et econontiquement avantageux, et qui comportent, en plus de la sequence Aan'*Ala-Aan"Pro, encofe d'autres segmnta peptidiqties prSaents dans la protSine du parasite. 



   Un objet de la présente invention est donc constitué par des polypeptides immulogiquement actifs, utiles pour la preparation de   vaccina antipaludeens et   de trousses de diagnostic pour la détection d'anticorps   atiaporozoa. ires   dans des   eehantillons   cliniques. 
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  Un autre objet de la prgoellte invention est & galement 1'utilit. atlot) dea poj. ypeptidea pour la preparation de vaccine anti- paludéens et de trousses de diagnostic pour la detection d'anticorps antisporozoniresdansdeséchantillonscliniques. 



   Un autre objet de la présente   inventlon est conatitu6 par   un procédé do préparation deadita polypeptides. 



   D'autres objets de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante et des exemples suivants. 



   En particulier, les polypeptides conformes à la présente invention peuvent être définis au moyen de la formule générale   suivante (I) :   
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 (Aan-Va!-Aap-Pro-Aan-Ala-'Aart-Pro)o-(Astt-Ala-Asn-Pro)-Aan-Ala   dane laquelle t   - Asp = acide aspartique   - Asn"asparagine   - Ala = alanine -   Pro.. praline   val ine et dang laquclle n   eet   egal ou   supérieur     A 3.   

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  On peut préparer le polypeptide (I) selon des techniques ganeralea connues soit en phase homogene, soit en phase solide. t Selon la presssnia invention on aynthStiae le polypeptide (I) en phase solide par un procéda comportant: a) la condensation du premier acide amine (Ala), dont le groupe < X-amino est prote, sur Uti support solide insoluble. par r & action d'eaterification entre le groups carboxy activg at le groupe d'accrochage sur le support solide; b) l'élimination du groupe protecteur du groupe   &alpha;-amino;   c) Ja condensation de lucide   amin@ Ala, lié au support solide   insoluble, sur le second acide aminé Asn, dont le groupe   C-amino eat protge,   par reaction d'acylation entre La groupe 
 EMI5.2 
 amitio d6prot6g6 at]. e roupa carbOKy activ du second acids aminé ;

   d) lt6limiiiatioii du groul) ek protecteur du groups C-amino du second   acide aminé;   e) la condensation des acides aminés   auccessifs, seon des voiea   similaires à celles exposées ci-dessus pour lea étapes (C) et (d), jusqu'a l'achèvement du polypeptide (I) ;   f)   a séparation du polypeptide (I) ainsi obtenu d'avec le support solide insoluble, par hydrolyse acide ; g)   la recuperation   et la purification du polypeptide (1) par chromatographie. 



   Salon la présente invention, on choisit les supports solides insolubles parmi les résines de polyacrylamide, les résines de 
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 polystyrene reticulsses avec du div1nyl-benzène, et les resins phänoliquea. En particuier, on utilise une risine commerciale da polyacrylamide, fonctionnaliaee avec de la norlaucine (, Nle) en tant qu'acide aminé de rafmrence interne, et avec un groupe d'accrochage pour la formation de la Haison tévereible peptide-rêsille, comme par exemple de l'acide p-hydroxymssthylphenoxyacdtique. 



  AvAt-] tt cutidenaAC. T. on des atideti a' ! tines, on fait gonfler la résine fonctionnalia6e par traitament avae du N, N-dimathyl-formamide (DMF), Ai temp6rature ambiante ou i1 des tempEratures voisinera de la temperature ambiante. 

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  Selon la présente inve1\tlun, on peut condenser les acides amines Bur la résine, soit individuellement, soit sous fortae de peptides constitues au preaable, apresaynthSsepräliminairaann phase homogene. Les acides ataings sont condenses aur la rssaine apräa protection pr6a]. able du groupe 0 ("aoi' et des eventuelles fonctions raactivca plaessaa eu ! r Jea chatnaa lateralea, et apräa aetivation du groupe   carboxy terminal.   



   Des exemples da groupes   &alpha;-amino-protecteurs convenable   pour le but anvisagé sont les suivants : benzyloxycarbonyle, triphényl-   inssthyle,     tertioamyloxycarbouyle,   2-nitrophénylsulfonyle, fluorényl- 
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 methyloxycarbonyle (Fmoc) et tert1obutyloxycarbonyle (Boc). Parmi ceux-ci, on prgfare lee groupes Fwoc et Boe, qua l'on paut êllminer dans des conditions operatolres douces. On préfère en particulier la groupe fluorényl-méthyl-oxy-carbonyle (Fmoc). 



   Les éventuels groupes fonctionnels réactifs présents dans lea   chatnes   laterales des acides   aminES   sont   protestes     ä l'aide de   groupes protecteurs connus dans la technique des gynthöses de peptides. Un utilise an particulier des groupes protecteurs qui aont stables dans lea conditions   de l'élimination du groupe &alpha;-amino-protecteur,   Un exemple de ces groupes protecteurs est le groupe tertiobutylester    (OBut)   pour l'acide aspartique. 



   Selon la présente invention, on effectue l'activation des radicaux d'acides   aminées   Val, Ala, Pro, Asp par reaction avec la dicyclohexylcarbodiimida (DCI), pour former l'anhydride symétrique 
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 dudit acida amine, au niveau du gyoupe carboxy terminal. On effectue généralement la reaction en dlsso1vant J.'acide aminé, dont le groupe 0 (.-amino eat protesse, dan ? un aolvant nrnique inerte (non rssactif), an presence de dicyclohexylcarbodiimide, à température ambiante   (20-25"C).   Après la fin de la réaction, on sépare par filtration ou par centrifugation la   dicyclohexylurSe formee,   on 61imine le solvant par evaporation et on récupère l'anhydride symétrique forme. 



   On effectue l'activation du radical d'acide aminé   Aan   par 
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 réaction avec un dérivE du phénol, pour former l'eater actif sur le groupe carboxy terminal. Les dérivée du phenol que l'on utilise dans le procédé conforme à la présente invention sont des dérivés fluorés 

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 ou chlores du phenol, tels que par exemple le pentachlorophenol, le trichlorphenol et Je pentafluorophenol, ainai que le p-nitrophanol. 



  On effectuc la reaction d'activation du groupe carboxy des acides amines a groupe CX-amino protege an mettant en contact ledit acide aminc et leuit dFrlve du plidnol dans un solvant organique inerte, 3 Ja tempgrature ambiants ou aux environs de cette temperature. nee exempJ. ea de solvants organiques coavenables pour le but enviaagS aont choisia pacmi lea aolvanta aprotiquea, tela que par exemple l'acsstate d'ssthyle ou !essa hydrocarbures àliphatiquea chlorsss. 



  On refroidit ensulte 1. a aolution aiasi obtenuEI II une temperature d'environ O*C, at un y ajoute un agent de cOQdeus8t1on, le rapport molaira de l'agent de condensation a 'aclde amin etant gal ä l ou voisin de l. L'agent de condensation typiquement utilia6 est] e dicyelohexylcarbodiiMide (nCI). pa < : a Dans 1 retape (a) du procédé da 1a prbente invention, on effectue la réaction d'eaterification entre l'anhydride symétrique de l'acide aminé Ala, dont 1e groupe 0 (-amino aBt pro'tlSge, et le groupe d'accrochage de la rssine dans un solvant organique inerte, an presence de catalyseurs. 



  Les sol. vanta organiquea convenablas pour le but envisagé sont choisis parmi les eolvant aprutiques, par exemple les hydrocarbures aJlphatiquoa chlorea, lett eetoneB aliphatiques et lea estera alkyliques. Dea exemples particuliera de ces solvants sont le N, Ndimdthylformainidl- (DMF), le chloroforme, l'acétate d'éthyle et le tetrahydrofurana. 



  On choiait ea catalyseura parm ! ceux connua dans. la technique antérieure. En particulier, on utillae la 4-dlMethyJ. aminopyrl. ditie et la N-mcthyJmorpholine. 



  Les températures auxquell. ea on effectua Ja reaction d'esterification peuvent ae !- de fagon generaJo de- !. 0 C & 40"C, et les dureea correspondantes sont les duree nSceesaires pour que la réaction soit complète ou pratiquement coiaplate. En particulier, an effectue la réaction tel temperature ambiante (20-25 C). 

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 lt t aEe (b ) ¯¯¯ ¯¯¯¯ A la fin de] a reaction d'esterification, dans l'etape (b), le e groupe protecteur est sapare du gfoupa -amino. Rn particulier, lorsque la groupe protecteur et le groupe fluorenylméthyloxycarbonyle (Fmoc), on effectue cette séparation en traitant le produit peptiderästne avec un mclanga de piperidine/DMF (20 z 80, v/v), pendant una duree totale d'environ 10 minutes, a temperatura ambiante (20-25"C). 



  S-l-s-si Après la Separation du groupe c (-amino-protecteur et le avage c.otlvenabl.e du produit peptide-rEsinc on condense, au cours des 6tapes (e) et (e) du procède de la présente invention, las acides aminé. successifs par rEaction d'acylatioa entre lee acidee amines, convenablement protégea et pr8aJ. ablement activ6s au niveau de leur groupe   carboxy, et la group@ amino déprotégé de l'acide aminé à   la réeine. 



   On effectue en particulier cette rdaction d'acylation dana un solvant organique inerte en présence de catalyseurs. Les solvants organiques intertes sont choisis parmi les solvants aprotiques, par 
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 example lea hydrocarbures aliphatiques chlores, lea cetonea allphatlqueo ou les usters alkyliques. De prdfErencs, on utlllse le N. N-diethylformamide (DMF), le chloroforme, l'acetate d'éthyle ou le tétrahydrofurane. 



   Les catalyseurs sont choisis parmi ceux connus dans la   tachnique.   En particulier, on utilise la 4-diméthylaminopyridine, la N-méthylmorpholine, et pour le radical Asn, le 1-hydroxybenzotriazole (HOBT). 



   Lestempératuresauxquellesoneffectuelaréactiond'acylation sont généralement comprises entre -10 et 40 C, et de préférence entre 
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 0 et 25*C. Mieux encore, on effectue cette)'6actlon ä temprature ambiante ou au voiainage de cette tempefature, et lea durees correspondantes sont celles nécessaires pour que la reaction soit complète ou prntiquoment complète. 



    Etape (f)  
On peut   effectuer ! a Separation   du polypeptide (I)   d'avec   le support solide insoluble, selon les techniques connues, par hydrolyse acide ou   baaiaue. amiilui. vsa   ou   alcoolyse.   

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  De façon caractériatique, un effectue la reaction en mettant en auapension ! e produit peptlde-resine dana un melange acide trifluor acétique/eau (90/10, v/v) A une temperature comprise entre 10 et 30oC. A la fin de la réaction on aepare par filtration la reline d'avec le mélange réactionnel, on la   lave a 1.'eau   de façon   répétée,   at on la récupère grâce à une nouvelle filtration. On réunit les filtrate et on les concentre à siccité par évaporation, puis on 
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 dissout le rcsidu dans l'ean et un lyophiliae la solution obtenue. 



  522-Isl Le polypeptide brut (I), provenant de l'etape (f), est alors purifie graco & uns euite d'Scapft de Chromatographie par filtration sur gal, de chromatographie sur tamis moléculaire et/ou de chromatographie par échange d'ions. Les fractions correspondant au produit dear6 sont recueillies et lyophilisées. 



   A la fin du procédé de la présente invention, on obtient un rendement chromographique total de 59%, et un rendement en fraction purifiée de   73%.   par rapport au polypeptide libéré de la résine. 



   Les polypeptides présentant la formule générale (I) sont doucis d'unebonneactivitéimmunogène,
Les polypeptides dans lesquels n est compris entre 3 et 40 sont 
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 particttJiärement convenablea pour la propos de la présenta invention. 



  En effet. on a trouve que, loraque l'on injecte ces polypeptides, dans un adjuvant complet et/ou ineomplet de Freund, al des lignes da souria qui se sont rev8l6ea non reactivea au polypeptide (Aen-Ala-Asn-Pro) < o, css polypeptides provoquent la fortnation d'anticorps anti-polypeptides. On peut dune utiliser ces polypeptides pour la préparation de vaccina   atitipaludeens,   efficaces chez tous les patienta. On peut en outre utiliser ces polypeptides pour la 
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 präparation de trousses de diagnostic et dana. des systemes de détection d'anticorps anti-sporozoaires dans des échantillons de sang provenant de personnes atteintes de paludisme. 



   Lee exemples expérimentaux suivanta illustrent l'invention sans   la   limiter. 

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  EXEFIPLE I Synth & seda(Asn-Val-Aap-Pco-'Atin-Ala-*Aan-Pro).,-'(Aan"Ala-Aan-Pro)A9n-Ala On effactuc la syntheaa dan9 un appareil de synthèse automatique Beckman, modale 990 B, en utilisant une reine commercials de polyacrylamide (Cambridge Researche Biochemical, Pepayna A) foactiona- lisée avec de la norleucine en tant   qu'acide amia   de   référence   interne, et avec de l'acide p-hydrométhylphénoxyacétique en tant qua groupe d'accrochage réversible peptide-résine. 



   On fait gonfler 1 g de raine pendant 16   haures dans   32 ml de N,   N-d1méthylformam1de   (DMF), à température ambinate (20-25 C) et sous 
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 agitation. Après avoir lavä la raine avec du DMF (LU fois, 1 minute A chaque fois), on incorporo le premier radical d'acide aminé (AlB) par rgaction dlestgrifieation, sur Is groupe dlaccrochage r6versible, avec l'anhydride aymnStrique de AJa dont le groupe amino a etc protes avec 1e groupe proteCteur fluof6aylin6thyJ. oxycafbonyle (Fmoc). 



   On ajouta dane l'ordre indiqué 2,17 g (1,8 mmole) de (Fmoc-Ala)2O, 0,200 ml (1, 8 mmole) de N-méthylmorpholine (NMM), et   0, 022   g (0,18 mmole) de 4-diméthylaminopyridine (DMAP), et on dissout 
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 le tout dans 16 ml de DMF. On mlntient l.e mFlange reactionneL a la   temperaturc ambiantet   pendant 30 minutes anviron. A la fin de la réaction d'estérification, on lave la résine de façon   repetee   selon le cycle suivant de lavages !
5 lavages avec DMF, de 1 minute chacun
1 lavage avec une solution pipéridine/DMF (20/80, v/v), pendant 
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 3 minutes ; 1 lavaga avec une solution piperidiue/SMF (20/80, v/v), pendant 7 minutes ;. 



   10 lavagee avec DMF, de 1 minute chacun;
5   lavages   avec DMF, de   1   minute chacun. 



   Ensuite, on incorpore tous les autres acides aminés, un par un, selon la séquence souhaits, par rcaction d'acylation entre le 
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 radical d'ac'ide atuiüc, dont le groupe carboxy est activ et le groupe C. amino eat protEg par Fmoc, et Ja chatne du polypeptide an croissance. 

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  On offectue la reaction d'acylation a temperature ambiante pendant 50 minute ?, en utiliaant lea anhydrides syrnetriquea des acides amines A1a, Val, Asp et Pro, protégées par Fmoc (1, 6 mmole d'anhydride synetrique dans 16 m1 da DMF) et l'ester pentafluora phenyJique de Fmon-Aan (1, 8 mmole de Fmoc-Asn-O-PFP dans 16 ml de DMF), 011 presence de 0,244 g (1. 8 mmole) d I-hydroxybenzotriazole (HOBT). 



  On prspara lea anhydrides symdtriques des acides aminés prot & gäa, immediatement avant la rSction d'acylation, e < i faiaant rssagir 3, 6 mmoles d'acide amine protgg par Ftnoc avec 0, 371 g (1, 8 taiiiole) de dicyclohoxylcarbodiitnide (DCI), dans 20 nul de CH 2cl2t ä tampärature ambiante, pendant 10 minutes. A la tin de la reaction, on aepara par fUtration la dicyclohexyluree fonassc, on evapore le solvant et on rcupäre J.'anhydrida symsstrique ainsi obtenue. 



  Pour ehaque rEaction d'ac. y1. atlon, on versifie l'achevement de la formation de Ja liaison amide au moyen du test a la ninhydrine (E. Kaiaor et a].., Ana].. Biochssm., !. 9ÖU j4, 595), et au moyen du test a]'aclde trinitrobBnzanesulfotliqtie (W. S. Hancock et al., Anal. 



  Biochem., 1976 11, 261). 



  Ces teats donnent dea reau catis negatifs au bout de 30 minutes de reaction. 



  A la fin de J'assemblage de la aequence souhaitee, on effectue une analyse des acidea anülaSs du produit peptide-rée1ne, at on obtient les rsultats suivants (les valeurs theoriquee sont donages entre parenthases) : 
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<tb> 
<tb> Asx <SEP> Pro <SEP> Ala <SEP> Val <SEP> Nie
<tb> 18,64(19) <SEP> 9,75(9) <SEP> 7,00(7) <SEP> 3,12(3) <SEP> 1,28
<tb> 
 
 EMI11.3 
 Par Aox, on daigne soit Asn, aoit Asp.. 



  On sépare etianite le polypeptide alnat aynthecias d'avec la réa1na, par rdacticii avec 50 ml. d'U118 solution acide trifluoroactique/eau (90/10, v/v), ä une temparature de 20''C pendant 3 heure. La résine est ensuite ö6paree du m5 ! ange reactionnel par filtration eous vide, puie alle ent lavge troin fois, avee 20 ml d'eau a chaque foie, et finaletnent r6cup6f6e par filtration. Les 

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 filtrats sont réunis et concentrés à siccité par evaporation, puis les résidue sont dissous dans l'eau et la solution est lyophilisés. 



     Grâce     A   l'analyse de la résine résiduelle, on 4 constaté que le 
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 rendement de 18 liberation du polypeptide est 8superieur ä 98%. 



  On purifia le polypeptide ainsi obtenu par chromatographie par filtratton otif gel, our uaa coloane de rsine Sephadex G-25 (85 x 2, 6 cm), . uet ! avee CH3COOH 0, 1 M, ä un debit de 38 ml/h. On recueille lea Fractions correspondant au pie principal at on lea lyophilise. 



   On purifie encore le polypeptide par chromatographie d'échange d'ions, sur une résine Watmann DE-52 (colonne de 25 x   2, 6 cm, lS1. uée   avec une solution de NH4HCO3 on gradiant linéaire 0,1-0,5 M, à un d6bit de 36 ml/h). On recueille les fractions correspondant au pic principal et on lee lyophilise. 
 EMI12.2 
 



  Les resultate de l'analyse d'acides amines du polypeptide purifié Gant lea suivants : 
 EMI12.3 
 
<tb> 
<tb> Asx <SEP> Pro <SEP> Ala <SEP> Val
<tb> 18,66(19) <SEP> 9,48(9) <SEP> 7,00(7) <SEP> 3,02(3)
<tb> 
 
 EMI12.4 
 La rendement chronatographiqu' :' total, base aur lea teneura finales de la résine at Hur le rendement da La libration, est de 59%. Le rendewnt an produit purifié est de 73%.

Claims

REVENDICATIONS 1. Polypeptides A activité immunologique, utiles dans la préparation de vaccins antipaludeens et de trousses de diagnostie. pour la détection d'anticorps antisporozoaires. caractérisés par la formule générale (I) suivante : (Asn-Val-Asp-Pro-Asn-Pro)3-(Asn-Ala-Asn-Pro)n-Asn-Ala dans laquelle : (I) - Asp = acide aspartique - Asn = asparagine - Ala = alanine - Pro = proline - Val = valine et dans laquelle n a une valeur égale ou supérieure à 3.
2. Polypeptides conformes à la revendication 1. caractérisés en ce que i a une valeur comprise entre 3 et 40.
3. Procédé de preparation des polypeptides conformes à l'une des revendications 1 et 2. caractérise en ce qu'il comporte : a) la condensation. du premier acide aminé (Ala), dont le groupe C {-amino est protégé. sur un support solide insoluble, par reaction d'estérification entre le groupe carboxy activé et le groupe d'accrochage sur le support solide ; b) l'elimination du groupe protecteur du groupe α-amino; c) la condensation de l'acide aminé Ala, lié au support solide insoluble, sur le second acide amine Asn, dont le groupe α-amino est protegé, par réaction d'acylation antre le groupe amino déprotége et le groupe carboxy activé du second acide amine ;

d) l'elimination du groupe protecteur du groupe cl-amino du second acide amine ; e) la condensation des acides amines successifs, selon des voies similaires à celles exposées ci-dessus pour les étapes (c) et (d), jusqutä 1'achèvement du polypeptide (I) ; f) la séparation du polypeptide (I) ainsi obtenu d'avec le support solide insoluble, par hydrolyse acide ; <Desc/Clms Page number 14> g) la récupération er la purification du polypeptide (I) par chromatographie.
4. Procédé conforme à la revendication 3, caractarise en ce que EMI14.1 le grou'luorgn-jlle groupe protecteur du groupe in-amino est le groupe fluoränylmethyloxycarbonyle.
5. Procede conforme à la revendication 3, caractérisé en ce que, dans l'étape (a), on effectue la reaction d'esterification dans un solvant organique inerte, en presence de catalyseurs, ä une temperature comprise entre -10 C et 40 C.
6. Procède conforme ä la revendication 5, caractérisé en ce que le solvant organique est le N,N-diméthylformamide.
7. Procédé conforme ä la revendication 5, earacterise en ce que l'on utilise, comme catalyseurs, la N, N-méthylmorpholine et la 4diméthylaminopyridine.
8. Procédé conforme ä la revendication 5, caractérisé en ce que la température est la température ambiante (20-25"C).
9. Procédé conforme à la revendication 3, caractérisé en ce que, dans les étapes (b) er (d), on effectue l'élimination du groupe protégeant lue groupe C (-amino ä l'aide d'un melange pipéridine/N,N- EMI14.2 dimethylformamide (20/80 v/v), ä température ambiante (20-25OC).
10. Procédé conforme 1a revendication 3, caractérisé en ce que, dans les étapes (c) et (e), on effectue la réaction d'acylation dans un solvant organique inerte, en présence de catalyseurs, ä une température comprise entre -10 et 40oC.
11. Procédé conforme ä la revendication 10, caractérisé en ce que le solvant organique est le N, N-dimethylformamide.
12. Procédé conforme à 1a revendication 10, caractérisé en ce que les catalyseurs sont le 1-hydroxybenzotriazole, la 4-diméthylaminopyridine et la N-methylmorpholine.
13. Procédé conforme ä la revendication 10, caractérisé en ce que les températures sont comprises entre 0 et 25 C.
14. Procédé conforme ä la revendication 3, caractérisé en ce que dam. s l'itape (f), on effectue la réaction de liberation ä l'aide d'une solution acide trifluoroacétique/eau (90/10, v/v), ä une température comprise entre 10 et 30 C. <Desc/Clms Page number 15>
15. Procédé conforme b la revendication 3 : caractérisé en ce que dans l'étape (g), on effectue 1a purification par chromatographie sur tamis moléculaire et par chromatographie d'échange d'ions.
16. Utilisation des polypeptides conformes à l'une quelconque des revendications 1 et 2 ou préparés selon l'une des revendications 3 à 15 ; pour la préparation de vaccins contre le paludisme.
17. Utilisation des polypeptides conformes a l'une quelconque des revendications 1 et 2 ou préparés selon l'une des revendications 3 a 15, dans des systèmes de détection d'anticorps antisporozoaires dans des échantillons cliniques provenant de personnes atteintes de paludisme.
18. Polypeptides obtenus par le procédé selon l'une des revendications 3 b 15.