BE1001385A3

BE1001385A3 - Composition polypeptidique utile pour la preparation de vaccins anti-malaria et de necessaires diagnostiques pour la detection d'anticorps anti-merozoites.

Info

Publication number: BE1001385A3
Application number: BE8701476A
Authority: BE
Inventors: Fabio Bonelli; Antonello Pessi; Antonio Silvio Verdini
Original assignee: Eniricerche Spa
Priority date: 1986-12-23
Filing date: 1987-12-23
Publication date: 1989-10-17
Also published as: GB2199326A; SE468597B; SE8705073D0; ZA879622B; US5118501A; CA1301065C; GB2199326B; ATA339087A; ES2008794A6; IT1213576B; SE8705073L; IT8622820A0; FR2608925B1; CH672490A5; GB8729976D0; DE3743936A1; NL8703101A; AR240254A1; GR871992B; OA08704A

Abstract

Composition polypeptidique immunologiquement active et constituée par des polypeptides répondant à la formule : H-(Glu-Glu-Asn-Val-Glu-His-Asp-Ala)n-OH dans laquelle : Glu = acide glutamique; Asn = asparagine; Val = valine; His = histidine; Asp = acide aspartique; Ala = alanine; tandis que n a une vleur égale ou supérieure à 2.

Description


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   DESCRIPTION Composition polypeptidique utile pour la préparation de vaccins anti-malaria et de   necessaires   diagnostiques pour la detection   d'anticorps a"ti-mrozotes.   



   La présente invention concerne une composition polypeptidique immunologiquement active et utile pour la préparation de vaccins anti-malaria, ainsi que de systèmes pour la detection d'anticorps anti-mérozoites chez des individus atteints de la malaria. 



   De plus, l'invention concerne une méthode pour la préparation de cette composition. 



   L'agent étiologique de la malaria est un protozoaire appartenant au genre Plasmodium. 



   Parmi les centaines d'espèces de Plasmodium existant dans la nature, quatre seulement sont pathogènes pour l'homme : P. malariae, P. vivax,   P. ovale et   P. falciparum. 



   Ce dernier, en particulier, représente l'agent étiologique de la forme la plus grave de la malaria,   ä   savoir ce que l'on appelle la "malaria tierce maligne". 



   Non obstant l'élaboration d'insecticides et de médicaments tels que la chloroquine, la malaria constitue une des maladies parasitaires les plus sérieuses pour   l'homme.   



   En fait, on estime que cette maladie frappe chaque année un très grand nombre de populations donnant lieu, au cours de la prime enfance, 

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 à un taux de mortalité pouvant être aussi   é1evé   que 50% de cas. 



   De ce qui précède, il s'avere nécessaire d'élaborer un vaccin anti-malaria efficace, c'est- ä-dire un vaccin capable de stimuler la production d'anticorps aptes   ä   attaquer et à neutraliser le parasite et   ä   établir une immunité protectrice permanente. 



   Par suite de la complexité du cycle vital du parasite, cycle au cours duquel bon nombre de modifications interviennent tant dans la morphologie que dans le type des antigènes produits, 
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 il a été difficile, jusqu'à présent, de résoudre le problème que pose la vaccination. 



   En fait, ces parasites se développent selon un cycle à plusieurs étapes, partiellement à l'intérieur de l'hote invertébré (moustique Anophele) et, en partie,   ä   l'intérieur de l'hôte vertébré, exposant ainsi cet hôte   ä   un tres grand nombre de composants antigéniques différents   l'un   de l'autre et spécifiques   ä   l'étape dans laquelle ils interviennent. 



   L'infection provoquée chez l'homme par la malaria commence par la piqûre du moustique Anophele, piqûre qui libère, à l'intérieur de la circulation sanguine, un certain nombre de sporozoltes. 



   Endéans une heure, chaque sporozolte atteint une cellule hépatique où il donne lieu   ä   la formation de 20.000 mérozoïtes ou plus. 



   Ensuite, après avoir quitté les cellules hépatiques, chaque mérozoïte est en mesure d'infecter un érythrocyte dans lequel, moyennant une série de transformations, il subit une multiplication asexuée jusqu'à ce que l'érythrocyte explose et 

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 libère 10 à 20   merozoltes.   



   Un tel cycle de ruptures répétées de l'érythrocyte par les parasites asexués provoque les manifestations cliniques de la malaria. 



   Certains de ces   merozoltes   se différencient en gamétocytes mäles et femelles qui représentent la forme infectieuse du moustique et qui entament le cycle sexuel du parasite. 



   En règle générale, l'élaboration d'un vaccin anti-malaria est basée sur l'identification et la caractérisation des seuls antigènes du parasite, qui stimulent   specifiquement   des réponses immunoprotectrices. 



   Au cours des dernières années, les chercheurs ont concentré leur attention sur   l'identifi-   cation d'antigènes plasmodiques associés aux formes du parasite qui sont exposées au système immunitaire et qui sont présentes   ä   la fois sur la surface du parasite et sur la membrane des érythrocytes infectés. 



   L'élaboration d'un vaccin   anti-érythrocy-   taire asexué capable d'inhiber cette étape du cycle vital du parasite, est   particulierement   intéressante, étant donné qu'elle permet de réduire la morbidité et la mortalité dues ä la malaria. 



   De plus, ce vaccin est utile pour le traitement de personnes hautement exposées au risque de contracter l'infection parasitaire dans des régions endémiques, en ce sens qu'il est capable de provoquer une immunité   ä   un niveau tel que les complications qui accompagnent la malaria, sont empêchées. 



   Des études récentes ont conduit   ä   l'iden-   tification   et à la caractérisation, dans bon nombre d'especes de Plasmodium, d'antigènes virtuellement 

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 protecteurs situés sur la surface de la forme asexuée érythrocytaire du parasite, ainsi que sur la surface des érythrocytes infectes. 



   En particulier, Perkins et al. (J. Exp. 



  Mad. 160,   788-789,     1984)   et Coppel   R. L.   et al. 



  (Nature 310,789-792, 1984) ont identifié et caractérisé un antigène d'érythrocyte de "surface" (RESA) de Plasmodium falciparum, qui est apparemment   libéré par les mérozoltes au cours   de l'Invasion érythrocytaire. 



   Cet antigène, qui a un poids   moleculaire   de 150. 000 daltons, comporte, dans son segment terminal C, une zone présentant des sous-unités répétées formées par 8,4 et 3 amino-acides. 



   Des études effectuées avec des anticorps contre cet antigène ont démontré qu'ils inhibaient in vitro le développement de Plasmodium falciparum. 



   La synthèse d'un peptide constitue de la séquence :
Glu-Glu-Asn-Val-Glu-His-Asp-Ala identique à l'octapeptide appartenant   ä   une sousunité du segment terminal C de RESA, est décrite par Berzins et al. dans Proc. Natl. Acad. Sei. 



    E. U. A.   83,1065-1069, 1986. De plus, ces auteurs mentionnent que, lorsqu'il est conjugue avec une protéine support, ce peptide provoque, chez des animaux d'essai, la formation d'anticorps.   aI1tirepti-   diques capables de réagir avec la protéine complete. 



   En consequence, un tel produit conjugue peut   IHre   considéré comme un bon "candidat" pour l'élaboration d'un vaccin anti-malaria. 



   Toutefois, l'utilisation d'un support macromoléculaire d'un peptide obtenu comme décrit ci-dessus pose des problèmes particuliers pour l'élaboration d'un vaccin devant etre utilisé chez 

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 l'homme. En fait, on sait que des vaccins de synthèse contenant un peptide immunogène lié à un support, peuvent être capables de provoquer l'expansion de lymphocytes   B"a memolre"sans   
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 stimuler des lymphocytes T antipeptidiques. 



  , De ce fait, chez des individus aldultes ayant une immunité acquise vis-à-vis de l'agent pathogène. il en résulte une réponse immunitaire secondaire faible, voire absente. En conséquence, il est necessaire de trouver un peptide immunologiquement actif même en absence d'une conjugaison avec une protéine support. A présent, la Demanderesse a trouvé qu'il était possible d'éviter les   inconvé-   nients de la technique antérieure au moyen d'une composition polypeptidique constituée d'un mélange de polypeptides comportant une séquence répétée d'amino-acides, que l'on peut obtenir sous forme pure moyennant un procédé simple et économiquement favorable. 



   En conséquence, un objet de la présente invention est de fournir une composition polypeptidique utile pour la préparation de vaccins antimalaria et de nécessaires diagnostiques en vue de détecter des anticorps anti-mérozoltes dans des échantillons de sang provenant d'individus atteints de la malaria. 



   L'invention a également pour objet un procédé pour la préparation de cette composition polypeptidique. 



   Un autre objet encore de la présente invention réside également dans l'utilisation de cette composition polypeptidique pour la préparation de vaccins anti-malaria et de nécessaires en vue de détecter des anticoprs anti-mérozoites dans des échantillons de sang provenant d'individus 

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 atteints de la malaria. 



   D'autres objets encore de la présente invention ressortiront clairement de la description 
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 et des exemples ci-après. ¯ 
En particulier, la composition polypeptidque selon la présente invention est constituée de polypeptides pouvant   etre   définis par la formule 
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 generale (I) ci-après : H- (Glii-C, lti-Asn-Val-Glu-His-AsD-Ala)-OH (I) < n dans laquelle :
Glu = acide glutamique ;
Asn = asparagine ;
Val valine ;
His = histidine ;
Asp = acide aspartique ;
Ala = alanine et dans laquelle également n a une valeur égale ou   superieure   ä 2. 



   Selon la présente invention, on peut préparer ce   melange   polypeptidique selon un procédé comprenant : a) la synthèse, en phase solide, d'un octapeptide dont les fonctions carboxyle en chaine latérale   d'Asp   et de Glu sont protégées conformément ä la formule suivante :   H-Glu (Y)-Glu (Y)-Asn-Val-Glu (Y)-His-Asp (Y)-Ala-OH   (II) où Y représente un groupe protecteur labile d'acide ; b) la libération de l'octapeptide (II) de la résine moyennant un traitement avec une solution faiblement acide ; c) la purification de l'octapeptide (II) par chromatographie ;

     d) Ta polycondensation   de l'octapeptide (II) dans un solvant organique inerte en présence d'une base organique et d'un agent de polycondensation, 

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 pour obtenir un mé1ange polypeptidique de formule : H-LGlu(Y)-Glu(Y)-Asn-Val-Glu(Y)-His-Asp(Y)-AlaSn-OH (III) dans laquelle Y représente un groupe protecteur , labile d'acide et n a une valeur égale ou supé- rieure   ä   2   ;   e) l'élimination des groupes protecteurs des fonctions carboxyle en   chalne   latérale du 
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 mélange polypeptidique (III) par clivage acide ; . n41 m"rrz, f) la Separation du melange polypeptidi- que de formule :   H-(Glu-Glu-Asn-Val-Glu-His-Asp-Ala)n-OH (I)   dans laquelle n a une valeur égale ou supérieure   ä   2. 



  ETAPE (a)
Dans l'étape (a) du procédé selon la présente invention, la preparation de l'octapeptide (II) sous forme protégée est effectuée par condensation en phase solide selon des techniques générales connues. 



   En règle   generale,   on effectue le procédé en incorporant, dans un support solide insoluble, les amino-acides judicieusement protégés sur leur   groupe   -amine   et sur leurs fonctions réactives en chaine latérale, et également activés à leur groupe carboxyle terminal, en présence d'agents de condensation choisis parmi ceux connus dans la technique. 



   Les supports solides sont choisis parmi les résines de polyamides et/ou de polystyrene connues de l'homme de métier. 



   Dans la pratique, on utilise une résine de polyamide disponible dans le commerce qui est déjà fonctionnalisés avec la norleucine comme amino-acide Etalon interne, ainsi qu'un élément de soudage labile aux hyper-acides pour la formation 

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 de la liaison peptide-résine. 



   Les groupes protecteurs du groupe    fuzz   amino sont choisis parmi les groupes labiles aux bases,   c'est-à-dire parmi   les groupes qui peuvent être éliminés moyennant une hydrolyse basique. 



   Le groupe   fluorényl-méthoxy-carbonyle     (Fmoc)   est particulièrement préféré. 



   Les groupes protecteurs pour les fonctions réactives pendantes sont choisis parmi ceux qui sont stables dans les conditions dans lesquelles l'octapeptide est   liberté   de la résine. 



   Un   exemple prefer   de tels groupes utiles pour l'application envisagée est le groupe t-butyle. 



   Les amino-acides protégés comme 11 convient, sont incorporés dans la résine après activation préliminaire de leur groupe carboxyle terminal, sous forme d'esters phenyliques ou d'anhydrides symétriques, l'ester   pentafluorophénylique   étant préféré. Dans le cas du radical Asn, l'ester   4-nitrophénylique   est préféré. 



   La température   ä   laquelle la réaction d'estérification est effectuée, peut se situer   généralement entre-TOC-et 40 C, tandis   que les temps correspondants sont ceux requis pour amener la réaction à son terme ou pratiquement à son terme. 



   Entre une réaction de condensation et la réaction suivante de condensation, le groupe protecteur Fmoc est éliminé au moyen d'une solution de pipéridine-diméthylformamide, ainsi que par lavage de la liaison peptide-résine. 



  ETAPE (b)
Dans l'étape (b) de la présente invention, l'octapeptide (II) est éliminé de la résine moyennant un traitement avec une solution faiblement acide. 

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   Dans la pratique, on utilise une solution de   CH2C12 à 1%   dans l'acide trifluoracétique (TFA)   ä   la température ambiante. 



   Ensuite, on sépare   la résine du mélange   réactionnel moyennant une filtration directe dans 
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 le diméthylformamide (DMF) en une concentration molaire calculée de façon ä séquestrer complètement l'acide trifluoracétique (TFA). 



  De prefercnce, par rapport a l'acide trif1uoracétique, on utilise le diméthylformamide en un excès molaire représentant 25 à 30 fois la quantité stoechiométrique. 



   Ensuite, on combine les filtrats, on évapore le solvant jusqu'à siccité et on recueille les résidus avec une solution   d'eau-acétonitrile   (1 : 1, volume/volume), puis on le lyophilise. 



   En travaillant comme décrit ci-dessus, on obtient un rendement de libération égal ou supérieur   ä   95%. 



  ETAPE (c)
Lors de cette étape, on purifie l'octapeptide (II) par chromatographie liquide sous haute pression en utilisant une résine du type à "phases inverses", un mélange de CH3CH/H2O/TFA   (45 : 54, 9 : 0, 1   volume/volume) comme éluant et un débit de 9   ml/minute.   



   Aux analyses par chromatographie liquide sous haute pression, par chromatographie sur couche mince et par le spectre de résonance magnétique nucléaire   H,   on obtient l'octapeptide   ä   1'état pur. 



  ETAPE (d)
Lors de l'étape (d) du procédé de la présente invention, l'octapeptide   (II),   sous forme protégée, est condensé en phase liquide dans un 

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 solvant organique inerte (non réactif) en présence de quantités excédentaires d'une base de nature organique, ainsi que d'un agent de polycondensation. 
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  Parmi les bases organiques appropriées ¯ pour l'application envisagée, il y a les tert.- alkylamines dans lesquelles le groupe alkyle est formé par des atomes de carbone au nombre de 1   à 4.   



   La triéthylamine est particulièrement préférée. 



   Des exemples d'agents de polycondensation appropriés pour l'utilisation envisagée sont choisis parmi le dicyclohexyl-carbodiimide (DCCI), le DCCI + N-hydroxy-benzo-triazole, le carbonyl-diimidazole, ainsi qu'un certain nombre de composés actifs de phosphore tels que, par exemple, l'azide de diphenyl-phosphoryle, le phosphoro-cyano-hydrate de diethyl, le phosphate de   N-succinimido-diphényle,   le phosphate de   norborn-5-ène-2, 3-dicarboxyimido-   diphényle et le phosphate de   diphényl-2-oxO-3-   oxazolinyle. 



   Parmi ces agents, l'azide de diphenylphosphoryle   (DPPA)   est particulièrement approprie. 



   Des solvants organiques inertes sont choisis parmi le sulfoxyde de diméthyle et le   diméthylformamide.   



   La réaction de polycondensation est effectuée en utilisant la concentration maximale possible d'octapeptide (II) dans un solvant organique afin de minimiser la réaction de cyclisation intra-   moleculaire.   



   Les températures auxquelles la réaction de polycondensation est effectuée, peuvent varier dans l'intervalle allant   de -100 à 500C.   



   Dans la pratique, on effectue la réaction 

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 à une température de   400C   pendant environ 2 heures, ainsi qu'à la température ambiante   (20-25 C)   pendant 72 heures et, après la nouvelle addition de   trimethyl-   amine et de DPPA, toujours ä   la temperature   ambiante pendant 72 heures supplémentaires. 



  ETAPE (e)
Au terme de la réaction de polycondensation, lors de l'étape (e) du procédé de la présente 
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 invention, les groupes protecteurs des groupes kl , d5 1- carboxyle pendants sont éliminés de la composition polypeptidique moyennant un traitement avec de l'acide chlorhydrique concentré, puis avec de l'acide trifluoracétique, à la température ambiante. 



  ETAPE (f)
Enfin, lors de l'étape (f) de la présente invention, de la composition polypeptidique obtenue comme décrit ci-dessus et purifiée par chromatographie sur gel, on sépare un mélange de polypeptides répondant   ä   la formule suivante :
H-(Glu-Glu-Asn-Val-Glu-His-Asp-Ala)n-OH (I) dans laquelle n a une valeur égale ou supérieure   ä   2. 



   Ce   mé1ange   peut être utilisé tel quel pour la préparation de vaccins anti-malaria ou dans des nécessaires diagnostiques pour la détermination d'anticorps anti-merozoltes dans des échantillons cliniques prélevés chez des individus atteints de la malaria. 



   En variante, ce mélange peut être fractionné en mélanges ayant une. répartition plus étroite des poids moléculaires. 



   Le fractionnement est effectué par chromatographie sur gel en utilisant une   rés1ne "Sepha-     dex S-25", une température de 20 à 25 C, CH3COOH O, lM comme eluant et un débit de 36 ml/heure.   

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   En travaillant de la sorte, on sépare et on recueille les fractions qui correspondent à un poids   moleculaire   d'environ 4. 800 daltons 
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 avec n = S + l, ainsi que des fractions d'un poids avec n = 5 l, ainsi que des fractions d'un poids moleculaire d'environ 2. 700 daltons, avec n = 3 + l. 



  Un mélange de polypeptides d'un poids   moleculaire   d'environ 4. 800 daltons avec n = 5 + l est particulièrement utile pour les objets de   la präsente invention.   



   Tant le mélange global que les fractions individuelles exercent une activité immunogène chez des animaux d'essai. Les fractions des polypeptides dans lesquelles n = 5      1, sont particulerement actives. 



   En conséquence, tous ces polypeptides peuvent être utilisés pour la préparation de vaccins anti-malaria, ainsi que de nécessaires diagnostiques pour la détermination d'anticorps   anti-merozoltes   dans des échantillons cliniques prélevés chez des personnes atteintes de la malaria. 



   Les exemples expérimentaux ci-après sont donnés   ä   titre d'illustration sans aucunement limiter l'invention. 
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  Exemple 1 A) Synthèse de l'octapeptid protégé : H-Glu (OBut) -Glu (OBut) -Asn-Va1-Glu (OBut) -HiS-   Asp (OBut)-Ala-OH.   



   On effectue la synthèse en utilisant un synthétiseur automatique de Beckman, modèle
990 B, ainsi qu'une résine de polyamide disponible dans le commerce ("CRB Pepsyn   H")   fonctionnalisée avec de la norleucine comme amino-acide étalon interne, ainsi que l'acide   3-méthoxy-4-hydroxyméthy1-     phénoxy-acétique   comme élément de soudage reversible de peptide-résine. 
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 f 

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On laisse gonfler 2 g de cette résine pendant 16 heures dans 64 ml de   N. N-dimethylformamide   (DMF)   ä   la température ambiante (20-25 C), le réacteur étant maintenu sous agitation.

   L'incorporation du premier amino-acide   ä   l'élément de soudage est effectuée moyennant la réaction d'estérification en utilisant l'anhydride symétrique de l'aminoacide Ala protégé sur son groupe   Of-amino   par un groupe protecteur du groupe   finorenyl-méthyl-   oxy-carbonyle   (Fmoc-Ala) 20.   



   On dissout, dans l'ordre,   2, 17   g (3, 6 millimoles) de (Fmoc-Ala)2O, 0.400 ml (3,6 millimoles) de   N-méthylmorpholine   (NMM) et 0, 044 g (0, 36 millimole) de 4-diméthylaminopyridine (DMAP), dans 28 ml de diméthylformamide. 



   On effectue la réaction d'estérification à la température ambiante pendant environ 30 minutes. 



   Au terme de ce temps de reaction, on élimine le groupe protecteur du groupe Fmoc en lavant deux fois la résine avec un mélange de pipéridine/diméthylformamide (20 : 80, volume/volume), c'est-à-dire respectivement une fois pendant 3 minutes et une fois pendant 7 minutes. Ensuite, on ajoute tous les autres amino-acides (un   ä   la fois) selon la séquence désirée moyennant la réaction d'acylation entre le groupe carboxyle active de l'amino-acide protégé et le groupe aminique de la   chaine   peptidique en croissance.

   Entre une réaction d'acylation et la réaction d'acylation suivante, on procède   ä   des lavages intermédiaires et on élimine le groupe Fmoc N-terminal selon le cycle de lavage suivant : 10 lavages   (d'une   minute chacun) avec du dimethylformamide ; 1 lavage avec une solution de piperidine/diméthyl- 

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 formamide   (20 80,   volume/volume) pendant 3 minutes ; 1 lavage avec une solution de   pipéridine/diméthyl-   formamide (20 : 80, volume/volume) pendant 7 minutes ; 10 lavages   (-l-minute   chacun) avec du diméthylformamide. 



   On effectue les réactions d'acylation à la température ambiante pendant 60 minutes. 



   Les radicaux amino-acides Glu, Val, Asp et Ala sont introduits sous forme de leurs anhydrides symétriques préparés immédiatement avant la réaction d'acylation en faisant réagir 7, 2 millimoles du Fmoc-amino-acide avec   3, 6 milli-   moles de dicyclohexyl-carbodiimide (DCI) dans 25 ml de   CH2Cl2   ä la temperature ambiante, pendant 5 minutes. Au terme de la réaction, par filtration, on sépare la dicyclohexyl-urée, on sépare le solvant par Evaporation, on récupère l'anhydride symétrique, on le dissout dans 30 ml de dimethylformamide et on ajoute la solution obtenue à la liaison peptide-résine se trouvant dans le réacteur. 



   Le radical d'amino-acide Asn est introduit sous forme de l'ester   4-nitrophénylique   en presence de 0, 488 g (3, 6 millimoles) de   1-hydroxybenzothiazole   (HOBT). 



   Le radical d'amino-acide His est introduit sous forme du radical   Fmoc-His (Trt) OH (Trt   groupe protecteur du groupe   triphény1méthy1e)   et il est active in situ en le chargeant directement dans le réacteur contenant la liaison peptiderésine,   2, 26   g (3, 6 millimoles) de Fmoc-His (Trt) OH, 0, 741 g (3, 6 millimoles) de DCI et 0, 488 g (3, 6 millimoles) de HOBT, en solution dans 30 ml de   dimethylformamide.   



   On vérifie l'achèvement de la réaction d'acylation moyennant l'essai colorimétrique   ä   

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 la ninhydrine (E. Kaiser et al., Anal.   Biochem,,   34, 595, 1980) ainsi qu'au moyen de l'essai   ä   l'acide   trinitrobenzène-sulfonique (W. S.   Hancock et al., Anal.   Biochem.,   71,   26l,   1976). 



   Au terme de l'assemblage de la séquence, l'analyse de la liaison peptide-résine pour sa teneur en amino-acides révèle les résultats suivants : Asx Glx Ala Val His Nle 
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 1, 76 (2) 3, 10 (3) 1, 00 0, 94 (1) 0, 93 (1) 1, 06 s " 6 x L o , X v v o X , vç v s J7 v i o v, ;tv N vv Les valeurs théoriques sont indiquées entre parenthèses. 



   Dans le tableau ci-dessus : Asx : Asn + Asp ;
Glx : Glu +   Gln.   



    B)   Elimination de l'octapeptide sous forme protégée de la résine. 



   On élimine l'octapeptide (II) de la résine moyennant le traitement avec 250 ml d'une solution de 1% de   CH2C12   dans l'acide trifluoracétique (TFA)   ä   la température ambiante, pendant une heure. 



   Ensuite, on filtre directement le melange réactionnel dans un ballon contenant un exces molaire (25-30 fois la quantité stoechiométrique) de   dimethylformamide   par rapport à TFA. 



   On traite   ä   nouveau la liaison peptiderésine avec 250 ml d'une solution de CH2Cl2 à 1% dans l'acide trifluoracétique (TFA) pendant une heure et on filtre. 



   Du ballon contenant les filtrats combinés, on sépare le solvant par évaporation, on recueille le résidu dans un   melange     d'eaufacétonitrile     (50 : 50,     volume/volume)   et on le lyophilise. 



   En analysant la résine résiduelle, on constate que le pourcentage d'élimination de l'octapeptide est supérieur ä 95%. 

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   A l'analyse par le spectre de résonance magnétique    nuclêaire 1H,   on constate que le peptide récupéré contient, en fait, tous les groupes protecteurs   dugroupe   t-butyle tandis que, ainsi qu'on le désire, le noyau imidazole du radical histidine 
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 est obtenu à l'état libre. 



  C) Purification de l'octapeptide protégé (III)
La purification, jusqu'à homogénéité 
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 du peptide protégé, est effectuée par chromatographie uu (, i-L, L. L L, Kl-u LLJ. liquide sous haute pression dans un chromatographe de preparation"Miniprep"de Jobin-Yvon en utilisant la résine"Lichroprep RP-18" (25-40 pm) ("Merck"), CH3CN/H20/TFA (45 : 54, 9 : 0, 1, volume/volume) comme éluant, et ä un débit de 9 ml/minute. 



   On combine les fractions correspondant au peptide purifié, on les lyophilise et la substance lyophilisée est caractérisée par les analyses de chromatographie liquide sous haute pression, de chromatographie sur couche mince et de résonance   magnetiquenucleaire H.   



   L'analyse du peptide purifie pour les amino-acides donne les résultats suivants : Asx Glx Ala Val His 1, 95 (2) 3, 10 (3) 1 1, 02 (1) 0, 96 (1)
On obtient 540 mg de peptide purifié avec un rendement chromatographique de 32%. 



  D) Polycondensation de l'octapeptide protégé
On dissout   100   mg (0, 086 millimole) de l'octapeptide purifie (II) dans 0, 5 ml de dimethylsulfoxyde. A la solution obtenue maintenue sous agitation et   ä   une température réglée de   40OC,   on ajoute 31 fl (0, 223 millimole) de triethylamine (TEA)   et- 24 fl (0. 112   millimole) d'azide de diphenylphosphoryle   (DPPA).   

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   Tout en agitant, on maintient le mélange ainsi obtenu   ä   une température de   400C   pendant 2 heures, puis à la température ambiante (20-25 C) pendant 72 heures supplémentaires. 



   A ce   melange   réactionnel, on ajoute ensuite la triethylamine et l'azide de diphenylphosphoryle dans les mêmes proportions que celles indiquées ci-dessus et, après 72 heures à la température ambiante, on ajoute 0,5 ml de HCl concentré (32%, environ 12N). 



   On recueille le   mé1ange   réactionnel avec du   HCI   concentré, de l'eau et du dioxanne et on le transfère quantitativement dans un ballon en verre d'une capacité de 100   ml.   



   Par évaporation sous vide, on sépare le solvant du mélange réactionnel, on recueille le résidu avec 25 ml d'une solution de TFA-eau (90 : 10, volume/volume) et on laisse reposer la solution obtenue à la température ambiante pendant 30 minutes. 



   Ensuite, on élimine le solvant du   melange   réactionnel, on recueille le   residu   avec de l'eau, on le filtre, puis on le lyophilise. 



  E) Fractionnement de la composition de poly (GluGlu-Asn-Val-Glu-His-Asp-Ala)
Ensuite, on soumet le produit ainsi obtenu (54, 5 mg)   ä   un fractionnement par filtration sur un gel   de"Sephadex G-50"et, ensuite,   par chromatographie   sur"Sephadex G-25".   



   On utilise une colonne de 85 x 26 cm 
 EMI17.1 
 garnie de resine"Fine Sephadex G-50" ("Pha-rmacia Uppsala"), on 11élue avec du CH3COOIi O, lM à un débit de 35   ml/heure.   



   De la sorte, on obtient trois fractions : la fraction A = 33, 3 mg (35, 4 millimoles) ; la 

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 fraction B = 9, 8 mg   (10, 4   millimoles) ; et la fraction C = 0, 5 mg (0, 5 millimole) respectivement, correspondant   ä   un mélange de polypeptides dans lequel   n est egal   ou   superieur     ä   2 ;   ä     l'octapeptide   n'ayant pas réagi et à la matière non peptidique. 



   Le rendement chromatographique est de 80%. 



   On soumet encore la fraction A   ä   un 
 EMI18.1 
 fractionnement en utilisant une colonne de S5 x 2, 5 cm garnie de résine "Fine Sephadex Caque l'on élue avec du CH3COOH 0, 1M et ä un débit de 36 ml/heure. En travaillant de la sorte, on obtient trois fractions : la fraction A'= 2, 6 mg (2,8 moles); la fraction A"= 9, 4 mg (10, 0 roules) ; et la fraction A"'= 15, 0 mg (16,0 moles) correspondant respectivement au polymère d'un poids moleculaire moyen d'environ 4. 800, soit n = 5 + 1 ; ä un polymère d'un poids moléculaire moyen d'environ 2. 700, soit n = 3 1 et, enfin, au monomère d'un poids moléculaire de 941. 



   Le rendement chromatographique est de 81%. Le poids moléculaire des fractions individuelles est déterminé par chromatographie dans une colonne d'agarose dans un milieu ayant des propriétés de désagrégation et de dénaturation en raison de la présence du chlorure de guanidine 6M. 



   On utilise une colonne de 86 x 1, 5 cm garnie d'une résine "Biogel A5M" (100-200 mailles), équilibrée avec du chlorure de guanidinium 6M 
 EMI18.2 
 1 et éluée ä un débit de 2,5mh". La colonne est calibree en utilisant un   mé1ange   de myoglobine (poids moléculaire :   18. 000),   de Trypsine (poids moleculaire :   8. 000)   et de tryptophane (poids   moleculaire   : 200), comme étalon. 



  La chromatographie est effectuée   äla temperatureambiante.

Claims

REVENDICATIONS 1. Composition polypeptidique immunologiquement active utile pour la préparation de vaccins anti-malaria et de nécessaires diagnostiques pour la détermination d'anticorps anti-merozoltes, cette composition étant constituée de polypeptides qui peuvent être définis selon la formule générale suivante : H-(Glu-Glu-Asn-Val-Glu-His-Asp-Ala)n-OH (I) dans laquelle : Glu = acide glutamique ; Asn = asparagine ; Val = valine ; His = histidine ; Asp = acide aspartique ; Ala = alanine et dans laquelle également n a une valeur égale ou supérieure ä 2.
2. Composition polypeptidique selon la revendication 1, dans laquelle n a une valeur comprise dans l'Intervalle se situant entre 2 et 50.
3. Composition polypeptidique selon la revendication 1, dans laquelle au moins 20% en poids des polypeptides ont une valeur n = 5 1.
4. Procédé de préparation de la composition peptidique selon les revendications 1 ä 3, caractérisé en ce que : a) dans la phase solide, on synthétise un octapeptide dont les fonctions carboxyle en chaine latérale d'Asp et de Glu sont protégées, et qui répond ä la formule suivante : H-Glu (Y)-Glu (Y)-Asn-Val-Glu (Y)-His-Asp (Y)-Ala-OH (II) dans laquelle Y représente un groupe protecteur labile aux acides ; <Desc/Clms Page number 20> b) on libère l'octapeptide (II) de la résine moyennant un traitement avec une solution faiblement acide ; c) on purifie l'octapeptide (II) par chromatographie ;

d) on soumet l'octapeptide (II) ä une polycondensation dans un solvant organique inerte en présence d'une base de nature organique et EMI20.1 d'un agcnt de polycondensation et l'on cbtient une composition polypeptidique de formule : H- (Glu (Y)-Glu (Y)-Asn-Val-Glu (Y)-His-Asp (Y)-Ala)-OH (III) dans laquelle n a une valeur egale ou superieure ä 2 ; e) on élimine les groupes protecteurs des fonctions carboxyle en chaine latérale d'Asp et de Glu de la composition polypeptidique (III) par clivage acide ; f) on sépare le melange de polypeptides H-(Glu-Glu-Asn-Val-Glu-His-Asp-Ala)n-OH (I) où n a une valeur égale ou supérieure ä 2.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que lors de l'étape (a), le groupe protecteur labile aux acides est le groupe t-butyle. EMI20.2
6. procédé selon la revendication 4, caracterlse en ce que, lors de l'étape (b), on utilise une solution de 1% de CH2CI2 dans l'acide trifluoracétique et l'on effectue la reaction ä la température ambiante (20-25OC) pendant un laps de temps de 1 ä 2 heures.
7. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que, lors de l'étape (c), on effectue la purification par chromatographie liquide sous haute pression en utilisant une résine EMI20.3 acide, un mélange de CH3CN/H20/TFA comme éluant et 'J c <Desc/Clms Page number 21> une température de 20 ä 25 C.
8. procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que, lors de l'étape (d), la base de nature organique est choisie parmi des alkylamines tertiaires dans lesquelles le groupe alkyle contient 1 à 4 atomes de carbone.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'amine tertiaire est la EMI21.1 triethylamine.
10. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que, lors de l'étape (d), l'agent de polycondensation est choisi parmi des composés réactifs qui sont des dérivés du phosphore.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'agent de polycondensation est l'azide de diphényl-phosphoryle.
12. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que, lors de l'étape (d), la réaction est effectuée ä une température se situant dans l'Intervalle allant de -100 à 500C, tandis que les temps correspondants sont ceux necessaires pour achever ou presque achever la réaction.
13. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que, lors de l'étape (e), les groupes protecteurs sont éliminés par clivage acide avec de l'acide chlorhydrique concentré EMI21.2 et de l'acide trifluoracétique.
14. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que, lors de l'étape (f), la séparation est effectuée par chromatographie sur gel.
15. Utilisation de la composition polypeptidique selon les revendications 1 ä 3 pour la préparation de vaccins anti-malaria. <Desc/Clms Page number 22>
16. Utilisation de la composition polypeptidique selon les revendications 1 à 3, pour la préparation de nécessaires diagnostiques en vuedeladéterminationd'anticorpsanti-mérozoïtes dans des échantillons cliniques prélevés chez des individus atteints de la malaria.