BE1003486A5 - Procede d'obtention de l'inhibiteur de la neuraminidase du virus de la grippe. - Google Patents
Procede d'obtention de l'inhibiteur de la neuraminidase du virus de la grippe. Download PDFInfo
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Abstract
Selon l'invention, on effectue la mise en culture du producteur du genre Staphylococcus aureus dans un milieu nutritif contenant des sources de carbone, d'azote, des sels minéraux, des stimulants de la croissance, avec ensuite séparation du liquide de culture, extraction et purification du produit final.
Description
"Procédé d'obtention de l'inhibiteur de la neuraminidase du virus de la grippe". La présente invention a trait à la médecine et plus précisément à un procédé d'obtention de l'inhibiteur de la neuraminidase du virus de la grippe, que l'on peut utiliser pour le diagnostic de la grippe, l'étude de la structure antigénique des virus et l'obtention de vaccins. On connaît un procédé d'obtention de l'inhibiteur de la neuraminidase du virus de la grippe (W.Lin, K.Oishi a Ko Aida "Agricultural and biological chemistry", 1975, 39, n[deg.]3, pages 759-765). Ce procédé consiste à mettre le producteur de l'inhibiteur de la neuraminidase en culture en milieu nutritif contenant des sources de carbone et d'azote, des sels minéraux, des stimulants de la croissance. Comme producteurs, on utilise des actinomycètes. Après la culture du producteur, on sépare le liquide de culture et on le traite par l'éthanol à plusieurs reprises. Le précipité obtenu est solubilisé dans un tampon phosphaté et dialysé dans un tampon phosphaté. La durée du procédé d'extraction et de purification de la substance est de 12 heures sans compter le temps nécessaire à l'obtention et à. l'identification de l'inhibiteur actif de la neuraminidase. Le rendement en produit final est de 33 mg par litre de liquide de culture. Le produit final obtenu assure l'inhibition de 80 % de la neuraminidase du virus de la grippe du type A2. Le procédé mentionné est caractérisé par une longue durée du processus, une activité insuffisante et un rendement médiocre en inhibiteur de la neuraminidase. Le problème posé dans la présente invention est celui de l'augmentation du rendement et de l'activité de l'inhibiteur de la neuraminidase obtenu ainsi que la diminution de la durée du procédé grâce à une modification du producteur et de la technologie de purification de la culture recherchée. Ce problème se voit résolu par le fait que, dans un procédé d'obtention de l'inhibiteur de la neuraminidase du virus de la grippe par la mise en culture du producteur de l'inhibiteur de la neuraminidase en milieu nutritif contenant des sources de carbone, d'azote, des sels minéraux et des stimulants de la croissance, la séparation du liquide de culture, son traitement par l'alcool éthylique avec extraction subséquente et purification du produit final, selon l'invention on utilise, comme producteur de l'inhibiteur de la neuraminidase, un microorganisme du genre Staphylococcus aureus. Le nouveau producteur du genre Staphylococcus utilisé dans le procédé selon l'invention possède une haute activité antineuraminidase. Le procédé selon l'invention est simple, caractérisé par un bon rendement et une haute activité du produit final. L'inhibiteur de la neuraminidase des virus de la grippe obtenu assure à 100% l'inhibition de cette enzyme et est 10 fois plus actif que l'inhibiteur obtenu par le procédé connu. L'inhibiteur obtenu selon l'invention est résistant à la chaleur et ne subit aucun changement d'activité sous l'action des acides ou des bases. L'inhibiteur obtenu selon l'invention augmente la reproduction des virus de la grippe, ce qui peut être utilisé pour l'accélération et l'augmentation de la précision du diagnostic, pour l'obtention rapide de vaccins contre les souches circulantes des virus de la grippe et d'un monovaccin destiné à la prévention de la grippe. Dans le but de simplifier la technologie, il est avantageux d'effectuer la purification par la méthode de filtration sur gel. Le prccédé selon l'invention permet de diminuer la durée du processus d'obtention de l'inhibiteur de la neuraminidase. Le procédé s'effectue de la façon suivante. Comme producteur de l'inhibiteur de la neuraminidase du virus de la grippe, on utilise n'importe quelle souche de Staphylococcus aureus. Le producteur est mis en culture en milieu nutritif contenant des sources de carbone, d'azote, des sels minéraux et des stimulants de la croissance. La souche d'origine de Staphylococcus aureus est mise en culture dans 5 ml de milieu nutritif pendant 24 heures pour l'accumulation de la culture d'ensemencement, puis dans 100 ml de milieu nutritif pendant 24 heures supplémentaires. La culture d'ensemencement obtenue est introduite dans le milieu nutritif de fermentation et mise en culture pendant 24 heures en mélangeant continuellement. Ensuite, on sépare le liquide de culture et on le soumet à l'action de l'alcool éthylique. On sépare le précipité obtenu et on enlève le liquide surnageant. Le précipité est lavé à l'alcool éthylique, ensuite solubilisé dans un tampon phosphaté et de nouveau précipité par l'alcool éthylique. Le précipité obtenu est solubilisé, la solution réchauffée et le précipité obtenu enlevé. Le produit final est obtenu à partir du liquide surnageant purifié par filtration sur gel au moyen de Séphadex et séchage subséquent par lyophilisation. La durée de la séparation du produit final selon l'invention est de 5 jours. Le rendement en produit final est de 67 à 70 mg par litre de milieu de culture. La substance obtenue est caractérisée par une haute activité inhibitrice, puisqu'une solution à 1% de cette substance assure l'inhibition de 90 à 100% de la neuraminidase des virus de la grippe de type A. La haute activité de la substance ne diminue pas après une ébullition prolongée de 10 à 60 minutes et une incubation de 24 heures en milieu à un pH variant de 1,0 à 10,0. Pour une meilleure compréhension de la présente invention, les exemples suivants non limitatifs illustrent la rélisation du procédé d'obtention de l'inhibiteur de la neuraminidase. Exemple 1 La souche Staphylococcus aureus n[deg.] 392 du groupe phage IIIn de sérotype 18 selon Pillet est mise en culture sur un milieu neutritif de la composition suivante, en % en poids : <EMI ID=1.1> <EMI ID=2.1> tampon phosphaté le complément à 100 pH du milieu : 7,2 Pour l'accumulation de la culture d'ensemencement, on met la souche d'origine en culture dans 5 ml du milieu nutritif de la composition sus-mentionnée pendant 1 jour, puis dans 100 ml pendant un jour supplémentaire. La culture s'effectue à une température de 37[deg.]C. La culture d'ensemencement obtenue est introduite dans 3 litres de milieu nutritif et est cultivée pendant 1 jour en mélangeant continuellement. Ensuite, on sépare le liquide de culture par centrifugation à 8000 tours à la minute pendant 15 minutes. Le liquide surnageant obtenu est précipité à l'aide d'alcool éthylique à la proportion de 1: 1,5, est maintenu à +4[deg.]C pendant 12 heures et est centrifugé pendant 15 minutes entre 6 et 8000 t/mn. On enlève le liquide surnageant. Le précipité est lavé à l'aide d'alcool éthylique à 60 % et solubilisé au moyen d'un tampon phosphaté de pH 7,2. Ensuite on effectue de nouveau la précipitation à l'alcool éthylique à 60% à une proportion de 1:1,5 et on <EMI ID=3.1> Le précipité obtenu est de nouveau solubilisé dans un tampon phosphaté de pH 7,2, la solution est portée à 100[deg.]C pendant 10 minutes, centrifugée 15 minutes entre 6 et 8000 t/min, le précipité est enlevé. Le liquide surnageant est filtré sur gel dans une cclonne de 2,0 x 30,0 cm de Séphadex G200. La substance éluée est séchée par lyophilisation jusqu'à obtention d'une masse poudreuse homogène sèche. Le rendement en produit final est de 67 mg par litre du volume initial du milieu de culture. Le produit final obtenu a une masse moléculaire de 94000 à 12COOO, contient des protéines et des hydrocarbures en proportion de 1:10 et des acides gras comprenant de 11 à 20 atomes de carbone. La composition des protéines en acides aminés est la suivante : phénylalanine, thyrosine, isoleucine, leucine, méthionine, valine, alanine, glycine, proline, glu.ta.mine, sérine, thréonine, asparagine, histidine, lysine. Les hydrocarbures de l'inhibiteur sont représentés par les monosaccharides mannose et glucose à la proportion de 24:1 et par deux hexosamines, galactosamine et glucosamine, en proportion de 1:3,5. Le pic de densité optique de la substance obtenue se situe dans les longueurs d'onde de 210 nm. Du point de vue composition chimique, la substance obtenue est un complexe gluco-lipoprotéinique analogue à l'inhibiteur de la neuraminidase du virus de la grippe. La substance obtenue possède une activité inhibitrice sur la neuraminidase des virus de la grippe. Des essais en laboratoire de l'activité inhibitrice de la substance obtenue ont été effectués avec la neuraminidase des virus de la <EMI ID=4.1> solution aqueuse à 10% de la substance obtenue. Le mélange est incubé pendant 30 minutes dans un bain d'eau à une température de 37[deg.]C. A une émulsicn analogue de virus de la grippe témoin, on ajoute 0,2 ml de solution saline physiologique. On détermine l'activité de la neuraminidase des virus de la grippe dans tous les échantillons selon la méthode connue. Les essais ont été effectués en comparaison avec l'activité de l'inhibiteur obtenu par le procédé connu. Les résultats de ces essais sont présentés dans le tableau. Exemple 2 Le procédé est conduit de la même manière que dans l'exemple 1. Comme souche productrice, on prend la souche de Staphylococcus aureus n[deg.] 1025. Le rendement en produit final est de 7C,3 mg par litre de milieu de culture. La substance obtenue est identique, par sa composition chimique, à celle décrite dans l'exemple 1. L'essai de l'activité inhibitrice de la substance obtenue sur la neuraminidase des virus de <EMI ID=5.1> que dans l'exemple 1. Les résultats de ces essais sont présentés dans le tableau. Exemple 3 Le procédé est conduit de la même manière que dans l'exemple 1. On utilise la souche <EMI ID=6.1> produit final est de 66,7 mg par litre de milieu de culture. La substance obtenue est identique par sa composition chimique à celle décrite dans l'exemple 1. L'essai de l'activité inhibitrice de la substance obtenue s'effectue de manière analogue à celle de l'exemple 1. Les résultats des essais sont présentés dans le tableau. TABLEAU Activité inhibitrice (en %) de la substance obtenue à partir de différentes souches de Staphylococcus aureus vis à vis de la neuraminidase des virus de la grippe A <EMI ID=7.1>
Claims (2)
1. Procédé d'obtention de l'inhibiteur de la neuraminidase du virus de la grippe à l'aide de la mise en culture du producteur de l'inhibiteur de la neuraminidase dans un milieu nutritif contenant des sources de carbone, d'azote, des sels minéraux et des stimulants de la croissance, de la séparation du liquide de culture de son traitement par l'alcool éthylique avec extraction subséquente du produit final et sa purification et comme producteur de l'inhibiteur de la neuraminidase, un microorganisme du genre Staphylococcus aureus, caractérisé en ce que l'inhibiteur de la neuraminidase du virus de la grippe obtenu, possède une masse moléculaire de 94 000 à
120 000, et assure à 100% l'inhibition de cet enzyme.
2. Vaccin contre des souches circulantes des virus de la grippe, caractérisé en ce qu'il comprend l'inhibiteur de la neuraminidase obtenu selon le procédé de la revendication 1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BE8901248A BE1003486A5 (fr) | 1989-11-22 | 1989-11-22 | Procede d'obtention de l'inhibiteur de la neuraminidase du virus de la grippe. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BE8901248A BE1003486A5 (fr) | 1989-11-22 | 1989-11-22 | Procede d'obtention de l'inhibiteur de la neuraminidase du virus de la grippe. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BE1003486A5 true BE1003486A5 (fr) | 1992-04-07 |
Family
ID=3884400
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BE8901248A BE1003486A5 (fr) | 1989-11-22 | 1989-11-22 | Procede d'obtention de l'inhibiteur de la neuraminidase du virus de la grippe. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| BE (1) | BE1003486A5 (fr) |
-
1989
- 1989-11-22 BE BE8901248A patent/BE1003486A5/fr not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 103, no. 9, 2 septembre 1985, page 296, abrégé no. 67315v, Columbus, Ohio, US; L.D. VARBANETS et al.: "Influenza virus neuraminidase inhibitor isolated from staphylococcus aureus", & MIKROBIOL. ZH. (KIEV) 1985, 47(3), 84-7 * |
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|---|---|---|---|
| RE | Patent lapsed |
Owner name: KIEVSKY NAUCHNO-ISSLEDOVTELSKY INSTITUT EPIDEMIOL Effective date: 19921130 |