BE1003636A4

BE1003636A4 - Peptide-2 d'activation des neutrophiles.

Info

Publication number: BE1003636A4
Application number: BE8901313A
Authority: BE
Original assignee: Sandoz Sa; Kocher Theodor Inst
Priority date: 1988-12-08
Filing date: 1989-12-08
Publication date: 1992-05-12
Also published as: SE9002589D0; AU634508B2; SE9002589L; JP3051160B2; DK188690D0; GR890100810A; CA2004685A1; DK188690A; GR1000455B; IL92557A0; FR2640142B1; FR2640142A1; NL8921262A; GB2231872B; GB9011468D0; CH681625A5; FI903931A7; NZ231652A; US5759533A; WO1990006321A1

Abstract

L'invention décrit un nouveau facteur qui a une activité de stimulation des neutrophiles et est isolé à partir de leucocytes et/ou de plaquettes du sang. Sa structure et sa fonction sont apparentées à celles du facteur d'activation des neutrophiles NAF/NAP-1 est sa structure est aussi apparentée à celle de la beta-thromboglobuline, du PBP et du CTAP-III. La séquence a été déterminée. La masse moléculaire du facteur est d'environ 6500-7700. On en a également découvert 3 variantes. Le facteur peut être préparé à partir de sources naturelles ou par des techniques d'ADN recombinant.

Description

PEPTIDE-2 D'ACTIVATION DES NEUTROPHILES
La présente invention concerne une substance immunomodulatrice.

Elle concerne plus particulièrement un facteur immunostimulantqui active les leucocytes neutrophiles, en particulier les leucocytes neutrophiles humains. On l'appelle donc ici l'activité 1 de stimulation des neutrophiles (NS- 1) ou, ce qui est synonyme, le peptide 2 d'activation des neutrophiles.

Les leucocytes neutrophiles (neutrophiles) sont les leucocytes les plus courants et constituent environ les deux tiers des globules blancs dans le sang humain. Ils ont une fonction principale qui est de protéger l'organisme hôte des infections microbiennes. Les neutrophiles sont mobiles, présentent une réponse aux stimulations chimiotactiques créées lors d'une infection et sont capables de pénétrer dans les tissus infectés pour tuer les microorganismes. Cette destruction dépend de la capacité des neutrophiles à englober les microorganismes et à libérer des radicaux oxygène et des enzymes microbicides. La libération de ces produits dépend de l'activation des neutrophiles.

On connaît quelques protéines ayant une telle activité, comme le facteur d'activation des neutrophiles (NAF) (P. Peveri et coll., J. Exp. Med. 167 (1988) 1547), appelé aussi peptide 1 d'activation des neutrophiles (NAP-1).

On a maintenant découvert qu'une activité de stimulation des neutrophiles est produite en culture par des leucocytes stimulés et peut être obtenue à partir du liquide de culture. L'activité de stimulation des neutrophiles est appelée ici NSA-1 ou, ce qui est synonyme, peptide-2 d'activation des neutrophiles (NAP-2).

On a également découvert que le NSA-l/NAP-2 a une
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structure très similaire à celle de la ss-thromboglobuline (P-TG), du peptide III d'activation des tissus conjonctifs (CTAP-III) et de la protéine fondamentale des plaquettes (PBP).

L'invention a pour objet le NSA-l/NAP-2 ou une variante fonctionnelle, un fragment ou un dérivé de celui-ci ayant encore cette activité biologique, par exemple une mutéine, avec un degré de pureté suffisant pour permettre ensuite sa caractérisation et sa préparation, par exemple, par des techniques d'ADN recombinant, et son utilisation pharmaceutique.

L'invention a en outre pour objet un procédé de préparation du NSA-1/NAP-2 à partir, par exemple, de leucocytes et/ou de plaquettes de sang humain.

Elle a en outre pour objet l'utilisation du NSA-l/NAP-2 pour activer les leucocytes neutrophiles et améliorer ainsi la résistance aux infections.

Elle a également pour objet un procédé de préparation du NSA-l/NAP-2 ou d'une variante fonctionnelle, d'un fragment ou d'un dérivé de celui-ci, ou d'un de ses parents structurels biologiquement actifs comme la ss-TG, le CTAP-III ou le PBP par des techniques d'ADN recombinant, qui comprend le clonage d'un gène correspondant, renfermant une séquence leader naturelle, par exemple une séquence leader naturelle endogène des plaquettes humaines, son expression dans un hôte convenable et la récupération appropriée du produit peptidique, le cas échéant, au moyen d'une protéase appropriée.

On utilise les abréviations suivantes : BSA sérumalbumine de bovin ; CTAP-III peptide III d'activation des tissus conjonctifs DDS dodécylsulfate de sodium DTT dithiothréitol
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fMLP N-formyl-L-méthionyl-L-leucyl-L-phénylalanine LPS lipopolysaccharide de E. coli 055 : D5
MEM Milieu essentiel minimal d'Eagle (Seromed GmbH,
Munich, RFA), complété avec 25 ug/ml de néomy- cine, tamponné à pH 7,4 avec 25mM de NaHC03 et 20 mM de HEPES
MEM-PPL contient en plus une solution pasteurisée à 1% de protéine plasmatique (PPL-SRK 5%, Laboratoire de Berne la Croix Rouge Suisse, Berne, Suisse) et 100 UI/ml de pénicilline et de streptomycine (Gibco AG, Bâle, Suisse)
AMo anticorps monoclonaux 1
ARNm ARN messager
NAF facteur d'activation des neutrophiles (= NAP-1)

NAP-1 peptide 1 d'activation des neutrophiles (= NAF)
NAP-2 peptide 2 d'activation des neutrophiles (= NSA-1)
NEM N-éthylmaléimide
NSA-1 activité 1 de stimulation des neutrophiles (= NAP-
2)
PBP Protéine plaquettaire fondamentale
PBS Solution saline tamponnée sans Ca++ et Mg++ ;
PBS-BSA PBS supplémenté avec 0, 9mM de CaCl2, 0,49mM de MgCl2 et 2,5 mg/ml de BSA
PRP Plasma riche en plaquettes
PHA-P phytohémagglutinine (Difco Laboratories, Détroit,
MI, USA)
PMN cellules-neutrophiles polymorphonucléaires PMSF fluorure de phénylméthanesulfonyle
SDS-PAGE électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de so- dium-polyacrylamide

SSPE 180mM de NaCl ; 10mM de NaH2P04 ; 1mM d'EDTA ; pH 7,4 ss-TG ss-thromboglobuline.

Le NSA-l/NAP-2 est caractérisé biologiquement par ses propriétés d'activation des neutrophiles, en particulier pour produire la libération des enzymes de granulation. En termes moléculaires, le NSA-1/NAP-2 est caractérisé par une masse moléculaire d'environ 7500 et un point isoélectrique d'environ 8,7.

Il est produit par exemple à partir de leucocytes et/ou de plaquettes de sang humain par un procédé qui consiste à purifier, dans des liquides de culture, des leucocytes sanguins et/ou des plaquettes sanguines stimulés, par chromatographie sur phosphocellulose et chromatographie à polarité de phases inversée. t On peut produire un NSA-1/NAP-2 d'autres espèces que l'espèce humaine, d'une manière analogue, à partir des leucocytes et/ou des plaquettes du sang correspondants.

On peut effectuer une stimulation avec n'importe quel agent connu comme LPS et PHA-P.

On peut réaliser, par exemple, la chromatographie sur phosphocellulose, sur une colonne de phosphocellulose équilibrée avec un tampon phosphate de potassium/NaCl/EDTA/gly- cérol, au voisinage du pH neutre, par exemple à pH 7,2, en faisant ensuite une élution dans un gradient linéaire de concentration de NaCl, par exemple, dans le même tampon.

Une chromatographie à polarité de phases inversée suit de préférence la chromatographie sur phosphocellulose et est de préférence effectuée d'abord sur une colonne préparative C4 à polarité de phases inversée éluée avec, par exemple, un gradient de 0 à 80% d'acétonitrile dans de l'acide trifluoroacétique à 0,1% ; puis sur une colonne CN-propyle éluée avec, par exemple, un gradient de 0-80% d'acétonitrile dans de l'acide trifluoroacétique à 0,1% ; puis les fractions actives sont renvoyées sur une colonne C4 analytique à polarité de phases inversée, dans des conditions analogues à

celles utilisées pour la chromatographie sur CN-propyle.

On peut suivre le déroulement de la purification sur les figures la, 1b et lc.

On suit le déroulement de la purification par analyse de l'activité de stimulation des neutrophiles, par exemple en termes de capacité à amorcer la libération de l'élastase à partir de neutrophiles humains prétraités avec de la cytochalasine B (B. Devald et M. Baggiolini, Biochem. Pharmacol.

36 (1987) 2505-2510).

On constate que le NSA-1/NAP-2 a une masse moléculaire apparente d'environ 6500 par électrophorèse sur gel de SDSpolyacrylamide à 20% d'urée. Le point isoélectrique apparent est d'environ 8,3.

L'analyse de la séquence en acides aminés (figure 2) montre que les 20 premiers acides aminés N-terminaux correspondent exactement à une partie commune de la séquence de la protéine plaquettaire fondamentale (PBP) et de ses dérivés structuraux CTAP-III (C. W. Castor et coll., PNAS 80 (1983) 765-769) et ss-thromboglobuline (G. S. Berg et coll., Biochemistry 17 (1978) 1739-1744). La terminaison amino de NSA- 1/NAP-2 correspond à l'acide aminé 16 de CTAP-III et à l'acide aminé 12 de la ss-TG. La digestion avec la carboxypeptidase Y montre que les séquences en acides aminés C-termina-
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les sont identiques (-Glu-Ser-Ala-Asp).

Le NSA-1/NAP-2 s'aligne entièrement sur la séquence de la P-TG et est consti- tué par 70 acides aminés ayant une masse moléculaire calculée de 7628 et un point isoélectrique calculé de 8,7. La figure 4 montre la totalité de la séquence des 70 acides aminés. L'homologie globale entre le NSA-1/NAP-2 et le NAF/NAP- 1 est de 46%. La séquence de NSA-1/NAP-2 ne contient pas de sites de N-glycosylation apparents. Il existe un site potentiel de phosphorylation par la protéine kinase C (Thr) en position 39 et un site possible d'amidation (Asp) en position 42.

On peut ainsi considérer que le NSA-1/NAP-2 est un

fragment de la ss-TG.

La séquence du NSA-l/NAP-2 peut s'aligner sur celle du NAF/NAP-1, sur la base des deux premiers résidus cystéine (Cys 5 et Cys 7 pour NSA-l/NAP-2 et Cys 7 et Cys 9 pour NAF/NAP-1). Lorsqu'elles sont alignées de cette manière, environ la moitié des 20 premiers acides aminés du NSA-l/NAP-2 et du NAF/NAP-l sont identiques. Les deux facteurs sont ainsi liés non seulement fonctionnellement, mais aussi, dans une certaine mesure, structurellement.

La disponibilité de la séquence en acides aminés de NSA-1/NAP-2 permet de le préparer par d'autres procédés en plus de l'isolement à partir d'une source naturelle décrite ci-dessus. Ainsi, comme le peptide renferme seulement 70 acides aminés, la synthèse totale est possible d'une manière classique, par exemple au moyen du procédé à l'état solide de Merrifield en tenant compte de la présence de deux liaisons bisulfure. 1
D'autres procédés de production englobent les techniques d'ADN recombinant, par exemple par clonage et expression d'un gène synthétique correspondant, éventuellement après optimisation d'un codon. On a décrit la synthèse chimique et l'expression dans la levure d'un gène codant pour CTAP-III (G. T. Mullenbach et coll., J. Biol. Chem. 261 (1986) 719) et on peut ainsi l'appliquer à la production de peptides apparentés comme le NSA-l/NAP-2.

Cependant, seule une partie du CTAP-III produit a une activité biologique. Il semble probable qu'un mauvais repliement et une formation incorrecte des liaisons bisulfure sont des problèmes majeurs. Aucune séquence d'ADN codant pour une séquence leader n'est incorporée dans le gène synthétique, car on ne connaît pas encore une telle séquence leader pour cette classe de composés.

Un autre procédé de production par des techniques d'ADN recombinant est le clonage et l'expression d'un gène renfermant une séquence leader naturelle, par exemple une séquence

leader naturelle endogène aux plaquettes humaines, par exemple par clonaget expression d'un ADNc choisi dans une bibliothèque d'expression appropriée et codant pour le NSA- 1/NAP-2 ou un peptide plus grand englobant le NSA-l/NAP-2, comme la P-TG, le CTAP-III ou le PBP, et récupération du NSA-1/NAP-2 d'une manière classique à partir du produit de l'expression. Une telle séquence leader est, par exemple, constituée des 34 premiers acides aminés dans la séquence de la figure 5 ou d'un fragment ou dérivé fonctionnel de celleci.

L'exemple 7 décrit le clonage d'un ADNc codant pour le CTAP-III à partir d'une bibliothèque d'expression de ftll dérivée de plaquettes humaines. La récupération du produit peptidique recherché à partir d'une molécule mère peptidique peut se faire, par exemple, en tronquant de façon appropriée le plus gros peptide d'une manière classique avec une protéase comme une protéase sérine.

On peut, par exemple, isoler des protéases appropriées d'une manière classique, à partir de monocytes purifiés. Ils sont hautement sensibles au PMSF, modérément sensibles à la leupeptine et insensibles à l'EDTA.

En variante, la séquence leader peut être fixée directement sur le gène codant pour le peptide recherché.

La préparation par clonage d'un gène renfermant une séquence leader naturelle conduit à des produits peptidiques ayant le bon repliement pour avoir une entière activité biologique, par exemple pour le ciblage vers l'a-granulation, lorsqu'ils sont exprimés dans des cellules de mammifères.

Les fragments fonctionnels ou dérivés, par exemple les mutéines, de NSA-1/NAP-2 peuvent être préparés par des procédés connus dans la technique.

On a également découvert trois variantes de NSA-l/NAP-2 ayant une activité biologique quelque peu réduite, dont la séquence à 70 acides aminés est indiquée sur la figure 4, mais rallongées à l'extrémité N respectivement des 3,4 et 5 acides aminés correspondants de CTAP-III (voir figure 5).

Ils ont ainsi la séquence de la figure 4 précédée, respectivement, de
Asp-Leu-Tyr- Ser-Asp-Leu-Tyr-et
Asp-Ser-Asp-Leu-Tyret ont repectivement une longueur de 73,74 et 75 acides aminés.

On peut les produire comme il est décrit ci-dessus pour la préparation du NAP-2, à partir de leucocytes sanguins et/ou de plaquettes sanguines stimulés : par stimulation avec LPS en présence de surnageant de culture monocytaire, on obtient, en plus de NAP-2, un petit pic intermédiaire contenant les variantes à 73-75 résidus de NAP-2. On complète ce pic supplémentaire à 65,20 et 15% respectivement par les formes à 74, à 75 et à 73 résidus.

Le NSA-l/NAP-2 et ses variantes fonctionnelles, ses fragments et ses dérivés possèdent une activité biologique qui les rend indiqués pour être utilisés comme produits pharmaceutiques.

Par exemple, ils provoquent une infiltration des neutrophiles chez le rat en doses d'environ 1 ug/kg à environ 100 ug/kg de poids corporel de l'animal.

Le NSA-l/NAP-2 et ses variantes fonctionnelles, fragments et dérivés sont ainsi indiqués pour être utilisés dans le traitement d'affections qui s'accompagnent ou qui provoquent, localement ou systémiquement, une modification du nombre ou de l'état d'activation des PMN (cellules-neutrophiles polymorphonucléaires). Ils modifient beaucoup ces paramètres de PMN et sont donc indiqués pour être utilisés dans le traitement des affections dans lesquelles une hausse du nombre ou de la stimulation de l'état d'activation des PMN se traduit par une amélioration clinique, par exemple dans les infections bactériennes, mycoplasmiques, par les levures et les champignons, et dans les infections virales.

En outre, ils sont indiqués pour être utilisés dans les ma-

ladies inflammatoires comme le psoriasis, les affections arthritiques et l'asthme, ou dans les affections où la numération des neutrophiles est anormalement faible et/ou le taux des neutrophiles généralisé est faible, et dans la préparation d'antagonistes, par exemple d'anticorps monoclonaux, utilisables dans ces indications.

Puisqu'on a montré que, comme le NAP-1, ils étaient aussi chimiotactiques pour les lymphocytes T, ils sont également indiqués pour être utilisés dans certains états immunodéficitaires.

Pour ces indications, la posologie appropriée variera, bien entendu, par exemple de l'hôte, du mode d'administration et de la nature et de la gravité de l'affection à traiter. Toutefois, en général, on indique que l'on obtient des résultats satisfaisants par voie systémique avec des posologies quotidiennes d'environ 1 mg/kg à environ 100 mg/kg de poids corporel de l'animal. Pour un plus grand sujet, une posologie quotidienne indiquée est dans l'intervalle d'environ 0, 1 mg à environ 100 mg, de préférence d'environ 0, 1 mg à environ 10 mg, avantageusement administrée, par exemple, en doses divisées (jusqu'à 4 fois par jour).

On peut fabriquer d'une façon classique des compositions pharmaceutiques comprenant le composé en association avec au moins un véhicule ou un diluant pharmaceutiquement acceptable, en le mélangeant avec un véhicule ou un diluant pharmaceutiquement acceptable. Les formes posologiques unitaires contiennent, par exemple, d'environ 0,025 mg à environ 50 mg du composé.

Bien qu'il soit fonctionnellement très similaire au NAP-1, le NSA-1/NAP-2 ne peut sans doute être produit que in vivo lorsque le PBP et/ou le CTAP-III sont libérés des plaquettes, tandis que la production du NAF/NAP-1 par des phagocytes mononucléaires et une grande variété de cellules tissulaires est induite par des cytocines inflammatoires comme le facteur de nécrose tumorale et l'interleukine-1. On

peut donc s'attendre à ce que les deux peptides apparaissent dans des situations physiologiques dissemblables et à différents sites.

Comme il est dérivé des plaquettes, le NAP-2 est produit principalement en intravasculaire, où se produit l'activation et l'agrégation plaquettaires, par exemple dans les thrombus et dans les lésions athérosclérotiques, tandis que le NAF/NAP-l se forme presqu'invariablement dans les tissus.

On ne trouve pas le NSA-1/NAP-2 et ses variantes dans les plaquettes ou dans d'autres constituants des cultures cellulaires mononucléaires, et il semble qu'ils se forment après la libération. Ils présentent les propriétés typiques des agonistes des récepteurs chimiotactiques et provoquent des changements calciques non cytosoliques, une chimiotaxie et une exocytose dans le même intervalle molaire que le NAF/NAP-1, tandis que les PBP, CTAP-II et PF-4 ont peu, voire pas, d'activité en concentrations 100 à'10000 fois plus fortes. On s'attend à ce qu'ils soient aussi efficaces que le NAF/NAP-l et le C5a dans le recrutement des neutro-
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1 philes et qu'ils aient un rôle dans la thrombose, où ils pourraient attirer les neutrophiles impliqués dans la recanalisation des vaisseaux obstrués.

EXPLICATION DES FIGURES Figure la : Chromatographie liquide haute pression préparative à polarité de phases inversée de NSA-l sur une colonne C4. Graphe du haut : distribution des protéines, densité optique à 226 nm ; graphe du bas : activité de NSA-l, libération relative de l'élastase à partir des neutrophiles humains.

Deux pics sont en évidence : un petit correspondant au NSA-l/NAP-2 et un plus grand correspondant au NAF/NAP-1.

Figure lb : Chromatographie liquide haute pression à polarité de phases inversée de NSA-1/NAP-2 sur une colonne CNpropyle. Les détails sont les mêmes que pour la figure la.

Figure lc : Chromatographie liquide haute pression à pola-

rité de phases inversée de NSA-1/NAP-2 sur une colonne C4.

Les détails sont les mêmes que pour la figure la.

Figure 2 : Séquence amino-terminale de NSA-1/NAP-2. Les 20 premiers résidus sont représentés. Ils correspondent à une partie de la séquence de la ss-thromboglobuline.

Figure 3 : exocytose provoquée par le NSA-1/NAP-2 dans les : neutrophiles humains traités à la cytochalasine B. Influence de la concentration.

Figure 4 : Séquence en acides aminés de NSA-1/NAP-2.

Figure 5 : Séquence d'ADNc et séquence en acides aminés déduite du précurseur de PBP (commence par le nucléotide 103), CTAP-III (commence par le nucléotide 130), p-TG (commence par le nucléotide 142) et NSA-1/NAP-2 (commence par le nucléotide 175). Les deux liaisons disulfure internes sont marquées respectivement par des astérisques et par des carrés. Le signal de polyadénylation putatif est souligné (nucléotides 581-586). On a tiré un trait au-dessus du site de reconnaissance par EcoRI.

EXEMPLES
Les exemples suivants illustrent l'invention.

1ERE PARTIE : PRODUCTION DE NSA-1/NAP-2 A PARTIR DE SANG HUMAIN, PURIFICATION ET CARACTERISATION Exemple 1 : Production de NSA-1/NAP-2 par des leucocytes et/ou des plaquettes de sang humain stimulés au LPS
On utilise du sang d'un donneur anticoagulé obtenu auprès du Laboratoire de la Croix Rouge Suisse et stocké pendant des durées jusqu'à 20 heures à 4-100C. On isole des cellules mononucléaires (constituées de monocytes et de lymphocytes dans un rapport d'environ 1 : 5) à partir de couches leucocytaires uniques sur des gradients de Ficoll-Hypaque (A. Boyum, Scand. J. Immunol. 5 (1976) 9-15) et on les lave dans le MEM.

On remet en suspension les cellules lavées provenant de 6 couches leucocytaires dans le MEM-PPL (5x106 cellules/ml) et on les cultive pendant 20 heures en présence de 1 ug/ml de LPS dans des bouteilles en verre équipées d'un dispositif

d'agitation. A différents instants, on prélève des échantillons des milieux de culture et on détermine l'activité de stimulation des neutrophiles comme étant la capacité à provoquer la libération de l'élastase à partir de neutrophiles humains prétraités avec de la cytochalasine B (B. Dewald et M. Baggiolini, Biochem. Pharm. 36 (1987) 2505-2510). Cet essai détecte le NSA-1 ainsi que le NAF, qui est un facteur d'activation des neutrophiles décrit antérieuremment (P. Peveri et coll., J. Exp. Med. 167 (1988) 1547-1559).

L'activité de stimulation des neutrophiles augmente avec le temps et se nivelle au bout de 24 à 48 heures.

Exemple 2 : Production de NSA-1/NAP-2 par des leucocytes et/ou des plaquettes de sang humain stimulés au PHA-P
On utilise du sang d'un donneur anticoagulé obtenu auprès du Laboratoire de la Croix Rouge Suisse et stocké pendant jusqu'à 20 heures à 4-100C. On isole des cellules mononucléaires (constituées de monocytes et de lymphocytes dans un rapport d'environ 1 : 5) à partir de couches leucocytaires uniques sur des gradients de Ficoll-Hypaque (Boyum, 1976) et on les lave dans le MEM. On remet en suspension les cellules lavées provenant de 6 couches leucocytaires dans le MEM-PPL
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(5x106 cellules/ml) et on les cultive pendant 20 heures en présence de 5 ug/ml de PHA-P dans des bouteilles en verre équipées d'un dispositif d'agitation.

A différents instants, on prélève des échantillons des milieux de culture et on détermine l'activité de stimulation des neutrophiles comme étant la capacité à provoquer la libération de l'élastase à partir de neutrophiles humains prétraités avec de la cytochalasine B. L'activité de stimulation des neutrophiles augmente avec le temps et se nivelle au bout de 24 à 48 heures.

Exemple 3 : Purification de NSA-1/NAP-2 à partir de liquides de culture de leucocytes et/ou de plaquettes de sang humain stimulés au LPS a) Chromatographie sur phosphocellulose
On charge directement des portions de 700 ml de li-

quides de cultures acellulaires de leucocytes humains stimulés comme le décrit l'exemple 1 sur une colonne de 15 ml de phosphocellulose (Whatman Pll) équilibrée avec du tampon A (20mM de tampon phosphate de potassium, pH 7,2, contenant 20mM de NaCl, 1mM d'EDTA et 5% de glycérol). La colonne est lavée avec le même tampon, puis éluée (24 ml/heure) avec 120 ml d'un gradient linéaire de concentration de NaCl (0,02 à 1, 5M) dans le tampon A.

On analyse les fractions pour déterminer leur activité de stimulation des neutrophiles. b) Chromatographie à polarité de phases inversée
On réunit les fractions actives obtenues dans la séparation chromatographique sur phosphocellulose et on leur fait subir une purification supplémentaire par 4 passages répétés sur une colonne préparative C4 à polarité de phases inversée à gros pores (10 x 250 mm, 7 um, Macherey-Nagel, Dueren, RFA). La colonne est éluée à 2 ml/min avec un gradient de 0 à 80% d'acétonitrile dans de l'acide trifluoroacétique à 0,1%, avec un accroissement de 0,66% par minute.

On réunit les fractions actives ayant un temps de rétention de 20-26 minutes, on les concentre sur une centrifugeuse Speed Vac et on les charge sur une colonne analytique CN-propyle à polarité de phases inversée (4,6 x 250 mm, 5 um, gros pores, Baker Research Products, Phillipsburg, N. J., USA). La colonne est éluée à 0,5 ml/min avec un gradient de 0 à 80% d'acétonitrile dans de l'acide trifluoroacétique à 0,1%, avec un accroissement de 0,66% par minute. On réunit les fractions actives ayant un temps de rétention de 20-25 minutes, on les concentre et on les repasse sur une colonne analytique C4 à polarité de phases inversée (4,6 x 250 mm, 5 um, gros pores, Baker Research Products), dans les conditions décrites pour la colonne CN-propyle.

Les fractions actives ayant un temps de rétention de 42,5 minutes sont séchées dans une centrifugeuse Speed Vac, remises en suspension dans de l'eau stérile et ensuite utilisées pour l'analyse séquentielle en phase gazeuse et pour les dosages bio-

logiques. La figure 1 représente la séparation du NSA-1/NAP- 2 d'avec le NAF/NAP-1 et les fractions utilisées pour l'analyse de la séquence en acides aminés.

Exemple 4 : Electrophbrèse sur gel du NSA-1/NAP-2 purifié
On analyse le NSA-l/NAP-2 purifié sur un gel de SDS-polyacrylamide à 20% d'urée selon B. Kadenbach et coll., Analyt. Biochem. 129 (1983) 517-521). On obtient une seule bande, de masse moléculaire apparente 6500, par visualisation au moyen d'une coloration à l'argent. Le NAP-2 migre légèrement plus vite que le NAF/NAP-1.

Exemple 5 : Analyse de la séquence en acides aminés du NSA- 1/NAP-2
On effectue l'analyse de la séquence en acides aminés par décomposition automatisée à l'isothiocyanate de phényle en utilisant un séquenceur en phase gazeuse modèle 477A de Applied Biosystems. On applique les échantillons de NSA- 1/NAP-2 (500 pmoles) directement ou après modification chimique. On effectue la réduction et l'alkylation de la manière suivante : on dilue 1 nmole de NSA-1/NAP-2 dans 150 u. l de 6M de chlorhydrate de guanidinium, 2mM d'EDTA, 0,2M de Tris-HCl, pH 8,3, puis on ajoute 225 nl de tributylphosphine dans 15 u. l d'acétonitrile et on incube la solution à la température ambiante. Au bout de 60 minutes, on ajoute 160 nl
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de 4-vinylpyridine dans 10 ul d'acétonitrile.

Au bout de 30 minutes, on ajoute une quantité égale de tributylphosphine et de vinylpyridin et on poursuit la réaction pendant 40 minutes supplémentaires, sous azote. On acidifie la solution avec de l'acide trifluoroacétique jusqu'à pH 2,0 et on la dessale par CLHP à polarité de phases inversée dans de l'acide trifluoroacétique à 0,1% avec un gradient d'acétonitrile.

On détermine la terminaison carboxy avec 0,5 nmole de NAP-2 et 0,4 Ag de carboxypeptidase P ou de carboxypeptidase Y (pour séquençage, Boehringer).

La figure 2 illustre l'analyse des 20 premiers acides

aminés amino-terminaux.

Exemple 6 : Effet d'activation des neutrophiles de NSA- 1/NAP-2
Des neutrophiles sont isolés du sang humain, mis en suspension dans PBC/BSA, puis utilisés pour évaluer la capacité du NSA-1jNAP-2 à provoquer la libération d'élastase au moyen d'une méthode de dosage sur plaque de microtitrage de Dewald et Baggiolini (1987). Le NSA-1/NAP-2 amorce la libération sélective de l'élastase d'une manière dépendant de la concentration. L'influence de la concentration est analogue à celle que l'on observe avec le NAF/NAP-1 et l'activité est environ la moitié de cette du NAF et environ le tiers de celle du fMLP.

La figure 3 représente l'activité du NSA-1/NAP-2 en fonction de la concentration.

IIEME PARTIE : CLONAGE D'ADNc CODANT POUR LE CTAP-III PROVENANT D'UNE BIBLIOTHEQUE D'EXPRESSION DE gt11'DERIVEE DE PLAQUETTES HUMAINES Exemple 7 : a) Isolement et lavage des plaquettes
On isole des plaquettes à partir de sang traité au citrate, par centrifugation à 160 x g pendant 10 minutes, pour obtenir un plasma riche en plaquettes (PRP), et par une étape de centrifugation supplémentaire à 1100 x g pendant 10 minutes, pour obtenir un culot plaquettaire.

Les plaquettes
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sont ensuite lavées deux fois avec 30 moles/1 de glucose, 120 moles/1 de NaCl, 129 moles/1 de citrate de sodium, 10 moles/1 d'EDTA, pH 6, 5, et une fois avec 10 moles/1 de Tris-HCl, 154 moles/1 de NaCl, 10 moles/1 d'EDTA, pH 7, 4. b) Mégacaryocytes'humains
On les isole à partir du sang périphérique d'un patient atteint de leucémie mégacaryoblastique par centrifugation par densité de gradient de Ficoll-métrizoate. Le phénotype mégacaryoblastique de ces cellules leucémiques est basé sur leur réactivité avec des anticorps monoclonaux (AMo) sur le

GPIIb plaquettaire, le complexe GPIIb/GPIIIa et le facteur de Willebrand (vWF).

Une sonde d'ADNc pour GPIb plaquettaire donne aussi un signal positif avec un ARN messager (ARNm) de 2,4 kb (même taille que dans les plaquettes) dans une analyse par Northern blot avec un ARNm provenant de ces cellules. c) Préparation des anticorps
On solubilise des plaquettes lavées dans du Triton X- 114 à 1% en présence de N-éthylmaléimide (NEM) et de fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF, dissous dans le méthanol) en une concentration finale de 2 moles/1 pour chaque, et on réalise un partage des phases comme le décrit Biochim.

Biophys. Acta 778 (1984 463. On utilise la phase aqueuse pour la chromatographie d'exclusion sur Ultrogel AcA-34 (LKB) dans du dodécylsulfate de sodium (DDS) à 0,1%, 0, 1 mole/l de NH4HC03, pH 7,4. On utilise pour immuniser des la-
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1 pins une fraction contenant des protéines dans l'intervalle de 8-à 9-Kd que l'on estime par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide (SDS-PAGE). d) Immunoblot
On obtient des produits de dégranulation à partir du surnageant des plaquettes lavées stimulées avec de la thrombine (2 U/4 x 109/ml, 5 minutes, 37 C) et traitées avec 2 moles/1 de PMSF et 2 moles/1 de NEM.

On les solubilise dans 1% de SDS, on les réduit avec du dithiothréitol (DTT) à 0,1% et on les sépare à l'aide de SDS-PAGE à 20%, puis par transfert électrophorétique sur de'a nitrocellulose (BA 85, Schleicher & Shuell, Feldbach, Suisse) avec un papier électroabsorbant semi-sec, sous 150 mA pendant 90 minutes.

Après l'incubation avec un antisérum polyclonal de lapin antiCTAP-III, on utilise un second anticorps de chèvre antianticorps de lapin couplé à la phosphatase alcaline (Bio-Rad Laboratories, Glattbrugg, Suisse) pour colorer avec les substrat au nitrobleu de tétrazolium et au phosphate de 5-*brio- mo-4-chloro-3-indolyle.

e) Construction de la bibliothèque d'expression d'ADNc
On prépare un ARN total de plaquettes à partir de 180 litres de sang, en utilisant le procédé au chlorhydrate de guanidine. On isole un ARNm polyA par chromatographie d'affinité sur oligo (dT) cellulose (Pharmacia, Uppsala, Suède). Le premier brin est synthétisé au moyen d'amorces oligo (dT) (Parmacia P-L Biochemicals) et de transcriptase inverse (Bethesda Research Laboratories, Gibco, Bâle, Suisse).

Le second brin est préparé avec de l'ARNase H (New England Biolabs, Schwalbach bei Frankfort, RFA) et d'ADNpolymérase I de Escherichia coli (Boehringer Mannheim, Rotkreuz, Suisse). Après la production d'extrémités inactivées avec l'ADN T4-polymérase et l'enzyme de Klenow, la méthylation par EcoRI et la ligature aux linkers EcoRI, on prépare l'ADNc résultant dans une préparation d'extrait de gtll (Gigapack Gold, Statagene, San Diego, CA) et on l'amplifie dans E. coli ylO88. 1 f) Criblage de la bibliothèque et caractérisation des clones positifs
On crible la bibliothèque d'expression d'ADNc ^gt11 plaquettaire par la méthode standard avec l'antisérum de lapin polyclonal.

On élimine les anticorps spécifiques à E. coli BNN97 par immunoadsorption sur lysat lié à la nitrocellulose. Les phages recombinants positifs sont détectés par le même second anticorps et les mêmes substrats chromogènes que pour l'immunoblot. Après purification, l'ADN- est digéré avec EcoRI (Boehringer Mannheim) et les inserts sont isolés par électrophorèse sur gel d'agarose à 0,8% et électroélution dans un Bio-Trap (Schleicher & Schuell). L'ADN est précipité avec de l'éthanol et ligaturé à 5 ng de Bluescript M13 linéarisé par EcoRI (Sratagène) au moyen de T4 ligase (Bio-Lab) et transfecté dans E. coli JM 101.

Les colonies blanches sont soumises à un essai de plasmides recombinants positifs par le procédé d'extraction alcaline et on prépare des matrices d'ADNc monocaténaires par infection

avec un phage assitant M13K07. On détermine la séquence d'ADN des deux brins par la méthode de terminaison de la chaîne didésoxy en utilisant un kit de Séquénase (United States Biochemical Corporation) et un ATPd marqué au 53S en a (New England Nuclear, DuPont). g) Analyse par Northern Blot
A l'issue d'une électrophorèse dans un gel d'agarose à 1%, on sépare l'ARNm sur un papier Hybond N (Amersham) et on le soumet à une hybridation avec une sonde d'ADNc sulfonylée à 680C pendant 18 heures dans 4 x SSPE, 0,1% Na4P207, 0,2% SDS, 0,5 mg/ml d'héparine contenant 100 ug/ml d'ADN de spermacéti de saumon.

Après avoir lavé deux fois pendant cinq minutes dans 1 x SSPE, 1% SDS, 0,1% Na4P207 à la température ambiante et deux fois pendant 30 minutes dans 0,2 x SSPE, 0,1% SDS, 0,1% Na4P207 à 68 C, on détecte l'ARNm correspondant par immunocoloration avec un anticorps monoclonal de murin (AMo, Sigma, Deisenhofen, RFA) contre un ADN sulfonylé et un second anticorps de chèvre anti-IgG de souris conjugué à de la phosphatase alcaline.

Les substrats sont les mêmes que ci-dessus. h) Résultats
Les anticorps monoclonaux produits par immunisation de lapins avec une fraction de filtration sur gel contenant des protéines hydrosolubles plaquettaires dans l'intervalle de 8 à 9 kd présentent une haute avidité et une haute spécificité sur les immunoblots et sont utilisés pour cribler une bibliothèque d'expression d'ADNc ^gt11 dérivé de plaquettes.

On purifie sur plaques deux clones positifs, provenant des 100 000 phages recombinants initialement criblés, et on soumet les deux fragments internes EcoRI à un sous-clonage dans du M13 Bluescript. Les séquences en nucléotides des deux brins sont déterminées par la méthode de terminaison des chaînes didésoxy. On obtient un clone d'ADNc entier (rtC1) de 690 paires de bases (figure 5) contenant une région 5'non codante de 66 paires de bases, un cadre de lecture ouvert

codant pour une protéine de 128 résidus d'acides aminés (13 894 da) et une région 3'non codante contenant le codon de terminaison (TAA), le signal de polyadénylation putatif et la queue polyA.

Un second clone (C2), qui commence sur la position relative 9, présente une séquence en nucléotides identique.

La séquence consensus servant à amorcer la traduction en ARNm eucaryote (5'CCACCAUGA 3') commence au nucléotide 5.

Une hybridation par Northern Blot d'ARNm provenant d'une lignée cellulaire de leucémie mégacaryocytaire, de mégacaryocytes et de plaquettes, mais pas d'un témoin hépatocyte, donne un signal positif à environ 0,8 kb avec l'ARNm du précurseur CTAP-III, ce qui suggère que l'ADNc correspondant est entier. On n'obtient aucun signal avec l'ARNm de HEL, peut-être du fait de la sensibilité plus faible de la méthode de marquage radioactif pour la sonde d'ADNc et/ou de la faible teneur en ARNm spécifique au CTAP-III de la lignée cellulaire HEL utilisée.

La séquence en acides aminés que l'on déduit (figure 5) est identique à la séquence bien définie pour le CTAP-III plaquettaire humain. L'extrémité amino du CTAP-III est en position d'acide aminé 44 de la séquence traduite, et le début de son produit ss-thromboglobuline, mitogéniquement inactif, de décomposition par la plasmine ou la trypsine se trouve 4 résidus en aval en position 48. On a montré qu'un précurseur de ces protéines, le PBP, partage les dix premiers résidus de CTAP-III, mais que son extrémité amino se trouve neuf résidus en amont en position 35. Tout ce que l'on sait sur la structure de ces protéines est exactement en accord avec la séquence en acides aminés dérivée du clone d'ADNc codant, ce qui est une preuve solide que les trois protéines ont un précurseur unique.

Ainsi, la séquence leader de 34 acides aminés de CTAPIII représentée sur la figure 5 est exceptionnellement

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longue, diffère des peptides signaux classiques et est probablement responsable du ciblage des protéines vers les agranulations des mégacaryocytes en voie de maturation.

Claims

REVENDICATIONS 1. Peptide-2 d'activation des neutrophiles (NAP-2) ou variante fonctionnelle, fragment ou dérivé de celui-ci.
2. Facteur appelé activité 1 de stimulation des neutrophiles, qui active les neutrophiles et est dérivé des leucocytes et/ou des plaquettes du sang.
3. Facteur selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il active les neutrophiles humains pour libérer des enzymes de granulations.
4. Facteur selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il a une masse moléculaire d'environ 6500-7500.
5. Facteur selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il a une masse moléculaire apparente d'environ 6500 par électrophorèse sur gel de SDS polyacrylamide à 20% d'urée et un point isoélectrique apparent d'environ 8,3.
6. Facteur selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il a une masse moléculaire calculée de 7628 et un point isoélectrique calculé de 8,7.
7. Facteur selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte la séquence en acides aminés N-terminale suivante : Ala-Glu-Leu-Arg-Cys-Met-Cys-Ile-Lys-Thr- Thr-Ser-Gly-Ile-His-Pro-Lys-Asn-Ile-Gln-, ou variante fonctionnelle, fragment ou dérivé de celui-ci.
8. Facteur selon la revendication 7, caractérisé en ce que sa séquence en acides aminés N-terminale est suivie de la séquence en acides aminés C-terminale subséquente correspondante de la ss-TG, variante fonctionnelle, fragment ou dérivé de celui-ci.
9. Facteur selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte la séquence de 70 acides aminés suivante EMI21.1 <Desc/Clms Page number 22> EMI22.1 ou variante fonctionnelle, fragment ou dérivé de celui-ci.
10. Variante du facteur selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle comporte la séquence de 70 acides aminés définie dans la revendication 9 précédée de Asp-Leu-Tyr-.
11. Variante du facteur selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle comporte la séquence de 70 acides aminés définie dans la revendication 9 précédée de Ser-Asp-Leu- Tyr-.
12. Variante du facteur selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle comporte la séquence de 70 acides aminés définie dans la revendication 9 précédée de Asp-Ser-Asp-LeuTyr-.
13. Procédé de préparation de NSA-1/NAP-2, caractérisé en ce qu'il comprend la purification à partir de liquides de culture de leucocytes sanguins stimulés, par chromatographie sur phosphocellulose et chromatographie à polarité de phases inversée.
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend a) une chromatographie sur phosphocellulose, b) une chromatographie liquide haute pression à polarité de phases inversée sur une colonne C4, et c) une chromatographie liquide haute pression à polarité de phases inversée sur une colonne CN-propyle.
15. Procédé de préparation de NSA-1/NAP-2 ou d'une variante <Desc/Clms Page number 23> fonctionnelle, d'un fragment ou d'un dérivé de celui-ci, ou d'un parent structurel biologiquement actif de celui-ci comme ss-TG, CTAP-III ou PBP, caractérisé en ce qu'il comprend le clonage d'un gène correspondant renfermant une séquence leader naturelle, l'expression du gène dans un hôte convenable et la récupération appropriée du produit peptidique, éventuellement au moyen d'une protéase appropriée.
16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que la séquence leader code pour : EMI23.1 ou une variante fonctionnelle, un fragment ou un dérivé de celui-ci.
17. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend le facteur selon la revendication 1 ou une variante fonctionnelle, un fragment ou un dérivé de celui-ci, ainsi qu'un véhicule ou un diluant pharmaceutiquement acceptable.
18. Facteur selon la revendication 1 ou variante fonctionnelle, fragment ou dérivé de celui-ci, caractérisé en ce qu'il est utilisable comme spécialité pharmaceutique.
19. Facteur selon la revendication 1 ou variante fonctionnelle, fragment ou dérivé de celui-ci, caractérisé en ce qu'il est utilisable dans le traitement des affections qui sont accompagnées ou causées, localement ou systémiquement, par une modification du nombre ou de l'état d'activation des PMN (cellules-neutrophiles polymorphonucléaires).
20. Facteur selon la revendication 1 ou variante fonctionnelle, fragment ou dérivé de celui-ci, caractérisé en ce <Desc/Clms Page number 24> qu'il est utilisable dans le traitement des infections bactériennes, mycoplasmiques, par levures et champignons, et virales, ou dans le traitement des maladies inflammatoires ou des affections de numération neutrophilique anormalement faible et/ou de taux neutrophilique faible généralisé, et dans la préparation d'antagonistes utilisables dans ces indications.
21. Peptide leader ayant la séquence en acides aminés suivante : EMI24.1 ou variante fonctionnelle, fragment ou dérivé de celui-ci.
22. Procédé de traitement d'une affection selon la revendication 19 ou 20, caractérisé en ce qu'il comprend l'administration d'un facteur selon la revendication 1, ou d'une variante fonctionnelle, d'un fragment ou d'un dérivé de celuici, à un sujet nécessitant un tel traitement.
23. Facteur selon la revendication 1, ou variante fonctionnelle, fragment ou dérivé de celui-ci, caractérisé en ce qu'il est obtenu par un procédé selon la revendication 13 ou 15.
24. Facteur selon la revendication 1 ou variante fonctionnelle, fragment ou dérivé de celui-ci, caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir de ss-TG, de CTAP-III ou de PBP ou à partir d'un gène codant pour la ss-TG, le CTAP-III ou le PBP.