BE1004328A3 - Procede et dispositif de permeabilisation de cellules vivantes. - Google Patents
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Abstract
Procédé et dispositif de perméabilisation de membranes cellulaires par décharge électrique (électroporation) dans lequel on applique une solution contenant des cellules à rendre perméables, ainsi que les molécules destinées à être logées à l'intérieur des cellules, successivement, au moins une décharge électrique de haut voltage et de courte durée et ensuite au moins une décharge électrique de bas voltage et de plus longue durée.
Description
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PROCÉDÉ ET DISPOSITIF DE PERMÉABILISATION DE
CELLULES VIVANTES objet de l'invention
Le transfert de matériel génétique nouveau ainsi que de protéines étrangères ou autres molécules ou macromolécules dans des cellules vivantes a gagné en importance depuis les derniers développements en biochimie et notamment en génétique.
La présente invention est relative à ce domaine et concerne plus particulièrement un procédé de perméabilisation des membranes de cellules vivantes ainsi qu'un dispositif pour la mise en oeuvre de ce procédé.
Etat de la technique
Parmi les différentes méthodes destinées à rendre les membranes cellulaires perméables, de façon à permettre l'introduction de"corps étrangers"on connaît notamment les techniques de perméabilisation par chocs électriques, couramment dénommées"électroporation".
L'article"Enhancer-dependent expression of human immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation"de HUNTINGTON POTTER et al., Proc. Natl.
Acad. Sci-USA, Vol. 81, pages 7161-7165, Novembre 1984, mentionne l'utilisation d'impulsions de relativement faible intensité (de 1, 2 à 4 kV) pour rendre certaines cellules perméables à l'ADN cloné. En fait, une suspension de cellules et de ADN clone est soumise à une décharge électrique.
Par l'article"Electric shock-mediated transfection of cells", Biochem. J. (1988) 251, 427-434, de David J.
Winterbourne et al., il est connu d'appliquer des impulsions
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EMI2.1
t relativement longues à une solution contenant les cellules à percer ainsi que de l'ADN à faire pénétrer dans lesdites cellules.
On y mentionne notamment des impulsions du type rectangulaire créant un champ électrique de l'ordre de 2,5 à 3 kV/cm. Il y a également été découvert une corrélation entre la durée des impulsions (100 s à 500 s) et l'efficacité de l'opération, l'ADN étant ainsi soumis à un mouvement d'électrophorèse.
Toutefois, l'application d'un champ électrique entraîne une dissipation d'énergie importante dans la solution qui a pour résultat une mortalité élevée des cellules.
L'article"High efficiency transformation of E. COLI by high voltage electroporation", Nucleic Acids Research (1988), volume 16, n 13,6127-6144, de William J. Dower et al. mentionne des essais faisant appel à une électroporation à l'aide d'impulsions de forte intensité mais de courte durée.
On y atteint des résultats satisfaisants avec des intensités allant jusqu'à 12,5 kV/cm et 16,7 kV/cm et une corrélation entre l'intensité et la durée des impulsions est également établie.
Bien que l'énergie dissipée dans la solution soit réduite, l'efficacité de l'opération est limitée par une mortalité des cellules dues à l'éclatement suite à des chocs électriques trop importants.
But de l'invention
La présente opération vise à fournir un procédé de perméabilisation des membranes cellulaires qui ne présente pas les inconvénients de l'état de la technique et qui permet d'améliorer le rendement des manipulations en augmentant le taux de cellules percées et/ou la survie des cellules et/ou l'entrée des molécules étrangères dans les cellules.
Un autre but de la présente invention consiste à fournir un dispositif permettant la mise en oeuvre du procédé.
Eléments essentiels de l'invention
Conformément à la présente invention, on applique
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à une solution contenant les cellules à rendre perméables ainsi que les molécules destinées à être logées à l'intérieur des cellules, successivement au moins une décharge électrique de haut voltage et de courte durée et ensuite au moins une décharge électrique de bas voltage et de plus longue durée.
On a constaté que cette façon de procéder permet de réduire le taux de mortalité des cellules tout en augmentant le taux de pénétration de celles-ci.
Il est bien entendu que les deux étapes de l'inven- tion doivent se suivre d'un laps de temps très court. En effet, plus le laps de temps séparant les deux étapes est important, plus le taux de mortalité des cellules est élevé déjà à la suite de la première étape. On a constaté qu'un temps d'environ 30 s constitue un seuil à ne pas dépasser.
Avantageusement, la décharge de haut voltage et de courte durée consiste en une impulsion à décroissance exponentielle, notamment obtenue par la décharge d'un condensateur.
Les amplitudes peuvent atteindre 400 à 20.000 V/cm en fonction de la durée de l'impulsion et du type de cellules à traiter, la durée étant de l'ordre d'l s à 1 ms.
Par ailleurs, la décharge de bas voltage peut avantageusement consister en une tension essentiellement continue, par exemple fournie par une alimentation stabilisée, de l'ordre de 10 à 400 V/cm, en fonction de la durée de l'impulsion et du type de cellules à traiter, appliquée pendant un temps cumulé de l'ordre de 1 à 100 ms.
Selon une autre variante, on peut, dans certains cas d'application, préférer une impulsion courte de forte intensité du type rectangulaire, l'impulsion à basse tension étant éventuellement une impulsion à décroissance exponentielle.
Selon une forme d'exécution préférée, la première décharge et/ou la-seconde décharge peut consister en un train d'ondes. Dans ce cas, on peut encore prévoir de permuter la polarité de la différence de potentiel aux bornes de la solution au cours de la décharge.
Pour ce qui concerne la décharge de haut voltage,
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un effet de résonance dû à l'inversion de la polarité peut augmenter la création de pores dans la paroi cellulaire.
D'autre part, l'inversion de polarité lors de la décharge à bas voltage peut provoquer des mouvements de vaet-vient de la molécule, par exemple l'ADN, à introduire dans les cellules ; ce qui augmente les chances de pénétration dans la cellule.
Le procédé de la présente invention permet de percer des parois cellulaires que l'on n'était pas encore arrivé à pénétrer jusqu'à présent. Des expériences sur lymphocytes humains et sur certaines souches de levure ont été particulièrement concluantes.
Dans la mesure où la durée de vie des cellules dans le milieu considéré le permet, on peut encore augmenter le taux de pénétration en effectuant successivement plusieurs démarches conformes à l'invention.
Le dispositif qui permet la mise en oeuvre du procédé de l'invention comporte au moins un condensateur associé à un circuit de charge et une alimentation stabilisée, la tension dégagée par l'un et l'autre étant alternativement mise aux bornes d'électrodes adaptées à une cuvette destinée à contenir la solution.
Avantageusement, la tension maximum et la constante de temps de la décharge du condensateur sont programmables.
On comprend aisément que l'appareil conforme à l'invention est moins onéreux et de conception plus simple que les appareils de l'état de la technique.
En effet, on évite, conformément à l'invention, d'agencer plusieurs condensateurs destinés à être déchargés successivement ; ce qui en réduit le coût, simplifie le câblage et la commande. En outre, le poids et l'encombrement en sont réduits ; ce qui est toujours bien venu dans un laboratoire devant notamment fonctionner dans des conditions stériles.
La combinaison décharge de condensateur/alimentation stabilisée permet en outre d'éviter les pertes de temps entre deux décharges capacitives, dues à la charge des condensateurs ; ce qui est bénéfique pour la survie des
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cellules.
Avantageusement, le dispositif de l'invention peut être équipé d'une résistance de shuntage visant à réduire la dissipation d'énergie dans le milieu.
Le procédé ainsi que le dispositif de l'invention conviennent particulièrement bien pour la perméabilisation de parois cellulaires afin d'y introduire des molécules telles que l'ADN, des protéines, des anticorps, des drogues ou autres produits chimiques.
Une autre application réside dans l'extraction de molécules, notamment de l'ADN, de cellules rendues perméables. Cette technique permet notamment d'obtenir de l'ADN "propre", n'exigeant quasiment plus d'étape de purification ultérieure.
On peut encore trouver une application du procédé de l'invention dans la modification de cellules et éventuellement dans la fusion de celles-ci.
L'invention est décrite plus en détail ci-dessous à l'aide d'exemples d'exécution.
Exemple 1.
Perméabilisation de cellules de la lignée GH (GC, GH3b6, GH4,...)
On prépare les cellules comme pour une électroporation classique. On les concentre à 4 millions de cellules/800 gl, dans le milieu de culture habituel de ces cellules. On ajoute l'ADN, de 3 Mg à 50 pg suivant le plasmide ou le fragment d'ADN utilisé. On dépose 800 cl du mélange dans une cuvette d'électroporation classique de 4 mm. On applique une première décharge de 750 V (1875 V/cm), avec une résistance de shuntage de 74 n et un condensateur de 40 MF. On applique ensuite, une seconde décharge de 100 V (250 V/cm) avec une résistance de shuntage de 74 n et un condensateur de 1800 MF.
Les cellules sont ensuite transvasées dans du milieu de culture frais, endéans les 30 s. Par la méthode de mesure enzymatique"CAT", on obtient une réponse 10 fois supérieure par rapport à l'état de la technique.
Exemple 2 Perméabilisation de levures
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On procède de façon analogue à l'exemple l en utilisant les paramètres suivants : - première décharge : 750 V à 1500 V suivant la souche shunt 74 n condensateur 40 MF cuvettes de 2 mm - deuxième décharge : 100 V shunt 74 n condensateur 1800 MF
On obtient 103 à 107 transformants/jng ADN, c'est-à- dire 10 à 20 fois plus que selon l'état de la technique.
Exemple 3 Perméabilisation de bactéries
On procède de manière analogue avec les paramètres suivants : - première décharge : voltage de 2000 à 2500 V shunt de 74 n condensateur de 40 F cuvettes de 2 mm - deuxième, décharge : voltage de 100 V shunt de 74 n condensateur de 1800 F
Dans le cas de bactéries gram-, on obtient 106 à 10ll transformants/jng ADN, c'est-à-dire jusqu'à 10 fois plus que selon l'état de la technique.
Dans le cas des bactéries gram +, on obtient 104 à 107 transformants/jng ADN, c'est-à-dire jusqu'à 100 fois plus.
Exemple 4 Perméabilisation de protoplastes
On procède de façon analogue aux exemples précédents avec les paramètres suivants : - première décharge : voltage de 150 à 250 V shunt de 74 n condensateur de 40 F cuvettes de 4 mm - deuxième décharge : voltage de 50 à 100 V shunt de 74 n condensateur de 1800 F
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On obtient 101 à 103 transformants/g ADN.
Le dispositif de l'invention représenté à la figure 1 comporte un condensateur 1 associé à un circuit de charge 3 et une alimentation stabilisée 5. La tension aux bornes du condensateur 1 et de l'alimentation stabilisée 5 est appliquée à la cuvette d'essai 7. Des résistances de shuntage 9 sont prévues en parallèle sur le condensateur 1. L'alimentation stabilisée 5 ainsi que le circuit de charge 3 du condensateur sont commandés par un circuit de régulation Il qui permet de programmer la constante de temps de la décharge et la tension maximum.
Claims (14)
- REVENDICATIONS 1. Procédé de perméabilisation de membranes cellulaires par décharge électrique (électroporation) caractérisée en ce qu'on applique à une solution contenant les cellules à rendre perméables ainsi que les molécules destinées à être logées à l'intérieur des cellules, successivement au moins une décharge électrique de haut voltage et de courte durée et ensuite au moins une décharge électrique de bas voltage et de plus longue durée.
- 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la décharge de haut voltage et de courte durée consiste en une impulsion à décroissance exponentielle, notamment obtenue par la décharge d'un condensateur.
- 3. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que les amplitudes atteignent 400 à 20.000 V/cm en fonction de la durée de l'impulsion et du type de cellules à traiter, la durée étant de l'ordre d'l s à 1 ms.
- 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que la décharge de bas voltage consiste en une tension essentiellement continue, par exemple fournie par une alimentation stabilisée, de l'ordre de 10 à 400 V/cm, en fonction de la durée de l'impulsion et du type de cellules à traiter.
- 5. Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que la tension essentiellement continue est appliquée pendant un temps cumulé de l'ordre de 1 à 100 ms.
- 6. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'impulsion de haut voltage et de courte durée est du type rectangulaire, l'impulsion à basse tension étant éventuellement une impulsion à décroissance exponentielle.
- 7. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la seconde décharge consiste en un train d'ondes.
- 8. Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce qu'on permute ; pendant la décharge, la polarité de la différence de potentiel aux bornes de la solution.
- 9. Dispositif pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention caractérisé en ce qu'il comporte au moins un condensateur associé à un circuit de charge et une <Desc/Clms Page number 9> alimentation stabilisée, la tension dégagée par l'un et l'autre étant alternativement mise aux bornes d'électrodes adaptées à une cuvette connue en soi destinée à contenir la solution.
- 10. Dispositif selon la revendication 9 caractérisé en ce que la tension maximum et la constante de temps de la décharge du condensateur sont programmables.
- 11. Dispositif selon la revendication 9 ou 10 caractérisé en ce qu'il est équipé d'une résistance de shuntage.
- 12. Utilisation du dispositif selon la revendication 9, 10 ou 11 pour l'introduction dans les cellules de molécules telles que l'ADN, des protéines, des anticorps, des drogues ou autres produits chimiques.
- 13. Utilisation du dispositif selon la revendication 9, 10 ou 11 pour l'extraction de molécules, notamment de l'ADN, de cellules.
- 14. Utilisation du dispositif selon la revendication 9, 10 ou 11 pour la modification ou la fusion de cellules.,
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|---|---|
| WO1991018103A1 (fr) | 1991-11-28 |
| AU7772291A (en) | 1991-12-10 |
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Effective date: 20040531 |