BE1009021A5

BE1009021A5 - Thrombopoietine.

Info

Publication number: BE1009021A5
Application number: BE9500004A
Authority: BE
Inventors: Dan L Eaton; Sauvage Frederic J De
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1994-01-03
Filing date: 1995-01-03
Publication date: 1996-10-01
Also published as: US8193323B1; US8178107B1; US8192955B1

Abstract

La thrombopoïétine isolée (TPO), l'ADN isolé encodant la TPO, ainsi que des procédés recombinants ou synthétiques de préparation et de purification de la TPO sont divulgués. Diverses formes de la TPO sont représentées pour influencer la réplication, la différenciation ou la maturation de globules sanguines, en particulier des mégacaryocytes et des cellules progénitrices des mégacaryocytes. En conséquence, ces composés peuvent être utilisés pour le traitement de la thrombocytopénie.

Description

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0 THROMBOPOÏETINE
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne l'isolation, la purification et la synthèse chimique ou recombinante de protéines qui influencent la survie, la prolifération, la différenciation ou la maturation de cellules hématopoïétiques, en particulier des cellules progénitrices des plaquettes. La présente invention concerne spécifiquement le clonage et l'expression d'acides nucléiques encodant un ligand protéinique capable de se lier au mpl et de l'activer, mpl étant un membre de la superfamille des récepteurs des cytokines. La présente invention concerne en outre l'utilisation de ces protéines seules ou en combinaison avec d'autres cytokines pour traiter des troubles immuns ou hématopoïétiques, y compris la thrombocytopénie.

FONDEMENT DE L'INVENTION I. Le système hématopoïétique
Le système hématopoïétique produit les cellules du sang matures à haute spécialisation connues comme étant nécessaires pour la survie de tous les mammifères. Ces cellules matures englobent : les érythrocytes, spécialisées pour le transport de l'oxygène et du dioxyde de carbone, les lymphocytes T et B responsables des réponses immunes dont les médiateurs sont les cellules et les anticorps, les plaquettes ou les thrombocytes spécialisées pour former des caillots sanguins, ainsi que les granulocytes et les macrophages spécialisés comme purificateurs et comme cellules secondaires pour combattre l'infection.

Les granulocytes sont en outre subdivisés en : neutrophiles, éosinophiles, basophiles et mastocytes, des types de cellules spécialisées remplissant des fonctions discrètes. De manière remarquable, toutes ces cellules du sang matures spécialisées dérivent d'un type unique de cellule indifférenciée commune que l'on désigne comme étant la cellule souche polyvalente (ou plurivalente) que l'on trouve principalement dans la moelle osseuse (Dexter et collaborateurs, Ann. Rev. Cell Biol., 3 : 423-441 [1987]).

Les cellules du sang matures à haute spécialisation doivent être produites continuellement en grands nombres tout au long de la vie d'un mammifère. La grande majorité de ces cellules du sang spécialisées sont destinées à rester actives du point de vue fonctionnel pendant un laps de temps de seulement quelques heures à quelques semaines (Cronkite et collaborateurs, Blood Cells, 2 :

263-264 [1976]). Ainsi, un renouvellement continu des cellules du sang matures, des cellules souches indifférenciées elles-mêmes, ainsi que de n'importe quelle lignée de cellules progénitrices

intermédiaires ou impliquées dans un lignage, se trouvant entre les cellules indifférenciées et les cellules matures, est nécessaire dans le but de maintenir les besoins normaux du mammifère en cellules du sang, liés à l'état d'équilibre.

Au coeur du système hématopoïétique, on trouve la ou les cellules souches polyvalentes. Ces cellules sont relativement peu nombreuses et subissent un autorenouvellement par prolifération pour produire des cellules souches filles ou bien sont transformées, dans une série d'étapes de différenciation, en cellules progénitrices restreintes à un lignage dont la maturation augmente, pour obtenir, en définitive, la ou les cellules du sang matures à haute spécialisation.

Par exemple, certaines cellules progénitrices polyvalentes désignées par l'abréviation CFC-Mix, dérivées de cellules souches, subissent une prolifération (autorenouvellement) et un développement pour produire des colonies contenant toutes les cellules myéloides différentes : les érythrocytes, les neutrophiles, les mégacaryocytes (les prédécesseurs des plaquettes), les macrophages, les basophiles, les éosinophiles et les mastocytes. D'autres cellules progénitrices du lignage lymphoïde subissent une prolifération et un développement pour donner les cellules T et les cellules B.

En outre, entre les cellules progénitrices CFC-Mix et les cellules myéloïdes, on trouve une autre série de cellules progénitrices à implication intermédiaire par rapport à leur descendance. Ces cellules progénitrices restreintes à un lignage sont classées sur base de la descendance qu'elles produisent. Ainsi, les prédécesseurs immédiats connus des cellules myéloïdes sont : des unités formatrices de colonies d'érythroïdes (CFU-E) pour les

érythrocytes, les cellules formatrices de colonies de granulocytes/macrophages (GM-CFC) pour les neutrophiles et les macrophages, des cellules formatrices de colonies de mégacaryocytes (Meg-CFC) pour les mégacaryocytes, des cellules formatrices de colonies d'éosinophiles (Eos-CFC) pour les éosinophiles, et les cellules formatrices de colonies de basophiles (Bas-CFC) pour les mastocytes.

D'autres cellules prédécesseurs intermédiaires entre les cellules souches polyvalentes et les cellules du sang matures sont connues (voir ci-dessous) ou bien s'avéreront posséder divers degrés de restriction à un lignage et de capacité d'auto-renouvellement.

Il apparaît que le principe sous-jacent au système cellulaire hématopoïétique normal est une diminution de la capacité d'auto-renouvellement lorsque le caractère polyvalent est perdu et lorsque la restriction à un lignage et la maturité sont acquises. Ainsi, à une extrémité du spectre des cellules hématopoïétiques, on trouve les cellules souches polyvalentes possédant la capacité d'autorenouvellement et de différenciation pour obtenir toutes les diverses cellules progénitrices impliquées spécifiques à un lignage. Cette capacité constitue la base de la thérapie par transplants de moelle osseuse, dans laquelle des cellules souches indifférenciées repeuplent le système cellulaire hématopoïétique global.

A l'autre extrémité du spectre, on trouve les progéniteurs fortement restreints à un lignage, ainsi que leur descendance, qui ont perdu leur aptitude à l'auto-renouvellement, mais qui ont acquis une activité fonctionnelle arrivée à maturation.

La prolifération et le développement de cellules souches et de cellules progénitrices restreintes à un lignage sont minutieusement réglés par divers facteurs de croissance hématopoïétiques ou diverses cytokines. Le rôle

de ces facteurs de croissance in vivo est complexe et n'est pas complètement compris. Certains facteurs de croissance, tels que l'interleukine-3 (IL-3), sont capables de stimuler à la fois des cellules souches polyvalentes, ainsi que des cellules progénitrices impliquées de plusieurs lignages, y compris, par exemple, les mégacaryocytes. D'autres facteurs, tels que le facteur stimulant des colonies de granulocytes/macrophages (GM-CSF), ont été considérés au point de départ comme étant restreints dans leur action aux GM-CFC.

Toutefois, par la suite, on a découvert que les GMCSF influencent également la prolifération et le développement entre autres des mégacaryocytes. Ainsi, on a trouvé que IL-3 et GM-CSF possèdent des activités biologiques se chevauchant, tout en manifestant une activité différente. Plus récemment, on a trouvé qu'à la fois l'interleukine-6 (IL-6) et l'interleukine-11 (IL-11), bien qu'elles n'influencent apparemment pas isolément la
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formation de colonies meg, agissent par synergie avec IL-3 pour stimuler la maturation des mégacaryocytes (Yonemura et collaborateurs, Exp. Hemato., 20 : 1011-1016 [1992]).

Ainsi, les facteurs de croissance hématopoïétiques peuvent influencer la croissance et la différenciation d'un ou plusieurs lignages, ils peuvent se chevaucher avec d'autres facteurs de croissance en affectant une lignée unique de cellules progénitrices ou encore ils peuvent agir par synergie avec d'autres facteurs.

Il apparaît également que des facteurs de croissance hématopoïétiques peuvent manifester leur effet à différents stades du développement cellulaire depuis les cellules souches plurivalentes en passant par divers progéniteurs impliqués restreints à un lignage jusqu'aux cellules du sang matures. Par exemple, 11 érythropoïétine (epo) s'avère promouvoir la prolifération uniquement de cellules

progénitrices d'érythroides arrivées à maturation. IL-3 s'avère avoir un effet plus précoce, en influençant les cellules souches indifférenciées et les cellules progénitrices intermédiaires restreintes à un lignage.

D'autres facteurs de croissance, tels que les facteurs de cellules souches (SCF), peuvent influencer un développement de cellules encore plus indifférenciées.

On comprendra, d'après ce qui précède, que de nouveaux facteurs de croissance hématopoïétiques qui affectent la survie, la prolifération, la différenciation ou la maturation de n'importe laquelle des cellules du sang ou des prédécesseurs de ces dernières, seraient utiles en particulier pour favoriser le rétablissement d'un système hématopoïétique affaibli, provoqué par la maladie ou suite à une thérapie par rayons ou à une chimiothérapie.

II. Mégacaryocytopoièse - production de plaquettes
Un tour d'horizon de la régulation de la mégacaryocytopoïèse et de la production de plaquettes a été réalisé par : Mazur, Exp. Hemato., 15 : 248 [1987] et par Hoffman, Blood, 74 : 1196-1212 [1989]. Pour le dire brièvement, des cellules souches plurivalentes de moelle osseuse se différencient en lignées cellulaires mégacaryocytaires, érythrocytaires et myélocytaires. On pense qu'il existe une hiérarchie de cellules progénitrices mégacaryocytaires impliquées, entre les cellules souches et les mégacaryocytes.

On a identifié au moins trois classes de cellules progénitrices mégacaryocytaires, notamment des mégacaryocytes "d'unités formatrices de salves" (burst forming unit megakaryocites) (BFU-MK), des mégacaryocytes d'unités formatrices de colonies (CFU-MK) et des cellules progénitrices de mégacaryocytes de faible densité (LD-CFUMK). La maturation mégacaryocytaire elle-même est un

développement continu qui a été séparé en stades basés sur des critères morphologiques classiques. Les membres de la famille des mégacaryocytes (MK ou meg) dont la détection est la plus précoce sont les mégacaryoblastes.

Ces cellules, d'un diamètre initial de 20 à 30 m, possèdent un cytoplasme basophile et un noyau légèrement irrégulier à chromatine lâche quelque peu réticulaire et à plusieurs nucléoles. Dans un stade ultérieur, les mégacaryoblastes peuvent contenir jusqu'à 32 noyaux (polyploïdes), mais le cytoplasme reste rare et immature. Lorsque la maturation progresse, le noyau devient plus lobulaire et picnoïde, la quantité du cytoplasme augmente et il devient plus acidophile et granulaire. Les cellules les plus matures de cette famille peuvent manifester une libération des plaquettes à leur périphérie. Normalement, moins de 10% des mégacaryocytes se trouvent à l'état de blastes et plus de 50% sont arrivés à maturation.

Des classifications morphologiques arbitraires communément appliquées à la série des mégacaryocytes sont les mégacaryoblastes pour la forme la plus précoce, les promégacaryocytes ou les mégacaryocytes basophiles pour la forme intermédiaire et des mégacaryocytes matures (acidophiles, granulaires ou producteurs de plaquettes) pour les formes tardives. Le mégacaryocyte mature étend des filaments de cytoplasme dans des espaces sinusoïdaux où ils se détachent et se fragmentent pour donner des plaquettes individuelles (Williams et collaborateurs, Hematology, 1972).

On pense que la mégacaryocytopoièse implique plusieurs facteurs de régulation (Williams et collaborateurs, Br. J.

Haematol., 52 : 173 [1982] et Williams et collaborateurs, J.

Cell Physio., 110 : 101 [1982]). On considère le niveau précoce de la mégacaryocytopoièse comme étant mitotique et qu'il intervient dans la prolifération cellulaire et dans le déclenchement de colonies à partir de CFU-MK, mais qu'il

n'est pas concerné par la numération plaquettaire (Burstein et collaborateurs, J. Cell Physio., 109 : 333 [1981] et Kimura et collaborateurs, Exp.

Hemato., 13 : 1048 [1985]). Le stade ultérieur de maturation est non mitotique, il est impliqué dans la polyploïdisation nucléaire et la maturation cytoplasmique et il est probablement régulé dans un mécanisme de rétroaction par le nombre de plaquettes périphériques (Odell et collaborateurs, Blood, 48 : 765 [1976] et Ebbe et collaborateurs, Blood, 32 : 787 [1968]).

Le fait de l'existence d'un facteur distinct et spécifique stimulant des colonies de mégacaryocytes (MK-CSF) a été débattu (Mazur, Exp. Hemato., 15 : 340-350 [1987]).

Toutefois, la plupart des auteurs pensent qu'un processus aussi vital pour la survie, tel que la production de plaquettes, doit être régulé par une ou des cytokines ayant la responsabilité exclusive de ce processus. L'hypothèse qu'il existe une ou des cytokines spécifiques aux mégacaryocytes/plaquettes a fourni la base à plus de 30 années de recherches-mais jusqu'à aujourd'hui, aucune cytokine de ce type n'a été purifiée, séquencée et établie par analyse comme étant un MK-CFS (TPO) unique.

Bien que l'on ait rapporté que les MK-CSF ont été partiellement purifiés à partir de thrombocytopénie produite par expérience (Hill et collaborateurs, Exp. Hemato., 14 : 752 [1986]) et d'un milieu conditionné [CM] de rein embryonnaire d'un être humain (McDonald et collaborateurs, J. Lab. Clin. Med., 85 : 59 [1975]) et chez l'homme à partir d'extraits urinaires dans le cas d'anémie plastique et de purpura thrombocytopénique idiopathique (Kawakita et collaborateurs, Blood, 6 : 556 [1983] et à partir du plasma (Hoffman et collaborateurs, J. Clin. Invest., 75 : 1174 [1985]), leur fonction physiologique reste inconnue jusqu'à présent dans la plupart des cas.

Le milieu conditionné de cellules spléniques activées par le mytogène pokeweed (PWM-SpCM) et la lignée cellulaire WEHI-3 de myélomonocytes (WEHI-3CM) de muridés ont été utilisés comme activateurs des mégacaryocytes. PWM-SpCM contient des facteurs augmentant la croissance des CFU-MK (Metcalf et collaborateurs, Pro. Natl. Acad. Sci., USA, 72 : 1744-1748 [1975] ; Quesenberry et collaborateurs, Blood, 65 : 214 [1985] ; et Iscove, N.

N., dans Hernatopoietic Cell Differentiation, ICN-UCL Symposia on Molecular and Cellular Biology, volume 10, Golde et collaborateurs, eds. [New York, Academy Press] pages 37-52 [1978]), dont l'un est l'interleukine-3 (IL-3), un facteur stimulant des colonies de multilignage (multi-CSF [Burstein, Blood Cells, 11 : 469 [1986]). Les autres facteurs dans ce milieu n'ont pas encore été identifiés et isolés. WEHI-3 est une lignée cellulaire de myélomonocytes de muridés sécrétant des quantités relativement importantes de IL-3 et des quantités inférieures de GM-CSF. IL-3 s'est avérée activer la croissance d'une large gamme de cellules hématopoïétiques (Ihle et collaborateurs, J.

Immunol., 13 : 282 [1983]). IL-3 s'est également avérée avoir une action synergique avec un grand nombre des hormones hématopoïétiques ou des facteurs de croissance connus (Bartelmez et collaborateurs, J. Cell Physiol., 122 : 362-369 [1985] et Warren et collaborateurs, Cell, 46 : 667-674 [1988]), y compris à la fois l'érythropoïétine (EPO) et l'interleukine-1 (IL-1), dans l'induction de précurseurs très précoces à activités multiples et dans la formation de très grandes colonies hématopoïétiques mixtes.

D'autres sources d'activateurs des mégacaryocytes ont été trouvées dans les milieux conditionnés de poumons de muridés, d'os, de lignées de cellules macrophages, de cellules d'exsudats péritonéens et de cellules de reins embryonnaires d'êtres humains. Malgré certaines données

contradictoires (Mazur, Exp. Hemato., 15 : 340-350 [1987]), on possède certaines preuves (Geissler et collaborateurs, Br.

J. Haematol., 60 : 233-238 [1985]), du fait que les lymphocytes T activés plutôt que les monocytes jouent un rôle de développement dans la mégacaryocytopoïèse. Ces découvertes suggèrent que les sécrétions de lymphocytes T activés tels que les interleukines peuvent constituer des facteurs de régulation dans le développement des MK (Geissler et collaborateurs, Exp. Hemato., 15 : 845-853 [1987]). Un certain nombre d'études réalisées sur la mégacaryocytopoïèse avec de l'érythropoiétine purifiée (EPO) (Vainchenker et collaborateurs, Blood, 54 : 940 [1979]) ; McLeod et collaborateurs, Nature, 261 : 492-4 [1976]) ; et Williams et collaborateurs, Exp.

Hemato., 12 : 734 [1984]) indiquent que cette hormone a un effet d'augmentation sur la formation de colonies MK. Ceci a également été démontré à la fois dans des cultures exemptes de sérum et dans des cultures contenant du sérum et en l'absence de cellules secondaires (Williams et collaborateurs, Exp. Hemato., 12 : 734 [1984]). On fait l'hypothèse que EPO est davantage impliquée dans les aspects correspondant aux stades mono-et bicellulaires de la mégacaryocytopoïèse, contrairement à l'effet de PWM-SpCM s'exerçant au stade quadricellulaire du développement mégacaryocytaire. L'interaction de tous ces facteurs, à la fois sur les phases précoces et tardives du développement des mégacaryocytes, reste à élucider.

Des données obtenues auprès de divers laboratoires suggèrent que les seuls facteurs à multilignage, qui possèdent individuellement une activité de stimulation des colonies MK, sont GM-CSF et IL-3, et, dans une moindre mesure, le facteur IL-6 stimulant les cellules B (Ikebuchi et collaborateurs, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 : 9035
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[1987]). Plus récemment, certains auteurs ont rapporté que IL-11 et le facteur inhibiteur de la leucémie (LIF) agissent

de manière synergique avec IL-3 pour augmenter la dimension et la ploidie des mégaryocytes (Yonemura et collaborateurs, British Journal of Hematology, 84 : 16-23 [1993] ; Burstein et collaborateurs, J. Cell.

Physio., 153 : 305-312 [1992] ; Metcalf et collaborateurs, Blood, 76 : 50-56 [1990] ; Metcalf
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et collaborateurs, Blood, 77 : 2150-2153 [1991] ; Bruno et collaborateurs, Exp. Hemato., 19 : 378-381 [1991] ; et Yonemura et collaborateurs, Exp. Hemato., 20 : 1011-1016 [1992]).

D'autres documents d'intérêt englobent : Eppstein et collaborateurs, brevet U. S. 4.962. 091 ; Chong, brevet U. S.

4.879. 111 ; Fernandes et collaborateurs, Brevet U. S.

4.604. 377 ; Wissler et collaborateurs, brevet U. S. 4.512. 971 ; Gottlieb, brevet U. S. 4.468. 379 ; Bennett et collaborateurs, brevet U. S. 5.215. 895 ; Kogan et collaborateurs, brevet U. S.

5.250. 732 ; Kimura et collaborateurs, Eur. J. Immunol., 20 (9) : 1927-1931 [1990] ; Secor et collaborateurs, J. of Immunol., 144 (4) : 1484-1489 [1990] ; Warren et collaborateurs, J. of Immunol., 140 (1) : 94-99 [1988] ; Warren et collaborateurs, Exp. Hemato., 17 (11) : 1095-1099 [1989] ;
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Bruno et collaborateurs, Exp. Hemato., 17 (10) : 1038-1043 [1989] ; Tanikawa et collaborateurs, Exp. Hemato., 17 (8) : 883-888 [1989] ; Koike et collaborateurs, Blood, 75 (12) : 2286-2291 [1990] ; Lotem, Blood, 75 (5) : 1545-1551 [1989] ; Rennick et collaborateurs, Blood, 73 (7) : 1828-1835 [1989] ; et Clutterbuck et collaborateurs, Blood, 73 (6) : 1504- 1512 [1989].

III. Thrombocytopênie
Les plaquettes sont des éléments critiques du mécanisme de formation de caillots sanguins. La diminution du taux de circulation des plaquettes, que l'on désigne par le terme thrombocytopénie, se manifeste dans divers troubles et dans diverses conditions cliniques. La thrombocytopénie est définie communément comme étant une numération plaquettaire inférieure à 150 x 109 par litre.

Les causes majeures de la thrombocytopénie peuvent être grosso modo divisées en trois catégories sur base de la durée de vie des plaquettes, notamment : (1) production insuffisante de plaquettes par la moelle osseuse, (2) séquestration des plaquettes dans la rate (splénomégalie), ou (3) augmentation de la destruction des plaquettes dans la circulation périphérique (par exemple, thrombocytopénie auto-immune ou chimiothérapie et thérapie par rayons). En outre, chez des patients recevant des volumes importants de produits sanguins pauvres en plaquettes administrés de manière rapide, la thrombocytopénie peut se développer par dilution.

Les manifestations cliniques du saignement de la thrombocytopénie dépendent de la gravité de la thrombocytopénie, de ses causes et des problèmes éventuels de coagulation qui lui sont associés. En général, des patients dont la numération plaquettaire se situe entre 20 et 100 x 109 par litre présentent un risque de saignement postraumatique excessif, tandis que ceux dont la numération plaquettaire est inférieure à 20 x 109 par litre peuvent saigner spontanément. Ces derniers patients sont des candidats pour des transfusions de plaquettes avec le risque immun et viral qui leur est associé. Pour n'importe quel degré donné de thrombocytopénie, le saignement tend à être plus important lorsque la cause est la diminution de la production plutôt que l'augmentation de la destruction des

plaquettes.

Dans ce dernier cas, un renversement accéléré de la numération plaquettaire donne lieu à une circulation de plaquettes plus jeunes, plus grosses et plus efficaces du point de vue hémostatique. La thrombocytopénie peut provenir de divers troubles que l'on décrit brièvement ci-dessous.

Une description plus détaillée peut être trouvée dans Schafner, A. I.,"Thrombocytopenia and Disorders of Platelet Function,"Internal Medicine, 3ème édition, John J. Hutton et collaborateurs, Eds. Little Brown and Co., Boston/Toronto/Londres [1990].

(a) Thrombocytopénie due à une production insuffisante de plaquettes.

Les causes de la thrombocytopénie congénitale englobent l'anémie aplastique constitutionnelle (syndrome de Fanconi) et la thrombocytopénie amégacaryocytaire congénitale qui peut être associée à des malformations du squelette. Des troubles acquis au niveau de la production de plaquettes sont provoqués soit par hypoplasie des mégacaryocytes ou par thrombopoièse inefficace. L'hypoplasie mégacaryocytaire peut résulter de diverses conditions, y compris l'aplasie médullaire (englobant les formes idiopathiques ou la myélosuppression par des agents chimiothérapeutiques ou par la thérapie par rayons), la myélofibrose, la leucémie et l'invasion de la moelle osseuse par des tumeurs métastasiques ou par des granulomes.

Dans certains cas des toxines, des agents infectieux ou des médicaments peuvent interférer avec la thrombopoièse de manière relativement sélective ; des exemples englobent les thrombocytopénies transitoires provoquées par l'alcool et par certaines infections virales, ainsi que la thrombocytopénie douce associée à l'administration de diurétiques de thiazides.

Enfin, la thrombopoïèse inefficace faisant suite à des processus mégaloblastiques (déficience en folate ou en B12)

peut également provoquer la thrombocytopénie, habituellement avec coexistence d'une anémie ou d'une leucopénie.

Le traitement courant des thrombocytopénies dues à la diminution de la production de plaquettes dépend de l'identification et de la réversion de la cause sous-jacente à l'insuffisance médullaire. Des transfusions de plaquettes sont habituellement réservées à des patients souffrant de complications de saignement sérieuses ou à titre de couverture lors d'opérations chirurgicales, étant donné que l'isoimmunisation peut donner lieu au fait que l'organisme est réfractaire à des transfusions ultérieures de plaquettes. Le saignement muqueux résultant de la thrombocytopénie sévère peut être amélioré par administration par voie orale ou par voie intraveineuse d'agents antifibrinolytiques.

Toutefois, des complications thrombotiques peuvent se développer si l'on utilise des agents antifibrinolytiques chez des patients souffrant de coagulation intravasculaire disséminée (DIC).

(b) Thrombocytopénie due à la séquestration splénique
La splénomégalie due à n'importe quelle cause peut être associée à une thrombocytopénie allant d'une thrombocytopénie douce à une thrombocytopénie modérée. Il s'agit d'un processus largement passif (hypersplénie) de séquestration splénique des plaquettes contrairement à la destruction active des plaquettes par la rate dans des cas de thrombocytopénie à médiation immune que l'on évoque cidessous. Bien que la cause la plus commune d'hypersplénie soit la splénomégalie congestive provenant de l'hypertension portale due à la cirrhose alcoolique, d'autres formes de splénomégalie congestive, infiltrante ou lymphoproliférative sont également associées à la thrombocytopénie.

En général, la numération plaquettaire ne

tombe pas en dessous de 50 x 109 par litre suite à l'hypersplénie seule.

(c) Thrombocytopénie due à une destruction des plaquettes à médiation non immune
La thrombocytopénie peut résulter de la destruction accélérée des plaquettes provoquée par divers processus non immunologiques. Des troubles de ce type englobent la coagulation intravasculaire disséminée, des dispositifs prothétiques intravasculaires, la circulation extracorporelle du sang et les microangiopathies thrombotiques telles que le purpura thrombocytaire thrombotique. Dans toutes ces situations, des plaquettes circulantes qui sont exposées, soit à des surfaces artificielles, soit à une intima vasculaire anormale, soit sont consommées à ces sites, soit sont endommagées et ensuite prématurément éliminées par le système réticuloendothélial.

Des états de maladie ou, des troubles dans lesquels peut survenir une coagulation intravasculaire disséminée (DIC) sont décrits plus en détail dans Braunwald et collaborateurs, (eds) Harrison's Principles of Internal Medicine, llème édition, page 1478, McGraw Hill [1987]. Des dispositifs prothétiques intravasculaires, y compris des valves cardiaques et des ballons intraortiques, peuvent provoquer une thrombocytopénie destructrice douce à modérée, et la thrombocytopénie transitoire chez des patients soumis à une déviation cardiopulmonaire ou à une hémodialyse peut provenir d'une consommation ou d'une dégradation des plaquettes dans le circuit extracorporel.

(d) Thrombocytopénie immune induite par médicaments
Plus de cent médicaments sont impliqués dans la thrombocytopénie à médiation immunologique. Toutefois, seule la quinidine, la quinine, l'or, les sulfonamides, la céphalothine et l'héparine ont été bien caractérisés. La thrombocytopénie induite par médicaments est fréquemment très sévère et se manifeste spécifiquement de manière brutale en quelques jours au cours de la prise du médicament de sensibilisation.

(e) Purpura thrombocytopénique immun (auto-immun) (ITP)
Le ITP chez les adultes est une maladie chronique caractérisée par une destruction auto-immune des plaquettes.

L'auto-anticorps est habituellement l'IgG, bien que d'autres immunoglobulines aient été également rapportées. Même si l'auto-anticorps de l'ITP s'est avéré comme étant associé à la membrane des plaquettes GPIIbIIIa, spécificité de l'antigène des plaquettes n'a pas été identifiée dans la plupart des cas. La destruction extravasculaire de plaquettes sensibilisées se produit dans le système réticulo-endothélial de la rate et du foie. Bien que plus de la moitié de tous les cas de l'ITP soit idiopathique, la plupart des patients souffrent de troubles rhumatismaux ou de maladies auto-immunes (par exemple le lupus érythémateux aigu disséminé) ou encore des troubles lymphoprolifératifs (par exemple la leucémie lymphocytaire chronique) sousjacents.

(f) ITP induit par HIV
L'ITP est une complication commune croissante d'une infection par HIV (Morris et collaborateurs, Ann. Intern.

Med., 96 : 714-717 [1982]) et elle peut apparaître à n'importe quel stade de la progression de la maladie à la fois chez les patients chez qui on a diagnostiqué le syndrome acquis d'immunodéficience (SIDA), ceux souffrant de complexes

apparentés au SIDA et ceux souffrant d'une infection par HIV, mais qui ne manifestent pas les symptômes du SIDA.

L'infection par HIV est une maladie transmissible qui se caractérise en fin de compte par une déficience marquée de la fonction immune cellulaire, ainsi que par l'apparition d'infections opportunistes et de malignité. L'anormalité immunologique primaire résultant de l'infection par HIV concerne la diminution progressive et la défaillance fonctionnelle des lymphocytes T exprimant la glycoprotéine de la surface des cellules CD4 (Lane et collaborateurs, Ann.

Rev. Immunol., 3 : 477 [1985]). La perte de la fonction des cellules T amplificatrices inductrices des CD4 sous-tend probablement les défauts marqués dans l'immunité cellulaire et humorale, donnant lieu aux infections opportunistes et aux malignités caractéristiques du SIDA (H. Lane supra).

Bien que le mécanisme de l'ITP associé au HIV soit inconnu, on pense qu'il est différent du mécanisme de l'ITP
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non associé à l'infection par HIV. (Walsh et collaborateurs, N. Eng. J. Med., 311 : 635-639 [1984] ; et Ratner, Am. J. Med., 86 : 194-198 [1989]).

IV. Thérapie courante pour la thrombocytopénie
L'approche thérapeutique concernant le traitement des patients souffrant de thrombocytopénie est dictée par la gravité et l'urgence de la situation clinique. Le traitement est similaire pour la thrombocytopénie associée au HIV et non apparentée au HIV, et bien qu'un certain nombre de différentes approches thérapeutiques aient été utilisées, des controverses subsistent au niveau de la thérapie.

On a réussi à augmenter la numération plaquettaire chez des patients chez qui on a diagnostiqué la thrombocytopénie à l'intervention d'une thérapie aux glucocorticoïdes (par exemple la prednisolone) ; toutefois, chez la plupart des patients, la réponse est incomplète ou une récidive se produit lorsqu'on réduit la dose des glucocorticoides ou lorsqu'on interrompt leur administration. En se basant sur des études effectuées avec des patients souffrant de ITP associé au HIV, certains chercheurs ont suggéré le fait que la thérapie aux glucocorticoïdes peut donner lieu à une prédisposition au SIDA. Les glucocorticoïdes sont administrés habituellement lorsque la numération plaquettaire tombe en dessous de 20 x 109 litres ou lorsque le saignement spontané se produit.

Pour des patients réfractaires aux glucocorticoïdes, on
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a utilisé avec succès le composé 4- (2-chlorophényl)-9méthyl-2- [3- (4-morpholinyl)-3-propanon-l-yl]-6H-thiéno- [3, 2f] [1, 2, 4] triazolo [4, 3, a] [1, 4] diazépine (WEB 2086) pour traiter un cas sévère de ITP non associé au HIV. Un patient dont la numération plaquettaire était de 37.000-58. 000/il a été traité avec WEB 2086 et après un traitement de 1-2 semaines, la numération plaquettaire a augmenté à 140.000-190. 000/il. (EP-A-361.077 et Lohman et collaborateurs, Lancet, 1147 [1988]).

Bien que le traitement optimal pour le purpura thrombocytopénique amégacaryocytaire acquis (AATP) soit incertain, la globuline antithymocyte (ATG), un antisérum de cheval pour le tissu du thymus d'un être humain, s'est avéré produire une rémission complète prolongée (Trimble et collaborateurs, Am. J. Hematol, 37 : 126-127 [1991]).

Toutefois, un rapport récent indique que les effets hématopoïétiques de l'ATG doivent être attribués au thimerosal dans lequel on pense que la protéine fait office

de transporteur du mercure (Panella et collaborateurs, Cancer Research, 50 : 4429-4435 [1990]).

De bons résultats ont été rapportés avec la splénectomie. Par la splénectomie, on élimine le site majeur de la destruction des plaquettes et une source majeure de production d'auto-anticorps chez un grand nombre de patients. Ce procédé donne lieu à des rémissions prolongées exemptes de traitement chez un grand nombre de patients.

Toutefois, étant donné que des opérations chirurgicales sont généralement à éviter pour des patients dont l'immunité est altérée, la splénectomie est recommandée uniquement dans des cas graves de thrombocytopénie (par exemple l'ITP sévère associé au HIV), chez des patients qui ne répondent pas à un traitement de 2 à 3 semaines aux glucocorticoïdes ou qui n'apportent pas une réponse soutenue après interruption de l'administration des glucocorticoïdes. En se basant sur les connaissances scientifiques du moment, on ne peut pas savoir clairement si la splénectomie prédispose le patient au SIDA.

En plus de la thérapie à la prednisolone et de la splénectomie, certains agents cytotoxiques, par exemple la vincristine et l'azidothimidine (AZT, zidovudine), sont également prometteurs dans le traitement de l'ITP induit par HIV ; toutefois, les résultats sont au stade préliminaire.

On comprendra, d'après ce qui précède, qu'une manière de traiter la thrombocytopénie serait d'obtenir un agent capable d'accélérer la différenciation et la maturation des mégacaryocytes ou des précurseurs de ces derniers dans la forme productrice de plaquettes. Des efforts considérables ont été consentis pour identifier un tel agent désigné communément par le terme"thrombopoïétine" (TPO). D'autres noms pour la TPO, que l'on trouve couramment dans la littérature, englobent : le facteur stimulant la

thrombocytopoïèse (TSF), le facteur stimulant des colonies de mégacaryocytes (MK-CSF), le facteur stimulant les mégacaryocytes et l'activateur des mégacaryocytes. L'agent actif de la TPO a été observé dès 1959 (Rack et collaborateurs, Med.

Exp., 1 : 125) et des tentatives pour caractériser et purifier cet agent se sont poursuivies jusqu'à ce jour. Bien que des rapports de purification partielle de polypeptides TPO-actifs existent (voir, par exemple, Tayrien et collaborateurs, J. Biol. Chem., 262 : 3262 [1987] et Hoffman et collaborateurs, J. Clin.

Invest., 75 : 1174 [1985], d'autres ont fait l'hypothèse que la TPO n'est pas une entité discrète en soi, mais plutôt simplement la manifestation polyfonctionnelle d'une hormone connue (IL-3, Sparrow et collaborateurs, Prog. Clin. Biol. res., 215 : 123 [1986]). Quelle que soit sa forme ou son origine, une molécule possédant une activité thrombopoiétique pourrait revêtir une valeur thérapeutique importante.. Bien qu 1 aucune protéine n'ait été identifiée de manière non ambiguë comme étant la TPO, un intérêt considérable entoure la découverte récente du fait que le mpl, un récepteur putatif des cytokines, peut servir de transducteur pour un signal thrombopoiétique.

V. Npl est un récepteur de la cytokine mégacaryocytopoïêtique
On pense que la prolifération et la maturation de cellules hématopoïétiques est fortement régulée par des facteurs qui modulent, de manière positive ou négative, la prolifération de cellules souches plurifonctionnelles et la différenciation de multilignages (multilineage differentiation). Ces effets sont dus à une médiation par la liaison à affinité élevée de facteurs protéiniques extracellulaires à des récepteurs de surface cellulaire spécifiques. Ces récepteurs de surface cellulaire partagent

une homologie considérable et sont généralement classés comme étant des membres de la super-famille des récepteurs des cytokines.

Des membres de la super-famille englobent les récepteurs pour IL-2 (chaînes ss et y) (Hatakeyama et collaborateurs, Science, 244 : 551-556 [19891] ; Takeshita et collaborateurs, Science, 257 : 379 -382 [1991) i IL- 3 (Itoh et collaborateurs, Science, 247 : 324-328 [1990] ; Gorman et collaborateurs, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 : 5459-5463 [1990] ; Kitamura et collaborateurs, Cell, 66 : 1165-1174 [1991a] ; Kitamura et collaborateurs, Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, 88 : 5082-5086 [1991b]), IL-4 (Mosley et collaborateurs, Cell, 59 : 335-348 [1989], IL-5 (Takaki et collaborateurs, EMBO J., 9 : 4367-4374 [1990] ; Tavernier et collaborateurs, Cell, 66 : 1175-1184 [1991]), IL-6 (Yamasaki et collaborateurs, Science, 241 : 825-828 [1988] ; Hibi et collaborateurs, Cell, 63 : 1149-1157 [1990]), IL-7 (Goodwin et collaborateurs, Cell, 60 : 941-951 [1990]) ; IL-9 (Renault et collaborateurs, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 : 5690-5694 [1992]), le facteur stimulant des colonies de granulocytesmacrophages (GMCSF) (Gearing et collaborateurs, EMBO J., 8 : 3667-3676 [1991] ; Hayashida et collaborateurs, Proc. Natl, Acad. Sci.

USA, 244 : 9655-9659 [1990]), le facteur stimulant des colonies de granulocytes (G-CSF) (Fukunaga et collaborateurs, Cell, 61 : 341-350 [1990a) ; Fukunaga et collaborateurs, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 : 8702-8706 [1990b] : Larsen et collaborateurs, J. Exp. Med., 172 : 1559- 1570 [1990], EPO (D'Andrea et collaborateurs, Cell, 57 : 277- 285 [1989] ; Jones et collaborateurs, Blood, 76 : 31-35 [1990]), le facteur inhibiteur de la leucémie (LIF) (Gearing et collaborateurs, EMBO J., 10 : 2839-2848 [1991]), l'oncostatine M (OSM) (Rose et collaborateurs, Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 88 : 8641-8645 [1991]), ainsi que des récepteurs pour la prolactine (Boulin et collaborateurs, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 : 7744-7748 [1988] ; Edery et collaborateurs, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 : 2112-2116

[1989]), l'hormone de croissance (GH) (Leung et collaborateurs, Nature, 330 : 537-543 [1987]) et le facteur neutrophique ciliaire (CNTF) (Davis et collaborateurs, Science, 253 : 59-63 [1991].

Les membres de la super-famille des récepteurs des cytokines peuvent être regroupés en trois catégories fonctionnelles (pour un aperçu voir Nicola et collaborateurs, Cell, 67 : 1-4 [1991]). La première classe comprend des récepteurs à chaîne unique, tels que les récepteurs de l'érythropoiétine (EPO-R) ou encore des récepteurs du facteur stimulant les colonies de granulocytes (G-CSF-R) qui se lient à des ligands avec une affinité élevée via le domaine extracellulaire et qui génèrent également un signal intracellulaire.

Une deuxième classe de récepteurs, que l'on appelle les sous-unités a, englobent le récepteur de l'interleukine-6 (IL6-R), le récepteur du facteur stimulant des colonies de granulocytes macrophages (GM-CSF-R), le récepteur de l'interleukine-3 (IL3-Ra), ainsi que d'autres membres de la super-famille des récepteurs des cytokines. Ces sous-unités a se lient à des ligands avec une faible affinité, mais ne peuvent faire office de transducteur pour un signal intracellulaire. Un récepteur à affinité élevée, capable de transmettre des signaux est généré par un hétérodimère entre une sous-unité a et un membre d'une troisième classe des récepteurs des cytokines, que l'on appelle les sous-unités ss, par exemple ssc, la sous-unité P commune aux trois sous-unités a IL3-Ra et GM-CSF-R.

La preuve que le mpl est un membre de la super-famille des récepteurs des cytokines provient de l'homologie de séquences (Gearing, EMBO J., 8 : 3667-3676 [1988] ; Bazan,
EMI22.1
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 : 6834-6938 [1990] ; Davis et collaborateurs, Science, 253 : 59-63 [1991] et Vigon et

collaborateurs, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 : 5640-5644 [1992]), ainsi que de son aptitude à opérer la transduction des signaux prolifératifs.

La séquence protéinique déduite du clonage moléculaire du c-mpl de muridé révèle que cette protéine est homologue à d'autres récepteurs des cytokines. Le domaine extracellulaire contient 465 résidus d'aminoacides et est composé de deux sous-domaines, chacun comportant quatre cystéines fortement conservées et un motif particulier dans le sous-domaine N-terminal et dans le sous-domaine C-terminal.

On fait l'hypothèse que les domaines extracellulaires de liaison au ligand possèdent des géométries similaires à structure plissée à double paroi P (similar double ss-barrel fold structural geometries). Ce domaine extracellulaire dupliqué est fortement homologue à la chaîne transductrice de signaux commune aux récepteurs de IL-3, de IK-5 et de GM-CSF, ainsi qu'au domaine de liaison à faible affinité de LIF (Vigon et collaborateurs, Oncogene, 8 : 2607-2615 [1993]). Ainsi, il se peut que le mpl appartienne à la classe des récepteurs des cytokines de liaison à des ligands à faible affinité.

Une comparaison du mpl de muridé et du mpl P mature d'un être humain révèle que ces deux protéines présentent une identité de séquences de 81%. Plus spécifiquement, les sous-domaines extracellulaires N-et C-terminaux partagent une identité de séquences à raison de 75% et de 85%, respectivement. La région du mpl la plus conservée concerne le domaine cytoplasmique présentant une identité d'aminoacides à concurrence de 91%, une séquence de 37 résidus proches du domaine transmembranaire étant identique dans les deux espèces. En conséquence, le mpl est rapporté comme étant un des membres les plus conservés de la superfamille des récepteurs des cytokines (Vigon supra).

La preuve que le mpl est un récepteur fonctionnel capable de réaliser une transduction d'un signal prolifératif vient de la construction de récepteurs chimères contenant un domaine extracellulaire provenant du récepteur des cytokines possédant une affinité élevée pour une cytokine connue avec le domaine cytoplasmique du mpl. Etant donné qu'aucun ligand connu pour le mpl n'a été rapporté, il a été nécessaire de construire le domaine extracellulaire chimère de liaison du ligand à affinité élevée à partir d'un récepteur de cytokines de la classe un, tel que IL-4R ou G-CSFR. Vigon et collaborateurs, supra ont fusionné le domaine extracellulaire de G-CSFR avec, à la fois le domaine transmembranaire et cytoplasmique du c-mpl.

Une lignée cellulaire dépendant de IL-3, BAF/B03 (Ba/F3) a été transfectée avec le chimère G-CSFR/mpl conjointement avec une séquence de commande GC-CSFR de longueur totale. La croissance des cellules transfectées avec le chimère a été aussi bonne en présence des cytokines IL-3 ou G-CSF. De la même manière, des cellules transfectées avec G-CSFR ont également subi une bonne croissance, que ce soit dans IL-3 ou dans G-CSF. Aucune cellule n'a survécu en l'absence de facteurs de croissance. Une expérience similaire a été réalisée par Skoda et collaborateurs, EMBO J., 12 (7) : 2645- 2653 (1993) dans laquelle, à la fois les domaines extracellulaires et transmembranaires du récepteur humain IL-4 (hIL-4-R) ont été fusionnés au domaine cytoplasmique du mpl de muridé et transfectés dans une lignée cellulaire de muridé BA/F3 dépendante de IL-3.

Les cellules BA/F3 transfectées avec hIL-4-R de type sauvage ont proliféré normalement en présence de l'une ou l'autre espèce spécifique IL-4 ou IL-3. Les cellules BA/F3 transfectées avec hIL-4 -R/mpl ont proliféré normalement en présence de hIL-4 (en présence ou en l'absence de IL-3), démontrant que, dans les cellules BA/F3 le domaine cytoplasmique du mpl

contient tous les éléments nécessaires pour effectuer une transduction d'un signal prolifératif.

Ces expériences chimères démontrent la capacité de signalement de prolifération du domaine cytoplasmique du mpl, mais elles restent muettes en ce qui concerne le fait de savoir si le domaine extracellulaire du mpl peut se lier à un ligand. Ces résultats sont conformes avec au moins deux possibilités, notamment le fait que le mpl est un récepteur à chaîne unique (classe un) comme EPO-R ou G-CSFR, ou bien qu'il s'agit d'une sous-unité ss transductrice de signaux (classe trois) nécessitant une sous-unité a telle que IL-3 (Skoda et collaborateurs, supra).

VI. Le ligand pour le mpl est une thrombopoïétine (TPO)
Comme décrit ci-dessus, il a été suggéré que le sérum contient un facteur unique que l'on désigne parfois par le terme thrombopoiétine (TPO) qui développe une activité synergique avec diverses autres cytokines pour favoriser la croissance et la maturation des mégacaryocytes. Aucun facteur naturel de ce type n'a jamais été isolé à partir du sérum ou de n'importe quelle autre source, même après des efforts considérables déployés par de nombreux groupes.

Bien que l'on ignore si le mpl est capable ou non de se lier directement à un facteur de stimulation des mégacaryocytes, des expériences récentes démontrent que le mpl est impliqué dans la transduction de signaux prolifératifs à partir d'un ou de plusieurs facteurs trouvés dans le sérum de patients atteints de myélose aplastique (Methia et collaborateurs, Blood, 82 (5) : 1395-1401 [1993].

La preuve qu'un facteur sérique unique formateur de colonies distinct de IL-la, de IL-3, de IL-4, de IL-6, de IL-11, de SCF, de EPO, de G-CSF et de GM-CSF opère une transduction d'un signal prolifératif à l'intervention du mpl ressort de l'examen de la distribution de l'expression par c-mpl dans des lignées cellulaires hématopoïétiques non différentiées et impliquées, ainsi que d'études antisens du mpl dans une de ces lignées cellulaires.

En utilisant la transcriptase réverse (RT-PCR) dans des cellules hématopoïétiques humaines immunopurifiées, Methia et collaborateurs, supra, on a démontré qu'on trouve seulement des messages forts d'ARN du mpl dans des cellules purifiées CD34+, dans les mégacaryocytes et dans les plaquettes. Les cellules CD34+ purifiées à partir de moelle osseuse (BM) représentent environ 1% de toutes les cellules de BM et sont enrichies dans des progéniteurs non différenciés et impliquées de tous les lignages (par exemple, les érythroides, les granulomacrophages et les mégacaryocytes).

Des oligodésoxynucléotides antisens du mpl se sont avérés supprimer la formation de colonies de mégacaryocytes des cellules plurivalentes CD34+ cultivées dans le sérum de patients souffrant de myélose aplastique (une source riche en agent actif stimulant des colonies de mégacaryocytes [MKCSA]). Ces mêmes oligodésoxynucléotides antisens n'ont pas d'effet sur la formation de colonies d'érythroides ou de granulomacrophages.

Le fait de savoir si le mpl se lie directement à un ligand et le fait de savoir si le facteur sérique qui s'avère provoquer la megacaryocytopoïèse agit par l'intermédiaire du mpl sont restés inconnus jusqu'à présent.

Toutefois, on a fait la suggestion que, si le mpl se lie

vraiment directement à un ligand, sa séquence d'aminoacides est susceptible de se conserver dans une large mesure et de posséder une réactivité croisée d'espèce du fait de l'identité de séquence considérable entre les domaines extracellulaires des mpl de muridés et d'êtres humains (Vigon et collaborateurs, supra [1993].

VII. Objets
Au vu de ce qui précède, on comprendra qu'un besoin actuel et persistant existe dans la technique d'isoler et d'identifier des molécules capables de stimuler la prolifération, la différentiation et la maturation de cellules hématopoïétiques en particulier des mégacaryocytes ou de leurs prédécesseurs pour une utilisation thérapeutique dans le traitement de la thrombocytopénie. On pense qu'une telle molécule est un ligand pour le mpl, et ainsi il existe un besoin supplémentaire d'isoler un ou des ligands de ce type pour évaluer leur (s) rôle (s) dans la croissance et dans la différentiation cellulaire.

En conséquence, un objet de la présente invention est d'obtenir une molécule pharmaceutiquement pure capable de stimuler la prolifération, la différentiation et/ou la maturation des mégacaryocytes pour obtenir la forme mature productrice de plaquettes.

Un autre objet est de procurer la molécule sous une forme destinée à l'utilisation thérapeutique dans le traitement d'un trouble hématopoïétique, en particulier la thrombocytopénie.

Un autre objet de la présente invention est d'isoler, de purifier et spécifiquement d'identifier des ligands protéiniques capables de se lier in vivo à un récepteur de la super-famille des cytokines désigné par l'abréviation mpl et de procéder à la transduction d'un signal prolifératif.

Un autre objet encore est de procurer des molécules d'acides nucléiques encodant des ligands protéiniques de ce type et d'utiliser ces molécules d'acides nucléiques pour procurer des ligands de liaison au mpl dans des cultures de cellules recombinantes à des fins diagnostiques et thérapeutiques.

Un autre objet encore est de procurer des dérivés et des formes modifiées des ligands protéiniques englobant des variants des séquences d'aminoacides, des formes glycoprotéiniques variantes, ainsi que des dérivés covalents de ces dernières.

Un objet supplémentaire est de procurer des formes de polypeptides de fusion combinant un ligand pour le mpl et une protéine hétérologue, ainsi que des dérivés covalents de ces derniers.

Un autre objet encore est de procurer des formes polypeptidiques variantes combinant un ligand pour le mpl avec des additions et des substitutions d'aminoacides à partir de la séquence de EPO pour obtenir une protéine capable de réguler la prolifération et la croissance, à la fois des plaquettes et des progéniteurs des érythrocytes.

Un autre objet encore est de préparer des immunogènes pour dresser des anticorps contre des ligands pour le mpl ou contre des formes de fusion de ces derniers, ainsi que pour obtenir des anticorps capables de se lier à des ligands de ce type.

Ces objets de l'invention, ainsi que d'autres se dégageront aux yeux de l'homme de métier en considérant la spécification dans sa totalité.

SOMMAIRE DE L'INVENTION
Les objets de l'invention sont réalisés en procurant une protéine de mammifère isolée, qui favorise la prolifération et la maturation mégacaryocytopoiétique, désignée par le terme" ligand pour le mpl" (ML) ou encore par le terme"thrombopoïétine" (TPO) capable de stimuler la prolifération, la maturation et/ou la différenciation de mégacaryocytes pour obtenir la forme productrice de plaquettes à l'état mature.

Cette protéine essentiellement homogène peut être purifiée à partir d'une source naturelle par un procédé comprenant : (1) la mise en contact d'un plasma source contenant les molécules de ligand pour le mpl qui doivent être purifiées, avec un polypeptide récepteur immobilisé, en particulier le mpl ou un polypeptide de fusion au mpl immobilisé sur un support dans des conditions dans lesquelles les molécules de ligand pour le mpl qui doivent être purifiées sont adsorbées de manière sélective sur le polypeptide récepteur immobilisé, (2) laver le polypeptide récepteur immobilisé et son support pour éliminer la matière non adsorbée et (3) éluer les molécules de ligand pour le mpl par rapport au polypeptide récepteur immobilisé sur lequel elles sont adsorbées, à l'aide d'un tampon d'élution.

De préférence, la source naturelle est le plasma ou l'urine d'un mammifère, contenant le ligand pour le mpl. De manière facultative, le mammifère est aplasique et le récepteur immobilisé est une fusion mpl-IgG.

De manière facultative, la protéine préférée qui favorise la prolifération et la maturation mégacaryocytopoiétique est un polypeptide ligand pour le mpl isolé, essentiellement homogène, préparé par un moyen synthétique ou recombinant.

De préférence, le polypeptide" ligand pour le mpl"ou la"TPO"de la présente invention possède une identité de séquence globale d'au moins 70% avec la séquence d'aminoacides du polypeptide ligand pour le mpl de porcin purifié essentiellement homogène fortement purifié et une identité de séquence d'au moins 80% avec le"domaine EPO"du polypeptide-ligand pour le mpl de porcin. De manière facultative, le ligand pour le mpl de la présente invention est un ligand pour le mpl mature d'un être humain (hML) dont la séquence d'aminoacides arrivée à maturation est procurée en figure 1 (SEQ ID NO : 1) ou une forme variante ou encore modifiée de cette dernière par voie de post-transcription, ou bien une protéine possédant une identité de séquence d'environ 80% avec le ligand pour le mpl mature d'un être humain.

De manière facultative, le variant du ligand pour le mpl est un fragment, en particulier un fragment aminoterminal ou"de domaine EPO"du ligand pour le mpl mature d'un être humain (hML). De préférence, le fragment aminoterminal conserve essentiellement toute la séquence du ML d'un être humain entre les premier et quatrième résidus de cystéine, mais peut contenir des additions, des délétions ou des substitutions importantes en dehors de cette région.

Conformément à cette forme de réalisation, le polypeptide fragment peut être représenté par la formule :

X-hML (7-151)-Y où hML (7-151) représente la séquence d'aminoacides de la TPO humaine (hML) de Cys à Cysl51 inclus ; X représente le groupe amino de Cys7 ou encore un ou plusieurs des résidus d'aminoacides amino-terminaux du hML mature ou encore des prolongements de résidus d'aminoacides à ce dernier, tels que Met, Tyr ou des séquences de tête contenant par exemple des sites de clivage protéolytiques (par exemple le facteur Xa ou la thrombine) ; et Y représente le groupe carboxyterminal de CysS ou encore un ou plusieurs résidus d'aminoacides carboxy-terminaux du hML mature ou de prolongements de ce dernier.

De manière facultative, le polypeptide ligand pour le mpl ou un fragment de ce dernier peut être fusionné à un polypeptide hétérologue (chimère). Un polypeptide hétérologue préféré est une cytokine, un facteur stimulant des colonies ou l'interleukine ou encore un fragment de
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cette dernière, en particulier un ligand ^kit (KL), IL-1, IL-3, IL-6, IL-11, EPO, GM-CSF ou LIF. Un polypeptide hétérologue éventuel préféré est une chaîne d'immunoglobuline, en particulier IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IGA, IgE, IgD, IgM humaines ou un fragment de ces dernières, comprenant en particulier le domaine constant d'une chaîne lourde de IgG.

Un autre aspect de la présente invention est de procurer une composition comprenant un agoniste isolé du mpl qui est biologiquement actif et qui est de préférence capable de stimuler l'incorporation de nucléotides marqués (par exemple 3H-thymidine) dans l'ADN de cellules Ba/F3 dépendantes de IL-3 transfectées avec le mpl d'un être humain. Eventuellement, l'agoniste du mpl est le ligand pour le mpl biologiquement actif et il est de préférence capable

de stimuler l'incorporation de 35S dans des plaquettes circulantes dans une détermination du rebond plaquettaire chez la souris (mouse platelet rebound assay). Un agoniste du mpl approprié englobe hML153, hML (R153A, R154A), hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML et pML2 ou les fragments de ces derniers.

Dans une autre forme de réalisation, la présente invention procure un anticorps isolé capable de se lier au ligand pour le mpl. L'anticorps isolé capable de se lier au ligand pour le mpl peut éventuellement être fusionné à un second polypeptide et l'anticorps ou la fusion de ce dernier peut être utilisé pour isoler et purifier le ligand pour le mpl à partir d'une source telle que décrite ci-dessus pour le mpl immobilisé. Dans un autre aspect de la présente forme de réalisation, l'invention procure un procédé pour détecter le ligand pour le mpl in vitro ou in vivo, comprenant la mise en contact de l'anticorps avec un échantillon, en particulier un échantillon de sérum que l'on suspecte de contenir le ligand, et la détection permettant de voir si la liaison a eu lieu.

Dans d'autres formes de réalisation encore, l'invention procure une molécule isolée d'acide nucléique encodant le ligand pour le mpl ou des fragments de ce dernier, ladite molécule d'acide nucléique pouvant éventuellement être marquée avec une fraction détectable, ainsi qu'une molécule d'acide nucléique possédant une séquence qui est complémentaire à une molécule d'acide nucléique possédant une séquence encodant un ligand pour le mpl ou qui s'hybride à cette dernière dans des conditions modérées à extrêmement sévères ("stringentes"). Les molécules d'acides nucléiques préférées sont celles encodant le ligand pour le mpl d'un être humain, d'un porcin et d'un muridé, et englobent l'ARN et l'ADN tous deux génomiques,

ainsi que l'ADNc. Dans un

autre aspect de la présente invention, la molécule d'acide nucléique est l'ADN encodant le ligand pour le mpl et comprend, en outre, un vecteur réplicable dans lequel l'ADN est lié de manière fonctionnelle pour commander la séquence reconnue par un hôte transformé avec le vecteur.

Eventuellement, l'ADN est l'ADNc dont la séquence procurée en figure 1 est 5'-3' (SEQ ID NO : 2), 3'-5'ou un fragment de cette dernière. Cet aspect englobe, en outre, des cellules hôtes, de préférence des cellules CHO transformées avec le vecteur, ainsi qu'un procédé d'utilisation de l'ADN pour réaliser la production du ligand pour le mpl, de préférence comprenant l'expression de l'ADNc encodant le ligand pour le mpl dans une culture des cellules hôtes transformées et la récupération du ligand pour le mpl par rapport aux cellules hôtes ou à la culture de cellules hôtes. Le ligand pour le mpl préparé de cette manière est de préférence le ligand pour le mpl d'un être humain.

L'invention englobe, en outre, un procédé pour traiter un mammifère manifestant un trouble hématopoïétique, en particulier la thrombocytopénie, comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un ligand pour le mpl au mammifère. Eventuellement, le ligand pour le mpl est administré en combinaison avec une cytokine, en particulier un facteur amplificateur de colonies ou l'interleukine. Des facteurs préférés stimulant des colonies ou encore des interleukines préférées englobent : le ligand kit (KL), LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-3, IL-6 et IL-11.

L'invention englobe, en outre, un procédé pour isoler et purifier la TPO (ML) à partir d'un micro-organisme producteur de TPO, comprenant :

(1) le fait de rompre ou de lyser les cellules contenant la TPO, (2) le fait d'éventuellement séparer la matière soluble de la matière insoluble que contient la
TPO, (3) le fait de solubiliser la TPO dans la matière insoluble avec un tampon de solubilisation, (4) le fait de séparer la TPO solubilisée par rapport aux autres matières solubles et insolubles, (5) le fait de remettre en plis (refolding) la TPO dans un tampon rédox, et (6) le fait de séparer la TPO remise en plis de manière appropriée de la TPO mal remise en plis.

Le procédé procure la solubilisation de la TPO contenant une matière insoluble avec un agent chaotropique, ce dernier étant choisi parmi un sel de guanidine, le thiocyanate. de sodium ou l'urée. Le procédé prévoit, en outre, de séparer la TPO solubilisée par rapport au reste de la matière soluble et insoluble à l'intervention d'une ou de plusieurs étapes choisies parmi la centrifugation, la filtration sur gel et la chromatographie en phase réverse.

L'étape de remise en plis (refolding) du procédé prévoit un tampon rédox contenant à la fois un agent oxydant et un agent réducteur. En général, l'agent oxydant est l'oxygène ou un composé contenant au moins une liaison disulfure et l'agent réducteur est un composé contenant au moins un groupe sulfhydryle libre. De préférence, l'agent d'oxydation est choisi parmi le glutathion oxydé (GSSG) et la cystine, et l'agent de réduction est choisi parmi le glutathion réduit (GSH) et la cystéine. De manière de loin préférée, l'agent d'oxydation est le glutathion oxydé (GSSG) et l'agent de réduction est le glutathion réduit (GSH). Il est également préféré que le rapport molaire de l'agent d'oxydation soit égal ou supérieur à celui de l'agent de

réduction.

Le tampon rédox contient, en outre, un détergent de préférence choisi parmi CHAPS ou CHAPSO, présent en une quantité d'au moins 1%. Le tampon rédox contient, en outre, du NaCl, de préférence dans un domaine de concentration d'environ 0,1 à 0,5 M et du glycérol, de préférence en une concentration supérieure à 15%. Le pH du tampon rédox se situe de préférence dans le domaine d'environ 7,5 à 9,0 et l'étape de remise en plis est réalisée à 4 pendant 12-48 heures. L'étape de remise en plis procure une TPO biologiquement active dans laquelle une liaison disulfure est formée entre l'aminoacide Cys le plus proche de la terminaison amino avec l'aminoacide Cys le plus proche de la terminaison carboxyle du domaine EPO.

L'invention englobe, en outre, un procédé pour purifier la TPO biologiquement active à partir d'un micro-organisme comprenant : (1) le fait de lyser au moins la membrane extracellulaire du micro-organisme, (2) le fait de traiter le lysat contenant la TPO avec un agent chaotropique, (3) le fait de remettre en plis (refolding) la TPO et (4) le fait de séparer les impuretés et la TPO mal remise en plis par rapport à la TPO remise en plis de manière appropriée.

BREVE DESCRIPTION DES FIGURES La figure 1 représente la séquence d'aminoacides déduite (SEQ ID NO : 1) de l'ADNc du ligand pour le mpl d'un être humain (hML), ainsi que la séquence nucléotidique de codage (SEQ ID NO : 2). Les nucléotides sont numérotés au début de chaque ligne. Les régions 5'et 3'non traduites sont indiquées en lettres minuscules. Les résidus d'aminoacides sont numérotés au-dessus de la séquence en partant de Ser 1

de la séquence protéinique du ligand pour le mpl mature (ML). Les limites de l'exon 3 présumé sont indiquées par les flèches et les sites potentiels de N-glycosylation sont entourés d'un rectangle. Les résidus de cystéine sont indiqués par un point au-dessus de la séquence.

La séquence soulignée correspond à la séquence N-terminale déterminée à
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partir du ligand pour le mpl purifié à partir de plasma de p porcin.

La figure 2 représente le procédé utilisé pour le dosage d'incorporation du ligand pour le mpl par la 3H-thymidine. Pour déterminer la présence du ligand pour le mpl à partir de diverses sources, on prive de IL-3 les cellules Ba/F3 du mpl P pendant 24 heures dans un incubateur humidifié à 37 C dans du e02 (5%) et à l'air. Suite à la privation de IL-3, on étale les cellules dans des boîtes de cultures à 96 puits avec ou sans échantillons dilués et on cultive pendant 24 heures dans un incubateur de culture cellulaire. On ajoute, à chaque puits, pendant les dernières 6-8 heures, 20 pl de milieux RPMI exempts de sérum contenant 1 pli de 3H- thymidine.

On récolte alors les cellules sur des plaques filtrantes à 96 puits et on les lave avec de l'eau. Ensuite, on quantifie les filtres.

La figure 3 représente l'effet de la pronase, du DTT et de la chaleur sur l'aptitude manifestée par APP à stimuler la prolifération des cellules Ba/F3 -mpl. Pour la digestion de APP par la pronase, on couple de la pronase (Boehringer Mannheim) ou de l'albumine de sérum bovin à Affi-gellO (Biorad) et on incube individuellement avec APP pendant 18 heures à 37 C. Par la suite, on élimine les résines par centrifugation et on analyse les produits surnageants. On
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chauffe également APP à 80 C pendant 4 minutes ou bien on porte DTT à 100 MM, puis on procède à une dialyse contre PBS.

La figure 4 représente l'élution de l'agent actif du ligand pour le mpl à partir de colonnes Phényl-Toyopearl, BlueSépharose et Ultralink-mpl.

Les fractions 4-8 provenant de la colonne d'affinité au mpl représentent les fractions maximales d'agent actif éluées de la colonne.

La figure 5 représente le SDS-PAGE des fractions de Ultralink-mpl éluées. A 200 gl de chaque fraction 2-8, on ajoute 1 ml d'acétone contenant HCl 1 mM à-20 C. Après 3 heures à-20 C, on centrifuge les échantillons et on lave les pastilles résultantes deux fois avec de l'acétone à
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- 20 C. On dissout, par la suite, les pastilles traitées à l'acétone dans 30 gl d'un tampon de solubilisation SDS, on porte le DTT à 100 J. LM et on chauffe à 900C pendant 5 minutes. On "résout" ensuite les échantillons sur un gel SDS-polyacrylamide (4-20%) et on visualise les protéines par coloration à l'argent.

La figure 6 représente l'élution de l'agent actif du ligand pour le mpl à partir de CDS-PAGE. On"résout"la fraction Cys provenant de la colonne manifestant une affinité pour le mpl sur du gel SDS-polyacrylamide (4-20%) dans des conditions de non-réduction. Après électrophorèse, on découpe le gel en tranches pour obtenir 12 régions égales et on soumet à une électro-élution, comme décrit dans les exemples. On dialyse dans PBS les échantillons ayant subi une électro-élution et on dose à une dilution 1/20. Les valeurs Mr utilisées pour calibrer le gel sont des normes Novex Mark 12.

La figure 7 représente l'effet de APP appauvri en ligand pour le mpl en faisant passer 1 ml par-dessus une colonne de 1 ml manifestant une affinité pour le mpl (700 jig de mpl- IgG/ml de NHS-superose, Pharmacia). On porte la teneur en APP des cultures des cellules souches périphériques humaines

à 10% ou à une teneur en APP appauvri en ligand pour le mpl de 10% et on cultive pendant 12 jours. On quantifie la mégacaryocytopoièse, comme décrit dans les exemples.

La figure 8 représente l'effet de mpl-IgG sur la stimulation de la mégacaryocytopoièse humaine par APP. On porte à 10% la teneur en APP des cultures des cellules souches périphériques humaines et on cultive pendant 12 jours. Aux jours 0,2 et 4, on ajoute mpl-IgG (0,5 gg) ou ANP-R-IgG
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(0, 5 mg). auprès 12 jours, on quantifie la mégacaryocytopoièse, comme décrit dans les exemples. On reporte la moyenne des échantillons dupliqués sur un graphique, les données réelles des duplicats étant indiquées entre parenthèses.

La figure 9 représente les deux brins d'un fragment de 390 pb de l'ADN génomique humain encodant le ligand pour le mpl. On représente la séquence d'acides amino déduite de "exon 3" (SEQ ID NO : 3), la séquence de codage (SEQ ID NO : 4) et son complément (SEQ ID NO : 5).

La figure 10 représente la séquence d'aminoacides déduite du ligand pour le mpl mature d'un être humain (hML) (SEQ ID NO : 6) et de l'êrythropoiétine humaine mature (hEPO) (SEQ ID NO : 7). La séquence d'aminoacides prédite pour le ligand pour le mpl d'un être humain est disposée en alignement avec la séquence d'érythropoiétine humaine. Des aminoacides identiques sont entourés d'un rectangle et on insère des brèches pour un alignement optimal, qui sont indiquées par des points. Les sites potentiels de N-glycosylation sont soulignés d'un trait plein pour le hML et d'un trait interrompu pour la hEPO. Les deux cystéines importantes pour l'agent actif de l'êrythropoiétine sont indiquées par un gros point.

La figure 11 représente la séquence d'aminoacides déduites d'isoformes du ligand pour le mpl mature d'un être humain, hML (SEQ ID NO : 6), hML2 (SEQ ID NO : 8), hML3 (SEQ ID NO : 9) et hML4 (SEQ ID NO : 10). Des aminoacides identiques sont entourés d'un rectangle et on introduit des brèches pour obtenir un alignement optimal, qui sont indiquées par des points.

Les figures 12A, 12B et 12C représentent l'effet du ligand pour le mpl d'un être humain sur la prolifération des cellules Ba/F3-mpl (A), la mégacaryocytopoïèse humaine in vitro quantifiée en utilisant un anticorps monoclonal radiomarqué IgG de muridé spécifique pour la glycoprotéine des mégacaryocytes GPIIbIIIa (B), et la thrombopoïèse de muridé mesurée dans un détermination du rebond plaquettaire (C).

Des cellules (293) ont été transfectées par le procédé au CaP04 (Gorman, C in DNA Cloning : A New Approach 2 : 143- 190 [1985]) avec le vecteur pRK5 seul, avec pRK5-hML ou avec pRK5-ML153 pendant une nuit (on génère pRK5-ML153 en introduisant un codon d'arrêt après le résidu 153 du hML par PCR). On conditionne alors les milieux pendant 36 heures et on les analyse pour détecter la stimulation de la prolifération cellulaire de Ba/F3-mpl, comme décrit dans l'exemple 1 (A) ou de la megacaryocytopoïèse humaine in vitro (B).

On quantifie la megacaryocytopoïèse en utilisant un anticorps monoclonal IgG de muridé radiomarqué par 125r (HP1-1D) à la glycoprotéine spécifique aux mégacaryocytes GPIIbIIIa, comme décrit (Grant et collaborateurs, Blood 69 : 1334-1339 [1987]). On détermine l'effet du recombinant ML partiellement purifié (rML) sur la production de plaquettes in vivo (C) en utilisant le dosage de la thrombocytose par rebond décrit par McDonald, T. P. Proc. Soc. Exp. Biol. Med.

144 : 1006-10012 (1973). On prépare le rML partiellement

purifié à partir de 200 ml de milieux conditionnés contenant le Ml recombinant. On fait passer les milieux à travers une colonne Blue-Sépharose de 2 ml équilibrée dans PBS et on lave la colonne avec PBS et on l'élue avec PBS contenant 2M respectivement d'urée et de NaCl. On dialyse la fraction active dans PBS et on porte à 1 mg/ml avec du BSA exempt d'endotoxine. L'échantillon contient moins d'une unité d'endotoxine/ml. On injecte aux souris, soit 64.000, soit 32.000 ou encore 16.000 unités de rML ou bien l'excipient seul. Chaque groupe est constitué par six souris. On représente la moyenne et l'écart-type pour chaque groupe.

Les valeurs p sont déterminées par le test de T à 2 extrémités en comparant les médianes.

La figure 13 compare l'effet d'isoformes et de variants du ligand pour le mpl d'un être humain dans le dosage de la prolifération des cellules Ba/F3 -mpl. On dose hML, mock, hML2, hML3, hML (R153A, R154A) et hML153 à diverses dilutions, comme décrit à l'exemple 1.

Les figures 14 A à E représentent la séquence d'aminoacides déduite (SEQ ID NO : 1) du ligand pour le mpl d'un être humain hML ou de la TPO humaine (hTPO), ainsi que la séquence de codage de l'ADN génomique humain (SEQ ID NO : 11). Les nucléotides et les résidus d'aminoacides sont numérotés au début de chaque ligne.

La figure 15 représente un SDS-PAGE de 293-rhML332 purifié et de 293-rhML153 purifié.

La figure 16 représente la séquence nucléotidique : la séquence de codage d'ADNc (SEQ ID NO : 12) et d'aminoacides déduite (SEQ ID NO : 13) du cadre de lecture ouvert d'un isoforme de ML de muridé. Cet isoforme du ligand pour le mpl mature de muridé contient 331 résidus d'aminoacides, quatre

en moins par rapport au mML putatif de longueur totale, et il est, par conséquent, désigné par l'abréviation mML2. Les nucléotides sont numérotés au début de chaque ligne. Les résidus d'aminoacides sont numérotés au-dessus de la séquence en commençant par Ser 1. Les sites potentiels de Nglycosylation sont soulignés. Les résidus de cystéine sont indiqués par un point au-dessus de la séquence.

La figure 17 représente la séquence d'ADNc (SEQ ID NO : 14) et la séquence protéinique prédite (SEQ ID NO : 15) de cet isoforme du ML de muridé (mML). Les nucléotides sont numérotés au début de chaque ligne. Les résidus d'aminoacides sont numérotés au-dessus de la séquence en commençant par Ser 1. Cet isoforme du ligand pour le mpl mature de muridé contient 335 résidus d'aminoacides et il est considéré comme étant le ligand pour le mpl de longueur totale, désigné par l'abréviation mML. La séquence signal est indiquée par un soulignement en pointillé et l'endroit de clivage éventuel est désigné par une flèche. Les régions 5'et 3'non traduites sont indiquées par des minuscules.

Les deux délétions résultant d'un épissage donné en variante (mML2 et mML3) sont soulignées. Les quatre résidus de cystéine sont indiqués par un point. Les sept sites potentiels de N-glycosylation sont entourés d'un rectangle.

En figure 18, on compare la séquence d'aminoacides déduite de l'isoforme du ML d'un être humain (hML3) (SEQ ID NO : 9) et un isoforme du ML de muridé désigné par l'abréviation mML3 (SEQ ID NO : 16). La séquence d'aminoacides prédite pour le ligand pour le mpl d'un être humain est disposée en alignement avec la séquence du ligand pour le mpl de muridé.

Les aminoacides identiques sont entourés d'un rectangle et on introduit des brèches pour obtenir un alignement optimal, qui sont désignées par des points. Les aminoacides sont numérotés au début de chaque ligne.

En figure 19, on compare les séquences d'aminoacides prédites d'isoformes de ML mature provenant de ML de souris (SEQ ID NO : 17), de ML de porcin (SEQ ID NO : 18) et de ML d'un être humain (SEQ ID NO : 6). Les séquences d'aminoacides sont alignées avec des brèches indiquées par des points introduites pour obtenir un alignement optimal. Les aminoacides sont numérotés au début de chaque ligne, des résidus identiques étant entourés d'un rectangle. Les sites potentiels de N-glycosylation sont indiqués par un rectangle ombré et les résidus de cystéine sont désignés par un point. Le motif d'aminoacides dibasiques conservé, qui présente un site potentiel de clivage de protéase, est souligné. La délétion de quatre aminoacides, qui s'est produite dans l'ensemble des trois espèces (ML2), est soulignée par un rectangle en trait épais.

La figure 20 représente la séquence d'ADNc (SEQ ID NO : 19) et la séquence prédite de protéines mature (SEQ ID NO : 18) d'un isoforme du ML de porcin (pML). Cet isoforme du ligand pour le mpl de porcin contient 332 résidus d'aminoacides et est considéré comme étant le ligand pour le mpl de porcin de longueur totale désigné par l'abréviation pML. Les nucléotides sont numérotés au début de chaque ligne. Les résidus d'aminoacides sont numérotés au-dessus de la séquence en commençant par Ser 1.

La figure 21 représente la séquence d'ADNc (SEQ ID NO : 20) et la séquence prédite de protéines mature (SEQ ID NO : 21) d'un isoforme du ML de porcin (pML2). Cet isoforme du ligand pour le mpl de porcin contient 328 résidus d'aminoacides et est une forme du ligand pour le mpl de porcin de longueur totale présentant une délétion de quatre résidus, désignée par l'abréviation pLM2. Les nucléotides sont numérotés au début de chaque ligne. Les résidus d'aminoacides sont numérotés au-dessus de la séquence en partant de Ser 1.

En figure 22, on compare la séquence déduite d'aminoacides de l'isoforme du ML de porcin de longueur totale, pML (SEQ ID NO : 18) et un isoforme du ML de porcin désigné par pML2 (SEQ ID NO : 21). La séquence d'aminoacides prédites pour le pML est alignée avec la séquence pML2. Les aminoacides identiques sont entourés d'un rectangle et les brèches introduites pour obtenir un alignement optimal sont indiquées par des points. Les aminoacides sont numérotés au début de chaque ligne.

La figure 23 représente les caractéristiques pertinentes du plasmide pSVI5. ID. LL. MLORF ("longueur totale"ou TPOgg utilisé pour transfecter les cellules hôtes CHO-DP12 pour la production de CHO-rhTPO- La figure 24 représente les caractéristiques pertinentes du plasmide pSVI5. ID. LL. MLEPO-D ("tronqué"ou TPOis) utilisé pour transfecter les cellules hôtes CHO-DP12 pour la production de CHO-rhTPO153.

Les figures 25A, 25B et 25C indiquent l'effet de E. colirhTPO (Met-1, 153) sur les plaquettes (A), sur les érythrocytes (B), et (C) sur les leucocytes de souris normales. Deux groupes de six souris femelles C57 B6 ont reçu une injection quotidienne, soit avec le tampon PBS, soit avec 3,0 gg de E. coli-rhTPO (Met-1, 153) (100 jul sc-)Au jour 0 et aux jours 3-7, on prélève 40 te. de sang dans le sinus orbital. On dilue immédiatement le sang dans 10 ml d'un diluant disponible dans le commerce et on obtient la numération globulaire sur un"Serrono Baker Hematology Analyzer 9018". Les données sont présentées comme moyennes l'écart-type de la moyenne.

Les figures 26A, 26B et 26C indiquent l'effet de E. colirhTPO (Met-1, 153) sur les plaquettes (A), sur les cellules du sang (B) et (C) sur des leucocytes chez des souris ayant subi une irradiation subléthale. On a soumis deux groupes de dix souris femelles C57 B6 à une irradiation subléthale avec 750 cGy de rayons gamma provenant d'une source 137Cs et elles ont reçu une injection quotidienne, soit avec le tampon PBS, soit avec 3,0 Mg de E. coli-rhTPO (Met-1, 153) (100 tl sc.). Au jour 0 et à des moments intermédiaires ultérieurs, on prélève 40 gl de sang dans le sinus orbital.

On dilue immédiatement le sang dans 10 ml d'un diluant disponible dans le commerce et on obtient la numération globulaire sur un"Serrono Baker Hematology Analyzer 9018".

Les données sont présentées comme moyennes i l'écart-type de la moyenne.

Les figures 27A, 27B et 27C indiquent l'effet de CHOrhTP0332 sur les plaquettes (thrombocytes) (A), sur les hématies (érythrocytes) (B) et (C) sur les leucocytes de souris normales. On soumet deux groupes de six souris femelles C57 B6 à une injection quotidienne, soit avec le tampon PBS, soit avec 0,3 Mg de CHO-rhTPO (100 cl se.). Au jour 0 et aux jours 3-7, on prélève 40 lit de sang du sinus orbital. On dilue immédiatement le sang dans 10 ml d'un diluant disponible dans le commerce et on obtient la numération globulaire sur un"Serrono Baker Hematology Analyzer 9018". Les données sont présentées comme moyennes I l'écart-type de la moyenne.

La figure 28 représente les courbes de réponse à la dose pour différentes formes de rhTPO obtenues à partir des diverses lignées cellulaires. Ces courbes de réponse ont été construites par rapport à rhTPO à partir des lignées cellulaires ci-après : hTP0332 de CHO (longueur totale des cellules ovariennes de hamsters chinois) ; hTPOMet-1 153

(forme tronquée dérivée de E. coli avec une forme de méthionine N-terminale) ; hTP0332 (TPO de longueur totale provenant de cellules 293 humaines) ; Met-moins 155 E-coli (la forme tronquée [rhTPOigg] sans la méthionine terminale de E-coli). Des groupes de six souris femelles C57B6 reçoivent une injection quotidienne pendant 7 jours avec rhTPO en fonction du groupe.

Chaque jour, on prélève 40 Al de sang du sinus orbital pour obtenir la numération globulaire. Les données présentées ci-dessus concernent les effets maximaux que l'on peut voir avec les divers traitements et, à l'exception de (met 153 E-coli), ils apparaissent au jour 7 du traitement. Dans le groupe"met 153 E-coli"susmentionné, l'effet maximal a été détecté au jour 5. Les données sont présentées comme moyenne écarttype de la moyenne.

La figure 29 représente les courbes de réponse à la dose comparant l'agent actif des formes de longueur totale et "découpées"de hTPO produites dans des cellules CHO avec celui de la forme tronquée de E. coli. Des groupes de six souris femelles C57B6 reçoivent une injection quotidienne de 0,3 jug de rhTPO de divers types. Aux jours 2-7, on prélève
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40 l de sang dans le sinus orbital pour la numération globulaire.

Les groupes de traitement sont Topo, la forme de TPO tronquée de E. coli ; TP0332 (fraction mixte), TPO de longueur totale contenant approximativement 80-90% de la longueur totale et 10-20% de formes découpées ; TP0332 (fraction 30K) = fraction découpée et purifiée provenant de la préparation originale"mixte" ; TPOg (fraction 70K) = fraction TPO purifiée de longueur totale provenant de la préparation originale"mixte". Les données sont présentées comme moyennes ¯ écart-type de la moyenne.

La figure 30 est un schéma représentant le dosage KIRA ELISA pour mesurer la TPO.

Dans le dessin, on représente le chimère MPL/Rse. gD et les parties pertinentes des récepteurs parentaux, ainsi que le produit de construction final (portion droite de la figure) et un schéma logique (portion gauche de la figure) représentant les étapes pertinentes du dosage.

La figure 31 est un schéma logique pour le dosage KIRA ELISA représentant chaque étape du procédé.

Les figures 32A-32Z5 procurent la séquence nucléotidique (SEQ ID NO : 22) du vecteur d'expression pSVI17. ID. LL utilisé pour l'expression de Rse. gD dans l'exemple 17.

La figure 33 est une représentation schématique de la
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préparation du plasmide pMP1. r La figure 34 est une représentation schématique de la préparation du plasmide pMP21.

La figure 35 est une représentation schématique de la préparation du plasmide pMP151.

La figure 36 est une représentation schématique de la préparation du plasmide pMP202.

La figure 37 est une représentation schématique de la préparation du plasmide pMP172.

La figure 38 est une représentation schématique de la préparation du plasmide pMP210.

La figure 39 est un tableau des cinq meilleurs clones TPO d'expression provenant de la banque du plasmide pMP210 (SEQ ID NOS : 23,24, 25,26, 27 et 28).

La figure 40 est une représentation schématique de la préparation du plasmide pMP41.

La figure 41 est une représentation schématique de la préparation du plasmide pMP57.

La figure 42 est une représentation schématique de la préparation du plasmide pMP251.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION 1. Définitions
En général, les mots, les expressions ci-après ont la définition indiquée lorsqu'on les utilise dans la description dans les exemples et dans les revendications.

"Agent chaotropique"désigne un composé qui, en solution aqueuse et dans des concentrations appropriées, peut provoquer un changement dans la configuration spatiale ou dans la conformation d'une protéine en supprimant au moins partiellement les forces responsables du maintien des structures secondaire et tertiaire normales de la protéine.

De tels composés englobent, par exemple, l'urée, la guanidine-HCl et le thiocyanate de sodium. Les concentrations élevées, habituellement 4-9M, de ces composés sont normalement requises pour exercer l'effet conforme sur les protéines.

"Cytokines"est un terme générique pour des protéines libérées par une population cellulaire, qui agissent sur d'autres cellules à titre de médiateurs intercellulaires.

Des exemples de telles cytokines sont les lymphokines, les monokines et les hormones polypeptidiques traditionnelles.

Font partie des cytokines, l'hormone de croissance, les facteurs de croissance analogues à l'insuline, l'hormone de croissance humaine, l'hormone de croissance humaine Nméthionylée, l'hormone de croissance bovine, l'hormone parathyroïde, la thyroxine, l'insuline, la pro-insuline, la relaxine, la prorelaxine, les hormones glycoprotéiniques, ainsi que les hormones stimulant les follicules (FSH), l'hormone stimulant la thyroïde (TSH) et l'hormone lutéinisante (LH), le facteur de croissance hématopoïétique, le facteur de croissance hépatique, le facteur de croissance des fibroblastes, la prolactine, le lactogène placentaire, le facteur a de la nécrose tumorale (TNF-a et TNF-ss), la substance :

j. nhibitrice mullérienne, les peptides associés à la gonadotrophine de souris, l'inhibine, l'activine, le facteur de croissance endothélial vasculaire, l'intégrine, les facteurs de croissance des nerfs tels que NGF-P, les facteurs de croissance des plaquettes, les facteurs de croissance de transformation (TGF) tels que TGF-a et TGF-P, les facteurs I et II de croissance analogues à l'insuline, l'érythropoïétine (EPO), les facteurs oestéo-inductifs, les interférons tels que l'interféron a, ss et y, les facteurs stimulant des colonies (CSF) tels que le CSF de macrophages (M-CSF), le CSF de granulocytes macrophages (GM-CSF) et le CSF de granulocytes (G-CSF), les interleukines (IL) telles que IL-1, IL-la, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9,

IL-11, IL-12, ainsi que d'autres facteurs polypeptidiques, y compris LIF, SCF et le ligand"kit". Tels qu'utilisés ici, les termes que l'on vient de citer sont destinés à englober les protéines provenant de sources naturelles ou de cultures cellulaires recombinantes. De

même, les termes sont destinés à englober des équivalents biologiquement actifs, par exemple qui diffèrent dans la séquence aminoacides de un ou plusieurs aminoacides ou quant au type de l'étendue de la glycosylation.

Les expressions, ligand pour le mpl" (de l'anglais "mpl
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ligand"),"polypeptide ligand pour le mpl","ML", "thrombopolétine"ou"TPO"sont utilisés de manière interchangeable ici et comprennent n'importe quels polypeptides qui possèdent la propriété de liaison au mpl, un membre de la super-famille des récepteurs des cytokines, et possédant une propriété biologique du ML, telle que définie ci-dessous. Une propriété biologique donnée à titre d'exemple est l'aptitude à stimuler l'incorporation de nucléotides marqués (par exemple 3H-thymidine) dans l'ADN de cellules Ba/F3 dépendantes de IL-3 transfectées avec le mpl P d'un être humain.

Une autre propriété biologique donnée à titre d'exemple est l'aptitude à stimuler l'incorporation de 35S dans des plaquettes circulantes dans une détermination du rebond plaquettaire chez la souris (mouse platelet rebound assay). Cette définition englobe le polypeptide isolé d'une source du ligand pour le mpl, tel que le plasma d'un porcin aplasique décrit ici ou d'une autre source telle que d'autres espèces animales, y compris humaines, ou préparé par des procédés recombinants ou de synthèse et englobe des formes variantes, y compris des dérivés fonctionnels, des fragments, des allèles, des isoformes et des analogues de ces derniers.

Un"fragment du ligand pour le mpl"ou"un fragment de la TPO"est une portion d'une séquence de TPO ou du ligand pour le mpl mature de longueur totale existant naturellement, dans laquelle on a procédé à la délétion d'un ou de plusieurs résidus d'aminoacides ou unités carbohydrates. Le ou les résidus d'aminoacides ayant subi

une délétion peuvent exister n'importe où dans le peptide, y compris, soit à l'extrémité N-terminale, soit à l'extrémité C-terminale, ou encore à l'intérieur. Le fragment partagera au moins une propriété biologique en commun avec le ligand pour le mpl.

Des fragments du ligand pour le mpl posséderont spécifiquement une séquence successive d'au moins 10,15, 20,25, 30 ou 40 résidus d'aminoacides qui sont identiques à ceux des séquences du ligand pour le mpl isolé d'un mammifère, y compris le ligand isolé du plasma d'un porcin aplasique ou du ligand d'un être humain ou d'un muridé, en particulier de son domaine EPO. Des exemples représentatifs
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de fragments N-terminaux sont hML153 ou TPO (Met-11-153).

L'expression variants du ligand pour le mpl"ou "variants de la séquence du ligand pour le mpl"telle que définie ici désigne un ligand pour le mpl biologiquement actif tel que défini ci-dessous, possédant une identité de séquence inférieure à 100% à celle du ligand pour le mpl isolé de la culture de cellules recombinantes ou du plasma de porcins aplasiques ou encore du ligand d'un être humain possédant la séquence déduite décrite en figure 1 (SEQ ID NO : 1).

Ordinairement, un variant biologiquement actif du ligand pour le mpl possédera une séquence d'aminoacides possédant au moins environ 70% d'identité de séquence d'aminoacides avec celle du ligand pour le mpl isolé du plasma de porcins aplasiques ou du ligand mature de muridés ou d'êtres humains ou encore de fragments de ces derniers (voir figure 1 (SEQ ID NO : 1), de préférence au moins environ 70%, de manière plus préférée au moins environ 80%, de manière encore plus préférée au moins environ 85%, de manière toujours plus préférée au moins environ 90%, de manière de loin préférée au moins environ 95%.

Un"ligand chimère pour le mpl"est un polypeptide comprenant un ligand pour le mpl de longueur totale ou bien un ou plusieurs fragments de ce dernier fusionnés ou liés à un second polypeptide hétérologue ou encore à un ou plusieurs fragments de ce dernier. Le chimère possédera au moins une propriété biologique en commun avec le ligand pour le mpl. Le second polypeptide sera spécifiquement une cytokine, une immunoglobuline ou un fragment de ces
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v dernières.

Les expressions"ligand pour le mpl isolé", "ligand pour le mpl fortement purifié"et"ligand pour le mpl essentiellement homogène sont utilisées de manière interchangeable et désignent un ligand pour le mpl qui a été purifié à partir d'une source de ligand pour le mpl ou qui a été préparé par des procédés recombinants ou synthétiques et qui est essentiellement exempt d'autres peptides ou protéines (1) pour obtenir au moins 15, de préférence 20 résidus d'aminoacides de la séquence N-terminale ou d'une séquence interne d'aminoacides en utilisant un séquenceur à cupule rotative ou encore le meilleur séquenceur d'aminoacides disponible dans le commerce, tel que mis sur le marché ou tel que modifié par des procédés publiés à la date de dépôt de la présente demande, ou (2) à des fins d'homogénéité,

par SDS-PAGE dans des conditions non réductrices ou réductrices en utilisant du bleu de Coomassie ou de préférence une coloration à l'argent. L'homogénéité désigne ici une contamination inférieure à environ 5% avec d'autres protéines sources.

Lorsqu'on utilise l'expression"propriété biologique" conjointement, soit avec le"ligand pour le mpl"ou"le ligand pour le mpl isolé", cela signifie qu'il possède un agent à activité thrombopoïétique ou qu'il possède une fonction ou un agent actif effecteur ou antigène in vivo qui

est directement ou indirectement provoquée ou mise en oeuvre par un ligand pour le mpl (qu'il soit dans sa conformation naturelle ou dénaturée) ou par un fragment de ce dernier.

Les fonctions effectrices englobent la liaison au mpl et n'importe quel agent actif de liaison à un support, n'importe quel agonisme ou antagonisme du mpl, en particulier la transduction d'un signal prolifératif englobant la réplication, la fonction régulatrice de l'ADN, la modulation de l'activité biologique d'autres cytokines, l'activation de récepteurs (en particulier des cytokines), la désactivation, la régulation vers le haut ou vers le bas, la croissance ou la différenciation cellulaire et analogues.

Une fonction antigène désigne la possession d'un site épitope ou antigénique qui est capable de réaliser une réaction croisée avec des anticorps dressés contre le ligand naturel pour le mpl. La fonction antigénique principale d'un polypeptide ligand pour le mpl réside dans le fait qu'il se lie avec une affinité d'au moins environ 106 l/mole à un anticorps dressé contre le ligand pour le mpl isolé du plasma d'un porcin aplasique. Ordinairement, le polypeptide se lie avec une affinité d'au moins environ 107 litres/mole. De manière de loin préférée, le polypeptide ligand pour le mpl à activité antigénique est un polypeptide qui se lie à l'anticorps dressé contre le ligand pour le mpl possédant une des fonctions effectrices décrites ci-dessus.

Les anticorps utilisés pour définir l'l'activité biologique"sont des anticorps polyclonaux de lapin dressés par formulation du ligand pour le mpl isolé à partir d'une culture de cellules recombinantes ou de plasma d'un porcin aplasique dans un adjuvant complet de Freund, en injectant la formulation par voie sous-cutanée et en amplifiant la réponse immune par injection intrapéritonéale de la formulation jusqu'à ce que le titre de l'anticorps du ligand pour le mpl se trouve en plateau.

L'expression"biologiquement actif", lorsqu'on l'utilise conjointement, soit avec le, ligand pour le mpl", soit avec le, ligand pour le mpl isolé", désigne un ligand ou un polypeptide pour le mpl qui manifeste une activité thrombopoïétique ou qui partage une fonction effectrice du ligand pour le mpl isolé du plasma d'un porcin aplasique ou exprimé dans une culture cellulaire recombinante décrite ici. Une fonction effectrice principale connue du ligand ou du polypeptide pour le mpl, en l'occurrence, concerne la liaison au mpl et la stimulation de l'incorporation de nucléotides marqués (3H-thymidine) dans l'ADN de cellules Ba/F3 dépendant de IL-3 transfectées avec le mpl P d'un être humain.

Une autre fonction effectrice connue du ligand ou du polypeptide pour le mpl, en l'occurrence, concerne l'aptitude à stimuler l'incorporation de 35S dans des plaquettes circulantes dans une détermination du rebond plaquettaire chez la souris. Toutefois, une autre fonction effectrice connue du ligand ou du polypeptide pour le mpl concerne l'aptitude à stimuler la mégacaryocytopoïèse humaine in vitro, qui peut être quantifiée en utilisant un anticorps monoclonal radiomarqué spécifique à la glycoprotéine GPIIbIIIa des mégacaryocytes.

L'expression"pour cent d'identité de la séquence d'aminoacides"par rapport à la séquence du ligand pour le mpl est définie ici comme étant le pourcentage de résidus d'aminoacides dans la séquence candidate, qui sont identiques aux résidus dans la séquence du ligand pour le mpl isolé du plasma d'un porcin aplasique ou du ligand d'un muridé ou d'un être humain possédant la séquence d'aminoacides déduite, décrite en figure 1 (SEQ ID NO : 1) après alignement des séquences et introduction des brèches, si nécessaire, pour obtenir l'identité séquentielle maximale en pour cent et en ne considérant aucune substitution de conservation comme faisant partie de l'identité de

séquences.

Aucune extension, délétion ou insertion Nterminale, C-terminale ou interne dans la séquence du ligand pour le mpl ne doit être considérée comme affectant l'identité ou l'homologie de la séquence. Ainsi, des polypeptides ligands pour le mpl biologiquement actifs donnés à titre d'exemple sont considérés comme possédant des séquences identiques et englobent le ligand pour le préprompl, le ligand pour le pro-mpl et le ligand pour le mpl mature.
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On peut réaliser le"microséquençage du ligand pour le mpl"par nimporte quel procédé classique approprié pourvu que le procédé soit suffisamment sensible. Dans un tel procédé, on séquence directement un polypeptide à purification élevée obtenu à partir de gels SDS ou à partir d'une étape HPLC finale à l'intervention d'une dégradation automatique de Edman (isothiocyanate de phényle) en utilisant un séquenceur en phase gazeuse de Applied Biosystems, modèle 470A équipé d'un analyseur d'aminoacides 120A à la phénylthiohydantoine (PTH).

En outre, des fragments du ligand pour le mpl préparé par digestion chimique (par exemple CNBr, hydroxylamine, 2-nitro-5thiocyanobenzoate) ou enzymatique (par exemple trypsine, clostripaine, protéase staphylocoque, suivie d'une purification fragmentaire (par exemple, HPLC) peuvent être séquencées de manière similaire. Des aminoacides PTH sont analysés en utilisant le système de données ChromPerfect (Justice Innovations, Palo Alto, CA). L'interprétation de la séquence est réalisée sur un ordinateur VAX 11/785 de Digital Equipment Co., comme décrit par Henzel et collaborateurs, J.

Chromatography, 404 : 41-52 [1987]. De manière facultative, on peut soumettre des quantités aliquotes de fractions HPLC à une électrophorèse sur SDSPAGE (5-20%), à un électrotransfert, à une membrane PVDF (ProBlott, AIB, Foster City, CA) et à une coloration avec du

bleu"Coomassie Brilliant" (Matsurdiara, J. Biol. Chem., 262 : 10035-10038 [1987]. Une protéine spécifique identifiée par la coloration est excisée du buvard et on effectue le séquençage N-terminal avec le séquenceur en phase gazeuse décrit ci-dessus.

Pour les séquences protéiniques internes, on sèche les fractions HPLC sous vide (SpeedVac), on les remet en suspension dans des tampons appropriés et on les met à digérer avec du bromure de cyanogène, l'enzyme Lys-C spécifique à Lys (WAko Chemicals, Richmond, VA) ou avec AspN (Boehringer, Mannheim, Indianapolis, IN). Après digestion, on procède au séquençage des peptides résultants sous forme de mélange ou après dédoublement HPLC sur une colonne C4 développée avec un gradient de propanol dans du TFA (0, 1%) avant de passer au séquençage en phase gazeuse.

La"thrombocytopénie"est définie comme correspondant à une numération plaquettaire inférieure à 150 x 109 par litre de sang.

L'inactivité thrombopoïétique" est définie comme étant l'activité biologique qui consiste à accélérer la prolifération, la différenciation et/ou la maturation de mégacaryocytes ou de précurseurs des mégacaryocytes pour obtenir la forme productrice de plaquettes de ces cellules.

Cette activité peut être mesurée dans différents dosages englobant une détermination synthétique in vivo du rebond plaquettaire chez la souris, un dosage d'induction d'antigènes de surface cellulaire des plaquettes (induction of platelet cell surface antigen assay), tel que mesuré par un immunodosage anti-plaquettaire (anti-GPIIbIIIa) pour une lignée cellulaire mégacaryoblastique de la leucémie humaine (CMK), et l'induction d'une polyploïdisation dans une lignée cellulaire mégacaryoblastique (DAMI).

La"thrombopoïétine" (TPO) est désignée comme étant un composé possédant une activité thrombopoïétique ou qui est capable d'augmenter le nombre des plaquettes sériques chez un mammifère. La TPO est de préférence capable d'augmenter le nombre des plaquettes endogènes d'au moins 10%, de manière plus préférée de 50%, de manière de loin préférée est capable d'élever la numération plaquettaire chez un être humain à une valeur supérieure à 150 x 109/litre de sang.

L'expression"acide nucléique isolé du ligand pour le mpl"est l'ARN ou l'ADN contenant plus de 16, de préférence 20 ou plus de bases nucléotidiques séquentielles qui encodent le ligand pour le mpl biologiquement actif ou encore un fragment de ce dernier, qui est complémentaire à l'ARN ou l'ADN ou qui s'hybride à l'ARN ou à l'ADN et qui reste lié de manière stable dans des conditions modérées à sévères. Cet ARN ou cet ADN est exempt d'au moins un acide nucléique source contaminant avec lequel il est normalement associé dans la source naturelle, de préférence essentiellement exempt de n'importe quel ARN ou ADN d'un autre mammifère.

L'expression"exempt d'au moins un acide nucléique source contaminant avec lequel il est normalement associé"englobe le cas dans lequel l'acide nucléique est présent dans la cellule source ou naturelle, mais se trouve à un autre endroit chromosomique ou est flanqué d'une autre manière par des séquences d'acides nucléiques que l'on ne trouve pas normalement dans la cellule source.

Comme exemples d'acides nucléiques isolés du ligand pour le mpl, on citera l'ARN ou l'ADN qui encode un ligand pour le mpl biologiquement actif partageant au moins 75% de l'identité de séquence, de manière plus préférée au moins 80%, de manière encore plus préférée au moins 85%, de manière toujours plus préférée 90%, de manière de loin préférée 95% de l'identité de séquence avec celle du ligand pour le mpl d'un être humain, d'un muridé ou d'un porcin.

Des"séquences de commande", lorsqu'on se réfère à l'expression, désignent des séquences d'ADN nécessaires pour l'expression d'une séquence de codage à liaison opérationnelle dans un organisme hôte particulier. Les séquences de commande, qui sont appropriées pour les procaryotes, par exemple, englobent un promoteur, éventuellement une séquence d'opérateur, un acide de liaison ribosomique et éventuellement d'autres séquences qui ne sont toujours pas bien comprises aujourd'hui. On sait que les cellules eucaryotes utilisent des promoteurs, des signaux de polyadénylation et des amplificateurs.

L'expression"à liaison fonctionnelle", lorsqu'on s'en réfère à des acides nucléiques, désigne le fait que les acides nucléiques sont placés dans une relation fonctionnelle avec une autre séquence d'acides nucléiques.

Par exemple, l'ADN pour une préséquence ou une tête de séquence sécrétoire est lié de manière opérationnelle à l'ADN pour un polypeptide s'il est exprimé comme préprotéine qui participe à la sécrétion du polypeptide ; un promoteur ou un amplificateur est lié de manière fonctionnelle à une séquence de codage s'il affecte la transcription de la séquence ; ou bien, un site de liaison ribosomique est lié de manière opérationnelle à une séquence de codage s'il est positionné de façon à faciliter la traduction. En général, l'expression, liée de manière fonctionnelle&commat;9 désigne le fait que les séquences d'ADN liées sont contiguës et, dans le cas d'une tête de séquence sécrétoire, contiguës et en phase de lecture.

Toutefois, des amplificateurs ne sont pas nécessairement contigus. La liaison est réalisée par ligation à n'importe quels sites de restriction adéquats. Si de tels sites n'existent pas, on utilise les adaptateurs ou les chaînons oligonucléotidiques synthétiques en accord avec la pratique conventionnelle.

Le terme"exogène", lorsqu'on se réfère à un élément, désigne une séquence d'acides nucléiques qui est étrangère à la cellule, ou bien homologue à la cellule, mais dans une position à l'intérieur de l'acide nucléique de la cellule hôte dans laquelle l'élément ne se trouve pas d'ordinaire.

En l'occurrence, on utilise les termes et expressions "cellule", "lignée cellulaire" et "culture de cellules"de manière interchangeable, et de telles expressions englobent toute la descendance d'une cellule ou d'une lignée cellulaire. Ainsi, par exemple, des termes tels que "transformant"et"cellule transformée"englobent la cellule sujet primaire et les cultures qui en dérivent, sans prendre en compte le nombre de transferts. On comprendra également que toutes les descendances peuvent ne pas être précisément identiques quant à leur teneur en ADN, étant donné des mutations délibérées ou inadvertantes.

Sont incluses, les descendances mutantes qui possèdent la même fonction ou la même activité biologique, telle qu'elle est détectée dans les cellules transformées à l'origine lorsqu'on désire attribuer des définitions distinctes qui se dégageront clairement du contexte.

Des"plasmides"sont des molécules d'ADN circulaire à réplication autonome possédant des origines de réplication indépendantes et sont indiqués ici par la lettre minuscule "p"précédée ou suivie par des lettres majuscules et/ou des chiffres. Les plasmides de départ, en l'occurrence, sont soit disponibles dans le commerce, soit disponibles au public sur une base illimitée, ou bien ils peuvent être construits à partir de plasmides disponibles de ce type conformément à des procédés publiés. En outre, d'autres plasmides équivalents sont connus dans la technique et seront familiers de l'homme de métier ordinaire.

L'expression"digestion par enzymes de restriction", lorsqu'on se réfère à l'ADN, désigne le clivage catalytique de liaisons phosphodiester internes de l'ADN avec une enzyme qui agit uniquement à certains endroits ou sites dans la séquence d'ADN. On appelle de telles enzymes des "endonucléases de restriction". Chaque endonucléase de restriction reconnaît une séquence d'ADN spécifique que l'on appelle un"site de restriction"qui manifeste une double symétrie. Les diverses enzymes de restriction utilisées ici sont disponibles dans le commerce et leurs conditions réactionnelles, leurs cofacteurs et d'autres exigences telles qu'établies par le vendeur de l'enzyme sont utilisés.

On désigne communément les enzymes de restriction par des abréviations composées d'une lettre majuscule, suivie d'autres lettres représentant le micro-organisme pour lequel chaque enzyme de restriction a été obtenue à l'origine et ensuite, un chiffre désignant l'enzyme particulière. En général, on utilise environ 1 ig de plasmide ou de fragment d'ADN avec environ 1-2 unités d'enzyme dans environ 20 pl d'une solution tampon. Des quantités appropriées de tampon et de substrat pour les enzymes de restriction particulières sont spécifiées par le fabricant. L'incubation pendant environ 1 heure à 350C est habituellement utilisée et elle peut varier conformément aux instructions données par le fabricant.

Après incubation, la protéine ou le polypeptide est éliminé par extraction dans du phénol et du chloroforme et l'acide nucléique digéré est récupéré de la fraction aqueuse par récupération dans de l'éthanol. La digestion à l'aide d'une enzyme de restriction peut être suivie d'une hydrolyse bactérienne par alcaline phosphatase des phosphates de terminaison 5'pour empêcher les deux extrémités clivées par restriction du fragment d'ADN de"se circulariser"ou de former une boucle fermée qui empêcherait l'insertion d'un autre fragment d'ADN au site de restriction. Sauf indication contraire, la digestion des

plasmides n'est pas suivie par la déphosphorylation 5' terminale.

Des procédés et des réactifs pour la déphosphorylation sont conventionnels à ceux décrits dans les sections 1.56-1. 61 de Sambrook et collaborateurs, Molecular Cloning : A Laboratory Manual (New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989].

La"récupération"ou l"isolation"d'un fragment donné d'ADN par rapport à un produit de digestion par restriction désigne la séparation du produit de digestion sur du gel de polyacrylamide ou d'agarose par électrophorèse, l'identification du fragment d'intérêt par comparaison de sa mobilité par rapport à celle de fragments d'ADN faisant office de marqueurs ayant un poids moléculaire connu, l'élimination de la section de gel contenant le fragment désiré et la séparation du gel de l'ADN. Ce procédé est connu en général. Par exemple, voir Lawn et collaborateurs, Nucleic Acids Res., 9 : 6103-6114 [1981] et Goeddel et collaborateurs, Nucleic Acids Res., 8 : 4057 [1980].

L'expression"analyse Southern"ou"transfert Southern" est un procédé par lequel on confirme la présence de séquences d'ADN dans un produit de digestion d'ADN ou d'une composition contenant de l'ADN par endonucléase de restriction, par hybridation à un fragment d'ADN ou oligonucléotidique marqué connu. L'analyse Southern implique spécifiquement la séparation électrophorétique de produits de digestion d'ADN sur des gels d'agarose, la dénaturation
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de l'ADN après séparation électrophorétique et le transfert de l'ADN à de la nitrocellulose, du nylon ou n'importe quel autre support membranaire approprié pour l'analyse avec une sonde radiomarquée, biotinylée ou marquée par une enzyme, comme décrit dans les sections 9.37-9. 52 de Sambrook et collaborateurs, supra.

L'expression"Northern analysis"ou"transfert Northern"est un procédé utilisé pour identifier les séquences d'ARN qui s'hybrident à une sonde connue telle qu'un oligonucléotide, un fragment d'ADN, l'ADNc ou un fragment de ces derniers, ou encore un fragment d'ARN. La sonde est marquée avec un radio-isotope tel que 32p ou par biotinylation, ou encore avec une enzyme. L'ARN à analyser est habituellement séparé par électrophorèse sur du gel d'agarose ou de polyacrylamide, transféré à une membrane de nitrocellulose, de nylon ou à n'importe quelle autre membrane appropriée, et hybridé à la sonde en utilisant des procédés classiques bien connus dans la technique, tels que ceux décrits dans les sections 7.39-7. 52 de Sambrook et collaborateurs, supra.

La"ligation"ou"ligature"concerne le procédé de formation de liaisons phosphodiesters entre deux fragments d'acides nucléiques. Pour la ligation des deux fragments, les extrémités des fragments doivent être mutuellement compatibles. Dans certains cas, les extrémités seront directement compatibles après digestion par endonucléase. Toutefois, il peut s'avérer nécessaire de transformer d'abord les extrémités ébréchées communément obtenues après digestion par endonucléase pour obtenir des extrémités franches (blunt ends) pour les rendre compatibles à des fins de ligation.

Pour rendre les extrémités franches, on traite l'ADN dans un tampon approprié pendant au moins 15 minutes à 150C avec environ 10 unités du fragment de Klenow de l'ADN polymérase 1 ou de l'ADN polymérase de T4 en présence des quatre désoxyribonucléotide triphosphates. L'ADN est alors purifié par extraction dans du phénol-chloroforme et par précipitation dans de l'éthanol. Les fragments d'ADN, qui doivent être ligaturés l'un à l'autre, sont mis en solution dans des quantités approximativement équimolaires. La solution contiendra également ATP, un tampon de ligase et

une ligase telle que l'ADN ligase de T4 à environ 10 unités par 0,5 g d'ADN.

Si l'ADN doit être ligaturé dans un vecteur, le vecteur est d'abord linéarisé par digestion avec la ou les endonucléases de restriction appropriées. Le fragment linéarisé est alors traité avec de l'alcaline phosphatase bactérienne ou avec de la phosphatase d'intestin de veau pour empêcher l'autoligation au cours de l'étape de ligation.

La"préparation"de l'ADN à partir de cellules signifie l'isolation d'ADN plasmidique à partir d'une culture des cellules hôtes. Les procédés communément utilisés pour la préparation d'ADN sont les préparations plasmidiques à grande et à petite échelle décrites dans les sections 1.25- 1.33 de Sambrook et collaborateurs, supra. Après préparation de l'ADN, on peut le purifier par des procédés bien connus dans la technique, tels que ceux décrits dans la section 1.40 de Sambrook et collaborateurs, supra.
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Des"oligonuclêotides"sont des polydésoxynucléotides de courte longueur, mono-ou bicaténaires, qui sont synthétisés par voie chimique par des procédés connus (tels que la chimie des phosphotriesters, des phosphites ou des phosphoramidites en utilisant des techniques en phase solide, comme décrit dans le EP 266.032 publié le 4 mai 1988 ou via des produits intermédiaires de désoxynucléosides Hphosphonates, comme décrit par Froehler et collaborateurs, Nucl. Acids Res., 14 : 5399-5407 [1986]). D'autres procédés englobent l'amplification en chaîne par polymérase définie ci-dessus ou encore d'autres procédés à auto-amorçage, ainsi que des synthèses d'oligonucléotides sur des supports solides. Tous ces procédés sont décrits dans Engels et collaborateurs, Agnew. Chem. Int. Ed.

Engl., 28 : 716-734 [1989]. Ces procédés sont utilisés si l'on connaît la séquence globale d'acides nucléiques du gène ou si la

séquence de l'acide nucléique complémentaire au brin de codage est disponible. En variante, si l'on connaît la séquence d'aminoacides cible, on peut inférer les séquences d'acides nucléiques en utilisant des résidus de codage connus et préférés pour chaque résidu d'aminoacides. Les oligonucléotides sont alors purifiés sur des gels de polyacrylamide.

L'"amplification en chaîne par polymérase"ou"PCR" désigne un procédé ou une technique dans laquelle on amplifie des quantités minuscules d'un morceau spécifique d'acide nucléique, d'ARN et/ou d'ADN, comme décrit dans le brevet US 4.683. 195 publié le 28 juillet 1987. En général, l'information séquentielle provenant des extrémités de la région d'intérêt ou au-delà doit être disponible de telle sorte que l'on puisse désigner des amorces oligonucléotidiques ; ces amorces seront identiques ou similaires quant à leur séquence à celles de brins opposés de la matrice à amplifier. Les nucléotides de terminaison 5' des deux amorces peuvent coïncider avec les extrémités de la matière amplifiée.

On peut utiliser la PCR pour amplifier des séquences d'ARN spécifiques, des séquences d'ADN spécifiques par rapport à l'ADN génomique total, ainsi que l'ADNc transcrit à partir d'ARN cellulaire total, des séquences de bactériophages ou de plasmides, etc. Voir, en général, Mullis et collaborateurs, Cold Spring Harbor Symp.

Quant. Biol., 51 : 263 [1987] ; Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989). Telle qu'utilisée ici, la PCR est considérée comme étant un procédé donné en exemple, mais non le seul procédé réactionnel par amplification d'acides nucléiques par polymérase pour amplifier un échantillon d'acides nucléiques pour essai, comprenant l'utilisation d'un acide nucléique connu comme amorce et d'une polymérase d'acide nucléique pour amplifier ou générer un morceau spécifique d'acide nucléique.

L'expression"conditions sévères"désigne celles dans lesquelles (1) on utilise une faible résistance ionique et une température élevée pour le lavage, par exemple NaCl 0,015 M/citrate de sodium O. OO15M/NaDodS04 (SDS) (0, 1%) à 500C ou (2) on emploie, au cours de l'hybridation, un agent de dénaturation tel que le formamide, par exemple du formamide (50%) (volume/volume) avec de l'albumine de sérum bovin (0, l%)/Ficoll (0, l%)/polyvinylpyrrolidone (0, 1%)- /tampon de phosphate de sodium 50 mM à un pH de 6,5 et avec NaCl 750 mM, du citrate de sodium 75 mM à 42 C. Un autre exemple consiste à utiliser du formamide (50%), 5xSSC (NaCl 0,75 M, citrate de sodium 0,075 M), du phosphate de sodium 50 mM (pH 6,8), du pyrophosphate de sodium (0, 1%),

5 x une solution de Denhardt, de l'ADN de sperme de saumon ayant subi un traitement aux ultrasons (50 g/ml), SDS (0, 1%) et sulfate de dextrane (10%) à 420C avec des lavages à 420C dans 0, 2xSSC et SDS (0, 1%).

Des"conditions modérément sévères"sont décrites dans Sambrook et collaborateurs, supra, et englobent l'utilisation de conditions de solution de lavage et d'hybridation (par exemple la température, la résistance ionique et le pourcentage en SDS) moins sévères que celles décrites ci-dessus. Un exemple de conditions modérément sévères sont des conditions telles qu'une incubation pendant une nuit à 370C dans une solution comprenant : formamide (20%), 5xSSC (NaCl 150 mM, citrate trisodique 15 mM), phosphate de sodium 50 mM (pH 7, 6), 5 x solution de Denhardt, sulfate de dextrane (10%) et 20 1/ml d'ADN de sperme de saumon cisaillé dénaturé, l'incubation étant
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suivie d'un lavage des filtres dans 1 x SSC à environ 37- 50 C.

L'homme de métier sera à même de régler la température, la résistance ionique, etc., en fonction des nécessités pour prendre en compte des facteurs tels que la longueur de la sonde et analogues.

Des"anticorps" (Abs) et des "immunoglobulines" (Igs) sont des glycoprotéines possédant les mêmes caractéristiques de structure. Alors que les anticorps manifestent une spécificité de liaison à un antigène spécifique, les immunoglobulines englobent à la fois des anticorps et d'autres molécules analogues à des anticorps, dont la spécificité antigénique fait défaut. Des polypeptides du dernier type sont par exemple produits à des taux peu élevés par le système lymphatique et à des taux élevés par des myélomes.

Des"anticorps et immunoglobulines naturels"sont habituellement des glycoprotéines hétérotétramères d'environ 150.000 daltons composées de deux chaînes légères (L) identiques et de deux chaînes lourdes (H) identiques. Chaque chaîne légère est liée à une chaîne lourde par une liaison disulfure covalente, tandis que le nombre de chaînons disulfure varie entre les chaînes lourdes de différents isotypes d'immunoglobulines. Chaque chaîne lourde et chaque chaîne légère possèdent également des ponts disulfures intrachaînes régulièrement espacés. Chaque chaîne lourde possède à une extrémité, un domaine variable (VH) suivi d'un certain nombre de domaines constants.

Chaque chaîne légère possède un domaine variable à une extrémité (VL) et un domaine constant à son autre extrémité ; le domaine constant de la chaîne légère est en alignement avec le premier domaine constant de la chaîne lourde et le domaine variable de la chaîne légère est en alignement avec le domaine variable de la chaîne lourde. On pense que des résidus d'aminoacides particuliers forment une interface entre les domaines variables des chaînes légères et lourdes (Clothia et collaborateurs, J. Mol. Biol., 186 : 651-663 [1985] ; Novotny et Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 : 4592-4596 [1985]).

Le terme"variable"désigne le fait que certaines portions des domaines variables diffèrent quant à l'étendue de leur séquence parmi les anticorps et sont utilisées dans la liaison et dans la spécificité de chaque anticorps particulier pour son antigène particulier. Toutefois, la variabilité n'est pas distribuée de manière uniforme à travers les domaines variables des anticorps. Elle est concentrée dans trois segments que l'on appelle les régions de détermination de complémentarité (CDR) ou les régions hypervariables, à la fois dans les domaines variables de la chaîne légère et de la chaîne lourde. Des portions à conservation la plus élevée des domaines variables sont appelées le cadre (FR).

Les domaines variables des chaînes lourdes et légères naturelles comprennent chacun quatre régions FR, adoptant, dans une large mesure, une
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configuration en feuille ss, reliée par trois CDR qui forment des boucles reliant la structure en feuille P et, dans certains cas, faisant partie de cette dernière.

Les CDR, dans chaque chaîne, sont maintenues ensemble à proximité étroite par les régions FR et, avec les CDR de l'autre chaîne, contribuent à la formation du site de liaison des anticorps à l'antigène (voir Kabat et collaborateurs, Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, MD [1987]. Les domaines constants ne sont pas directement impliqués dans la liaison d'un anticorps à un antigène, mais ils manifestent différentes fonctions effectrices telles que la participation de l'anticorps dans la toxicité cellulaire dépendant d'un anticorps.

* La digestion d'anticorps à la papaïne produit deux fragments identiques de liaison à des antigènes, que l'on appelle les fragments"Fab", chacun avec un site unique de liaison à l'antigène, et un fragment résiduel"Fc"dont le nom reflète son aptitude à se cristalliser aisément. Un

traitement à la pepsine procure un fragment F (ab') 2 qui possède deux sites de combinaison à des antigènes et qui est toujours capable d'une liaison croisée avec un antigène.

"RV"désigne le fragment d'anticorps minimal qui contient un site complet de reconnaissance et de liaison à un antigène. Cette région consiste en un dimère possédant un domaine variable de chaînes lourdes et un domaine variable de chaînes légères en association étroite non covalente.

C'est dans cette configuration que les trois CDR de chaque domaine variable interagissent pour définir un site de liaison à l'antigène à la surface du dimère VH-VL. De manière collective, les six CDR confèrent à l'anticorps une spécificité de liaison à l'antigène. Toutefois, même un seul domaine variable (ou la moitié d'un Fv comprenant seulement trois CDR spécifiques pour un antigène) a la possibilité de reconnaître un antigène et de s'y lier, bien qu'avec une plus faible affinité que celle manifestée par le site de liaison.

Le fragment Fab contient également le domaine constant de la chaîne légère et le premier domaine constant (CH1) de la chaîne lourde. Des fragments Fab'diffèrent des fragments Fab par l'addition de quelques résidus à la terminaison carboxyle du domaine (CH1) de la chaîne lourde, y compris une ou plusieurs cystéines provenant de la région d'articulation de l'anticorps. Fab'-SH désigne ici un Fab' dans lequel le ou les résidus de cystéine du domaine constant portent un groupe thiol libre. On a produit à l'origine des fragments d'anticorps F (ab') 2 comme paires de fragments Fab'qui possèdent des cystéines articulées entre eux. D'autres couplages chimiques de fragments d'anticorps sont également connus.

Les"chaînes légères"d'anticorps (d'immunoglobulines) de n'importe quelle espèce de vertébrés peuvent être assignées à un des deux types clairement distincts que l'on appelle kappa et lambda en se basant sur les séquences d'aminoacides de leur domaine constant.

En fonction de la séquence d'aminoacides du domaine constant de leurs chaînes lourdes, les immunoglobulines peuvent faire partie de différentes classes. Il existe cinq classes majeures d'immunoglobulines IgA, IgD, IgE, IgG et IgM, et plusieurs de ces dernières peuvent être davantage divisées en sous-classes (isotypes), par exemple IgG-1, IgG- 2, IgG-3 et IgG-4, IgA-1 et IgA-2. Les domaines constants des chaînes lourdes qui correspondent aux différentes classes d'immunoglobulines sont appelés a, delta, epsilon, y et, respectivement. Les structures de sous-unités et les configurations tridimensionnelles des différentes classes d'immunoglobulines sont bien connues.

Le terme"anticorps"est utilisé dans son sens le plus large et recouvre spécifiquement des anticorps monoclonaux uniques (y compris des anticorps agonistes et antagonistes), des compositions d'anticorps à spécificité polyépitopique, ainsi que des fragments d'anticorps (par exemple Fab, F (ab') 2 et Fv) pour autant qu'ils manifestent l'activité biologique désirée.

L'expression"anticorps monoclonal"telle qu'utilisée ici désigne un anticorps obtenu à partir d'une population d'anticorps essentiellement homogènes, c'est-à-dire que les anticorps individuels que comprend la population sont identiques, à l'exception de mutations éventuelles apparaissant naturellement, qui peuvent être présentes dans des quantités mineures. Des anticorps monoclonaux manifestent une spécificité élevée en étant dirigés contre

un seul site antigénique. En outre, contrairement à des préparations d'anticorps conventionnelles (polyclonales) qui englobent spécifiquement différents anticorps dirigés contre différents déterminants (épitopes), chaque anticorps monoclonal est dirigé contre un seul déterminant sur l'antigène.

En plus de leur spécificité, les anticorps monoclonaux sont avantageux en ce qu'ils sont synthétisés par la culture d'hybridomes, en étant non contaminés par d'autres immunoglobulines. Le modificateur"monoclonal" indique le caractère de l'anticorps que l'on obtient à partir d'une population essentiellement homogène d'anticorps et il ne doit pas être considéré comme nécessitant une production de l'anticorps par n'importe quel procédé particulier. Par exemple, les anticorps monoclonaux à utiliser conformément à la présente invention peuvent être préparés par le procédé faisant appel à un hybridome décrit pour la première fois par Kohler et Milstein, Nature, 256 : 495 (1975) ou bien ils peuvent être préparés par des procédés d'ADN recombinant (voir, par exemple le brevet USA-4.816. 567 [Cabilly et collaborateurs]).

Les anticorps monoclonaux indiqués ici englobent spécifiquement des anticorps (immunoglobulines) "chimères" dans lesquels une portion de la chaîne lourde et/ou de la chaîne légère est identique à des séquences correspondantes dans des anticorps ou homologues à ces dernières, qui dérivent d'une espèce particulière ou qui appartiennent à une classe ou à une sous-classe particulière d'anticorps, tandis que le reste de la ou des chaînes est identique à des séquences correspondantes dans des anticorps ou est homogène à ces dernières dérivées d'autres espèces appartenant à d'autres classes ou sous-classes d'anticorps, ainsi que des fragments de tels anticorps, pour autant qu'ils manifestent l'activité biologique désirée (brevet US-A-4.816. 567

[Cabilly et collaborateurs] ;

et Morrison et collaborateurs, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 : 6851-6855 [1984].

Des formes "humanisées" d'anticorps non humains (par exemple, de muridés) sont des immunoglobulines chimères, des chaînes d'immunoglobulines ou des fragments de ces dernières (tels que FV, Fab, Fab', F (ab') 2 ou d'autres sous-séquences d'anticorps se liant à des antigènes) qui contiennent une séquence minimale dérivée d'une immunoglobuline non humaine.

La majeure partie des anticorps "humanisés" sont des immunoglobulines humaines (anticorps receveurs) dans lesquelles des résidus provenant d'une région déterminante complémentaire (CDR) du receveur sont remplacés par des résidus provenant d'un CDR d'une espèce non humaine (anticorps donneurs) telle qu'une souris, un rat ou un lapin, possédant la spécificité, l'affinité et la capacité désirée. Dans certains cas, des résidus à cadre FV de l'immunoglobuline humaine sont remplacés par des résidus non humains correspondants. En outre, un anticorps humanisé peut comprendre des résidus que l'on ne trouve ni dans l'anticorps receveur, ni dans les séquences de cadre ou de CDR importées. Ces modifications sont réalisées pour affiner et optimiser davantage la performance de l'anticorps.

En général, l'anticorps humanisé comprendra essentiellement l'ensemble d'au moins un, et spécifiquement de deux domaines variables dans lesquels l'ensemble ou essentiellement l'ensemble des régions CDR correspondent à celles d'une immunoglobuline non humaine et l'ensemble ou essentiellement l'ensemble des régions FR sont celles d'une séquence consensus d'immunoglobuline humaine. L'anticorps humanisé comprendra également de manière optimale au moins une portion d'une région constante d'immunoglobuline (Fc), spécifiquement celle d'une immunoglobuline humaine. Pour de plus amples détails, voir : Jones et collaborateurs, Nature, 321 : 522-525 [1986] ; Reichmann et collaborateurs, Nature,

332 : 323-329 [1988] et Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2 : 593-596 [1992].

L'expression"non immunogène chez un être humain" désigne le fait que, lors du contact du polypeptide, dans un support pharmaceutiquement acceptable et en une quantité thérapeutiquement efficace, avec le tissu approprié d'un être humain, aucun état de sensibilité ou aucune résistance au polypeptide ne peut être démontré lors de la seconde administration du polypeptide après un temps de latence approprié (par exemple de 8 à 15 jours).

II. Formes de réalisation préférées de l'invention
Des polypeptides préférés de la présente invention sont un ou des polypeptides essentiellement homogènes que l'on désigne par les termes "ligand (s) du emploi ou "thrombopoïétine" (TPO), qui possèdent la propriété de se lier au mpl, un élément de la super-famille des récepteurs des cytokines et possédant la propriété biologique de
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stimuler l'incorporation de nucléotides marqués (3Hthymidine) dans l'ADN de cellules Ba/F3 dépendantes de IL-3 transfectées avec le mpl P d'un être humain.

Un ou des ligands pour le mpl plus préférés sont une ou des protéines de mammifères isolées possédant une activité hématopoïétique, en particulier mégacaryocytopoïétique ou thrombocytopoïétique-notamment qui sont capables de stimuler la prolifération, la maturation et/ou la différenciation de mégacaryocytes immatures ou de leurs prédécesseurs pour obtenir la forme mature productrice de plaquettes. Des polypeptides de loin préférés de la présente invention sont un ou des ligands pour le mpl d'un être humain, y compris des fragments de ces derniers, possédant une activité hématopoïétique mégacaryocyto-poïétique ou thrombopoïétique. Eventuellement, ce ligand ou des ligands

pour le mpl d'êtres humains sont exempts de glycosylation.

D'autres ligands pour le mpl d'un être humain préférés sont le"domaine EPO"du hML désigné par hML153 ou hTPO153, une forme tronquée du hML désignée par hML245 ou hTP0245, ainsi que le polypeptide mature de longueur totale possédant la séquence d'aminoacides représentée en figure 1 (SEQ ID NO : 1) désigné par hML, hML332 ou hTP0332, ainsi que les variants de substitution biologiquement actifs hML (R153A, R154A).

D'autres polypeptides éventuels de la présente invention sont des variants de ligands pour le mpl biologiquement ou immunologiquement actifs choisis parmi hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML et pML2.

D'autres polypeptides préférés de la présente invention sont un ou des variants du ligand pour le mpl biologiquement actifs qui possèdent une séquence d'aminoacides possédant au moins 70% d'identité de séquence d'aminoacides avec celle du ligand pour le mpl d'un être humain (voir Figure 1 [SEQ ID NO : 1]), du ligand pour le mpl de muridé (voir Figure 16 [SEQ ID NO : 12 et 13]), du ligand pour le mpl recombinant de porcin (voir Figure 19 [SEQ ID NO : 18]) ou encore du ligand pour le mpl de porcin isolé du plasma d'un porcin aplasique, de préférence au moins 75%, de manière plus préférée au moins 80%, de manière encore plus préférée au moins 85%, de manière toujours plus préférée au moins 90% et de manière de loin préférée au moins 95%.

Le ligand pour le mpl isolé du plasma d'un porcin aplasique possède les caractéristiques ci-après : (1) on élue le ligand partiellement purifié à partir d'une colonne de filtration sur gel en le faisant passer, soit dans PBS, soit dans PBS contenant SDS (0,1%) ou dans PBS contenant MgCl2 4M avec une valeur Mr de 60. 000-70. 000 ; (2) l'activité du ligand est détruite par la pronase ; (3) le ligand est stable à un pH faible de 2,5, SDS (0,1%) et urée 2M ; (4) le ligand est une glycoprotéine, basé sur sa liaison à une variété de colonnes de lectine ; (5) le ligand très purifié s'élue dans SDS-PAGE non réduit avec une valeur Mr de 25. 000-35. 000.

Des quantités inférieures d'activité s'éluent également avec une valeur Mr de-18. 000-22. 000 et 60.000 : (6) le ligand très purifié se dédouble sur SDS-PAGE réduit, sous forme d'un doublet avec une valeur Mr de 28.000 et de 31.000.

(7) la séquence amino-terminale des bandes 18. 000- 22.000, 28.000 et 31.000 est la même SPAPPACDPRLLNKLLRDDHVLHGR (SEQ ID NO : 29) ; et

(8) le ligand se lie et s'élue à partir des colonnes d'affinité ci-après :
Blue-Sépharose,
CM Blue-Sépharose,
MONO-Q,
MONO-S,
Lentil lectine-Sépharose,
WGA-Sépharose,
Con A-Sépharose,
Ether 650m Toyopearl,
Butyl 650m Toyopearl,
Phényl 650m Toyopearl, et
Phényl-Sépharose
Des polypeptides ligands pour le mpl plus préférés sont ceux encodés par l'ADNc génomique humain possédant une séquence d'aminoacides décrite à la Figure 1 (SEQ ID NO : 1).

D'autres polypeptides ligands pour le mpl biologiquement actifs existant naturellement préférés de la présente invention englobent le ligand pour le prepro-mpl, le ligand pour le pro-mpl, le ligand pour le mpl mature, des fragments du ligand pour le mpl et des variants de glycosylation de ces derniers.

D'autres polypeptides encore préférés de la présente invention englobent des variants et des chimères de séquences du ligand pour le mpl. Ordinairement, des variants et des chimères de la séquence du ligand pour le mpl préféré sont des variants du ligand pour le mpl biologiquement actif, qui possèdent une séquence d'aminoacides possédant une identité de séquence d'aminoacides d'au moins 70% avec celle du ligand pour le mpl d'un être humain ou du ligand pour le mpl isolé du plasma d'un porcin aplasique, de

préférence d'au moins 75%, de manière plus préférée d'au moins 80%, de manière encore plus préférée d'au moins 85%, de manière toujours plus préférée d'au moins 90% et de manière de loin préférée d'au moins 95%.

Un variant du ligand pour le mpl préféré donné à titre d'exemple est un variant hML de domaine N-terminal (que l'on désigne par
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l'expression"domaine EPO"à cause de son homologie de séquence à celle de l'érythropoiétine). Le domaine EPO du hML préféré comprend environ les 153 premiers résidus d'aminoacides du hML mature et est désigné par hML153. Un variant de la séquence du hML éventuellement préféré comprend un variant dans lequel un ou plusieurs des résidus d'aminoacides basiques ou dibasiques dans le domaine Cterminal sont substitués par un ou plusieurs résidus d'aminoacides non basiques (par exemple, hydrophobes, neutres, acides, aromatiques, Gly, Pro et analogues).

Un variant préféré de la séquence du domaine C-terminal du hML comprend un variant dans lequel les résidus Arg 153 et 154 sont remplacés par des résidus Ala. Ce variant est désigné par hML332 (R153A, R154A). Un variant du hML préféré donné en variante comprend, soit hML152, soit hML153 dans lequel les résidus amino 111-114 (QLPP ou LPPQ) ont subi une délétion ou sont remplacés par une séquence tétrapeptidique différente (par exemple, AGAG ou analogues). Les mutants de délétion mentionnés ci-dessus sont désignés par ss4hML332 ou ss4hML153.

Un chimère préféré est une fusion entre un ligand pour le mpl ou un fragment de ce dernier (défini ci-dessous) avec un polypeptide hétérologue ou un fragment de ce dernier. Par exemple, hML153 peut être fusionné à un fragment IgG pour améliorer la demi-vie sérique, ou bien à IL-3, G-CSF ou EPO pour obtenir une molécule possédant une activité thrombopoiétique ou hématopoïétique chimère améliorée.

Un chimère préféré donné en variante du mpl d'un être humain est un"chimère de domaine ML-EPO"qui est constitué par les résidus hML 153 à 157 N-terminaux substitués par un ou plusieurs résidus EPO humains, mais non par tous, alignés de manière approximative comme indiqué en figure 10 (SEQ ID NO : 7). Dans cette forme de réalisation, le chimère hML aurait une longueur approximative de 153-166 résidus, dans lequel des résidus individuels ou en blocs provenant de la séquence EPO humaine sont ajoutés ou substitués dans la séquence hML à des positions correspondant à l'alignement représenté en figure 10 (SEQ ID NO : 6).

Des produits d'insertion de séquences en blocs donnés à titre d'exemple dans la portion N-terminale du hML englobent un ou plusieurs sites de N-glycosylation aux positions (EPO) 24-27,38-40 et 83-85 ; un ou plusieurs des quatre faisceaux amphipathiques a-hélicoïdaux prédits aux positions (EPO) 9-22,59-76, 90- 107 et 132-152 ; ainsi que d'autres régions à conservation élevée englobant les régions N-terminale et C-terminale et les positions de résidus (EPO) 44-52 (voir, par exemple Wen et collaborateurs, Blood, 82 : 1507-1516 [1993] et Boissel et collaborateurs, J. Biol. Chem., 268 (21) : 15983-15993 [1993]). On pense que ce chimère de domaine ML-EPO"possédera une activité biologique thrombopoiétique-érythropoiétique mixte (TEPO).

D'autres polypeptides préférés de la présente invention englobent des fragments du ligand pour le mpl possédant une séquence successive d'au moins 10,15, 20,25, 30 ou 40 résidus d'aminoacides qui sont identiques aux séquences du ligand pour le mpl isolé du plasma d'un porcin aplasique ou du ligand pour le mpl d'un être humain décrit ici (voir par exemple Tableau 14, Exemple 24). Un fragment préféré du ligand pour le mpl d'un être humain est ML [1-X] où X représente 153,164, 191, 205,207, 217,229 ou 245 (voir figure 1 (SEQ ID NO : 1) pour la séquence de résidus 1-X).

D'autres fragments de ligand pour le mpl préférés englobent ceux obtenus comme résultat de l'hydrolyse ou de la digestion chimique ou enzymatique du ligand purifié.

Un autre aspect préféré de l'invention concerne un procédé pour purifier des molécules du ligand pour le mpl, comprenant la mise en contact d'une source du ligand pour le mpl contenant des molécules de ligand pour le mpl, avec un polypeptide récepteur immobilisé, spécifiquement le mpl ou un polypeptide de fusion au mpl dans des conditions dans lesquelles les molécules du ligand pour le mpl purifié sont sélectivement adsorbées sur le polypeptide récepteur immobilisé, le lavage du support immobilisé pour éliminer la matière non adsorbée et l'élution des molécules à des fins de purification par rapport au polypeptide récepteur immobilisé, avec un tampon d'élution. La source contenant le ligand pour le mpl peut être du plasma dans lequel le récepteur immobilisé est de préférence une fusion mpl-IgG.

En variante, la source contenant le ligand pour le mpl est une culture de cellules recombinantes dont la concentration du ligand pour le mpl, soit dans le milieu de culture, soit dans des lysats cellulaires est généralement supérieure à celle que l'on trouve dans le plasma ou dans d'autres sources naturelles. Dans ce cas, le procédé d'immunoaffinité par mpl-IgG décrit ci-dessus, bien qu'il soit toujours utile, n'est habituellement pas nécessaire et on peut appliquer des procédés de purification protéinique plus traditionnels connus dans la technique.

Pour le dire brièvement, le procédé de purification préféré pour procurer un ligand pour le mpl essentiellement homogène comprend : l'élimination des débris particulaires, soit les cellules hôtes, soit les fragments lysés, par exemple par centrifugation ou par ultrafiltration ; éventuellement la protéine peut être concentrée avec un filtre de

concentration protéinique disponible dans le commerce ; ensuite, on sépare le ligand des autres impuretés en le faisant passer par une ou plusieurs étapes choisies parmi :

l'immunoaffinité, l'échange d'ions (par exemple, DEAE ou des matrices contenant des groupes carboxyméthyle ou sulfopropyle), Blue-Sépharose, CM Blue-Sépharose, MONO-Q, MONO-S, lentil lectine-Sépharose, WGA-Sépharose, Con ASépharose, Ether Toyopearl, Butyl Toyopearl, Phényl Toyopearl, Protéine A-Sépharose, SDS-PAGE, HPLC à phase réverse (par exemple gel de silice avec des groupes aliphatiques pendants) ou encore un tamis moléculaire Séphadex ou une chromatographie par exclusion de dimension, ainsi que la précipitation dans de l'éthanol ou dans du sulfate d'ammonium. Un inhibiteur de protéase tel que le fluorure de méthylsulfonyle (PMSF) peut être inclus dans n'importe quelle étape précédente pour inhiber la protéolyse.

Dans une autre forme de réalisation préférée, la présente invention procure un anticorps isolé capable de se lier au ligand pour le mpl. Un anticorps préféré du ligand pour le mpl est monoclonal (Kohler et Milstein, Nature, 256 : 495-497 [1975] ; Campbell, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Burdon et collaborateurs, Eds., volume 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam [1985] ; et Huse et collaborateurs, Science, 246 : 1275-1281 [1989]. Un anticorps isolé préféré du ligand pour le mpl est un anticorps qui se lie au ligand pour le mpl avec une affinité d'au moins environ 106 l/mole.

De manière plus préférée l'anticorps se lie avec une affinité d'au moins environ 107 l/mole. De manière de loin préférée, on dresse l'anticorps contre le ligand pour le mpl possédant une des fonctions effectrices décrites ci-dessus.

L'anticorps isolé capable de se lier au ligand pour le mpl peut éventuellement être fusionné à un second polypeptide et

l'anticorps ou la fusion de ce dernier peut être utilisé pour isoler et purifier le ligand pour le mpl à partir d'une source telle que décrite ci-dessus pour le polypeptide immobilisé pour le mpl. Dans un aspect davantage préféré de la présente forme de réalisation, l'invention procure un procédé pour détecter le ligand pour le mpl in vitro ou in vivo, comprenant la mise en contact de l'anticorps avec un échantillon, en particulier un échantillon de sérum que l'on suspecte de contenir le ligand et on détecte le fait de savoir si la liaison a eu lieu.

Dans d'autres formes de réalisation davantage préférées, l'invention procure une molécule d'acides nucléiques isolée encodant le ligand pour le mpl ou des fragments de ce dernier, ladite molécule d'acide nucléique pouvant être marquée ou non marquée avec une fraction détectable, ainsi qu'une molécule d'acides nucléiques possédant une séquence qui est complémentaire à celle d'une molécule d'acide nucléique possédant une séquence encodant un ligand pour le mpl ou qui s'hybride à cette dernière dans des conditions sévères ou modérément sévères.

Un acide nucléique préféré du ligand pour le mpl est l'ARN ou l'ADN qui encode un ligand pour le mpl biologiquement actif partageant une identité de séquence à concurrence d'au moins 75%, de manière plus préférée d'au moins 80%, de manière encore plus préférée d'au moins 85%, de manière toujours plus préférée de 90% et de manière de loin préférée de 95% avec l'identité de séquence du ligand pour le mpl d'un être humain.

Des molécules d'acides nucléiques isolées plus préférées sont des séquences d'ADN encodant un ligand pour le mpl biologiquement actif choisies parmi : (a) de l'ADN basé sur la région codante d'un gène du ligand pour le mpl d'un mammifère (par exemple, l'ADN comprenant la séquence nucléotidique procurée en figure 1 (SEQ ID NO : 2) ou des fragments de ce dernier) ; (b) de l'ADN capable de s'hybrider

à un ADN de (a) dans des conditions au moins modérément sévères ; et (c) de l'ADN qui est dégénéré pour obtenir un ADN défini dans (a) ou (b) qui provient de la dégénérescence du code génétique.

On envisage que les nouveaux ligands pour le mpl décrits ici sont des membres d'une famille de ligands ou de cytokines possédant une identité de séquence appropriée, de telle sorte que leur ADN peut s'hybrider à l'ADN de la figure 1 (SEQ ID NO : 2) (ou encore au complément ou au fragment de ce dernier) dans des conditions de sévérité faible à modérée. Ainsi, un autre aspect de la présente invention englobe l'ADN qui s'hybride dans des conditions de sévérité faible à modérée avec l'ADN encodant les polypeptides ligands pour le mpl.

Dans une autre forme de réalisation préférée de la présente invention, la molécule d'acide nucléique est l'ADNc encodant le ligand pour le mpl et elle comprend en outre un vecteur réplicable dans lequel l'ADNc est lié de manière fonctionnelle pour commander les séquences reconnues par un hôte transformé avec le vecteur. Cet aspect englobe en outre des cellules hôtes transformées avec le vecteur, ainsi qu'un procédé d'utilisation de l'ADNc pour utiliser la production du ligand pour le mpl, comprenant l'expression de l'ADNc encodant le ligand pour le mpl dans une culture des cellules hôtes transformées et la récupération du ligand pour le mpl à partir de la culture de cellules hôtes. Le ligand pour le mpl préparé de cette manière est de préférence un ligand pour le mpl essentiellement homogène d'un être humain.

Des cellules hôtes préférées pour obtenir le ligand pour le mpl sont les cellules ovariennes du hamster chinois (CHO).

L'invention englobe en outre un procédé préféré pour traiter un mammifère manifestant un trouble immunologique ou hématopoïétique en particulier la thrombocytopénie, comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement

efficace d'un ligand pour le mpl au mammifère. En variante, le ligand pour le mpl est administré en combinaison avec une cytokine, en particulier un vecteur de stimulation de colonies ou l'interleukine. Des facteurs préférés amplificateurs de colonies ou des interleukines préférées englobent : le ligand kit, LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 ou IL-11.

III. Procédés de mise en oeuvre
Certains auteurs ont longtemps pensé que la production de plaquettes était contrôlée par de multiples facteurs humoraux à lignage spécifique. On a fait l'hypothèse que deux activités distinctes des cytokines, que l'on désigne par les termes facteur stimulant des colonies de mégacaryocytes (meg-CSF) et thrombopoiétine, régulent la mégacaryocytopoïèse et la thrombopoïèse (Williams et collaborateurs, J, Cell Physio., 110 : 101-104 [1982] ; Williams et collaborateurs, Blood Cells, 15 : 123-133 [1989] ; et Gordon et collaborateurs, Blood, 80 : 302-307 [1992].

Conformément à cette hypothèse, meg-CSF stimule la prolifération de mégacaryocytes progéniteurs, tandis que la thrombopoiétine affecte principalement la maturation de cellules plus différenciées et, en définitive, la libération des plaquettes. Depuis les années 60, l'induction et l'apparition des deux activités meg-CSF et thrombopoiétine dans le plasma, dans le sérum et dans l'urine d'animaux et d'êtres humains, suite à des épisodes thrombocytopéniques ont été bien documentées (Odell et collaborateurs, Proc.

Soc. Exp. Biol. Med., 108 : 428-431 [1961] ; Nakeff et collaborateurs, Acta Haematol., 54 : 340-344 [1975] ; Specter, Proc. Soc. Exp. Biol., 108 : 146-149 [1961] ; Schreiner et collaborateurs, J. Clin. Invest., 49 : 1709-1713 [1970] ; Ebbe, Blood, 44 : 605-608 [1974] ; Hoffman et collaborateurs, N.

Engl. J. Med., 305 : 533 [1981] ; Straneva et collaborateurs,

Exp, Hemato., 17 : 1122-1127 [1988] ; Mazur et collaborateurs, Exp. Hematol., 13 : 1164 [1985] ; Mazur et collaborateurs, J.

Clin. Invest., 68 : 733-741 [1981] ; Sheiner et collaborateurs, Blood, 56 : 183-188 [1980] ; Hill et collaborateurs, Exp.

Hemato., 20 : 354-360 [1992] ; et Hegyi et collaborateurs, Int. J. Cell Cloning, 8 : 236-244 [1990]). Ces activités ont été rapportées comme étant spécifiques à un lignage et distinctes de cytokines connues (Hill R. J. et collaborateurs, Blood, 80 : 346 (1992) ; Erickson-Miller C. L. et collaborateurs, Brit. J. Haematol., 84 : 197-203 (1993) ; Straneva J. E. et collaborateurs, Exp. Hemato., 20 : 4750 (1992) ; et Tsukada J. et collaborateurs, Blood, 81 : 866-867 [1993]). Jusqu'à présent, des tentatives pour purifier meg-CSF ou la thrombopoïétine à partir du plasma ou de l'urine thrombocytopénique ont échoué.

Dans la ligne des observations ci-dessus décrivant le plasma thrombocytopénique, la demanderesse a trouvé que le plasma d'un porcin aplasique (APP) obtenu à partir de porcs irradiés, stimule la mégacaryocytopoïèse humaine in vitro.

La demanderesse a trouvé que cette activité de stimulation est supprimée par le domaine extracellulaire soluble de cmpl, ce qui confirme le fait que APP est une source potentielle du ligand pour le mpl (ML) putatif. La demanderesse a maintenant réussi à purifier le ligand pour le mpl à partir de APP et a utilisé l'information de la séquence d'aminoacides pour isoler l'ADNc du ML de muridés, de porcins et d'êtres humains. Ces ML possèdent une homologie de séquence avec celle de l'érythropoiêtine et possèdent deux activités analogues à meg-CSF et à la thrombopoïétine.

1. Purification et identification du ligand pour le mpl à partir de plasma
Comme indiqué ci-dessus, le plasma aplasique provenant de diverses espèces a été rapporté comme contenant des activités qui stimulent l'hématopoïèse in vitro ; toutefois, aucun facteur amplificateur hématopoïétique n'a été rapporté antérieurement après avoir été isolé du plasma. Une source de plasma aplasique est celle obtenue à partir de porcs irradiés. Ce plasma de porcins aplasiques (APP) stimule l'hématopoïèse humaine in vitro. Pour déterminer le fait de savoir si APP contient le ligand pour le mpl, on a analysé son effet en mesurant l'incorporation de 3H-thymidine dans des cellules Ba/F3 transfectées avec du mpl P d'un être humain (Ba/F3-mpl) par le procédé indiqué en figure 2.

APP
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stimule l'incorporation de 3H-thymidine dans des cellules Ba/F3 -mpl, mais non dans des cellules de commande Ba/F3 (c'est-à-dire non transfectées avec le mpl P d'un être humain). En outre, aucune activité de ce type n'a été observée dans du plasma de porcin normal. Ces résultats indiquent que APP contient un ou des facteurs qui opèrent la transduction d'un signal prolifératif à travers le récepteur mpl et, par conséquent, pourrait être le ligand naturel pour ce récepteur. Cette idée a été davantage confirmée par la découverte du fait qu'un traitement de APP avec mpl-IgG soluble bloque les effets amplificateurs de APP sur des cellules Ba/F3-mpl.

L'agent actif dans APP s'avère être une protéine, étant donné que la pronase, DTT ou la chaleur détruisent l'agent actif dans APP (figure 3). L'agent actif est également non dialysable. Toutefois, l'agent actif est stable à un pH faible (pH de 2,5 pendant 2 heures) et s'est avéré se lier et s'éluer à partir de diverses colonnes d'affinité contenant de la lectine, indiquant qu'il s'agit d'une

glycoprotéine. Pour élucider davantage la structure et l'identité de cet agent actif, il a été purifié par affinité à partir de APP en utilisant un chimère mpl-IgG.

On traite APP conformément au protocole indiqué dans les exemples 1 et 2. Pour le dire brièvement, on purifie le ligand pour le mpl en utilisant une chromatographie par interaction hydrophobe (HIC), une chromatographie par colorant immobilisé et une chromatographie par affinité au mpl. La découverte de l'agent actif à chaque étape est représentée en figure 4 et le nombre de purifications (purification n fois) est procuré dans le tableau 1. La récupération globale de l'agent actif à travers la colonne d'affinité au mpl est approximativement de 10%. La fraction maximale d'agent actif (F6) à partir de la colonne d'affinité au mpl possède une activité spécifique estimée de 9,8 x 106 unités/mg.

La purification globale à partir de 5 litres de APP est approximativement multipliée par 4 x 106 (0,8 unité/mg à 3,3 x 106 unités/mg) avec une réduction multipliée par 83 x 106 dans la protéine (250 g à 3 gag). La demanderesse estime que l'activité spécifique du ligand élué à partir de la colonne d'affinité au mpl est de-3 x 106 unités/mg.

TABLEAU I Purification du ligand pour le mpl
EMI85.1

<tb>
<tb> Echantillon <SEP> Volume <SEP> Protéine <SEP> Unités/ml <SEP> Unités <SEP> Activité <SEP> Rendement <SEP> Purification
<tb> ml <SEP> mg/ml <SEP> spécifique <SEP> t <SEP> n <SEP> fois
<tb> unités/mg
<tb> APP <SEP> 500 <SEP> 50 <SEP> 40 <SEP> 200.000 <SEP> 0, <SEP> 8-1
<tb> Phényle <SEP> 4700 <SEP> 0,8 <SEP> 40 <SEP> 200.000 <SEP> 50 <SEP> 94 <SEP> 62
<tb> Blue-Sep <SEP> 640 <SEP> 0, <SEP> 93 <SEP> 400 <SEP> 256.000 <SEP> 430 <SEP> 128 <SEP> 538
<tb> mpl <SEP> (fil)
<tb> (Fxns <SEP> 507) <SEP> 12 <SEP> 5x10-4 <SEP> 1666 <SEP> 20.000 <SEP> 3.300.000 <SEP> 10 <SEP> 4.100.000
<tb>
La protéine est déterminée par le dosage de Bradford. La concentration protéinique des fractions 5-7 éluées quant au mpl sont des estimations basées sur l'intensité de coloration d'un gel SDS coloré à l'argent.

Une unité est définie comme étant celle provoquant une stimulation maximale de 50\ de la prolifération des cellules Ba/F3-mpl.

L'analyse des fractions éluées de la colonne d'affinité au mpl par SDS-PAGE (4-20%, gel Novex) réalisée dans des conditions de réduction a révélé la présence de diverses protéines (figure 5). Des protéines qui subissent une coloration à l'argent avec l'intensité la plus forte se sont séparées avec une valeur Mr apparente de 60.000, 55.000, 30.000, 28.000 et 18.000-22. 000. Pour déterminer laquelle parmi ces protéines stimule la prolifération des cultures de cellules Ba/F3-mpl, on a élué les protéines à partir du gel comme décrit à l'exemple 2.

Les résultats de ces expériences montrent que la majeure partie de l'agent actif élué d'une tranche de gel qui englobe des protéines avec une valeur Mr de 28.000- 32.000, un partie moindre de l'agent actif s'éluant dans la région 18.000-22. 000 du gel (figure 6). Les seules protéines visibles dans ces régions possèdent une valeur Mr de 30.000,

28.000 et 18.000-22. 000. Pour identifier et obtenir la séquence protéinique pour la séparation de protéines dans cette région du gel (c'est-à-dire les bandes à 30,28 et 18- 22 kDa), on soumet ces trois protéines à un électrotransfert sur PVDF et à un séquençage comme décrit à l'exemple 3. Les séquences amino-terminales obtenues sont procurées dans le tableau 2.

TABLEAU 2
Séquences amino-terminales du ligand pour le mpl
EMI86.1

<tb>
<tb> 30 <SEP> kDa
<tb> 1 <SEP> 5 <SEP> 10 <SEP> 15 <SEP> 20 <SEP> 25
<tb> (S) <SEP> P <SEP> A <SEP> P <SEP> P <SEP> A <SEP> (C) <SEP> D <SEP> PRLLNKLLRDD <SEP> (H/S) <SEP> V <SEP> L <SEP> H <SEP> (G) <SEP> R <SEP> L <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 30)
<tb> 28 <SEP> kDa
<tb> 1 <SEP> 5 <SEP> 10 <SEP> 15 <SEP> 20 <SEP> 25
<tb> (S)PAPPAXDPRLLNKLLRDD(H)VL(H)GR <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 31)
<tb> 18-22 <SEP> kDa
<tb> 1 <SEP> 5 <SEP> 10
<tb> X <SEP> P <SEP> A <SEP> P <SEP> P <SEP> A <SEP> X <SEP> D <SEP> P <SEP> R <SEP> L <SEP> X <SEP> (N) <SEP> (K) <SEP> (SEO <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 32
<tb>

Une analyse assistée par ordinateur révèle que ces séquences d'aminoacides sont nouvelles.

Etant donné que les trois séquences sont les mêmes, on pense que les protéines de 30 kDa, 28 kDa et 18-22 kDa, sont apparentées et pourraient constituer différentes formes de la même protéine nouvelle. En outre, cette ou ces protéines constituent un candidat vraisemblable à titre de ligand naturel pour le mpl, étant donné l'agent actif séparé sur SDS-PAGE dans la même région (28.000-32. 000) d'un gel (4-20%). En outre, le ligand partiellement purifié migre avec une valeur Mr de 17.000-30. 000 lorsqu'il est soumis à une chromatographie par filtration sur gel en utilisant une colonne Superose 12 (Pharmacia). On pense que les différentes formes Mr du

ligand sont la conséquence de différences de protéolyse ou de glycosylation ou encore sont dues à d'autres modifications suivant ou précédant la traduction.

Comme décrit ci-avant, l'ARN antisens du mpl d'un être humain supprime la mégacaryocytopoièse dans des cultures de moelle osseuse humaine enrichie avec des cellules progénitrices CD34+ sans affecter la différenciation d'autres lignages cellulaires hématopoïétiques (Methia et collaborateurs, supra). Ce résultat suggère que le récepteur mpl pourrait jouer un rôle dans la différenciation et dans la prolifération des mégacaryocytes in vitro. Pour élucider plus avant le rôle joué par le ligand pour le mpl dans la mégacaryocytopoièse, on compare les effets de APP et de APP appauvri en ligand pour le mpl sur la mégacaryocytopoièse humaine in vitro.

On détermine l'effet de APP sur la mégacaryocytopoièse humaine en utilisant une modification du dosage de la mégacaryocytopoièse en suspension liquide décrit à l'exemple 4. Dans ce dosage, on traite des cellules souches périphériques humaines (PSC) avec APP avant et après la chromatographie d'affinité au mpl-IgG. La stimulation par
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GPIIbIIIa de la mégacaryocytopoièse a été quantifiée avec un anticorps 125I-anti-IIbIlla (figure 7). Comme représenté en figure 7, l'APP (10%) a provoqué une stimulation approximativement triple, tandis que APP appauvri en ligand pour le mpl n'a pas d'effet. Il est significatif que APP appauvri en ligand pour le mpl n'a pas induit la prolifération des cellules Ba/F3-mpl.

Dans une autre expérience, le chimère mpl-IgG humain soluble ajouté aux jours 0,2 et 4 à des cultures contenant APP (10%), a neutralisé les effets amplificateurs du APP sur la mégacaryocytopoièse humaine (figure 8). Ces résultats indiquent que le ligand pour le mpl joue un rôle dans la

régulation de la mégacaryocytopoïèse et, par conséquent peut être utile pour le traitement de la thrombocytopénie.

2. Clonage moléculaire du ligand pour le mpl
En se basant sur la séquence d'aminoacides aminoterminale obtenue à partir des protéines de 30 kDa, de 28 kDa et de 18-22 kDa (voir tableau 2 ci-dessus), on conçoit un groupe d'amorces oligonucléotidiques dégénérées et on les utilise pour amplifier l'ADN génomique de porcin par PCR. On fait l'hypothèse que si la séquence d'aminoacides aminoterminale est encodée par un seul exon, le produit PCR correct possédera une longueur escomptée de 69 pb. On détecte un fragment d'ADN de cette dimension et on le soumet à un sous-clonage dans pGEMT. Les séquences des amorces oligonucléotidiques PCR et les trois clones obtenus sont représentés dans l'exemple 5.

La séquence d'aminoacides (PRLLNKLLR [SEQ ID NO : 33]) du peptide encodé entre les amorces PCR est identique à celle obtenue par le séquençage protéinique amino-terminal du ligand de porcin (voir résidus 9-17 pour les séquences protéiniques de porcins de 28 et 30 kDa ci-dessus).

On utilise un oligonucléotide de synthèse basé sur la séquence du fragment PCR pour cribler une bibliothèque d'ADN génomique humain. On conçoit un oligonucléotide 45-mer, désigné par pR45, et on le synthétise en se basant sur la séquence du fragment PCR. Cet oligonucléotide possède la séquence ci-après : 5'GCC-GTG-AAG-GAC-GTG-GTC-GTC-ACG-AAG-CAG-TTT-ATT-TAG-GAG-TCG-3' (SEQ ID NO : 34)

On utilise ce désoxyoligonucléotide pour cribler une bibliothèque d'ADN génomique humain dans À. gem12 dans des conditions de lavage et d'hybridation de faible sévérité, conformément à l'exemple 6. On prélève les clones positifs, on les purifie par plaque et on les analyse par cartographie de restriction et par transfert Southern.

On soumet à un sous-clonage un fragment EcoRI-Xbal de 390 pb hybridé au 45-mer dans pBluescript SK-. Le séquençage d'ADN de ce clone confirme l'isolation de l'ADN encodant l'homologue humain du ligand pour le mpl de porcin. La séquence d'ADN humain et la séquence d'aminoacides déduite sont représentées en figure 9 (SEQ ID NO : 3 & 4). Les positions prédites des introns dans la séquence génomique sont également indiquées par des
EMI89.1
flèches et définissent un exon putatif ("exon 3").

En se basant sur la séquence humaine"exon 3" (exemple 6), on synthétise des oligonucléotides correspondant aux extrémités 3'et 5'de la séquence d'exon. On utilise ces amorces dans des réactions PCR en utilisant comme matrice un ADNc préparé à partir de divers tissus humains. La dimension escomptée du produit PCR correct est de 140 pb. Après analyse des produits PCR sur un gel de polyacrylamide (12%), on détecte un fragment d'ADN ayant la dimension escomptée dans des bibliothèques d'ADNc préparées à partir d'un rein adulte humain, de cellules (293) de rein foetal et d'ADNc préparé à partir de foie foetal humain.

On crible ensuite une bibliothèque d'ADNc de foie foetal (7 x 106 clones) dans kDR2 avec le même oligonucléotide 45-mer utilisé pour cribler la bibliothèque génomique humaine et la bibliothèque d'ADNc de foie foetal dans des conditions d'hybridation de faible sévérité. On prélève des clones positifs, on les purifie par plaque et on détermine la dimension du produit d'insertion par PCR. On sélectionne un clone contenant un produit d'insertion de 1,8 kb pour

l'analyse ultérieure. En utilisant les procédés décrits à l'exemple 7, on obtient le nucléotide et la séquence d'aminoacides déduite du ligand pour le mpl d'un être humain (hML). Ces séquences sont présentées en figure 1 (SEQ ID NO : 1 & 2).

3. Structure du ligand pour le mpl d'un être humain (hML)
La séquence d'ADNc du ligand pour le mpl d'un être humain (hML) (figure 1 [SEQ ID NO : 2]) comprend 1774 nucléotides suivis par une queue poly (A). Elle contient
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215 nucléotides de la séquence 5'non traduite et une région 3'non traduite de 498 nucléotides. Le codon de départ présumé à la position nucléotidique (216-218) se trouve dans une séquence consensus favorable pour le déclenchement de la traduction eucaryotique. Le cadre de lecture ouvert a une longueur de 1059 nucléotides et encode un polypeptide de 353 résidus d'aminoacides en commençant à la position nucléotidique 220. La terminaison N de la séquence d'aminoacides prédite est fortement hydrophobe et correspond probablement à un peptide signal.

L'analyse par ordinateur de la séquence d'aminoacides prédite (von Heijne et collaborateurs, Eur. J. Biochem., 133 : 17-21 [1983]) indique un site de clivage potentiel pour la peptidase signal entre les résidus 21 et 22. Le clivage à cette position générera un polypeptide mature de 332 résidus d'aminoacides commençant avec la séquence amino-terminale obtenue à partir du ligand pour le mpl purifié à partir de plasma de porcin.

Le poids moléculaire prédit non glycosylé du ligand de 332 résidus d'aminoacides est d'environ 38 kDa. On trouve 6 sites potentiels de N-glycosylation et 4 résidus de cystéine.

La comparaison de la séquence du ligand pour le mpl à la base de données de séquences Genbank révèle 23% d'identité entre les 153 résidus amino-terminaux du ligand pour le mpl mature d'un être humain et de l'érythropoïétine humaine (figure 10 [SEQ ID NO 6 & 7]). Lorsqu'on prend en compte les substitutions de conservation, cette région du hML représente une similarité de 50% à celle de l'érythropolétine humaine (hEPO). A la fois, hEPO et hML contiennent 4 cystéines. Trois des 4 cystéines sont conservées dans hML, y compris les première et dernière cystéines. Des expériences de mutagenèse dirigée sur des sites ont montré que les première et dernière cystéines de l'érythropolétine forment une liaison disulfure requise pour la fonction (Wang F.

F. et collaborateurs, Endocrinology, 116 : 2286-2292 [1983]). Par analogie, les première et dernière cystéines du hML peuvent également former une liaison disulfure critique. Aucun site de glycosylation n'est conservé dans hML. Tous les sites potentiels de glycosylation du hML à liaison N sont situés dans la moitié carboxy-terminale du polypeptide hML.

De la même manière que hEPO, l'ARNm du hML ne contient ni la séquence consensus de polyadénylation AAUAAA, ni l'élément régulateur AUUUA présent dans les régions 3'non traduites d'un grand nombre de cytokines et que l'on suppose influencer la stabilité de l'ARNm (Shaw et collaborateurs, Cell, 46 : 659-667 [1986]). L'analyse par transfert Northern révèle de faibles taux d'un transcript d'ARN unique du hML de 1,8 kb dans le foie foetal et adulte. Après une exposition de plus longue durée, on peut détecter une bande plus faible ayant la même dimension dans le rein adulte.

Par comparaison, on exprime l'érythropolétine humaine dans le foie foetal et, en réponse à l'hypoxie, dans le foie et le rein adultes (Jacobs et collaborateurs, Nature, 313 : 804-809

[1985] ; et Bondurant et collaborateurs, Molec. Cell. Biol., 6 : 2731-2733 [1986].

L'importance de la région C-terminale du hML reste à élucider. En se basant sur la présence des six sites potentiels pour la glycosylation à liaison N et sur l'aptitude du ligand à se lier à des colonnes d'affinité de lectine, cette région du hML est vraisemblablement glycosylée. Dans certaines expériences d'élution sur gel, la demanderesse a observé un agent actif qui se sépare avec une mesure Mr autour de 60.000, qui peut représenter la molécule glycosylée de longueur totale. Par conséquent, la région Cterminale peut agir pour stabiliser et augmenter la demi-vie du hML circulant.

Dans le cas de l'érythropoïétine, la forme non glycosylée possède une activité biologique complète in vitro, mais elle possède une demi-vie plasmatique essentiellement réduite par rapport à celle de l'érythropoiétine glycosylée (Takeuchi et collaborateurs, J. Biol. Chem., 265 : 12127-12130 [1990] ; Nahri et collaborateurs, J. Biol. Chem., 266 : 23022-23026 [1991] ; et Spivack et collaborateurs, Blood, 7 : 90-99 [1989]). Le domaine C-terminal du hML contient des séquences d'aminoacides dibasiques (motifs Arg-Arg) aux positions 153- 154 et 245-246 qui pourraient servir de sites de traitement potentiels. Le clivage à ces sites peut être responsable de la génération des formes de 30,28 et 18-22 kDa du ML isolé de APP.

De manière significative, la séquence Argc-Arg apparaît immédiatement après le domaine du ML analogue à l'érythropoïétine. Ces observations indiquent que le ML de longueur totale peut représenter une protéine précurseur qui subit une protéolyse limitée pour générer le ligand mature.

4. Isoformes et variants du ligand pour le mpl d'un être humain
Des isoformes ou des formes épissées données en variante du ligand pour le mpl d'un être humain ont été détectées par PCR dans le foie adulte humain. Pour le dire brièvement, on synthétise des amorces correspondant à chaque extrémité, ainsi que des régions internes sélectionnées de la séquence de codage du hML. On utilise ces amorces dans RT-PCR pour amplifier l'ARN de foie adulte humain, comme décrit à l'exemple 10. En plus de la forme de longueur totale, désignée par hML, on observe ou on déduit trois autres formes désignées par hML2, hML3 et hML4.

Les séquences d'aminoacides matures déduites de l'ensemble des quatre isoformes sont présentées en figure 11 (SEQ ID NO : 6, 8,9 & 10). hML3 possède une délétion de 116 nucléotides à la position 700, qui donne lieu à la fois, à une délétion d'aminoacides et à un décalage de cadre. L'ADNc encode maintenant un polypeptide mature ayant une longueur de 265 aminoacides et qui diverge de la séquence de hML aux résidus d'aminoacides 139. Enfin, hML4 possède à la fois une délétion de 12 nucléotides suite à la position nucléotidique 618 (que l'on trouve également dans les séquences de souris et de porc [voir ci-dessous et la délétion de 116 pb trouvée dans hML3.

Bien que l'on n'ait isolé aucun clone présentant uniquement la délétion de 12 pb (après le nucléotide 619) chez l'être humain (désigné par hML), cette forme est susceptible d'exister, étant donné qu'un tel isoforme a été identifié à la fois chez la souris et chez le porc (voir ci-dessous) et étant donné qu'il a été identifié conjointement avec la délétion de 116 nucléotides dans hML4.

On construit à la fois un variant de substitution du hML dans lequel la séquence dibasique Arg153-Arg154 a été remplacée par deux résidus alanine, ainsi qu'une forme tronquée du"domaine EPO"du hML pour déterminer le fait de savoir si le ML de longueur totale est nécessaire à l'activité biologique. Le variant de substitution à séquence dibasique Arg153-Arg154 désigné par hML (R153A, R154A) a été construit en utilisant PCR comme décrit à l'exemple 10. La forme tronquée du"domaine EPO"hMLg a également été préparée en utilisant PCR par introduction d'un codon d'arrêt après Argy53-
5.

Expression du ligand pour le mpl recombinant d'un être humain (rhML) dans des cellules (293) de rein embryonnaire humain provisoirement transfectées
Pour confirmer le fait que l'ADNc humain cloné a encodé un ligand pour le mpl, on exprime le ligand dans des cellules 293 de mammifère sous le contrôle du promoteur précoce immédiat du cytomégalovirus en utilisant les vecteurs d'expression pRK5-hML ou pRKB-hMLg. Il s'avère que le produit surnageant provenant des cellules 293 de rein embryonnaire humain provisoirement transfectées stimule l'incorporation de 3H-thymidine dans des cellules Ba/F3-mpl, mais non dans les cellules parentales Ba/F3 (figure 12A). Les milieux issus des cellules 293 transfectées avec le vecteur pRK seul ne contiennent pas cet agent actif.

L'addition de mpl-IgG aux milieux supprime la stimulation (données non représentées). Ces résultats indiquent que l'ADNc cloné encode un ML fonctionnel d'un être humain (hML).

Pour déterminer le fait de savoir si le"domaine EPO" seul peut se lier au mpl et l'activer, on exprime la forme tronquée de hML rhML153 dans des cellules 293. Il s'avère que le produit surnageant provenant des cellules transfectées possède un agent actif semblable à celui présent dans le produit surnageant issu des cellules exprimant le hML de longueur totale (figure 12A) ce qui indique que le domaine C-terminal de ML n'est pas requis pour la liaison au c-mpl et pour l'activation de ce dernier.

6. Le ligand pour le mpl stimule la mégacaryocytopoièae et la thrombopoïèse
A la fois, les formes rhML de longueur totale et rhML153 tronquée du hML recombinant stimulent la mégacaryocytopolèse humaine in vitro (figure 12B). Cet effet a été observé en l'absence d'autres facteurs de croissance hématopoïétiques ajoutés par voie exogène.

A l'exception de IL-3, le ML est le seul facteur de croissance hématopoïétique soumis à l'essai qui manifeste cet agent actif. IL-11, IL-6, IL-1, l'érythropoiétine, G-CSF, IL-9, LIF, le ligand kit (KL), M-CSF, OSM et GM-CSF n'ont aucun effet sur la mégacaryocytopoïèse lorsqu'on les soumet à un essai séparé dans l'analyse effectuée par la demanderesse (données non représentées). Ce résultat démontre que ML possède un agent actif stimulant les mégacaryocytes et indique un rôle pour ML dans la régulation de la
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mégacaryocytopoïèse.

On a pu observer que des agents actifs thrombopoïétiques présents dans le plasma d'animaux thrombocytopéniques stimulent la production de plaquettes dans un dosage de thrombocytose rebond prévisible chez la souris (McDonald, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 14 : 1006-1001 [1973] et McDonald et collaborateurs, Scand. Haematol.,

16 : 326-334 [1976]). Dans ce modèle, on fait en sorte que les souris manifestent une thrombocytopénie aiguë en utilisant un sérum anti-plaquettaire spécifique donnant lieu à une thrombocytose rebond prédictive. De telles souris immunothrombocythémiques sont plus sensibles à des agents actifs exogènes analogues à la thrombopoiétine que des souris normales (McDonald, Proc. Soc. Exp. Biol.

Med., 14 : 1006-1001
EMI96.1
[1973]), exactement de la même manière que des souris exhypoxiques sont plus sensibles à l'érythropolétine que des souris normales (McDonald et collaborateurs, J. Lab. Clin. Med., 77 : 134-143 [1971]). Pour déterminer le fait de savoir si rML stimule la production de plaquettes in vivo, on injecte à des souris souffrant de thrombocytose rebond du rhML partiellement purifié. On détermine alors la numération plaquettaire et on quantifie l'incorporation de 35S dans les plaquettes.

L'injection à des souris de 64.000 ou de 32.000 unités de rML augmente de manière significative la production de plaquettes comme manifesté par une
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augmentation de la numération plaquettaire de-20% (p = 0, 0005 et 0, 0001, respectivement) et une augmentation de-40% dans l'incorporation de 35S dans les plaquettes (p = 0, 003) dans les souris traitées par rapport aux souris témoins auxquelles on a injecté un excipient seul (figure 12C). Ce niveau de stimulation est comparable à celui que la demanderesse a observé avec IL-6 dans ce modèle (données non représentées). Le traitement avec 16.000 unités de rML n'a pas stimulé de manière significative la production des plaquettes.

Ces résultats indiquent que ML stimule la production de plaquettes d'une manière dépendant de la dose et, par conséquent, possède une activité analogue à celle de la thrombopoïétine.

On a également transfecté des cellules 293 avec les autres produits de construction isoformes hML décrits cidessus et on a analysé le produit surnageant en utilisant le dosage de prolifération de Ba/F3-mpl (voir figure 13). hML-2 et hML-3 n'ont manifesté aucune quantité détectable d'agent actif dans ce dosage ; toutefois, l'agent actif de hML (R153A, R154A) est similaire à celui de hML et de hML153 indiquant que le traitement aux sites dibasiques Arg153 -Arg154 n'est ni requis pour l'agent actif, ni préjudiciable à ce dernier.

7. Mégacaryocytopoièse et le ligand pour le mpl
On a proposé de réguler la mégacaryocytopoïèse à de multiples taux cellulaires (Williams et collaborateurs, J. Cell. Physio., 110 : 101-104 [1982] et Williams et collaborateurs, Blood Cells, 15 : 123-133 [1989]). Ceci se base en grande partie sur l'observation que certains facteurs de croissance hématopoïétiques stimulent la prolifération de progéniteurs des mégacaryocytes, tandis que d'autres s'avèrent affecter principalement la maturation. Les résultats présentés ici suggèrent que le ML agit à la fois comme facteur de prolifération et de maturation. Le fait que ML stimule la prolifération des progéniteurs des mégacaryocytes est confirmé par plusieurs évidences.

En premier lieu, APP stimule à la fois la prolifération et la maturation de mégacaryocytes humains in vitro et cette stimulation est complètement inhibée par mpl-IgG (figures 7 et 8). En outre, l'inhibition de la formation de colonies de mégacaryocytes par des oligonucléotides anti-sens c-mpl (Methia et collaborateurs, Blood, 82 : 1395-1401 [1993]) et la découverte que c-mpl peut opérer la transduction d'un signal prolifératif dans des cellules dans lesquelles il est transfecté (Skoda et collaborateurs, EMBO, 12 : 2645-2653 [1993] et Vigon et collaborateurs, Oncogene, 8 : 2607-2615 [1993]) indique également que ML stimule la prolifération.

L'expression manifeste de c-mpl au cours de tous les stades de différenciation des mégacaryocytes (Methia et collaborateurs, Blood, 82 : 1395-1401 [1993], ainsi que l'aptitude manifestée par le ML recombinant à stimuler rapidement la production de plaquettes in vivo indique que ML affecte également la maturation. La disponibilité du ML recombinant permet une évaluation minutieuse de son rôle dans la régulation de la megacaryocytopoïèse et dans la thrombopoièse, ainsi que son potentiel pour influencer d'autres lignages hématopoïétiques.

8. Isolation du gène du ligand pour le mpl (TPO) d'un être humain
On isole des clones d'ADN génomique humain du gène pour la TPO par criblage d'une bibliothèque génomique humaine dans gem12 avec pR45 dans des conditions de faible sévérité ou dans des conditions de sévérité élevée avec un fragment correspondant à la moitié 3'de l'ADNc humain codant pour le ligand pour le mpl. On isole deux clones À. se chevauchant et s'étendant sur 35 kb. On soumet à un sous-clonage et à un séquençage 2 fragments se chevauchant BamHI et EcoRI contenant le gène entier pour la TPO (voir figures 14A, 14B 14C, 14D et 14E).

La structure du gène humain est composée de 6 exons à l'intérieur de 7 kb d'ADN génomique. Les limites de toutes les jonctions exon/intron sont conformes aux motifs consensus établis pour les gènes de mammifères (Shapiro
EMI98.1
M. B., et collaborateurs, Nucl. Acids Res., 15 : 7155 [1987]). L'exon 1 et l'exon 2 contiennent la séquence 5'non traduite et les quatre premiers aminoacides du peptide signal. Le reste du signal sécrétoire et les premiers 26 aminoacides de la protéine mature sont encodés à l'intérieur de l'exon 3.
EMI98.2

1 1 Le domaine carboxylique entier et la région 3'non traduite,

ainsi que-50 aminoacides du domaine analogue à celui de l'érythropoiétine sont encodés à l'intérieur de l'exon 6. Les quatre aminoacides impliqués dans la délétion observée à l'intérieur de hML-2 (hTPO-2) sont encodés à l'extrémité 5' de l'exon 6.

L'analyse de l'ADN génomique humain par transfert Southern indique que le gène pour la TPO est présent en une seule copie. La localisation chromosomique du gène a été déterminée par hybridation fluorescente in situ (FISH) qui correspond à la portion du chromosome 3q27-28 sur la carte.

9. Expression et purification de la TPO à partir de cellules 293
La préparation et la purification du ML ou de la TPO à partir de cellules 293 sont décrites en détail à l'exemple 19. Pour le dire brièvement, on obtient l'ADNc correspondant au cadre de lecture complet ouvert de la TPO par PCR en utilisant pRK5-hmplI. On purifie le produit PCR et on le clone entre les sites de restriction Clal et Xbal du plasmide pRK5tknéo (un vecteur dérivé de pRK5 modifié pour exprimer un gène de résistance à la néomycine sous le contrôle du promoteur de la thymidine kinase) pour obtenir le vecteur pRK5tknéo. ORF (un vecteur codant pour le cadre de lecture complet ouvert).

Un second vecteur codant pour le domaine homologue EPO est généré de la même manière, mais en utilisant des amorces PCR différentes pour obtenir le produit de construction final appelé pRK5-tknéoEPO-D.

On transfecte ces deux produits de construction dans des cellules de rein embryonnaire humain par le procédé faisant appel au CaP04, on sélectionne les clones résistant à la néomycine et on les fait croître jusqu'à confluence. On vérifie l'expression de ML153 ou de ML332 dans les milieux conditionnés à partir de ces clones en utilisant le dosage de prolifération de Ba/F3-mpl.

On effectue la purification de rhML332 comme décrit à l'exemple 19. Pour le dire brièvement, on applique des milieux conditionnés par 293-rhML332 sur une colonne BlueSépharose (Pharmacia) que l'on lave ensuite avec un tampon contenant de l'urée 2M. On élue la colonne avec un tampon contenant de l'urée 2M et NaCl 1M. On applique alors directement la récolte d'élution de Blue-Sépharose sur une colonne WGA-Sépharose, on lave avec 10 volumes de colonne d'un tampon contenant de l'urée 2M et NaCl 1M et on élue avec le même tampon contenant de la N-acétyl-D-glucosamine 0, 5M. On applique l'éluat de WGA-Sépharose sur une colonne C4-HPLC (Synchrom, Inc. ) et on élue avec un gradient discontinu de propanol.

Par SDS-PAGE, le 293-rhML332 purifié migre sous forme d'une large bande dans la région de 68-80 kDa du gel (voir figure 15).

On effectue également la purification de rhML153 comme décrit à l'exemple 19. Pour le dire brièvement, on sépare des milieux conditionnés par 293-rhML153 sur Blue-Sépharose comme décrit pour rhML332. On applique l'éluat de BlueSépharose directement sur une colonne d'affinité au mpl comme décrit ci-dessus. On purifie jusqu'à homogénéité le
EMI100.1
rhML] élue de la colonne d'affinité au mpl en utilisant une colonne C4-HPLC mise en service dans les mêmes conditions que celles utilisées pour rhML332. Par SDS-PAGE, le rhML153 purifié se sépare en deux bandes majeures et en

deux bandes mineures avec une Mr de-18. 000-22.000 (voir figure 15).

10. Le ligand pour le mpl de muridé
On obtient un fragment d'ADN correspondant à la région de codage du ligand pour le mpl d'un être humain obtenu par PCR, on le purifie sur gel et on le marque en présence de 32p-dATP et de 32p-dCTP. On utilise cette sonde pour cribler 106 clones d'une bibliothèque d'ADNc de foie de souris dans GTIO. On isole et on séquence un clone de muridé (figure 16 [SEQ ID NO : 12 & 13]) contenant un produit d'insertion de 1443 paires de bases. Le codon d'initiation présumé à la position nucléotidique 138-141 se trouve à l'intérieur d'une séquence de consensus favorable pour le déclenchement de la traduction eucaryotique (Kozak, M. J. Cell.

Biol., 108 : 229- 241 [1989]). Cette séquence définit un cadre de lecture ouvert de 1056 nucléotides qui prédit un produit de traduction primaire de 352 aminoacides. 137 nucléotides de séquence 5'non traduite et 247 nucléotides de séquence 3' non traduite flanquent ce cadre de lecture ouvert. Une queue poly (A) ne suit pas la région 3'non traduite indiquant que le clone est probablement incomplet. La terminaison N de la séquence d'aminoacides prédite est fortement hydrophobe et représente probablement un peptide signal. L'analyse par ordinateur (von Heijne, Eur. J. Biochem., 133 : 17-21 [1983] indique un site de clivage potentiel pour la peptidase signal entre les résidus 21-22.

Un clivage à cette position générerait un polypeptide mature de 331 aminoacides de 35 kDa identifié comme mML331 (ou mML2 pour les motifs décrits ci-dessous). La séquence contient quatre cystéines toutes conservées dans la séquence humaine et sept sites potentiels de N-glycosylation dont cinq sont conservées dans la séquence humaine. A nouveau, comme c'était le cas pour

hML, l'ensemble des six sites potentiels de N-glycosylation sont situés dans la moitié C-terminale de la protéine.

Lorsqu'on compare avec le ML d'un être humain, on observe une identité considérable pour les séquences à la fois nucléotidiques et d'aminoacides déduite dans les "domaines EPO"de ces ML. Toutefois, lorsqu'on aligne les séquences d'aminoacides déduites des ML d'un être humain et de souris, la séquence de souris s'avère posséder une délétion tétrapeptidique entre les résidus 111-114 correspondant à la délétion de 12 nucléotides faisant suite à la position nucléotidique 618 que l'on a vu à la fois dans les ADNc d'êtres humains (voir ci-dessus) et de porcins (voir ci-dessous). En conséquence, on examine des clones supplémentaires pour détecter des isoformes possibles du ML de muridé. Un clone encode un polypeptide possédant une séquence déduite de 335 aminoacides contenant le tétrapeptide LPLQ"manquant".

On pense que cette forme constitue le ML de muridé de longueur totale et on le désigne comme mML ou comme mML335. Les séquences nucléotidiques et d'aminoacides déduites pour mML sont procurées en figure 17 (SEQ ID NO : 14 & 15). Ce clone d'ADNc est constitué par 1443 paires de bases, suivies par une queue poly (A). Il possède un cadre de lecture ouvert de 1068 pb flanqué de 134 bases de la séquence 5'non traduite et de 241 bases de la séquence 3'non traduite. Le codon de départ présumé se situe à la position nucléotidique 138-140. Le cadre de lecture ouvert encode une protection prédite de 356 aminoacides dont les 21 premiers sont fortement hydrophobes et font vraisemblablement office de signal de sécrétion.

Enfin, on isole un troisième clone de muridé, on le séquence et il s'avère contenir la délétion de 116 nucléotides correspondant à celle de hML3. Cet isoforme de muridé est par conséquent désigné par mML3. La comparaison des séquences d'aminoacides déduites de ces deux isoformes est représentée en figure 18 (SEQ ID NO : 9 & 16).

L'identité globale de la séquence d'aminoacides entre le ML d'un être humain et de souris (figure 19 [SEQ ID NO : 6 & 17]) est de 72%, mais cette homologie n'est pas uniformément distribuée. La région définie comme étant le "domaine EPO" (aminoacides 1-153 pour la séquence humaine et 1-149 pour la souris) est mieux conservée (86% d'homologie) que la région carboxy-terminale de la protéine (62% d'homologie). Ceci peut servir d'indication supplémentaire du fait que seul le"domaine EPO"est important pour l'activité biologique de la protéine. Il est intéressant à noter que, des deux motifs dibasiques d'aminoacides trouvés dans hML, seul le motif dibasique suivant immédiatement le "domaine EPO" (position de résidus 153-154) dans la séquence humaine est présent dans la séquence de muridé.

Ceci confirme la possibilité que le ML de longueur totale peut représenter une protéine précurseur qui subit une protéolyse limitée pour générer le ligand mature. En variante, une protéolyse entre Arg153 -Arg154 peut faciliter la clairance du hML.

On transfecte provisoirement un vecteur d'expression contenant la séquence de codage totale du mML dans des cellules 293 comme décrit à l'exemple 1. Des milieux conditionnés provenant de ces cellules stimulent l'incorporation de 3H-thymidine dans des cellules Ba/F3 exprimant, soit le mpl de muridé, soit le mpl d'un être humain, mais n'ont aucun effet sur la lignée cellulaire parentale (moins le mpl). Ceci indique que l'ADNc cloné de

ML de muridé encode un ligand fonctionnel qui est apte à activer à la fois le récepteur ML de muridé et d'un être humain (mpl).

11. Le ligand pour le mpl de porcin
On isole l'ADNc du ML de porcin (pML) par RACE PCR comme décrit à l'exemple 13. On trouve un produit PCR ADNc de 1342 pb dans le rein et on le soumet à un sous-clonage. On séquence plusieurs clones et ils s'avèrent encoder un ligand pour le mpl de porc de 332 résidus d'aminoacides désigné par pML (ou pML332) possédant les séquences de nucléotides et d'aminoacides déduite représentées en figure 20 (SEQ ID NO : 18 & 19).

A nouveau, on identifie une seconde forme désignée par pML2 encodant une protéine avec une délétion de quatre résidus d'aminoacides (228 résidus d'aminoacides) (voir figure 21 [SEQ ID NO : 21]). La comparaison des séquences d'aminoacides pML et pML2 indique que la forme mentionnée en dernier lieu est identique, avec cette exception que le tétrapeptide QLPP correspondant aux résidus 111-114 inclus a subi une délétion (voir figure 22 [SEQ ID NO : 18 & 21]). Les quatre délétions d'aminoacides observées à la fois dans l'ADNc de ML de muridé et de porcin apparaissent exactement à la même position à l'intérieur des protéines prédites.

La comparaison des séquences d'aminoacides prédites du ML mature provenant d'un être humain, d'une souris et d'un porc (figure 19 [SEQ ID NO : 6,17 & 18]) indique que l'identité de séquence globale correspond à 72 pour cent entre la souris et l'être humain, à 68 pour cent entre la souris et le porc, et à 73 pour cent entre le porc et l'être humain. L'homologie est essentiellement supérieure dans la moitié amino-terminale du ML (domaine homologue EPO). Ce

domaine homologue présente une identité de 80 à 84 pour cent entre deux espèces quelles qu'elles soient, tandis que la moitié carboxy-terminale (domaine carbohydrate) présente une identité de seulement 57 à 67 pour cent.

Un motif dibasique d'aminoacides qui pourrait représenter un site de clivage à la protéase est présent à l'extrémité carboxylique du domaine d'homologie de l'érythropoiétine. Le motif est conservé entre les trois espèces à cette position (figure 19 [SEQ ID NO : 6,17 & 18]). Un second site dibasique est présent aux positions 245 et 246 dans la séquence humaine et n'est pas présent dans les séquences de souris ou de porc.

Les séquences ML de muridé et de porc contiennent quatre cystéines toutes conservées dans la séquence humaine. On trouve sept sites potentiels de N-glycosylation dans le ligand de souris et six dans le ML de porcin, dont cinq sont conservés dans la séquence humaine. A nouveau, tous les sites potentiels de N-glycosylation sont situés dans la moitié C-terminale de la protéine.

12. Expression et purification de la TPO à partir de cellules ovariennes de hamster chinois (CHO)
Les vecteurs d'expression utilisés pour transfecter des cellules CHO sont désignés comme suit : pSVI5. ID. LL. MLORF (longueur totale ou TPO332) et pSVI5. ID. LL. MLEPO-D (tronqué ou TPOïc). Les caractéristiques pertinentes de ces plasmides sont présentées dans les figures 23 et 24.

Les procédés de transfection sont décrits à l'exemple 20. Pour le dire brièvement, on obtient par PCR l'ADNc correspondant au cadre de lecture complet ouvert de la TPO.

Le produit PCR est purifié et cloné entre deux sites de restriction (Clal et Sall) du plasmide pSVI5. ID. LL pour obtenir le vecteur pSVI5. ID. LL. MLORF. Un second produit de construction correspondant au domaine homologue EPO est

généré de la même manière, mais en utilisant une amorce réverse différente (EPOD. Sal). Le produit de construction final pour le vecteur codant pour le domaine homologue EPO de la TPO est appelé pSVI5. ID. LL. MLEPO-D.

Ces deux produits de construction sont linéarisés avec Notl et transfectés dans des cellules ovariennes de hamster chinois (cellules CHO-DP12, brevet EP 307.247 publié le 15 mars 1989) par électroporation. On soumet 107 cellules à une électroporation dans un appareil d'électroporation BRL (350 volts, 330 mF, faible capacitance, en présence de 10, 25 ou 50 mg d'ADN comme décrit (Andreason, G. L. J. Tissue Cuit. Meth. 15,56 [1993]). Au lendemain de la transfection, on incise les cellules dans des milieux sélectifs DHFR (DMEM-F12 à teneur élevée en glucose 50 : 50 sans glycine, glutamine 2 mM, sérum de veau foetal dialysé (2-5%)). Dix à quinze jours plus tard, on transfère des colonies individuelles à des boîtes de 96 puits et on les fait croître jusqu'à confluence.

L'expression de ML153 ou ML332 dans les milieux conditionnés à partir de ces clones est confirmée en utilisant le dosage de prolifération de Ba/F3- mpl (décrit à l'exemple 1).

Le procédé pour la purification et l'isolation de la TPO à partir de fluide de culture de cellules CHO récolté est décrit à l'exemple 20. Pour le dire brièvement, on applique du fluide de culture cellulaire récolté (HCCF) sur une colonne Blue-Sépharose (Pharmacia) dans un rapport d'approximativement 100 l de HCCF par litre de résine. On lave alors la colonne avec de 3 à 5 volumes de colonne d'un tampon, puis avec de 3 à 5 volumes de colonne de tampon contenant de l'urée 2, OM. On élue alors la TPO avec de 3 à 5 volumes de colonne d'un tampon contenant à la fois de l'urée 2, OM et du NaCl 1, OM.

On applique ensuite la récolte d'éluat de BlueSépharose contenant de la TPO sur une colonne Sépharose de germes de blé-lectine (Pharmacia) équilibrée dans le tampon d'élution de Blue-Sépharose dans un rapport de 8 à 16 ml d'éluat de Blue-Sépharose par ml de résine. On lave alors la colonne avec de 2 à 3 volumes de colonne de tampon d'équilibration. On élue alors la TPO avec de 2 à 5 volumes de colonne d'un tampon contenant de l'urée 2, OM et de la Nacétyl-D-glucosamine 0,5M.

On acidifie alors l'éluat de germes de blé-lectine contenant la TPO et on ajoute C12E8 pour obtenir une concentration finale de 0, 04%. On applique le regroupement résultant sur une colonne C4 à phase réverse équilibrée dans TFA (0, 1%), C12E8 (0, 04%) à une charge d'approximativement 0,2 à 0,5 mg de protéine par ml de résine.

On élue la protéine dans un gradient linéaire d'acétonitrile à deux phases contenant TFA (0, 1%) et C12E8 (0, 04%) et on récolte, sur base de SDS-PHAGE.

On dilue alors la récolte de C4 et on la soumet à une diafiltration contre approximativement 6 volumes de tampon sur une membrane d'ultrafiltration Amicon YM ou analogues possédant une"section"de poids moléculaire de 10.000 à 30.000 Daltons. On peut alors directement traiter le produit de diafiltration résultant ou bien le concentrer par ultrafiltration. On règle habituellement le produit de diafiltration/concentration pour obtenir une concentration finale de Tween 80 de 0, 01%.

On applique alors sur une colonne Séphacryl S-300 HR (Pharmacia) équilibrée dans un tampon contenant Tween 20 (0, 01%), la totalité ou une portion du produit de diafiltration/concentration équivalent à 2-5% du volume de

colonne calculé et on chromatographie. Les fractions contenant la TPO, qui sont exemptes d'agrégats et de produits de dégradation protéolytique sont alors regroupées sur la base de SDS-PAGE. On filtre le regroupement résultant et on entrepose à 2-8 C.

13. Procédés pour transformer et induire la synthèse de la TPO dans un micro-organisme, et isolation, purification et remise en plis de la TPO préparée dans ces derniers
La construction des vecteurs d'expression E. coli TPO est décrite en détail dans l'exemple 21. Pour le dire brièvement, les plasmides pMP21, pMP151, pMP41, pMP57 et pMP202 sont tous conçus pour exprimer les 155 premiers aminoacides de la TPO en aval d'une petite séquence de tête qui varie parmi les différents produits de construction. Les séquences de tête ont principalement pour tâche le déclenchement de la traduction de niveau élevé et la purification rapide.

Les plasmides pMP210-1, pMP210-T8, pMP210-21, pMP210-22, pMP210-24, pMP210-25 sont conçus pour exprimer les 153 premiers aminoacides de la TPO en aval d'une méthionine d'initiation et diffèrent uniquement dans l'usage du codon pour lés 6 premiers aminoacides de la TPO, tandis que le plasmide pMP251 est un dérivé de pMP210-1 dans lequel l'extrémité carboxy-terminale de la TPO est prolongée par 2 aminoacides. Tous les plasmides décrits ci-dessus produiront des taux élevés d'expression intracellulaire dans E. coli suite à l'induction du promoteur du tryptophane (Yansura, D. G. et collaborateurs Methods in Enzymology (Goeddel, D. V. Ed. ) 185 : 54-60, Academic Press, San Diego [1990]).

Les plasmides pMPl et pMP172 sont des produits intermédiaires intervenant dans la construction des plasmides d'expression intracellulaires de la TPO indiqués ci-dessus.

On utilise les plasmides d'expression de la TPO indiqués ci-dessus pour transformer E. coli en utilisant le procédé de choc thermique au CaCl2 (Mandel, M. et collaborateurs J. Mol. Biol., 53 : 159-162 [1970]), ainsi que d'autres procédés décrits à l'exemple 21. Pour le dire brièvement, on fait croître les cellules transformées, d'abord à 370C jusqu'à ce que la densité optique (600 nm) de la culture atteigne approximativement 2-3. On dilue ensuite la culture et, après croissance avec aération, on ajoute de l'acide. On laisse alors la culture poursuivre sa croissance en procurant une aération pendant 15 heures supplémentaires, après quoi on récolte les cellules par centrifugation.

Les procédés d'isolation, de purification et de remise en plis donnés ci-dessous pour la production de la TPO humaine remise en plis biologiquement active ou de fragments de cette dernière sont décrits dans les exemples 22 et 23 et peuvent être appliqués pour la récupération de n'importe quel variant de la TPO, y compris les formes N-et Cterminales remises en plis.

D'autres procédés appropriés pour la remise en plis de la TPO recombinante ou synthétique peuvent être trouvés dans les brevets ci-après : Builder et collaborateurs, brevet US-A-4.511. 502, Jones et collaborateurs, brevet US-A-4.512. 922, Olson, brevet US-A- 4.518. 526 et Builder et collaborateurs, brevet US-A- 4.620. 948, pour une description générale du processus de récupération et de remise en plis pour une variété de protéines recombinantes exprimées dans une forme insoluble dans E. coli.

A. Récupération de la TPO non soluble
On met à fermenter un micro-organisme tel que la TPO exprimant E. coli encodé par n'importe quel plasmide approprié dans des conditions dans lesquelles la TPO est déposée dans des"corps aptes à être brisés insolubles.

Eventuellement, on lave d'abord les cellules dans un tampon de rupture de cellules. Spécifiquement, on remet environ 100 g de cellules en suspension dans environ 10 volumes d'un tampon de rupture de cellules (par exemple, Tris 10mM, EDTA 5mM, pH 8) avec, par exemple un homogénéisateur Polytron et on centrifuge les cellules à 5.000 x g pendant 30 minutes.

On lyse alors les cellules en utilisant n'importe quelle technique conventionnelle telle que le choc tonique, les ultrasons, la cyclisation sous pression, des procédés chimiques ou enzymatiques. Par exemple, on peut remettre en suspension les pastilles cellulaires lavées ci-dessus dans 10 volumes supplémentaires d'un tampon de rupture de cellules avec un homogénéisateur et on fait passer la suspension cellulaire à travers un dispositif de rupture cellulaire LH (LH Inceltech, Inc. ) ou à travers un "Microfluidizer" (Microfluidics International) en suivant les instructions du fabricant. La matière particulaire contenant la TPO est alors séparée de la phase liquide et éventuellement lavée avec n'importe quel liquide approprié.

Par exemple, on peut centrifuger une suspension de lysat cellulaire à 5.000 x g pendant 30 minutes, la remettre en suspension et éventuellement la centrifuger une seconde fois pour obtenir une pastille lavée à corps"apte à être brisé".

La pastille lavée peut alors être utilisée immédiatement ou éventuellement entreposée à l'état congelé (par exemple, à- 700C).

B. Solubilisation et purification de la TPO monomère
On solubilise alors avec un tampon de solubilisation, la TPO insoluble dans la pastille à corps"apte à être brisé". Le tampon de solubilisation contient un agent chaotropique ; il est habituellement tamponné à un pH basique et contient un agent de réduction pour améliorer le rendement en TPO monomère. Des agents chaotropiques représentatifs englobent l'urée, la guanidine-HCl et le thiocyanate de sodium. Un agent chaotropique préféré est la guanidine-HCl. La concentration de l'agent chaotropique est habituellement de 4-9M, de préférence de 6-8M. On maintient le pH du tampon de solubilisation à l'intervention de n'importe quel tampon approprié dans un domaine de pH d'environ 7,5-9, 5, de préférence de 8, 0-9, 0, et de manière de loin préférée de 8,0.

De préférence, le tampon de solubilisation contient également un agent de réduction pour aider à la formation de la forme monomère de la TPO. Des agents de réduction appropriés englobent des composés organiques contenant un thiol libre (RSH). Des agents de réduction représentatifs englobent le dithiothréitol (DTT), le dithioérytritol (DTE), le mercaptoéthanol, le glutathion (GSH), la cystéamine et la cystéine. Un agent de réduction préféré est le dithiothréitol (DTT). Eventuellement, le tampon de solubilisation peut contenir un agent d'oxydation doux (par exemple, de l'oxygène moléculaire) et un sel de sulfite pour former la TPO monomère via sulfitolyse.

Dans cette forme de réalisation, le TPO-S-sulfonate résultant est soumis à une remise en plis ultérieure en présence du tampon rédox (par exemple, GSH-GSSG) pour obtenir la TPO remise en plis de manière appropriée.

Habituellement, on soumet la protéine TPO à une purification ultérieure en utilisant par exemple la centrifugation, la chromatographie par filtration sur gel et la chromatographie sur colonne à phase réverse.

A titre d'illustration, le procédé ci-après a procuré des rendements appropriés en TPO monomère. On remet en suspension la pastille à corps"apte à être brisé" d'environ 5 volumes en poids du tampon de solubilisation (Tris 20 mM, pH 8, avec guanidine 6-8M et DTT 25 mM) et on agite pendant 1-3 heures, ou pendant une nuit à 40C pour mettre en oeuvre la solubilisation de la protéine TPO. Des concentrations élevées d'urée (6-8M) sont également utiles, mais donnent généralement lieu à des rendements quelque peu inférieurs comparés à ceux obtenus avec la guanidine. Après la solubilisation, on centrifuge la solution à 30.000 x g pendant 30 minutes pour obtenir un produit surnageant clair contenant de la protéine TPO monomère dénaturée.

On chromatographie alors le produit surnageant sur une colonne de filtration sur gel Superdex 200 (Pharmacia, 2,6 x 60 cm) à un débit de 2 ml/min. et on élue la protéine avec du phosphate de sodium 20 mM, pH 6,0, avec DTT 10mM. On rassemble les fractions contenant la protéine TPO monomère dénaturée en éluant entre 160 et 200 ml. On purifie davantage la protéine TPO sur une colonne C4 semipréparative à phase réverse (2 x 20 cm, VYDAC). On applique l'échantillon à 5 ml/min sur une colonne équilibrée dans du TFA (acide trifluoracétique) (0, 1%) avec de l'acétonitrile (30%). On élue la protéine avec un gradient linéaire d'acétonitrile (30-60% pendant 60 minutes). La protéine réduite purifiée s'élue à une teneur d'approximativement 50% d'acétonitrile.

On utilise cette matière pour la remise en plis dans le but d'obtenir un variant de la TPO biologiquement actif.

C. Remise en plis de la TPO pour générer la forme biologiquement active
Suite à la solubilisation et à la purification ultérieure de la TPO, on obtient la forme biologiquement active par remise en plis de la TPO monomère dénaturée dans un tampon rédox. Etant donné la teneur élevée de la TPO en agent actif (on obtient une stimulation correspondant à la moitié d'une stimulation maximale dans le dosage Ba/F3 à approximativement 3 pg/ml), il est possible d'obtenir une matière biologiquement active en utilisant un grand nombre de conditions rédox, de détergents et de tampons différents.

Toutefois, dans la plupart des conditions, on obtient seulement une petite quantité de matière plissée de manière appropriée ( < 10%). Pour des procédés de fabrication à l'échelle industrielle, il est souhaitable d'obtenir des rendements de remise en plis à concurrence d'au moins 10%, de manière. plus préférée, de 30-50% et de manière de loin préférée > 50%. Un grand nombre de détergents différents, y compris Triton X-100, le dodécyl-ss-maltoside, CHAPS, CHAPSO, SDS, le sarcosyle, Tween-20 et Tween-80, le zwittergent 3-14, ainsi que d'autres, se sont avérés appropriés pour produire au moins une certaine quantité de matière plissée de manière appropriée.

Toutefois, parmi ces derniers, les détergents de loin préférés sont de ceux de la famille CHAPS (CHAPS et CHAPSO) qui se sont avérés travailler au mieux dans la réaction de remise en plis et limiter l'agrégation des protéines et la formation inappropriée de disulfure. On préfère de loin des taux de CHAPS supérieurs à environ 1%.

On a besoin de chlorure de sodium pour obtenir les meilleurs rendements, des taux optimaux se situant entre O, 1M et 0,5M.

La présence de EDTA (1-5mM) dans le tampon rédox est préférée pour limiter la quantité d'oxydation (et d'agrégation) à catalysation métallique observée avec certaines préparations. Des concentrations de glycérol

supérieures à 15% procurent les conditions optimales de remise en plis. Pour des rendements maximaux, il est essentiel de disposer d'une paire rédox dans le tampon rédox constituée par, à la fois un thiol organique oxydé et un thiol organique réduit (RSH). Des paires rédox appropriées englobent le mercaptoéthanol, le glutathion (GSH), la cystéamine, la cystéine et leurs formes oxydées correspondantes. Des paires rédox préférées sont glutathion (GSH) : glutathion oxydé (GSSG) ou cystéine : cystine. Une paire rédox de loin préférée est glutathion (GSH) : glutathion oxydé (GSSG).

On observe également des rendements supérieurs lorsque le rapport molaire de l'élément oxydé de la paire rédox est égal à celui de l'élément réduit de la paire rédox ou en excès par rapport à lui. Des valeurs de pH entre 7,5 et environ 9 sont optimales pour la remise en plis de ces variants de la TPO. Des solvants organiques (l'éthanol, l'acétonitrile, le méthanol) sont tolérés à des concentrations de 10-15% ou moins. Des teneurs supérieures en solvants organiques augmentent les quantités de formes plissées de manière inappropriée. Des tampons Tris et phosphate sont généralement utiles. L'incubation à 40C procure également des taux supérieurs en TPO plissée de manière appropriée.

Des rendements de remise en plis de 40-60% (basés sur la quantité de TPO réduite et dénaturée utilisée dans la réaction de remise en plis) sont spécifiques pour des préparations de TPO qui ont été purifiées en passant par la première étape C4. On peut obtenir une matière active lorsqu'on utilise des préparations moins pures (par exemple, directement l'étape concernant la colonne Superdex 200 ou après l'extraction initiale du corps"apte à être brisé"), bien que les rendements soient moindres du fait de la précipitation étendue et de l'interférence des protéines non-TPO au cours du procédé de remise en plis de la TPO.

Etant que donné que la TPO contient quatre résidus de cystéine, il est possible de générer trois versions différentes de disulfures de cette protéine : version 1 : disulfures entre les résidus de cystéine 1-4 et 2-3 version 2 : disulfures entre les résidus de cystéine 1-2 et 3-4 version 3 : disulfures entre les résidus de cystéine 1-3 et 2-4
Au cours de l'exploration initiale, lors de la détermination des conditions de remise en plis, on sépare plusieurs pics différents contenant la protéine TPO par chromatographie C4 en phase réverse. Seul un de ces pics possède une activité biologique significative comme déterminé en utilisant le dosage Ba/F3. Par la suite, on optimise les conditions de remise en plis pour obtenir de préférence cette version.

Dans ces conditions, les versions mal remises en plis sont inférieures à 10-20% de la TPO monomère totale obtenue à partir de l'étape de solubilisation.

Le modèle de disulfure pour la TPO biologiquement active a été déterminé comme étant de 1-4 et de 2-3 par spectrométrie de masse et par séquençage protéinique, dans lequel les cystéines sont numérotées successivement à partir de la terminaison amino. Ce modèle de liaison croisée de cystéines est conforme au modèle de liaison de disulfures connu de l'érythropoïétine moléculaire apparentée.

D. Activité biologique de la TPO recombinante remise en plis
La TPO remise en plis et purifiée manifeste la présence d'un agent actif à la fois dans des dosages in vitro et in vivo. Par exemple, dans le dosage Ba/F3, on obtient une stimulation semi-maximale d'incorporation de thymidine dans les cellules Ba/F3 pour TPO (Met-1 1-153) à 3,3 pg/ml

(0,3 pM). Dans l'ELISA basé sur le récepteur mpl, la teneur semi-maximale en agent actif apparaît à 1,9 ng/ml (120 pM).

Dans des animaux normaux et myélodépressifs obtenus par rayons X subléthaux, la TPO remise en plis (Met-1 1-153) manifeste une teneur élevée en agent actif (on observe la présence d'un agent actif à des doses aussi faibles que 30 ng/souris) pour stimuler la production de nouvelles plaquettes. On observe une activité biologique similaire pour d'autres formes de la TPO remise en plis conformément aux procédés décrits ci-dessus (voir figures 25,26 et 28).

14. Procédés pour mesurer l'activité thrombopoiétique
On peut mesurer l'activité thrombopoïétique dans différents dosages, y compris le dosage du ligand pour le mpl à Ba/F3 décrit à l'exemple 1, une détermination de synthèse du rebond plaquettaire chez la souris in vivo, un dosage par induction d'antigènes de surface de cellules de plaquettes, tel que mesuré par un immunodosage antiplaquettaire (anti-GPIIbIIIa) pour une lignée cellulaire mégacaryoblastique de la leucémie humaine (CMK) (voir Sato et collaborateurs, Brit. J.

Haematol., 72 : 184-190 [1989]) (voir également le dosage de la megacaryocytopoïèse en suspension liquide décrit à l'exemple 4), et l'induction d'une polyploïdisation dans une lignée cellulaire mégacaryoblastique (DAMI) (voir Ogura et collaborateurs, Blood, 72 (1) : 49-60 [1988]). La maturation de mégacaryocytes à partir de cellules immatures synthétisant dans une large mesure du non-ADN, pour obtenir des mégacaryocytes morphologiquement identifiables implique un procédé qui englobe l'apparition d'organelles cytoplasmiques, l'acquisition d'antigènes membranaires (GPIIbIIIa), l'endoréplication et la libération de plaquettes comme décrit dans le fondement.

On escompterait de la part d'un promoteur spécifique à un lignage (c'est-à-dire le ligand

pour le mpl) de la maturation des mégacaryocytes qu'il induise au moins une partie de ces changements dans des mégacaryocytes immatures donnant lieu à une libération de plaquettes et à un soulagement de la thrombocytopénie.

Ainsi, on a conçu des analyses pour mesurer l'émergence de ces paramètres dans des lignées cellulaires de mégacaryocytes immatures, c'est-à-dire des cellules CMK et DAMI. Le dosage CMK (exemple 4) mesure l'apparition d'un marqueur de plaquettes spécifique GPIIbIIIa et le bourgeonnement de plaquettes. Le dosage DAMI (exemple 15) mesure l'endoréplication, étant donné que des augmentations dans la ploidie constituent des signes d'appel de mégacaryocytes matures. Des mégacaryocytes reconnaissables possèdent des valeurs de ploidie de 2N, 4N, 8N, 16N, 32N, etc.

Enfin, la détermination du rebond plaquettaire chez la souris in vivo (exemple 16) est utile pour démontrer que l'administration du composé d'essai (en l'occurrence, le ligand pour le mpl) donne lieu à une augmentation de la numération plaquettaire.

On a mis au point deux dosages in vitro supplémentaires pour mesurer la teneur de la TPO en agent actif. Le premier est un ELISA par activation du récepteur de kinase (KIRA) dans laquelle les cellules CHO sont transfectées avec un chimère mpl-Rse et la phosphorylation de tyrosine du Rse est mesurée par ELISA après exposition de la portion mpl du chimère au ligand pour le mpl (voir exemple 17). Le second est un dosage par le procédé ELISA basé sur un récepteur, dans lequel la IgG anti-humaine de lapin recouvrant des boîtes ELISA capture le récepteur chimère mpl-IgG d'un être humain, qui se lie au ligand pour le mpl soumis au dosage.

On utilise un anticorps polyclonal biotinylé de lapin au ligand pour le mpl (TPO155) pour détecter le ligand pour le mpl lié, que l'on mesure en utilisant la streptavidine peroxydase comme décrit à l'exemple 18.

15. Réponse biologique in vivo de souris normales et de celles ayant subi une irradiation subléthale, traitées avec de la TPO
On traite à la fois des souris normales et des souris ayant subi une irradiation subléthale avec de la TPO tronquée et de la TPO de longueur totale isolée à partir de cellules ovariennes de hamster chinois (CHO), de E. coli et de cellules (293) de rein embryonnaire humain. Les deux formes de la TPO produite dans ces trois hôtes stimulent la production de plaquettes chez les souris ; toutefois, la TPO de longueur totale isolée à partir de CHO s'avère produire la plus forte réponse in vivo. Ces résultats indiquent qu'une glycosylation appropriée du domaine carboxy-terminal peut être nécessaire pour obtenir une teneur optimale in vivo quant à l'agent actif.
EMI118.1

(a) E. coli-rhTPO (Met 1, 153)
A des souris femelles C57 B6 normales, on injecte quotidiennement la forme"Met"du domaine EPO (Met en position 1 plus les 153 premiers résidus de la TPO humaine) produite dans E. coli (voir exemple 23), comme décrit dans les légendes des figures 25A, B et C. Dans ces figures, on représente le fait que la forme tronquée non glycosylée de la TPO produite dans E. coli et remise en plis comme décrit ci-dessus est capable de stimuler une augmentation approximativement double de la production de plaquettes chez des souris normales, sans affecter la population des érythrocytes ou des lymphocytes.

La même molécule injectée quotidiennement à des souris femelles C57 B6 ayant subi une irradiation subléthale (137Cs) comme décrit dans les légendes des figures 26A, B et C, stimule le rétablissement des plaquettes et diminue le

nadir, mais n'a aucun effet sur les érythrocytes ou les leucocytes.

(b) CHO-rhTP0332
La forme de longueur totale de la TPO produite dans CHO et injectée quotidiennement à des souris femelles C57 B6 normales, comme décrit dans les légendes des figures 27A, B et C, produit une augmentation d'environ de la production de plaquettes chez des souris normales sans affecter la population des érythrocytes ou des leucocytes.

(c) CHO-rhTPO332 ; E. coli-rhTPO (Met- 1, 153) ; 293- rhTP0332 et -coJi-rhTPOn
On construit des courbes de réponse pour le traitement de souris normales avec rhTPO provenant de diverses lignées cellulaires (CHO-rhTPO332 ; coli-rhTPO (Met-l, 153) i 293rhTP0332 et E. coli-rhTPO155) comme décrit dans la légende de la figure 28. Dans cette figure, on représente le fait que toutes les formes testées de la molécule stimulent la production de plaquettes ; toutefois, la forme de longueur totale produite dans CHO manifeste l'activité la plus intense in vivo.

(d) CHO-rhTPO153, CHO-rhTPO"découpé" et CHO-rhTPO332
On construit également des courbes de réponse pour le traitement de souris normales avec diverses formes de rhTPO
EMI119.1
produites dans CHO (CHO-rhTPO, CHO-rhTPOncoupê"s CHO- rhTP0332) comme décrit dans la légende de la figure 29. Dans cette figure, on représente le fait que toutes les formes CHO testées de la molécule stimulent la production de plaquettes, mais que la forme de longueur totale de 70 kDa possède l'activité la plus intense in vivo.

16. Préparation recombinante générale du ligand pour le mpl et de variants
De préférence, on prépare le ligand pour le mpl par des procédés recombinants classiques qui impliquent la production du polypeptide ligand pour le mpl par culture de cellules transfectées pour exprimer l'acide nucléique du ligand pour le mpl (spécifiquement, en transformant les cellules avec un vecteur d'expression) et en récupérant le polypeptide des cellules. Toutefois, on envisage facultativement de produire le ligand pour le mpl par recombinaison homologue ou encore avec des procédés de production recombinante utilisant des éléments de commande introduits dans des cellules contenant déjà l'ADN encodant le ligand pour le mpl.

Par exemple, un élément promoteur/amplificateur puissant, un suppresseur ou encore un élément modulateur de transcription exogène peut être introduit dans le génome de la cellule hôte visée à une proximité et dans une orientation suffisantes pour influencer la transcription de l'ADN encodant le polypeptide ligand pour le mpl désiré. L'élément de commande n'encode pas le ligand pour le mpl, c'est plutôt l'ADN qui est indigène au génome de la cellule hôte. On procède ensuite à un criblage pour détecter les cellules fabriquant le polypeptide récepteur de la présente invention ou pour détecter des taux supérieurs ou inférieurs d'expression comme on le souhaite.

Ainsi, l'invention envisage un procédé de production du ligand pour le mpl comprenant l'insertion dans le génome d'une cellule contenant la molécule d'acide nucléique du ligand pour le mpl, un élément modulateur de la transcription à une proximité et dans une orientation suffisantes par rapport à la molécule d'acide nucléique pour influencer la transcription, avec une étape ultérieure

facultative comprenant la culture des cellules contenant l'élément modulateur de transcription et la molécule d'acide nucléique. L'invention envisage également une cellule hôte contenant la molécule d'acide nucléique du ligand pour le mpl indigène liée de manière fonctionnelle aux séquences de commande exogènes reconnues par la cellule hôte.

A. Isolation de J'ADN encodant le polypeptide ligand pour le mpj
L'ADN encodant le polypeptide ligand pour le mpl peut être obtenu à partir de n'importe quelle bibliothèque d'ADNc préparée à partir de tissus censés posséder l'ARN du ligand pour le mpl et l'exprimer à un niveau détectable. On peut également obtenir le gène du ligand pour le mpl à partir d'une bibliothèque d'ADN génomique ou par synthèse oligonucléotidique in vitro à partir de la séquence nucléotidique ou d'aminoacides complète.

On crible les bibliothèques avec des sondes conçues pour identifier le gène d'intérêt ou la protéine encodée par ce dernier. Des sondes appropriées pour les bibliothèques d'expression d'ADNc englobent des anticorps monoclonaux ou polyclonaux qui reconnaissent le ligand pour le mpl et se lient spécifiquement à lui. Des sondes appropriées pour des bibliothèques d'ADNc englobent des oligonucléotides ayant une longueur d'environ 20-80 bases, qui encodent des portions connues ou suspectées de l'ADNc du ligand pour le mpl à partir d'espèces identiques ou différentes ; et/ou des ADNc complémentaires ou homologues ou encore des fragments de ces derniers qui encodent le même gène ou un gène similaire.

Des sondes appropriées pour cribler des bibliothèques d'ADN génomique englobent, sans y être limité, des oligonucléotides, des ADNc ou des fragments de ces derniers qui encodent le même gène ou un gène similaire

et/ou des ADN génomiques homologues ou encore des fragments de ces derniers. Le criblage de la bibliothèque génomique ou d'ADNc avec la sonde sélectionnée peut être réalisé en utilisant des procédés classiques comme décrit aux chapitres 10-12 de Sambrook et collaborateurs, supra.

Un moyen donné en variante pour isoler le gène encodant le ligand pour le mpl consiste à utiliser la méthodologie PCR comme décrit dans la section 14 de Sambrook et collaborateurs, supra. Ce procédé nécessite l'utilisation de sondes oligonucléotidiques qui s'hybrideront à l'ADN encodant le ligand pour le mpl. Des stratégies pour la sélection des oligonucléotides sont décrites ci-dessous.

Un procédé préféré de mise en oeuvre de la présente invention consiste à utiliser des séquences d'oligonucléotides soigneusement sélectionnées pour cribler des bibliothèques d'ADNc à partir de divers tissus, de préférence de rein (adulte ou foetal) d'un être humain ou de porcin, ou encore des lignées cellulaires de foie. Par exemple, on crible des bibliothèques d'ADNc de lignées cellulaires de foie foetal humain avec les sondes oligonucléotidiques. En variante, on peut cribler des bibliothèques génomiques humaines avec les sondes oligonucléotidiques.

Les séquences oligonucléotidiques sélectionnées comme sondes doivent posséder une longueur suffisante et être suffisamment non ambiguës de telle sorte que l'on minimise de fausses certitudes. La ou les séquences nucléotidiques réelles sont habituellement conçues en étant basées sur des régions du ligand pour le mpl qui possèdent la redondance de codons la plus minime. Les oligonucléotides peuvent être dégénérés à une ou plusieurs positions. L'utilisation d'oligonucléotides dégénérés revêt une importance

particulière lorsqu'on crible une bibliothèque à partir d'une espèce dans laquelle l'utilisation de codons préférentiels n'est pas connue.

L'oligonucléotide peut être marqué de manière à pouvoir être détecté lors de l'hybridation à l'ADN dans la bibliothèque soumise à un criblage. Le procédé de marquage préféré consiste à utiliser ATP (par exemple, y32p) et la polynucléotide kinase pour radiomarquer l'extrémité 5'de l'oligonucléotide ; toutefois, d'autres procédés peuvent être utilisés pour marquer l'oligonucléotide, y compris sans y être limité, la biotinylation ou le marquage enzymatique.

Revêt un intérêt particulier, l'acide nucléique du ligand pour le mpl qui encode un polypeptide ligand pour le mpl de longueur totale. Dans certaines formes de réalisation préférées, la séquence d'acides nucléiques englobe la séquence signal du ligand naturel pour le mpl. On obtient les acides nucléiques possédant l'ensemble de la séquence de codage protéinique en criblant des bibliothèques d'ADNc ou génomiques sélectionnées en utilisant la séquence d'aminoacides déduite.

B. Variants de séquences d'aminoacides du ligand naturel pour le mpl
On prépare des variants de séquences d'aminoacides du ligand pour le mpl en introduisant des changements nucléotidiques appropriés dans l'ADN du ligand pour le mpl ou par synthèse in vitro du polypeptide ligand pour le mpl désiré. De tels variants englobent par exemple des délétions de résidus ou encore des insertions ou des substitutions de tels résidus à l'intérieur de la séquence d'aminoacides pour le ligand pour le mpl de porcin. Par exemple, les portions carboxy-terminales du ligand mature de longueur totale pour

le mpl peuvent être supprimées par clivage protéolytique, soit in vivo, soit in vitro, ou encore par clonage et expression d'un fragment ou de l'ADN encodant le ligand pour le mpl de longueur totale pour obtenir un variant biologiquement actif.

N'importe quelles combinaisons de délétion, d'insertion et de substitution peut être mise en oeuvre pour aboutir au produit de construction final, à condition que le produit de construction final possède l'activité biologique désirée. Les changements d'aminoacides peuvent également altérer des processus postérieurs à la traduction du ligand pour le mpl, tels que le changement du nombre ou de la position des sites de glycosylation. Pour la conception des variants de séquences d'aminoacides pour le ligand pour le mpl, la localisation du site de mutation et la nature de la mutation dépendront de la ou des caractéristiques du ligand pour le mpl à modifier.

Les sites pour la mutation peuvent être modifiés individuellement ou en série par exemple (1) en procédant à une substitution d'abord avec des choix d'aminoacides de conservation et ensuite, avec des sélections plus radicales en fonction des résultats obtenus, (2) par délétion du résidu cible ou (3) par insertion de résidus de la même classe ou d'une classe différente, adjacents au site localisé, ou encore des combinaisons des options 1-3.

Le procédé utile pour l'identification de certains résidus ou de certaines régions du polypeptide ligand pour le mpl, qui constituent des localisations préférées pour la mutagenèse, est désigné par l'expression"mutagenèse par criblage à l'alanine"comme décrit par Cunningham et Wells, Science, 244 : 1081-1085 [1989]. Dans ce cas-ci, on identifie un résidu ou un groupe de résidus cibles (par exemple des résidus chargés tels que arg, asp, his, lys et glu) et on les remplace par n'importe quels aminoacides, mais de préférence un aminoacide neutre ou à charge négative (de

manière de loin préférée, l'alanine ou la polyalanine) pour affecter l'interaction des aminoacides avec le milieu aqueux environnant dans ou en dehors de la cellule.

Ces domaines manifestant une sensibilité fonctionnelle aux substitutions sont alors affinés en introduisant une quantité supplémentaire de variants ou d'autres variants aux sites de substitution ou destinés à ces derniers. Ainsi, bien que le site pour l'introduction d'une variation de séquences d'aminoacides soit prédéterminé, la nature de la mutation en soi ne doit pas nécessairement être prédéterminée. Par exemple, pour optimiser la performance d'une mutation à un site donné, on effectue la mutagenèse aléatoire ou par criblage au codon ou à la région cible et on crible les variants du ligand pour le mpl exprimés pour obtenir une combinaison optimale de l'activité désirée.

Deux variables principales sont liées à la construction de variants de séquences d'aminoacides : la localisation du site de mutation et la nature de la mutation. Par exemple, des variants du polypeptide ligand pour le mpl englobent des variants par rapport à la séquence du ligand pour le mpl et peuvent représenter des allèles existant naturellement (qui ne nécessitent pas la manipulation de l'ADN du ligand pour le mpl) ou encore des formes de mutants prédéterminées, obtenues par mutation de l'ADN, pour arriver, soit à un allèle, soit à un variant introuvable dans la nature. En général, la localisation et la nature de la mutation sélectionnée dépendront de la caractéristique du ligand pour le mpl à modifier.

En général, des délétions de séquences d'aminoacides se situent dans le domaine d'environ 1 à 30 résidus, de manière plus préférée d'environ 1 à 10 résidus et elles sont spécifiquement contiguës. En variante, des délétions de séquences d'aminoacides pour le ligand pour le mpl peuvent

englober une portion du domaine glycoprotéinique carboxyterminal ou ce domaine dans son ensemble. Des délétions de séquences d'aminoacides peuvent également englober un ou plusieurs des six premiers résidus amino-terminaux de la protéine mature. Des délétions facultatives de séquences d'aminoacides comprennent un ou plusieurs résidus dans une ou plusieurs des régions de boucles qui existent entre les "faisceaux hélicoïdaux".

On réalise ordinairement des délétions contiguës de résidus en nombres pairs, mais des délétions uniques ou de nombre impair rentrent dans le cadre de la présente invention. On peut introduire des délétions dans des régions de faible homologie parmi les ligands pour le mpl qui partagent l'identité maximale de séquences pour modifier l'activité du ligand pour le mpl. Ou bien on peut introduire des délétions dans des régions de faible homologie parmi le ligand pour le mpl d'un être humain et des polypeptides ligands pour le mpl d'autres mammifères qui partagent la plus forte identité de séquence à celle du ligand pour le mpl d'un être humain.

Des délétions à partir d'un polypeptide ligand pour le mpl chez un mammifère dans des zones d'homologie importante avec des ligands pour le mpl chez d'autres mammifères seront plus susceptibles de modifier l'activité biologique du ligand pour le mpl de manière plus importante. Le nombre de délétions consécutives sera sélectionné de façon à préserver la structure tertiaire des ligands pour le mpl dans le domaine visé, par exemple le feuillet plissé bêta ou l'hélice alpha.

Des insertions de séquences d'aminoacides englobent des fusions amino et/ou carboxy terminales dont la longueur se situe dans le domaine d'un résidu à des polypeptides contenant 100 résidus ou plus, ainsi que des insertions d'intraséquences d'un ou de plusieurs résidus d'aminoacides.

Des insertions d'intraséquences (c'est-à-dire des insertions à l'intérieur de la séquence du ligand pour le mpl mature)

peuvent se situer généralement dans le domaine d'environ 1 à 10 résidus, de manière plus préférée de 1 à 5, de manière de loin préférée de 1 à 3. Une fusion préférée, donnée à titre d'exemple est celle du ligand pour le mpl ou d'un fragment de ce dernier et d'une autre cytokine ou d'un fragment de cette dernière.

Des exemples d'insertions terminales englobent le ligand pour le mpl mature avec un résidu méthionyle N-terminale, un produit de l'expression directe du ligand pour le mpl mature dans une culture de cellules recombinantes, ainsi que la fusion d'une séquence signal hétérologue N-terminale à la terminaison N de la molécule mature du ligand pour le mpl pour faciliter la sécrétion du ligand pour le mpl mature à partir d'hôtes recombinants. En général, on obtiendra de telles séquences signal à partir des espèces de cellules hôtes visées, qui sont ainsi homologues à ces dernières. Des séquences appropriées englobent STII ou Ipp pour E. coli, le facteur alpha pour la levure et des signaux viraux tels que herpès gD pour des cellules de mammifères.

D'autres variants insertionnels de la molécule du ligand pour le mpl englobent la fusion à la terminaison N ou C du ligand pour le mpl de polypeptides immunogènes (c'est- à-dire non endogènes pour l'hôte auquel on administre la fusion), par exemple des polypeptides bactériens tels que la bêta-lactamase ou encore une enzyme encodée par le locus de E. coli trp ou bien de la protéine de levure, ainsi que des fusions C-terminales avec des protéines possédant une longue demi-vie telle que des régions constantes d'immunoglobulines (ou d'autres régions d'immunoglobulines), l'albumine ou la ferritine, comme décrit dans le document WO 89/02922 publié le 6 avril 1989.

Un troisième groupe de variants sont des variants à substitution d'aminoacides. Ces variants possèdent au moins un résidu d'aminoacides dans la molécule du ligand pour le mpl qui a été supprimé, un résidu différent ayant été inséré à sa place. Les sites représentant un intérêt majeur pour la mutagenèse par substitution englobent des sites identifiés comme étant le ou les sites actifs du ligand pour le mpl et les sites dans lesquels les aminoacides trouvés dans d'autres analogues sont essentiellement différents en termes de volume des chaînes latérales, de charges ou d'hydrophobicité, mais dans lesquels on trouve également un degré élevé d'identité de séquences au site sélectionné parmi diverses espèces du ligand pour le mpl et/ou à l'intérieur des divers analogues animaux d'un membre du ligand pour le mpl.

D'autres sites d'intérêt sont ceux dans lesquels des résidus particuliers du ligand pour le mpl obtenus à partir de divers membres de familles et ou d'espèces animales à l'intérieur d'un membre sont identiques. Ces sites, en particulier ceux rentrant dans une séquence d'au moins trois autres sites conservés de manière identique, sont substitués d'une manière relativement conservatrice. De telles substitutions de conservation sont représentées dans le tableau 3 sous l'intitulé"substitutions préférées".

Si de telles substitutions donnent lieu à un changement quant à l'activité biologique, des changements importants supplémentaires désignés par l'intitulé"substitutions données à titre d'exemples dans le tableau 3 ou, comme décrit plus loin ci-dessous, en référence à des classes d'aminoacides, sont introduites et les produits sont criblés.

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TABLEAU. 5 Des modifications importantes quant à la fonction ou à l'identité immunologique du ligand pour le mpl sont réalisées en sélectionnant des substitutions qui diffèrent significativement quant à leur effet sur le maintien de (a) la structure du squelette polypeptidique dans la région de la substitution, par exemple sous forme d'une feuille ou d'une hélice, (b) de la charge ou de l'hydrophobicité de la molécule au site cible ou (c) du volume de la chaîne
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latérale. Des résidus apparaissant naturellement sont Cys (C) Set Ser Gln (0) Asn Asn Glu (E) Asp Asp Gly (G) Pro Pro divisés en groupes basés sur des propriétés communes de
EMI130.3
chaînes latérales : (1) hydrophobes : norleucine.

Met, Ala, Val, Leu, Ile ; (2) hydrophiles neutres : Cys, Ser, Thr ; (3) acides : Asp, Glu ; (4) basiques : Asn, Gin, His, Lys, Arg ; (5) des résidus qui influencent l'orientation de la chaîne : Gly, Pro ; et (6) aromatiques : Trp ; Tyr, Phe.

Des substitutions non conservatrices englobent l'échange d'un membre d'une de ces classes contre un autre.

De tels résidus substitués peuvent également être introduits dans les sites de substitution de conservation ou, de manière plus préférée, dans les sites restants (non conservés).

Dans une forme de réalisation de l'invention, il est souhaitable d'inactiver un ou plusieurs sites de clivage par protéase qui sont présents dans la molécule. Ces sites sont identifiés par inspection de la séquence d'aminoacides Ser (S) Thr Thr Thr (T) Ser Ser Trp (W) Tyr Tyr encodée, dans la cas de la trypsine, par exemple pour un résidu arginyle ou lysinyle. Lorsque les sites de clivage par protéase sont identifiés, ils sont rendus inactifs au clivage protéolytique en substituant le résidu ciblé par un autre résidu, de préférence un résidu basique tel que la

glutamine ou par un résidu hydrophobe tel que la sérine ; par délétion du résidu ; ou par insertion d'un résidu de prolyle immédiatement après le résidu.

Dans une autre forme de réalisation, on substitue n'importe quel résidu de méthionyle autre que le résidu de méthionyle de départ de la séquence signal ou n'importe quel résidu situé à l'intérieur d'environ 3 résidus N ou Cterminaux par rapport à chacun desdits résidus de méthionyle, par un autre résidu (par exemple, de préférence conformément au tableau 3) ou bien on les soumet à une délétion. En variante, environ 1-3 résidus sont insérés en position adjacente à de tels sites.

N'importe quels résidus de cystéine, qui ne sont pas impliqués pour maintenir la conformation appropriée du ligand pour le mpl, peuvent également être substitués en général avec de la sérine pour améliorer la stabilité oxydante de la molécule et empêcher des liaisons transversales aberrantes. On a trouvé que les première et quatrième cystéines dans le domaine EPO, numérotées à partir de la terminaison amino, sont nécessaires pour maintenir la configuration appropriée, mais que les deuxième et troisième ne le sont pas. En conséquence, les deuxième et troisième cystéines dans le domaine EPO peuvent être substituées.

On prépare des molécules d'acides nucléiques encodant des variants de séquences d'aminoacides du ligand pour le mpl par divers procédés connus dans la technique. Ces procédés englobent, sans y être limités, l'isolation à partir d'une source naturelle (dans le cas de variants de séquences d'aminoacides existant naturellement) ou la préparation par une mutagenèse à médiation oligonucléotidique (ou dirigée vers un site), la mutagenèse par PCR, et la mutagenèse par cassettes d'un variant préparé

EMI132.1
1 antérieurement ou encore une version non variante du polypeptide ligand pour le mpl.

La mutagenèse à médiation oligonucléotidique est un procédé préféré pour préparer les variants de substitutions de délétion et d'insertion de l'ADN du ligand pour le mpl.

Ce procédé est bien connu dans la technique, comme décrit par Adelman et collaborateurs, ADN, 2 : 183 [1983]. Pour le dire brièvement, on modifie l'ADN du ligand pour le mpl par hybridation d'un oligonucléotide encodant la mutation désirée à une matrice d'ADN, la matrice étant la forme monocaténaire d'un plasmide ou d'un bactériophage contenant la séquence d'ADN inaltérée ou naturelle du ligand pour le mpl. Après hybridation, on utilise une ADN polymérase pour synthétiser un second brin complémentaire entier de la matrice dans laquelle sera ainsi incorporée l'amorce oligonucléotidique, et qui codera pour l'altération sélectionnée dans l'ADN du ligand pour le mpl.

En général, on utilise des oligonucléotides ayant une longueur d'au moins 25 nucléotides. Un oligonucléotide optimal possédera de 12 à 15 nucléotides qui sont tout à fait complémentaires à la matrice de part et d'autre du ou des nucléotides codant pour la mutation. Ainsi, on garantit que l'oligonucléotide va s'hybrider de manière appropriée à la molécule matricielle d'ADN monocaténaire. On synthétise aisément les oligonucléotides en utilisant des procédés connus dans la technique, tels que celui décrit par Crea et collaborateurs, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75 : 5765 [1978].

L'ADN matriciel peut être généré par des vecteurs qui, soit dérivent de vecteurs du bactériophage M13 (les vecteurs M13mpl8 et M13mpl9 disponibles dans le commerce sont appropriés) ou encore par des vecteurs qui contiennent une origine phagique monocaténaire de réplication, comme décrit

par Viera et collaborateurs, Meth. Enzymol, 153 : 3 [1987]. Ainsi, l'ADN qui doit subir une mutation peut être inséré dans l'un de ces vecteurs pour générer une matrice monocaténaire. La production de la matrice monocaténaire est décrite dans les sections 4.21-4. 41 de Sambrook et collaborateurs, Molecular Cloning : A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 1989).

En variante, on peut générer une matrice d'ADN monocaténaire par dénaturation d'ADN plasmidique bicaténaire (ou d'un autre ADN) en utilisant des techniques classiques.

Pour l'altération de la séquence naturelle d'ADN (dans le but de générer des variants de séquences d'aminoacides, par exemple), on hybride l'oligonucléotide à la matrice monocaténaire dans des conditions d'hybridation appropriées.

On ajoute alors une enzyme de polymérisation d'ADN, habituellement le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I pour synthétiser le brin complémentaire de la matrice en utilisant l'oligonucléotide comme amorce pour la synthèse.

On obtient ainsi une molécule hétéroduplex de telle sorte qu'un brin d'ADN encode la forme ayant subi une mutation du ligand pour le mpl et que l'autre brin (le modèle original) encode la séquence naturelle non modifiée du ligand pour le mpl. Cette molécule hétéroduplex est alors transformée en une cellule hôte appropriée, habituellement un procaryote tel que E. coli JM101. Après croissance de toutes les cellules, on les étale sur des boîtes d'agarose et on les crible en utilisant l'amorce oligonucléotidique radiomarquée avec 32-phosphate pour identifier les colonies bactériennes qui contiennent l'ADN ayant subi une mutation.

On élimine alors la région ayant subi une mutation et on la place dans un vecteur approprié pour la production protéinique, en général un vecteur d'expression du type spécifiquement utilisé pour la transformation d'un hôte approprié.

Le procédé que l'on vient juste de décrire peut être modifié de telle sorte que l'on crée une molécule homoduplex dans laquelle les deux brins du plasmide contiennent la ou les mutations. Les modifications sont les suivantes : l'oligonucléotide monocaténaire subit une hybridation (de l'anglais"annealing"avec la matrice monocaténaire, comme décrit ci-dessus. On combine un mélange de trois désoxyribonucléotides, la désoxyriboadénosine (dATP), la désoxyriboguanosine (dGTP) et la désoxyribothymidine (dTTP) avec une thiodésoxy-ribocytosine modifiée appelée dCTP- (aS) (que l'on peut obtenir auprès de Amersham Corporation). On ajoute ce mélange au complexe matrice-oligonucléotide.

Après addition de l'ADN polymérase à ce mélange, on génère un brin d'ADN identique à celui de la matrice, à l'exception des bases ayant subi une mutation. En outre, ce nouveau brin d'ADN contiendra dCTP-aS au lieu de dCTP qui sert à le protéger contre la digestion par endonucléase de restriction.

Après coupure simple brin du brin matriciel de l'hétéroduplex bicaténaire avec une enzyme de restriction appropriée, le brin matriciel peut être mis à digérer avec ExoIII nucléase ou une autre nucléase appropriée au-delà de la région qui contient le ou les sites devant subir une mutagenèse. On arrête alors la réaction pour laisser une molécule qui est seulement partiellement monocaténaire. On forme alors un homoduplex complet d'ADN bicaténaire en utilisant l'ADN polymérase en présence de tous les quatre désoxyribonucléotide triphosphates, d'ATP et d'ADN ligase.

Cette molécule homoduplex peut alors être transformée en une cellule hôte appropriée telle que E. coli JM101, comme décrit ci-dessus.

On peut générer, de plusieurs manières, de l'ADN encodant des mutants du ligand pour le mpl possédant plus d'un aminoacide à substituer. Si les aminoacides sont proches l'un de l'autre dans la chaîne polypeptidique, ils peuvent subir une mutation de manière simultanée en utilisant un oligonucléotide qui code pour toutes les substitutions désirées d'aminoacides. Toutefois, si les aminoacides sont situés à une certaine distance l'un de l'autre (en étant séparés par plus d'environ 10 aminoacides), il est plus difficile de générer un seul oligonucléotide qui encode tous les changements désirés. On peut utiliser à la place un de deux procédés donnés en variante.

Dans le premier procédé, on génère un oligonucléotide séparé pour chaque aminoacide à substituer. Les oligonucléotides sont alors soumis à une hybridation avec l'ADN matriciel monocaténaire de manière simultanée et le second brin d'ADN qui est synthétisé à partir de la matrice encodera toutes les substitutions désirées d'aminoacides.

Le procédé donné en variante implique deux ou plusieurs cycles de mutagenèses pour obtenir le mutant désiré. Le premier cycle est tel que décrit pour les mutants uniques : on utilise de l'ADN de type sauvage pour la matrice, on soumet un oligonucléotide encodant la ou les premières substitutions désirées d'aminoacides à une hybridation avec cette matrice et on génère ensuite la molécule d'ADN hétéroduplex. Le deuxième cycle de mutagenèse utilise l'ADN ayant subi une mutation, obtenu dans la première série de mutagenèse sous forme de matrice. Ainsi, cette matrice contient déjà une ou plusieurs mutations.

L'oligonucléotide encodant la ou les substitutions supplémentaires désirées d'aminoacides subit alors une hybridation avec cette matrice et le brin d'ADN résultant encode maintenant des mutations à

partir à la fois des premier et deuxième cycles de mutagenèses. On peut utiliser cet ADN résultant comme matrice dans un troisième cycle de mutagenèse, etc.

La mutagenèse par PCR est également appropriée pour préparer des variants d'aminoacides du polypeptide ligand pour le mpl. Bien que les commentaires qui suivent se réfèrent à l'ADN, on comprendra que la technique trouve également une application pour l'ARN. La technique PCR se réfère généralement au procédé ci-après (voir Erlich, supra, le chapitre au nom de R. Higuchi, pages 61-70) : lorsqu'on utilise de petites quantités d'ADN matriciel comme matière de départ dans un PCR, on peut utiliser des amorces qui diffèrent légèrement quant à leur séquence de la région correspondante dans un ADN matriciel, pour générer des quantités relativement importantes d'un fragment d'ADN spécifique qui diffère de la séquence matricielle uniquement aux positions dans lesquelles les amorces diffèrent de la matrice.

Pour introduire une mutation dans un ADN plasmidique, on conçoit une des amorces pour qu'elle chevauche la position de la mutation et qu'elle contienne la mutation ; la séquence de l'autre amorce doit être identique à une étendue de séquence du brin opposé du plasmide, mais cette séquence peut être située n'importe où sur l'ADN plasmidique. Toutefois, il est préférable que la séquence de la seconde amorce soit située en deçà de 200 nucléotides de celle de la première de telle sorte qu'à la fin, on puisse aisément séquencer la région entière amplifiée d'ADN délimitée par les amorces.

L'amplification PCR utilisant une paire d'amorces analogues à celles que l'on vient juste de décrire, donne lieu à une population de fragments d'ADN qui diffèrent à la position de mutation spécifiée par l'amorce et éventuellement à d'autres positions, étant donné que le copiage de la matrice est quelque peu enclin à l'erreur.

Si le rapport de la matrice à la matière de produit est extrêmement faible, la grande majorité des fragments d'ADN du produit englobe la ou les mutations désirées. On utilise cette matière de produit pour remplacer la région correspondante dans le plasmide qui a servi de matrice PCR en utilisant une technologie d'ADN classique. On peut introduire des mutations à des positions séparées de manière simultanée, soit en utilisant une seconde amorce mutante, soit en réalisant un second PCR avec différentes amorces mutantes et en ligaturant les deux fragments PCR résultants de manière simultanée aux fragments vectoriels dans une ligation en trois parties (ou plus).

Dans un exemple spécifique de mutagenèse par PCR, on linéarise de l'ADN plasmidique matriciel (1 Mg) par digestion avec une endonucléase de restriction qui possède un site unique de reconnaissance dans l'ADN plasmidique en dehors de la région à amplifier. A partir de cette matière, on ajoute 100 ng à un mélange PCR contenant un tampon PCR qui contient les quatre désoxynucléotide triphosphates et qui est inclus dans les nécessaires GeneAmp (obtenus auprès de Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT et Emeryville, CA), et 25 pmoles de chaque amorce oligonucléotidique pour obtenir un volume final de 50 pl. On recouvre le mélange réactionnel avec 35 gl d'huile minérale.

On dénature le mélange réactionnel pendant 5 minutes à 100 C, on le place brièvement sur de la glace et ensuite, on ajoute 1 gl d'ADN polymérase de Thermus aquaticus (Taq) (5 unités/1, vendu par Perkin-Elmer Cetus) en dessous de la couche d'huile minérale.

Ensuite, on insère le mélange réactionnel dans un DNA Thermal Cycler (vendu par Perkin-Elmer Cetus) programmé comme suit :

2 minutes à 550C
30 secondes à 72 C, puis 19 cycles comme suit :
30 secondes à 940C
30 secondes à 550C et
30 secondes à 720C
Au terme du programme, on retire le récipient réactionnel du cycliseur thermique et on transfère la phase aqueuse dans un nouveau flacon, on l'extrait dans du phénolchloroforme (volume 50 : 50) et on le précipite dans de l'éthanol, puis on récupère l'ADN par des procédés classiques. On soumet ensuite cette matière aux traitements appropriés pour l'insertion dans un vecteur.

Un autre procédé pour préparer des variants, la mutagenèse par cassette, est basé sur la technique décrite par Wells et collaborateurs, Gene, 34 : 315 [1985]. La matière de départ est le plasmide (ou un autre vecteur) comprenant l'ADN du ligand pour le mpl qui doit subir une mutation. Le ou les codons dans l'ADN du ligand pour le mpl qui doit subir une mutation, sont identifiés. Un site unique d'endonucléase de restriction doit exister de part et d'autre du ou des sites de mutations identifiés. Si aucun site de restriction de ce type n'existe, on peut les générer en utilisant le procédé de mutagenèse à médiation oligonucléotidique décrit ci-dessus pour les introduire aux endroits appropriés dans l'ADN du ligand pour le mpl.

Après avoir introduit les sites de restriction dans le plasmide, le plasmide est incisé à ces sites à des fins de linéarisation. En utilisant des procédés classiques, on synthétise un oligonucléotide bicaténaire encodant la séquence de l'ADN entre les sites de restriction, mais contenant la ou les mutations désirées. On synthétise séparément les deux brins et ensuite, on les hybride l'un à l'autre en utilisant des techniques classiques. Cet

oligonucléotide bicaténaire est désigné par le terme "cassette". Cette cassette est conçue pour posséder des extrémités 3'et 5'qui sont compatibles avec les extrémités du plasmide linéarisé de telle sorte qu'elles puissent exactement ligaturer au plasmide.

Ce plasmide contient maintenant la séquence d'ADN du ligand pour le mpl ayant subi une mutation.

C. Insertion d'acide nucléique dans un vecteur réplicable
On insère l'acide nucléique (par exemple l'ADNc ou l'ADN génomique) encodant le polypeptide ligand naturel ou variant pour le mpl dans un vecteur réplicable pour le clonage ultérieur (amplification de l'ADN) ou à des fins d'expression. Un grand nombre de vecteurs sont disponibles et la sélection du vecteur approprié dépendra (1) du fait de savoir s'il doit être utilisé pour l'amplification d'ADN ou pour l'expression d'ADN, (2) de la dimension de l'acide nucléique à insérer dans le vecteur et (3) de la cellule hôte à transformer avec le vecteur. Chaque vecteur contient divers composants dépendant de sa fonction (amplification de l'ADN ou expression de l'ADN) et de la cellule hôte avec laquelle il est compatible.

Les composants vectoriels englobent généralement, sans y être limités, un ou plusieurs des composants désignés ci-après : une séquence signal, une origine de réplication, un ou plusieurs gènes marqueurs, un élément amplificateur, un promoteur et une séquence de terminaison de transcription.

(i) Composant de séquence signal
Le ligand pour le mpl de la présente invention peut être exprimé non seulement directement, mais également sous forme d'une fusion avec un polypeptide hétérologue, de préférence une séquence signal ou un autre polypeptide possédant un site de clivage spécifique à la terminaison N de la protéine ou du polypeptide mature. En général, la séquence signal peut être un composant du vecteur ou bien elle peut faire partie de l'ADN du ligand pour le mpl qui est inséré dans le vecteur. La séquence signal hétérologue sélectionnée doit être une séquence qui est reconnue et qui est traitée (c'est-à-dire clivée par une peptidase signal) par la cellule hôte.

Pour des cellules hôtes procaryotes qui ne reconnaissent ni ne traitent la séquence signal naturelle du ligand pour le mpl, on substitue la séquence signal par une séquence signal procaryote sélectionnée, par exemple à partir du groupe comprenant l'alcaline phosphatase, la pénicillinase, lpp ou encore des séquences de tête d'entérotoxines II stables à la chaleur. Pour une sécrétion de levure, la séquence signal naturelle peut être substituée par exemple par l'invertase de levure, le facteur alpha ou encore des séquences de tête d'acide phosphatase, la séquence de tête glucoamylase de C. albicans (EP 362.179 publié le 4 avril 1990) ou encore le signal décrit dans le WO 90/13646 publié le 15 novembre 1990.

Dans l'expression de cellules de mammifères, la séquence signal naturelle (c'est- à-dire la préséquence du ligand pour le mpl qui dirige normalement la sécrétion du ligand pour le mpl à partir de ses cellules de mammifères naturelles in vivo) donne satisfaction, bien que d'autres séquences de mammifères puissent être appropriées, telles que des séquences signal provenant d'autres polypeptides ligands pour le mpl ou du même ligand pour le mpl appartenant à une espèce animale différente, des séquences signal provenant d'un ligand pour

le mpl et des séquences signal provenant de polypeptides sécrétés de la même espèce ou d'une espèce apparentée, ainsi que des séquences de tête sécrétoires virales, par exemple le signal herpès simplex gD.

* (ii) Composant d'origine de réplication
A la fois les vecteurs d'expression et de clonage contiennent une séquence d'acides nucléiques qui permet au vecteur de répliquer dans une ou plusieurs cellules hôtes sélectionnées. En général, dans des vecteurs de clonage, cette séquence est une séquence qui permet au vecteur de répliquer indépendamment de l'ADN chromosomique hôte et qui englobe des origines de réplication ou des séquences à réplication autonome. De telles séquences sont bien connues pour diverses bactéries, levures et virus. L'origine de réplication du plasmide pBR322 est appropriée pour la majeure partie des bactéries Gram-négatif, l'origine plasmidique 2y est appropriée pour la levure et diverses origines virales (SV40, polyome, adénovirus, VSV ou BPV) sont utiles pour des vecteurs de clonage dans des cellules de mammifères.

En général, le composant d'origine de réplication n'est pas requis pour des vecteurs d'expression de mammifères (l'origine SV40 peut être utilisée de manière spécifique uniquement parce qu'elle contient le promoteur précoce).

La plupart des vecteurs d'expression sont des vecteurs "navettes", c'est-à-dire qu'ils sont capables d'une réplication dans au moins une classe d'organismes, mais qu'ils peuvent être transfectés dans un autre organisme à des fins d'expression. Par exemple, un vecteur est cloné dans E. coli et ensuite, le même vecteur est transfecté dans des cellules de levures ou de mammifères à des fins

d'expression même s'il n'est pas capable d'une réplication indépendante du chromosome cellulaire hôte.

L'ADN peut également être amplifié par insertion dans le génome hôte. On réalise aisément cette caractéristique en utilisant l'espèce Bacillus comme hôtes, par exemple en englobant dans le vecteur une séquence d'ADN qui est complémentaire à une séquence que l'on trouve dans l'ADN génomique de Bacillus. La transfection de Bacillus avec ce vecteur donne lieu à une recombinaison homologue avec le génome et à une insertion de l'ADN du ligand pour le mpl.

Toutefois, la récupération de l'ADN génomique encodant le ligand pour le mpl est plus complexe que celle d'un vecteur répliqué par voie exogène, étant donné que la digestion par enzyme de restriction est requise pour exciser l'ADN du ligand pour le mpl.

(iii) Composant du gène de sélection
Des vecteurs d'expression et de clonage doivent contenir un gène de sélection que l'on désigne également par l'expression"marqueurs sélectionnables". Ce gène encode une protéine nécessaire pour la survie ou la croissance, dans un milieu de culture sélectif, de cellules hôtes transformées. Des cellules hôtes non transformées avec le vecteur contenant le gène de sélection ne survivront pas dans le milieu de culture.

Des gènes de sélection spécifiques encodent des protéines qui (a) confèrent une résistance à des antibiotiques ou à d'autres toxines, par exemple l'ampicilline, la néomycine, le méthotrexate ou la tétracycline, (b) complémentent des déficiences auxotrophiques ou (c) procurent des constituants alimentaires critiques non disponibles à partir de milieux complexes, par exemple le gène encodant la D-alanine racémase pour des Bacilli.

Un exemple d'un schéma de sélection utilise un médicament pour bloquer la croissance d'une cellule hôte.

Ces cellules qui sont transformées avec succès avec un gène hétérologue expriment une protéine conférant de la résistance aux médicaments et ainsi, survivent au schéma de sélection. Des exemples de sélection dominante de ce type utilisent les médicaments néomycine (Southern et
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collaborateurs, J. Molec. Appl. Genet., 1 : 327 [1982], l'acide mycophénolique (Mulligan et collaborateurs, Science, 209 : 1422 [1980]) ou l'hygromycine Sugden et collaborateurs, Mol. Cell. Biol., 5 : 410-413 [1985]). Les trois exemples donnés ci-dessus utilisent des gènes bactériens sous le contrôle eucaryote pour conférer de la résistance aux médicaments appropriés G418 ou néomycine (généticine), xgpt (acide mycophénolique) ou hygromycine, respectivement.

Des exemples de marqueurs sélectionnables appropriés pour des cellules de mammifères sont ceux qui permettent l'identification de cellules compétentes pour fixer l'acide nucléique du ligand pour le mpl tel que la dihydrofolate réductase (DHFR) ou la thymidine kinase. Les transformants de cellules de mammifères sont soumis à une pression de sélection telle que seuls les transformants sont uniquement adaptés pour survivre en vertu du fait qu'ils ont fixé leur marqueur. La pression de sélection est imposée par culture des transformants dans des conditions dans lesquelles on modifie successivement la concentration de l'agent de sélection dans le milieu, donnant ainsi lieu à l'amplification à la fois du gène de sélection et de l'ADN qui encode le polypeptide ligand pour le mpl.

L'amplification concerne le processus par lequel des gènes requis en plus grand nombre pour la production d'une protéine critique pour la croissance sont réitérés en tandem dans les chromosomes de génération successive de cellules

recombinantes. On synthétise des quantités croissantes du ligand pour le mpl à partir de l'ADN amplifié.

Par exemple, on identifie d'abord des cellules transformées avec le gène de sélection DHFR en cultivant tous les transformants dans un milieu de culture qui contient le méthotrexate (Mtx), un antagoniste compétitif de la DHFR. Une cellule hôte appropriée lorsqu'on utilise la DHFR de type sauvage est la lignée de cellules ovariennes de cobayes chinois (CHO) qui manifestent une déficience quant à l'activité DHFR, préparée et propagée comme décrit par Urlaub et Chasiin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 : 4216 [1980]. Les cellules transformées sont alors exposées à des teneurs croissantes en Mtx. Ceci donne lieu à la synthèse de copies multiples du gène DHFR et de manière concomitante à des copies multiples d'autres ADN comprenant les vecteurs d'expression tels que l'ADN encodant le ligand pour le mpl.

Cette technique d'amplification peut être utilisée avec n'importe quel hôte par ailleurs approprié, par exemple CHOKl ATCC CCL61, malgré la présence de DHFR endogène, si par exemple on utilise un gène DHFR mutant qui manifeste une résistance élevée à Mtx (EP 117.060). En variante, on peut sélectionner des cellules hôtes [en particulier des hôtes de type sauvage qui contiennent le DHFR endogène] transformées ou cotransformées avec des séquences d'ADN encodant le ligand pour le mpl, une protéine DHFR de type sauvage, ainsi qu'un autre marqueur sélectionnable tel que l'aminoglycoside 3'phosphotransférase (APH), par croissance cellulaire dans un milieu contenant un agent de sélection pour le marqueur sélectionnable tel qu'un antibiotique aminoglycoside, par exemple la kanamycine, la néomycine ou G418.

Voir le brevet US 4.965. 199.

Un gène de sélection approprié à utiliser dans la levure est le gène trpl présent dans le plasmide de levure YRp7 (Stinchcomb et collaborateurs, Nature, 282 : 39 [1979] ; Kingsman et collaborateurs, Gene, 7 : 141 [1979] ; ou Tschemper et collaborateurs, Gene, 10 : 157 [1980]). Le gène trpl procure un marqueur de sélection pour une souche mutante de levure à laquelle fait défaut l'aptitude à croître dans le tryptophane, par exemple ATCC 44076 ou PEP4-1 (Jones, Genetics, 85 : 12 [1977]). La présence de la lésion trpl dans le génome de la cellule hôte de levure procure alors un environnement efficace pour la détection de la transformation par croissance en l'absence du tryptophane.

De la même manière, des souches de levure déficientes en Leu2 (ATCC 20.622 ou 38.626) sont complémentées par des plasmides connus portant le gène Leu2.
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(iv) Composant de promoteur
Des vecteurs d'expression et de clonage contiennent habituellement un promoteur qui est reconnu par l'organisme hôte et qui est lié de manière opérationnelle à l'acide nucléique du ligand pour le mpl. Des promoteurs sont des séquences non traduites situées en amont (5') du codon de départ d'un gène de structure (en général, dans l'intervalle d'environ 100 à 1.000 pb) qui commandent la transcription et la traduction d'une séquence particulière d'acides nucléiques, telle que la séquence d'acides nucléiques du ligand pour le mpl à laquelle ils sont liés de manière opérationnelle. De tels promoteurs font spécifiquement partie de deux classes, inductible et constitutive.

Des promoteurs inductibles sont des promoteurs qui déclenchent une augmentation des taux de transcription à partir de l'ADN sous leur contrôle en réponse à un certain changement dans les conditions de culture, par exemple la présence ou l'absence d'une substance nutritive ou un changement de

température. A l'heure actuelle, on connaît bien un grand nombre de promoteurs reconnus par diverses cellules hôtes potentielles. Ces promoteurs sont liés de manière opérationnelle à l'ADN encodant le ligand pour le mpl en éliminant le promoteur de l'ADN source par digestion par enzyme de restriction et en insérant dans le vecteur, la séquence isolée du promoteur.

On peut utiliser à la fois la séquence de promoteurs du ligand naturel pour le mpl et un grand nombre de promoteurs hétérologues pour diriger l'amplification et/ou l'expression de l'ADN du ligand pour le mpl. Toutefois, on préfère des promoteurs hétérologues, étant donné qu'ils permettent généralement d'obtenir une plus grande transcription et des rendements supérieurs en ligand pour le mpl exprimé par comparaison au promoteur du ligand naturel pour le mpl.

Des promoteurs appropriés à utiliser avec des hôtes procaryotes- englobent les systèmes de promoteurs de bêtalactamase et de lactose (Chang et collaborateurs, Nature, 275 : 615 [1978] ; et Goeddel et collaborateurs, Nature, 281 : 544 [1979]), l'alcaline phosphatase, un système de promoteur de tryptophane (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8 : 4057 [1980] et EP 36.776), ainsi que des promoteurs hybrides tels que le promoteur tac (deBoer et collaborateurs, proc. Natl. Acad. Sei., USA, 80 : 21-25 [1983]). Toutefois, d'autres promoteurs bactériens connus sont appropriés.

Leurs séquences nucléotidiques ont été publiées, permettant ainsi à l'homme de métier de les ligaturer de manière opérationnelle à l'ADN encodant le ligand pour le mpl (Siebenlist et collaborateurs, Cell., 20 : 269 [1980] en utilisant des lieurs ou des adaptateurs pour procurer n'importe quels sites de restriction requis. Des promoteurs à utiliser dans des systèmes bactériens contiendront également une séquence de Shine-Dalgarno (S. D.)

liée de manière opérationnelle à l'ADN encodant le polypeptide ligand pour le mpl.

On connaît des séquences de promoteurs pour les eucaryotes. Virtuellement, tous les gènes eucaryotes possèdent une région riche en AT située approximativement à une distance de 25 à 30 bases en amont par rapport au site auquel on déclenche la transcription. Une autre séquence que l'on trouve à une distance de 70 à 80 bases en amont par rapport au début de la transcription d'un grand nombre de gènes est une région CXCAAT où X peut représenter n'importe quels nucléotides. A l'extrémité 3'de la plupart des gènes eucaryotes, on trouve une séquence AATAAA qui peut être le signal pour l'addition de la queue poly A à l'extrémité 3' de la séquence de codage. Toutes ces séquences sont insérées de manière appropriée dans des vecteurs d'expression eucaryotes.

Des exemples de séquences de promotion appropriées à utiliser avec des hôtes de levure englobent les promoteurs pour la 3-phosphoglycérate kinase (Hitzeman et collaborateurs, J. Biol. Chem., 255 : 2073 [1980] ou encore d'autres enzymes glycolytiques (Hess et collaborateurs, J.

Adv. Enzyme, Reg., 7 : 149 [1968] ; et Holland, Biochemistry, 17 : 4900 [1978], tels que l'énolase, la glycéraldéhyde-3phosphate déshydrogénase, l'hexokinase, la pyruvate décarboxylase, la phosphofructokinase, la glucose-6phosphate isomérase, la 3-phosphoglycérate mutase, la pyruvate kinase, la trioséphosphate isomérase, la phosphoglucose isomérase et la glucokinase.

D'autres promoteurs de levures, à savoir des promoteurs inductibles possédant l'avantage supplémentaire d'une transcription contrôlée par des conditions de croissance, sont les régions de promoteurs pour la déshydrogénase

2 alcoolique, l'isocytochrome C, la phosphatase acide, des enzymes de dégradation associées au métabolisme de l'azote, la métallothionéine, la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase, ainsi que des enzymes responsables de l'utilisation du maltose et du galactose. Des vecteurs et des promoteurs appropriés à utiliser dans l'expression de la levure sont décrits plus en détail dans Hitzeman et collaborateurs, EP 73.657A. Des amplificateurs de levures sont également utilisés de manière avantageuse avec des promoteurs de levures.

La transcription du ligand pour le mpl à partir de vecteurs dans des cellules hôtes de mammifères est commandée par exemple par des promoteurs que l'on obtient à partir des génomes de virus tels que le virus de polyome, le virus fowipox (brevet britannique 2.211. 504) publié le 5 juillet 1989), l'adénovirus (tel que l'adénovirus 2), le virus de papillome bovin, le virus de sarcome avien, le cytomégalovirus, un rétrovirus, le virus de l'hépatite B et, de manière de loin préférée, le virus simien 40 (SV40), à partir de promoteurs hétérologues de mammifères, par exemple le promoteur d'actine ou encore un promoteur d'immunoglobuline, à partir de promoteurs à chocs thermiques et à partir du promoteur normalement associé à la séquence du ligand pour le mpl à condition que des promoteurs de ce type soient compatibles avec les systèmes de la cellule hôte.

Les promoteurs précoces et tardifs du virus SV40 sont obtenus de manière adéquate sous forme d'un fragment de restriction SV40 qui contient également l'origine virale de réplication du SV40. Fiers et collaborateurs, Nature, 273 : 113 [1978] ; Mulligan et Berg, Science, 209 : 1422-1427 [1980] ; Pavlakis et collaborateurs, Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, 78 : 7398-7402 [1981]. Le promoteur précoce immédiat du

cytomégalovirus humain est obtenu de manière adéquate comme fragment de restriction HindIII E. Greenaway et collaborateurs, Gene, 18 : 355-360 [1982]. Un système pour exprimer l'ADN dans des hôtes de mammifères en utilisant le virus de papillome bovin comme vecteur est révélé dans le brevet US 4.419. 446. Une modification de ce système est décrite dans le brevet US 4.601. 978.

Voir également Gray et collaborateurs, Nature, 295 : 503-508 [1982] concernant l'expression d'ADNc encodant l'interféron humain dans des cellules de singes ; Reyes et collaborateurs, Nature, 297 : 598-601 [1982] concernant l'expression de l'ADNc de bêta-interféron humain dans des cellules de souris sous le contrôle d'un promoteur de thymidine-kinase à partir du virus herpès simplex ; Canaani et Berg, Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 79 : 5166-5170 [1982] concernant l'expression du
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gène de l'interféron pi humain dans des cellules de souris et de lapins activées ; et Gorman et collaborateurs, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79 : 6777-6781 [1982] concernant l'expression de séquences bactériennes CAt dans des cellules de reins de singes CV-1, dans des fibroblastes embryonnaires de volailles, dans des cellules ovariennes de hamsters chinois, dans des cellules HeLa, et dans des cellules NIH- 3T3 de souris utilisant la longue répétition terminale du virus du sarcome de Rous comme promoteur.

(v) Composant d'élément amplificateur
La transcription d'un ADN encodant le ligand pour le mpl de la présente invention à l'intervention d'eucaryotes supérieurs est souvent accrue en insérant une séquence d'amplificateur dans le vecteur. Des amplificateurs sont des éléments d'ADN à action cis habituellement d'environ 10 à 300 pb, qui agissent sur un promoteur pour augmenter sa transcription. Les amplificateurs manifestent une indépendance relative par rapport à l'orientation et à la

position, et on les trouve aux positions 5' (Laimins et collaborateurs, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78 : 993 [1981]) et 3' (Lusky et collaborateurs, Mol.

Cell Bio., 3 : 1108 [1983]) par rapport à l'unité de transcription, à l'intérieur d'un intron (Banerji et collaborateurs, Cell, 33 : 729 [1983], ainsi que dans la séquence de codage ellemême (Osborne et collaborateurs, Mol. Cell. Bio., 4 : 1293 [1984]. On connaît actuellement un grand nombre de séquences d'amplificateurs provenant de gènes de mammifères (globine, élastase, albumine, alpha-fétoprotéine et insuline). Toutefois, de manière spécifique, on utilisera un amplificateur provenant d'un virus de cellules eucaryotes.

Des exemples englobent l'amplificateur SV40 sur le côté tardif de l'origine de réplication (pb 100-270), le promoteur/amplificateur précoce du cytomégalovirus, l'amplificateur de polyome sur le côté tardif de l'origine de réplication, ainsi que les amplificateurs de l'adénovirus. Voir également, Yaniv, Nature, 297 : 17-18 [1982] concernant des éléments d'amplification pour l'activation de promoteurs eucaryotes. L'amplificateur peut être épissé dans le vecteur aux positions 5'ou 3'par rapport à la séquence d'encodage du ligand pour le mpl, mais il est de préférence situé à un site 5'par rapport au promoteur.

(vi) Composant de terminaison de transcription
Des vecteurs d'expression utilisés dans des cellules hôtes eucaryotes (des cellules de levure, de champignons, d'insectes, de plantes, d'animaux, d'êtres humains ou encore des cellules nucléées provenant d'autres organismes multicellulaires) contiendront également les séquences nécessaires pour la terminaison de la transcription ou pour
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la stabilisation de l'ARNm. De telles séquences sont communément disponibles à partir des régions 5'non

traduite, et éventuellement 3'non traduite, d'ADN ou d'ADNc eucaryotes ou viraux. Ces régions contiennent des segments nucléotidiques transcrits sous forme de fragments polyadénylés dans la portion non traduite de l'ARNm encodant le ligand pour le mpl.

(vii) Construction et analyse des vecteurs
La construction de vecteurs appropriés contenant un ou plusieurs des composants répertoriés ci-dessus utilise des techniques de ligation classiques. Les plasmides ou des fragments d'ADN isolés sont clivés, adaptés à la demande et religaturés sous la forme désirée pour générer les plasmides requis.

Pour l'analyse dans le but de confirmer les séquences correctes dans les plasmides construits, on utilise les mélanges de ligation pour transformer la souche 294 de E. coli K12 (ATCC 31.446) et des transformants obtenus avec succès sont sélectionnés par la résistance à l'ampicilline ou à la tétracycline lorsque cela s'impose. On prépare les plasmides à partir des transformants, on les analyse par digestion par endonucléase de restriction et/ou on les séquence par le procédé de Messing et collaborateurs, Nucleic Acids Res., 9 : 309 [1981] ou par le procédé de Maxam et collaborateurs, Methods in Enzymology, 65 : 499 [1980].

(viii) Vecteurs d'expression transitoire
Sont particulièrement utiles dans la mise en oeuvre de la présente invention, des vecteurs d'expression qui procurent l'expression transitoire dans des cellules d'ADN de mammifères encodant le polypeptide ligand pour le mpl. En général, l'expression transitoire implique l'utilisation d'un vecteur d'expression qui est capable de répliquer de

manière efficace dans une cellule hôte de telle sorte que la cellule hôte accumule un grand nombre de copies du vecteur d'expression et, à son tour, synthétise des taux élevés d'un polypeptide désiré encodé par le vecteur d'expression.

Sambrook et collaborateurs, supra, pages 16.17-16. 22. Des systèmes d'expression transitoire comprenant un vecteur d'expression approprié et une cellule hôte permettent l'identification positive adéquate de polypeptides encodés par les ADN clonés, ainsi que le criblage rapide de tels polypeptides pour détecter les propriétés biologiques ou physiologiques désirées. Ainsi, des systèmes d'expression transitoire sont particulièrement utiles dans l'invention à des fins d'identification d'analogues et de variants du polypeptide ligand pour le mpl, qui possèdent l'activité biologique du polypeptide ligand pour le mpl.

(ix) Vecteurs de cellules de vertébrés appropriés, donnés à titre d'exemple
D'autres procédés, d'autres vecteurs et d'autres cellules hôtes appropriées pour l'adaptation à la synthèse du ligand pour le mpl dans des cultures de cellules recombinantes de vertébrés sont décrits dans Gething et collaborateurs, Nature, 293 : 620-625 [1981] ; Mantei et collaborateurs, Nature, 281 : 40-46 [1979] ; Levinson et collaborateurs ; EP 117.060 et EP 117.058. Un plasmide particulièrement utile pour l'expression de cultures de cellules de mammifères du ligand pour le mpl est le pRK5 (EP 307.247 ; brevet U. S-A-5. 258.287) ou pSV16B (Publication PCT No. WO 91/08291).

D. Sélection et transformation de cellules hôtes
Des cellules hôtes appropriées pour le clonage ou l'expression des vecteurs dans le présent document sont les cellules procaryotes, de levure ou eucaryotes supérieures décrites ci-dessus. Des procaryotes appropriés englobent des eubactéries telles que des organismes Gram-négatif ou Grampositif, par exemple E. coli, Bacilli tels que B. subtilis, les espèces Pseudomonas telles que P. aeruginosa, Salmonella typhimurium ou Serratia marcescans. Un hôte de clonage E. coli préféré est E. coli 294 (ATCC No. 31.446), bien que d'autres souches telles que E. coli B, E. coli X1776 (ATCC No. 31.537) et E. coli W3110 (ATCC No. 27.325) soient appropriées. Ces exemples sont donnés à titre d'illustration plutôt qu'à des fins de limitation.

De préférence, la cellule hôte doit sécréter des quantités minimales d'enzymes protéolytiques. En variante, des procédés de clonage in vitro, par exemple PCR ou dans d'autres réactions d'amplification d'acides nucléiques par polymérase, sont appropriés.

En plus des procaryotes, des microbes eucaryotes tels que des champignons filamenteux ou des levures sont des hôtes appropriés pour des vecteurs encodant le ligand pour le mpl. Saccharomyces cerevisiae, à savoir la levure commune du boulanger, constitue le micro-organisme le plus communément utilisé parmi les microorganismes hôtes eucaryotes inférieurs. Toutefois, un certain nombre d'autres genres, espèces et souches sont communément disponibles et utiles ici tels que Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature, 290 : 140 [1981] ; EP 139.383 publié le 2 mai 1985), des hôtes Kluyveromyces (brevet US-A-4.943. 529) tels que par exemple, K. lactis (Louvencourt et collaborateurs, J.

Bacteriol, 737 [1983]), K. fragilis, K. bulgaricus, K. thermotolerans et K. marxianus, yarrowia [EP 402. 226],

Pichia pastoris (EP 183,070 ; Sreekrishna et collaborateurs, J. Basic Microbiol., 28 : 265-278 [1988]), Candida, Trichoderma reesia (EP 244.234), Neurospora crassa (Case et collaborateurs, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 76 : 5259-5263 [1979], et des champignons filamenteux tels que, par exemple Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publié le 10 janvier 1991), et des hôtes Aspergillus tels que A. nidulans (Ballance et collaborateurs, Biochem. Biophys. Res.

Commun., 112 : 284-289 [1983] ; Tilburn et collaborateurs, Gene, 26 : 205-221 [1983] ; Yelton et collaborateurs, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 : 1470-1474 [1984]) et A. niger (Kelly et Hynes, EMBO J., 4 : 475-479 [1985])
Des cellules hôtes appropriées pour l'expression du ligand pour le mpl glycosylé dérivent d'organismes multicellulaires. De telles cellules hôtes sont aptes à un traitement complexe et à des activités de glycosylation. En principe, n'importe quelle culture de cellules eucaryotes supérieurs peut être utilisée, qu'elle provienne d'une culture de vertébrés ou d'invertébrés. Des exemples de cellules d'invertébrés englobent des cellules de plantes et d'insectes.

On a identifié un grand nombre de couches et de variants"baculoviraux", ainsi que des cellules hôtes permissives d'insectes correspondantes provenant d'hôtes tels que Spodoptera frugiperda (scarabée), Aedes aegypti (moustique), Aedes albopictus (moustique), Drosophila melanogaster (mouche du fruit) et Bombyx mori.

Voir, par exemple Luckow et collaborateurs, Bio/Technology, 6 : 47-55 [1988] ; Miller et collaborateurs, Genetic Engineering ; Setlow et collaborateurs, eds, Vol. 8 (Plenum Publishing 1986), pages 277-279 ; et Maeda et collaborateurs, Nature, 315 : 592-594 [1985]. Une variété de souches virales pour la transfection est disponible au public, par exemple le variant L-1 de Autographa californica NPV et la souche Bm-5 de Bombyx mori NPV, ainsi que des virus de ce type peuvent

être utilisés comme virus dans le présent document conformément à la présente invention, en particulier pour la transfection de cellules Spodoptera frugiperda
On peut utiliser, comme hôtes, des cultures de cellules végétales de coton, de mais, de pommes de terre, de soja,

de pétunia, de tomates et de tabac. Spécifiquement, des cellules végétales sont transfectées par incubation avec certaines souches de la bactérie Agrobacterium tumefaciens qui a été manipulée au préalable pour contenir l'ADN du ligand pour le mpl. Au cours de l'incubation de la culture de cellules végétales avec A. tumefaciens, l'ADN encodant le ligand pour le mpl est transféré dans l'hôte de cellules végétales de façon à la transfecter et il exprimera dans des conditions appropriées l'ADN du ligand pour le mpl. En outre, des séquences signal et de régulation compatibles avec des cellules végétales sont disponibles, telles que le promoteur de nopaline synthase et des séquences signal de polyadénylation. Depicker et collaborateurs, J. Mol. Appl.

Gen., 1 : 561 [1982]. En outre, des segments d'ADN isolés de la région en amont du gène 780 d'ADN-T sont capables d'activer ou d'augmenter les taux de transcription de gènes aptes à une expression végétale dans des tissus végétaux contenant de l'ADN recombinant. EP 321.196 publié le 21 juin 1989.

Toutefois, on a manifesté un très grand intérêt pour les cellules de vertébrés, et la propagation de cellules de vertébrés dans des cultures (cultures tissulaires) est devenue une procédure de routine ces dernières années (Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, editors [1973]). Des exemples de lignées cellulaires hôtes de mammifères utiles sont la lignée CV1 de rein de singe transformé par SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651) ; la lignée de rein embryonnaire humain (cellules 293 ou cellules 293

soumises à un sous-clonage à des fins de croissance dans une culture de suspension), Graham et collaborateurs, J. Gen.

Virol., 36 : 59 (1977)) ; des cellules de reins de hamsters (BHK, ATCC CCL 10) ; des cellules ovariennes de hamster chinois/-DHFR (CHO, Urlaub et Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, 77 : 4216 [1980]) ; des cellules sertoli de souris (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23 : 243-251 [1980]) ; des cellules de rein de singe (CV1 ATCC CCL 70) ; des cellules de rein de singe vert africain (VERO-76, ATCC CRL-1587) ; des cellules de carcinome de cerveau humain (HELA, ATCC CCL-2) ; des cellules de rein canin (MDCK, ATCC CCL 34) ; des cellules de foie de rat buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442) ; des cellules de poumon humain (W138, ATCC CCL 75) ; des cellules de foie humain (Hep G2, HB 8065) ; des tumeurs mammaires de souris (MMT 060562, ATCC CCL51) ; des cellules TRI (Mather et collaborateurs, Annals N. Y. Acad. Sci., 383 : 44-68 [1982] ; des cellules MRC 5 ; des cellules FS4 et une lignée d'hépatome humain (Hep G2).

Les cellules hôtes sont transfectées et de préférence transformées avec les vecteurs d'expression ou de clonage décrits ci-dessus de la présente invention et elles sont mises en culture dans des milieux nutritifs conventionnels modifiés de manière appropriée pour induire des promoteurs, des transformants de sélection ou pour amplifier les gènes encodant les séquences désirées.

La transfection désigne la fixation d'un vecteur d'expression par une cellule hôte sans tenir compte du fait de savoir si oui ou non les séquences de codage sont effectivement exprimées. De nombreux procédés de transfection sont connus de l'homme de métier ordinaire, par exemple CaPO4 et l'électroporation. On admet, en général, qu'une transfection est réussie lorsqu'on trouve une

quelconque indication de l'opération de ce vecteur à l'intérieur de la cellule hôte.

La transformation signifie l'introduction d'ADN dans un organisme de telle sorte que l'ADN soit réplicable, soit sous forme d'un élément extrachromosomique, soit à l'intervention d'un intégrant chromosomique. En fonction de la cellule hôte utilisée, on réalise la transformation en utilisant des techniques classiques appropriées pour de telles cellules. Le traitement au calcium qui utilise le chlorure de calcium, comme décrit dans la section 1.82 de Sambrook et collaborateurs, supra, est généralement utilisé pour des cellules procaryotes ou pour d'autres cellules qui contiennent des barrières importantes sous forme de parois cellulaires.

On utilise l'infection avec Agrobacterium tumefaciens pour la transformation de certaines cellules végétales, comme décrit par Shaw et collaborateurs, Gene, 23 : 315 [1983] et dans le WO 89/05859 publié le 29 juin 1989. En outre, on peut transfecter des plantes en utilisant un traitement aux ultrasons, comme décrit dans le WO 91/00358 publié le 10 janvier 1991. Pour des cellules de mammifères exemptes de telles parois cellulaires, on préfère le procédé de précipitation au phosphate de calcium de Graham et van der Eb, Virology, 52 : 456-457 [1978]. Des aspects généraux des transformations du système de cellules hôtes de mammifères ont été décrits par Axel dans le brevet US-A- 4.399. 216 publié le 16 août 1983.

Des transformations dans de la levure sont spécifiquement effectuées conformément au procédé de Van Solingen et collaborateurs, J. Bact., 130 : 946 [1977] et Hsio et collaborateurs, Proc. Natl. Acad. Sci (USA), 76 : 3829 [1979]. Toutefois, on peut également utiliser d'autres procédés pour introduire de l'ADN dans des cellules, par exemple par injection nucléaire, par électroporation ou par fusion de protoplastes.

E. Culture des cellules hôtes
On cultive des cellules procaryotes utilisées pour produire le polypeptide ligand pour le mpl de la présente invention dans des milieux appropriés, comme décrit en général dans Sambrook et collaborateurs, supra.

On peut cultiver les cellules hôtes de mammifères utilisées pour produire le ligand pour le mpl de la présente invention dans une variété de milieux. Des milieux disponibles dans le commerce, tels que HAM's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma) et le milieu de Eagle modifié par Dulbecco ([DMEM], Sigma) sont appropriés pour cultiver les cellules hôtes. En outre, on peut utiliser comme milieux de culture pour les cellules hôtes, n'importe quels milieux de ceux décrits dans Ham et Wallace, Meth. Enz., 58 : 44 [1979], Barnes et Sato, Anal.

Biochem., 102 : 255 [1980], dans les brevets US 4.767. 704, 4.657. 866,4. 927.762 ou 4.560. 655 ; dans le WO 90/03430 ; dans le WO 87/00195 ; dans le brevet US Re. 30.985 ; ou dans la demande de brevet U. S. S. N. 07/592.107 ou 07/592.141, toutes deux déposées le 3 octobre 1990, les divulgations de l'ensemble de ces documents étant incorporées ici à titre de référence.

A n'importe lequel de ces milieux, on peut ajouter, en fonction des nécessités, des hormones et/ou d'autres facteurs de croissance (tels que l'insuline, la transferrine ou le facteur de croissance épidermique), des sels (tels que le chlorure de sodium, le calcium, le magnésium et le phosphate), des tampons tels que HEPES, des nucléosides (tels que l'adénosine et la thymidine), des antibiotiques (tels que le médicament Gentamycin"), des oligo-éléments (définis comme étant des composés inorganiques habituellement présents dans des concentrations finales dans le domaine micromolaire), ainsi que du glucose ou encore une source d'énergie équivalente. N'importe quel

autre additif nécessaire peut également être inclus dans des concentrations appropriées connues de l'homme de métier.

Les conditions de culture, telles que la température, le pH et analogues, sont celles préalablement utilisées avec la cellule hôte sélectionnée pour l'expression et seront évidentes aux yeux de l'homme de métier.

Les cellules hôtes auxquelles on fait référence dans cette divulgation englobent des cellules dans des cultures in vitro, ainsi que des cellules se trouvant dans un animal hôte.

F. Amplification/expression du gène de détection
On peut mesurer l'amplification et/ou l'expression génique dans un échantillon de manière directe, par exemple par transfert Southern conventionnel, par transfert Northern pour quantifier la transcription de l'ARNm (Thomas, Proc.

Natl. Acad. Sci., USA, 77 : 5201-5205 [1980], le &commat;transfert par points" (dot blotting) (analyse d'ADN) ou encore l'hybridation in situ en utilisant une sonde marquée de manière appropriée, basée sur les séquences procurées ici.

On peut utiliser diverses marques, le plus communément des radio-isotopes, en particulier 32p. Toutefois, on peut également utiliser d'autres techniques telles que l'utilisation de nucléotides modifiés par de la biotine pour l'introduction dans un polynucléotides. La biotine sert alors de site pour la liaison à l'avidine ou à des anticorps qui peuvent être marqués avec une large gamme de marqueurs tels que des radionucléides, des agents fluorescents, des enzymes ou analogues. En variante, on peut utiliser des anticorps qui peuvent reconnaître des duplex spécifiques, y compris des duplex d'ADN, des duplex d'ARN et des duplex hybrides ADN-ARN ou encore des duplex d'ADN-protéine.

A leur tour, les anticorps peuvent être marqués et on peut

effectuer le dosage lorsque le duplex est lié à une surface, si bien qu'après la formation du duplex à la surface, on peut détecter la présence d'un anticorps lié au duplex.

En variante, on peut mesurer l'expression génique par des procédés immunologiques tels que la coloration immunohistochimique de coupes tissulaires, ainsi que des dosages de cultures cellulaires ou de fluides corporels pour quantifier directement l'expression du produit génique. Avec des techniques de coloration immunohistochimique, on prépare un échantillon cellulaire spécifiquement par déshydratation et fixation, puis par réaction avec des anticorps marqués spécifiques pour le produit génique couplé, dans lequel les marques sont habituellement détectables à l'oeil nu, telles que des marques enzymatiques, des marques fluorescentes, des marques luminescentes et analogues. Une technique de coloration particulièrement sensible, appropriée pour être utilisée dans la présente invention est décrite par Hsu et collaborateurs, Am. J.

Clin. Path., 75 : 734-738 [1980].

Des anticorps utiles pour la coloration immunohistochimique et/ou le dosage de fluides échantillons peuvent être, soit monoclonaux, soit polyclonaux, et on peut les préparer dans n'importe quels mammifères. De manière adéquate, on peut préparer les anticorps contre un polypeptide ligand naturel pour le mpl ou contre un peptide synthétique basé sur les séquences d'ADN procurées ici comme décrit ultérieurement ci-dessous.

G. Purification du polypeptide ligand pour le mpl
On récupère de préférence le ligand pour le mpl à partir du milieu de culture sous forme d'un polypeptide sécrété, bien qu'il puisse également être récupéré à partir de lysats de cellules hôtes lorsqu'il est directement exprimé sans signal sécrétoire.

Lorsque le ligand pour le mpl est exprimé dans une cellule recombinante autre qu'une cellule d'origine humaine, le ligand pour le mpl est complètement exempt de protéines ou de polypeptides d'origine humaine. Toutefois, il est toujours habituellement nécessaire de purifier le ligand pour le mpl par rapport aux autres protéines ou polypeptides de cellules recombinantes pour obtenir des préparations qui sont essentiellement homogènes comme l'est le ligand pour le mpl en soi. Dans une première étape, on centrifuge le milieu de culture-ou le lysat pour éliminer les débris cellulaires de forme particulaire. On sépare alors la membrane et les fractions protéiniques solubles. En variante, on peut utiliser un filtre de concentration protéinique disponible dans le commerce (par exemple des unités d'ultrafiltration Amicon ou Millipore Pellicon).

On peut alors purifier le ligand pour le mpl à partir de la fraction protéinique soluble et à partir de la fraction membranaire du lysat de culture en fonction du fait de savoir si le ligand pour le mpl est lié à une membrane. Par après, on purifie le ligand pour le mpl par rapport aux protéines et aux polypeptides solubles contaminants par relargage et par des procédés d'échange ou des procédés chromatographiques en utilisant diverses matrices de gel. Ces matrices englobent : l'acrylamide, l'agarose, le dextrane, la cellulose, ainsi que d'autres communes pour la purification protéinique.

Des procédés chromatographiques donnés à titre d'exemple, appropriés pour la purification protéinique englobent

l'immunoaffinité (par exemple le ligand Mab anti-hmpl), l'affinité à un récepteur (par exemple mpl-IgG ou protéine A-Sépharose), la chromatographie par interaction hydrophobe (HIC) (par exemple éther-, butyl-ou phényl-Toyopearl), la chromatographie à la lectine (par exemple Con A-Sépharose, lentil-lectin-Sépharose), l'exclusion de dimensions (par exemple Sephadex G-75), des colonnes d'échange de cations et d'anions (par exemple DEAE ou la carboxyméthyl-et la sulfopropyl-cellulose), ainsi que la chromatographie liquide à haut rendement en phase réverse (RP-HPLC) (voir, par exemple Urdal et collaborateurs, J.

Chromatog., 296 : 171 [1984] dans laquelle on utilise deux étapes séquentielles de RP-HPLC pour purifier la IL-2 humaine recombinante).

D'autres étapes de purification englobent éventuellement : la précipitation dans de l'éthanol, la précipitation dans du sulfate d'ammonium, la chromatofocalisation, le SDS-PAGE préparatif et analogues.

On récupère des variants du ligand pour le mpl dans lesquels des résidus ont été soumis à une délétion, insérés ou substitués, de la même manière que pour le ligand naturel pour le mpl en prenant en compte tous changements importants des propriétés occasionnés par la variation. Par exemple, la préparation d'une fusion du ligand pour le mpl avec une autre protéine ou un autre polypeptide, par exemple un antigène bactérien ou viral, facilite la purification ; on peut utiliser une colonne d'immuno-affinité contenant l'anticorps à l'antigène pour adsorber le polypeptide de fusion. On peut utiliser des colonnes d'immuno-affinité, telles qu'une colonne d'anti-ligand pour le mpl polyclonal de lapin, pour adsorber le variant du ligand pour le mpl en le liant à au moins un épitope humain restant.

En variante, on peut purifier le ligand pour le mpl par chromatographie par affinité en utilisant un mlp-IgG purifié, couplé à une résine (de préférence) immobilisée telle que Affi-Gel 10

(Bio-Rad, Richmond, CA) ou analogues, par des moyens bien connus dans la technique. On peut également utiliser un inhibiteur de protéase tel que le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) pour inhiber la dégradation protéolytique au cours de la purification et on peut englober des antibiotiques pour empêcher la croissance de contaminants éventuels.

L'homme de métier sera à même de déterminer si des procédés de purification appropriés pour le ligand naturel pour le mpl peuvent nécessiter une modification pour prendre en compte des changements quant au caractère du ligand pour le mpl ou de ses variants après expression dans une culture de cellules recombinantes.

H. Modifications covalentes du polypeptide ligand pour le mpl
Des modifications covalentes des polypeptides ligands pour le mpl sont incluses dans le cadre de la présente invention. On peut modifier de manière covalente à la fois le ligand naturel pour le mpl et des variants du ligand pour le mpl contenant des séquences d'aminoacides. Un type de modifications covalentes inclus dans le cadre de la présente invention est un fragment du ligand pour le mpl. On peut préparer de manière adéquate des fragments du variant du ligand pour le mpl possédant jusqu'à environ 40 résidus d'aminoacides par synthèse chimique ou par clivage enzymatique ou chimique du polypeptide ligand variant ou de longueur totale pour le mpl.

D'autres types de modifications covalentes du ligand pour le mpl ou des fragments de ce dernier sont introduites dans la molécule par réaction de résidus d'aminoacides ciblés du ligand pour le mpl ou des fragments de ce dernier avec un agent à dérivation organique qui est capable de réagir avec des chaînes latérales sélectionnées ou avec les résidus N-ou C-terminaux.

De manière la plus commune, on fait réagir des résidus de cystéinyle avec des a-halogénoacétates (et des amines correspondantes) tels que l'acide chloracétique ou le chloroacétamide pour obtenir des dérivés carboxyméthylés ou carboxyamidométhylés. On dérive également des résidus de cystéinyle par réaction avec la bromotrifluoracétone, l'acide a-bromo-P- (5-imidozoyl) propionique, le phosphate de chloracétyle, les N-alkylmaléimides, le disulfure de 3-
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nitro-2-pyridyle, le disulfure de méthyl-2-pyridyle, le p- chloromercuribenzoate, le 2-chloromercuri-4-nitrophénol ou encore le chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1, 3-diazole.

On dérive des résidus d'histidyle par réaction avec du pyrocarbonate de diéthyle à un pH de 5, 5-7, 0, étant donné que cet agent est relativement spécifique pour la chaîne latérale histidyle. Le bromure de para-bromophénacyle est également utile ; de préférence, on effectue la réaction dans du cacodylate de sodium 0,1 M à un pH de 6,0.

On fait réagir des résidus de lysinyle amino-terminaux avec l'anhydride d'acide succinique ou d'autres anhydrides d'acides carboxyliques. La dérivation avec ces agents a pour effet d'inverser la charge des résidus de lysinyle. D'autres réactifs appropriés pour la dérivation de résidus à teneur amino englobent des imido-esters tels que le picolinimidate de méthyle, le phosphate de pyridoxal, le pyridoxal, le chloroborohydrure, l'acide trinitrobenzène-sulfonique, la 0méthyliso-urée, la 2,4-pentanedione, ainsi qu'une réaction avec le glyoxylate catalysée par la transaminase.

On modifie des résidus d'arginyle par réaction avec un ou plusieurs réactifs conventionnels comprenant le phénylglyoxal, la 2, 3-butanedione, la 1, 2-cyclohexanedione et la ninhydrine. La dérivation de résidus d'arginine nécessite le fait de réaliser la réaction dans des

conditions alcalines, étant donné la valeur pKa élevée du groupe fonctionnel de guanidine. En outre, on peut faire réagir ces réactifs avec les groupes de lysine, ainsi qu'avec le groupe èpsilon-amino de l'arginine.

La modification spécifique de résidus de tyrosyle peut être réalisée avec un intérêt particulier en introduisant des marqueurs spectraux dans des résidus de tyrosyle par réaction avec des composés de diazonium aromatiques ou avec le tétranitrométhane. De manière la plus commune, on utilise le N-acétylimidizole et le tétranitrométhane pour former une espèce O-acétyl-tyrosyle et des dérivés 3-nitro, respectivement. On soumet des résidus de tyrosyle à une iodation en utilisant 125r ou 13lI pour préparer des protéines marquées à utiliser dans un radio-immunodosage, le procédé à la chloramine T décrit ci-dessus étant approprié.

On modifie sélectivement des groupes latéraux carboxyle (aspartyle ou glutamyle) par réaction avec des carbodiimides (R-N=C=N-R') où R et R'représentent différents groupes alkyle, tels que le l-cyclohexyl-3- (2-morpholinyl-4- éthyl) carbodiimide ou le 1-éthyl-3- (4-azonia-4, 4-diméthylphényl) carbodiimide. En outre, on transforme des résidus d'aspartyle et de glutamyle en résidus d'asparaginyle et de glutaminyle par réaction avec des ions ammonium.

La dérivation avec des agents bifonctionnels est utile pour opérer la réaction croisée du ligand pour le mpl à une surface ou une matrice de support insoluble dans l'eau à utiliser dans le procédé destiné à la purification d'anticorps anti-ligand pour le mpl et vice versa. Des agents de réaction croisée, communément utilisés englobent par exemple le l, l-bis (diazoacétyl)-2-phényléthane, le glutaraldéhyde, des esters de N-hydroxysuccinimide, par exemple des esters avec l'acide 4-azidosalicylique, des

imidoesters homobifonctionnels, y compris des esters disuccinimidyliques tels que le 3, 3'-dithiobis- (succinimidylpropionate), ainsi que des maléimides
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bifonctionnels tels que le bis-N-maléimido-1, 8-octane.

Des agents de dérivation tels que le méthyl-3- [ (p- azidophényl) dithio] propioimidate procurent des produits intermédiaires photoactivables qui sont capables de former des réactions croisées en présence de la lumière. En variante, on peut utiliser, pour l'immobilisation protéinique, des matrices réactives insolubles dans l'eau, telles que des carbohydrates activés au bromure de cyanogène, ainsi que les substrats réactifs décrits dans les brevets US-A-3.969. 287,3. 691.016, 4.195. 128,4. 247.642, 4.229. 537 et 4.330. 440.

On soumet fréquemment des résidus de glutaminyle et d'asparaginyle à une désamidation pour obtenir les résidus correspondants de glutamyle et d'aspartyle, respectivement.

On soumet ces résidus à une désamidation dans des conditions neutres ou basiques. La forme désamidée de ces résidus rentre dans le cadre de la présente invention.

D'autres modifications englobent l'hydroxylation de la proline et de la lysine, la phosphorylation de groupes hydroxyle de résidus de séryle ou de thréonyle, la méthylation des groupes a-amino des chaînes latérales de lysine, d'arginine et d'histidine (T. E. Creighton, Proteins : Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pages 79-86 [1983]), l'acétylation de l'amine Nterminale et l'amidation de n'importe quel groupe carboxyle C-terminal.

Un autre type de modification covalente du polypeptide ligand pour le mpl inclus dans le cadre de la présente invention comprend la modification du modèle naturel de glycosylation du polypeptide. Par le terme"modification", on désigne la délétion d'une ou de plusieurs fractions carbohydrates que l'on trouve dans le ligand naturel pour le mpl et/ou l'addition d'un ou de plusieurs sites de glycosylation qui ne sont pas présents dans le ligand naturel pour le mpl.

La glycosylation de polypeptides est spécifiquement, soit à liaison N, soit à liaison 0. La liaison N désigne la fixation de la fraction carbohydrate à la chaîne latérale d'un résidu d'asparagine. Les séquences tripeptidiques asparagine-X-sérine et asparagine-X-thréonine où X représente n'importe quel aminoacide, à l'exception de la proline, constituent les séquences de reconnaissance pour la fixation enzymatique de la fraction carbohydrate à la chaîne latérale d'asparagine. Ainsi, la présence de l'une ou l'autre de ces séquences tripeptidiques dans un polypeptide crée un site de glycosylation potentielle.

La glycosylation à liaison 0 désigne la fixation d'un des sucres de N-acétylgalactosamine, de galactose ou du xylose à un hydroxyaminoacide, le plus communément la sérine ou la thréonine, bien que l'on puisse également utiliser la 5hydroxyproline ou la 5-hydroxylysine.

On effectue de manière adéquate l'addition de sites de glycosylation au polypeptide ligand pour le mpl en modifiant la séquence d'aminoacides de telle sorte qu'elle contienne une ou plusieurs des séquences tripeptidiques décrites cidessus (pour des sites de glycosylation à liaison N). On peut également réaliser la transformation par addition d'un ou de plusieurs résidus de sérine ou de thréonine, ou par substitution à l'intervention de ces derniers, dans la

séquence du ligand naturel pour le mpl (pour des sites de glycosylation à liaison 0).

A des fins de facilité, on modifie de préférence la séquence d'aminoacides du ligand pour le mpl par des changements au niveau de l'ADN, en particulier par mutation de l'ADN encodant le polypeptide ligand pour le mpl à des bases présélectionnées de telle sorte que l'on génère des codons qui vont subir une traduction pour donner les aminoacides désirés. La ou les mutations d'ADN peuvent être réalisées en utilisant des procédés décrits ci-dessus sous l'intitulé"variants de séquences d'aminoacides du ligand pour le mpl".

Un autre procédé pour augmenter le nombre de fractions carbohydrates sur le ligand pour le mpl concerne le couplage chimique ou enzymatique de glycosides au polypeptide. Ces procédés sont avantageux en ce qu'ils ne nécessitent pas la production du polypeptide dans une cellule hôte qui possède des capacités de glycosylation pour la glycosylation à liaison N ou O. En fonction du mode de couplage utilisé, le ou les sucres peuvent être fixés à (a) l'arginine et l'histidine, (b) des groupes carboxyle libres, (c) des groupes sulfhydryle libres tels que ceux de la cystéine, (d) des groupes hydroxyle libres tels que ceux de la sérine, de la thréonine ou de l'hydroxyproline, (e) des résidus aromatiques tels que ceux de phénylalanine, de tyrosine ou de tryptophane ou (f) le groupe amide de la glutamine. Ces procédés sont décrits dans W.

O. 87/05330 publié le 11 septembre 1987 et dans Aplin et Wriston, CRC, Crit. Rev.

Biochem., pages 259-306 [1981].

L'élimination de fractions carbohydrate présentes sur le polypeptide ligand pour le mpl peut être réalisée par voie chimique ou par voie enzymatique. La déglycosylation chimique nécessite l'exposition du polypeptide au composé d'acide trifluorométhanesulfonique ou à un composé

équivalent. Ce traitement donne lieu au clivage de la plupart ou de la totalité des sucres, à l'exception du sucre de liaison (N-acétylglucosamine ou N-acétylgalactosamine), tout en laissant le polypeptide intact. La déglycosylation chimique est décrite par Hakimuddin et collaborateurs, Arch. Biochem. Biophys., 259 : 52 [1987] et par Edge et collaborateurs, Anal. Biochem., 118 : 131 [1981].

On peut réaliser le clivage enzymatique de fractions carbohydrate sur des polypeptides en utilisant diverses endo-et exoglycosidases, comme décrit par Thotakura et collaborateurs, Meth. Enzymol., 138 : 350 [1987].

On peut empêcher la glycosylation à des sites de glycosylation potentiels en utilisant le composé de tunicamycine comme décrit par Duskin et collaborateurs, J. Biol. Chem., 257 : 3105 [1982]. La tunicamycine bloque la formation de chaînons protéine-N-glycoside.

Un autre type de modification covalente du ligand pour le mpl comprend la liaison du polypeptide ligand pour le mpl à un polymère faisant partie de divers polymères non protéiniques, par exemple le polyéthylèneglycol, le polypropylèneglycol ou les polyoxyalkylènes, de la manière présentée dans les brevets US-A-4.640. 835,4. 496.689, 4.301. 144,4. 670.417, 4.791. 192 ou 4.179. 337.

On comprendra qu'un certain criblage du variant du ligand pour le mpl récupéré sera nécessaire pour sélectionner le variant optimal pour la liaison à un mpl et possédant l'activité biologique et/ou immunologique définie ci-dessus. On peut procéder à un criblage à des fins de stabilité dans la culture de cellules recombinantes ou dans le plasma (par exemple contre le clivage protéolytique), pour obtenir une affinité élevée à un membre mpl, pour la stabilité à l'oxydation, pour l'aptitude à être sécrété dans

des rendements élevés, et analogues. Par exemple, un changement dans le caractère immunologique du polypeptide ligand pour le mpl, tel que l'affinité pour un anticorps donné, est mesuré par un immunodosage de type compétitif.

D'autres modifications potentielles des propriétés protéiniques ou polypeptidiques, telles que la stabilité rédox ou thermique, l'hydrophobicité ou la sensibilité à la dégradation protéolytique, sont analysées par des procédés bien connus dans la technique.

17. Procédés généraux pour la préparation d'anticorps au ligand pour le mpl Préparation d'anticorps (i) Anticorps polyclonaux
On dresse généralement des anticorps polyclonaux à des polypeptides du ligand pour le mpl ou à des fragments dans des animaux par de multiples injections sous-cutanées (sc) ou intrapéritonéales (ip) du ligand pour le mpl et d'un adjuvant.

Il peut être utile de conjuguer le ligand pour le mpl ou un fragment contenant la séquence d'aminoacides cible à une protéine qui est immunogène dans l'espèce à immuniser, par exemple l'hémocyanine de la"patelle à trou de serrure", l'albumine de sérum, la thyroglobuline bovine ou l'inhibiteur de la trypsine de soja en utilisant un agent bifonctionnel ou un agent de dérivation, par exemple l'ester de maléimidobenzoylsul-fosuccinimide (conjugaison à l'intervention de résidus de cystéine), le Nhydroxysuccinimide (par des résidus de lysine), le
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glutaraldéhyde, l'anhydride succinique, SOCl, ou encore RlN=C=NR où R et RI représentent différents groupes alkyle.

On immunise des animaux contre le polypeptide ligand pour le mpl ou contre un fragment de ce dernier, contre des conjugués ou des dérivés immunogènes en combinant 1 mg ou 1 g du peptide ou du conjugué (pour des lapins ou des souris, respectivement) avec 3 volumes d'adjuvant complet de Freund et en injectant la solution par voie intradermique à des sites multiples. Un mois plus tard, on procède à une injection de rappel avec 1/5 à 1/10 de la quantité originale du peptide ou du conjugué dans l'adjuvant complet de Freund par injection sous-cutanée à des sites multiples. De sept à quinze jours plus tard, on saigne les animaux et on analyse le sérum pour détecter le titre de l'anticorps du ligand pour le mpl. On fait des injections de rappel aux animaux jusqu'à ce que le titre se trouve en plateau.

De préférence, on fait les injections de rappel aux animaux avec le conjugué du même ligand pour le mpl, mais conjugué à une protéine différente et/ou à l'intervention d'un réactif différent de liaison croisée. On peut également réaliser des conjugués dans des cultures de cellules recombinantes sous forme de fusions protéiniques. De même, on utilise des agents d'agrégation tels que l'alun pour augmenter la réponse immune.

(ii) Anticorps monoclonaux
On obtient des anticorps monoclonaux à partir d'une population d'anticorps essentiellement homogène, c'est-àdire que les anticorps individuels que comprend la population sont identiques, à l'exception de mutations éventuelles apparaissant naturellement, qui peuvent être présentes dans des quantités mineures. Ainsi, le modificateur"monoclonal"indique le caractère de l'anticorps comme n'étant pas un mélange d'anticorps discrets.

Par exemple, on peut préparer les anticorps monoclonaux du ligand pour le mpl de l'invention en utilisant le procédé d'hybridome décrit pour la première fois par Kohler et Milstein, Nature, 256 : 495 [1975] ou bien on peut les préparer par des procédés d'ADN recombinants (brevets US-A- 4.816. 567 [Cabilly et collaborateurs]).

Dans le procédé d'hybridome, on immunise une souris ou un autre animal hôte approprié tel qu'un hamster, comme décrit ci-dessus, pour obtenir des lymphocytes qui produisent ou qui sont capables de produire des anticorps qui vont se lier de manière spécifique à la protéine utilisée pour l'immunisation. En variante, on peut immuniser des lymphocytes in vitro. On fusionne alors des lymphocytes avec des cellules de myélome en utilisant un agent de fusion approprié tel que le polyéthylèneglycol pour obtenir une cellule d'hybridome (Goding, Monoclonal Antibodies : Principles. and Practice, pages 59-103 [Academic Press, 1986]).

On ensemence les cellules d'hybridomes ainsi préparées et on les fait croître dans un milieu de culture approprié qui contient de préférence une ou plusieurs substances qui inhibent la croissance ou la survie des cellules de myélome parentales non fusionnées. Par exemple, si les cellules de myélome parentales sont déficitaires en enzyme hypoxanthine guanine phosphoribosyl transférase, (HGPRT ou HPRT), le milieu de culture pour les hybridomes englobera spécifiquement l'hypoxanthine, l'aminoptérine et la thymidine (milieu HAT), des substances qui empêchent la croissance de cellules déficientes en HGPRT.

Des cellules de myélome préférées sont celles qui se fusionnent de manière efficace, qui apportent leur soutien à une expression stable de niveau élevé de l'anticorps par les cellules produisant l'anticorps sélectionné et qui sont sensibles à un milieu tel qu'un milieu HAT. Parmi elles, des lignées cellulaires de myélome préférées sont les lignées de myélome de muridés, telles que celles dérivées de tumeurs, de souris, MOCP-21 et MPC-ll disponible auprès du Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Californie, USA, et des cellules SP-2 disponibles auprès de la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA. Des lignées de cellules de myélome d'être humain et d'hétéromyélome de souris-être humain ont également été décrites pour la production d'anticorps monoclonaux humains (Kozbor, J.

Immunol., 133 : 3001 [1984] ; Brodeur et collaborateurs, Monoclonal Antibody Production techniques and Applications, pages 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987).

On soumet à un dosage le milieu de culture dans lequel croissent des cellules d'hybridomes, pour détecter la production des anticorps monoclonaux dirigés contre le ligand pour le mpl. De préférence, on détermine la spécificité de liaison d'anticorps monoclonaux obtenus par des cellules d'hybridomes par immunoprécipitation ou par dosage de liaison in vitro tel qu'un radio-immunodosage (RIA) ou un dosage immuno-absorbant à liaison enzymatique (ELISA).

On peut déterminer par exemple l'affinité de liaison de l'anticorps monoclonal par l'analyse de Scatchard de Munson et Pollard, Anal. Biochem., 107 : 220 [1980].

Après avoir identifié les cellules d'hybridomes qui produisent les anticorps possédant la spécificité, l'affinité et/ou l'activité désirées, on peut soumettre les clones à un sous-clonage en limitant les procédés de dilution et en les faisant croître par des procédés classiques (Goding, supra). Des milieux de culture appropriés à cet effet englobent, par exemple, le milieu de Eagle modifié par Dulbecco ou le milieu RPMI-1640. En outre, on peut faire croître les cellules d'hybridomes in vivo sous forme de tumeurs ascitiques chez un animal.

De manière appropriée, on sépare du milieu de culture, du fluide ascitique ou du sérum, les anticorps monoclonaux sécrétés par les sous-clones, par des procédés conventionnels de purification à l'immunoglobuline, tels que par exemple protéine A-Sépharose, la chromatographie à l'hydroxylapatite, l'électrophorèse sur gel, la dialyse ou la chromatographie par affinité.

On isole et on séquence aisément l'ADN encodant les anticorps monoclonaux de l'invention en utilisant des procédés conventionnels (par exemple, en utilisant des sondes oligonucléotidiques qui sont capables de se lier de manière spécifique à des gènes encodant les chaînes lourde et légère d'anticorps de muridés). Les cellules d'hybridomes de l'invention font office de source préférée d'un ADN de ce type. Une fois, isolé l'ADN peut être placé dans des vecteurs d'expression qui sont alors transfectés dans des cellules hôtes telles que des cellules COS de simiens, des cellules ovariennes de hamsters chinois (CHO) ou encore des cellules de myélome qui ne produisent par ailleurs pas de protéines d'immunoglobuline, pour obtenir la synthèse des anticorps monoclonaux dans les cellules hôtes recombinantes.

On peut également modifier l'ADN, par exemple en substituant la séquence de codage pour les domaines constants humains à

chaînes lourde et légère à la place des séquences homologues de muridés (Cabilly et collaborateurs, supra ; Morrison et collaborateurs, Proc. Nat. Acad. Sci., 81 : 6851 [1984]), ou bien en procédant à la jonction covalente à la séquence de codage d'immunoglobuline, la totalité ou une partie de la séquence de codage pour un polypeptide de nonimmunoglobuline.

Spécifiquement, de tels polypeptides de nonimmunoglobuline sont substitués aux ou mis à la place des domaines constants d'un anticorps de l'invention ou bien ils sont substitués aux domaines variables d'un site de combinaison à un antigène d'un anticorps de l'invention pour créer un anticorps chimère bivalent comprenant un site de combinaison à un antigène possédant une spécificité pour un ligand pour le mpl et un autre site de combinaison à un antigène possédant une spécificité pour un antigène différent.

On peut également préparer des anticorps chimères ou hybrides in vitro en utilisant des procédés connus dans la chimie protéinique de synthèse, y compris ceux impliquant des agents de liaisons croisées. Par exemple, on peut construire des immunotoxines en utilisant une réaction d'échange de disulfures ou en formant une liaison thioéther.

Des exemples de réactifs appropriés à cet effet englobent l'iminothiolate et le méthyl-4-mercaptobutyrimidate.

Pour des applications diagnostiques, les anticorps de l'invention seront spécifiquement marqués avec une fraction détectable. La fraction détectable peut être n'importe quelle fraction qui est capable de produire, soit directement, soit indirectement un signal détectable. Par exemple, la fraction détectable peut être un radio-isotope tel que 3H, 14C, 32p, 35S ou 125I, un composé fluorescent ou

chimioluminescent tel que l'isothiocyanate de fluorescéine, la rhodamine ou la luciférine ; des marqueurs isotopes radioactifs tels que par exemple 125I, 32p, 14C ou 3H, ou encore une enzyme telle que l'alcaline phosphatase, la ssgalactosidase ou la peroxydase de Armoracia lapathifolia.

N'importe quel procédé connu dans la technique pour conjuguer de manière séparée l'anticorps à la fraction détectable peut être utilisé, y compris les procédés décrits par Hunter et collaborateurs, Nature, 144 : 945 [1962] ; David et collaborateurs, Biochemistry, 13 : 1014 [1974] ; Pain et collaborateurs, J. Immunol. Meth., 40 : 219 [1981] ; et Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30 : 407 [1982].

On peut utiliser les anticorps de la présente invention dans n'importe quel procédé de dosage connu, tel que des dosages faisant appel à une liaison compétitive entre deux substances, des dosages directs et indirects en sandwich et des dosages par immunoprécipitation. Zola, Monoclonal Antibodies : A Manual of Techniques, pages 147-158 (CRC Press, Inc., 1987).

Les dosages faisant appel à une liaison compétitive entre deux substances s'appuient sur l'aptitude manifestée par un modèle marqué (qui peut être un ligand pour le mpl ou une portion de ce dernier apte à une réaction immunologique) à entrer en compétition avec l'analyte de l'échantillon pour l'essai (ligand pour le mpl) pour une liaison avec une quantité limitée de l'anticorps. La quantité du ligand pour le mpl dans l'échantillon pour l'essai est inversement proportionnelle à la quantité du modèle qui se lie aux anticorps.

Pour faciliter la détermination de la quantité du modèle qui se lie, on procède en général à l'insolubilisation des anticorps avant ou après la mise en compétition, si bien que le modèle et l'analyte qui sont

liés aux anticorps peuvent être séparés de manière commode du modèle et de l'analyte qui restent non liés.

Des dosages sandwich impliquent l'utilisation de deux anticorps, chacun étant capable de se lier à une portion immunogène (épitope) différente de la protéine (ligand pour le mpl) à détecter. Dans un dosage sandwich, l'analyte de l'échantillon pour l'essai est lié par un premier anticorps qui est immobilisé sur un support solide et par la suite, un second anticorps se lie à l'analyte, formant ainsi un complexe insoluble en trois parties. David & Green, brevet US-A-4.376. 110. Le second anticorps peut être, quant à lui, marqué avec une fraction détectable (dosage sandwich direct) ou bien on peut le mesurer en utilisant un anticorps antiimmunoglobuline qui est marqué par une fraction détectable (dosage sandwich indirect).

Par exemple, un type de dosage sandwich est un dosage ELISA ; dans quel cas, la fraction détectable est une enzyme (par exemple, la peroxidase de Armoracia lapathifolia).

(iii) Anticorps humanisés et humains
Des procédés pour"humaniser"des anticorps non humains sont bien connus dans la technique. En général, un anticorps humanisé possède un ou plusieurs résidus d'aminoacides qui ont été introduits à partir d'une source qui est non humaine.

On désigne souvent ces résidus d'aminoacides non humains comme étant des résidus "d'importation" qui sont spécifiquement récupérés à partir d'un domaine variable "d'importation". On peut réaliser essentiellement l'humanisation en suivant le procédé de Winter et collaborateurs (Jones et collaborateurs, Nature, 321 : 522-525 [1986] ; Riechmann et collaborateurs, Nature, 332 : 323-327 [1988] ; Verhoeyen et collaborateurs, Science, 239 : 1534-1536 [1988]), en remplaçant des séquences correspondantes d'un

anticorps humain par des CDR ou des séquences de CDR de rongeurs.

En conséquence, de tels anticorps"humanisés"sont des anticorps chimères (Cabilly et collaborateurs, supra) dans lesquels une quantité essentiellement inférieure à celle correspondant à un domaine variable humain intact a été remplacée par la séquence correspondante provenant d'une espèce non humaine. En pratique, des anticorps humanisés sont spécifiquement des anticorps humains dans lesquels certains résidus CDR et éventuellement certains résidus FR sont remplacés par des résidus provenant de sites analogues dans des anticorps de rongeurs.

Le choix de domaines variables humains, à la fois à chaînes lourde et légère, à utiliser pour préparer les anticorps humanisés, est très important pour réduire l'antigénicité. Conformément au procédé que l'on désigne par l'expression"qui convient le mieux", on crible la séquence du domaine. variable d'un anticorps de rongeur par rapport à la bibliothèque complète des séquences des domaines variables et humains connues. La séquence humaine qui est la plus proche de celle du rongeur est alors acceptée comme cadre humain (FR) pour l'anticorps humanisé (Sims et
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collaborateurs, J. Immunol. 151 : 2296 [1993] ; Chothia et Lesk, J. Mol. Biol., 196 : 901 [1987]). Un autre procédé utilise un cadre particulier dérivé de la séquence de consensus de tous les anticorps humains d'un sous-groupe particulier de chaînes légère ou lourde.

Le même cadre peut être utilisé pour plusieurs anticorps humanisés différents (Carter et collaborateurs, Proc. Natl. Acad. sci. USA., 89 : 4285 [1992] ; Presta et collaborateurs, J. Immunol., 151 : 2623 [1993].

En outre, il est important d'humaniser les anticorps en conservant une affinité élevée pour l'antigène, ainsi que d'autres propriétés biologiques favorables. Pour atteindre ce but, conformément à un procédé préféré, on prépare des anticorps humanisés par un procédé d'analyse des séquences parentales et de divers produits humanisés conceptuels en utilisant des modèles à trois dimensions des séquences parentales et humanisées. Les modèles d'immunoglobulines à trois dimensions sont disponibles dans le commerce et sont familiers de l'homme de métier. Des programmes d'ordinateurs sont disponibles, qui illustrent et affichent des structures conformationnelles à trois dimensions éventuelles de séquences sélectionnées d'immunoglobuline candidates.

L'inspection de ces affichages permet l'analyse du rôle que les résidus sont susceptibles de jouer dans le fonctionnement de la séquence d'immunoglobuline candidate, c'est-à-dire l'analyse des résidus qui influencent l'aptitude de l'immunoglobuline candidate à se lier à son antigène. De cette manière, on peut sélectionner et combiner des résidus FR à partir de la séquence consensus et d'importation pour obtenir la caractéristique d'anticorps désirée telle que l'augmentation de l'affinité pour le ou les antigènes cibles. En général, les résidus CDR sont impliqués de manière directe et de manière très importante dans le fait d'influencer la liaison à l'antigène.

Pour de plus amples détails, voir la demande US numéro de série 07/934.373 déposée le 21 août 1992, qui constitue une continuation-en-partie de la demande numéro de série 07/715.272 déposée le 14 juin 1991.

En variante, il est maintenant possible de produire des animaux transgéniques (par exemple des souris) qui sont capables, après immunisation, de produire un répertoire complet d'anticorps humains en l'absence de production d'immunoglobulines endogènes. Par exemple, on a décrit que

la délétion homozygote du gène de la région adjacente à la chaîne lourde (JH) dans des souris mutantes chimères et de lignée de germes donne lieu à une inhibition complète de la production d'anticorps endogènes. Le transfert de la série de gènes d'immunoglobulines humaines de la lignée de germes dans des souris mutantes de la lignée de germes de ce type donnera lieu à la production d'anticorps humains suite à la provocation par l'antigène. Voir, par exemple, Jakobovits et collaborateurs, Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, 90 : 2551-2555 [1993] ; Jakobovits et collaborateurs, Nature, 362 : 255-258 [1993] ; Bruggermann et collaborateurs, Year in Immuno, 7 : 33 [1993]. On peut également produire des anticorps humains dans des bibliothèques d'affichage de phages (Hoogenboom et Winter, J. Mol. Biol. 227,381 [1991] ; Marks et collaborateurs, J. Mol. Biol., 222,581 [1991]).
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(iv) Anticorps bispécifiques
Des anticorps bispécifiques sont des anticorps monoclonaux de préférence humains ou humanisés qui possèdent des spécificités de liaison pour au moins deux antigènes différents. Des procédés pour préparer des anticorps bispécifiques sont connus dans la technique.

De manière conventionnelle, la production recombinante d'anticorps bispécifiques se base sur la coexpression de deux paires de chaînes lourdes-chaînes légères d'immunoglobulines dans laquelle les deux chaînes lourdes possèdent des spécificités différentes (Millstein et Cuello, Nature, 305 : 537-539 [1983]. Grâce à l'arrangement aléatoire des chaînes lourde et légère de l'immunoglobuline, ces hybridomes (quadromes) produisent un mélange potentiel de dix molécules d'anticorps différentes dont seulement une possède la structure bispécifique correcte. La purification de la molécule correcte, que l'on effectue habituellement

par des étapes de chromatographie par affinité, est relativement compliquée et les rendements en produit sont faibles.

Des procédés similaires sont révélés dans la publication PCT WO 93/08829 (publiée le 13 mai 1993) et dans Traunecker et collaborateurs, EMBO, 10 : 3655-3659 [1991].

Conformément à une approche différente et plus préférée, on fusionne des domaines variables d'anticorps possédant les spécificités de liaison désirées (sites de combinaison anticorps-antigène) à des séquences d'immunoglobuline de domaine constant. De préférence, la fusion s'effectue avec un domaine constant d'immunoglobuline à chaîne lourde comprenant au moins une partie des régions d'articulation CH2 et CH3. Il est préférable que la première région constante à chaîne lourde (CH1) contenant le site nécessaire pour la liaison à la chaîne légère soit présente dans au moins une des fusions. On insère des ADN encodant les fusions de chaîne lourde de l'immunoglobuline et, si on le souhaite, la chaîne légère de l'immunoglobuline dans des vecteurs d'expression séparés et on les soumet à une cotransfection dans un organisme hôte approprié.

Ainsi, on obtient une grande flexibilité quant au réglage des proportions mutuelles des trois fragments polypeptidiques dans des formes de réalisation dans lesquelles des rapports inégaux des trois chaînes polypeptidiques utilisées dans la construction procurent des rendements optimaux. Toutefois, il est possible d'insérer les séquences de codage pour deux chaînes polypeptidiques ou pour l'ensemble de ces trois chaînes dans un seul vecteur d'expression lorsque l'expression d'au moins deux chaînes polypeptidiques dans des rapports égaux donne lieu à des rendements élevés ou lorsque les rapports ne revêtent pas une importance particulière.

Dans une forme de réalisation préférée de cette approche, les anticorps bispécifiques sont composés d'une chaîne lourde d'immunoglobuline hybride présentant une

première spécificité de liaison dans un bras et une paire de chaîne lourde-chaîne légère d'immunoglobuline hybride (procurant une seconde spécificité de liaison) dans l'autre bras. On a trouvé que cette structure asymétrique facilite la séparation du composé bispécifique désiré par rapport à des combinaisons de chaînes d'immunoglobulines non désirées, étant donné que la présence d'une chaîne légère d'immunoglobuline dans seulement une moitié de la molécule bispécifique procure une voie facile de séparation. Cette approche est révélée dans la demande pendante numéro de série 07/931.811 déposée le 17 août 1992.

Pour de plus amples détails de la génération d'anticorps bispécifiques, voir, par exemple, Suresh et collaborateurs, Methods in Enzymology, 121 : 210 [1986].

(v) Anticorps hétéroconjugués
Des anticorps hétéroconjugués rentrent également dans le cadre de la présente invention. Des anticorps hétéroconjugués sont composés de deux anticorps joints de manière covalente. De tels anticorps ont par exemple été proposés pour cibler des cellules de systèmes immuns par rapport à des cellules non désirées (brevet des Etats-Unis d'Amérique 4.676. 980), ainsi que pour le traitement de l'infection par HIV (publication PCT WO 91/00360 et WO 92/00373 ; EP 03089). On peut préparer des anticorps hétéroconjugués en utilisant n'importe quel procédé adéquat de liaisons croisées.

Des agents de liaisons croisées appropriés sont bien connus dans la technique et sont révélés dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique 4.676. 980, conjointement avec un certain nombre de techniques de liaisons croisées.

IV. Utilisation thérapeutique de la protéine mégacaryocytopoiétique ligand pour le mpl
Le ligand pour le mpl biologiquement actif possédant une fonction hématopoïétique effectrice et que l'on désigne ici comme étant une protéine mégacaryocytopoiétique ou thrombocytopoiétique (TPO)

peut être utilisé dans une préparation ou dans une formulation pharmaceutique stérile
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pour stimuler l'activité mégacaryocytopoiétique ou thrombopoiétique chez des patients souffrant de thrombocytopénie due à une production insuffisante de plaquettes, à une séquestration des plaquettes ou à une augmentation de la destruction de ces dernières.

On peut traiter efficacement l'hypoplasie de la moelle osseuse associée à la thrombocytopénie (par exemple l'anémie aplasique faisant suite à une chimiothérapie ou à un transplant de moelle osseuse) avec les composés de la présente invention, de même que des troubles tels que la coagulation intravasculaire disséminée (DIC), la thrombocytopénie immune (y compris l'ITP induit par HIV et l'ITP non induit par HIV), la thrombocytopénie idiopathique chronique, la thrombocytopénie congénitale, la myélodysplasie et la thrombocytopénie thrombotique. En outre, ces protéines mégacaryocytopoiétiques peuvent être utiles dans le traitement de maladies thrombocytotiques myéloprolifératives, ainsi que de la thrombocytose provenant de conditions inflammatoires et d'une déficience en fer.

Des utilisations préférées de la protéine mégacaryocytopoiétique ou thrombocytopoiétique (TPO) de la présente invention concernent son utilisation conjointe avec la chimiothérapie myélotoxique, la chimiothérapie myéloablative, et la thrombocytopénie due à l'insuffisance de moelle osseuse.

D'autres troubles encore habituellement traités avec les protéines mégacaryocytopoiétiques de la présente invention englobent des anomalies ou des dégradations provoquées à des plaquettes résultant de médicaments, d'empoisonnement ou d'activation sur des surfaces artificielles. Dans ces cas, les composés de la présente invention peuvent être utilisés pour stimuler le "bourgeonnement"de nouvelles plaquettes"non endommagées".

Pour obtenir une liste plus complète d'applications utiles, voir le"fondement"supra, en particulier, les sections (a)- (f), ainsi que les références qui y sont citées.

Les protéines mégacaryocytopoiétiques de la présente invention peuvent être utilisées seules ou en combinaison avec d'autres cytokines, hématopoïétines, interleukines, d'autres facteurs de croissance ou d'autres anticorps dans le traitement des troubles et des conditions identifiées cidessus. Ainsi, les composés de la présente invention peuvent être utilisés en combinaison avec d'autres protéines ou
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d'autres peptides possédant une activité thrombopoiétique, y compris G-CSF, GM-CSF, LIF, M-CSF, IL-1, IL-3, l'érythropoïétine (EPO), le ligand kit, IL-6 et IL-11.

On prépare les protéines mégacaryocytopoiétiques de la présente invention en mélange avec un support pharmaceutiquement acceptable. Cette combinaison thérapeutique peut être administrée par voie intraveineuse ou encore par voie nasale ou pulmonaire. La composition peut également être administrée par voie parentérale ou par voie sous-cutanée, si on le souhaite. Lorsqu'on l'administre de manière systématique, la composition thérapeutique doit être exempte de pyrogène et se trouver dans une solution acceptable par voie parentérale en ce qui concerne le pH, l'isotonicité et la stabilité. Ces conditions sont connues de l'homme de métier.

Pour le dire brièvement, on prépare

des formulations posologiques des composés de la présente invention à des fins d'entreposage ou d'administration en mélangeant le composé manifestant le degré désiré de pureté, avec des supports, des excipients ou des stabilisateurs acceptables du point de vue physiologique.

De telles matières sont non toxiques pour les receveurs, aux posologies et aux concentrations utilisées, et elles englobent des tampons tels que des sels de phosphate, de citrate, d'acétate, ainsi que d'autres sels d'acides organiques ; des antioxydants tels que l'acide ascorbique ; des peptides à faible poids moléculaire (inférieur à environ 10 résidus) tels que la polyarginine ; des protéines tels que l'albumine sérique, la gélatine ou des immunoglobulines ; des polymères hydrophiles tels que la polyvinylpyrrolidinone ; des aminoacides tels que la glycine, l'acide glutamique, l'acide aspartique ou l'arginine ; des monosaccharides, des disaccharides, ainsi que d'autres carbohydrates, y compris la cellulose ou ses dérivés, le glucose, le mannose ou la dextrine ; des agents de chélation tels que EDTA ; des alcools de sucre tels que le mannitol ou le sorbitol ;

des ions complémentaires tels que le sodium et/ou des agents tensioactifs non ioniques tels que Tween, Pluronics ou le polyéthylèneglycol.

On formule environ 0,5 à 500 mg d'un composé ou d'un mélange de la protéine mégacaryocytopoiétique, sous forme de l'acide ou de la base libre ou sous forme d'un sel pharmaceutiquement acceptable, avec un véhicule, un support, un excipient, un liant, un conservant, un stabilisateur, un aromatisant, physiologiquement acceptables, etc., comme indiqué par la pratique pharmaceutique admise. La quantité de l'ingrédient actif dans ces compositions est telle que l'on obtient une posologie appropriée dans le domaine indiqué.

On peut formuler des compositions stériles pour injection conformément à la pratique pharmaceutique conventionnelle. Par exemple, on peut souhaiter obtenir une dissolution ou une suspension du composé actif dans un véhicule tel que l'eau ou une huile végétale existant naturellement, telle que l'huile de sésame, l'huile d'arachide ou l'huile de semences de coton ou encore un véhicule gras synthétique tel que l'oléate d'éthyle, ou analogues. Des tampons, des conservants, des antioxydants et analogues peuvent être incorporés conformément à la pratique pharmaceutique admise.

Des exemples appropriés de préparations à libération retard englobent des matrices semi-perméables de polymères hydrophobes solides contenant le polypeptide, lesdites matrices ayant la forme d'articles façonnés, par exemple des films ou des microcapsules. Des exemples de matrices à libération retard englobent des polyesters, des hydrogels [par exemple le poly (méthacrylate) de 2-hydroxyéthyle, comme décrit par Langer et collaborateurs, J. Biomed.

Mater. Res., 15 : 167-277 [1981] et Langer, Chem. tech., 12 : 98-105 [1982] ou encore l'alcool polyvinylique], des polylactides (brevet des Etats-Unis d'Amérique 3.773. 919, EP 58.481), des copolymères d'acide L-glutamique et de gamma-éthyl-Lglutamate (Sidman et collaborateurs, Biopolymer, 22 : 547-556
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[1983], des copolymères non dégradables d'éthylène-acétate de vinyle (Langer et collaborateurs, supra) et des copolymères dégradables d'acide lactique-acide glycolique tels que le Lupron Depot (microsphères injectables composées d'un copolymère d'acide lactique-acide glycolique, et l'acétate de leuprolide), ainsi que l'acide poly-D- (-)-3- hydroxybutyrique (EP 133.988).

Bien que des polymères tels que éthylène-acétate de vinyle et acide lactique-acide glycolique permettent la libération de molécules pendant une période allant au-delà de 100 jours, certains hydrogels libèrent des protéines pendant des laps de temps plus courts. Lorsque des protéines encapsulées restent dans le corps pendant un long moment, elles peuvent se dénaturer ou s'agréger suite à l'exposition à l'humidité à 37 C, donnant lieu à une perte de l'activité biologique et à des changements possibles quant à l'immunogénicité. On peut mettre au point des stratégies rationnelles pour la stabilisation protéinique en fonction du mécanisme impliqué.

Par exemple, s'il s'avère que le mécanisme d'agrégation est une formation intermoléculaire de liaisons S-S par échange mutuel de disulfures, on peut obtenir la stabilisation en modifiant les résidus sulfhydryle, en procédant à une lyophilisation à partir de solutions acides, en réglant la teneur en humidité, en utilisant des additifs appropriés et en mettant au point des compositions de matrices de polymères spécifiques.

Les compositions de protéines mégacaryocytopoïétiques à libération retard englobent également la protéine mégacaryocytopoïétique emprisonnée dans des lyposomes. On prépare des lyposomes contenant la protéine mégacaryocytopoïétique par des procédés connus en soi : DE 3.218. 121 ; Epstein et collaborateurs, Proc. Natl. Acad.

Soi. USA, 82 : 3688-3692 [1985] ; Hwang et collaborateurs, proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 : 4030-4034 [1980] ; EP 52.322, EP 36.676 ; EP 88.046 ; EP 143.949 ; EP 142.641 ; la demande de brevet japonais 83-118008 ; les brevets des Etats-Unis d'Amérique 4.485. 045 et 4.544. 545 ; et EP 102.324. Ordinairement, les liposomes sont du type petit à une seule couche (environ 20-800 Angströms), dans laquelle la teneur lipidique est supérieure à environ 30 moles W de cholestérol, la proportion sélectionnée étant réglée pour

obtenir la thérapie optimale procurée par la protéine mégacaryocytopoiétique.

La posologie sera déterminée par le médecin traitant en prenant en compte divers facteurs connus pour modifier l'action des médicaments, y compris la gravité et le type de maladie, le poids du corps, le sexe, le régime, le moment et la voie d'administration, d'autres médications, ainsi que d'autres facteurs cliniques pertinents. Spécifiquement, le schéma posologique quotidien se situera dans le domaine de 0,1-100 g/kg de poids du corps. De préférence, la posologie se situera dans le domaine de 0, 1-50 g/kg de poids du corps. De manière plus préférée, la posologie se situera dans le domaine de 1 à 5 g/kg/jour. De manière facultative, le domaine posologique peut être le même que celui d'autres cytokines, en particulier G-CSF, GM-CSF et EPO.

Des posologies thérapeutiquement efficaces peuvent être déterminées par des procédés, soit in vitro, soit in vivo.

EXEMPLES
Sans description ultérieure, on pense que l'homme de métier ordinaire peut, en utilisant la description précédente et les exemples donnés à titre d'illustration, mettre en oeuvre et utiliser l'invention dans toute son étendue. Par conséquent, les exemples de mise en oeuvre font spécifiquement ressortir des formes de réalisation préférées de la présente invention et ne doivent pas être considérés comme limitant en aucune façon le reste de la divulgation.

EXEMPLE 1
Purification partielle du ligand pour le mpl d'un porcin
On récolte le plasma pauvre en plaquettes à partir de porcs anémiques aplasiques ou normaux. On rend des porcs aplasiques par rayonnement avec 900 cGy en irradiant la totalité du porc en utilisant un accélérateur linéaire de 4 mEV. Les porcs irradiés sont soutenus pendant 6-8 jours avec des injections intramusculaires de céfazolin. Ensuite, on retire leur volume de sang total sous anesthésie générale, on l'héparinise et on le centrifuge à 1800 x g pendant 30 minutes pour obtenir un plasma pauvre en plaquettes. L'activité stimulant les mégacaryocytes s'est avérée être maximale six jours après l'irradiation.

On porte le plasma de porcin aplasique obtenu auprès de porcs irradiés à 4M avec du NaCl et on agite pendant 30 minutes à la température ambiante. On élimine le précipité résultant par centrifugation à 3800 tours/minute dans un Sorvall RC3B et on charge le produit surnageant sur une colonne Phényl-Toyopearl (220 ml) équilibrée dans NaPO4 10 mM contenant NaCl 4M. On lave la colonne avec ce tampon jusqu'à ce que A280 soit < 0,05 et on élue avec dH20. On

dilue le pic protéinique élué avec dH20 pour obtenir une conductivité de 15 mS et on charge sur une colonne BlueSépharose équilibrée (240 ml) dans PBS. Ensuite, on lave la colonne avec 5 volumes de colonne chaque fois de PBS et de NaP04 10 mM (pH 7,4) contenant de l'urée 2M.

On élue les protéines de la colonne avec NaPO4 10 mM (pH 7,4) contenant de l'urée 2M et du NaCl 1M. On porte la teneur du pic protéinique élué en octylglucoside (n-octyl-ss-Dglucopyranoside) (0, 01%) et on le rend 1 mM, respectivement avec EDTA et Pefabloc (Boehringer Mannheim) et on le charge directement sur des colonnes CD4-IgG (Capon, D. J. et collaborateurs, Nature, 337 : 525-531 [1989] et mpl-IgG Ultralink (Pierce) reliées en tandem (voir ci-dessous). On retire la colonne CD4-IgG (2 ml) après avoir chargé l'échantillon et on lave la colonne mpl-IgG (4 ml) avec 10 volumes de colonne, respectivement de PBS et de PBS contenant NaCl 2M et on élue avec de la glycine-HCl 0,1 M, pH 2,25. On récolte les fractions dans 1/10 volume de Tris- HCl 1M (pH 8,0).

L'analyse des fractions éluées à partir de la colonne d'affinité au mpl par SDS-PAGE (4-20%, gel Novex) à laquelle on procède dans des conditions de réduction, révèle la présence de plusieurs protéines (figure 5). Des protéines qui se colorent à l'argent avec l'intensité la plus forte se séparent avec une valeur Mr apparente de 66.000, 55.000, 30.000, 28.000 et 14.000. Pour déterminer laquelle de ces protéines stimulent la prolifération des cultures cellulaires Ba/F3-mpl, on élue ces protéines du gel, comme décrit à l'exemple 2 ci-dessous.

Colonnes d'affinité Ultralink
On couple 10-20 mg de mpl-IgG ou de CD4-IgG dans PBS à 0,5 g de résine Ultralink (Pierce), comme décrit par les instructions du fabricant.

Construction et expression de mpl-IgG
On exprime, dans des cellules 293, une molécule chimère comprenant le domaine extracellulaire entier du mpl humain (aminoacides 1-491) et la région Fc d'une molécule IgG1 humaine. On obtient un fragment d'ADNc encodant les aminoacides 1-491 du mpl humain par PCR à partir d'une bibliothèque d'ADNc de cellules CMK mégacaryocytaires humaines et on le séquence. On insert un site Clal à l'extrémité 5'et un site BstEII à l'extrémité 3'. On clone ce fragment en amont de la région de codage Fc de l'IgGl dans un vecteur Bluescript entre le site Clal et les sites BstEII après digestion partielle du produit de PCR avec BstEII à cause de deux autres sites BstEII présents dans l'ADN encodant le domaine extracellulaire du mpl.

On fait en sorte que le site BstEII introduit à l'extrémité 31 du produit du mpl par PCR possède une région Fc dans le cadre avec le domaine extracellulaire mpl. On soumet le produit de construction à un sous-clonage dans un vecteur pRK5-tknéo entre les sites Clal et Xbal, et on s'en sert pour transfecter des cellules 293 de rein embryonnaire humain par le procédé faisant usage du phosphate de calcium. On sélectionne les cellules dans 0,4 mg/ml de G418 et on isole des clones individuels. On détermine l'expression de mpl-IgG à partir de clones isolés en utilisant un ELISA spécifique à la Fc humaine. Le meilleur clone d'expression possède un taux d'expression de 1-2 mg/ml de mpl-IgG.

Cellules d'expression de Ba/F3 mpl P
On clone un ADNc correspondant à la région de codage totale du mpl P humain dans pRK5-tknéo que l'on soumet ensuite à une linéarisation avec NotI et on s'en sert pour transfecter la lignée cellulaire Ba/F3 dépendant de IL-3 par électroporation (1 x 107 cellules, 9605F, 250 volts). Trois jours plus tard, on déclenche la sélection en présence de 2 mg/ml de G418. On sélectionne les cellules sous forme de regroupements ou bien on obtient des clones individuels en limitant la dilution dans des plaques à 96 puits. On maintient les cellules sélectionnées dans RPMI contenant FBS (15%), 1 mg/ml de G418, glutamine 20 mM, HEPES 10 mM et 100 g/ml de Pen-Strep.

L'expression du mpl P dans des clones sélectionnés est déterminée par analyse FACS en utilisant un anticorps polyclonal de lapin anti-mpl P.

Dosage du ligand pour le mpl de Ba/F3
On effectue le dosage du ligand pour le mpl, comme indiqué en figure 2. Pour déterminer la présence du ligand pour le mpl à partir de diverses sources, on prive de IL-3 des cellules mpl P-Ba/F3 contenant pendant 24 heures à une densité de cellules de 5 x 105 cellules/ml dans un incubateur humidifié à 370C dans C02 (5%) et de l'air. Suite à la privation de IL-3, on étale les cellules sur des plaques de culture à 96 puits à une densité de 50.000 cellules dans 200 Ml de milieux avec ou sans échantillon dilué et on cultive pendant 24 heures dans un incubateur de culture cellulaire. On ajoute 20 l de milieux RPMI exempt de sérum contenant 1 Ci de 3H-thymidine à chaque puits pendant les dernières 6-8 heures.

On récolte ensuite les cellules sur des plaques filtrantes GF/C à 96 puits et on lave à cinq reprises avec de l'eau. On quantifie les filtres en présence de 40 gl de fluide de

scintillation (Microscint 20) dans un compteur Packard Top Count.

EXEMPLE 2
Ligand pour le mpl d'un porcin à purification élevée
Protocole d'élution sur gel
On mélange, à la température ambiante, des quantités égales de ligand pour le mpl purifié par affinité (fraction 6 éluée de la colonne mpl-IgG) et d'un tampon pour échantillon 2X Laemmli sans agent de réduction et on les charge sur du gel de polyacrylamide Novex (4-20%) aussi vite que possible. On ne chauffe pas l'échantillon. A titre de témoin, on fait passer un tampon pour échantillon sans ligand dans une bande adjacente. On fait passer le gel à 4- 60C à 135 volts pendant approximativement 2 1/4 heures. Au départ, le tampon d'essai se trouve à la température ambiante. On retire ensuite le gel de la plaque et on retire la plaque d'un côté du gel.

On réalise un réplicat du gel sur de la nitrocellulose, comme suit : on humidifie un morceau de nitrocellulose avec de l'eau distillée et on le dépose avec précaution sur la face du gel exposée de façon à exclure les bulles d'air. On place des repères fiduciels sur la nitrocellulose et sur la plaque de gel de façon à pouvoir repositionner de manière précises les réplicats après coloration. Après approximativement 2 minutes, on retire avec précaution la nitrocellulose et on enveloppe le gel dans un emballage en plastique et on le place dans le réfrigérateur. On colore la nitrocellulose avec un colorant d'or pour protéine totale de Biorad en agitant d'abord dans 3 x 10 ml de Tween 20 (0, 1%) + NaCl 0,5 M + Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, pendant

approximativement 45 minutes, puis on purifie avec 3 x 10 ml d'eau pendant 5 minutes.

On ajoute ensuite le colorant d'or et on laisse se développer jusqu'à ce que les bandes soient visibles dans les modèles. On rince alors les réplicats avec de l'eau, on les place par-dessus l'emballage en plastique sur le gel et on les aligne avec précaution avec les repères fiduciels. On marque les positions des normes Novex sur la plaque de gel et on trace les lignes pour indiquer les positions d'incision. On retire alors la nitrocellulose et l'emballage plastique et on incise le gel le long des lignes indiquées avec une lame de rasoir aiguisée. Les incisions s'étendent au-delà des bandes pour échantillons de façon à pouvoir les utiliser pour déterminer les positions des tranches lorsque le gel est coloré. Après avoir éliminé les tranches, on colore le gel à l'argent et on mesure les positions des modèles et des marques d'incision.

On détermine les poids moléculaires correspondant aux positions de d'incision à partir des modèles Novex.

On place les 12 tranches de gel dans les cellules dans deux dispositifs d'électro-élution Biorad modèle 422. On utilise dans les cellules, des capsules membranaires ayant une section de poids moléculaire de 12-14 K. Le tampon d'élution est un tampon de bicarbonate d'ammonium 50 mM + SDS (0, 05%) (approximativement pH 7,8). On refroidit 1 l de tampon pendant approximativement 1 heure dans une chambre froide à 4-6 C avant l'emploi. On élue les tranches de gel à 10 ma/cellule (40 v en premier lieu) dans une chambre froide à 4-6 C. L'élution dure approximativement 4 heures. On élimine soigneusement les cellules et on élimine le liquide au-dessus de la fritte à l'aide d'une pipette. On retire la chambre d'élution et on élimine toute quantité de liquide au-dessus de la capsule membranaire à l'aide d'une pipette.

On retire le liquide dans la capsule membranaire avec une "Pipetman"et on conserve. On place alors des quantités

aliquotes de 50 gl d'eau purifiée dans la capsule, on agite et on élimine jusqu'à ce que tous les cristaux SDS soient dissous. On combine ces eaux de lavage avec le liquide conservé ci-dessus. Le volume total de l'échantillon d'élution est de 300-500 gl par tranche de gel. On place les échantillons dans une tubulure de dialyse de section 12-14K Spectrapor 4 de 10 mm que l'on imprègne pendant plusieurs heures d'eau purifiée. On les dialyse pendant une nuit à 4-6 C contre 600 ml d'une solution saline tamponnée au phosphate (PBS approximativement 4 mM dans du potassium) par six échantillons.

Le lendemain, on remet le tampon en place et on poursuit la dialyse pendant 2,5 heures. On retire ensuite les échantillons des sacs de dialyse et on les place dans des tubes de microcentrifugation. On place les tubes sur de la glace pendant 1 heure, on procède à une microcentrifugation à 14K/tours/minute pendant 3 minutes et on retire avec précaution le produit surnageant du SDS précipité. On place alors le produit surnageant sur de la glace pendant approximativement 1 heure supplémentaire et on procède à une nouvelle microcentrifugation pendant 4 minutes. On dilue le produit surnageant dans une solution saline tamponnée au phosphate et on le soumet au dosage de l'activité. On congèle les échantillons restants à-70 C.

EXEMPLE 3 Microséquençage du ligand pour le mpl d'un porcin
On concentre la fraction 6 (2,6 ml) provenant de la colonne d'affinité mpl-IgG sur un Microcon-10 (Amicon). Dans le but d'empêcher le ligand pour le mpl d'être absorbé par le Microcon, on rince la membrane avec SDS (1%) et on ajoute 5 ml de SDS (10%) à la fraction 6. On ajoute le tampon pour échantillon 20 gl de 2X à la fraction &num;6 après concentration dans le Microcon (20 l) et on charge le volume total

(40 gl) sur une seule bande d'un gel d'acrylamide à gradient de 4-20% (Novex). On se sert du gel en suivant le protocole Novex.

On équilibre ensuite le gel pendant 5 minutes avant de procéder à un électrotransfert dans un tampon d'acide 3- (cyclohexylamino)-l-propanesulfonique (CAPS) 10 mM, pH 11, 0, contenant du méthanol (10%). On effectue l'électrotransfert sur des membranes Immobilon-PSQ (Millipore) pendant 45 minutes à un courant constant de 250 mA dans une cellule de transfert Trans-Blot Biorad (32). On colore la membrane PVDF avec du bleu de Coomassie R-250 (0, 1%) dans du méthanol (40%), de l'acide acétique (0, 1%) pendant 1 minute et on décolore pendant 2-3 minutes avec de l'acide acétique (10%) dans du méthanol (50%). Les seules protéines visibles dans la plage de valeur Mr 18.000-35. 000 possèdent une valeur Mr de 30.000, 28.000 et 22.000.

On soumet les bandes à 30,28 et 22 kDA à un séquençage protéinique. On réalise un séquençage protéinique automatique sur un séquenceur de Applied Biosystem modèle 470A équipé d'un analyseur PTH mis en circuit. On modifie le séquenceur pour injecter 80-90% de l'échantillon (Rodriguez,
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J. Chromatogr., 350 : 217-225 [1985]). On ajoute de l'acétone (-12 gill) au solvant A pour équilibrer l'absorption UV. On séquence les protéines ayant subi un électrotransfert dans la cartouche"Blott". On intègre les pics avec un logiciel Justice Innovation en utilisant des interfaces Nelson Analytical 970. On réalise l'interprétation des séquences sur un VAX 5900 (Henzel et collaborateurs, J.

Chromatogr., 404 : 41-52 [1987]). Les séquences N-terminales (en utilisant un code lettré et en mettant les résidus incertains entre parenthèses), ainsi que la quantité de matière obtenue (entre parenthèses) sont présentés dans le tableau 2'.

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TABLEAU 2' Séquences amino-terminales du ligand pour le mpl
EMI197.2

<tb>
<tb> 30 <SEP> kDa <SEP> 11. <SEP> 8pmol]
<tb> 1 <SEP> 5 <SEP> 10 <SEP> 15 <SEP> 20 <SEP> 25
<tb> (S)PAPPA(C)DPRLLNKLLRDD(H/S)VLH(G)RL <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 30)
<tb> 28 <SEP> kDa <SEP> [0.5 <SEP> pmol]
<tb> 1 <SEP> 5 <SEP> 10 <SEP> 15 <SEP> 20 <SEP> 25
<tb> (S) <SEP> PAPPAXDPRLLNKLLRDD <SEP> (H) <SEP> VL <SEP> (H) <SEP> G <SEP> R <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 31
<tb> 18-22 <SEP> kDa <SEP> [0. <SEP> 5 <SEP> pmol]
<tb> 1 <SEP> 5 <SEP> 10
<tb> XPAPPAXDPRLX <SEP> N <SEP> K <SEP> SEO <SEP> ID <SEP> NO <SEP> :

EXEMPLE 4 Dosage de la mégacaryocytopoïèse en liquide
On dilue à 1/5 des cellules souches périphériques humaines (PCS) (obtenues auprès de patients consentants) avec des milieux IMDM (Gibco) et on centrifuge pendant 15 minutes à la température ambiante à 800 x g. On remet les pastilles cellulaires en suspension dans IMDM et on les étale sur Percoll (60%) (densité 1,077 g/ml) (Pharmacia) et on centrifuge à 800 x g pendant 30 minutes. On aspire à l'interface les cellules mononucléaires à faible densité et on les lave 2x avec IMDM et on les dépose à une concentration de 1-2 x 106 cellules/ml dans IMDM contenant FBS (30%) (volume final de 1 ml) dans des ensembles de culture tissulaire à 24 puits (Costar).

On ajoute de l'APP ou de l'APP appauvri en ligand pour le mpl à concurrence de 10% et on fait croître les cultures pendant 12-14 jours dans un incubateur humidifié à 370C dans C02 (5%) et de l'air. On fait également croître les cultures en présence de APP (10%)

avec 0,5 Mg de mpl-IgG que l'on ajoute aux jours 0,2 et 4. On appauvrit l'APP en ligand pour le mpl en faisant passer l'APP à travers une colonne d'affinité au mpl-IgG.

Pour quantifier la mégacaryocytopoièse dans ces cultures en suspension liquide, on utilise une modification de Solberg et collaborateurs, et on emploie un anticorps monoclonal IgG de muridé radiomarqué (HP1-1D) au GPIIbIIIa (procuré par Dr. Nichols, Mayo Clinic). On procède au radiomarquage de 100 Mg du HP1-1D (voir Grant, B. et collaborateurs, Blood, 69 : 1334-1339 [1987] avec 1 mCi de Na1251 en utilisant des perles enzymatiques (Biorad, Richmond, CA) comme décrit par les instructions du fabricant. On entrepose HP1-1D radiomarqué à-70 C dans du PBS contenant de l'octyl-glucoside (0, 01%). Les activités spécifiques typiques sont de 1-2 x 106 cpm/g ( > 95% précipités par 12,5% d'acide trichloracétique).

Pour chaque expérience particulière, on triple les cultures en suspension liquide. Après 12-14 jours de culture, on transfère les cultures de 1 ml dans des tubes eppendorf de 1,5 ml et on les centrifuge à 800 x g pendant 10 minutes à la température ambiante et on remet en suspension les pastilles cellulaires résultantes dans 100 gl de PBS contenant EDTA (0, 02%) et du sérum de veau (20%). On ajoute 10 ng de i-HPi-lD dans 50 cl de tampon de dosage aux cultures remises en suspension et on incube pendant 60 minutes à la température ambiante (RT) en agitant à l'occasion. Ensuite, on récolte les cellules par centrifugation à 800 x g pendant 10 minutes à RT et on lave 2x avec le tampon de dosage. On compte les pastilles pendant 1 minute dans un compteur gamma (Packard).

On détermine la liaison non spécifique en ajoutant 1 Mg de HP1-1D non marqué pendant 60 minutes, avant l'addition du HP1-1D marqué. On détermine la liaison spécifique comme étant la quantité

totale de 125i-HPl-lD lié moins celle liée en présence du HP1-1D non marqué en excès.

EXEMPLE 5
Amorces PCR oligonucléotidiques
En se basant sur la séquence d'aminoacides aminoterminale obtenue à partir des protéines de 30 kDa, de 28 kDa et de 18-22 kDa, on conçoit des oligonucléotides dégénérés pour les utiliser comme amorce d'amplification en chaîne par polymérase (PCR) (voir tableau 4). On synthétise deux groupes d'amorces, un groupe 20-mer à sens positif encodant les résidus d'aminoacides 2-8 (mpl 1) et un groupe 21-mer antisens complémentaire aux séquences encodant les aminoacides 18-24 (mpl 2).

TABLEAU 4
Regroupement d'amorces oligonucléotidiques dégénérées
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<tb>
<tb> m/1 <SEP> : <SEP> 5' <SEP> CCN <SEP> GCN <SEP> CCN <SEP> CCN <SEP> GCN <SEP> TGV <SEP> GA <SEP> 3' <SEP> (2 <SEP> 048 <SEP> fois <SEP> dégénéré <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 35)
<tb> mpl <SEP> 2:5' <SEP> NCC <SEP> RTG <SEP> NAR <SEP> NAC <SEP> RTG <SEP> RTC <SEP> RTC <SEP> 3' <SEP> (2 <SEP> MS <SEP> fois <SEP> dégénéré) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 36)
<tb>

Comme matrice pour le PCR, on utilise l'ADN génomique d'un porcin isolé à partir de lymphocytes du sang périphérique d'un porcin.

Le mélange réactionnel de 50 ml contient : 0,8 jug d'ADN génomique d'un porcin dans Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl2 3 mM, 100 g/ml de BSA, 400 JLM de dNTP, 1 M de chaque regroupement d'amorce et 2,5 unités de polymérase Taq. La dénaturation de départ de la matrice est réalisée à 940C pendant 8 minutes, celle-ci

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étant suivie de 35 cycles de 45 secondes à 94 C, de 1 minute à 550C et de 1 minute à 72 C. On laisse le cycle final se prolonger pendant 10 minutes à 72 C. On sépare les produits de PCR par électrophorèse sur du gel de polyacrylamide (12%) et on inspecte à l'oeil nu en colorant avec du bromure d'éthidium.

On pense que si la séquence d'aminoacides aminoterminale est encodée par un seul exon, on s'attend au fait que la taille du produit de PCR correct soit de 69 pb. On élue du gel un fragment d'ADN de cette taille et on le soumet à un sous-clonage dans pGEMT (Proméga). Des séquences
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de trois clones sont représentées ci-dessous dans le tableau 5.

TABLEAU 5
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<tb>
<tb> Fragments <SEP> d'ADN <SEP> génomique <SEP> de <SEP> 69 <SEP> pb <SEP> d'un <SEP> porcin
<tb> gemT3
<tb> 5'CCAGCGCCGC <SEP> CAGCCTGTGA <SEP> CCCCCGACTC <SEP> CTAAATAAAC <SEP> TGCCTCGTGA
<tb> 3'GGTCGCGGCG <SEP> GTCGGACACT <SEP> GGGGGCTGAG <SEP> GATTTATTTG <SEP> ACGGAGCACI
<tb> TGACCACGTT <SEP> CAGCACGGC <SEP> (69 <SEP> bp] <SEP> (SEC <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 37)
<tb> ACTGGTGCAA <SEP> GTCGTGCCG <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 38)
<tb> gemT7
<tb> 5'CCAGCACCTC <SEP> CGGCATGTGA <SEP> CCCCCGACTC <SEP> CTAAATAAAC <SEP> TGCTTCGTGA
<tb> 3'GGTCGTGGAG <SEP> GCCGTACACT <SEP> GGGGGCTGAG <SEP> GATTTATTTG <SEP> ACGAAGCACT
<tb> CGACCACGTC <SEP> CATCACGGC <SEP> [69 <SEP> bp] <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 39)
<tb> GCTGGTGCAG <SEP> GTAGTGCCG <SEP> (sec <SEP> ID <SEP> NO <SEP> :

<SEP> 40)
<tb> gemT9
<tb> P <SEP> R <SEP> L <SEP> L <SEP> N <SEP> K <SEP> L <SEP> L <SEP> R <SEP> (SEQ) <SEP> D
<tb> NO <SEP> : <SEP> 32)
<tb> 5'CCAGCACCGCCGGCATGTGACCCCCGACTCCTAAATAAACTGCTTCGTGACG
<tb> 3'GGTCGTGGCGGCCGTACACTGGGGGCTGAGGATTTATTTGACGAAGCACTGC
<tb> ATCATGTCTATCACGGT <SEP> 3' <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 41)
<tb> TAGTACAGATAGTGCCA <SEP> 5' <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 42)
<tb>

La position des amorces PCR est indiquée par un soulignement. Ces résultats attestent la présence du fragment N-terminal obtenu pour les aminoacides 9-17, pour les protéines de 30 kDa, de 28 kDa et de 18-22 kDa, et indiquent que ce fragment est encodé par un seul exon d'ADN de porcin.

EXEMPLE 6
Gène du ligand pour le mpl humain
En se basant sur les résultats de l'exemple 5, on conçoit et on synthétise un désoxyoligonucléotide 45-mer appelé pR45 pour cribler une bibliothèque génomique. La séquence du 45-mer est la suivante :
5'-GCC-GTG-AAG-GAC-GTG-GTC-GTC-ACG-AAG-CAG-TTT-ATT-TAG-GAG-TCG 3' (SEQ ID NO : 28)
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On soumet cet oligonucléotide à un marquage 32p avec (yP)-ATP et de la kinase de T4 et on l'utilise pour cribler une bibliothèque d'ADN génomique humain dans kgeml2 dans des conditions d'hybridation et de lavage de faible sévérité (voir exemple 7). On prélève les clones positifs, on les soumet à une purification dans des plaques et on les analyse par cartographie de restriction et par transfert Southern. On sélectionne le clone &num;4 pour la poursuite de l'analyse.

On soumet à un sous-clonage dans pBluescript SK-un fragment BamHI-XbaI de 2,8 kb qui s'hybride au 45-mer. On soumet l'ADN de ce clone à un séquençage partiel préalable en utilisant, comme amorces, des oligonucléotides spécifiques à la séquence d'ADN du ligand pour le mpl de porcin. La séquence obtenue confirme que l'ADN encodant

l'homologue humain du ligand pour le mpl de porcin a été isolé. Un site de restriction EcoRI a été détecté dans la séquence, ce qui permet à la demanderesse d'isoler un fragment EcoRI-Xbal de 390 pb par rapport au fragment BamHIXbal de 2,8 kb et de le sous-cloner dans pBluescript SK-.

On séquence les deux brins de ce fragment. La séquence d'ADN humain et la séquence d'aminoacides déduite sont représentées en figure 9 (SEQ ID NO : 3 & 4). Les positions prédites des introns dans la séquence génomique sont également indiquées par des flèches et définissent un exon putatif ("exon 3").

L'examen de la séquence prédite d'aminoacides confirme qu'un résidu de sérine est le premier aminoacide du ligand pour le mpl mature, comme déterminé à partir de l'analyse directe de la séquence d'aminoacides. Immédiatement en amont de ce codon, la séquence prédite d'aminoacides suggère fortement la présence d'une séquence signal impliquée dans la sécrétion du ligand pour le mpl mature. Cette région de codage de la séquence signal est probablement interrompue à la position nucléotidique 68 par un intron.

Dans la direction 3', l'exon semble se terminer au nucléotide 196. Par conséquent, cet exon encode une séquence de 42 aminoacides dont 16 font vraisemblablement partie d'une séquence signal et dont 26 font partie du ligand pour le mpl mature d'un être humain.

EXEMPLE 7
ADNc du ligand pour le mpl humain de longueur totale
En se basant sur la séquence humaine de"l'exon 3" (exemple 6), on synthétise deux oligonucléotides non dégénérés correspondant aux extrémités 31 et 51 de la séquence de l'''exons 3" (tableau 6).

TABLEAU 6
Amorces oligonucléotidiques PCR non dégénérées d'ADNc humain
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<tb>
<tb> Amorce <SEP> 5'GCT <SEP> AGC <SEP> TCT <SEP> AGA <SEP> AAT <SEP> TGC <SEP> TCC <SEP> TCG <SEP> TGG <SEP> TCA <SEP> TGC <SEP> TTC <SEP> T3' <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> :
<tb> 43)
<tb> Amorce <SEP> Ar <SEP> 5'CAG <SEP> TCT <SEP> GCC <SEP> GTG <SEP> AAG <SEP> GAC <SEP> A <SEP> TG <SEP> G <SEP> 3' <SEP> (SEO <SEP> ID <SEP> NO <SEP> :
<tb> 44)
<tb>

EMI203.2
On utilise ces deux amorces dans des réactions PCR en utilisant, comme matrice de l'ADN provenant de diverses bibliothèques d'ADNc humain ou 1 ng d'ADNc de"Quick Clone" (Clonetech) provenant de divers tissus en utilisant les conditions décrites à l'exemple S. La taille escomptée du produit de PCR est de 140 pb.

Après analyse des produits PCR sur un gel de polyacrylamide (12%), on détecte un fragment d'ADN de la taille escomptée dans les bibliothèques d'ADNc préparées à partir de rein adulte, de cellules 293 de rein foetal et d'ADNc préparé à partir de foie foetal humain (Clonetech cat. &num;7171-1).

On crible une bibliothèque d'ADNc de foie foetal dans À DR2 (Clonetech cat. &num; HL1151x) avec le même oligonucléotide 45-mer utilisé pour cribler la librairie génomique humaine.

On marque l'oligonucléotide avec (#32P)-ATP en utilisant la kinase polynucléotidique de T4. On crible la bibliothèque dans des conditions d'hybridation de faible sévérité. On soumet les filtres à une préhybrydation pendant 2 heures, puis à une hybridation avec la sonde pendant une nuit à 420C dans du formamide (20%), 5xSSC, 10xDenhardt, phosphate de sodium 0,05 M, pH 6,5, du pyrophosphate de sodium (0, 1%), 50 g/ml d'ADN de sperme de saumon soumis aux ultrasons, pendant 16 heures.

On rince alors les filtres dans 2xSSC, puis on les lave lx dans 0, 5xSSC, SDS (0, 1%) à 42 C. On expose les filtres pendant 1 nuit à un film radiographique Kodak, on prélève les clones positifs, on les soumet à une purification en plaques et on détermine la taille du produit d'insertion par PCR en utilisant des oligonucléotides flanquant le BamHI-Xbal clonant dans DR2 (Clonetech cat.

&num;6475-1). On utilise 5 Ml de la matière phagique comme source de matrice. La dénaturation initiale s'effectue pendant 7 minutes à 94 C, suivie par 30 cycles d'amplification (une minute à 94 C, une minute à 52 C et 1,5 minute à 72 C). On procède à l'extension finale pendant 15 minutes à 72 C. Le clone &num;FL2b possède un produit d'insertion de 1,8 kb qui est sélectionné pour la poursuite de l'analyse.

On récupère le plasmide pDR2 (Clonetech, système d'expression de clonage de kDR2 et de pDR2, Library Protocol Handbook, page 42) que contiennent les bras du phage kDR2, comme décrit par les instructions du fabricant (Clonetech, système d'expression de clonage de ÀDR2 et de pDR2, Library Protocol Handbook, pages 29-30). L'analyse de restriction du plasmide pDR2-FL2b avec BamHI et Xbal indique la présence d'un site de restriction interne BamHI dans le produit

d'insertion approximativement à la position 650. La digestion du plasmide avec BamHI-Xbal coupe le produit d'insertion en deux fragments, un de 0,65 kb et un de 1,15 kb.

On détermine la séquence d'ADN avec trois classes différentes de matrices dérivées du plasmide pDR2-FL2b. On effectue le séquençage d'ADN de l'ADN plasmidique bicaténaire avec le séquenceur fluorescent automatique d'ADN AB1373 (Applied Biosystems, Foster City, Californie) en utilisant des protocoles normaux pour des terminaisons didésoxy nucléoside triphosphate marquées par un colorant (terminaisons colorées) et des amorces déambulatrices synthétisées pour répondre à la demande (Sanger et collaborateurs, Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, 74 : 5463-5467 [1977] ; Smith et collaborateurs, Nature, 321 : 674-679 [1986]). On réalise le séquençage direct de fragments amplifiés par réaction en chaîne par polymérase à partir du plasmide, avec le séquenceur AB1373 en utilisant des amorces adaptées à la demande et des réactions procurant des terminaisons colorées. On génère une matrice monocaténaire avec le vecteur Janus M13 (DNASTAR, Inc., Madison, Wisconsin) (Burland et collaborateurs, Nucl.

Acids Res., 21 : 3385-3390 [1993]). On isole des fragments BamHI-Xbal à 15 kb et BamHI 0,65 kb à partir du plasmide pDR2-FL2b, on colmate les
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1 extrémités avec de l'ADN polymérase de T4 en présence de désoxynucléotides et ensuite, on soumet à un sous-clonage dans le site Smal du Janus M13. On effectue le séquençage avec des protocoles normaux pour des amorces universelles et réverses M13 marquées par un colorant ou pour des amorces déambulatrices et des terminaisons colorées. On effectue des réactions de séquençage manuel sur un ADN M13 monocaténaire en utilisant des amorces déambulatrices et la chimie didésoxy-terminale classique (Sanger et collaborateurs, Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, 74 : 5463-5467 [1977]), a-dATP
EMI205.2
marqué par 33p et de la Séquénase (United States Biochemical que par Corp., Cleveland, Ohio). On effectue l'assemblage de la

séquence d'ADN avec un séquenceur V2. lbl2 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Michigan). Les séquences nucléotidiques et déduites du hML sont procurées en figure 1 (SEQ ID NO : 1).

EXEMPLE 8
Isolation du gène du ligand pour le mpl humain (TPO)
On isole des clones d'ADN génomique humain du gène pour la TPO par criblage d'une bibliothèque génomique humaine dans À-Gem12 avec pR45, une sonde oligonucléotidique décrite antérieurement, dans des conditions de faible sévérité (voir exemple 7) ou dans des conditions de sévérité élevée avec un fragment correspondant à la moitié 3'de l'ADNc humain codant pour le ligand pour le mpl (à partir du site BamHI jusqu'à l'extrémité 3'). On isole deux clones À se chevauchant, s'étendant sur 35 kb. On soumet à un sousclonage et à un séquençage, deux fragments se chevauchant (BamHI et EcoRI) contenant le gène entier pour la TPO.

La structure du gène humain est composée de 6 exons à l'intérieur de 7 kb de l'ADN génomique (figures 14 A à E).

Les limites de toutes les jonctions exon/intron correspondent au motif consensus établi pour les gènes de mammifères (Shapiro, M. B. et collaborateurs, Nucl. Acids Res. 15 : 7155 [1987]). L'exon 1 et l'exon 2 contiennent la séquence 5'non traduite et les quatre premiers aminoacides du peptide signal. Le reste du signal sécrétoire et les premiers 26 aminoacides de la protéine mature sont encodés à l'intérieur de l'exon 3. Les domaines carboxyle total et 3' non traduit, ainsi que-50 aminoacides du domaine analogue à l'érythroprotéine sont encodés à l'intérieur de l'exon 6.

Les 4-aminoacides impliqués dans la délétion observée dans hML-2 (hTPO-2) sont encodés à l'extrémité 5'de l'exon 6.

EXEMPLE 9
Expression transitoire du ligand pour le mpl humain (hML)
Dans le but de sous-cloner le produit d'insertion de longueur totale contenu dans pDR2-FL2b, on soumet le plasmide à une digestion complète avec Xbal, puis à une digestion partielle avec BamHI. On purifie sur gel un fragment d'ADN correspondant au produit d'insertion de 1,8 kb et on le sous-clone dans pRK5 (pRK5-hmplI) (voir le brevet US-A-5.258. 287 pour la construction de pRK5) sous le contrôle du promoteur précoce immédiat du cytomégalovirus.
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On prépare l'ADN provenant du produit de construction pRK5hmplI par le procédé PEG et on le transfecte dans des cellules 293 de rein embryonnaire humain conservées dans un milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) auquel on a ajouté un mélange d'éléments nutritifs F-12, Hepes 20 mM (pH 7,4) et du sérum bovin foetal (10%). On transfecte les cellules par le procédé faisant appel au phosphate de calcium, comme décrit (Gorman C. [1985] dans DNA Cloning : A Practical Approach (Glover D. M., ed.), volume II, pages 143-190, IRL Press, Washington, D. C. ). Trente-six heures après la transfection, on analyse le produit surnageant des cellules transfectées pour détecter l'activité dans le dosage de prolifération (voir exemple 1).

Le produit surnageant des cellules 293 transfectées avec le vecteur pRK seul ne donne aucune stimulation des cellules Ba/F3 ou Ba/F3 -mpl (figure 12A). Le produit surnageant des cellules transfectées avec pRK5-hmplI n'a pas d'effet sur les cellules Ba/F3, mais stimule de manière spectaculaire la prolifération des cellules Ba/F3-mpl (figure 12A), indiquant que cet ADNc encode un ligand pour le mpl humain actif du point de vue fonctionnel.

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EXEMPLE 10 Jsoformes du ligand pour le mpl humain hML2, hML3 et hML4 Dans le but d'identifier en variante des formes épissées de hML, on synthétise des amorces correspondant à chaque extrémité de la séquence de codage du hML. On utilise ces amorces dans RT-PCR pour amplifier l'ARN de foie adulte humain. En plus, on construit des régions sélectionnées d'intérêt (voir ci-dessous) flanquant des amorces internes et on les utilise de manière similaire.

Le séquençage direct des extrémités du produit de PCR révèle une séquence unique correspondant exactement à la séquence de l'ADNc isolé à partir de la bibliothèque de foie foetal humain (voir figure 1 [SEQ ID NO : 1]). Toutefois, une région proche de la terminaison C du domaine EPO (au centre du produit de PCR) manifeste un modèle de séquence complexe suggérant l'existence de variants éventuels d'épissage dans cette région. Pour isoler ces variants d'épissage, on utilise les amorces procurées dans le tableau 7, flanquant la région d'intérêt dans un PCR comme matrices pour l'ADNc de foie adulte humain.

TABLEAU 7
Amorces PCR d'isoformes du ML humain
EMI208.2

<tb>
<tb> phmpllcdna.3e1: <SEP> 5'TGTGGACTTTAGCTTGGGAGAATG3' <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 45)
<tb> pbx4.f2: <SEP> 5'GGTCCAGGGACCTGGAGGTTTG3' <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 46)
<tb>

On sous-clone les produits PCR à extrémités franches dans M13. Le séquençage des sous-clones individuels révèle l'existence d'au moins 3 isoformes de ML. L'une d'entre elles, hML (également désignée par hML322), est la forme la plus longue et elle correspond exactement à la séquence isolée de la bibliothèque de foie foetal. Des séquences des quatre isoformes du ligand pour le mpl humain répertoriées en partant de la plus longue (hML) pour aboutir à la plus courte (hML-4) sont données en (figure 11 [SEQ ID NO : 6,8, 9 & 10]).

EXEMPLE 11 Construction et expression transitoire d'isoformes du ligand pour le mpl humain et de variants substitutionne1s hML2, hML3 et hML (R153A, R154A)
On reconstitue les isoformes hML2 et hML3, ainsi que le variant substitutionnel hML (R153A, R154A) à partir de hML en utilisant la technique recombinante PCR décrite par Russell Higuchi dans PCR Protocols, A guide to Methods and Applications, Acad. Press, M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J.

Sninsky & T. J. White Editors.

Dans tous les produits de construction des amorces
EMI209.1
"externes"utilisées sont représentés dans le tableau 8 et les amorces"de chevauchement"sont représentées dans le tableau 9.

TABLEAU 8 Amorces externes
EMI210.1

<tb>
<tb> Cla. <SEP> FL. <SEP> F2 <SEP> :
<tb> 5'ATC <SEP> GAT <SEP> ATC <SEP> GAT <SEP> AGC <SEP> CAG <SEP> ACA <SEP> CCC <SEP> CGG <SEP> CCA <SEP> G3' <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> :
<tb> 47)
<tb> HMPLL-R <SEP> :
<tb> 5'GCT <SEP> AGC <SEP> TCT <SEP> AGA <SEP> CAG <SEP> GGA <SEP> AGG <SEP> GAG <SEP> CTG <SEP> TAC <SEP> ATG <SEP> AGA3' <SEP> (SEO <SEP> ID <SEP> NO <SEP> :
<tb> 48)
<tb>

TABLEAU 9 Amorces de chevauchement
EMI210.2

<tb>
<tb> hML-2
<tb> ML, <SEP> 14. <SEP> F <SEP> : <SEP> 5'CTC <SEP> CTT <SEP> GGA <SEP> ACC <SEP> CAG <SEP> GGC <SEP> AGG <SEP> ACC <SEP> 3' <SEP> (SEO <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 49)
<tb> ML#4.R <SEP> 5'GGT <SEP> CCT <SEP> GCC <SEP> CTG <SEP> GGT <SEP> TCC <SEP> AAG <SEP> GAG <SEP> 3' <SEP> (SEO <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 50)
<tb> hML-3 <SEP> :
<tb> hMLA116+ <SEP> :

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On procède à des amplifications PCR avec de l'ADN polymérase de Pfu cloné (Stratagene) en utilisant les conditions ci-après :

la dénaturation initiale de la matrice est réalisée à 940C pendant 7 minutes, suivie de 30 cycles de 1 minute à 94 C, de 1 minute à 550C et de 1,5 minute à 72 C On laisse le cycle final se prolonger pendant 10 minutes à 72 C. On met à digérer le produit de PCR final avec Clal-Xbal, on purifie sur gel et on clone dans pRK5tknéo. On transfecte des cellules 293 avec les divers

produits de construction, comme décrit ci-dessus, et on analyse le produit surnageant en utilisant le dosage de prolifération de BajF3-mpl. hML-2 et hML-3 ne présentent aucune activité détectable dans ce dosage ; toutefois, l'activité de hML (R153A, R154A) est similaire à celle du hML, indiquant que le traitement de ce site dibasique n'est pas requis pour l'activité (voir figure 13).

EXEMPLE 12
ADNc du ligand pour le mpl de muridé mML, mML-2 et mML-3
Isolation de l'ADNc du mML
On obtient par PCR un fragment d'ADN correspondant à la région de codage totale du ligand pour le mpl humain, on le purifie sur gel et on le marque par amorçage aléatoire en présence de 32P-dATP et P-dCTP. On utilise cette sonde pour cribler 106 clones d'une bibliothèque d'ADNc de foie de souris dans GTIO (Clontech cat&num; ML3001a). On hybride des filtres de duplication dans du formamide (35%), 5xSSC, 10xDenhardt, SDS (0,1%), phosphate de sodium 0,05M, pH 6,5, pyrophosphate de sodium (0, 1%), 100 Mg/ml d'ADN de sperme de saumon soumis à des ultrasons, pendant une nuit en présence de la sonde.

On rince les filtres dans 2xSSC, puis on les lave lx dans 0,5xSSC, SDS (0, 1%) à 42 C. On purifie par mise en plaque le phage d'hybridation et on sous-clone les produits d'insertion d'ADNc dans le site EcoRI du plasmide Bluescript SK-. On choisit le clone"LD"contenant un produit d'insertion de 1,5 kb pour la poursuite de l'analyse et on séquence les deux brins, comme décrit ci-dessus, pour l'ADNc du ML humain. Les séquences nucléotidiques et d'aminoacides déduites du clone LD sont procurées en figure 14 (SEQ ID NO 1 & 11). La séquence du ML mature déduite à

partir de ce clone possède une longueur de 331 aminoacides et est identifiée par l'abréviation mML331 (ou mML-2 pour les raisons décrites ci-dessous).

On observe une identité considérable à la fois pour les séquences nucléotidique et d'aminoacides déduite dans les domaines de ces ML, analogues à EPO. Toutefois, lorsqu'on met en alignement les séquences déduites d'aminoacides des ML humains et de souris, la séquence de souris s'avère posséder une délétion tétrapeptidique entre les résidus humains 111-114 correspondant à la délétion de 12 nucléotides faisant suite à la position nucléotidique 618 que l'on trouve dans les ADNc à la fois humains (voir ci-dessus) et de porcins (voir ci-dessous). En conséquence, on évalue des clones supplémentaires pour détecter des isoformes possibles du Ml de muridé. Un clone,"L7", possède un produit d'insertion de 1,4 kb comprenant une séquence déduite de 335 aminoacides contenant le tétrapeptide LPLQ"manquant".

On pense que
EMI212.1
cette forme constitue le ML de muridé de longueur totale et on la désigne par mML ou mMLg. La séquence nucléotidique et d'aminoacides déduite pour le mML est procurée en figure 16 (SEQ ID NO : 12 & 13). Enfin, on isole et on séquence le clone"L2". Ce clone possède la délétion de 116 nucléotides correspondant à celle de hML3 et est, par conséquent, désigné par mML-3. La comparaison des séquences déduites d'aminoacides de ces deux isoformes est représentée en figure 16.

Expression du mML recombinant. On prépare des vecteurs d'expression pour le ML de muridé essentiellement comme décrit à l'exemple 8. On sous-clone des clones encodant mML et mML-2 dans pRK5tknéo, un vecteur d'expression de mammifères qui procure une expression sous le contrôle du promoteur CMV et d'un signal de polyadénylation de SV40. Les vecteurs d'expression résultants mMLpRKtknéo et mML2pRKtknéo sont transfectés de manière transitoire dans des cellules

293 en utilisant le procédé faisant appel au phosphate de calcium. Suite à la transfection transitoire, on conditionne les milieux pendant 5 jours. On maintient les cellules dans des milieux DMEM à teneur élevée en glucose, auxquels on a ajouté 10% de sérum de veau foetal.

Expression du mpl de muridé (mmpl) dans des cellules Ba/F3. On obtient des lignées cellulaires stables exprimant c-mpl par transfection de mmplpRKtknéo essentiellement comme décrit pour le mpl humain dans l'exemple 1. Pour le dire brièvement, on transfecte un vecteur d'expression (20 J. ; linéarisé) contenant la séquence de codage totale du mpl de muridé (Skoda, R. C. et collaborateurs, EMBO J. 12 : 2645-2653 [1993]) dans des cellules Ba/F3 par électroporation (5 x 106 cellules, 250 volts, 960 F), la transfection étant suivie d'une sélection pour détecter la résistance à la néomycine avec 2 mg/ml de G418. On confirme l'expression du mpl par analyse cytométrique en flux continu en utilisant des antisérums mpl-IgG de lapin antimuridés.

On maintient les cellules BaF3 dans des milieux RPMI 1640 provenant de cellules WEHI-3B comme source de IL-3. On analyse le produit surnageant provenant de cellules 293 transfectées de manière transitoire à la fois avec mML et mML2, dans des cellules BaF3 transfectées à la fois avec mmpl et hmpl, comme décrit à l'exemple 1.

EXEMPLE 13
ADNc du ligand pour le mpl d'un porcin pML et pML-2
On isole l'ADNc du ML d'un porcin (pML) par RACE PCR.

*Pour le dire brièvement, on conçoit une amorce oligo dT et 2 amorces spécifiques basées sur la séquence de l'exon du gène du ML d'un porcin encodant la terminaison amino du ML purifié à partir du sérum de porc aplasique. On obtient et on amplifie l'ADNc préparé à partir de divers tissus de porcs aplasiques. On trouve un produit d'ADNc par PCR de 1342 pb dans le rein et on le sous-clone. On séquence plusieurs clones et ils s'avèrent encoder le ligand pour le mpl mature de porc (sans inclure un signal de sécrétion complet). Il s'avère que l'ADNc encode une protéine mature de 332 aminoacides (pML332) dont la séquence est représentée en figure 18 (SEQ ID NO : 9 & 16).

Procédé :
Isolation du gène et de 1'ADNC de pML. On isole des clones génomiques du gène du ML d'un porcin par criblage d'une bibliothèque génomique de porc dans EMBL3 (Clontech Inc) avec pR45. On crible la bibliothèque essentiellement comme décrit à l'exemple 7. On isole plusieurs clones et on séquence l'exon encodant la séquence d'aminoacides identique à celle obtenue à partir du ML purifié. On obtient l'ADNc du ML de porcin en utilisant une modification du protocole RACE PCR. On conçoit deux amorces ML spécifiques basées sur la séquence du gène du ML de porc. On isole l'ARNm polyadénylé à partir du rein de porcs aplasiques, essentiellement comme décrit ci-dessus.

On prépare l'ADNc par transcription réverse avec l'amorce BamdT

(BamdT : 5'GACTCGAGGATCCATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT3') (SEQ ID NO : 55) dirigée contre la queue polyadénosine du ARNm. On effectue une série initiale d'amplification PCR (28 cycles de 950C pendant 60 secondes, 580C pendant 60 secondes et 720C pendant 90 secondes), en utilisant l'amorce h-avant-1 spécifique du ML (h-avant-1 : 5'GCTAGCTCTAGAAATTGCTCCTCGTGGTCATGCTTCT3') (SEQ ID NO : 43) et l'amorce BAMAD (BAMAD : 5'GACTCGAGGATCCATCG3') (SEQ ID NO :

56) dans un milieu réactionnel de 100 ml (KCl 50 mM, MgCl 1,5 mM, Tris 10 mM, pH 8,0, dNTP 0,2 mM avec 0,05 U/ml de polymérase Amplitaq [Perkin Elmer Inc.]). On met ensuite à digérer le produit de PCR par Clal, on l'extrait dans du phénol-chloroforme (1 : 1), on précipite dans de l'éthanol et on ligature à 0,1 mg du vecteur Bluescript SK (Stratagene Inc. ) qui a été incisé avec Clal et Kpnl.

Après incubation pendant 2 heures à la température ambiante, on ajoute un quart du mélange de ligation directement à une seconde série de PCR (22 cycles comme décrit ci-dessus) en utilisant une seconde amorce avant-1 spécifique au ML (avant-l : 5'GCTAGCTCTAGAAGCCCGGCTCCTCCTGCCTG3') (SEQ ID NO : 57)

et T3-21 (un oligonucléotide qui se lie à une séquence adjacente à la région de clonage multiple à l'intérieur du vecteur Bluescript SK-) : (5'CGAAATTAACCCTCACTAAAG3') (SEQ ID NO : 58) On met à digérer le produit de PCR résultant avec Xbal et Clal et on le sous-clone dans Bluescript SK-. On séquence plusieurs clones à partir de réactions PCR indépendantes.

A nouveau, on définit une seconde forme désignée par pML-2 encodant une protéine comprenant une délétion de 4 résidus d'aminoacides (328 résidus d'aminoacides) (voir figure 21 [SEQ ID NO : 21]). La comparaison des séquences d'aminoacides de pML et de pML-2 indique que la dernière forme est identique, avec cette exception que le QLPP tétrapeptidique correspondant aux résidus 111-114 inclus a subi une délétion (voir figure 22 [SEQ ID NO : 18 et 21]). La délétion de 4 aminoacides observée dans l'ADNc du ML d'un muridé, d'un être humain et d'un porcin se produit précisément à la même position à l'intérieur des protéines prédites.

EXEMPLE 14 Dosage CMK pour l'induction par la thrombopoiétine (TPO) de l'expression de l'antigène plaquettaire GPIIbIIIa
On maintient des cellules CMK dans un milieu RMPI 1640 (Sigma) auquel on a ajouté 10% de sérum bovin foetal et de la glutamine 10 mM. En les préparant pour le dosage, on récolte les cellules, on les lave et on les remet en suspension à concurrence de 5 x 105 cellules/ml dans un milieu GIF exempt de sérum auquel on a ajouté 5 mg/l

d'insuline bovine, 10 mg/l d'apo-transferrine, 1 x des oligo-éléments.

Dans une plaque à fond plat à 96 puits, on ajoute des échantillons normaux ou expérimentaux de la TPO à chaque puits à des dilutions appropriées dans des volumes de 100 l. On ajoute 100 gl de la suspension cellulaire CMK à chaque puits et on incube les plaques à 370C dans un incubateur contenant 5% de C02 pendant 48 heures. Après incubation, on centrifuge les plaques à 1000 tours/minute à 40C pendant 5 minutes. On se défait du produit surnageant et on ajoute 100 gl de l'anticorps monoclonal 2D2 de GPIIbIIIa conjugué avec FITC. Après incubation à 40C pendant 1 heure, on centrifuge une nouvelle fois les plaques à 1000 tours/minute pendant 5 minutes.

On se défait du produit surnageant contenant l'anticorps non lié et on ajoute 200 gl d'un produit de lavage BSA-PBS (0,1%) à chaque puits. On répète trois fois chaque étape de lavage au BSA-PBS (0, 1%).

On analyse ensuite les cellules sur un FASCAN en utilisant, comme norme, une analyse paramétrique mesurant l'intensité de fluorescence relative.

EXEMPLE 15
Dosage DAMI pour la thrombopoiétine (TPO) en mesurant l'activité endomitotique de cellules DAMI sur des plaques de
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microtitrage à 96 puits On maintient des cellules DAMI dans IMDM + 10% de sérum chevalin (Gibco) auquel on ajoute de la glutamine 10 mM, 100 ng/ml de Pénicilline G et 50 g/ml de streptomycine.

Lorsqu'on les prépare pour le dosage, on récolte les cellules, on les lave et on les remet en suspension à concurrence de 1 x 106 cellules/ml dans IMDM + 1% de sérum chevalin. Dans une plaque à fond rond à 96 puits, on ajoute à la suspension cellulaire DAMI, 100 Ml d'échantillons normaux ou expérimentaux de TPO. On incube alors les

cellules pendant 48 heures à 37 C dans un incubateur contenant du C02 (5%). Après incubation, on centrifuge les plaques dans une centrifugeuse Sorvall 6000B à 1000 tours/minute pendant 5 minutes à 4 C. On se défait du produit surnageant et on répète l'étape de lavage avec 200 l de PBS-BSA (0, 1%). On fixe les cellules par addition de 200 gl d'éthanol (70%)-PBS refroidi à la glace et on met en suspension par aspiration.

Après incubation à 40C pendant 15 minutes, on centrifuge les plaques à 2000 tours/minute pendant 5 minutes et on ajoute, à chaque puits, 150 l de 1 mg/ml de RNAse contenant 0,1 mg/ml d'iodure de propidium et Tween-20 (0,05%). Après 1 heure d'incubation à 37 C, on mesure les changements quant à la teneur d'ADN par cytométrie à flux continu.

On mesure la polyploïdie et on la quantifie comme suit : Rapport polyploide t de cellules dans > G2+M/t de cellules dans < G2+M) avec TPO normalisé (NPR) = t de cellules dans > G2+M/t de cellules dans < G2+M) dans le témoin
EXEMPLE 16
Dosage in vivo de la tnromjbopo-iétine (TPO) (Détermination du rebond plaquettaire chez la souris)
Dosage in vivo pour la détermination par 35S de la production de plaquettes
A des souris C57BL6 (obtenues auprès de Charles River), on injecte par voie intrapéritonéale (IP) 1 ml de sérum plaquettaire anti-souris de chèvre (6 amps) au jour 1 pour provoquer la thrombocytopénie. Aux jours 5 et 6, on administre aux souris 2 injections IP du facteur ou du PBS comme témoin.

Au jour 7, on injecte, par voie intraveineuse, 30 Ci de Na2 35 S04 dans 0,1 ml de solution saline et on

mesure le pourcentage d'incorporation de 358 de la dose injectée dans les plaquettes circulantes dans des échantillons de sang obtenus à partir de souris traitées et témoins. On procède à la numération plaquettaire et à la numération leucocytaire en même temps à partir de sang obtenu pour le sinus rétro-orbital.

EXEMPLE 17
KIRA BLISA pour la thrombopoiétine (TPO) en mesurant la phosphorylation du récepteur chimère mpl-Rse. gD
Le récepteur mpl humain a été révélé par Vigon et collaborateurs, PNAS, USA, 89 : 5640-5644 (1992). On prépare un récepteur chimère comprenant le domaine extracellulaire (ECD) du récepteur mpl et le domaine transmembranaire (TM) et intracellulaire (ICD) de Rse (Mark et collaborateurs, J. of Biol. Chem. 269 (14) : 10720-10728 [1994]) avec un polypeptide drapeau carboxy-terminal (c 1 est-à-dire Rse. gD) pour l'utiliser dans le KIRA ELISA décrit ici. Voir figures 30 et 31 pour une description schématique du dosage.

(a) Préparation de l'agent de capture
On dresse un anti-gD monoclonal (clone 5B6) contre un peptide de la glycoprotéine D du virus Herpès simplex (Paborsky et collaborateurs, Protein Engineering 3 (6) : 547- 553 [1990]). On règle la préparation de matières purifiées à 3,0 mg/ml dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4 et on entrepose des quantités aliquotes de 1,0 ml à-20 C.

(b) Préparation de l'anticorps anti-phosphotyrosine
On se procure un antiphosphotyrosine monoclonal, clone 4G10, auprès de UBI (Lake Placid, NY) et on le biotinyle en utilisant le biotin-N-hydroxysuccinamide à long bras
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(Biotin-X-NHS, Research Organic, Cleveland, OH).

(c) Ligand On prépare le ligand pour le mpl par les techniques recombinantes décrites ici. On entrepose le ligand purifié pour le mpl à 40C sous forme d'une solution de réserve.

(d) Préparation de l'acide nucléique Rse. gD.

On utilise des oligonucléotides synthétiques bicaténaires pour reconstituer la séquence de codage pour les dix aminoacides C-terminaux (880-890) du Rse humain et on ajoute une quantité supplémentaire de 21 aminoacides contenant un épitope pour l'anticorps SB6, ainsi qu'un codon d'arrêt. Dans le tableau 10, on présente la séquence finale de la portion synthétique du gène de fusion.

TABLEAU 10 Portion synthétique bicaténaire du gène de fusion de Rae humain
EMI221.1

<tb>
<tb> Bnn <SEP> codant
<tb> 5'-TGCAGCAAGGGCTACTGCCACACTCGAGCTGCGCAGATGCTAGCCTCAAGA
<tb> TGGCTG <SEP> ATCCAAA <SEP> TCGATTCCGCGGCAAAGATCTTCCGGTCCTGTAGAAGCT-3' <SEP> (sec <SEP> ID
<tb> NO <SEP> : <SEP> 59)
<tb> Brin <SEP> non <SEP> codanf <SEP> (antisens)
<tb> S'. <SEP> AGCTTCTACAGGACCGGAAGATC'rTTGCCGCGGAATCGATTTGGATCAGCCA
<tb> TCTTG <SEP> AGGCTAGCATCTGCGCAGCTCGAGTGTGGCAGTAGCCCTTGCTGCA-3' <SEP> (SEQ <SEP> ID
<tb> NO <SEP> : <SEP> 60)
<tb>

On ligature l'ADN synthétique avec l'ADNc encodant les aminoacides 1-880 du Rse humain au site PstI en commençant au nucléotide 2644 de la séquence publiée de l'ADNc du Rse humain (Mark et collaborateurs, Journal of Biological Chemistry 269 (14) :

10720-10728 [1994]) et aux sites HindIII dans le polylieur du vecteur d'expression pSV17. ID. LL (voir figures 32 A-L ; SEQ ID NO : 22) pour créer le plasmide d'expression pSV. ID. Rse. gD. Pour le dire brièvement, le plasmide d'expression comprend un transcript primaire dicistronique qui contient la séquence encodant DHFR lié par des sites d'épissage d'intron donneur à épissage 5'et accepteur à épissage 3', suivie par la séquence qui encode le Rse. gD. Le message de longueur totale (non épissé) contient DHFR comme premier cadre de lecture ouvert et, par conséquent, génère la protéine DHFR pour permettre la sélection de transformants stables.

(e) Préparation de l'acide nucléique mpl-Rse. gD
On modifie le plasmide d'expression pSV. ID. Rse. gD produit comme décrit ci-dessus pour produire le plasmide pSV. ID. M. tmRd6 qui contient la séquence de codage du ECD du mpl humain (aminoacides 1-491) fusionné au domaine transmembranaire et au domaine intracellulaire de Rse. gD (aminoacides 429-911). On utilise des oligonucléotides synthétiques pour joindre la séquence de codage d'une portion du domaine extracellulaire du mpl humain à une portion de la séquence de codage de Rse dans une réaction de clonage par PCR en deux étapes, comme décrit par Mark et collaborateurs, J. Biol. Chem. 267 : 26166-26171 (1992).

Les amorces utilisées pour la première réaction PCR sont Ml (5'-TCTCGCTACCGTTTACAG-3') (SEQ ID NO : 61) et M2 (5'-CAGGTACCCACCAGGCGGTCTCGGT-3') (SEQ ID NO : 62) avec une matrice d'ADNc du mpl et R1 (5'-GGGCCATGACACTGTCAA-3') (SEQ ID NO : 63) et R2 (5'-GACCGCCACCGAGACCGCCTGGTGGGTACCTGTGGTCCTT-3') (SEQ ID NO : 64)

avec une matrice d'ADNc de Rse. On utilise la portion PvuIISmaI de cette jonction par fusion pour la construction du récepteur chimère de longueur totale.

(f) Transformation cellulaire
On soumet des cellules DP12. CHO (EP 307.247 publié le 15 mars 1989) à une électroporation avec pSV. ID. M. tmRd6 qui a été linéarisé à un site unique NotI dans le squelette plasmidique. On précipite l'ADN dans de l'éthanol après extraction dans du phénol/chloroforme et on le remet en suspension dans 20 gl de 1 : 10 Tris : EDTA. Ensuite, on incube 10 g d'ADN avec 107 cellules CHO DP12 dans 1 ml de PBS sur de la glace pendant 10 minutes avant de procéder à une électroporation à 400 volts et à 330 F. On remet les cellules sur de la glace pendant 10 minutes avant de les étaler sur un milieu non sélectif. Après 24 heures, on charge les cellules dans un milieu exempt de nucléoside pour sélectionner les clones DHFR+ stables.

(g) Sélection de cellules transformées pour les utiliser dans le KIRA ELISA
On identifie des clones exprimant MPL/Rse. gD par transfert Western de lysats de cellules non fractionnées soumises à un post-fractionnement par SDS-PAGE en utilisant l'anticorps 5B6 qui détecte la marque de l'épitope gD.

(h) Milieux
On fait croître des cellules dans F12/DMEM 50 : 50 (Gibco/BRL, Life Technologies, Grand Island, NY). On ajoute au milieu du FBS (10%) ayant subi une diafiltration (HyClone, Logan, Utah), HEPES 25 mM et L-glutamine 2 mM.

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(i) KIRA ELISA On ensemence des cellules DP12. CHO transformées par mpl-Rse. gD (3X104 par puits) dans les puits d'une plaque de culture à 96 puits et à fond plat dans 100 91 de milieu et on cultive pendant une nuit à 370C dans 5%-de C02. Le lendemain matin, on se défait du produit surnageant des puits et on comprime légèrement les plaques sur un chiffon en papier. On ajoute alors à chaque puits 50 gl de milieux contenant, soit des échantillons expérimentaux, soit 200, 50,12, 5,3, 12,0, 78,0, 19,0, 048 ou 0 ng/ml du ligand pour le mpl. On stimule les cellules à 370C pendant 30 minutes, on se défait du produit surnageant des puits et, à nouveau, on comprime légèrement les plaques sur un chiffon de papier.

Pour lyser les cellules et solubiliser les récepteurs chimères, on ajoute 100 cl de tampon de lyse à chaque puits.

Le tampon de lyse est constitué par NaCl 150 mM contenant HEPES 50 mM (Gibco), Triton-X 100 (Gibco) (0, 5%), du thimerosal (0,01%), 30 KIU/ml d'aprotinine (ICN Biochemicals, Aurora, OH), du chlorhydrate de 4- (2aminoéthyl)-benzènesulfonyl-fluorure 1 mM (AEBSF ; ICN Biochemicals), leupeptine 50 uM (ICN Biochemicals) et de l'orthovanadate de sodium 2 mM (NaVO ; Sigma Chemical Co, St. Louis, MO), pH 7,5. On agite alors légèrement la plaque sur un agitateur destiné à cet effet (Bellco, Instruments, Vineland, NJ) pendant 60 minutes à la température ambiante.

Tandis que l'on procède à la solubilisation des cellules, on décante une plaque de microtitrage ELISA (Nunc Maxisorp, Inter Med, Denmark) recouverte pendant la nuit à 40C avec l'anticorps monoclonal 5B6 anti-gD (5,0 g/ml dans un tampon de carbonate 50 mM, pH 9,6, 100 j. Ll/puits), on le comprime sur un chiffon de papier et on le bloque avec 150 /puits de tampon de blocage [PBS contenant du BSA (0, 05%) (Intergen Company, Purchase, NY) et du thimerosal

(0, 01%)] pendant 60 minutes à la température ambiante, tout en agitant modérément.

Après 60 minutes, on lave à six reprises la plaque recouverte de 5B6 anti-gD avec un tampon de lavage (PBS contenant Tween-20 (0, 05%) et du thimerosal (0,01%)) en utilisant un dispositif automatique de lavage de plaques (ScanWasher 300, Skatron Instruments, Inc., Sterling, VA).

On transfère le lysat contenant le MPL/Rse. gD solubilisé depuis le puits de microtitrage de culture cellulaire (85 1/puits) à un puits ELISA bloqué et recouvert de 5B6 anti-gD, et on incube pendant 2 heures à la température ambiante, tout en agitant modérément. On élimine le mpl-Rse. gD non lié par lavage avec un tampon de lavage et on ajoute, à chaque puits, 100 pl de 4G10 biotinylé (antiphosphotyrosine) dilué à 1 : 18000 dans un tampon de dilution (PBS contenant BSA (0, 5%), Tween-20 (0, 05%), EDTA 5 mM et du thimerosal (0, 01%)), c'est-à-dire 56 ng/ml.

Après incubation pendant 2 heures à la température ambiante, on lave la plaque et on ajoute, à chaque puits, 100 gl de streptavidine conjuguée à de la peroxydase de Armoracia lapathifolia (HRPO) (Zymed Laboratories, S. San Francisco, CA) dilué à 1 : 60000 dans un tampon d'élution. On incube la plaque pendant 30 minutes à la température ambiante, tout en agitant modérément. On élimine par lavage le conjugué d'avidine libre et on ajoute, à chaque puits, 100 cl d'une solution de substrat fraîchement préparée (tétraméthylbenzidine [TMB] ; un nécessaire de substrat à deux composants ; Kirkegaard et Perry, Gaithersburg, MD).

On laisse la réaction se produire pendant 10 minutes ; après quoi, on arrête le développement chromogène par addition de 100 l ! puits de H3PO4 1,0 M. On lit l'absorbance à 400 nm avec une longueur d'onde de référence de 650 nm (ABS450/650) en utilisant un lecteur de plaques Vmax (Molecular Devices, Palo Alto, CA) commandé par un Macintosh centrix 650 (Apple

Computers, Cupertino, CA) et par un logiciel DeltaSoft (BioMetallics, Inc., Princeton, NJ).

On dresse la courbe de référence en stimulant les cellules dpl2. trkA, B ou C. gD avec 200,50, 12,5, 3,12, 0,78, 0,19, 0,048 ou 0 ng/ml du ligand pour le mpl et on la représente sous forme de ng/ml de TPO par rapport à la moyenne ABS450/650 écart-type en utilisant le programme DeltaSoft. On obtient des concentrations d'échantillons par interpolation de leur absorbance sur la courbe de référence et on les exprime en termes de ng/ml d'activité de la TPO.

Le ligand pour le mpl s'avère être capable d'activer le récepteur chimère mpl-Rse. gD d'une manière dépendant de la concentration et spécifique au ligand. En outre, le KIRAELISA du mpl-Rse. gD s'est avéré tolérer jusqu'à 100% de
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sérum humain (non représenté) ou 100% de plasma (non représenté), ce qui permet d'utiliser le dosage pour cribler aisément des échantillons de patients et de pK.

EMI227.1

Courbe de référence < < < -) TPr---nn-... *---im
EMI227.2

<tb>
<tb> Abs
<tb> 450/650
<tb> @
<tb>
Concentration de TPO (ng/ml)
EMI227.3
Rsum des CE50 de la TPO
EMI227.4

<tb>
<tb> Forme <SEP> de <SEP> la <SEP> TPO <SEP> (celluels) <SEP> CE50 <SEP> (poids/volume) <SEP> CE50(molanté)
<tb> Hu <SEP> TPO <SEP> 332 <SEP> (293) <SEP> 2.56 <SEP> ng/ml <SEP> 67.4 <SEP> pM
<tb> Mu <SEP> TPO <SEP> 332 <SEP> (293) <SEP> 3.69 <SEP> ng/ml <SEP> 97.1 <SEP> pM
<tb> Hu <SEP> TPO <SEP> 153 <SEP> (293) <SEP> -41 <SEP> ng/ml <SEP> -1 <SEP> 08 <SEP> nM
<tb> Hu <SEP> TPO <SEP> 155 <SEP> (E. <SEP> coli) <SEP> 0.44 <SEP> ng/ml <SEP> 11.6 <SEP> pM
<tb> Hu <SEP> TPO <SEP> 153met <SEP> (E.

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EXEMPLE 18 ELISA basé sur un récepteur pour la thrombopolétine (TPO) On recouvre des plaques ELISA avec de l'IgG antihumaine (Fc) de lapin F (ab') 2 dans un tampon de carbonate pH 9, 6 à 40C pendant une nuit. On bloque les plaques avec de l'albumine de sérum bovin (0, 5%) dans PBS à la température ambiante pendant 1 heure. On ajoute la récolte de fermentation contenant le récepteur chimère, mpl-IgG aux plaques et on incube pendant 2 heures.

On ajoute aux plaques des dilutions successives doubles (0, 39-25 ng/ml) de la norme (TP0332 produite dans des cellules 293 avec la concentration déterminée par analyse quantitative des aminoacides) et des échantillons ayant subi une dilution successive dans de l'albumine de sérum bovin (0, 5%), Tween- 20 (0, 05%) et on incube pendant 2 heures. On détecte la TPO liée avec la protéine A purifiée, des anticorps de lapin biotinylés à la TP0155 que l'on obtient dans E. coli (incubation pendant 1 heure), puis par la streptavidineperoxydase (incubation pendant 30 minutes) et la 3, 3', 5, 5'tétraméthylbenzidine comme substrat. On lit l'absorbance à 450 nm. On lave les plaques entre les étapes. Pour l'analyse des données, on adapte la courbe de référence en utilisant un programme d'adaptation de courbe à 4 paramètres par "Kaleidagraph".

On calcule les concentrations des échantillons à partir de la courbe de référence.

EXEMPLE 19 Expression et purification de la TPO
EMI229.1
à partir de cellules 293 1. Préparation des vecteurs d'expression de cellules 293
On obtient un ADNc correspondant au cadre de lecture complet ouvert de la TPO par PCR en utilisant les oligonucléotides ci-après comme amorces :
TABLEAU 11
Amorces de 293 par PCR
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<tb>
<tb> Cla. <SEP> FL. <SEP> F <SEP> : <SEP> 5'ATC <SEP> GAT <SEP> ATC <SEP> GAT <SEP> CAG <SEP> CCA <SEP> GAC <SEP> ACC <SEP> CCG <SEP> GCC <SEP> AG <SEP> 3' <SEP> (SEO <SEP> ID <SEP> NO <SEP> :
<tb> 65)
<tb> hmptt. <SEP> R <SEP> :

On utilise PRK5-hmplI (décrit à l'exemple 9) comme matrice pour la réaction en présence d'ADN polymérase de pfu (Stratagene). La dénaturation initiale a lieu pendant 7 minutes à 94 C, suivie par 25 cycles d'amplification (1 minute à 94 C, 1 minute à 55 C et 1 minute à 72 C).

L'extension finale est réalisée pendant 15 minutes à 72 C.

On purifie le produit de PCR et on le clone entre les sites de restriction Clal et Xbal du plasmide pRK5tknéo, un vecteur dérivé de pRK5 modifié pour exprimer un gène de résistance à la néomycine sous le contrôle du promoteur de thymidine kinase pour obtenir le vecteur pRK5tknéo. ORF. On génère un second produit de construction correspondant au

domaine homologue EPO de la même manière, mais en utilisant Cla. FL. F comme amorce avant, ainsi que l'amorce arrière ciaprès : Arg. STOP. Xba : 5'TCT AGA TCT AGA TCA CCT GAC GCA GAG GGT GGA CC 3' (SEQ ID NO : 66) On appelle le produit final de construction pRK5-tknéoEPO-D. On examine la séquence des deux produits de construction comme décrit à l'exemple 7.

2. Transfection de cellules de rein embryonnaire humain
On transfecte ces deux produits de construction dans des cellules de rein embryonnaire humain par le procédé au CaP04, comme décrit à l'exemple 9. Vingt-quatre heures après la transfection, on déclenche la sélection des clones résistant à la néomycine en présence de 0, 4 mg/ml de G418. 10 de telle sorte que, 15 jours plus tard, des colonies individuelles sont transférées dans des plaques de 96 puits et sont mises à croître jusqu'à confluence. L'expression de ML153 ou de ML332 dans les milieux conditionnés à partir de ces clones est confirmée en utilisant le dosage de prolifération de Ba/F3-mpl (décrit à l'exemple 1).

3. Purification de rhML332
On applique des milieux conditionnés 293-rhML332 à une colonne Blue-Sépharose (Pharmacia) équilibrée dans du phosphate de sodium 10 mM, pH 7,4 (tampon A). On lave ensuite la colonne avec 10 volumes de colonne chaque fois de tampon A et de tampon A contenant de l'urée 2M. On élue ensuite la colonne avec le tampon A contenant de l'urée 2M et du NaCl 1M. On applique ensuite le regroupement d'élution

de Blue-Sépharose sur une colonne WGA-Sépharose équilibrée dans le tampon A. On lave alors la colonne WGA-Sépharose avec 10 volumes de colorant de tampon A contenant de l'urée 2M et NaCl 1M, et on élue avec le même tampon contenant Nacétyl-D-glucosamine 0, 5M.

On applique l'éluat WGA-Sépharose dans une colonne C4-HPLC (Synchrom, Inc. ) équilibrée dans TFA (0,1%). On élue la colonne C4-HPLC avec un gradient de propanol discontinu (0-25%, 25-35%, 35-70%). rHML332 s'avère s'éluer dans la région du gradient dans laquelle la teneur en propanol est de 28-30%. Par SDS-PAGE, le rhML332 purifié migre sous forme d'une large bande dans la région de 68-80 kDA du gel (voir figure 15).

4. Purification du rhML153
On sépare les milieux conditionnés 293-rhML153 sur Blue-Sépharose, comme décrit pour rhMLg. On applique l'éluat de Blue-Sépharose directement sur une colonne d'affinité au mpl comme décrit ci-dessus. Le rhML153 élué de la colonne d'affinité au mpl est purifié jusqu'à homogénéité
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en utilisant une colonne C4-HPLC mise en service dans les mêmes conditions que décrites pour rhML332. Par SDS-PAGE, le rhML153 purifié se sépare en deux bandes majeures et en deux bandes mineures avec une valeur Mr de-18. 000-21.000 (voir figure 15).

EXEMPLE 20
Expression et purification de la TPO à partir de CHO 1. Description des vecteurs d'expression de CHO
Les vecteurs d'expression utilisés dans les protocoles d'électroporation décrits ci-dessous ont été désignés comme suit : pSVIS. ID. LL. MLORF (longueur totale ou hTP0332) et pSVI5. ID. LL. MLEPO-D (tronqué ou hTPOig3).

Les caractéristiques pertinentes de ces plasmides sont représentées dans les figures 23 et 24.

2. Préparation des vecteurs d'expression de CHO
On obtient un ADNc correspondant au cadre de lecture complet ouvert de la hTPO par PCR en utilisant les amorces oligonucléotidiques du tableau 12.

TABLEAU 12
Amorces PCR du vecteur d'expression de CHO
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EMI232.2
On utilise pRK5-hmplI (décrit aux exemples 7 et 9) comme matrice pour la réaction en présence d'ADN polymérase de pfu (Stratagene).

On effectue la dénaturation initiale pendant 7 minutes à 94 C, qui est suivie par 25 cycles

d'amplification, 1 minute à 94 C, 1 minute à 550C et 1 minute à 72 C. On procède à l'extension finale pendant 15 minutes à 72 C. On purifie le produit de PCR et on le clone entre les sites de restriction Clal et SalI du
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plasmide pSVI5. ID. LL pour obtenir le vecteur pSVI5. ID. LL. MLORF. On génère un second produit de construction correspondant au domaine homologue au EPO de la même manière, mais en utilisant Cla. FL. F2 comme amorce réverse ci-après :
EPOD. Sal S'AGT CGA CGT CGA CTC ACC TGA CGC AGA GGG TGG ACC 3' (SEQ ID NO : 68) On appelle le produit de construction final pSVI5. ID. LL. MLEPO-D.

On examine la séquence des deux produits de construction, comme décrit aux exemples 7 et 9.

En principe, on introduit les séquences de codage pour les ligands de longueur totale et tronqué dans le site de clonage multiple du vecteur d'expression de CHO pSVI5. ID. LL.

Ce vecteur contient la région précoce de promoteur/amplificateur de SV40, une unité d'épissage modifiée contenant l'ADNc de DHFR de souris, un site de clonage multiple pour l'introduction du gène d'intérêt (dans ce cas-ci, les séquences TPO décrites), une origine de réplication et un signal de polyadénylation de SV40, ainsi que le gène de P-lactamase pour la sélection et l'amplification plasmidiques dans des bactéries.

3. Méthodologie pour l'établissement de lignées cellulaires CHO stables exprimant les TP0332 et TP01 5 3 humains recombinantes a.

Description de la lignée cellulaire parentale CHO
La lignée cellulaire hôte CHO (ovaire de hamster chinois) utilisée pour l'expression des molécules TPO décrites ici est connue par l'abréviation CHO-DP12 (voir EP 307.247 publié le 15 mars 1989). On sélectionne cette lignée cellulaire de mammifère en passant par des clones à partir d'une transfection de la lignée parentale (CHO-K1 DUX-Bll (DHFR-)- obtenue auprès de Dr. Frank Lee de la Stanford University avec la permission du docteur L. Chasin) avec un vecteur exprimant la préproinsuline pour obtenir des clones manifestant des exigences en insuline réduites.

Ces cellules sont également DHFR-et des clones peuvent être sélectionnés pour détecter la présence de séquences vectorielles d'ADNc de DHFR par croissance sur un milieu exempt de suppléments nucléotidiques (glycine, hypoxanthine et thymidine). Ce système de sélection pour l'expression stable de lignée cellulaire CHO est utilisé couramment. b. Procédé de transfection (électroporation)
On génère des lignées cellulaires exprimant TP0332 et TP0153 par transfection de cellules DP12 via électroporation (voir, par exemple Andreason, G. L. J. Tiss. Cult. Meth.,
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15, 56 [1993]) avec des plasmides linéarisés pSVI5. ID. LL. MLORF ou pSVI5. ID. LL. MLEPO-D, respectivement.

On prépare trois mélanges réactionnels d'enzymes de restriction pour chaque incision plasmidique : 10 g, 25 g et 50 ug du vecteur avec l'enzyme Notl par des procédés classiques de biologie moléculaire. On trouve seulement une fois ce site de restriction dans le vecteur dans la région 3'de

linéarisation et en dehors des unités de transcription du ligand pour la TPO (voir figure 23). On prépare les mélanges réactionnels de 100 cl pour une incubation pendant une nuit à 370. Le lendemain, on extrait les mélanges dans du phénolchloroforme-alcool isoamylique (50 : 49 : 1) une fois et on précipite dans de l'éthanol sur de la neige carbonique pendant approximativement 1 heure.

On récolte ensuite le précipité par microcentrifugation pendant 15 minutes et on sèche. On remet en suspension l'ADN linéarisé dans 150 gl de milieu DMEM-F12 1 : 1 de Ham, auquel on a ajouté des antibiotiques classiques et de la glutamine 2 mM.

On récolte les cellules DP12 croissant en suspension, on les lave une fois dans le milieu décrit pour la remise en suspension de l'ADN et enfin, on les remet en suspension dans le même milieu à une concentration de 107 cellules par
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750 gl. Pendant une heure à la température ambiante, on incube conjointement des quantités aliquotes de cellules (750 Ml) et chaque mélange d'ADN linéarisé, puis on transfère à une chambre d'électroporation BRL. On soumet alors chaque mélange réactionnel à une électroporation dans un appareil d'électroporation classique BRL réglé à 350 volts à 330 F et à faible capacitance.

Après électroporation, on laisse les cellules au repos dans l'appareil pendant 5 minutes et puis sur de la glace pendant un laps de temps d'incubation supplémentaire de 10 minutes.

On transfère les cellules ayant subi une électroporation à des boîtes de culture cellulaire de 60 mm contenant 5 ml de milieu de croissance complet classique pour des cellules CHO (DMEM-F12 50 : 50 à teneur élevée en glucose, sans addition de glycine avec IX GHT, glutamine 2 mM et du sérum de veau foetal (5%)) et on laisse croître pendant une nuit dans un incubateur de culture cellulaire avec 5% de C02.

c.

Procédé de sélection et de criblage
Le lendemain, on sépare les cellules des plaques par trypsination par des procédés classiques et on transfère à des boîtes de culture tissulaire de 150 mm contenant un milieu sélectif DHFR (milieu DMEM-F12 1 : 1 de Ham décrit cidessus, auquel on ajoute, soit 2%, soit 5% de sérum de veau foetal dialysé qui est exempt de glycine, d'hypoxanthine et de thymidine, à savoir le milieu de sélection DHFR normal que la demanderesse utilise). Les cellules provenant de chaque boîte de 60 mm sont ensuite réétalées dans 5 boîtes de 150 mm. On incube alors les cellules pendant 10 à 15 jours (avec un changement de milieu) à 370/5% de C02 jusqu'à ce que les clones commencent à apparaître et atteignent des tailles qui permettent de les transférer dans des boîtes à 96 puits.

Pendant un laps de temps de 4-5 jours, on transfère des lignées cellulaires à des boîtes de 96 puits en utilisant des pointes jaunes stériles sur un "pipettman"réglé à 50 ml. On laisse les cellules croître jusqu'à confluence (habituellement 3-5 jours), puis on soumet les plateaux à une trypsination et on reproduit deux copies du plateau original. On entrepose à court terme deux de ces copies dans le congélateur, les cellules dans chaque puits étant diluées dans 50 jus de FCS (10%) dans DMSO. On analyse les échantillons de milieux exempts de sérum conditionnés pendant 5 jours, à partir de puits confluents dans le troisième plateau pour l'expression de la TPO via le dosage d'activité basé sur les cellules Ba/F.

A partir de l'entreposage, on ranime les clones basés sur ce dosage, qui manifestent l'expression la plus élevée et on les développe dans deux ballons confluents en T de 150 mm pour les transférer au groupe de culture cellulaire à des fins d'adaptation de la suspension, de redosage et de mise en banque.

d. Protocole d'amplification Ensuite, on soumet plusieurs lignées cellulaires
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manifestant le titrage le plus élevé, à partir de la sélection décrite ci-dessus, à un schéma d'amplification classique au méthotrexate pour générer des clones de titre plus élevé.

On amplifie des clones de cellules CHO et on les étale dans des boîtes de 10 cm à quatre concentrations de méthotrexate (c'est-à-dire 50 nM, 100 nM, 200 nM et 400 nM) à deux ou trois nombres de cellules (105, 5x105 et 106 cellules par boîte). On incube ensuite ces cellules à 370/5% de C02 jusqu'à ce que les clones soient établis et qu'ils puissent être transférés à des boîtes de 96 puits pour la poursuite du dosage. On soumet à nouveau plusieurs clones de cette sélection à titre élevé à des concentrations supérieures en méthotrexate (c'est-à-dire 600 nM, 800 nM, 1000 nM et 1200 nM) et, comme précédemment, on laisse s'établir les clones résistants et ensuite, on les transfère à des boîtes de 96 puits et on les soumet au dosage.

4. Culture de lignées cellulaires CHO stables exprimant les TP0332 et TPO153 humaines recombinantes
On décongèle les cellules mises en banque et on amplifie la population cellulaire par des procédés classiques de croissance de cellules, soit dans un milieu exempt de sérum, soit dans un milieu contenant du sérum.

Après avoir obtenu une amplification correspondant à une densité cellulaire suffisante, on lave les cellules pour éliminer les milieux de culture cellulaire consommés. On cultive alors les cellules par n'importe quels procédés classiques comprenant la culture par lots, semi-continue ou continue à 25-40 C, à un pH neutre avec une teneur en 02 dissous d'au moins 5% jusqu'à ce que la TPO sécrétée de manière constitutive se soit accumulée. On sépare alors le

fluide de culture cellulaire des cellules par des moyens mécaniques tels que la centrifugation.
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5. Purification de la TPO humaine recombinante à partir de fluides de culture de CHO
On applique directement un fluide de culture de cellules récoltées (HCCF) sur une colonne Blue Sépharose 6 à écoulement rapide (Pharmacia) équilibrée dans du phosphate de Na O, oim, pH 7,4, NaCl 0, 15 M à un rapport d'approximativement 100 1 de HCCF par litre de résine et à un débit linéaire d'approximativement 300 ml/h/cm2. On lave ensuite la colonne avec 3-5 volumes de colonne de tampon d'équilibration, puis avec 3-5 volumes de colonne de phosphate de Na 0, 01 M, pH 7,4, urée 2, 0 M. On élue ensuite la TPO avec 3 à 5 volumes de colonne de phosphate de Na 0, 01 M, pH 7,4, urée 2, 0 M, NaCl 1, 0 M.

On applique ensuite le regroupement de la Blue Sépharose contenant la TPO sur une colonne Sépharose 6 MB à teneur en germe de blé-lectine (Pharmacia) équilibrée dans du phosphate de Na 0, 01 M, pH 7,4, urée 2, 0 M et NaCl 1, 0 M à un rapport de 8 à 16 ml de regroupement de Blue Sépharose par ml de résine à un débit d'approximativement 50 ml/h/cm2. On lave alors la colonne avec 2 à 3 volumes de colonne d'un tampon d'équilibration. On élue ensuite la TPO avec 2 à 5 volumes de colonne de phosphate de Na 0, 01 M, pH 7,4, urée 2, 0 M, N-acétyl-D-glucosamine 0, 5 M.

On règle alors le regroupement germe de blé-lectine pour obtenir une concentration finale de CEg (0, 04%) et d'acide trifluoracétique (TFA) (0, 1%). On applique le regroupement résultant sur une colonne en C4 à phase réverse (Vydac 214TP1022) équilibrée dans TFA (0, 1%,) CEg (0, 04%)

à une charge d'approximativement 0, 2 à 0, 5 mg de protéine par ml de résine à un débit de 157 ml/h/cm2.

On élue la protéine dans un gradient linéaire d'acétonitrile à deux phases contenant TFA (0, 1%), C12E8 (0,04%). La première phase est composée d'un gradient linéaire de 0 à 30% d'acétonitrile pendant 15 minutes. La seconde phase est composée d'un gradient linéaire de 30 à 60% d'acétonitrile dans un laps de temps de 60 minutes. La TPO s'élue à une teneur d'approximativement 50% d'acétonitrile. On procède à un regroupement sur base de SDS-PAGE.

Ensuite, on dilue le regroupement C4 avec 2 volumes de phosphate de Na O, 01M, pH 7,4, NaCl 0, 15 M et on procède à une diafiltration contre approximativement 6 volumes de phosphate de Na 0, 01 M, pH 7,4, NaCl 0, 15 M sur une membrane Amicon YM'ou sur une membrane d'ultrafiltration analogue possédant une section de poids moléculaire de 10.000 à 30.000 daltons. Le produit de diafiltration résultant peut alors être traité directement ou davantage concentré par ultrafiltration. On règle le produit de diafiltration/concentration à une concentration finale de Tween 80 de 0, 01%.

Ensuite, on applique la totalité ou une partie du produit de diafiltration/concentration équivalant à 2-5% du volume de colonne calculé sur une colonne Sephacryl S-300 HR (Pharmacia) équilibrée dans du phosphate de Na 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, Tween 80 (0, 01%) et on chromatographie à un débit d'approximativement 17 ml/h/cm2. Les fractions contenant la TPO, qui sont exemptes d'agrégats et de produits de dégradation protéolytique, sont rassemblées sur base de SDS-PAGE. On filtre le regroupement résultant sur un

filtre 0, 22J. L, Millex-GV ou analogues, et on l'entrepose à 2-8 C.
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EXEMPLE 21 Transformation et induction de la synthèse protéinique de la TPO dans E. coli 1. Construction des vecteurs d'expression de la TPO dans E. coli
On conçoit tous les plasmides pMP21, pMP151, pMP41, pMP57 et pMP202 pour exprimer les 155 premiers aminoacides de la TPO en aval d'une petite séquence de tête qui varie parmi les différents produits de construction. Les séquences de têtes procurent principalement un déclenchement de traduction à niveau élevé et une purification rapide.

Les plasmides pMP210-1, -T8, -21, -22, -24, -25 sont conçus pour exprimer les 153 premiers aminoacides de la TPO en aval d'un méthionine d'initiation et diffèrent uniquement dans l'utilisation du codon pour les 6 premiers aminoacides de la TPO, tandis que le plasmide pMP251 est un dérivé du pMP210-1 dans lequel l'extrémité carboxy-terminale de la TPO est prolongée par 2 aminoacides. Tous les plasmides ci-dessus produisent des taux élevés d'expression intracellulaire de la TPO dans E. coli suite à l'induction du promoteur du tryptophane (Yansura, D. G. et collaborateurs, Methods in Enzymology (Goeddel, D. V.

Ed. ) 185 : 54-60, Academic Press, San Diego [1990]). Les plasmides pMP1 et pMP172 sont des produits intermédiaires dans la construction des plasmides d'expression intracellulaire de la TPO ci-dessus.

(a) Plasmide pMPl
Le plasmide pMP1 est un vecteur de sécrétion pour les 155 premiers aminoacides de la TPO et on le construit en ligaturant ensemble 5 fragments d'ADN, comme représenté en figure 33. Le premier de ces fragments est le vecteur pPho21 dans lequel on a éliminé le petit fragment MluI-BamHI. pPho21 est un fragment dérivé de phGH1 (Chang, C. N. et collaborateurs, Gene 55 : 189-196 [1987]) dans lequel on a remplacé le gène de l'hormone de croissance humaine par le gène phoA de E. coli et le site de restriction MluI a été arrangé dans la séquence de codage pour la séquence signal STII aux aminoacides 20-21.

On préligature les deux fragments suivants, un morceau d'ADN de HinfI-PstI de 258 paires de bases provenant de pRK5-hmplI (exemple 9) encodant des aminoacides 19-103 de la TPO et l'ADN synthétique ci-après encodant les aminoacides 1-18
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5'-CGCGTATGCCAGCCCGGCTCCTCCTGCTTGTGACCTCCGAGTCCTCAGTAAACTGCTTCGTG ATACGGTCGGGCCGAGGAGGACGAACACTGGAGGCTCAGGAGTCATTTGACGAAGCACTGA-5' (SEQ ID NO : 69) (SEQ ID NO : 70) avec de l'ADN ligase de T4, et on incise le second avec PstI. Le quatrième est un fragment PstI-HaeIII de 152 paires de bases provenant de pRK5hmpII encodant les aminoacides 104-155 de la TPO.

Le dernier est un fragment StuI-BamHI de 412 paires de bases provenant de pdhl08 contenant le phage lambda pour la terminaison transcriptionnelle, comme décrit précédemment (Scholtissek, S. et collaborateurs, NAR 15 : 3185 [1987]).

(b) Plasmide pMP21
On conçoit le plasmide pMP21 pour exprimer les 155 premiers aminoacides de la TPO à l'aide d'une séquence de tête de 13 aminoacides comprenant une partie de la séquence signal STII. On le construit en ligaturant ensemble trois fragments d'ADN, comme représenté en figure 34, le premier de ces fragments étant le vecteur pVEG31 dans lequel on a éliminé le petit fragment Xbal-SphI. Le vecteur pVEG31 dérivé de pHGH207-1 (de Boer, H. A. et collaborateurs, dans promoter Structure and Function (Rodriguez, R. L. et Chamberlain, M. J., Ed) 462, Praeger, New York [1982]) dans lequel on a remplacé le gène de l'hormone de croissance humaine par le gène pour le facteur de croissance endothélial vasculaire (ce fragment vectoriel identique peut être obtenu auprès du plasmide mentionné en dernier lieu).

La seconde partie dans la ligation concerne un duplex d'ADN synthétique possédant la séquence ci-après :
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5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTAA TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGAAGAATTGCGC-5' (SEQ ID NO : 71) (SEQ ID NO : 72) Le dernier morceau est un fragment MluI-SphI de 1072 paires de bases provenant de pMP1 encodant 155 aminoacides de la TPO.

(c) Plasmide pMP151
Le plasmide pMP151 est conçu pour exprimer les 155 premiers aminoacides de la TPO en aval d'une séquence de tête comprenant 7 aminoacides de la séquence signal STII, 8 histidines et un site de clivage pour le facteur Xa. Comme

indiqué en figure 35, on construit pMP151 par ligation commune de trois fragments d'ADN, dont le premier est le vecteur pVEG31 décrit précédemment dont on a retiré le petit fragment XbaI-SphI. Le second est un duplex d'ADN synthétique possédant la séquence ci-après :
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5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCATCACCATCACCATCACCATCACATCGAAGGTCGTAGCC TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTAGTGTAGCTTCCAGCAT-5' (SEQ ID NO : 73) (SEQ ID NO : 74) Le dernier est un fragment BglI-SphI de 1064 paires de bases provenant de pMP11 encodant 154 aminoacides de la TPO.

Le plasmide pMP11 est identique à pMP1, à l'exception de quelques changements de codons dans la séquence signal STII (on peut obtenir ce fragment à partir de pMP1).

(d) Plasmide pMP202
Le plasmide pMP202 est très similaire au vecteur d'expression de pMP151, avec cette exception que le site de clivage du facteur Xa dans la séquence de tête a été remplacé par un site de clivage de la thrombine. Comme représenté en figure 36, on construit pMP202 par ligation conjointe de trois fragments d'ADN. Le premier de ces fragments est le pVEG31 décrit antérieurement, dans lequel on a retiré le petit fragment XbaI-SphI.

Le second est un duplex d'ADN synthétique possédant la séquence ci-après :
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5'-CTAGAATTATGAAAAAAGATATCGCATTTCATCACCATCACCATCACCATCACATCGAACCACGTAGCC TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTAGTGTAGCTTGGTGCAT-5' (SEQ IQ NO : 75) (SEQ ID NO : 76)

Le dernier morceau est un fragment BglI-SphI de 1064 paires de bases provenant du plasmide pMP11 décrit antérieurement.

(e) Plasmide pMP172
Le plasmide pMP172 est un vecteur de sécrétion pour les 153 premiers aminoacides de la TPO et est un produit intermédiaire pour la construction de pMP210. Comme représenté en figure 37, on prépare pMP172 par ligation conjointe de trois fragments d'ADN, dont le premier est le vecteur pLS32lamB dans lequel la petite section EcoRIHindIII est éliminée. Le second est un fragment EcorI-HgaI de 946 paires de bases provenant du plasmide pMP11 décrit antérieurement.

Le dernier morceau est un duplex d'ADN synthétique possédant la séquence ci-après : 5'-TCCACCCTCTGCGTCAGGT (SEQ ID NO : 77)
GGAGACGCAGTCCATCGA-5' (SEQ ID NO : 78) (f) Plasmide pMP210
On conçoit le plasmide pMP210 pour exprimer les 153 premiers aminoacides de la TPO après un résidu de méthionine de déclenchement de la traduction. On construit en fait le plasmide sous forme d'une banque plasmidique dans laquelle les 6 premiers codons de la TPO sont disposés de manière aléatoire dans la troisième position de chaque codon et on le construit, comme représenté en figure 38, par la ligation de trois fragments d'ADN. Le premier de ces fragments est le vecteur pVEG31 décrit antérieurement dans lequel on a éliminé le petit fragment XbaI-SphI.

Le second est un duplex d'ADN synthétique représenté ci-dessous, traité d'abord avec l'ADN polymérase (Klenow), puis par digestion avec XbaI et HinfI, et en encodant le résidu de méthionine d'initiation et les 6 premiers codons de la TPO à

disposition aléatoire.

5'-GCAGCAGTTCTAGAATTATGTCNCCNGCNCCNCCNGCNTGTGACCTCCGA
ACACTGGAGGCT GTTCTCAGTAAA (SEQ ID NO : 79) CAAGAGTCATTTGACGAAGCACTGAGGGTACAGGAAG-5' (SEQ ID NO : 80) Le troisième est un fragment HinfI-SphI de 890 paires de bases provenant de pMP172 encodant les aminoacides 19-153 de la TPO.

On retransforme la banque plasmidique pMP210 d'approximativement 3700 clones sur des plaques LB à teneur élevée en tétracycline (50 g/ml) pour extraire par sélection des clones à déclenchement de traduction élevée
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(Yansura, D. G. et collaborateurs, Methods : A companion to Methods in Enzymology, 4 : 151-158 [1992]). Des 8 colonies qui apparaissent sur les plaques à teneur élevée en tétracycline, 5 des meilleures en terme d'expression de la TPO sont soumises à un séquençage d'ADN et les résultats sont représentés en figure 39 (SEQ ID NO : 23,24, 25,26, 27 et 28).

(g) Plasmide pMP41
On conçoit le plasmide pMP41 pour exprimer les 155 premiers aminoacides de la TPO fusionnés à une séquence de tête constituée par 7 aminoacides de la séquence signal STII suivie par un site de clivage du facteur Xa. On construit le plasmide, comme représenté en figure 40, en ligaturant ensemble trois morceaux d'ADN dont le premier est le vecteur pVEG31 décrit antérieurement, dans lequel on a éliminé le petit fragment XbaI-SphI. Le second est le duplex d'ADN synthétique suivant :

B'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTATCGAAGGTCGTAGCC (SEQ ID NO : 81) TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAATAGCTTCCAGCAT-5' (SEQ ID NO : 82) Le dernier morceau de la ligation est le fragment BglI-SphI de 1064 paires de bases provenant du plasmide pMP11 décrit antérieurement.

(h) Plasmide pMP57
Le plasmide pMP57 exprime les 155 premiers aminoacides de la TPO en aval d'une séquence de tête constituée par 9 aminoacides de la séquence signal STII et par le site dibasique Lys-Arg. Ce site dibasique procure un moyen d'éliminer la séquence de tête avec la protéase ArgC. On construit ce plasmide, comme représenté en figure 41, en ligaturant ensemble trois morceaux d'ADN. Le premier de ces morceaux est le vecteur pVEG31 décrit antérieurement, dans lequel on a éliminé le petit fragment XbaI-SphI.

Le second est le duplex d'ADN synthétique suivant : S'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTAAACGTAGCC (SEQ ID NO : 83)
TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGAAGAATTTGCAT-5' (SEQ ID NO : 84) La dernière partie de la ligation est le fragment BglI-SphI de 1064 paires de bases provenant du plasmide pMP11 décrit antérieurement.

(i) Plasmide pMP251
Le plasmide pMP251 dérivé du pMP210-1 dans lequel on a inclus 2 aminoacides supplémentaires de la TPO sur l'extrémité carboxy-terminale. Comme représenté en figure 42, on construit ce plasmide par ligation conjointe de deux morceaux d'ADN, dont le premier est le pMP21 décrit antérieurement, dans lequel on a éliminé le petit fragment XbaI-ApaI. La seconde partie de la ligation est un fragment XbaI-ApaI de 316 paires de bases provenant du pMP210-1.

2. Transformation et induction de E. coli avec des vecteurs d'expression de la TPO
On utilise les plasmides d'expression de la TPO cidessus pour transformer la souche E. coli 44C6 (w3110 tonal rpoHts long clpP galE) en utilisant le procédé de choc thermique au CaCl2 (Mandel, M et collaborateurs, J. Mol.

Biol., 53 : 159-162 [1970]). On fait croître d'abord les cellules transformées à 370C dans des milieux LB contenant 50 g/ml de carbénicilline jusqu'à ce que la densité optique (600 nm) de la culture atteigne approximativement 2-3. On dilue alors la culture LB dans des milieux M9 contenant 0, 49% de casaminoacides (poids/volume) et 50 g/ml de carbénicilline. Après croissance sous aération à 300C pendant 1 heure, on ajoute de l'acide indol-3-acrylique pour obtenir une concentration finale de 50 g/ml. On laisse alors la culture poursuivre sa croissance à 300C avec aération pendant 15 heures supplémentaires, moment auquel on récolte les cellules par centrifugation.

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EXEMPLE 22 Production de la TPO Jbioloiquement active fet' 1-153 dans B. coli On peut appliquer les procédés donnés ci-dessous pour la production de la TPO remise en plis biologiquement active (met-1 1-153) par analogie à la récupération d'autres variants de la TPO, y compris des formes prolongées N et C terminales (voir exemple 23).

A. Récupération de la TPO non soluble (Met-1 1-153)
On met à fermenter des cellules E. coli exprimant la TPO (Met-1 1-153) encodées par le plasmide pMP210-1, comme décrit ci-dessus. Spécifiquement, on remet en suspension environ 100 g de cellules dans 1 1 (10 volumes) de tampon de rupture de cellules (Tris 10 mM, EDTA 5 mM, pH 8) avec un homogénéisateur Polytron et on centrifuge les cellules à 5000 x g pendant 30 minutes. On remet à nouveau en suspension la pastille cellulaire lavée dans 1 1 de tampon de rupture de cellules avec l'homogénéisateur Polytron et on fait passer la suspension cellulaire à travers un LH Cell Disrupter (LH Inceltech, Inc. ) ou à travers un Microfluidizer (Microfluidics International) en suivant les instructions fournies par le fabricant.

On centrifuge la suspension à 5.000 g pendant 30 minutes et on la remet en suspension, puis on la centrifuge une seconde fois pour obtenir une pastille lavée à corps apte à être rompu. On utilise immédiatement la pastille lavée ou bien on l'entrepose en la congelant à-70 C.

B. Solubilisation et purification de la TPO monomère (Met-1 1-153)
On remet la pastille ci-dessus en suspension dans 5 volumes en poids de Tris 20 mM, pH 7,8, avec de la guanidine 6-8 M et DTT 25 mM (dithiothréitol) et on agite pendant 1-3 heures ou pendant la nuit à 40C pour obtenir la solubilisation de la protéine de TPO. Des concentrations élevées en urée (6-8 M) sont également utiles, mais donnent généralement lieu à des rendements inférieurs, comparés à ceux obtenus avec la guanidine.

Après solubilisation, on centrifuge la solution à 30.000 x g pendant 30 minutes pour obtenir un produit surnageant clair contenant de la protéine de TPO monomère dénaturée. On chromatographie ensuite le produit surnageant sur une colonne de filtration sur gel Superdex 200 (Pharmacia, 2,6 x 60 cm) à un débit de 2 ml/min et on élue la protéine avec du phosphate de Na 20 mM, pH 6, 0 et avec DTT 10 mM. On rassemble les fractions contenant la protéine de TPO dénaturée monomère s'éluant entre 160 et 200 ml. On purifie davantage la protéine de TPO sur une colonne semi-préparative en C4 à phase réverse (2 x 20 cm, VYDAC). On applique l'échantillon à 5 ml/min sur une colonne équilibrée dans TFA (0,1%) (acide trifluoracétique) avec de l'acétonitrile (30%). On élue la protéine avec un gradient linéaire d'acétonitrile (30-60% pendant 60 minutes).

La protéine réduite purifiée s'élue à une teneur d'approximativement 50% d'acétonitrile. On utilise cette matière à des fins de remise en plis pour obtenir le variant de la TPO biologiquement active.

C. Génération de la TPO biologiquement active (Met-1 1-153)
On dilue approximativement 20 mg de protéine de TPO monomère réduite et dénaturée dans 40 ml de TFA (0, l%)/acétonitrile (50%), dans 360 ml d'un tampon de remise en plis contenant, dans des conditions optimales, les réactifs ci-après :
Tris 50 mM
NaCl 0,3 M
EDTA 5 mM
Détergent CHAPS (2%)
Glycérol (25%)
Glutathion oxydé 5 mM
Glutathion réduit 1 mM pH réglé à 8,3.

Après mélange, on agite modérément le tampon de remise en plis à 40C pendant 12-48 heures pour obtenir des rendements maximaux de remise en plis de la forme correcte de la TPO contenant des liaisons disulfure (voir cidessous). On acidifie ensuite la solution avec TFA pour obtenir une concentration finale de 0, 2%, on filtre à travers un filtre de 0,45 ou de 0,22 micron et on ajoute 1/10 volume d'acétonitrile. On pompe cette solution directement sur une colonne en C4 à phase réverse et on élue la TPO purifiée remise en plis (Met-1 1-153) avec le même programme de gradient que ci-dessus. On élue la TPO remise en plis biologiquement active à une teneur approximative de 45% d'acétonitrile dans ces conditions. Les versions de la TPO contenant des liaisons incorrectes de disulfure sont éluées plus tôt.

La TPO purifiée finale (Met-1 1-153) manifeste une pureté supérieure à 95%, comme déterminé par des gels SDS et par chromatographie analytique en C4 à phase réverse. Pour des études sur les animaux, on dialyse la

matière C4 purifiée dans des tampons physiologiquement compatibles. On utilise des tampons isotoniques (acétate de Na 10 mM, pH 5, 5, succinate de Na 10 mM, pH 5,5 ou phosphate de Na 10 mM, pH 7,4) contenant NaCl 150 mM et Tween 80 (0, 01%).

A cause de l'activité élevée de la TPO dans le dosage par Ba/F3 (on obtient une stimulation semi-maximale à approximativement 3 pg/ml), il est possible d'obtenir une matière biologiquement active en utilisant un grand nombre de conditions rédox, de détergents et de temps différents.

Toutefois, dans la plupart des conditions, on obtient seulement une petite quantité de matière plissée de manière appropriée ( < 10%). Pour des procédés de fabrication à l'échelle industrielle, il est souhaitable d'obtenir des rendements de remise en plis d'au moins 10%, de manière plus préférée de 30-50%, de manière de loin préférée > 50%. On évalue bon'nombre de différents détergents (Triton X-100, dodécyl-bêta-maltoside, CHAPS, CHAPSO, SDS, sarcosyle, Tween 20 et Tween 80, Zwittergent 3-14, etc. ) pour leur efficacité à supporter des rendements élevés de remise en plis.

Parmi ces détergents, seule la famille CHAPS (CHAPS et CHAPSO) s'est avérée généralement utile dans la réaction de remise en plis pour limiter l'agrégation protéinique et la formation inadéquate de liaison disulfure. Des taux de CHAPS supérieurs à 1% sont les plus utiles. On a besoin de chlorure de sodium pour les meilleurs rendements, les taux optimaux se situant entre 0, 1 M et 0, 5 M. La présence de
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EDTA (1-5 mM) limite la quantité d'oxydation (et d'agrégation) à catalyse métallique que l'on observe avec certaines préparations. Des concentrations de glycérol supérieures à 15% procurent les conditions optimales de remise en plis. Pour des rendements maximaux, il est essentiel de disposer de glutathion à la fois oxydé et réduit ou de cystéine oxydée et réduite comme paire de

réactifs rédox.

En général, on observe des rendements supérieurs lorsque le rapport molaire du réactif oxydé est égal à ou en excès par rapport à l'élément réactif réduit de la paire rédox. Des valeurs de pH entre 7,5 et environ 9 sont optimales pour la remise en plis de ces variants de la TPO. Des solvants organiques (par exemple éthanol, acétonitrile, méthanol) sont tolérés à des concentrations de 10-15% ou moins. Des taux plus élevés de solvants organiques augmentent la quantité de formes inadéquatement plissées.

Des tampons Tris et phosphate sont généralement utiles.

L'incubation à 40C procure également des niveaux plus élevés de TPO plissée de manière adéquate.

Des rendements de remise en plis de 40-60% (basés sur la quantité de la TPO réduite et dénaturée, utilisée dans la réaction de remise en plis) sont spécifiques pour des préparations de TPO qui a été purifiée au cours de la première étape C4. On peut obtenir une matière active avec des préparations moins pures (par exemple directement après passage sur la colonne Superdex 200 ou bien après extraction initiale du corps apte à être rompu) bien que les rendements soient moindres, du fait de la précipitation prononcée et de l'interférence avec les protéines non-TPO, au cours du processus de remise en plis de la TPO.

Etant donné que la TPO (Met-1 1-153) contient 4 résidus de cystéine, il est possible de générer trois versions de disulfure différentes de cette protéine : version 1 : disulfures entre les résidus de cystéine 1-4 et 2-3 version 2 : disulfures entre les résidus de cystéine 1-2 et 3-4 version 1 : disulfures entre les résidus de cystéine 1-3 et 2-4

Au cours de l'exploration initiale pour déterminer les conditions de remise en plis, on sépare plusieurs pics différents contenant la protéine TPO par chromatographie en C4 en phase réverse. Un seul de ces pics possède une activité biologique significative, comme déterminé en utilisant le dosage par Ba/F3. Ensuite, on optimise les conditions de remise en plis pour procurer, de manière préférentielle, cette version.

Dans ces conditions, les versions mal remises en plis sont inférieures à 10-20% de la TPO monomère totale obtenue.

Le modèle de disulfure pour la TPO biologiquement active a été déterminé comme étant de 1-4 et de 2-3 par spectrométrie de masse et par séquençage protéinique (c'est- à-dire la version 1). On met à digérer des quantités aliquotes des divers pics séparés par C4 (5-10 nmoles) avec de la trypsine (rapport molaire 1 : 25 trypsine : protéine). On analyse le 1 mélange de digestion par spectrométrie de masse par désorption au laser assisté par une matrice et après réduction avec DTT. Après réduction, on détecte les masses correspondant au plus grand nombre de peptides tryptiques les plus gros de la TPO. Dans les échantillons non réduits, certaines de ces masses sont manquantes et on observe de nouvelles masses.

La masse des nouveaux pics correspond fondamentalement à la somme des peptides tryptiques individuels impliqués dans la paire de disulfures. Ainsi, il est possible de déterminer de manière non équivoque le modèle de disulfures de la TPO biologiquement active recombinante remise en plis comme étant de 1-4 et 2-3. Ceci confirme le modèle de disulfures connu de l'érythropolétine moléculaire apparentée.

D. Activité biologique de la TPO remise en plis recombinante (met 1-153)
La TPO remise en plis et purifiée (Met-1 1-153) manifeste une activité dans des dosages à la fois in vitro et in vivo. Dans le dosage par Ba/F3, on obtient une stimulation semi-maximale de l'incorporation de thymidine dans les cellules Ba/F3 à 3,3 pg/ml (0, 3 pM).

Dans l'ELISA basé sur le récepteur mpl, l'activité semi-maximale apparaît à 1,9 ng/ml (120 pM). Dans des animaux normaux et myélodépressifs obtenus par rayons X subléthaux, la TPO (Met-1 1-153) manifeste une activité élevée (on peut voir une activité à des doses aussi faibles que 30 ng/souris)
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pour stimuler la production de nouvelles plaquettes.

EXEMPLE 23 Productiond'autres variants de la TPO biologiquement active dans E. coli
Ci-dessous, on procure trois variants différents de la TPO produits dans E. coli, purifiés et remis en plis pour obtenir des formes biologiquement actives, comme indiqué cidessous.

(1) MLF-on fusionne 13 résidus provenant de la séquence signal STII à dérivation bactérienne du domaine Nterminal de la TPO (résidus 1-155). La séquence résultante est MKKNIAFLLNAYASPAPPAC.-..-CVRRA (SEQ ID NO : 85)

la séquence de tête étant soulignée et C----C représentant Cys à Cysl5l. On construit ce variant pour procurer une tyrosine pour la radio-iodation de la TPO pour des études biologiques et concernant le récepteur.

(2) H8MLF-on fusionne 7 résidus provenant de la séquence STII, 8 résidus d'histidine et la séquence de clivage enzymatique du facteur Xa IEGHR au domaine Nterminal (résidus 1-155) de la TPO. La séquence est MKKNIAFHHHHHHHHIEGRSPAPPAC.-..-CVRRA (SEQ ID NO : 86) dans laquelle la séquence de tête est soulignée et CCC représente Cys7 à Cys151. On peut traiter ce variant à l'état purifié et remis en plis avec le facteur enzymatique Xa qui va opérer un clivage après le résidu d'arginine de la séquence IEGR pour donner un variant de la TPO ayant une longueur de 155 résidus avec un aminoacide de sérine naturel N-terminal.

(3) T-H8MLF-on le prépare comme décrit ci-dessus pour le variant (2), avec cette exception qu'on fusionne une séquence IEPR sensible à la thrombine au domaine N-terminal de la TPO. La séquence résultante est MKKNIAFHHHHHHHHIEPRSPAPPAC-----CVRRA (SEQ ID NO : 87) dans laquelle la séquence de tête est soulignée et C'-'-'C représente Cys7 à CysSl On peut traiter ce variant à l'état purifié et remis en plis avec l'enzyme thrombine pour générer un variant naturel N-terminal de la TPO ayant une longueur de 155 résidus.

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A. Récupération, solubilisation et purification des variants (1), (2) et (3) de la TPO monomère biologiquement active
Tous les variants sont exprimés dans E. coli.

On trouve la majorité des variants dans des corps aptes à être rompus, comme observé à l'exemple 22 pour la TPO (Met-1 1-153). On met en oeuvre des procédés identiques pour la récupération, la solubilisation et la purification de variants de la TPO monomère comme décrit à l'exemple 22. On utilise des conditions de remise en plis identiques à celles utilisées pour la TPO (Met-1 1-153) avec des rendements globaux de 30- 50%. Après remise en plis, on purifie les variants de la TPO par chromatographie en C4 à phase réverse dans TFA (0, 1%) en utilisant un gradient d'acétonitrile comme décrit précédemment. L'ensemble des variants de la TPO (dans leurs formes non protéolysées) possèdent une activité biologique comme confirmé par le dosage par BA/F3 avec des activités semi-maximales de 2-5 pM.

B. Traitement protéolytique des variants (2) et (3) pour générer la TPO N-terminale authentique (1-155).

On conçoit les variants (2) et (3) ci-dessus de la TPO avec un peptide à séquence de tête apte à un clivage enzymatique avant le résidu d'aminoacide N-terminal normal de la TPO. Après remise en plis et purification des variants (2) et (3) comme décrit ci-dessus, on soumet chacun d'eux à une digestion avec l'enzyme appropriée. Pour chaque variant, on élimine l'acêtonitrile à partir de l'étape C4 à phase réverse, en faisant passer un courant modéré d'azote sur la solution. Par la suite, on traite les deux variants, soit avec le facteur Xa, soit avec de la thrombine, comme décrit ci-dessous.

Pour le variant (2) de la TPO, on ajoute le tampon Tris 1M, pH 8, à la solution exempte d'acétonitrile pour obtenir une concentration finale de 50 mM et on règle si nécessaire
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le pH à 8. On ajoute NaC12 et CaC12 a concurrence de 0, 1 M et de 2 mM, respectivement. On ajoute le facteur Xa (New England Biolabs) pour obtenir un rapport molaire d'environ 1 : 25 à 1 : 100 de l'enzyme au variant. On incube l'échantillon à la température ambiante pendant 1-2 heures pour obtenir un clivage maximal comme confirmé par un changement dans la migration sur des gels SDS, représentant la perte de la séquence de tête. Par la suite, on purifie le mélange réactionnel par chromatographie en C4 à phase réverse en utilisant le même gradient et les mêmes conditions que décrit ci-dessus pour la purification de variants à remise en plis adéquate.

On sépare le variant B non clivé du variant clivé (2) par ces conditions. Les aminoacides Nterminaux s'avèrent être SPAPP, indiquant que l'élimination de la séquence de tête N-terminale est réussie. Le facteur Xa génère également des quantités variables d'un clivage interne à l'intérieur du domaine de la TPO ; on observe un clivage après le résidu d'arginine à la position 118, générant un fragment N-terminal supplémentaire de TTAHKDP (SEQ ID NO : 4). Sur des gels SDS non réducteurs, on observe une bande unique à approximativement 17.000 Daltons pour le variant clivé par le facteur Xa ; sur des gels réducteurs, on observe deux bandes ayant un poids moléculaire d'approximativement 12.000 et 5.000 Daltons, conforme au clivage au résidu d'arginine 118.

Cette observation confirme également le fait que les deux parties de la molécule sont maintenues ensemble par une liaison disulfure entre les premier et quatrième résidus de la cystéine comme on peut le déduire d'après les expériences de digestion tryptique décrites ci-dessus. Dans le dosage biologique par Ba/F3, le variant purifié de la TPO (1-155), après élimination de la séquence de tête N-terminale et avec le clivage interne,

manifeste une activité semi-maximale de 0, 2-0, 3 picomolaire. Le variant intact muni de la séquence de tête manifeste une activité semi-maximale de 2-4 picomolaire.

Pour le variant (3), le tampon de digestion constitué par Tris 50 mM, pH 8, CHAPS (2%), NaCl 0, 3 M, EDTA 5 mM, ainsi que de la thrombine humaine ou bovine (Calbiochem) à un rapport en poids de 1 : 25 à 1 : 50 de l'enzyme à la protéine variante de la TPO. On procède à la digestion à la température ambiante pendant 2-6 heures. On atteste la progression de la digestion par des gels SDS décrits cidessus pour la réaction de clivage par le facteur Xa. En général, on obtient à ce moment, un clivage de plus de 90% de la séquence de tête. On purifie la TPO résultante sur des colonnes en C4 à phase réverse comme décrit ci-dessus et elle s'avère posséder le fragment N-terminal désiré par séquençage des aminoacides.

On obtient seulement des quantités très minimes ( < 5%) d'un clivage interne à la même liaison arginine-thréonine comme observé ci-dessus avec le facteur Xa. La protéine de TPO résultante possède une activité biologique élevée avec des réponses semi-maximales dans le dosage par Ba/F3 à une teneur protéinique de 0, 2-0, 4 picomolaire. Dans l'ELISA basé sur le récepteur mpl, cette protéine possède une réponse semi-maximale à une concentration de protéine purifiée de 2-4 ng/ml (120-240 picomolaire), tandis que le variant intact contenant la séquence de tête manifeste une activité inférieure dans les deux dosages de l'ordre de 5-10 fois.

Pour des études sur des animaux, on dialyse la protéine clivée purifiée par HPLC dans des tampons physiologiquement acceptables avec NaCl 150 mM, Tween-80 (0, 01%) et succinate de sodium 10 mM, pH 5,5 ou acétate de sodium 10 mM, pH 5,5 ou phosphate de sodium 10 mM, pH 7,4. Par HPLC et à l'intervention de gels SDS, la protéine purifiée est stable pendant plusieurs semaines lorsqu'on l'entrepose à 4 C. Dans

des souris normales et myélodépressives, cette TPO purifiée contenant la séquence authentique N-terminale est très active, stimulant la production de plaquettes à des doses aussi faibles que 30 ng/souris.
EMI259.1

EXEMPLE 24 Ligand pour le mpl synthétique Bien que l'on prépare habituellement le ligand pour le mpl humain (hML) en utilisant des procédés recombinants, on peut également le synthétiser via ligation enzymatique de fragments peptidiques synthétiques en utilisant le procédé décrit ci-dessous. La production synthétique de hML permet l'incorporation d'aminoacides non naturels à fonctionnalité synthétique, tels que le polyéthylèneglycol.

Par le passé, on a construit un mutant de la sérine protéase subtilisine BPN, la subtiligase (S221C/P225A) pour procurer une ligation efficace d'esters peptidiques en solution aqueuse (Abrahmsen et collaborateurs, Biochem., 30 : 4151-4159 [1991]). Il s'est maintenant avéré que l'on peut procéder à la ligation de peptides synthétiques par voie enzymatique d'une manière séquentielle pour obtenir de longs peptides et de longues protéines actives du point de vue enzymatique, telles que la ribonucléase A (Jackson et collaborateurs, Science, [1994])

. Cette technologie décrite plus en détail ci-dessous a permis à la demanderesse de synthétiser par voie chimique de longues protéines que l'on ne pouvait par le passé préparer qu'avec la technologie de l'ADN recombinant.

On représente une stratégie générale pour la synthèse de hML153 utilisant la subtiligase (Schéma 1). En commençant avec un peptide complètement déprotégé correspondant au fragment C-terminal de la protéine, on ajoute conjointement avec la subtiligase un peptide d'ester à fragment N-terminal protégé et à fragment C-terminal activé. Lorsque la réaction

arrive à son terme, on isole le produit par HPLC à phase réverse et on élimine le groupe protecteur de la terminaison N. On ligature le fragment peptidique suivant, on le déprotège et on répète le procédé en utilisant des peptides successifs jusqu'à ce que l'on obtienne une protéine de longueur totale.

Le processus est similaire à la méthodologie en phase solide en ce qu'on ligature un peptide à fragment N-terminal protégé et à fragment C-terminal protégé à la terminaison N du peptide précédent et en ce qu'on synthétise une protéine dans la direction C-+N. Toutefois, étant donné que chaque couplage donne lieu à l'addition d'une quantité de résidus allant jusqu'à 50, et étant donné que l'on isole les produits après chaque ligation, on peut synthétiser, dans des rendements raisonnables, des protéines beaucoup plus longues à pureté élevée.

Schéma 1.

Stratégie pour la synthèse du hML en utilisant la aubtiligaae
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En se basant sur ses connaissances de la spécificité de la séquence de la subtiligase et de celle de la séquence d'aminoacides du domaine"EPO"biologiquement actif du hML, la demanderesse a divisé hML153 en sept fragments ayant une longueur de 18-25 résidus. On synthétise des tétrapeptides de ligation d'essai pour déterminer des jonctions de ligation appropriées pour les 18-25mères. Dans le tableau 13, on représente les résultats de ces ligations d'essai.

TABLEAU 13 Ligations d'essai de hML. On dissout des peptides donneurs
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et nucléophiles à 10 mM dans de la tricine (100 mM, pH 7, 8) à 22 C. On ajoute de la ligase pour obtenir une concentration finale de 10 lim à partir d'une matière de 1,6 mg/ml (-70 M) et on laisse la ligation s'effectuer pendant une nuit. Les rendements se basent sur le pourcentage de ligation par rapport à l'hydrolyse des peptides donneurs.
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Site <SEP> Donneur <SEP> (glc-K-NH2) <SEP> NH2 <SEP> nucléophile <SEP> Hydrolyse <SEP> (%) <SEP> Ligation <SEP> (%)
<tb> 1 <SEP> (23/24) <SEP> HVLH <SEP> SRLS <SEP> 92 <SEP> 08
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 89) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 90)
<tb> (22/23) <SEP> SHVL <SEP> HSRL <SEP> 48 <SEP> 52
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:91) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 92)
<tb> 2 <SEP> (46/47) <SEP> AVDF <SEP> SLGE <SEP> 22 <SEP> 78
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 93) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 94)
<tb> 3 <SEP> (69/70) <SEP> AVTL <SEP> LLEG <SEP> 53 <SEP> 47
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 95) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 96)
<tb> 4 <SEP> (89/90) <SEP> LSSL <SEP> LGQL <SEP> 95 <SEP> 05
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 97) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 98)
<tb> (88/89) <SEP> C(acm)LSS <SEP> LLGQ <SEP> 00 <SEP> 00
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:

<SEP> 99) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 100)
<tb> (90/91) <SEP> SSLL <SEP> GQLS <SEP> 45 <SEP> 55
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 101) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 102)
<tb> (88/89) <SEP> CLSS <SEP> LLGQ <SEP> 90 <SEP> 10
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 103) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 100)
<tb> 5 <SEP> (107/108) <SEP> LQSL <SEP> LGTQ <SEP> 99 <SEP> 01
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 104) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 105)
<tb> (106/107) <SEP> ALQS <SEP> LLGT <SEP> 70 <SEP> 30
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 106) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 107)
<tb> 6 <SEP> (128/129) <SEP> NAIF <SEP> LSFQ <SEP> 60 <SEP> 40
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 108) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:

En se basant sur ces expériences, les peptides de ligation indiqués dans le tableau 14 doivent être ligaturés de manière efficace par la subtiligase. On a besoin d'un groupe protecteur approprié pour la terminaison N de chaque peptide d'ester faisant office de donneur pour empêcher l'autoligation. La demanderesse a choisi un groupe protecteur isonicotinyle (iNOC) (Veber et collaborateurs, J.

Org. Chem., 42 : 3286-3289 [1977]) étant donné qu'il est soluble dans l'eau, qu'il peut être incorporé à la dernière étape de la synthèse peptidique en phase solide et qu'il est stable vis-à-vis du HF anhydre utilisé pour déprotéger et cliver les peptides par rapport à la résine en phase solide.

En outre, on peut l'éliminer du peptide après chaque ligation dans des conditions de réduction douces (Zn/CH3C02H) pour obtenir une terminaison N libre pour des ligations ultérieures. On utilise un ester de glycosylatelysyl-amide (glc-K-NH2) pour l'activation du fragment Cterminal basée sur des expériences antérieures qui indiquent une acylation efficace à l'intervention de la subtiligase (Abrahmsen, et collaborateurs, Biochem, 30 : 4151-4159 [1991]). Les peptides à activation glc-K-amide et protégés par iNOC peuvent être synthétisés en utilisant des procédés classiques en phase solide comme indiqué (Schéma 2). Les peptides sont alors ligaturés successivement jusqu'à ce qu'on obtienne la protéine complète, et le produit final est remis en plis in vitro.

En se basant sur l'homologie avec EPO, on pense que des paires de disulfures se forment entre les résidus de cystéine 7 et 151 et entre 28 et 85. L'oxydation des disulfures peut être réalisée en agitant simplement la matière réduite sous atmosphère d'oxygène pendant plusieurs heures. La matière remise en plis peut alors être purifiée par HPLC et des fractions contenant la protéine active peuvent être rassemblées et lyophilisées. En variante, on peut protéger de manière différentielle des disulfures pour commander l'oxydation séquentielle entre des

paires de disulfures spécifiques. La protection des cystéines 7 et 151 avec des groupes acétamidométhyle (acm) garantirait l'oxydation de 28 et de 85. On pourrait alors retirer les groupes acm et oxyder les résidus 7 et 151.

A l'inverse, on pourrait protéger les résidus 28 et 85 par acm et les oxyder au cas où une oxydation séquentielle est requise pour une remise en plis correcte. De manière facultative, les cystéines 28 et 85 peuvent être substituées par un autre résidu naturel ou non naturel différent de Cys pour garantir une oxydation appropriée des cystéines 7 et 151.

TABLEAU 14 Fragmenta peptidiques utilisés pour la synthèse totale du hML en utilisant la subtiligase Fragment
Séquence 1 (SEQ ID NO : 110) iNOC-HN-SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVL-glc-K-NH2 (1-22) 2 (SEQ ID NO : 111) iNOC-HN-HSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDF-glc-K-NH2 (23-46) 3 (SEQ ID NO : 112) iNOC-HN-SLGEWKTQMEETKAQDILGAVTL-glc-K-NH2 (47-69) 4 (SEQ ID NO : 113)
EMI264.1
iNOC-HN-LLEGVMAARGQLGPTCLSSLL-glc-K-NH2 (70-90) 5 (SEQ ID NO : 114) iNOC-HN-GQLSGQVRLLLGALQS-glc-K-NH2 (90-106)

6 (SEQ ID NO : 115) iNOC-HN-LLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIF-glc-K-NH2 (107-128) 7 (SEQ ID NO : 116)
EMI265.1
H2N-LSFQHLLRGKVRFLMLVGGSTLCVR-C02 (129-153).

On effectue une ligation peptidique à 250C dans tricine 100 mM, pH 8 (fraîchement préparée et dégazée par filtration sous vide à travers un filtre de 5 hum), Spécifiquement, on dissout le fragment C-terminal dans un tampon (peptide 2-5 mM) et on ajoute une solution de réserve 10x de subtiligase (1 g/ml de tricine 100 mM, pH 8) pour amener la concentration enzymatique finale à -5 m. On ajoute alors un excès 3-5 molaire du peptide donneur activé glc-K-NH2 sous forme solide, on le dissout et on laisse le mélange au repos
EMI265.2
à 25 C. On surveille les ligations par HPLC analytique en C18 à phase réverse (gradient de CH3CN/H20 avec TFA (0, 1%)). On purifie''les produits de ligation par HPLC préparative et on les lyophilise.

On effectue la déprotection par le groupe isonicotinyle (iNOC) en agitant de la poussière de zinc activée par HCl avec le peptide protégé dans de l'acide acétique. On élimine la poussière de zinc par filtration et on évapore sous vide l'acide acétique. On peut utiliser le peptide résultant directement dans la ligation ultérieure et répéter le processus. On peut ligaturer le hML153 synthétique par des procédés analogues à ceux décrits cidessus au hML154-332 synthétique ou recombinant pour obtenir un hML synthétique ou semi-synthétique de longueur totale.

Le hML synthétique possède un grand nombre d'avantages par rapport au recombinant. On peut introduire des chaînes latérales non naturelles dans le but d'améliorer l'activité ou la spécificité. On peut incorporer des fonctionnalités polymères telles que le polyéthylèneglycol pour améliorer la durée d'action. Par exemple, on peut fixer le

polyéthylèneglycol à des résidus de lysine des fragments individuels (tableau 14) avant ou après la mise en oeuvre d'une ou de plusieurs étapes de ligation. On peut éliminer ou modifier des liaisons peptidiques sensibles à la protéase pour améliorer la stabilité in vivo. En outre, on peut synthétiser des dérivés d'atomes lourds pour favoriser la détermination de la structure. schéma 2.

Synthèse en phase solide de fragments peptidiques pour la ligation des segments
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a) On mélange de la résine 1 de lysyl-para- méthylbenzhydrylamine (MBHA) (0,63 méq. /g, Advanced ChemTech. ) avec de l'acide bromacétique (5 éq. ) et du diisopropylcarbodiimide (5 éq. ) pendant 1 heure à 250C dans du diméthylacétamide (DMA) pour obtenir le dérivé bromacétylé 2. b) On lave convenablement la résine avec du DMA et on estérifie les aminoacides individuels protégés par un groupe BOC (3 éq., Bachem) en agitant avec du bicarbonate de sodium (6 éq. ) dans du diméthylformamide (DMF) pendant 24 heures à 500C pour obtenir la résine correspondante de glycolate-phénylalanyl-amide 3.

On lave la résine aminoacétylée 3 avec du DMF (3 fois) et du dichlorométhane (CH2C12) (3 fois) et on peut l'entreposer à la température ambiante pendant plusieurs mois. On charge alors la résine 3 dans un synthétiseur peptidique automatique (Applied Biosystems 430A) et on prolonge les peptides en utilisant des procédés classiques en phase solide (5). c) On élimine
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le groupe N-a-BOC avec une solution d'acide trifluoracétique (45%) dans CHCl-d) On préactive les aminoacides suivants (5 éq. ) protégés par le groupe BOC en utilisant l'hexafluorophosphate de benzotriazol-1-yl-oxy-tris- (diméthylamino) phosphonium (BOP, 4 éq. ) et de la N-méthylmorpholine (NMM, 10 éq. ) dans du DMA et on couple pendant 1- 2 heures.

e) On élimine le groupe N-a-BOC final (TFA/CH2C12) pour obtenir 4 et on introduit le groupe protecteur isonicotinyle (iNOC) comme décrit précédemment (4) via agitation avec du carbonate de 4-isonicotinyl-2,4- dinitrophényle (3 éq. ) et du NMM (6 éq. ) dans du DMA à 250C pendant 24 heures. f) Le clivage et la déprotection du peptide via un traitement avec du HF anhydre (anisol (5%)/éthylméthylsulfure (5%)) à OOC pendant 1 heure donnent le peptide 5 protégé par iNOC et activé par le glycolatelys-amide, que l'on purifie par HPLC en C18 à phase réverse (gradient de CH3/H20, TFA (0, 1%)). L'identité de tous les substrats est confirmée par spectrométrie de masse.

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HABILITATION SUPPLEMENTAIRE
L'invention telle que revendiquée est habilitée conformément à la spécification ci-dessus, ainsi qu'aux références et aux matières de départ aisément disponibles.

Néanmoins, la demanderesse a déposé à la American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC) les lignées cellulaires répertoriées ci-dessous : Escherichia coli, DH10B-pBSK-hmplI 1.8, numéro matricule du ATCC CRL 69575, déposée le 24 février 1994.

Le plasmide pSVI5. ID. LL. MLORF, numéro matricule du ATCC CRL déposé le décembre 1994, et les cellules CHO DP-12, ML 1/50 MCB (marquées &num;1594), numéro matricule au ATCC CRL 11770, déposées le 6 décembre 1994.

Ce dépôt a été réalisé conformément aux conditions du Traité de Budapest sur la Reconnaissance Internationale du Dépôt des Micro-organismes aux Fins de la Procédure en Matière de Brevet et aux règlements afférents (Traité de Budapest). Ainsi on garantit le maintien d'une culture viable pendant 30 ans à partir de la date de dépôt. Les organismes seront rendus disponibles par ATCC dans les termes du Traité de Budapest et soumis à un accord entre la demanderesse et ATCC, qui garantit une disponibilité illimitée après délivrance du brevet US pertinent. La disponibilité de la souche déposée ne doit pas être envisagée comme une licence pour la mise en oeuvre de l'invention en violation des droits accordés sous l'autorité de n'importe quel gouvernement en conformité avec ses lois de brevets.

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Bien que l'invention ait été nécessairement décrite conjointement avec des formes de réalisation préférées et des exemples de mise en oeuvre spécifiques, l'homme de métier ordinaire après lecture de la spécification ci-dessus sera à même de procéder à divers changements, à diverses substitutions ou à divers équivalents et à diverses altérations de la matière en question indiquée ci-avant sans se départir de son esprit et de son cadre. Par conséquent, l'invention peut être mise en oeuvre dans d'autres manières que celles décrites ici. En conséquence, l'intention est de limiter la protection octroyée en l'occurrence par le brevet, uniquement par les revendications annexées et par ses équivalents.

En l'occurrence, toutes les références citées dans le présent document sont incorporées expressément à titre de référence.

Claims

REVENDICATIONS 1. Polypeptide ligand pour le mpl (mpl ligand polypeptide) isolé essentiellement homogène.

2. Polypeptide ligand pour le mpl selon la revendication 1, choisi parmi le groupe constitué par : (a) un polypeptide fragment, (b) un polypeptide variant, et (c) un polypeptide chimère.

3. Polypeptide ligand pour le mpl selon la revendication 1, choisi parmi le groupe constitué par : (a) le polypeptide isolé à partir d'un mammifère, (b) le polypeptide obtenu par un moyen recombinant, et (c) le polypeptide obtenu par un moyen synthétique.

4. Polypeptide ligand pour le mpl selon la revendication 1, choisi parmi le groupe constitué par : (a) le polypeptide humain, et (b) le polypeptide non-immunogène chez un être humain.

5. Agoniste du mpl isolé essentiellement homogène, caractérisé en ce que : (a) l'agoniste stimule l'incorporation de nucléotides marqués (3H-thymidine) dans l'ADN de cellules Ba/F3 dépendantes de IL-3 transfectées avec le polypeptide mpl humain, ou (b) l'agoniste stimule l'incorporation 35S dans des plaquettes circulantes dans une détermination du rebond plaquettaire (platelet rebound assay). <Desc/Clms Page number 271> 6.

Polypeptide fragment selon la revendication 2, représenté par X-hTPO (7-151)-Y où hTPO (7-151) représente la séquence d'aminoacides humaine TPO (hML) de Cys7 à CysS inclusivement, X représente un groupe amino de Cys7 ou encore un ou des résidus d'aminoacides amino-terminaux choisis parmi le groupe M, MA, MPA, MPPA, (SEQ ID NO : 117) MAPPA, (SEQ ID NO : 118) MPAPPA, (SEQ ID NO : 119) MSPAPPA, (SEQ ID NO : 120) A, PA, PPA, APPA, (SEQ ID NO : 121) PAPPA, (SEQ ID NO : 122) SPAPPA, (SEQ ID NO : 123) Y représente le groupe carboxy-terminal de Cys151 ou encore un ou des résidus d'aminoacides carboxy-terminaux EMI271.1 choisis parmi le groupe comprenant V, VR, VRR, VRRA, (SEQ ID NO : 124), VRRAP, (SEQ ID NO : 125), VRRAPP, (SEQ ID NO : 126), VRRAPPT, (SEQ ID NO : 127), VRRAPPTT, (SEQ ID NO : 128), VRRAPPTTA, (SEQ ID NO :

129), <Desc/Clms Page number 272> VRRAPPTTAV, (SEQ ID NO : 130), VRRAPPTTAVP, (SEQ ID NO : 131), VRRAPPTTAVPS, (SEQ ID NO : 132), VRRAPPTTAVPSR, (SEQ ID NO : 133), VRRAPPTTAVPSRT, (SEQ ID NO : 134), VRRAPPTTAVPSRTS, (SEQ ID NO : 135), VRRAPPTTAVPSRTSL, (SEQ ID NO : 136), VRRAPPTTAVPSRTSLV, (SEQ ID NO : 137), VRRAPPTTAVPSRTSLVL, (SEQ ID NO : 138), VRRAPPTTAVPSRTSLVLT, (SEQ ID NO : 139), VRRAPPTTAVPSRTSLVLTL, (SEQ ID NO : 140), VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLN, (SEQ ID NO : 141), VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNE, (SEQ ID NO : 142), VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNEL, (SEQ ID NO : 143), VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNELP, (SEQ ID NO : 144), et des prolongements d'un ou de résidus d'aminoacides aminoterminaux comprenant un ou plusieurs des résidus 176-332 du ML humain comme indiqué en figure 1 (SEQ ID NO : 1).

7. Polypeptide fragment selon la revendication 6, choisi parmi le groupe TPO (1-153) et TPO (1-245).

8. Polypeptide fragment selon la revendication 2, dans lequel la séquence d'aminoacides du polypeptide fragment comprend SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVL, (SEQ ID NO : 110) HSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDF, (SEQ ID NO : 111) SLGEWKTQMEETKAQDILGAVTL, (SEQ ID NO : 112) LLEGVMAARGQLGPTCLSSLL, (SEQ ID NO : 113) <Desc/Clms Page number 273> GQLSGQVRLLLGALQS (SEQ ID NO : 114) LLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIF (SEQ ID NO : 115) LSFQHLLRGKVRFLMLVGGSTLCVR, (SEQ ID NO : 116) et des combinaisons de ces dernières.

9. Polypeptide selon la revendication 6, qui est non glycosylé.

10. Polypeptide isolé encodé par un acide nucléique possédant une séquence qui s'hybride dans des conditions modérément sévères à des molécules d'acides nucléiques possédant une séquence d'acides nucléiques présentée en figure 1 (SEQ ID NO : 2).

11. Polypeptide selon la revendication 10, qui est biologiquement actif.

12. Polypeptide selon la revendication 1 choisi parmi le groupe comprenant hML, hML153, hML (R153A, R154A), hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML et pML2.

13. Polypeptide selon la revendication 2, dans lequel la séquence d'aminoacides du polypeptide comprend les résidus d'aminoacides 1 à X selon la figure 1 (SEQ ID NO : 1), où X est choisi parmi le groupe comprenant 153,155, 164,174, 191,205, 207,217, 229,245 et 332.

14. Polypeptide ligand pour le mpl isolé essentiellement homogène partageant au moins 80% d'identité de séquence avec le polypeptide selon la revendication 13. <Desc/Clms Page number 274> 15 Polypeptide selon la revendication 13, dans lequel X représente 153.

16. Chimère comprenant le ligand pour le mpl selon la revendication 13, fusionné à un polypeptide hétérologue.

17. Chimère selon la revendication 16, dans lequel le polypeptide hétérologue est un polypeptide d'immunoglobuline.

18. Chimère selon la revendication 16, dans lequel le polypeptide hétérologue est un polypeptide d'interleukine.

19. Chimère comprenant les résidus N-terminaux 1 à environ 153 à 157 du hML, substitués par un ou plusieurs des résidus de l'EPO humaine, mais pas par tous, ajoutés ou mis comme substituants aux ou dans les résidus N-terminaux du hML à des positions correspondant à l'alignement représenté en figure 10.

20. Anticorps capable de se lier au polypeptide ligand pour le mpl selon la revendication 13.

21. Lignée cellulaire d'hybridome produisant l'anticorps selon la revendication 20.

22. Molécule isolée d'acide nucléique encodant le polypeptide ligand pour le mpl selon la revendication 1.

23. Molécule isolée d'acide nucléique encodant le polypeptide ligand pour le mpl selon la revendication 13.

24. Molécule isolée d'acide nucléique comprenant la séquence d'acides nucléiques à cadre de lecture ouvert représentée en figure 1 (SEQ ID NO : 2). <Desc/Clms Page number 275> 25. Molécule isolée d'acide nucléique selon la revendication 24, encodant un polypeptide ligand pour le mpl choisi parmi le groupe comprenant hML, hML153, hML (R153A, R154A), hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML et pML2.

26. Molécule isolée d'acide nucléique choisie parmi le groupe constitué par (a) un clone d'ADNc comprenant la séquence nucléotidique de la région codante du gène du ligand pour le mol ; (b) une séquence d'ADN capable de s'hybrider dans des conditions sévères à un clone de (a), et (c) un variant génétique de n'importe quelle séquence d'ADN de (a) et (b), qui encode un polypeptide possédant une propriété biologique d'un polypeptide ligand pour le mpl existant naturellement.

27. Molécule d'ADN isolée possédant une séquence capable de s'hybrider à une séquence d'ADN procurée en figure 1 (SEQ ID NO : 2) dans des conditions modérément sévères, dans laquelle la molécule d'ADN encode un polypeptide ligand pour le mpl biologiquement actif.

28. Molécule d'acide nucléique selon la revendication 25, comprenant en outre un promoteur lié de manière fonctionnelle à la molécule d'acide nucléique.

29. Vecteur d'expression comprenant la séquence d'acides nucléiques selon la revendication 25, liée de manière fonctionnelle à des séquences de contrôle reconnues par une cellule hôte transformée avec le vecteur.

30. Cellule hôte transformée avec le vecteur selon la revendication 29. <Desc/Clms Page number 276>

31. Procédé d'utilisation d'une molécule d'acide nucléique encodant le polypeptide ligand pour le mpl pour mettre en oeuvre la production du polypeptide ligand pour le mpl, comprenant la culture de la cellule hôte selon la revendication 30.

32. Procédé selon la revendication 31, dans lequel le polypeptide ligand pour le mpl est récupéré de la cellule hôte.

33. Procédé selon la revendication 31, dans lequel le polypeptide ligand pour le mpl est récupéré du milieu de culture de la cellule hôte.

34. Procédé pour déterminer la présence du polypeptide ligand pour le mpl, comprenant l'hybridation d'ADN encodant le polypeptide ligand pour le mpl à un acide nucléique d'échantillon pour essai ou analyse, et la détermination de la présence de l'ADN du polypeptide ligand pour le mpl.

35. Procédé pour amplifier un échantillon d'acide nucléique pour essai, comprenant le fait d'amorcer une réaction acide nucléique-polymérase avec un acide nucléique encodant un polypeptide ligand pour le mpl.

36. Composition comprenant le polypeptide ligand pour le mpl selon la revendication 1 et un support pharmaceutiquement acceptable.

37. Composition selon la revendication 36, comprenant en outre une quantité thérapeutiquement efficace d'un agent choisi parmi le groupe constitué par une cytokine, le facteur stimulant des colonies et l'interleukine. <Desc/Clms Page number 277> 38. Composition selon la revendication 37, dans laquelle l'agent est choisi parmi le groupe comprenant KL, LIF, GCSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 et IL-ll.

39. Utilisation d'une composition selon l'une quelconque des revendications 36 à 38 pour préparer des médicaments permettant le traitement de mammifères souffrant de thrombocytopénie ou présentant un risque pour une telle affection.