KR20040065249A - 트롬보포이에틴 - Google Patents

Abstract

본 발명에는 단리된 트롬보포이에틴(TPO), TPO를 암호화하는 단리된 DNA, 및 TPO를 제조 및 정제하는 재조합 또는 합성 방법이 게재되어 있다. 다양한 형태의 TPO가 혈액 세포, 특히 거핵구 및 거핵구 조상세포의 복제, 분화 또는 성숙에 영향을 미친다는 것이 밝혀져 있다. 따라서, 이러한 화합물들은 혈소판 감소증의 치료에 이용될 수 있다.

Description

트롬보포이에틴{THROMBOPOEITIN}

<발명의 분야>

본 발명은 조혈 세포, 특히 혈소판 조상 세포의 생존, 증식, 분화 또는 성숙에 영향을 미치는 단백질의 분리, 정제 및 재조합 또는 화학적 합성법에 관한 것이다. 본 발명은 구체적으로 시토킨 수용체 상과의 일원인, mpl에 결합하여 이를 활성화시킬 수 있는 단백질 리간드를 암호화하는 핵산의 클로닝 및 발현에 관한 것이다. 본 발명은 또한 혈소판 감소증을 포함한 면역 또는 조혈성 질환을 치료하는데 이 단백질 단독으로 또는 다른 시토킨과의 조합 하의 용도에 관한 것이다.

<발명의 배경>

1. 조혈계

조혈계는 모든 포유류의 생존에 필요한 것으로 알려진 성숙되고 고도로 전문화된 혈액 세포를 생산한다. 이들 성숙한 세포에는 산소 및 이산화탄소를 수송하는 역할을 하는 적혈구, 세포- 및 항체 매개 면역 반응에 관여하는 T- 및 B-임파구, 혈병 형성에 관여하는 혈소판 및 감염과 싸우는 식세포 및 보조 세포 기능을 하는 과립구 및 대식 세포가 있다. 과립구는 별도의 기능을 가지는 세포 유형인 호중구, 호산구, 호염기구 및 마스트세포로 세분된다. 이들 모든 분화된 성숙 혈액 세포들이 주로 골수 내에서 발견되는 다능성(또는 전능성) 간세포로 불리우는, 하나의 공통된 원시 세포형으로부터 유래한다는 점이 주목할 만하다[문헌(Dexter et al., Ann. Rev. Cell Biol.,3:423-441 [1987])].

성숙한 고도로 전문화된 혈액 세포는 포유류의 일생 내내 지속적으로 다량으로 생성된다. 이들 전문화된 혈액 세포들의 대다수는 수 시간 내지 수 주간 기능적으로 활성을 유지한다(Cronkite et al., Blood Cells, 2:263-284 [1976]). 따라서, 포유류의 정상 상태 혈액 세포 요구량을 유지하기 위해서는 원시 및 성숙한 세포 사이의 중간적 또는 계통적으로 연계된 조상 세포주 뿐만 아니라 성숙한 혈액세포, 원시 간세포 자체가 연속적으로 재생될 필요가 있다.

조혈계에서는 다능성 간세포가 그 핵심적 위치에 있다. 이들 세포는 숫적으로 비교적 적고, 증식에 의해 자가 재생하여 딸 간세포를 생성하거나 일련의 분화 단계에서 더욱 성숙된 계통 한정 조상 세포로 변화하여 최종적으로는 고도로 분화된 성숙된 혈액 세포를 형성한다.

예를 들어, 간세포로부터 유래하며, CFC-Mix로 불리우는 특정한 다능성 조상 세포는 증식(자가 재생) 및 발달 과정을 거쳐 각종의 골수 세포 즉 적혈구, 호중구, 거핵구(혈소판의 전구체), 대식세포, 호염기구, 호산구 및 마스트 세포를 함유하는 집락을 형성한다. 임파계의 기타 선구 세포는 증식되어 T- 및 B-세포로 발달된다.

또한, CFC-Mix 선구 세포와 골수 세포 사이에는 각각의 자손 세포로 이어지는일련의 단계의 중간적 조상 세포들이 존재한다. 이들 계통 한정 조상 세포는 그들이 생성하는 자손 세포를 기준으로 분류된다. 즉, 골수세포의 공지된 직접적 전구체는 적혈구에 있어서는 에리트로이트 형성 단위(CFU-E), 호중구 및 대식세포에 있어서는 과립구/대식 세포 집락 형성 세포(GM-CFC), 거핵구에 있어서는 거핵세포 집락 형성 세포(Meg-CFC), 호산구에 있어서는 호산구 집락 형성 세포 및 마스트 세포에 있어서는 호염기구 집락 형성 세포(Bas-CFC)이다. 다능성 간세포와 성숙한 혈액 세포 사이의 다른 중간 전구체 세포들은 공지되어 있거나(아래 참조) 또는 다양한 수준의 계통적 한정성 및 자가 재생능력을 가지는 것으로 밝혀질 수 있다.

정상 조혈 세포계에서는 다능성을 상실하고 계통 한정성 및 성숙도를 획득함에 따라 자가 재생능력이 감소되는 규칙성이 존재하는 것으로 보인다. 즉, 일련의 조혈 세포들의 한쪽 말단에는 자가 재생능 및 각종의 계통 특이 연계 선구 세포로의 분화능을 가지는 다능성 간세포가 존재한다. 이 능력은 원시 간세포가 전체적인 조혈계를 새로 형성하는 골수 이식 치료법의 근간이 된다. 이 일련의 조혈 세포들의 다른 말단에는 고도로 계통적으로 한정된 조상세포 및 자가 재생능력을 상실하였으나 성숙한 기능적 활성을 획득한 이들의 자손 세포가 존재한다.

간세포 및 계통 한정 조상 세포의 증식 및 발달은 다양한 조혈 성장 인자 즉 시토킨에 의해 면밀히 조절된다. 이들 성장 인자들의 생체내 역할은 복잡하며 완전이 밝혀지지는 않았다. 인터로이킨-3(IL-3)과 같은 일부 성장 인자들은 예를 들어, 거핵 세포를 포함하는, 수 개의 계통의 선구 세포들 뿐만 아니라 다능성 간세포들도 자극할 수 있다. 과립구/대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF)와 같은 다른 인자들은 처음에는 GM-CFC의 작용에만 제한된 것으로 생각되었다. 그러나, 후에, GM-CSF도 인터랄리아(interalia) 거핵세포의 증식 및 발달에 영향을 미친다는 사실이 발견되었다. 이로서, IL-3 및 GM-CSF는 효력 면에서는 상이하지만 서로 중복되는 생물학적 활성을 가지는 것으로 밝혀졌다. 좀더 최근에, 인터로이킨-6(IL-6) 및 인터로이킨-11(IL-11)이 단독으로는 거핵구 집락 형성에 명백한 영향을 미치지 않지만, IL-3와 상승적으로 작용하여 거핵구 성숙을 자극하는 한다는 것이 밝혀졌다(Yonemura et al., Exp. Hematol., 20: 1011-1016 [1992]).

이로서, 조혈 성장 인자는 하나 이상의 계통의 성장 및 분화에 영향을 미치며, 단일 조상 세포주에 영향을 미침에 있어서, 다른 성장 인자들과 중복되거나 이들과 상승적으로 작용할 수 있다.

또한 조혈 성장 인자는 전능 간세포로부터 다양한 계통 제한 조상 세포들을 경유한, 성숙된 혈액 세포로의 세포 발달의 상이한 단계들에서 이들의 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 에리트로포이에틴(epo)은 성숙한 에리트로이드 조상 세포만의 증식을 항진시키는 것으로 보인다. IL-3은 좀더 거슬러 올라가서 원시 간세포 및 중간 계통 제한 선구 세포에 영향을 준다. 간세포 인자(SCF)와 같은 기타 성장 인자는 원시 세포 발달에 더 많은 영향을 미칠 것이다.

전술한 내용으로부터 혈액 세포 또는 그의 전구체의 생존, 증식, 분화 또는 성숙에 영향을 미치는 신규 조혈 성장 인자는 질병 또는 방사능 치료 또는 화학 치료후에 유발되는 감퇴된 조혈계의 재생에 도움을 주는데 특히 유용할 것이다.

II. 거핵구 형성-혈소판 생성

거핵구 형성 및 혈소판 생산의 조절은 마주르[문헌: Exp. Hematol., 15:248 [1987]] 및 호프만[문헌: Blood, 74:1196-1212 [1989]]에 의해 연구되었다. 요컨대, 골수 다능성 간세포는 거핵구, 적혈구, 골수구 세포주로 분화된다. 간세포와 거핵구 사이에는 서로 연결된 단계의 거핵 선구 세포들이 존재하는 것으로 믿어진다. 3종 이상의 거핵 조상 세포, 즉 파열 형성 단위 거핵구(BFU-MK), 집락 형성 단위 거핵구(CFU-MK) 및 저밀도 거핵구 조상 세포(LD-CFU-MK)가 동정되었다. 거핵구 성숙 그 자체는 표준 형태 기준에 근거한 단계들로 구분된 발달 과정의 연속이다. 거핵구(MK. meg) 계의 인식가능한 초기 구성 일원 세포는 거대 적아구이다. 이들 세포는 치음에는 호염기성 세포질 및 느슨하고, 약간 망상인 염색질 및 수개의 인을 포함하는 약간 불규칙한 모양의 한개의 핵을 가지며, 세포 직경이 20 내지 30 um이다. 일정 시간 경과 후, 거핵구는 32 개까지의 핵(다배체)을 포함하지만 세포질은 성글고 미성숙한 채로 남아 있다. 성숙 과정이 진행되면서, 핵이 더욱더 소엽화하고 농축되며, 세포질은 양적으로 증가하고 더욱 호산성화 및 과립화된다. 이 계통의 가장 성숙한 세포에서는 세포 가장 자리에서 혈소판이 유리되는 광경을 관찰할 수 있다. 보통, 10% 미만의 거핵구가 적아 단계에 있으며 50% 이상이 성숙한다. 거핵구계에 통상 적용되는 형태학상 분류에 따르면 초기 형태의 거핵구, 중기 형태의 전거핵구 또는 호염기성 거핵구 및 말기 형태의 성숙한(호산성, 과립 또는 혈소판 생성) 거핵구로 나뉜다. 성숙한 거핵구는 시누소이드형 공간으로 세포질의 필라멘트를 방사하는데 여기서 이들이 떨어져 나가 분절되어 개개 혈소판을 형성한다.(Williams et al., Hematology, 1972).

거핵구 형성에는 수개의 조절 인자가 관련되어 있는 것으로 믿어진다(Williams et al., Br. J. Hematol., 52: 173 [1982] 및 Williams et al., J. Cell Physiol., 110:101[1982]). 거핵구 형성의 초기 단계는 CFU-MK로부터의 세포 증식 및 집락 개시과 관련된 유사 분열 분열성이나 이는 혈소판 수치에는 영향을 받지 않는 것으로 추측된다(Burstein et al., J. Cell Physiol., 109:333[1981] 및 Kimura et al., Exp. Hematol., 13:1048[1985]). 성숙의 후기 단계는 비 유사 분열성으로서, 핵 다배체화 및 세포질 성숙과 관련되어 있으며 아마도 말초 혈소판 수치에 의한 피드백 메카니즘으로 조절되는 것으로 보인다(Odell et al., Blood, 48:765[1976] 및 Ebbe et al. Blood, 32:787 [1968]).

별도의 특이적인 거핵구 집락 자극 인자(MK-CSF)의 존재 여부에 대해서는 논란이 일고 있다(Mazur, Exp. Hematol., 15:340-350 [1987]). 그러나 대부분의 권위자들은 혈소판 생산과 같은 생존에 있어서 중요한 과정은 이 과정에만 전적으로 관여하는 시토킨에 의해 조절될 것이라고 생각한다. 거핵구/혈소판 특이 시토킨이 존재할 것이라는 가설은 30 년 이상 동안 이를 발견하고자 하는 연구의 근거로서 작용하였지만 현재까지 그러한 시토킨은 정제되거나 서열 규명되거나, 분석에 의해 특이적인 MK-CSF(TPO)로서 확정되지 않았다.

실험적으로 고안된 혈소판 감소증(Hill et al., Exp. Hematol., 14 : 752[1986]) 및 [CM] 배지에서 조건화된 인간 배아 신장(McDonald et al., J. Lab. Clin. Med. 85:59[1975]), 재생불량성 빈혈 및 특발성 혈소판 감소증성 프르푸라(purpura) 추출물(Kawakita et al., Blood, 6:556[1983]) 및 혈장(Hoffman et al.,J. Clin, Invest., 75:1174[1985])으로부터 MK-CSF가 부분적으로 정제되었음이 보도되었지만, 이들의 생리적 기능은 대부분의 경우 아직까지 알려지지 않았다.

포크 위드(poke weed) 돌연변이형 활성화 비장 세포(PWM-SpCM) 및 뮤린(쥐과)(murine) 골수 세포주WEHl-3(WEHl-3CM)의 조건화된 배양물이 거핵구 강화인자(potentiators)로서 이용되었다. PWM-SpCM은 CFU-MK의 성장을 항진시키는 인자를 함유하며(Metcalf et al., Pro. Natl, Acad. Sci., USA, 72:1744-1748[1975]; Quesenberry et al., Blood, 65:214[1985]; 및 Iscove, N. N., in Hematopoietic Cell Differentiation, ICN-UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, Vol. 10, Golde et al., eds. [New York, Academy Press] pp 37-52[1978]), 이중하나는 다중계통 집락 자극 인자(multi-CSF)[Burstien, Blood Cells, 11:469[1989])인 인터로이킨-3(IL-3)이다. 이 배양물 중의 다른 인자는 아직 동정되거나 단리되지 않았다. WEHl-3은 비교적 다량의 IL-3 및 소량의 GM-CSF를 분비하는 뮤린 골수 세포주이다. IL-3은 다양한 조혈 세포들의 성장을 항진시키는 것으로 밝혀졌다(Ihle et al., J. Immumol., 13:282[1983]). IL-3은 또한 초기 다능성 전구체의 유도 및 다량의 혼합 조혈 집락 형성에 대해 에리트로포이에틴(EPO) 및 인터로이킨-1(IL-1)을 포함하여 많은 공지된 조혈계 호르몬 또는 성장 인자와 상승 작용을 일으키는 것으로 밝혀졌다(Bartelmez et al., Cell Physiol., 122:362-369 [1985] 및 Warren et al.,J. Cell, 46:667-674[1988]).

다른 거핵구 강화인자원은 쥐의 폐, 뼈, 거식세포주, 복강 삼출물 세포들 및 인간의 태아 신장세포의 조건화된 배지에서 발견되었다. 몇몇 반증적 데이타(Mazur, Exp. Hematol., 15:340-350[1987])에도 불구하고, 단핵 세포보다는 활성화된 T-임파구가 거핵구 형성에 고무적인 역할을 한다는 몇몇 증거(Geissler et al., Br. J. Hematol. 15:340-350 [1987])가 있다. 이러한 발견들은 인터로이킨과 같은 활성화된 T-임파구의 분비물이 MK 발달에서 조절 인자일 수 있다는 것을 암시한다(Geissler et al., Exp. Hematol. 15:845-853 [1987]). 정제된 에리트로포이에틴(EPO)을 이용한 거핵구 형성에 대한 많은 연구(Vainchenker et al., Blood, 54:940 [1979]); McLeod et al., Nature, 261:492-4 [1976] 및 Williams et al., Exp. Hematol. 12:734 [1984])가 이 호르몬이 MK 집락 형성에 고무적인 효과를 가진다는 것을 암시한다. 이는 또한 무혈청 및 혈청 함유 배양액 및 부세포의 부재하에서증명되기도 하였다(Williams et al., Exp. Hematol. 12:734 [1984]). EPO는 거핵구 발달의 4개 세포 단계에 관여하는 PWM-SpCM의 작용에 반해 거핵구 형성의 하나 및 2개 세포 단계에 더 많이 관여하는 것으로 추정되었다. 거핵구 발달의 초기 및 후기에서의 이 모든 인자들의 상호 작용은 좀더 규명될 여지가 남아 있다.

여러 실험실에서 작성된 데이타에서 개별적으로 MK 집락 자극 활성을 가지는 다중계통 인자가 GM-CSF 및 IL-3 및 효과는 적지만, B-세포 자극 인자인 IL-6라고 제안한다(Ikebuchi et al., Proc. Natl. Acae. Sci. USA, 84:9035 [1987]). 좀더 최근에는, 몇몇 권위자들이 IL-11 및 백혈병 억제 인자(LIF)가 IL-3과 상승 작용을 일으켜 거핵구 크기 및 염색체 배수를 증가시킨다고 보고하였다(Yonemura et al., British Journal of Hematology, 84:16-23 [1993]; Burstein et al., J. Cell Physiol., 153:305-312 [1992]; Metcalf et al., Blood, 76:50-56 [1990]; Metcalf et al., Blood, 77:2150-2153 [1991]; Bruno et al., Exp. Hematol., 19:378-381 [1991] 및 Yonemura et al., Exp. Hematol., 20:1011-1016 [1992]).

관련된 기타 문헌에는 (Eppstein et al., 미합중국 특허 제4.962,091; Chong et al., 동 제4.879,111; Fernardes et al., 동 제4.604,377; Wissler et al., 동 제4.512,971; Gottlieb et al., 동 제4.468,379; Bennet et al., 동 제5.215,895; Kogan et al., 동 제5.250,732; Kimura et al., Eur. J. Immunol., 20(9): 1927-1931[1990]; Secor et al., J of immunol., 144(4):1484-1489 [1990]; Warren et al., J of Immunol., 140(1):94-99 [1988]; Warren et al., Exp. Hematol., 17(11):1095-1099 [1989]; Bruno et al., Exp. Hematol., 17(10):1038-1043[1989]; Tanikawa et al., Exp. Hematol., 17(8):883-888 [1989]; Koike et al., Blood, 75(2):2286-2291[1990];Lotem et al., Blood, 75(5):1545-1551 [1989]; Rennick et al., Blood, 73(7):1828-1835 [1989]; 및 Clutterbuck et al., Blood, 73(6):1504-1512 [1989]).

III 혈소판 감소증

혈소판은 혈병 생성 메커니즘의 중요 요소이다. 순환 혈소판 농도의 감소, 즉 혈소판 감소증은 다양한 임상 상태 및 질환에서 발생한다. 혈소판 감소증은 보통 단위 리터 당 혈소판 수가 150×10⁹미만인 경우로 정의된다. 혈소판 감소증의 주요 원인은 대체로혈소판 수명을 기준으로 하였을때 3개의 범주로 나뉜다; 즉 (1)골수 의 혈소판 생산 기구의 손상, (2) 비장에서의 혈소판 격리(거비증) 또는 (3)말초 순환에서의 혈소판 파괴의 증가(예: 자가 면역성 혈소판 감소증 또는 화학적 및 방사능 치료). 또한, 대량의 저혈소판 함유 혈액제제를 급속히 투여받은 환자에게서 체내 희석으로 인해 혈소판 감소증이 발생할 수 있다.

혈소판 감소증의 임상적 출혈 현상은 혈소판 감소증의 심도(severity), 그 원인, 및 가능한 관련 응고 결함에 좌우된다. 일반적으로, 혈소판수가 단위 리터 당 20×10⁹내지 100×10⁹사이인 환자는 과도한 후손상 출혈의 위험이 있으며, 단위 리터 당 혈소판 수가 20×10⁹미만인 환자는 자연 발생적으로 출혈을 일으킬 수 있다. 후자의 경우의 환자들은 면역 및 바이러스 위험이 수반되기는 하지만 혈소판 수주의 대상이 된다. 혈소판 감소증의 심도에 관계없이, 그 원인이 혈소판 파괴의 증가가 아니라 그의 생성 감소라면 더욱더 악화될 수 있다. 전자의 경우, 혈소판 교체의 가속화로 인해 보다 덜 성숙되고, 더 크며 지혈 효과가 더 큰 혈소판이 순환하게 된다. 혈소판 감소증은 하기하는 다양한 질환으로부터 유발될 수 있다. 좀더 상세한 설명은 문헌[Schafner, A.I. "Thrombocytopenia and Disorders of Platlet Function", Internal Medicine, 3rd Ed., John J. Hutton et al., Eds., Little Brown and Co., Boston/Toronto/London[1990]에 기재되어 있다.

(a) 혈소판 생산 손상에 의한 혈소판 감소증

선천성 혈소판 감소증의 원인에는 체질적 재생 불량성 빈혈(판코니 증후군) 및 선천성 무거핵구 혈소판 감소증이 포함되는데, 이는 골격 형성 부진과 관련이 있을 수 있다. 혈소판 생산의 후천성 질환은 거핵구의 형성 부전 또는 비효율적인 혈소판 형성에 의해 유발된다. 거핵구 형성 부전은 골수 형성 부전(자연 발생형 또는 화학치료제 또는 방사능 치료에 의한 척수 억제 포함), 골수섬유증, 백혈병 및 전이성 종양 또는 육아종의 골수 침해를 포함하는 다양한 상태로부터 유발될 수 있다. 몇몇 경우, 톡신, 전염성 인자. 또는 약물이 비교적 선택적으로 혈소판 형성을 방해할 수 있다; 예를 들어, 알콜 및 몇몇 바이러스 감염에 의해 유발되는 일시적 혈소판 감소증 및 티아자이드 계 이뇨제의 투여와 관련된 가벼운 혈소판 감소증이 있다. 마지막으로, 거대적아구 과정(폴레이트 또는 B₁₂결핍증)에 수반되는 비효율적인 혈소판 형성도 또한 통상 빈혈 및 백혈구 감소증을 수반하면서, 혈소판 감소증을 유발할 수 있다.

혈소판 생산의 감소로 인한 혈소판 감소증의 현재의 치료법은 골수 부전과 관련된 원인의 동정 및 역전에 그 근거를 둔다. 동종 면역으로 인해 추가의 혈소판 수주로 이어지기 때문에 치료 불응이 일어날 수 있으므로 혈소판 수주는 보통 심한 출혈 합병증이나, 또는 외과 수술 도중의 혈액 공급을 위한 최후의 대안이다. 심한 혈소판 감소증으로부터 유발되는 점막 출혈은 항섬유용해제를 경구 또는 정맥내 투여하여 호전시킬 수 있다. 그러나, 항섬유용해제가 유사한 전염성 관내 응고(DIC) 환자에게 적용되었을 경우, 혈전성 합병증이 유발될 수 있다.

(b) 비장 격리로 인한 혈소판 감소증

임의의 원인으로 인한 거비증이 중등도의 혈소판 감소증과 관련될 수 있다. 아래에 거론되는 면역 매개 혈소판 감소증이 비장에 의한 혈소판의 능동적 파괴인 것에 반해, 이것은 주로 비장 혈소판 격리에 의한 것으로서 수동적 과정이다. 비기능항진증의 가장 통상의 원인이 알콜성 경변에 의한 문맥 고혈압으로 인한 울혈성 거비증이기는 하지만, 기타 형태의 울혈성, 침윤성, 또는 임파증식성 거비증도 또한 혈소판 감소증과 관련이 있다. 혈소판수는 비기능항진증 단독에 의해서는 일반적으로 단위 리터 당 50×10⁹미만으로 떨어지지 않는다.

(c) 비면역 매개 혈소판 파괴로 인한 혈소판 감소증

혈소판 감소증은 다양한 비면역 과정으로 인한 혈소판 파괴의 가속화로부터 유발될 수 있다. 이 유형의 질환에는 전염성 관내 응고, 보철 관내 장치, 혈액의 체외 순환 및 혈전성 트롬보사이틱 프르푸라와 같은 혈전성 모세혈관내층장애가 포함된다. 모든 이들 상황하에서, 인공적 표면 도는 비정상적 맥관 동맥 내막에 노출되는 순환 혈소판은 이 위치에서 소진되거나 손상된 후 세망 내피 조직계에 의해 미성숙 상태에서 제거된다. 전염성 관내 응고(DIC)가 유발될 수 있는 질병 상태 또는 질환은 문헌[Braunwald et al., (eds), Harrison's Principles of Internal Medicine, 11th Ed., p.1478, McGraw Hill[1987]에 상세히 기술되어 있다. 심장판막 및 대동맥내 풍선과 같은 심맥관내 보철 기구는 경도(mild) 내지 중도의(moderate) 파괴성 혈소판 감소증을 유발시킬 수 있으며 폐-심장 바이패스 또는 혈액 투석 치료중의 환자의 일시적인 혈소판 감소증은 체외순환계에서의 혈소판 소비 또는 손상으로부토 유발될 수 있다.

(d) 약물 유도성 면역성 혈소판 감소증

100 종 이상의 약물이 면역 매개 혈소판 감소증에 고려되었다. 그러나, 퀴니딘, 퀴닌, 금, 술폰아미드, 세팔로틴 및 헤파린만의 특성만이 잘 규명되어 있다. 약물 유도성 혈소판 감소증은 종종 심각한 경우도 있으며 통상 환자가 감작 치료를 받는 기간중 수일 이내에 갑자기 발생한다.

(e) 면역(자가 면역)성 혈소판 감소증성 푸르푸라(ITP)

성인에서의 ITP는 자가 면역성 혈소판 파괴가 그 특성인 만성 질병이다. 다른 면역 글로불린의 경우도 보고되었지만 자가 항체는 통상 IgG이다. ITP의 자가 항체가 혈소판 막 GPII_bIII_a에 결합한다는 것이 알려지기는 했지만 이 혈소판 항체의 특이성은 대부분의 경우 동정되지 않았다. 감작된 혈소판의 관외 파괴는 비장및 간의 세망내피조직계에서 일어난다. 모든 ITP의 반 이상이 자연 발생성이지만, 많은 ITP 환자가 류마티스 또는 자가 면역성 질환(예: 홍반성 낭창) 또는 임파구증식성 질환(예: 만성 임파구 백혈병)을 동시에 수반한다.

(f) HIV-유도성 ITP

ITP는 점점더 빈발하는 HIV 감염의 합병증이 되고 있으며[Morris et al., Ann. Intern, Med., 96:714-717[1982], 후천성 면역 결핍증으로 진단된 환자 , AIDS 관련 합병증으로 진단된 환자 및 AIDS 증상은 없으나 HIV에 감염된 것으로 진단된 환자에게서 이 질환 진행 과정 중의 어느 단계에서도 발생할 수 있다. HIV 감염은 궁극적으로 기회성 감염 및 악성 종양의 발생 및 세포 면역 기능의 심각한 결핍을 특징으로 하는 전염성 질병이다. HIV 감염으로 인한 일차적 면역상 비정상적 현상은 CD₄세포 표면 당단백을 발현시키는 T 임파구의 진행성 감퇴 및 기능적 손상이다[Lane et al., Ann. Rev. Immunol., 3:477[1985]). CD₄헬퍼/인듀서 T 세포 기능의 손실은 세포성 및 체액성 면역의 심각한 손실을 일으켜 AIDS의 특징인 기회성 감염 및 악성 종양을 유발하는 것으로 보인다(H. Lane supra).

HIV 관련 ITP의 메카니즘은 알려지지 않았지만, 비HIV 감염 관련 ITP의 메카미즘과는 다를 것으로 생각된다[Walsh et al., N. Eng. J.Med., 311:635-639[1984]; 및 Ratner Am. J. Med., 86:194-198[1989].

IV. 혈소판 감소증의 현재 치료법

혈소판 감소증 환자의 치료에 대한 접근법은 임상 상태의 심도 및 긴급성에의해 좌우된다. 이 치료법은 HIV 관련 및 비-HIV 관련 혈소판 감소증의 치료법과 유사하며, 많은 여러가지 치료 방법이 이용되었지만, 그 최선의 치료법에 대해서는 논란이 일고 있다.

혈소판 감소증으로 진단된 환자의 혈소판 수는 글루코코르티코이드(예: 프레드니솔론) 치료에 의해 성공적으로 증가하였지만, 대부분의 환자에 있어서, 그 반응이 불완전하거나, 글루코코르티코이드의 투여량이 감소하거나 그의 투여가 중지되면 병세가 회귀되었다. HIV 관련 ITP 환자에 대한 연구에 근거하여, 일부 학자들은 글루코코르티코이드 치료는 AIDS로의 소인을 유발할 수 있다고 제안하였다. 글루코코르티코이드는 통상 혈소판 수가 단위 리터당 20×10⁹미만으로 떨어질 때 또는 자연 발생적 출혈이 있을 때 투여된다.

글루코코르티코이드에 불응성인 환자의 경우에는, 화합물 4-(2-클로로페닐)-9-메틸-2-[3-(4-모르폴리닐-3-프로판논-1-일]6H-티에노[3,2,f][1,2,4]트리아졸[4,3,a][1,4]디아제핀(WEB 2086)을 이용하여 비HIV-관련 ITP의 심한 경우를 성공적으로 치료하였다. 혈소판 수치가 37000-58000/ul인 환자에게 WEB 2086를 투여하고, 투여 1 내지 2 주 후에 혈소판 수가 140000 내지 190000/ul로 증가하였다.(유럽 특허 361.077 및 Lohman et al., Lancet, 1147[1988]).

후천성 무거핵구성 혈소판 감소증 푸르푸라(AATP)의 최선의 치료법은 정해진바 없지만, 안티히모사이트 글로불린(ATG)(휴먼 티무스 조직에 대한 말의 항혈청)이 좀더 연장된 완전한 질병 차도를 보였다[Trimble et al., Am. J. Hematol.,37:126-127[1991]). 그러나, 최근의 보고에서는 ATG의 조혈 효과가 티메로살에 의한 것이며, 여기서 이 단백질(ATG)은 수은 캐리어로 작용한다고 주장하였다(Panella et al., Cancer Research, 50:4429-4435[1990]).

비장절제술의 경우 좋은 결과가 보고되었다. 비장 절제술에서는 많은 환자으로부터 혈소판 파괴의 주요 부위 및 자가 항체 생산의 주요원을 제거한다. 이 방법으로 다수의 환자가 장기간의 무치료 차도를 보였다. 그러나, 외과 수술적 방법은 일반적으로 면역 손상 환자에게는 기피되어야 하므로, 비장 절제술은 심한 혈소판 감소증 환자(예: 심한 HIV-관련 ITP), 글루코코르티코이드 치료후 2 내지 3 주 후에 반응을 보이지 못하거나 또는 글루코코르티코이드 투여 중지후 지속적 반응을 보이지 못한 환자에게만 추천된다. 현재의 과학적 지식에 근거할 때, 비장 절제술이 AIDS로의 소인을 제공하는 지의 여부는 불확실하다.

프레드니솔론 치료 및 비장 절제술 외에, 몇몇 세포독성제(예: 빈크리스틴 및 아지도티미딘(AZT, 지도부딘))도 또한 HIV 유도성 ITP 치료에 밝은 전망을 제공하나, 그 결과는 일시적이다.

상기 기술로부터 혈소판 감소증을 치료하기 위한 하나의 방법이 거핵구 또는 그의 전구 세포를 혈소판 형성 형태로 분화 및 성숙시키는 것을 가속화하는 물질을 얻는 것임을 알 수 있을 것이다. 통상 "트롬보포이에틴"(TPO)으로 불리는 이러한 물질을 동정하는데 이미 상당한 노력이 소요되었다. 문헌상에서 발견되는 TPO의 다른 명칭으로는 혈소판 형성 자극 인자(TSF), 거핵구 집락 자극 인자(MK-CSF), 거핵구 자극 인자 및 거핵구 강화인자가 있다. TPO 활성은 1959년에 관찰되었고(Rak et al., Med. Exp., 1:125) 이 물질의 특성을 규명하고 정제하려는 시도가 현재까지 계속되고 있다. TPO 활성 폴리펩티드의 부분적 정제에 대한 보고가 있었으나(예를 들어, Tayrien et al., J. Biol. Chem., 262:3262[1987] 및 Hoffman et al., J. Clin. Invest. 75:1174[1985] 참조]), 일각에서는 TPO 자체가 구체적인 존재가 아니라 이미 공지된 호르몬(IL-3)의 다기능의 발현으로 가정하였다[Sparrow et al., Prog. Clin. Biol. Res., 215:123[1985]). 그 형태나 기원에 관계없이, 혈소판 형성 활성을 가지는 분자는 상당한 치료적 가치를 지닌다. 어떤 단백질도 TPO로서 확실하게 동정되지는 않았지만, mpl(시토킨 수용체로 추정됨)이 혈소판 형성 신호를 발생시킨다는 최근의 발견에 많은 관심이 집중된다.

V. mpl은 거핵구 형성 시토킨 수용체이다

조혈 세포의 증식 및 성숙이 긍정적으로 또는 부정적으로 다능성 간세포의 증식 및 다계통 분화를 조절하는 인자들에 의해 엄격히 조절되고 있다고 믿어진다. 이들 효과는 세포의 단백질 인자가 특정 세포 표면 수용체에 높은 친화성으로 결합하는 것을 통해 매개된다. 이들 세포 표면 수용체들은 상당한 상동관계에 있어 일반적으로 시토킨 수용체 상과의 일원으로 분류된다. 이 상과에는 IL-2(β 및 γ 체인)(Hatakeyama et al., Science, 244:551-556[1989]; Takeshita et al., Science, 257:379-382[1991]), IL-3(Itoh et al., Science, 247:324-328[1990]; Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:5459-5463[1990]; Kimura et al., Cell, 66:1165-1174[1991a]; Kitamura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5082-5086[1991b]), IL-4(Mosely et al., Cell, 59:335-348[1989]), IL-5(Takaki et al., EMBO J., 9:4367-4374[1990];, Tavernier et al., Cell, 66:1175-1184[1991]), IL-6(Yamasaki et al., Science, 241:825-828[1988]; Hibi et al., Cell, 63:1149-1157[1990]), IL-7, (Goodwin et al, Cell, 60:941-951[1990]), IL-9(Renault et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5690-5694[1992]), 과립구-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF)(Gearing et al., EMBO J., 8:3667-3676[1991]; Hayashida et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 244:9655-9659[1990]), 및 과립구 집락 자극 인자(G-CSF)(Fukunaga et al., Cell, 61:341-350[1990a]; Fukunaga et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:8702-8706[1990b]; Larsen et al., J. Exp. Med., 172:1559-1570[1990]), EPO(D'Andrea et al., Cell, 57:277-285[1989]; Jones et al., Blood, 76:31-35 [1990]), 백혈구 억제 인자(LIF)(Gearing et al., EBMO.J.10:2839-2849[1991]); 온코스타틴 M(OSM)(Rose et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8641-8645[1991]의 수용체들 및 프로락틴의 수용체(Boutin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7744-7748[1988]; Edery et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:2112-2116[1989], 성장 호르몬(GH)(Leung et al., Nature, 330:537-543[1987] 및 섬모성 뉴트로트로픽 인자(CNTF)(Davis et al., Science, 253:59-63[1991]가 포함된다.

시토킨 수용체 상과의 일원들은 세개의 기능적 범주로 분류될 수 있다(상세한 사항은 문헌[Nicola et al., Cell, 67:1-4[1991]] 참조). 첫번째 부류는 에리트로포이에틴 수용체(EPO-R) 또는 과립구 집락 자극 수용체(G-CSF-R)과 같은 단일 체인 수용체들로 구성되어 있으며, 이들은 세포외 도메인(domain)을 통해 높은 친화성으로 리간드와 결합하며 또한 세포내 신호를 발생시킨다. α-서브유니트로 불리우는 두번째 부류의 수용체에는 인터로이킨-6 수용체(IL6-R), 과립구-대식세포 집락 자극 인자 수용체(GM-CSF-R), 인터로이킨-3 수용체 (IL3-Rα) 및 시토킨 수용체 상과의 다른 일원들이 포함된다. 이들 α-서브유니트는 낮은 친화성으로 리간드에 결합하기는 하지만 세포내 신호를 전달할 수 없다. 신호 전달이 가능한 높은 친화성의 수용체는 α-서브유니트와 β-서브유니트라고 불리우는 세번째 부류의 수용체(예: IL3-Rα 및 GM-CSF-R에 있어서 3개의 α-서브유니트에게 공통적인 β-서브유니트인 βc)와의 헤테로다이머에 의해 형성된다.

mpl이 시토킨 수용체 상과의 일원이라는 증거는 서열 상동 관계(Gearing, EMBO J., 8:3667-3676[1988]; Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6834-6938[1990]; Davis et al., Science, 253:59-63[1991] 및 Vigon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5640-5644[1992] 및 증식 신호를 전달할 수 있는 그의 능력이다.

쥐의 c-mpl의 분자 클로닝으로부터 연역된 단백질 서열은 이 단백질이 다른 시토킨 수용체와 상동임을 나타낸다. 세포외 도메인은 465 개 아미노산 잔기로 구성되어 있고 각각 N-말단 서브도메인과 C-말단 서브도메인에 4 개의 고도로 보존된 시스테인 및 1개의 특별한 모티프를 가지는 2 개의 서브도메인으로 구성되어 있다. 리간드에 결합하는 세포외 도메인은 유사한 이중 β-베럴 폴드(Barrel fold) 구조형태를 가지는 것으로 예상된다. 이 2중화된 세포외 도메인은 LIF의 저친화성 결합 도메인뿐만 아니라 IL-3, IL-5 및 GM-CSF 수용체에 공통으로 존재하는 신호 전달 체인과 고도로 상동성이다(Vigon et al., Oncogene, 8:2607-2615[1993]). 따라서, mpl은 시토킨 수용체의 저친화성 리간드 결합 부류에 속할 수 있다.

쥐의 mpl 및 성숙한 인간의 mpl P을 비교해보면, 이 두 단백질 서열의 81%가 동일하다는 것을 알 수 있다. 좀더 구체적으로는, N-말단 및 C-말단 세포외 서브도메인의 서열은 각각 75% 및 80%가 동일하다. 가장 잘 보존되는 mpl 영역은 91%의 서열 동일성을 보이는 세포질 영역이고, 막관통 도메인의 37개 잔기의 서열이 두 종에서 동일하였다. 따라서, mpl은 시토킨 수용체 상과의 가장 잘 보존되는 일원의 하나로 보고된다(Vigon supra).

mpl이 증식 신호를 전달할 수 있는 기능성 수용체라는 증거는 공지된 시토킨에 대해 높은 친화성을 가지는 시토킨 수용체의 세포외 도메인과 mpl 세포질 도메인을 포함하는 키메릭 수용체를 제조하여 도출한다. mpl의 어떤 알려진 리간드도 보고되지 않았으므로, IL-4R 또는 G-CSFR과 같은 제1부류 시토킨 수용체로부터 키메릭 고친화성 리간드 결합 세포외 도메인을 제조할 필요가 있었다. Vigon 등은 G-CSFR의 세포외 도메인을 c-mpl의 막관통 및 세포질 도메인과 융합시켰다. IL-3 의존성 세포주인, BAF/B03(Ba/F3)를 이 G-CSFR/mpl 키메라(chimera)로 감염시키고 전길이의 G-CSFR 대조구를 따로 마련하였다. 상기 키메라로 감염된 세포는 IL-3 또는 G-CSFR의 존재하에서 동일하게 잘 성장하였다. 마찬가지로, G-CSFR로 감염된 세포들도 IL-3 또는 G-CSF 내에서 잘 성장하였다. 모든 세포들은 성장 인자 부재하에서는 사멸하였다. 유사한 실험을 Skoda등이 수행하였다[문헌: EMBO J., 12(7):2645-2653[1993], 여기서는 인간 IL-4 수용체(hIL-4-R)의 세포외 및 막관통도메인을 쥐의 mpl 세포질 도메인과 융합시키고 쥐의 IL-3 의존 Ba/F3 세포주에 감염시켰다. 자연형 hIL-4 R로 감염된 Ba/F3 세포들은 종 특이적인 IL-4 및 IL-3의 존재하에서 정상적으로 증식하였다. hIL-4R/mpl로 감염된 Ba/F3 세포주들은 hIL-4(IL-3위 존재 및 부재하에)의 존재하에서 정상적으로 성장하여 Ba/F3 세포에 mpl세포질 도메인은 증식 신호를 전달하는데 필요한 모든 요소를 갖추고 있다는 것을 보여준다.

이들 키메릭 실험들은 mpl 세포질 도메인의 증식 신호 발생 능력을 보여주나 mpl 세포외 도메인이 리간드에 결합하는지에 대해서는 알려주는 바가 없다. 이들 결과는 적어도 2가지의 가능성, 즉 mpl이 EPO-R 또는 G-CSFR과 같은 단일 체인(제1부류) 수용체이거나, 또는 IL-3과 같이 α-서브유니트를 필요로 하는 신호 전달가능한 β-서브유니트(제3부류)일 수 있다는 점과 일치한다(Skoda et al. supra).

VI. Mpl 리간드는 트롬보포이에틴(TPO)의 일종이다

상술한 바와 같이, 혈청은 거핵구의 성장 및 성숙을 항진시키는 다양한 기타 시토킨과 상승적으로 작용하며 트롬보포이에틴(TPO)으로 불리우는, 독특한 인자를 함유한다는 것이 주장되었다. 수많은 연구자들이 상당한 노력을 기울였음에도 불구하고 이러한 자연형 인자의 어느것도 혈청으로부터 분리되지 않았다. mpl이 직접 거핵구 자극 인자와 결합하는지에 대해서는 알려져 있지 않지만, 최근의 실험에 의해 mpl이 재생불량성 골수를 가진 환자의 혈청내에서 발견되는 하나의 인자 또는 여러 인자들로부터 증식 신호 전달에 관여한다는 것이 밝혀졌다(Methia et al., Blood, 82(5):1395-1401[1993]).

IL-1α, IL-3, IL-4, IL-6, IL-11, SCF, EPO, G-CSF 및 GM-CSF와는 구별되는 독특한 혈청 집락 형성 인자가 mpl을 통해 증식 신호를 전달한다는 증거는 원시 조혈 세포 및 그와 연계된 조혈 세포주 내에서의 c-mpl 발현의 분포 검사 및 이들 세포주 내에서의 mpl 항감작 연구로부터 도출된다.

면역 정제 인간 조혈 세포 내에서 역전사효소 (RT)-PCR을 이용하여, Methia등은 강력한 mpl mRNA 정보는 CD34⁺정제 세포, 거핵구 및 혈소판에서만 발견된다는 것을 밝혔다. 골수(BM)로부터 정제된 CD34⁺세포는 전체 BM 세포들의 약 1%를 차지하고 전체 계통(예: 에리트로이드, 과립대식세포 및 거핵세포)의 원시 조상 세포 및 그에 연계되는 조상세포들 내에서 양적으로 증가된다.

mpl 항감작 올리고데옥시뉴클레오티드는 재생불량성 골수(풍부한 거핵구 집락 자극 활성원[MK-CSF])를 가지는 환자의 혈청에서 배양된 다능성 CD34⁺세포에서 거핵구 집락 형성을 억제하는 것으로 관찰되었다. 이들 동일한 항감작 올리고데옥시뉴클레오티드는 에리트로이드 또는 과립대식세포 집락 형성에는 영향을 미치지 않았다.

mpl이 직접 리간드와 결합하며 거핵구 형성을 유발하는 혈청 인자가 mpl을 통해 작용하는지에 대해서는 아직 알려지지 않았다. 그러나, mpl이 리간드에 직접 결합한다면, 그의 아미노산 서열이 매우 잘 보존될 것이며 인간과 쥐의 mpl 세포외 도메인이 상당한 서열 동일성을 보여, 종간 반응성이 있을 것이라는 점이 제안되었다(Vigon at al, supra[1993]).

VII. 목적

상술한 바로부터, 혈소판 감소증의 치료적 용도를 위해 조혈세포 특히 거핵구 또는 그의 선구 세포의 증식, 분화 및 성숙을 자극할 수 있는 분자를 단리하고 동정할 필요성이 당업계에 현재하며 앞으로도 계속될 것이라는 것을 알 수 있을 것이다. 이러한 분자가 mpl 리간드이며 이러한 리간드(들)의 성장 및 분화에 있어서의 기능의 평가를 위해 이들을 분리할 필요성 추가로 존재한다고 생각된다.

따라서, 거핵구가 성숙한 혈소판 생산 형태로 증식, 분화 및(또는) 성숙하도록 자극할 수 있는 제약학적으로 순수한 분자를 얻는 것이 본 발명의 목적이다.

조혈계 질환, 특히 혈소판 감소증의 치료적 용도에 적합한 형태의 분자를 제공하는 것이 본 발명의 또다른 목적이다.

mpl로 알려진 시토킨 상과 수용체에 생체내에서 결합하여 증식 신호를 전달할 수 있는 단백질 리간드를 단리, 정제 및 구체적으로 동정하는 것이 본 발명의 추가의 목적이다.

이러한 단백질 리간드를 암호화하는 핵산 분자를 제공하고, 진단 및 치료 용도를 위해 이들 핵산 분자를 이용하여 재조합 세포 배양물에서 mpl 결합 리간드를 생산하는 것이 본 발명의 또다른 목적이다.

아미노산 서열 변형, 변형 당단백 형태 및 그의 공유 유도체를 포함하는 단백질 리간드의 유도체 및 개질된 형태를 제공하는 것이 본 발명의 또다른 목적이다.

mpl 리간드와 상이한 단백질 및 그의 공유 유도체를 결합시켜 융합 폴리펩티드 형태를 제공하는 것이 본 발명의 또다른 목적이다.

mpl 리간드를 EPO로부터의 아미노산 첨가체 및 치환체와 결합시켜 혈소판 및 적혈구 세포 조상세포의 증식 및 성장을 조절할 수 있는 단백질을 생산할 수 있는 변형 폴리펩티드 형태를 제공하는 것이 본 발명의 추가의 목적이다.

mpl 리간드에 결합할 수 있는 항체를 얻는 것뿐만 아니라, mpl 리간드 또는 그의 융합 형태에 대한 항체를 제공하는 이뮤노겐(immunogen)을 제조하는 것이 본 발명의 또다른 목적이다.

본 발명의 상기 및 기타 목적들은 본 명세서를 전체적으로 숙지한 당업계의 숙련가에게는 자명한 사항일 것이다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 거핵구를 성숙한 혈소판 생산 형태로 증식, 성숙 및(또는) 분화하도록 자극할 수 있는 "mpl 리간드"(ML) 또는 "트롬보포이에틴"(TPO)로 불리우는, 단리된 포유류의 거핵구 형성성 증식 및 성숙 항진 단백질을 제공함으로써 달성된다.

이 실질적으로 균질한 단백질은 (1) 정제될 mpl 리간드 분자가 선택적으로 고정화 수용체 폴리펩티드에 흡착하도록 하는 조건하에서, 정제될 mpl 리간드 분자를 함유하는 혈장 소스(source)를 고정화 수용체 폴리펩티드, 특히 지지체에 고정된 mpl 또는 mpl 융합 폴리펩티드와 접촉시키고, (2) 고정화 수용체 폴리펩티드 및 그의 지지체를 세척하여 흡착하지 않은 물질을 제거하고, (3) 용출제 완충액을 이용하여 mpl 리간드 수용체가 흡착한 고정화 수용체 폴리펩티드로부터 mpl 리간드 물질을 용출시키는 단계로 구성되는 방법으로 천연 소스로부터 정제할 수 있다. 바람직하게는 이 천연 소스는 mpl 리간드를 함유하는 포유류 혈장 또는 뇨이다. 임의로 포유류는 재생불량성이고 고정화 수용체는 mpl-IgG 융합체이다.

임의로, 바람직한 거핵구 형성 증식 및 성숙 항진 단백질은 합성 또는 재조합 방법에 의해 제조된 단리된 실질적으로 균질한 mpl 리간드 폴리펩티드이다.

본 발명의 "mpl 리간드" 폴리펩티드 또는 "TPO"는 고도로 정제된 실질적으로 균질한 돼지(porcine) mpl 리간드 폴리펩티드와 70% 이상의 서열 동일성을 가지며 돼지 mpl 리간드 폴리펩티드의 "EPO-도메인"과 80% 이상의 서열 동일성을 가진다. 임의로, 본 발명의 mpl 리간드는 도1(SEQ ID NO:1)에 제공된 성숙한 아미노산 서열을 가지는, 성숙한 인간의 mpl 리간드(hML) 또는 변형체 또는 그의 후전사적으로 개질된 형태 또는 성숙한 인간 mpl 리간드와 약 80%의 서열 동일성을 가지는 단백질이다. 임의로 mpl 리간드 변형체는 인간 mpl 리간드(hML)의 절편으로서, 특히 아미노 말단 또는 "EPO-도메인" 절편이다. 바람직하게는, 아미노 말단 절편은 첫번째와 네번째 시스테인 잔기 사이의 실질적으로 모든 인간 ML 서열을 가지나 그 이외의 영역에서는 상당한 첨가기, 탈락기 또는 치환기를 포함할 수 있다. 이 실시 태양에 따르면, 절편 폴리펩티드는 하기 일반식으로 나타낼 수 있다:

X-hML(7-151)-Y

여기서 hML(7-151)은 Cys⁷과 Cys¹⁵¹사이(Cys¹⁵¹포함)의 인간 TPO(hML) 아미노 서열을 나타내고; X는 Cys⁷의 아미노기, 또는 성숙한 hML의 하나 이상의 아미노 말단 아미노산 잔기또는 Met, Tyr 또는 예를 들어, 단백질 절단 부위(예: 인자 Xa 또는 트롬빈)를 포함하는 리더 서열과 같은 그의 아미노산 잔기의 연장기를 나타내며; Y는 Cys¹⁵¹의 카르복시 말단기 또는 성숙한 hML의 하나 이상의 카르복시 말단 아미노 잔기이거나 그의 연장기를 나타낸다.

임의로 mpl 리간드 폴리펩티드 또는 그의 절편은 이형성 폴리펩티드에 융합될 수 있다(키메라). 바람직한 이형성 폴리펩티드는 시토킨, 집락 자극 인자 또는 인터로이킨 또는 그의 절편, 특히 키트 리간드(KL), IL-1, IL-3, IL-6, IL-11, EPO, GM-CSF, 또는 LIF이다. 임의의 바람직한 비상동 폴리펩티드는 특히 IgG 헤비 체인의 불변의 도메인을 포함하는 면역글로불린 체인, 특히 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgD, IgM 또는 그의 절편이다.

본 발명의 또다른 면에서는 생물학적으로 활성이고, 바람직하게는 표지된 뉴클레오티드(예:³H-티미딘)을 인간 mpl로 감염시킨 IL-3 의존 Ba/F3 세포의 DNA에 혼입시키는 것을 자극할 수 있는 분리된 mpl 아고니스트를 포함하는 조성물을 제공한다. 임의로 mpl 아고니스트는 생물학적으로 활성인 mpl 리간드이고 바람직하게는 마우스 혈소판 반사 분석에서 순환 혈소판으로의³⁵S의 혼입을 자극할 수 있다. 적당한 mpl 아고니스트에는 hML₁₅₃, hML(R153A, R154A), hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML 및 pML2 또는 그의 절편이 포함된다.

또다른 실시 태양에서, 본 발명은 mpl 리간드와 결합할 수 있는 단리된 항체를 제공한다. mpl 리간드에 결합할 수 있는 단리된 항체는 임의로 다른 폴리펩티드와 융합시킬 수 있으며 이 항체 또는 그의 융합체는 고정화 mpl를 얻기 위해 상기 방법대로 소스로부터 mpl 리간드를 분리 또는 정제하는데 이용할 수 있다. 이 실시 태양의 또다른 측면에서, 본 발명은 mpl 리간드를 함유하는 것으로 의심되는 샘플, 특히 혈청 샘플과 상기 항체를 접촉시켜 결합이 발생하면 그를 검출하는 단계로 구성되는 시험관내 또는 생체내 mpl 리간드 검출 방법을 제공한다.

또다른 실시 태양에서, 본 발명은 mpl 리간드 또는 그의 절편을 암호화하는 단리된 핵산을 제공하며, 이 핵산은 임의로 검출가능한 기로 표지될 수 있으며, mpl 리간드를 암호화하는 서열을 가지는 핵산 분자와 상보적 관계에 있거나 또는 중간 내지 고도로 가혹(stringent) 조건 하에서 혼성화하는 핵산 분자일 수 있다. 바람직한 핵산 분자는 인간, 돼지 및 쥐의 mpl 리간드를 암호화하는 핵산이며 RNA 및 DNA, 게놈 및 cDNA를 포함한다. 이 실시 태양의 또다른 면에서 핵산 분자는 mpl 리간드를 암호화하는 DNA이고, 추가로 DNA가 감염된 숙주에 의해 인식되는 조절 서열에 기능 가능하게 결합되는 DNA를 가지는 복제 가능한 벡터를 포함할 수 있다. 임의로 DNA는 도1 5'-3'(SEQ ID NO:2), 3'-5'에 제공된 서열을 가지는 cDNA이거나 또는 그의 절편이다. 본 발명의 이 측면은 벡터로 감염된 숙주세포, 바람직하게는 CHO 세포 및 mpl 리간드를 제조하기 위해 DNA를 이용하는, 바람직하게는 mpl 리간드를 암호화하는 cDNA를 감염된 세포의 배지에서 발현시키고 이 숙주세포 또는 그의 숙주 배양물에서 mpl 리간드를 회수하는 것으로 이루어지는 방법이 포함된다.

본 발명은 또한 치료학적으로 유효한 양의 mpl 리간드를 포유류에 투여하는 것으로 이루어진, 조혈계 질환, 특히 혈소판 감소증을 가지는 포유류을 치료하는 방법을 포함한다. 임의로 mpl 리간드는 시토킨, 특히 집락 자극 인자 또는 인터로이킨과 병용하여 투여한다. 바람직한 집락 자극 인자 또는 인터로이킨에는 키트 리간드(KL), LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-3, IL-6 및 IL-11이 포함된다.

본 발명은 또한

(1) TPO 함유 세포를 파괴 또는 용해시키고,

(2) 임의로 가용성 물질을 TPO를 포함하는 불용성 물질로부터 분리하고,

(3) 가용화 완충액으로 불용성 물질 중의 TPO를 용해시키고

(4) 용해된 TPO를 다른 가용성 및 불용성 물질로부터 단리하고,

(5) 산화환원 완충액에서 TPO를 리폴딩시키고,

(6) 적당히 폴딩된 TPO를 잘못 폴딩된 TPO로부터 분리하는 단계로 이루어진, TPO 생산 미생물로부터의 TPO 단리 및 정제 방법을 제공한다.

상기 방법은 구아니딘 염, 소듐 티오시아네이트 또는 우레아로부터 선택되는 차오트로픽 물질로 TPO를 함유하는 불용성 물질을 가용화하는데 이용되는 차오트로픽 물질을 제공한다. 이 방법은 가용화된 TPO가 원심 분리, 겔 여과 및 역상 크로마토그레피로부터 선택되는 하나 이상의 단계에 의해 다른 가용성 물질 및 불용성 물질로부터 분리되는 방법을 추가로 제공한다. 이 방법의 리폴딩 단계는 산화 및환원제를 둘다 함유하는 산화환원 완충액울 제공한다. 일반적으로 산화제는 산소 또는 하나 이상의 이황화 결합을 가지는 화합물이고 환원제는 하나 이상의 유리 술프히드릴을 가지는 화합물이다. 바람직하게는 산화제는 산화된 글루타치온(GSSG) 및 시스틴으로부터 선택되고 환원제는 환원된 글루타치온(GSH) 및 시스테인으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는 산화제는 산화된 글루타치온(GSSG)이고 환원제는 환원된 글루타치온(GSH)이다. 또한 산화제의 몰비가 환원제의 몰비와 같거나 또는 더 큰 것이 바람직하다. 산화환원 완충액은 추가로 바람직하게는 CHAPS 및 CHAPSO로부터 선택되며 1% 이상의 농도로 존재하는 표백제를 함유한다. 산화환원 완충액은 추가로 NaCl을 바람직하게는 약 0.1 내지 0.5 M의 농도 범위로, 글리세롤을 바람직하게는, 15% 초과의 농도로 함유한다. 산화환원 완충액의 pH는 바람직하게는 약 pH 7.5-pH 9.0 범위이며 리폴딩 단계는 12 내지 48 시간 동안 4 도에서 수행한다. 리폴딩 단계는 이황화 결합이 EPO 도메인의 아미노 말단에 가장 인접한 Cys와 카르복시 말단에 가장 인접한 Cys와의 사이에 형성되는 생물학적으로 활성인 TPO를 생산한다.

본 발명은 또한

(1) 적어도 미생물의 세포외막을 용해시키고,

(2) TPO를 함유하는 용해물을 차오트로픽 물질로 처리하고,

(3) TPO를 리폴딩하고,

(4) 불순물 및 잘못 폴딩된 TPO를 적당히 폴딩된 TPO로부터 분리하는 단계로 구성되는, 미생물로부터 생물학적으로 활성인 TPO를 정제하는 방법을 포함한다.

도1은 인간 mpl 리간드(hML) cDNA의 연역된 아미노산 서열(SEQ ID NO:1) 및 암호화 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:2)을 보여준다. 뉴클레오티드는 각 행의 처음에서부터 번호를 매겼다. 5' 및 3' 미번역 영역은 소문자로 나타낸다. 아미노산 잔기는 성숙한 mpl 리간드 단백질 서열의 아미노산 잔기는 성숙한 mpl 리간드(ML)의 단백질 서열의 Ser1에서 시작하여 서열 위에 그수치를 표기하였다. 추정되는 엑손 3의 경계는 화살표로 나타내었으며 잠재적인 N-글리코실레이션 위치는 사각형 테두리를 하였다. 시스테인 잔기는 서열 위에 점으로 표시하였다. 밑줄친 서열은 돼진 혈장으로부터 정제된 mpl 리간드로부터 결정된 N-말단 서열에 해당한다.

도2는 mpl 리간드³H-티미딘 혼입 분석을 위한 실험 방법을 보여준다. 다양한 소스내의 mpl 리간드 존재여부 결정을 위해, mpl P Ba/F3 세포를 24시간 동안 습화된 배양기 내에서 5% CO₂및 공기 중에서 IL-3을 기아시켰다(Starvation). IL-3 기아후, 세포를 희석된 샘플 존재 또는 희석 샘플 부재 96 웰 배양 디쉬에 접종하고 24 시간 동안 세포 배양기 내에서 배양하였다. 마지막 6 내지 8 시간 동안에 1 uCi의³H-티미딘을 함유하는 무혈청 RPMI 배지 20ul을 각 웰에 가하였다. 이어서세포를 96 웰 필터 플레이트에 회수하고 물로 세척하였다. 필터에서 방사선치를 측정하였다.

도3은 프로나제, DTT 및 열의 APP의 Ba/F3 mpl 세포 증식 자극 능력에 대한 영향을 보여준다. APP를 프로나제를 이용하여 절단하기 위해, 프로나제(뵈링거 만하임) 또는 소 혈청 알부민을 Affi-gel10(Biorad)에 커플링하고 개별적으로 APP와 함께 18 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 이어서 수지를 원심 분리로 제거하고 상등액을 분석하였다. APP는 또한 80℃에서 4분간 가열되거나 또는 100 uM DTT를 제제하여 PBS에 대하여 투석한다.

도4는 페닐 토요펄(phenyl toyopearl), 블루 세파로스(blue sepharose) 및 울트라링크(ultra link)-mpl 컬럼으로부터의 mpl 리간드 용출액의 활성을 보여준다. mpl 친화 크로마토그래피로부터의 4 내지 8 분획액이 컬럼에서 용출된 피크 활성 분획액들이다.

도5는 용출된 울트라링크-mpl 분획액의 SDS-PAGE을 보여준다. 각각의 2 내지 8 분획액 200 ul에, 1mM HCl을 함유하는 아세톤 1 ml을 -20℃에서 가하였다. 3 시간 후에, -20℃에서 샘플을 원심분리하고 얻어지는 펠리트를 아세톤으로 2회 -20℃에서 세척하였다. 후속하여 아세톤 펠리트를 30 ul의 SDS 가용화 완충액에 용해시켜 100 uM DTT를 제조하고 90℃ 5 분간 가열하였다. 이어서 샘플을 4-20%의 SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 분할시키고 단백질을 은 염색으로 시각화하였다.

도6은 SDS-PAGE로부터의 용출액의 mpl 리간드 활성을 보여준다. mpl 친화 컬럼으로부터의 제6 분획액을 4-20% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 비환원조건하에 분리시켰다. 전기 영동후 겔을 12 개의 같은 크기로 잘라 실시예에 기재된 바와 같이 전기 용출시켰다. 전기 용출된 샘플을 PBS에 대해 투석하고 1/20 배 희석 상태에서 분석하였다. 겔을 캘리브레이션하기 위해 이용한 Mr 표준액은 Novex Mark 12 표준액이었다.

도7은 mpl 리간드 부재 APP의 인간 거핵구 형성에 대한 효과를 보여준다. mpl 리간드 부재 APP는 1ml의 mpl 친화 컬럼(700 ug mpl-IgG/ml NHS-수퍼로오즈, Pharmacis)에 1 ml을 통과시킴으로서 제조하였다. 인간 말초 간세포 배양물을 10 % APP 또는 10% mpl 리간드 부재 APP로 처리하고 12 일간 배양하였다. 거핵구 형성은 하기 실시예에 기재된 바와 같이 정량화하였다.

도8은 APP에 의한 인간 거핵구 형성의 자극에 대한 mpl-IgG의 효과를 보여준다. 인간 말초 간세포 배지를 10 % APP로 처리하고 12일간 배양하였다. 0, 2 및 4일째에 mpl-IgG(0.5 ug) 또는 ANP-R-IgG(0.5 ug)을 가하였다. 12일 후에 거핵구 형성을 하기 실시예에 기재한 바와 같이 정량화하였다. 2개 1조의 샘플의 평균을 그래프에 나타내고 2개의 실측 데이타는 괄호안에 기입하였다.

도9는 mpl 리간드를 암호화하는 인간 게놈 DNA의 390 bp의 두개의 스트랜드를 보여준다. "엑손 3"의 연역된 아미노산 서열(SEQ ID NO:3), 코딩 서열(SEQ ID NO:4), 그의 상보체(SEQ ID NO:5)를 보여준다.

도10은 성숙한 인간 mpl 리간드(hML)(SEQ ID NO:6) 및 성숙한 인간 에리트로포이에틴(hEPO)(SEQ ID NO:7)의 연역된 아미노산 서열을 보여준다. 인간 mpl 리간드의 예상되는 아미노산 서열을 인간 에리트로포이에틴 서열과 나란히 배열하였다.동일한 아미노산은 사각형 테두리를 하고 적당한 배열을 위해 발생한 갭은 대시로 표시하였다. 잠재적 N-글리코실레이션 위치는 hML의 경우 실선으로 밑줄치고 hEPO의 경우 점선으로 밑줄쳤다. 에리트로포이에틴 활성에 중요한 2개의 시스테인은 큰 점으로 표시하였다.

도11은 성숙한 인간 mpl 리간드 이소폼 hML의 연역된 아미노산 서열(SEQ ID NO:6), hML2(SEQ ID NO:8), hML3(SEQ ID NO:9) 및 hML4(SEQ ID NO:10)을 보여준다. 동일한 아미노산은 사각형 테두리를 하고 적당한 배열을 위해 도입된 갭은 대시로 표시하였다.

도12a, 12b, 및 12c는 인간 mpl 리간드의 Ba/F3-mpl 세포 증식(A), 거핵구 당단백 GPll_blll_a(B)에 특이한 방사능 표지된 IgG 모노클론성 위의 항체를 이용하여 정량한 시험관내 인간 거핵구 형성, 및 혈소판 반사 분석에서 측정한 쥐의 혈소판 형성(C)에 대한 영향을 보여준다.

293 개의 세포를 pRK5 벡터 단독 또는 pRK5-hML 또는 pRK5-ML₁₅₃으로 CaPO₄법에 따라 철야로 감염시켰다(Gorman, C in DNA Cloning:A New Approach 2:143-190[1995])(pRK5-ML₁₅₃은 PCR에 의해 hML의 잔기 153 이후에 중지 코돈을 도입시킴으로써 제조되었다). 이어서 배양물을 36 시간 동안 조건화하고 하기 실시예 1(A)에 기술한 바와 같이 Ba/F3-mpl의 증식(A) 또는 시험관내 인간 거핵구 형성(B)의 자극에 대해 분석하였다. 거핵구 형성은 문헌[Grant et al., Blood 69:1334-1339)에 기재된 바와 같이¹²⁵I 표지된 쥐의 IgG 모노 클론성 항체(HP1-1D)를 거핵구 특이성 당단백질 GPll_blll_a에 이용하여 분석하였다. 부분적으로 정제된 재조합 ML(rML)의 생체내 혈소판 생산(C)에 대한 영향은 맥도날드에 의해 문헌[T.P. Proc.Soc. Exp. Biol. Med. 144:1006-10012(1973)]에 기재된 바와 같이 반사 혈소판 형성 분석을 이용하여 결정하였다. 부분적으로 정제된 rML은 재조합 ML을 함유하는 조건화된 배지 200 ml로부터 제조하였다. 이 배양물을 PBS내에서 평형을 이룬 2 ml Blue-Separose 컬럼에 통과시키고 이 컬럼을 PBS로 세척하고 각각 2M의 우레아 및 NaCl을 함유하는 PBS로 용출시켰다. 활성 분획을 PBS에 대해 투석하고 엔도톡신 부재 BSA를 농도가 1 mg/ml이 되도록 처리하였다. 샘플은 단위 밀리리터당 1 유니트 미만의 엔도톡신을 함유한다. 마우스에 64000, 32000 또는 16000 유니트의 rML 또는 부형재 단독으로 주입하였다. 각각의 집단은 6 마리의 마우스로 구성되었다. 각 집단의 평균 및 표준편차를 기재한다. p값은 중간치를 비교하는 2 테일드(tailed) T-시험에 의해 결정하였다.

도13은 Ba/F3 mpl 세포 증식 분석에서 인간 mpl 리간드 이소폼과 변형의 영향을 비교한다. hML, 모크(mock), hML2, hML3, hML(R153A, R154A) 및 hML₁₅₃을 실시예 1에 기재한 바와 같이 다양한 희석 농도에서 분석하였다.

도14a, 14b 및 14c는 인간 mpl 리간드(hML) 또는 인간 TPO(hTPO)의 연역된 아미노산 서열(SEQ ID NO:1) 및 인간 게놈 DNA 코딩 서열(SEQ ID NO:11)을 보여준다. 뉴클레오티드 및 아미노산 잔기는 각 행의 처음에서부터 번호를 매겼다.

도15는 정제된 293-rhML₃₃₂및 정제된 293-rhML₁₅₃의 SDS-PAGE를 보여준다.

도16은 뉴클레오티드 서열(쥐의 ML 이소폼의 개방 판독 프레임(open reading frame)의 cDNA 코딩 서열(SEQ ID NO:12) 및 연역된 아미노산 서열(SEQ ID NO:13))을 보여준다. 이 성숙한 쥐의 mpl 리간드 이소폼은 331 개의 아미노산 잔기로 구성되어 있는데, 이는 추정상의 전길이 mML보다 4 개 적은 수치이며 mML2로 표시한다. 뉴클레오티드는 각행의 처음에서부터 번호를 매긴다. 잠재적 N-글리코실레이션 위치에는 밑줄을 쳤다. 시스테인 잔기는 서열 위에 점으로 표시하였다.

도17도은 이 쥐의 ML 이소폼(mML)의 cDNA 서열(SEQ ID NO:14) 및 예상되는 단백질 서열(SEQ ID NO:15)을 보여준다. 뉴클레오티드는 각 행의 처음에서부터 번호를 매긴다. 아미노산 잔기는 Ser1으로부터 시작하여 서열 위에 번호를 표시하였다. 이 성숙한 쥐의 mpl 리간드 이소폼은 335 개의 아미노산 잔기를 포함하며 mML로 표시되는 전길이 mpl 리간드인 것으로 믿어진다. 신호 서열은 대시 표시된 줄로 나타내었고 절단 가능성 있는 지점은 화살표로 나타내었다. 5' 및 3' 미번역 영역은 소문자로 나타내었다. 대안적 스플라이싱(splicing)(mML2 및 mML3)의 결과로 발견되는 2개의 탈락기에는 밑줄을 쳤다. 4개의 시스테인 잔기는 점으로 나타내었다. 7개의 잠재적인 N-글리코실레이션 위치는 사각형 테두리를 하였다.

도18은 인간 ML 이소폼 hML3의 연역된 아미노산 서열(SEQ ID NO:9)와 쥐의 ML 이소폼 mML3의 아미노산 서열(SEQ ID NO:16)을 비교한다. 인간 mpl 리간드의 예상되는 아미노산 서열을 쥐의 mpl 리간드 서열과 나란하게 배열하였다. 동일한 아미노산은 사각형 테두리하고 적당한 배열을 위해 발생한 갭은 대시로 표시하였다. 아미노산은 각 행의 처음에서부터 번호를 매겼다.

도19는 마우스 ML(SEQ ID NO:17), 돼지-ML(SEQ ID NO:18) 및 인간-ML(SEQ ID NO:6)의 예상되는 아미노산 서열을 비교한다. 아미노산 서열들을 나란히 배열하되, 적당한 배열을 위해 도입된 갭은 대시로 표시되었다. 아미노산은 각 행의 처음에서부터 번호를 매겼고 동일한 잔기는 사각 테두리하였다. 잠재적인 N-글리코실레이션 위치는 그림자 사각 테두리로 표시하고 시스테인 잔기는 점으로 표시하였다. 잠재적 프로테아제 절단 위치가 있는 보존된 이염기성 아미노산 모티프에는 밑줄을 쳤다. 4개의 아미노산 탈락이 세개 종 모두(ML2)에서 발견되었고 볼드체 박스로 테두리하였다.

도20은 돼지 ML 이소폼(pML)의 cDNA 서열(SEQ ID NO:19) 및 예상되는 성숙한 단백질 서열(SEQ ID NO:18)을 보여준다. 이 돼지 mpl 리간드 이소폼은 332 개의 아미노산 잔기를 포함하며 pML로 나타내어지는 전길이 돼지 mpl 리간드인 것으로 믿어진다. 뉴클레오티드는 각 행의 처음에서부터 번호를 매겼다. 아미노산 잔기는 Ser1에서 시작하여 서열 위에 번호를 나타내었다.

도21은 돼지 ML 이소폼(pML2)의 cDNA 서열(SEQ ID NO:20) 및 예상되는 성숙한 단백질 서열(SEQ ID NO:21)을 보여준다. 이 돼지 mpl 리간드 이소폼은 328 개의 아미노산 잔기를 포함하며 pML2로 나타내어지는 전길이 돼지 mpl 리간드의 4개 잔기가 탈락된 형태인 것으로 믿어진다. 뉴클레오티드는 각 행의 처음에서부터 번호를 매겼다. 아미노산 잔기의 번호는 Ser1에서 시작하여 서열 위에 그 번호를 나타내었다.

도22는 전길이 돼지 ML 이소폼 pML3의 연역된 아미노산 서열(SEQ ID NO:18)와 돼지의 ML 이소폼 pML2의 연역된 아미노산 서열(SEQ ID NO:21)을 비교한다. pML의 예상되는 아미노산 서열을 pML2 서열과 나란하게 배열하였다. 동일한 아미노산은 사각형 테두리하고 적당한 배열을 위해 발생한 갭은 대시로 표시하였다. 아미노산은 각 행의 처음에서부터 번호를 매겼다.

도23은 CHO-rhTPO₃₃₂의 제조할 때 숙주 CHO-DP12세포를 감염시키기 위해 이용되는 플라즈미드 pSV15.ID.LL.MLORF(전길이 또는 TPO₃₃₂)의 적당한 특징을 보여준다.

도24는 CHO-rhTPO₁₅₃의 제조할 때 숙주 CHO-DP12세포를 감염시키기 위해 이용되는 플라즈미드 pSV15.ID.LL.MLEPO-D(절융형 또는 TPO₁₅₃)의 적당한 특징을 보여준다.

도25a, 25b, 및 25c은 E.coli-rhTPO(Met^-1, 153)의 정상적인 마우스에서의 혈소판(A), 적혈구 세포(B) 및 백혈구 세포(C)에 대한 영향을 보여준다. 6마리의 암컷 C57 B6 마우스로 구성된 2개의 집단에 하루에 PBS 완충액 또는 0.3 ug E. coli-rhTPO(Met^-1, 153)(100 ul, 피하 주사)을 주사하였다. 0 및 3 내지 7 일째에, 40 ul의 혈액을 안와동에서 채취하였다. 이 혈액을 즉시 시판되는 희석제 10 ml 중에 희석하고 Serrono Baker Hematology Analyzer 9018을 이용하여 최종적 혈액 수치를 얻었다. 이 데이타는 평균±평균의 표준오차의 형태로서 제시되었다.

도26a, 26b 및 26c는 E.coli-rhTPO(Met^-1, 153)의 준치사 수준으로 조사된마우스에서의 혈소판(A), 적혈구 세포(B) 및 백혈구 세포(C)에 대한 영향을 보여준다. 10마리의 암컷 C57 B6 마우스로 구성된 2개의 집단에¹³⁷Cs원으로부터 감마선 750 cGy를 조사하고 하루에 PBS 완충액 또는 3.0 ug E. coli-rhTPO(Met^-1, 153)(100 ul, 피하 주사)을 주사하였다. 0 및 후속되는 중간 시점에서, 40 ul의 혈액을 안와동에서 채취하였다. 이 혈액을 즉시 시판되는 희석제 10 ml 중에 희석하고 Serrono Baker Hematology Analyzer 9018을 이용하여 최종적 혈액 수치를 얻었다. 이 데이타는 평균±평균의 표준오차의 형태로서 제시되었다.

도27a, 27b 및 27c는 CHO-rhTPO₃₃₂의 정상적인 마우스에서의 혈소판(A), 적혈구 세포(B) 및 백혈구 세포(C)에 대한 영향을 보여준다. 6마리의 암컷 C57 B6 마우스로 구성된 2개의 집단에 하루에 PBS 완충액 또는 0.3 ug CHO-rhTPO₃₃₂(100 ul, 피하 주사)을 주사하였다. 0 및 3 내지 7 일째에, 40 ul의 혈액을 안와동에서 채취하였다. 이 혈액을 즉시 시판되는 희석제 10 ml 중에 희석하고 Serrono Baker Hematology Analyzer 9018을 이용하여 최종적 혈액 수치를 얻었다. 이 데이타는 평균±평균의 표준오차의 형태로서 제시되었다.

도28는 다양한 세포주로부터 얻은 rhTPO의 다양한 형태의 투여량-반응 곡선을 보여준다. 투여량-반응 곡선은 하기 세포주들로부터의 rhTPO에 대해 작성되었다: CHO로부터의 hTPO₃₃₂(차이니즈 햄스터 난세포로부터의 전길이 형태); hTPO_Met-1₁₅₃(N-말단 메티오닌을 가지는 E.coli 유도 절융형); hTPO₃₃₂(인간 293 세포로부터의전길이 TPO); 무Met 155 E Coli(말단 메티오닌이 없는 E.coli로부터의 절융형[rhTPO₁₅₅]). 6 마리의 암컷 C57B6 마우스 집단들에게 7일간 매일 집단에 따라 rhTPO를 주사하였다. 매일 40 ul의 혈액을 안와동으로부터 채취하여 최종 혈구 수치 측정에 이용하였다. 상기 데이타는 다양한 치료에서 관찰된 최대 효과를 나타낸 것이며 단 (met 153 E.Coli)는 치료 기간 중 7일 째에 발생한 데이타이다. 상기 "met 153 E.Coli"집단에서 최대 효과는 5일 째에 관찰된다. 이 데이타는 평균±평균의 표준 오차의 형태로서 제시되었다.

도29는 CHO 세포에서 생산된 rhTPO의 전길이 및 "클리핑된" 형태와 E. coli로부터의 절융형을 비교하는 투여량-반응 곡선을 보여준다. 6 마리의 암컷 C57B6 마우스로 구성된 집단에 다양한 유형의 rhTPO를 하루당 0.3 ug씩 주사하였다. 2 내지 7일째에 40 ul의 혈액을 안와동에서 채취하여 최종 혈액수치 측정에 이용하였다. 치료군은 E.coli로부터의 TPO 절융형인 TPO₁₅₃; 전 길이의 약 80-90% 및 클리핑된 형태의 10-20%를 함유하는 전길이 TPO인 TPO₃₃₂(Mix 분획); TPO332(30K 분획)= 초기 "Mix" 제제로부터의 정제된 클리핑된 분획; TPO332(70K 분획)=초기 "Mix" 제제로부터의 정제된 전길이 TPO 분획이다. 이 데이타는 평균±평균의 표준오차의 형태로서 제시되었다.

도30은 TPO를 측정하기 위한 KIRA ELISA를 보여주는 그림이다. 이 그림에는 최종 구조물(그림 우측)뿐만 아니라 MPL/Rse.gD 키메라 및 기원 수용체의 관련 부분 및 이 분석의 관련 단계를 도시하는 순서도(그림 좌측)도 도시되어 있다.

도31은 KIRA ELISA 분석의 실험 방법 중의 각 단계를 보여주는 순서도이다.

도32a 내지 32l은 실시예 17의 Rse.gD의 발현에 이용되는 발현 벡터 pSVl17.ID.LL의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:22)을 제공한다.

도33은 플라즈미드 pMP1의 제조의 개략적 도식이다.

도34는 플라즈미드 pMP21의 제조의 개략적 도식이다.

도35는 플라즈미드 pMP151의 제조의 개략적 도식이다.

도36은 플라즈미드 pMP202의 제조의 개략적 도식이다.

도37은 플라즈미드 pMP172의 제조의 개략적 도식이다.

도38은 플라즈미드 pMP210의 제조의 개략적 도식이다.

도39은 pMP210 플라즈미드 뱅크내에서 발현성이 가장 뛰어난 5 개의 TPO 클론을 나타내는 표이다.

도40은 플라즈미드 pMP41의 제조의 개략적 도식이다.

도41은 플라즈미드 pMP57의 제조의 개략적 도식이다.

도42는 플라즈미드 pMP251의 제조의 개략적 도식이다.

<발명의 상세한 설명>

I. 정의

일반적으로 하기 용어 또는 구문은 본 설명, 실시예 및 특허 청구 범위에서 이용될때, 하기 정의된 의미를 가진다.

"차오트로픽 물질"은 수용액에서 및 적당한 농도에서 단백질의 정상적인 2차 및 3차 구조를 유지시키는 데 관여하는 힘을 부분적으로 파괴함으로써 단백질의 공간적 배치 및 형태에 변화를 유발시킬 수 있는 화합물을 말한다. 이러한 화합물에는 예를 들어, 우레아, 구아니딘-HCl 및 소듐 티오시아네이트가 포함된다. 단백질에 대한 형태적 영향을 미치기 위해서는 통상 4 내지 9 M의 고농도의 이들 화합물이 필요하다.

"시토킨"은 일단의 세포로부터 유리되며 다른 세포에 세포내 매개체로서 작용하는 단백질에 대한 일반적 명칭이다. 이러한 시토킨의 예에는 림포킨, 모노킨, 및 전통적인 폴리펩티드 호르몬이 있다. 시토킨에는 성장 호르몬, 인슐린 유사 성장 인자, 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 소 성장 호르몬, 부갑상선 호르몬, 티록신, 인슐린, 프로인슐린, 릴랙신, 프로릴랙신, 여포 자극 호르몬(FSH), 갑상선 자극 호르몬(TSH) 및 황체 호르몬(LH)과 같은 당단백 호르몬, 조혈 성장 인자, 간 성장 인자, 적아구 성장 인자, 프로락틴, 태반 락토겐, 종양 괴사 인자-α(TNF-α 및 TNF-β), 뮬레리안 억제 물질, 마우스 고나도트로핀 관련 펩티드, 인히빈, 액티빈, 맥계 내피세포 성장 인자, 인테그린, NGF-β와 같은 신경 성장 인자, 혈소판 성장 인자, TGFs-α 및 TGFs-β와 같은 변형 성장 인자(TGFs), 인슐린 유사 성장 인자-I 및 -II, 에리트로포이에틴(EPO), 골 유도성 인자. 인터페론-α, -β, 및 -γ과 같은 인터페론, 거핵구 CSF(M-CSF), 과립구-대식세포-CSF(GM-CSF) 및 과립구-CSF(G-CSF)와 같은 집락 자극 인자(CSFs), IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12와 같은 인터로이킨(IL's) 및 LIF, SCF 및 키트 리간드를 포함하는 기타 폴리펩티드 인자가 포함된다. 본 명세서에서 이용한 상기 용어들은 천연 소스 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질을 포함하는 것이다. 마찬가지 맥락에서, 상기 용어들은 생물학적 동등물(예: 아미노산 서열상의 하나 이상의 아미노산의 차이 또는 글리코실레이션의 유형 또는 정도에 있어서의 차이가 있는 것)을 포함하는 것이다.

"mpl 리간드", "mpl 리간드 폴리펩티드", "ML", "트롬보포이에틴" 또는 "TPO"를 호환성있게 이용되며 시토킨 수용체 상과의 일원인, mpl에 결합하는 성질을 가지며 하기 정의되는 ML의 생물학적 특성을 가지는, 모든 폴리펩티드를 포함한다. 대표적인 생물학적 성질은 표지된 뉴클레오티드(예:³H-티미딘)를 인간 mpl P로 감염된 IL-3 의존성 Ba/F3 세포의 DNA에의 혼입을 자극하는 능력이다. 또다른 대표적인 생물학적 성질은 마우스 반사 분석에서 순환하는 혈소판으로³⁵S의 혼입을 자극하는 능력이다. 이 정의는 본 명세서에 기재된 재생 불량성 돼지 혈장 또는 인간을 포함한 다른 동물 종과 같은 기타 소스와 같은 mpl 리간드 소스로부터 분리되거나 또는 재조합 또는 합성법에 의해 제조된 폴리펩티드를 포함하며 관능적 유도체, 절편, 대립 유전자 형질, 이소폼 및 그의 유사체를 포함하는 변형들을 망라한다.

"mpl 리간드 절편" 또는 "TPO 절편"은 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 카르보히드레이트가 탈락된 천연에 존재하는 전길이 mpl 리간드의 한 부분이다. 탈락된 아미노산 잔기(들)은 N-말단 또는 C-말단 또는 내부를 포함하여 펩티드 내에 어느곳에나 존재할 수 있다. 이 절편은 mpl리간드와 하나 이상의 생물학적 특성을 공유한다. mpl 리간드 절편은 통상적으로 재생불량성 돼지 혈장으로부터 단리된 리간드 또는 인간 또는 쥐의 리간드를 포함한 포유류로부터 단리된 mpl 리간드의 서열, 특히 그의 EPO 도메인과 동일한 10, 15, 20, 25, 30, 또는 40개 이상의 아미노산의 연속적 서열을 가질 것이다. 대표적인 N-말단 절편의 예에는 hML₁₅₃또는 TPO(Met^-11-153)이다.

본 발명에서 정의된 "mpl 리간드 변형체" 또는 "mpl 리간드 서열 변형체"는 하기 정의되는 바와 같이 도1(SEQ ID NO:1)에 기재된 연역 서열을 가지는 재조합 세포 또는 재생불량성 돼지 혈장으로부터 분리된 mpl 리간드 또는 인간의 리간드와 100% 미만의 서열 동일성을 가지는 하기 정의되는 생물학적으로 활성인 mpl 리간드를 나타낸다. 통상, 생물학적으로 활성인 mpl 리간드 변형체는 재생불량성 돼지 혈장으로부터 단리된 mpl 리간드 또는 성숙한 쥐 또는 인간의 리간드 또는 그의 절편(도1(SEQ ID NO:1) 참조)과 약 70% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가진다. 서열 동일성은 바람직하게는 약 75% 이상, 더욱 바람직하게는 약 80% 이상, 한층 더 바람직하게는 약 85% 이상, 더더욱 바람직하게는 약 90% 이상 및 가장 바람직하게는 약 95% 이상이다.

"키메릭 mpl 리간드"는 제2의 이형성 폴리펩티드 또는 하나 이상의 그의 절편에 융합되거나 또는 결합된 전길이의 mpl 리간드 또는 그의 하나 이상의 절편으로 구성되는 폴리펩티드이다. 키메라는 mpl 리간드와 하나 이상의 특성을 공유하게 된다. 제2의 폴리펩티드는 통상 시토킨, 면역글로불린, 또는 그의 절편이다.

"단리된 mpl 리간드", "고도로 정제된 mpl 리간드" 및 "실질적으로 균질한 mpl 리간드"는 서로 호환성있게 이용되며, mpl 리간드 소스를 정제하거나 또는 재조합 또는 합성법에 따라 제조된 mpl 리간드을 나타내며, 기타 펩티트 또는 단백질이 충분히 제거되어 (1) 스피닝 컵 시쿼네이터(spinning Cup sequenator) 또는 가장 잘 시판되는 아미노산 시쿼네이터 또는 본 출원의 출원일 현재 공개된 방법에 따라 개량된 아미노산 시쿼네이터를 이용하여 N-말단 또는 내부의 아미노산 서열의 15 개 이상, 바람직하게는 20 개의 아미노산 잔기의 서열을 얻을 수 있거나 또는 (2) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 스테인을 이용하여, 비환원 또는 환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의해 균질성을 획득할 수 있는 mpl 리간드를 의미한다. 본 명세서에서 균질성이란 약 기타 소스 단백질로의 오염도가 약 5% 미만인 것을 나타낸다.

"mpl 리간드" 또는 "분리된 mpl 리간드"와 연관지어 이용된 경우의 "생물학적 특성"이란 혈소판 형성 활성을 가지거나 또는 mpl 리간드(천연 또는 가공된 형태에 관계없이) 또는 그의 절편에 의해 직접 또는 간접적으로 유발되거나 또는 수행되는 생체내 효과기 또는 항원 기능 또는 활성을 가지는 것을 의미한다. 효과기 기능에는 mpl 결합 및 기타 캐리어 결합 활성, mpl의 효현 또는 길항, 특히 복제, DNA 조절 기능, 시토킨, 수용체(특히 시토킨) 활성화, 불활성화, 상승 조절 또는 하강 조절, 세포 성장 또는 분화 등과 같은 생물학적 활성를 포함하는 증식 신호의 전달이 포함된다. 항원 기능은 천연의 mpl 리간드에 대하여 만들어진 항체와 교차반응할 수 있는 에피토우프 또는 항원적 위치를 소유함을 의미한다. mpl 리간드 폴리펩티드의 주된 항원적 기능은 재생불량성 돼지 혈장으로부터 분리된 mpl 리간드에 대하여 제조된 항체에 약 10⁶l/몰 이하의 친화성으로 결합한다는 것이다. 통상, 이 폴리펩티드는 약 10⁷l/몰 이하의 친화성으로 결합한다. 가장 바람직하게는 항원적으로 활성인 mpl 리간드 폴리펩티드는 상기 효과기 기능 중 하나를 가지는 mpl 리간드에 대해 제조된 항체에 결합하는 폴리펩티드이다. "생물학적 활성"을 정의하는 데에 이용되는 항체는 재조합 세포 배지 또는 재생 불량성 돼지 혈장으로부터 분리된 mpl 리간드를 프로인트 배지에서 제제화하고 이 제제를 피하에 주사하고 mpl 리간드 항체 플레토의 역가에 도달할 때까지 이 제제를 복강내 주사하여 면역 반응을 유발시킴으로써 제조된 토끼 폴리클론성 항체이다.

"mpl 리간드" 또는 "분리된 mpl 리간드"와 연관되어 이용되는 경우의 "생물학적으로 활성인"은 혈소판 형성 활성을 가지거나 또는 재생 불량성 돼지 혈장으로부터 분리되거나 또는 본 명세서에 기재된 재조합 세포 배지 내에서 발현된 mpl 리간드의 효과기 기능을 공유하는 mpl 리간드 또는 폴리펩티드를 나타낸다. 본 발명의 mpl 리간드 또는 폴리펩티드의 주요 공지된 효과기 기능은 mpl에 결합하여, 표지된 뉴클레오티드(³H-티미딘)이 인간 mpl P로 감염된 IL-3 의존성 Ba/F3 세포의 DNA에 혼입되도록 자극하는 것이다. mpl 리간드 또는 폴리펩티드의 또다른 공지된 효과기 기능은 마우스 혈소판 반사 분석에서³⁵S의 순환 혈소판에의 혼입을 자극하는 기능이다. mpl 리간드의 또다른 공지된 효과기 기능은 (거핵구 당단백 GPII_bIII_a에 특이적이며 방사능 표지된 모노클론성 항체를 이용하여 정량화할 수 있는)시험관내 인간 거핵구 형성을 자극할 수 있는 능력이다.

mpl 리간드 서열에 대한 "퍼센트 아미노산 서열 동일성"은 서열을 나란히 배열하고 필요하다면 갭을 도입하여 최대 퍼센트의 서열 동일성을 얻도록 하고 단, 보존성 치환 부분은 서열 동일성의 부분으로 간주하지 않았을때, 본 명세서에서 도1에 기재된 연역 아미노산 서열(SEQ ID NO:1)을 가지는 재생불량성 돼지 혈장에서 분리된 mpl 리간드 서열 또는 쥐의 또는 인간 리간드의 잔기와 동일성을 보이는, 후보 서열의 아미노산 잔기의 퍼센트로서 정의된다. N-말단, C-말단 또는 내부 연장기 또는 탈락기 또는 mpl 리간드로의 삽입기는 서열 동일성 및 상동 관계에 영향을 미치지 않는 것으로 간주되어야 한다. 이로서, 동일한 서열을 가지는 것으로 생각되는 대표적인 생물학적으로 활성인 mpl 리간드 폴리펩티드에는 프리프로-mpl 리간드, 프로-mpl 리간드 및 성숙한 mpl 리간드가 포함된다.

"mpl 리간드 마이크로시퀀싱(microsequencing)"은 충분히 예민한 모든 적당한 표준 방법에 따라 수행될 수 있다. 이러한 한 방법에서, SDS 겔로부터 얻거나 또는 최종 HPLC 단계로부터 얻은 고도로 정제된 폴리펩티드는 120A 페닐티오하이단토인(PTH) 아미노산 분석기가 장착된 모델 470A Applied Biosystems 기체상 시퀀서를 이용한 자동화된 에드만(페닐 이소티오시아네이트) 분해법에 의해 서열 규명된다. 또한 화학적(예:CNBr, 히드록실아민, 2-니트로-5-티오시아노벤조에이트) 또는 효소적(예: 트립신, 클로스트리파인(Clostripain), 스타필로코컬(staphylococcal) 프로테아제) 소화 후에 절편 정제(예:HPLC)함으로써 제조되는 mpl 리간드 절편도 유사한 방법으로 서열 규명된다. PTH 아미노산은 크롬퍼펙트(chromperfect) 데이타 시스템(Justice Innovationa, Palo Alto, CA)를 이용하여 분석한다. 서열 해석은 VAX 11/785 Digital Equipment Co. 컴퓨터를 이용하여 수행한다(Henzel et al., Chromatography, 404:41-52[1978]). 임의로, HPLC 분획의 부분량은 5 내지 20%의 SDS-PAGE 상에서 전기 영동시켜, PVDF 막으로 전기 이동시켜(ProBlott, AIB, Foster City, 캘리포니아) 쿠마시 브릴런트 블루를 이용하여 염색할 수 있다(Matsurdiara, J.Biol. Chem., 262:10035-10038[1987]). 이 염료에 의해 동정되는 특이 단백질은 블로트(blot) 부분으로부터 잘라내어 상기한 방법에 따라 기체상 시쿼네이터를 이용하여 N-말단 서열 규명한다. 내부 단백질 서열의 경우에는 HPLC 분획을 진공 하에서 건조시키고(SpeedVac), 적당한 완충액 내에 재현탁시키고, 시아노겐브로마이드, Lys-특이성 효소 Lys-C(Wako Chemicals, Richmond, VA) 또는 Asp-N(Boeringer Mannheim, Indianapolis, IN)로 소화한다. 소화후, 얻어지는 펩티드를 혼합물의 형태로서 서열 규명하거나 또는 0.1% TFA 중의 프로판올 구배를이용하면서 전개시키는 C4 컬럼 상에서의 HPLC로 분할후 기체상 서열 규명한다.

"혈소판 감소증"은 혈액 단위 리터 중의 혈소판 수가 150×10⁹미만인 것을 나타낸다.

"혈소판 형성 활성"이란 거핵구 또는 거핵구 선구 세포를 이들 세포의 혈소판 생산 형태로 증식, 분화 및(또는) 성숙시키는 것을 가속화하는 것으로 구성되는 생물학적 활성으로 정의된다. 이 활성은 생체내 혈소판 반사 분석, 인간 백혈병 거핵구 세포주(CMK)에 대한 항혈소판 면역 분석(anti-GPII_bIII_a)에 의해 측정되는 혈소판 세포 표면 항원 유도 분석 및 거핵구 세포주(DAMI)에서의 다배체화 유도를 포함한 다양한 분석법에 의해 측정될 수 있다.

"트롬보포이에틴(TPO)"는 포유류내에서 혈소판 형성능을 가지거나 또는 혈청 혈소판 수를 증가시킬 수 있는 화합물로서 정의된다. TPO는 바람직하게는 내인성 혈소판 수를 10% 이상, 더욱 바람직하게는 50 % 증가시킬 수 있으며 인간의 경우 가장 바람직하게는 혈소판 수를 혈액 단위 리터 당 150×10⁹이상으로 증가시킬 수 있다.

"단리된 mpl 리간드 핵산"은 생물학적으로 활성인 mpl 리간드 또는 그의 절편을 암호화하는 16개 이상, 바람직하게는 20개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 염기를 함유하는 RNA 또는 DNA이며 및 상기 RNA 또는 DNA에 상보적이거나 또는 상기 RNA 또는 DNA와 혼성화하여 중간 및 가혹 조건하에서 안정하게 결합된 상태로 남아 있다. 이 RNA 또는 DNA는 천연 소스에서 정상적으로는 서로 결합된 상태로 있는하나 이상의 오염 소스 핵산을 포함하지 않으며, 바람직하게는 기타 포유류의 RNA 또는 DNA를 실질적으로 함유하지 않는다. "정상적으로는 서로 결합된 상태로 있는 하나 이상의 오염 소스 핵산을 포함하지 않으며"라는 구문은 이 핵산이 소스 또는 천연 세포 내에 존재하되, 단 이 핵산이 다른 염색체 위치에 존재하거나 또는 이 핵산에 통상 소스 세포내에서 발견되지 않는 핵산 서열이 삽입되어 있지 않은 경우를 포함한다. 단리된 mpl 리간드 핵산의 예에는 인간, 쥐 또는 돼지의 mpl 리간드와 75% 이상의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 80% 이상의 서열 동일성, 한층 더 바람직하게는 85% 이상의 서열 동일성, 더더욱 바람직하게는 90% 이상의 서열 동일성, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 생물학적으로 활성인 mpl 리간드를 암호화하는 RNA 또는 DNA이다.

발현과 관련하여 "조절 서열"은 특정한 숙주 유기체내에서의 기능 가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 의미한다. 원핵세포에 적당한 조절 서열에는 예를 들어, 프로모터(promoter), 임의로 오퍼레이터(operator) 서열, 리보솜 결합 부위 및 가능하게는 기타로서 아직까지 잘 알려져 있지 않은 서열이 포함된다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서(inhancer)를 이용하는 것으로 알려졌다.

핵산과 관련하여 "기능가능하게 연결된"이란 특정 핵산이 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 위치된 것을 의미한다. 예를 들어, 전서열 또는 분비성 리더의 DNA가 폴리펩티드의 분비에 관여하는 전단백질로서 발현된다면, 이것은 이 폴리펩티드의 DNA에 기능적으로 결합한 것이 되며, 프로모터 또는 인핸서가 서열의 전사에 영향을 미친다면, 이것들은 이 코딩 서열에 기능적으로 결합된 것이 되고, 또는 리보솜 결합 부위가 존재하여 번역을 고무시키는 경우, 이것은 코딩 서열에 기능적으로 결합된 것이 된다. 일반적으로, "기능적으로 결합된"은 결합된 DNA 서열들이 서로 인접되어 있으며, 분비 리더의 경우, 인접하며 판독상으로 존재한다는 의미이다. 그러나, 인핸서는 인접하여 위치할 필요는 없다. 연결(linking)은 유리한 제한 부위에서 리게이션(ligation)에 의해 결합된다. 이러한 위치가 존재하지 않을 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 통상의 관행에 따라 이용할 수 있다.

인자에 관련되어 이용될 경우의 "외인성"이란 세포외에서 기인하거나 세포로부터 기인하더라도 숙주 세포 핵산내에서 이 인자가 통상 발견되지 않는 위치에 존재할 경우를 의미한다.

"세포", "세포주", 및 "세포 배양물"은 본 명세서에서 서로 호환성있게 이용되며 이러한 명칭에는 세포 또는 세포주의 모든 자식 세포도 포함된다. 즉, 예를 들어, "변형체" 및 "변형된 세포"에는 일차 피험 세포 및 전이 수치에 관계없이 그로부터 유도되는 배양물을 포함한다. 또한 의도적인 또는 우연한 돌연변이로 인해, 모든 자손 세포들이 DNA 내용에 있어서 서로 정확히 일치하지 않을 수 있다는 것도 알 수 있을 것이다. 초기의 변형 세포에 대해 검색된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 가지는 돌연변이 자손 세포도 포함된다. 명확한 명칭이 의도될 경우, 문맥 관계로부터 명료화될 것이다.

"플라즈미드"는 독립적인 복제 기점을 가지며 자의적으로 복제할 수 있는 환상 DNA 분자이고, 본 명세서에서는 단어 앞에 소품자 "p"를 쓰고 임의로 그 뒤에대문자 및(또는) 숫자를 써서 나타낸다. 본 발명에서 쓰인 출발 플라즈미드는 상업적으로 시판되거나, 비제한적으로 구할 수 있거나 또는 공개된 방법에 따라, 이러한 구입 가능한 플라즈미드로부터 제조될 수 있다. 또한, 다른 대응하는 플라즈미드는 당업계에 공지되어 있으며 통상의 당업계의 숙련가들이 명백히 알 수 있는 것이다.

DNA와 관련되어 이용되는 "제한 효소 소화"란 DNA 서열의 특정 위치 또는 부위에서만 작용하는 효소로 DNA의 내부적 포스포디에스테르 결합을 촉매적으로 절단하는 것을 의미한다. 이러한 효소를 "제한 엔도뉴클레아제"라고 한다. 각각의 제한 엔도뉴클레아제는 이중 대칭성을 가지는 "제한 부위"라고 불리우는 특정한 DNA 서열을 인식한다. 본 발명에서 이용되는 다양한 제한 효소는 시판되는 것이며 효소의 공급사측에 의해 정해진 반응 조건, 조효소 및 다른 요구 사항이 이용된다. 제한 효소는 통상 대문자 및 그 뒤에 각각의 제한 효소가 얻어진 미생물을 나타내는 다른 문자들 및 특정한 효소를 나타내는 숫자로 구성된 약자로 표시한다. 일반적으로, 약 1 ug의 플라즈미드 또는 DNA 절편은 약 20 ul의 완충액 중의 약 1 내지 2 유니트(unit)와 함께 이용된다. 특정한 제한 효소에 이용되는 적당한 완충액 및 기질의 양은 제조자에 의해 규정된다. 통상 약 1 시간 동안 37℃에서 배양하지만 공급사측의 지시에 따라 변할 수 있다. 배양후, 단백질 또는 폴리펩티드는 페놀 및 클로로포름으로 추출하여 제거하고, 소화된 핵산은 에탄올 침전에 의해 수성 분획에서 회수할 수 있다. 제한 효소를 이용한 소화 이후에 5' 말단 포스페이트를 세균성 알칼리 포스파타제 가수 분해하여 두개의 DNA 말단이 서로 "환화하여" 닫힌루프를 형성함으로써 또다른 DNA가 제한 위치에 삽입되지 못하는 것을 방지할 수 있다. 다른 언급이 없는한, 플라즈미드를 소화한 후에 5' 말단의 탈포스페이트화 과정을 거치지 않는다. 탈포스페이트화를 위한 방법 및 시약은 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual[New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]의 1.56-1.61 섹션에 기재되어 있는 바와 같이 통상적인 방법에 따른다.

제한 소화물로부터의 DNA의 주어진 절편의 "회수" 또는 "단리"는 전기 영동에 의해 폴리아크릴아미드 또는 아가로즈 겔상에서 소화물을 분리한 후, 기지의 분자량을 가진 마커 DNA 절편의 이동도와 목적 절편과의 이동도를 비교함으로써 목적 절편을 동정하고, 목적 절편을 함유하는 겔 섹션을 떼어내어 DNA 로부터 겔을 분리하는 것을 의미한다. 이 방법은 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Lawn et al., Nucleic Acids Res., 9:6103-6114[1981] 및 Goeddel et al.,Nucleic Acids Res., 8:4057[1980]을 참조할 수 있다.

"서던 분석(southern analysis)" 또는 "서던 블로팅(southern blotting)"은 DNA 또는 DNA-함유 조성물의 제한 효소 엔도뉴클레아제 소화물 중의 DNA 서열의 존재 여부를 기지의, 표지된 올리고뉴클레오티드 또는 DNA 절편에 혼성화시킴으로써 확인하는 방법이다. 서던 분석은 통상 아가로즈 겔 상에서 DNA 절편을 전기 영동하여 분리한 후, DNA를 변성시키고 DNA를 니트로셀룰로오즈, 나일론 또는 기타 적당한 막 지지체에 이전시켜 방사능 표지되거나 또는 비오티닐화되거나 또는 효소로 표지된 프로브를 이용하여 분석 단계를 포함한다[Sambrook et al., supra의9.37-9.52 섹션].

"노던(northern) 분석" 또는 "노던 블로팅"은 올리고뉴클레오티드, DNA 절편, cDNA 또는 그의 절편 또는 RNA 절편과 같은 공지된 프로브와 혼성화시킨 RNA 서열을 동정하는데 이용하는 방법이다. 이 프로브는³²P와 같은 방사성 동위원소 또는 비오틴 또는 효소로 표지된다. 분석할 RNA는 Sambrook et al., supra의 7.39-7.52 섹션에 기재된 방법들과 같이 당업계에 공지된 표준 방법을 이용하여 통상 아가로즈 또는 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기 영동적으로 분리된 후, 니트로셀룰로오즈, 나일론 또는 기타 적당한 막으로 이전시킨 후, 프로브와 혼성화시킨다.

"결찰(ligation)"은 두개의 핵산 절편 사이에 포스포디에스테르 결합을 형성하는 과정이다. 두 절편의 결찰을 위해서, 절편의 양단은 결찰에 적합해야 한다. 일부 경우에, 이 양단이 엔도뉴클레아제 소화 후에 바로 적합할 수 있다. 그러나, 엔도뉴클레아제 소화 후에 발생하는 스태거드(staggered) 말단을 결찰에 적합하도록 블런트(blunt) 말단으로 바꿔야 할 필요가 있다. 말단을 블런팅하기 위해서는, DNA를 4 종의 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트의 존재 하에 DNA 폴리머라제 I 또는 T4 DNA 폴리머라제의 클레브나우(klebnow) 절편 약 10 유니트로 적어도 15 분간 15℃에서 적당한 완충액 중에서 처리한다. 이어서, DNA를 페놀-클로로포름으로 추출하고 에탄올을 이요하여 침전시킨다. 서로 결찰될 DNA 절편을 대략 동일 몰량으로 용액에 가한다. 이 용액에는 DNA 0.5 ug 당 ATP, 리가제(ligase) 완충액,및 T4 DNA 리가제와 같은 리가제 약 10 유니트을 함유한다. DNA가 벡터에 결찰될 경우에는, 벡터를 우선 적당한 제한 엔도뉴클레아제들를 이용하여 소화함으로써 직쇄화한다. 이어서 직쇄화한 절편을 세균성 알칼리 포스파타제 또는 송아지 장 포스파타제로 처리하여 결찰 단계 중에 자가 결찰되는 것을 방지한다.

세포로부터의 DNA의 "제조"란 숙주 세포의 배양물로부터 플라즈미드 DNA를 단리하는 것을 의미한다. DNA 제조를 위해 통상 이용되는 방법은 Sambrook et al., supra의 1.25-1.33 섹션에 기재된 것과 같이 대규모 및 소규모적 플라즈미드 제조 방법들이다. DNA가 제조된 후, Sambrook et al., supra의 1.40 섹션에 기재된 당업계에 공지된 방법에 따라 이를 정제할 수 있다.

"올리코뉴클레오티드"는 공지된 방법(예: 1988년 5월 4일 공개된 유럽 특허 제266,032호에 기재된 고체상(solid phase) 기술을 이용하거나, 문헌[Froehler et al., Nucl. Acids Res., 14:5399-5407[1986]에 기재된 바와 같이 데옥시뉴클레오티드 H-포스포네이트 중간체를 이용한 포스포트리에스테르, 포스파이트 또는 포스포아미다이트 화학)에 의하여 화학적으로 합성된 짧은, 단일 또는 이중 스트랜드의 폴리데옥시뉴클레오티드이다. 추가의 방법에는 아래에 그 정의를 기재하는 폴리머라제 연쇄 반응 및 오토프리머 방법 및 고체 지지체 상에서의 올리고뉴클레오티드 합성법이 포함된다. 이들 방법 모두는 문헌[Engels et al., Agnew. Chem. Int. Ed. Engls. 28:716-734[1989]]에 기재되어 있다. 이들 방법은 유전자 전체 핵산의 서열이 알려져 있거나 또는 코딩 스트랜드에 상보적인 핵산의 서열을 알 수 있을때 이용한다. 다른 방법에서, 표적 아미노산 서열이 알려져 있을 경우, 각각의 아미노산 잔기에 대응하는 기지의 바람직한 코딩 잔기를 이용하여 가능한 핵산 서열을 유추할 수 있다. 이어서 이 올리고뉴클레오티드를 폴리아크릴아미드 겔 상에서 정제한다.

"폴리머라제 연쇄 반응" 또는 "PCR"은 1987년 7월 28일에 특허 등록된 미합중국 특허제4,683,195호에 기재된 바와 같이 미량의 핵산, RNA 및(또는) DNA의 특정 조각을 증량시키는 방법 또는 기술이다. 치환적으로, 올리고뉴클레오티드 프리머를 제조하기 위하여 목적 영역의 말단 또는 그 인접한 연장 부분에 대한 서열 정보를 알아야 할 필요가 있으며, 이들 프리머들의 서열은 증량될 주형의 상대방 스트랜드의 서열과 동일하거나 유사하다. 두개의 프리머의 5'말단 뉴클레오티드는 증량된 물질들의 말단과 일치할 것이다. PCR은 전체적인 게놈 DNA, 및 전체 세포 RNA로부터 전사된 cDNA, 박테리오파지 또는 플라즈미드 서열 등으로부터의 특정한 RNA 서열 및 특정한 DNA 서열을 증량하는 데 이용한다[일반적으로 Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263[1987]; Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989 참조). 본 명세서에서 이용된 용어 PCR은 핵산의 특정 조각을 증량하거나 또는 제조하기 위하여, 프리머로 기지의 핵산 및 핵산 폴리머라제를 이용하는 것으로 이루어진 핵산 시험 샘플 증량을 위한 핵산 폴리머라제 반응 방법의 한 가지 예이며 유일한 예는 아니다.

"심한(stringent) 조건"이란 (1) 세척시 낮은 이온 강도 및 고온의, 예를 들어, 0.015 M NaCl/0.0015 M 소듐 시트레이트/0.1 % NaDodSO₄(SDS) 및 50℃의 조건을이용하거나 또는 (2) 혼성화 중에서 변성화 시약으로서 포름아미드, 예를 들어, 750 mM NaCl, 75 mM 소듐 시트레이트를 함유한 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% Ficoll/0.1%폴리비틸피롤리딘/50 mM 인산나트륨 완충액(pH 6.5)을 이용하는 조건들이다. 다른 예로는 50% 포름아미드, 5×SSC(0.75 M NaCl, 0.075 M 소듐 시트레이트), 50 mM 인산나트륨(pH 6.8), 0.1% 소듐피로포스페이트, 5×덴하르트 용액(Denhardt's solution), 소니케이션된 송어 정자 DNA(50 ug/ml). 0.1% SDS, 및 10% 덱스트란 술페이트 42℃의 조건을 이용하며 세척시 42℃ 및 0.2×SSC 및 0.1% SDS의 조건을 이용하는 것이 있다.

"중간 정도의(moderately) 가혹 조건"은 Sambrook et al., supra에 기재되어 있으며 상기 가혹 조건의 경우보다 덜 심한 세척 용액 및 혼성화 조건(예: 온도, 이온 강도 및 %SDS)을 이용하는 것을 말한다. 중간 정도의 가혹 조건의 예로는 20% 포름아미드, 5×SSC(150 mM NaCl, 15 mM 트리소듐 시트레이트), 50 mM 인산나트륨(pH 7.6), 5×덴하르트 용액, 10% 덱스트란 술페이트, 및 변성 전단된 송어 정자 DNA(20 ug/ml)으로 구성된 용액에서 37℃에서 배양한후 1×SSC 중에서 약 37-50℃에서 세척하는 것과 같은 조건들이다. 당업계의 숙련가는 프로브 길이 등과 같은 인자를 조정하는데 필요한 것으로서 온도, 이온 강도 등을 조정하는 방법을 알 수 있을 것이다.

"항체(Abs)" 또는 "면역글로불린(Igs)"는 동일한 구조적 특징을 가지는 당단백질이다. 항체가 특정한 항원에 대하여 결합 특이성을 보이는 반면, 면역글로불린은 항체 및 항원 특이성을 갖지 않는 기타 항체 유사 분자를 포함한다. 후자 종류의 폴리펩티드는 예를 들어, 임파계에서 저농도로 골수종에서 고농도로 생산된다.

"천연의 항체 및 면역글로불린"은 통상 약 150,000 달톤의 헤테로사량체 당단백이며 2개의 동일한 라이트(L)(light) 체인 및 2 개의 동일한 헤비(H)(heavy) 체인으로 구성되어 있다. 각각의 라이트 체인은 헤비 체인과 1 개의 이황화 결합으로 연결되어 있으며, 이황화 결합의 수는 상이한 면역글로불린 이소타입에 따라 다양하다. 각각의 헤비 및 라이트 체인은 또한 규칙적으로 이격된 체인간 이황화 가교를 가진다. 각각의 헤비 체인에는 한쪽 말단에 가변(variable) 도메인(V_H) 및 그에 연결된 여러개의 불변(constant) 도메인을 가진다. 각각의 라이트 체인에는 한쪽 말단에 가변 도메인(V_L) 및 다른쪽 말단에 불변 도메인이 있다; 라이트 체인의 불변 도메인은 헤비 체인의 첫번째 불변 도메인과 나란히 배열되어 있으며, 라이트 체인 가변 도메인은 헤비 체인의 가변 도메인과 나란히 배열되어 있다. 특정한 아미노산 잔기들이 라이트 및 헤비 체인 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 생각된다(Clothia et al., J. Mol. Biol., 186:651-663[1985]; Novontny and Habor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4592-4596[1985]).

"가변" 이라는 용어는 가변 도메인의 일정 부분의 서열의 차이가 항체 간에 광범위하게 나타나며 각각의 특정한 항체가 그의 특정한 항원에 특이하게 결합하는데 이용되는 것을 의미한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 영역 전체에 걸쳐 고르게 분포하는 것은 아니다. 가변성은 라이트 체인 및 헤비 체인 가변 도메인의 상보성 결정 영역(complimentarity determining region)(CDR) 또는 과가변(hypervariable) 영역으로 불리우는 3개의 세그먼트에 집중되어 있다. 가변 도메인에서 보다더 보존된 부분을 프레임워크(FR)이라고 부른다. 천연의 헤비 및 라이트 체인의 가변 도메인은 각각 4 개의 FR 영역으로 이루어져 있는데 이들은 대체로β-시트 구조를 취하며, 루프 연결을 형성하며 일부의 경우에 β-시트 구조의 일부를 구성하는 3개의 CDR와 연결되어 있다. 각각의 체인 내의 CDR들은 FR에 의해 서로 매우 인접하게 연결되어 있으며, 다른 체인으로부터의 CDR와 함께 항체의 항원 결합 부위를 형성하는데 기여한다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immumological Interest, National Inatitute of Health, Bethesda, MD[1987]). 불변 도메인은 항원에 항체를 결합시키는데에 직접 관여하지는 않지만, 항원 의존성 세포 독성에 관여하는 등 다양한 효과기 기능을 나타낸다.

항체를 파파인 소화시키면 각각 단일 항원 결합 부위를 가지는 "Fab" 절편이라 불리우는 2개의 동일한 항원 결합 절편 및 이름으로부터 쉽게 결정화할 수 있음을 알 수 있는, 나머저 "Fc" 절편을 얻는다. 펩신으로 처리하면, 2개의 항원 결합 부위를 가지며 여전히 항원에 교차 결합이 가능한 F(ab')₂을 얻는다.

"Fv"는 완전한 항원 인지 및 결합 부위를 포함하는 최소한의 항체 절편이다. 이 영역은 밀착되어 비공유적으로 결합된 하나의 헤비 체인 및 하나의 라이트 체인으로 구성되어 있다. 상기 각각의 가변 도메인의 3개의 CDRs이 상호 작용하여 V_H-V_L이량체의 표면에 항원 결합 부위를 이루는 곳이 바로 이 구조에서이다. 전체적으로, 이 6개의 CDR이 항체에 대한 결합의 특이성을 제공한다. 그러나, 단일의 가변도메인(또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만으로 구성된 Fv의 절반)조차도 비록 전체적인 항원 결합 부위보다는 낮은 친화도이지만 항원을 인식하여 결합하는 능력을 가진다.

Fab 절편들은 또한 라이트 체인의 불변 도메인 및 헤비 체인의 첫번째 불변 도메인(CH1)을 포함한다. Fab'절편은 헤비 체인 CH1의 카르복시 말단에 항체 힌지 영역의 하나 이상의 시스테인을 포함한 몇 개의 잔기를 추가로 가진다는 점에서 Fab과 다르다. 본 명세서에서 Fab'-SH는 상기 불변 도메인의 시스테인 잔기가 유리 티올기를 가지는 Fab'를 나타낸다. F(ab')₂항체 절편들은 원래 그 사이에 힌지 시스테인을 가지는 한쌍의 Fab' 절편들로서 만들어 졌다. 항체 절편들이 기타, 화학적으로 커플링하는 사실도 또한 알려져 있다.

척추 동물 종의 항체(면역글로불린)의 "라이트 체인들"은 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 카파 및 람다(λ)로 불리우는, 서로 명백히 구별되는 유형으로 분류될 수 있다.

헤비 체인의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 부류로 분류될 수 있다. 면역글로불린의 5개의 주요 부류에는 lgA, lgD, lgE, lgG 및 lgM이 있으며, 이들중 몇몇은 아부류(이소타입)들로 추가 분류될 수 있다(예: lgG-1, lgG-2, lgG-3 및 lgG-4; lgA-1 및 lgA-2). 면역글로불린의 상이한 부류의 해당 헤비 체인 불변 도메인은 알파, 델타, 엡실론, 감마, 및 뮤로 각각 명명된다. 상이한 부류의 면역글로불린의 서브유니트 구조 및 3차 구조는 잘 알려져 있다.

용어 "항체"란 넓은 의미로 이용되며 구체적으로는 단일의 모노클론성 항체(효현 및 길항 항체 포함), 폴리에피토프 특이성을 가진 항체 조성물 및 목적하는 생물학적 활성을 가지는 한, 항체 절편(예:Fab, F(ab')₂및 Fv)을 망라한다.

본 명세서에서 이용된 용어 "모노클론성 항체"는 한 무리의 실질적으로 균질한 항체로부터 얻어진 항체를 말한다, 즉 이 무리를 구성하는 개개 항체들은 소량으로 존재할 수 있는 개연성 있는 자연 발생 돌연변이의 경우를 제외하고는 서로 동일하다. 모노클론성 항체들은 단일의 항원 부위에 고도로 특이적으로 결합한다. 또한, 상이한 결정소(에피토프)들에 결합하는 상이한 항체들을 보통 포함하는 통상의(폴리클론성) 항체 제제와는 달리, 각각의 모노클론성 항체는 항원의 단일 결정소에만 결합한다. 특이성 뿐 아니라, 모노클론성 항체들은 히브리도마 배양물로부터, 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않고 제조될 수 있다는 잇점이 있다. 수식어 "모노클론성"은 한 무리의 실질적으로 균질한 항체들로부터 얻어졌다는 항체의 한 특성을 가리키는 것이지 특정 제법으로 항체를 제조해야 한다는 의미는 아니다. 예들 들면, 본 발명에서 이용되는 모노클론성 항체들은 콜러 및 밀스타인에 의해 최초로 게재된 히브리도마법[Nature 256:495(1975)] 또는 재조합 DNA법[미합중국 특허 제4.816.567호 Cabilly et al] 참조]에 의해 제조될 수 있다.

본 명세서에서 모노클론성 항체에는 헤비 및(또는) 라이트 체인의 일부분이 특정 종으로 부터 유도되거나 또는 특정 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체의 대응하는 서열과 동일하거나 또는 상동이며, 상기 체인(들)의 나머지 부분이 위와다른 특정 종으로 부터 유도되거나 또는 위와 다른 특정 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체의 대응하는 서열과 동일하거나 또는 상동인 "키메릭" 항체(면역글로불린), 및 목적하는 생물학적 활성을 가지는 한 이러한 항체들의 절편이 포함된다[미합중국 특허 제4.816.567호 Cabilly et al; 및 Morrison et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855[1984]].

비인간(예: 쥐) 항체들의 "인간화" 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소한의 서열을 포함하는 키메릭 면역글로불린. 면역글로불린 체인 또는 그의 절편들(예:Fv, Fab, Fab', F(ab')₂)이다. 대부분, 인간화 항체들은 인간 항체의 상보적 결정 영역(CDR)의 잔기들이 목적하는 특이성, 친화성 및 효능을 가지는, 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비인간 종(공여 항체)의 CDR의 잔기로 치환시킨 인간 면역글로불린이다. 예를 들면, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 대응하는 비인간 잔기로 치환된다. 또한, 인간화된 항체는 수령 항체 및 도입된 CDR 또는 프레임워크 서열 어디에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 개질은 항체 기능의 향상 및 최적화를 위하여 수행한다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 모두가 하나 이상, 통상적으로는 두개의 가변 도메인으로 구성되며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비인간 면역글로불린의 CDR 영역에 해당하며 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 일치 서열의 FR영역들이다. 바람직하게는 인간화 항체는 하나 이상의 면역글로불린 불변 영역(Fc), 일반적으로는 인간 면역글로불린의 불변 영역을 포함할 것이다. 좀더 상세한 사항에 대해서는 [John et al., Naure 321:522-525[1986]; Reoghman et al., Nature, 332:323-329[1988] 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596[1992])을 참조할 수 있다.

II 본 발명의 바람직한 실시 태양

본 발명의 바람직한 폴리펩티드는 수용체 시토킨 상과의 구성원인 mpl에 결합하는 특성을 가지고, 인간 mpl P로 감염된 IL-3 의존성 Ba/F3 세포의 DNA로³H-티미딘을 혼입시키는 것을 자극하는 생물학적 특성을 가지는, mpl 리간드 또는 트롬보포이에틴(TPO)으로 불리우는 실질적으로 균질한 폴리펩티드이다. 보다 바람직한 mpl 리간드(들)은 조혈, 특히 거핵구 형성 또는 혈소판 형성 활성- 즉, 미성숙 거핵구 또는 그의 선구 세포들을 성숙한 혈소판 생산 형태로 증식, 성숙 및(또는) 분화하도록 자극할 수 있는 단리된 포유류 단백질이다. 본 발명의 가장 바람직한 폴리펩티드는 조혈, 거핵구 형성 또는 혈소판 형성 활성을 가지는 인간 mpl 리간드(그의 절편 포함)이다. 임의로 이들 인간 mpl리간드(들)은 글리코실화되지 않는다. 다른 바람직한 인간 mpl 리간드는 hML₁₅₃또는 hTPO₁₅₃로 불리우는 hML, hML₂₄₅또는 hTPO₂₄₅로 불리우는 hML의 절융형 및 hML, hML₃₃₂또는 hTPO₃₃₂로 불리우는 도1의 아미노산 서열(SEQ ID NO:1)을 가지는 성숙한 전길이 폴리펩티드의 "EPO-도메인" 및 생물학적으로 활성인 치환 변형 hML(R153A, R154A)이다.

본 발명의 바람직한 임의의 폴리펩티드는 hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML 및 pML2로부터 선택된 생물학적으로 또는 면역학적으로 활성인 mpl 리간드 변형체이다.

본 발명의 바람직한 임의의 폴리펩티드는 인간 mpl 리간드(도1:[SEQ ID NO:1]참조), 쥐의 mpl 리간드(도16:[SEQ ID NO:12 & 13] 참조), 재조합 돼지 mpl 리간드(도19:[SEQ ID NO:18] 참조) 또는 재생 불량성 돼지 혈장으로부터 단리된 mpl 리간드와 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 한층더 바람직하게는 85% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 생물학적으로 활성인 mpl 리간드 변형체(들)이다.

재생 불량성 돼지 혈장으로부터 단리된 mpl 리간드는 하기 특성들을 가진다:

(1): 부분적으로 정제된 리간드는 PBS, 0.1% SDS를 포함하는 PBS 또는 SDS 또는 4M MgCl₂를 함유하는 PBS을 이용한 겔 여과 컬럼에서 60000-70000의 Mr와 함께 용출된다;

(2): 이 리간드의 활성은 프로나제에 의해 파괴된다;

(3): 이 리간드는 낮은 pH(2.5), 0.1% SDS 및 2M 우레아에 안정하다;

(4): 다양한 렉틴 컬럼에의 결합에 근거할 때, 이 리간드는 당단백이다;

(5): 고도로 정제된 리간드는 25000-35000의 Mr과 함께 비환원형 SDS-PAGE으로부터 용출된다. 소량의 활량이 18000-22000 이하 및 60000의 Mr와 함께 용출된다;

(6): 고도로 정제된 리간드는 환원형 SDS-PAGE 상에서 28000 및 31000의 Mr과 함께 더블렛(doublet)으로써 분할된다;

(7): 18000-22000, 28000 및 31000 밴드의 아미노 말단 서열은 모두 동일하게 SPAPPACDPRLLNKLLRDDHVLHGR(SEQ ID NO:29)이다;

(8): 이 리간드는 하기 친화 컬럼에 결합하여 그로부터 용출된다

블루 세파로즈,

CM 블루 세파로즈,

MONO-Q,

MONO-S,

렌틸 렉틴-세파로즈,

WGA-세파로즈,

Con A-세파로즈,

에테르 650 m 토요펄(toyopearl),

부틸 650 m 토요펄,

페닐 650 m 토요펄, 및

페닐 세파로즈.

보다 바람직한 mpl 리간드 폴리펩티드는 인간 게놈 또는 도1(SEQ ID NO:1)의 아미노산 서열을 가지는 cDNA에 의해 암호화되는 것들이다.

본 발명의 다른 바람직한 천연 발생 생물학적 활성 mpl 리간드 폴리펩티드는 프리프로-mpl 리간드, 프로-mpl 리간드, 성숙한 mpl 리간드, mpl 리간드 절편 및 그의 글리코실화 변형체들이다.

본 발명의 또다른 바람직한 폴리펩티드에는 mpl 리간드 서열 변형체 및 키메라가 포함된다. 통상, 바람직한 mpl 리간드 서열 변형체 및 키메라들은 인간 mpl 리간드 또는 재생불량성 돼지 혈장으로부터 단리된 mpl 리간드와 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 한층더 바람직하게는 85 이상, 훨씬더 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 생물학적으로 활성인 mpl 리간드 변형체이다. 대표적인 바람직한 mpl 리간드 변형체는 N-말단 도메인 hML 변형체이다(에리트로포이에틴과의 서열 상동성으로 인해 "EPO-도메인"으로 불리움). 바람직한 hML EPO 도메인은 hML₁₅₃으로 불리우며, 성숙한 hML의 처음 153개 아미노산 잔기들로 구성된다. 임의로 바람직한 hML 서열 변형체는 C-말단 도메인의 하나 또는 그 이상의 염기성 또는 이염기성 아미노산 잔기가 비염기성 아미노산 잔기(예:소수성, 중성, 산성, 방향족, Gly, Pro 등)로 치환된 것을 포함한다. 바람직한 hML C-말단 도메인 서열 변형체는 Arg 잔기들 153 및 154가 Ala 잔기들로 치환된 것을 포함한다. 이 변형체는 hML₃₃₂(R153A, R154A)로 불리운다. 또다른 바람직한 hML 변형체에는 아미노산 잔기 111 내지 114(QLPP 또는 LPPQ)가 탈락되거나 또는 다른 테트라펩티드 서열(예 AGAG 등)으로 치환된 hML₃₃₂또는 hML₁₅₃이 포함된다. 상기 탈락 돌연변이들은 △4hML₃₃₂또는 △4hML₁₅₃로 불리운다.

바람직한 키메라는 mpl 리간드 또는 그의 절편(아래에 정의)과 이형성 폴리펩티드 또는 그의 절편과의 융합체이다. 예를 들어, hML₁₅₃를 lgG 절편과 융합시켜혈청 반감기를 개선시키거나 또는 IL-3, G-CSF 또는 EPO와 융합시켜 향상된 혈소판 형성 또는 키메릭 조혈 활성을 가진 분자가 된다.

다른 바람직한 인간 mpl 리간드 키메라는 도10(SEQ ID NO:7)에 도시된 바와 같이 대략 나란히 배열되었을때 하나 이상(그러나 전체는 아님)의 인간 EPO hML잔기로 치환된 N-말단의 153 내지 157 hML 잔기를 포함하는 "ML-EPO 도메인 키메라"이다. 이 실시 태양에서, hML 키메라는 인간 EPO 서열의 개별적인 또는 한 블럭의 잔기들이 도10(SEQ ID NO:6)에 도시된 배열에 대응하는 위치에서 hML 서열로 첨가되거나 또는 치환된, 길이가 약 153 내지 166 개 잔기들로 구성된다. hML의 N-말단 부분으로의 대표적인 블럭 서열 삽입예에는 (EPO) 24-27, 38-40 및 83-85 위치에서의 하나 이상의 N-글리코실화 위치; (EPO) 9-22, 59-76, 90-107 및 132-152 위치에서의 하나 이상의 4개의 예상되는 양친매성 α-나선형 다발; 및 N-말단 및 C-말단 영역 및 잔기 위치 (epo) 44-52를 포함한 고도로 보존되는 영역이 포함된다[Wen wt al., blood, 82:1507-1516[1993] 및 Biossel et al., J. Biol. Chem., 268(21):15983-15993[1993] 참조] 이 "ML-EPO 도메인 키메라"가 혼성의 혈소판 형성-적혈구 형성(TEPO) 생물학적 활성을 가질것이라는 것을 알 수 있을 것이다.

본 발명의 다른 바람직한 폴리펩티드에는 재생불량성 돼지 혈장으로부터 단리된 mpl 리간드 또는 본 명세서에 기재된 인간 mpl 리간드(표 14, 실시예 24 참조)의 서열과 동일한 적어도 10, 15, 20, 25, 30 또는 40 아미노산 잔기들을 가지는 연속된 서열을 가지는 mpl 리간드 절편이 포함된다. 바람직한 mpl 리간드 절편은 인간 X가 153, 191, 205, 217, 229 또는 245(1-X의 서열에 대하여는 도1(SEQ IDNO:1 참조)인 인간 ML[1-X]이다. 다른 바람직한 mpl 리간드 절편에는 정제된 이 리간드의 화학적 또는 효소적 가수분해의 산물로서 제조된 것들이 포함된다.

본 발명의 다른 바람직한 측면은 mpl 리간드 분자를 함유하는 mpl 리간드 소스와 고정화 수용체 폴리펩티드, 구체적으로는 mpl 또는 mpl 융합 폴리펩티드를 정제될 mpl 리간드 분자가 이 고정화 수용체 폴리펩티드에 선택적으로 흡착하는 조건하에서 접촉시키고, 이 고정화 지지체를 세척하여 비 흡착 물질을 제거하고, 용출 완충액을 이용하여 고정화 수용체 폴리펩티드로부터 정제될 분자들을 용출시키는 단계들로 구성되는 mpl 리간드 폴리펩티드 정제 방법이다. mpl 리간드를 함유하는 소스가 혈장일 경우 고정화 수용체는 바람직하게는 mpl-lgG융합체이다.

다른 방법에서, mpl 리간드 함유 소스는 배양물 배지 또는 세포 용해물 중의 mpl 리간드의 농도가 혈장 또는 천연 소스에서의 농도보다 높은 재조합 세포 배양물이다. 이 경우, 상기 mpl-lgG 면역 친화성 방법(비록 이용되기는 하지만)은 통상 불필요하여 좀더 전통적이고, 공지의 단백질 정제 방법이 적용될 수 있다. 요컨대, 실질적으로 균질한 mpl 리간드를 제공하는 바람직한 정제 방법은 예를 들어 원심분리 또는 초여과에 의해 숙주 세포 또는 용해된 절편들로부터 입자성 파편을 제거하고, 단백질을 시판되는 단백질 농축 필터로 농축시키고, 면역 친화성, 이온교환(예: DEAE 또는 카르복실메틸 또는 술포프로필기를 함유한 매트릭스), 블루 세파로즈, CM 블루 세파로즈, MONO-Q, MONO-S, 렌틸 렉틴 세파로즈, WGA-세파로즈, Con A-세파로즈, 에테르 토이펄, 부틸 토이펄, 페닐 토이펄, 단백질 A 세파로즈, SDS-PAGE, 역상 HPLC(예: 부착된 지방족기를 가진 실리카겔) 또는 세파덱스 분자체또는 분자 배제 크로마토그래피 및 에탄올 또는 암노늄 술페이트 침전으로부터 선택되는 하나 이상의 단계에 의해 기타 불순물로부터 이 리간드를 분리하는 단계로 이루어져 있다. 메틸술포닐플루오라이드(PMSF)와 같은 프로테아제 억제제가 상기단계 중 어느 한 단계에 포함되어 단백질 분해를 억제할 수 있다.

바람직한 실시 태양에서, 본 발명은 mpl 리간드에 결합할 수 있는 단리된 항체를 제공한다. 바람직한 mpl 리간드 분리 항체는 모노클론성이다(Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497[1975]; Campbell, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Burdon et al.,Eds, volume 13 elsvier science publisers, Amsterdam[1985]; 및 Huse wt al., Science, 246:1275-1281[1989]). 바람직한 mpl 리간드 단리 항체는 mpl 리간드와 약 10⁶l/몰 이상의 친화성으로 결합하는 것이다. 더욱 바람직하게는 약 10⁷l/mole 이상의 친화성으로 결합하는 항체이다. 가장 바람직하게는, 이 항체는 하나 이상의 상기 효과기 기능을 가지는 mpl 리간드에 대하여 제조된다. mpl 리간드에 결합가능한 단리된 항체는 임의로 제2의 폴리펩티드에 융합될 수 있고 항체 또는 그의 융합체는 상기 고정화 mpl 폴리펩티드에 대해 기재한 바와 같이 소스로부터 mpl 리간드를 단리하거나 정제하는데 이용될 수 있다. 이 실시 태양의 추가의 바람직한 측면에서, 본 발명은 mpl 리간드를 함유하는 것으로 의심되는 샘플, 특히 혈청 샘플과 상기 항체를 접촉시킨 후, 결합을 발생시켜 검출하는 단계로 구성된 시험관내 또는 생체내 mpl 리간드 검출 방법을 제공한다.

추가의 바람직한 실시 태양에서, 본 발명은 핵산이 검출 가능한 부분으로 표지되거나 또는 표지되지 않으며 mpl 리간드 또는 그의 절편을 암호화하는 핵산 분자 및 mpl 리간드를 암호화하는 서열을 가진 핵산 분자와 상보적이거나 또는 심하거나 또는 중간 정도의 가혹 조건하에서 혼성화할 수 있는 서열을 가진 핵산 분자를 제공한다. 바람직한 mpl 리간드는 인간 mpl 리간드와 75%이상, 더욱 바람직하게는 80%이상, 한층더 바람직하게는 85% 이상, 훨씬더 바람직하게는 90% 이상 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 생물학적으로 활성인 mpl 리간드를 암호화 하는 RNA 또는 DNA이다. 더욱 바람직한 단리 핵산 분자는 (a): 포유류 mpl 리간드 유전자의 코딩 영역상에 기초한 DNA(예:도1(SEQ ID NO:2)에 제공된 뉴클레오티드 서열로 구성된 DNA 또는 그의 절편); (b) 중간 정도의 가혹 조건 이상에서 상기(a)의 DNA와 혼성화할 수 있는 DNA; 및 (c) 유전자 코드의 축퇴로 인하여 (a) 또는 (b)에서 정의된 DNA로 축퇴되는 DNA로부터 선택되는, 생물학적으로 활성인 mpl 리간드를 암호화하는 DNA 서열이다. 본 명세서에 기재된 신규 mpl 리간드가 적당한 서열 동일성을 가지는 리간드 또는 시토킨과의 일원이어서 이들의 DNA가 도1(SEQ ID NO:2)의 DNA(또는 그의 상보체 또는 그의 절편)와 하등도 또는 중간 정도의 가혹 조건하에서 혼성화할 것이라는 것을 알 수 있다. 이로서 본 발명의 또다른 측면에는 mpl 리간드 폴리펩티드를 암호화하는 DNA와 하등도 또는 중간 정도의 가혹 조건 하에서 혼성화하는 DNA가 포함된다.

본 발명의 추가의 바람직한 실시 태양에서, 핵산 분자는 mpl 리간드를 암호화하는 cDNA이고, 추가로 복제 가능한 벡터로 감염된 숙주에 의해 인식되는 조절서열에 기능가능하게 연결된 상기 cDNA를 함유하는 복제 가능한 벡터를 포함한다. 이 측면은 추가로 복제 가능한 벡터로 감염된 숙주 세포를 포함하며 mpl 리간드를 암호화하는 cDNA를 감염된 숙주 세포의 배양물 내에서 발현시켜 이 숙주 세포 배양물로부터 mpl 리간드를 회수하는 것으로 이루어진, mpl 리간드 제조에 상기 cDNA를 이용하는 방법을 포함한다. 이런 방법으로 제조된 mpl 리간드는 바람직하게는 실질적으로 균질한 인간 mpl 리간드이다. mpl 리간드를 제조하기 위해 바람직한 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난(CHO)세포이다.

본 발명은 추가로 치료학적으로 유효한 양의 mpl 리간드를 포유류에 투여하는 것으로 이루어진, 면역 또는 조혈계 질환, 특히 혈소판 감소증을 지니는 포유류를 치료하는 바람직한 방법을 포함한다. 임의로 이 mpl 리간드는 시토킨, 특히 집락 자극 인자 또는 인터로이킨과 병용하여 투여될 수 있다. 바람직한 집락 자극 인자 또는 인터로이킨에는 키트-리간드,LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 또는 IL-11가 있다.

III, 제조 방법

혈소판 생산은 오래동안 일부 권위자들에 의해 다중 계통 특이성 체액 인자에 의해 조절되는 것으로 생각되었다. 거핵구 집락 자극 인자(meg-CSF) 및 트롬보포이에틴으로 불리우는, 두개의 별도의 시토킨 활성체가 거핵구 형성 및 혈소판 형성을 조절하는 것으로 생각되었다(Williams et al., J. Cell Phisiol. 110:101-104[1982]; Williams et al., Blood. Cells 15:123-133[1989]; 및 Gordon et al., Blood, 80:302-307[0992]). 이 가설에 따르면, meg-CSF는 거핵구 세포의 조상세포의 증식을 자극하며 트롬보포이에틴은 주로 좀더 분화된 세포의 성숙 및 최종적 혈소판 유리에 영향을 준다. 1960년대 이후로 동물 및 인간의 혈소판 감소증 발생이후의 혈장, 혈청 및 뇨에서의 meg-CSF 및 트롬보포이에틴 활성의 유도 및 출현에 대한 보고가 많았다[Odell et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 108:428-431[1961];[Nakeff et al., Acta Haematol. 54:340-344[1975]; [Specter, Proc. Soc. Exp. Biol. 108:146-149[1961]; [Schreiner et al., J. Clin. Invest. 49:1709-1713[1970]; Ebbe, Blood, 44:605-608[1974]; Hoffman et al., N. Engl. H. Med., 305:553[1981]; Straneva et al., Exp. Hematol. 17:1122-1127[1988]; Mazur et al., Exp. Hematol. 13:1164[1974]; Mazur et al., J.Clin,Invest. 68:733-741[1981]; Sceiner et al., Blood, 56:183-188[1980]; Hill et al., Exp. Hematol., 20:354-360 [1992]; 및 Heygi et al., Int. J. Cell Cloning, 8:236-244[1990]. 이들 활성들은 계통 특이적이며 공지된 시토킨과 구별되는 것으로 보고되었다[Hill R.J. et al., Blood 80:346(1992); Erickson-Miller C.L.et al., Brit, J, Heamatol., 84:197-203(1993); Straneva J.E. et al., Exp. Hematol. 20:4750(1992): 및 Tsukada J. et al., Blood 81:866-867[1993]). 아직까지, 혈소판 감소증의 혈장 또는 뇨로부터 meg-CSF 또는 트롬보포이에틴을 정제하려는 시도는 성공적이지 못했다.

혈소판 감소증의 혈장에 대한 상기 관찰과 관련하여, 본 발명자들은 조사된 돼지로부터 얻은 재생 불량성 돼지 혈장(APP)이 시험관 내에서 인간 거핵구 형성을 자극한다는 사실을 발견하였다. 본 발명자들은 이 자극 활성이 c-mpl의 가용성 세포외 도메인에 의해 파괴되어, 추정상의 mpl 리간드(ML)의 잠재적 소스로서의 APP를 확인하게 해준다. 본 발명자들은 이제 APP로부터 mpl 리간드를 성공적으로 정제하였고 아미노산 정보는 쥐, 돼지 및 인간 ML cDNA를 단리하는데 이용하였다. 이들 ML들은 에리트로포이에틴과 서열 상동성을 가지며 meg-CSF 및 트롬보포이에틴 유사 활성을 가진다.

1. 혈장으로부터의 mpl 리간드의 정제 및 동정

상기 제시된 바와 같이, 다양한 종으로부터의 재생 불량성 혈장은 시험관내에서 조혈을 자극하는 활성을 가지나, 아직 어떠한 조혈 자극 인자도 혈장으로부터 단리된 것으로 보고되지 않았다. 이 재생 불량성 돼지 혈장(APP)은 시험관내에서 인간의 조혈을 자극한다. APP가 mpl 리간드를 함유하는지를 결정하기 위해, 도2에 도시한 바와 같은 방법으로 인간 mpl P(Ba/F3-mpl)로 감염된 Ba/F3 세포로의³H-티미딘의 삽입을 측정함으로서 그의 효과를 분석하였다. APP는 Ba/F3 mpl 세포로의³H-티미딘의 삽입을 자극하였지만 Ba/F3 대조구 세포(즉: 인간 mpl P로 감염되지 않은 세포)에서는 자극하지 않았다. 또한, 정상 돼지 혈장에서는 이러한 활성이 관찰되지 않았다. 이러한 결과들은 APP가 mpl 수용체를 통해 증식 신호를 전달하며 그러므로 이 수용체의 천연 리간드일 수 있는 인자 또는 리간드들을 함유한다는 것을 보여준다. 이는 또한 APP를 가용성 mpl-IgG로 처리하면 APP의 Ba/F3 세포에 대한 자극 영향이 차단된다는 발견에 의해 뒷받침되었다.

APP 내의 활성체는, 프로나제, DTT 또는 열이 APP중의 활성을 파괴하는 사실로 보아 단백질인 것으로 보였다. 이 활성체는 또한 투석불가능하다. 그러나 이 활성체는 낮은 pH(2 시간 동안 pH 2.5)에서 안정하며 몇개의 렉틴 친화 컬럼에 결합하여 용출함으로서 이것이 당단백이라는 것을 나타내었다. 추가로 이 활성체의 구조 및 정체를 밝히기 위해 mpl-IgG키메라를 이용하여 APP로부터 친화 정제되었다.

APP는 실시예 1 및 2에 제시된 프로토콜에 따라 처리되었다. 요컨대, mpl 리간드를 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 고정화 염료 크로마토그래피 및 mpl 친화 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 각 단계로부터의 활성체의 회수는 도4에 도시하였으며 폴드 정제는 표1에 제공한다. mpl-친화 컬럼으로부터의 활성체의 전체적 회수량은 약 10%이다. mpl 친화 컬럼으로 부터의 피크 활성체 분획(F6)은 약 9.8 x 10⁶유니트/mg의 추정 비활성(specific activity)을 가진다. APP 5리터의 전체적 정제는 단백질이 83 x 10⁶-배 감소한 가운데(250 gms 내지 3 μg) 약 4 x 10⁶배( 0.8 유니트/mg 내지 3.3 x 10⁶유니트/mg)이었다. 본 발명자들은 mpl 친화 컬럼으로부터 용출된 리간드의 비활성이 3x10⁶units/mg 이하일 것으로 추정하였다.

샘플	용적(ml)	단백질mg/ml	유니트/ml	유니트	비활성유니트/mg	수율 %	정제 배수
APP	5000	50	40	200,000	0.8	-	1
페닐	4700	0.8	40	200,000	50	94	62
블루-세파로즈	640	0.93	400	256,000	430	128	538
mpl(μl)	12	5x10-4	1666	20,000	3,300,000	10	4,100,000

단백질은 브래드포드 분석에 의해 결정하였다. mpl 용출 분획 5 내지 7의 단백질 농도는 은으로 염색된 SDS-겔의 염색 강도에 기초한 추정치이다. 1 유니트는 Ba/F3-mpl 세포 증식의 최대 자극량의 50%를 유발하는 값으로 정의한다.

환원 조건하에 진행되는 SDS-PAGE(4 내지 20%, Novex 겔)을 이용한 mpl 친화 컬럼으로부터의 용출 분획의 분석에 의해 몇몇 단백질이 존재함이 밝혀졌다(도5). 가장 강한 강도로 은 염색된 단백질은 66000, 55000, 30000, 28000 및 18000-22000의 겉보기 Mr와 나란하게 분할되었다. Ba/F3-mpl 세포 배양물의 증식을 자극하는 단백질이 어느 것인가를 결정하기 위해, 이 단백질들을 실시예 2에 기재된 바와 같이 겔로부터 용출시켰다.

이 실험의 결과에 따르면, 대부분의 활성체가 Mr이 28000 내지 32000인 단백질들이 포함된 겔 조각으로부터 용출되며 좀더 소량의 활성체가 겔의 18000-22000 영역에서 용출된다(도6). 이 영역 내에서 관찰 가능한 유일한 단백질들은 Mr이 30000, 28000 및 18000-22000이다. 겔의 이 영역에서 분할하는 단백질들(예: 30, 28 및 18-22 kDa에서의 밴드)의 단백질 서열을 동정 및 얻기 위하여, 이들 3종의 단백질들을 실시예 3에 기재된 바와 같이 PVDF에 전기 블로팅하고 서열 규명하였다. 얻어진 아미노 말단 서열을 표2에 제시한다.

30 kDa1 5 10 15 20 25(S)PAPPA(C)DPRLLNKLLRDD(H/S)VLH(G)RL	(SEQ ID NO:30)
28 kDa1 5 10 15 20 25(S)PAPPAXDPRLLNKLLRDD(H)VL(H)GR	(SEQ ID NO:31)
18-22 kDa1 5 10XPAPPAXDPRLX(N)(K)	(SEQ ID NO:32)

컴퓨터 보조 분석에 따르면 이들 아미노산 서열들은 신규하다. 이 세 서열들이 동일했기 때문에, 30 kDa, 28 kDa 및 18-22 kDa 단백질들은 서로 연관되어 있으며, 동일한 신규 단백질의 상이한 형태일 수 있다고 믿어졌다. 또한, 활성체가 SDS-PAGE의 4-20% 겔의 동일 영역(28000-32000)에서 분할되었기 때문에 이 단백질(들)은 천연 mpl 리간드의 후보일 가능성이 있었다. 또한, 수퍼로즈 12(파마시아) 컬럼을 이용한 겔 여과 크로마토그래피하였을 때, 부분적으로 정제된 리간드는 17000 내지 30000의 Mr과 함께 이동하였다. 상기 리간드의 상이한 Mr 양상은 단백질 분해 또는 글리코실화 차이 또는 기타 후번역 또는 전 번역 개질의 결과인 것으로 믿어진다.

상기한 바와 같이, 항감작 인간 mpl RNA는 CD 34⁺조상세포가 강화된 인간 골수 배양물에서 거핵구 형성을 저지하나 기타 조혈 세포 계통의 분화에는 영향을 미치지 않는다(Methia et al., supra). 이 결과는 이 mpl 수용체가 시험관내 거핵구 분화 및 증식에 모종의 역할을 한다는 것을 암시한다. 거핵구 형성에 있어서의 mpl 리간드의 기능을 좀더 규명하기 위하여, APP 및 mpl 리간드를 제거시킨 APP의 시험관 내에서의 인간 거핵구 형성에의 영향력을 비교하였다. 인간 거핵구 형성에 대한 APP의 영향은 실시예 4에 기재된 바와 같이 액체 현탁액 거핵구 형성 분석의 한 변형법을 이용하여 측정하였다. 이 분석에서, 인간 말초 간세포(PSC)를 mpl-IgG 친화 크로마토그래피 전후에 APP로 처리하였다. 거핵구 형성의 GPII_bIII_a자극은¹²⁵I-항-II_bIII_a항체를 이용하여 정량하였다(도7). 도7에 도시된 바와 같이, 10% APP는 약 3배의 자극 효과를 유발할 수 있었는데 반해 mpl리간드를 제거한 APP는 아무런 효과를 가지지 못했다. 실질적으로, mpl리간드가 제거된 APP는 Ba/F3-mpl 세포들의 증식을 유도하지 못했다.

다른 실험에서, 가용성 인간 mpl-IgG를 10% APP를 함유하는 배양물에 0, 2 및 4일째에 가했더니 이는 인간 거핵구 형성에 대한 APP의 자극 효과를 파괴시켰다(도8). 이러한 결과들은 mpl 리간드는 인간 거핵구 형성의 조절 기능을 하며 따라서 혈소판 감소증의 치료에 유용할 수 있다는 것을 암시한다.

2. mpl 리간드의 분자 클로닝

30 kDa, 28 kDa 및 18-22 kDa 단백질로부터 얻어진 아미노 말단 아미노산 서열에 근거하여, 2개의 축퇴 올리고뉴클레오티드 프리머 풀을 계획하고 돼지 게놈 DNA를 PCR에 의해 증량하는데 이용하였다. 아미노 말단 아미노산 서열이 단 하나의 엑손에 의해 암호화할 경우 올바른 PCR 생성물은 길이가 69 bp일 것이 추정되었다. 이 크기의 DNA 절편이 발견되었으며 pGEMT로 서브클로닝되었다. 올리고뉴클레오티드 PCR 프리머의 서열 및 얻어진 세개의 클론을 실시예 5에 제시한다. PCR 프리머 사이에 암호화된 펩티드의 아미노산 서열(PRLLNKLLR[SEQ ID NO:33])은 돼지리간드의 아미노 말단 단백질 서열 규명에 의해 얻어진 서열과 동일하였다(상기 28 및 30 kDa 돼지 단백질의 9-17잔기 참조).

PCR 절편의 서열에 근거한 합성 올리고뉴클레오티드는 인간 게놈 DNA 라이브러리를 검색하는데 이용된다. pR45로 지칭되는 45량체 올리고뉴클레오티드를 PCR 절편의 서열에 근거하여 계획 및 합성하였다. 이 올리고뉴클레오티드는 하기 서열을 가졌다:

5'GCC-GTG-AAG-GAC-GTG-GTC-GTC-ACG-AAG-CAG-TTT-ATT-TAG-GAG-TCG-3'

(SEQ ID NO:34)

이 데옥시올리고뉴클레오티드는 실시예 6의 하등도 가혹 혼성 및 세척 조건하에서 λgem12 중에서 인간 게놈 DNA 라이브러리를 검색하는데 이용되었다. 양성 클론을 취하고 플레이크 정제한 후 제한 맵핑 및 서던 블로팅으로 분석하였다. 상기 45량체에 혼성화하는 390 bp의 EcoRI-XbaI 절편을 pBluescript SK-로 서브클로닝하였다. 이 클론의 DNA의 서열 규명 결과 돼지 mpl 리간드의 인간 상동체를 암호화하는 DNA가 단리되었다는 것을 확인시켜 주었다. 이 인간 DNA 서열 및 연역된 아미노산 서열을 도9(SEQ ID NO:3 & 4)에 보여준다. 게놈 서열중에서의 예상 인트론 위치도 또한 화살표로 나타내었으며 추정되는 엑손("엑손3")을 정하였다.

인간 "엑손 3" 서열(실시예 6)에 근거하여, 엑손 서열의 3' 및 5'말단에 해당하는 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 이러한 2개의 프리머를 다양한 인간 조직으로부터 제조된 cDNA를 이용하는 주형으로서 PCR 반응에 이용하였다. 올바른 PCR 생성물의 예상 크기는 140 bp였다. 12% 폴리아크릴아미드 겔상에서의 PCR 생성물에 대한 분석후, 예상되는 크기의 DNA 절편을 인간 성인 신장, 293 태아 신장 세포로부터 제조된 cDNA 라이브러리 및 인간 태아 간으로부터 제조된 cDNA 중에서검출하였다.

람다 DR2에서의 태아 간 cDNA 라이브러리(7×10⁶클론)를 인간 게놈 라이브러리 및 하등도의 가혹 조건하에서 태아 간 cDNA 라이브러리를 검색하는데 이용했던 45-mer 올리고뉴클레오티드를 이용하여 검색하였다. 양성 클론을 취하고, 플레이크를 정제하고 PCR을 이용하여 삽입 크기를 결정하였다. 1.8 kb 삽입물을 가진 클론을 후속 분석을 위해 선별하였다. 실시예 7에 기재된 방법을 이용하여 인간 mpl 리간드(hML)의 뉴클레오티드 및 연역된 아미노산 서열을 얻었다. 이들 서열을 도1(SEQ ID NO:1 & 2)에 제시하였다.

3, 인간 mpl 리간드(hML)의 구조

인간 mpl 리간드(hML) cDNA 서열(도1[SEQ ID NO:2])은 1774개의 뉴클레오티드로 구성되며 그 뒤에 폴리(A) 테일이 있다. 이것은 215 개 뉴클레오티드의 5' 미번역 서열 및 498 개 뉴클레오티드의 3' 미번역 영역을 표현한다. 뉴클레오티드 위치(216-218)에서의 추정 개시 코돈은 진핵 세포성 번역 개시에 적합한 일치 서열내에 있다. 개방된 판독 프레임은 길이가 1059 뉴클레오티드이고 뉴클레오티드위치 220에서 시작하여 353개 아미노산 잔기 폴리펩티드를 암호화한다. 예상 아미노산 서열의 N-말단은 매우 소수성이며 아마도 신호 폴리펩티드에 해당하는 것으로 보인다. 예상 아미노산 서열의 컴퓨터 분석은(von Heijne et al., Eur. J.Biochem., 133:17-21[1983]) 잔기 21과 22 사이가 신호 펩티다제의 잠재적 절단 위치라는 것을 나타낸다. 이 위치에서의 절단에 의해 돼지 혈장으로부터 정제된 mpl 리간드로부터 얻어진 아미노 말단 서열로부터 시작되는 332 아미노산 잔기의 성숙한 폴리펩티드가 형성된다. 이 332 개 아미노산 잔기 리간드의 예상되는 비-글리코실화 분자량은 약 38 kDa이다. 6개의 잠재적인 N-글리코실화 부위 및 4개의 시스테인 잔기가 있다.

mpl 리간드 서열을 진뱅크(Genbank) 서열 데이타베이스와 비교한 결과 성숙한 인간 mpl 리간드 및 인간 에리트로포이에틴의 아미노 말단 153개 잔기가 23%의 동일성을 보인다는 것이 밝혀졌다(도10:[SEQ ID NO:6 & 7]). 보존적 치환기도 고려할 경우, hML의 이 영역은 인간 에리트로포이에틴(hEPO)와 50% 유사성을 보인다. hEPO 및 hML 모두 4개의 시스테인을 함유한다. 4개의 시스테인 중 3개(첫번째 및 마지막 시스테인 포함)는 hML중에서 보존된다. 위치 지향 돌연변이 발생 실험결과에리트로포이에틴의 첫번째 및 마지막 시스테인이 기능에 필요한 이황화 결합을 형성한다(Wang F.F.et al., Endocrinology 116:2286-2292[1983]). 마찬가지로, hML의 첫째 및 마지막 시스테인도 또한 중요한 이황화 결합을 형성한다. 글리코실화 위치중 어느 것도 hML내에서 보존되지 않는다. 모든 잠재적인 hML N-결합 글리코실화 위치는 hML 폴리펩티드의 카르복시 말단쪽 절반에 위치한다.

hEPO와 마찬가지로, hML mRNA는 일치 폴리아데닐화 서열 AAUAAA를 함유하지도 않으며, 많은 시토킨의 3' 미번역 영역에 존재하며 mRNA 안정성에 영향을 미친다고 생각되는 조절 요소 AUUUA도 가지지 않는다(Shawet et al., Cell, 46:659-667[1986]). 노던 블로트 분석에 의해 태아 및 성인 간 내에서 단일 1.8 kb hML RNA의 농도가 낮음이 밝혀졌다. 장기간의 노출후에는, 동일한 크기의 더 약한 밴드가 성인 간내에서 검출된다. 반면, 인간 에리트로포이에틴은 태아 간에서 그리고 저산소증에 대해, 성인 신장 및 간내에서 발현된다(Jacobs et al., Nature, 313:804-809[1985] 및 Bondurant et al., Molec. Cell. Biol., 6:2731-2733[1986]).

hML의 C-말단 영역의 중요성은 아직 충분히 규명되지 못하였다. N-결합 글리코실화의 6개의 잠재적 부위의 존재 사실에 근거하여, hML의 이 영역이 글리코실화될 것으로 보인다. 몇몇 겔 용출 실험에서, 전길이의 글리코실화 분자임을 나타내는 약 60000의 Mr과 함께 분할하는 활성체를 관찰하였다. 그러므로 C-말단 영역은 순환하는 hML을 안정화시켜 그의 반감기를 증가시키는 역할을 할 수 있다. 에리트로포이에틴의 경우, 비 글리코실화 형태는 완전한 시험관내 생물학적 활성을 가지나 글리코실화 에리트로포이에틴에 비하여 상당히 감소된 혈장내 반감기를 가진다(Takeuchi et al., J. Biol. Chem., 265:12127-12130[1990]; Narhi et al., J. Biol. Chem., 266:23022-23026[1991] 및 Spivak et al., Blood, 7:90-99[1989]). hML의 C-말단 도메인은 잠재적인 프로세싱 위치 역할을 할 수 있는 2개의 이염기성 아미노산 서열[153-154 및 245-246 위치의 Arg-Arg 모티프]을 포함한다. 이들 부위에서의 절단은 APP로부터 단리되는 ML의 30, 28 및 18-22 kDa 형태의 생산에 관여하는 것으로 보인다. 실질적으로, Arg₁₅₃-Arg₁₅₄서열은 ML의 에리트로포이에틴 유사 도메인 바로 직후에 이어진다. 이러한 관찰 사항으로부터 제한된 단백질 분해를 거쳐 전길이 ML이 성숙한 리간드를 형성하는 선구 단백질을 나타낸다는 것을 암시한다.

4. 인간 mpl 리간드의 이소폼 및 변형체들

인간 mpl 리간드의 이소폼 또는 다른 방법으로 스플라이싱된 형태는 인간 성인 간 중에서 PCR에 의해 검출되었다. 요컨대, 프리머들을 hML의 코딩 서열의 선택된 내부 영역뿐 아니라 양단부에 대응하도록 합성하였다. 이들 프리머들을 실시예 10에 기재된 대로 인간 성인의 간의 RNA를 증량하기 위해 RT-PCR에서 이용하였다. hML로 나타내는 전길이 형태, hML2, hML3 및 hML4로 나타내는 3개의 다른 형태가 관찰되었거나 연역되었다. 모든 4개의 이소폼의 성숙한 연역 아미노산 서열은 도11에 제시하였다(SEQ ID NO:6, 8, 9 & 10). hML3은 700 위치에서 116 뉴클레오티드가 탈락되어 아미노산 탈락 및 프레임쉬프트를 유발한다. 이제 cDNA는 길이가 265 아미노산이고 139 아미노산 잔기에서 hML 서열과 차이를 보이는 성숙한 폴리펩티드를 암호화한다. 마지막으로 hML4는 hML3에서 관찰되는 618 뉴클레오티드 위치 이후에서의 12 뉴클레오티드 탈락(마우스 및 피그 서열(아래 참조)에서도 관찰됨) 및 116 bp 탈락을 보인다. (619 뉴클레오티드 위치 이후에서의) 12 bp 탈락 현상을 보이는 클론이 인간(hML2으로 표시)의 경우 아직 단리되지는 않았지만, 이러한 이소폼이 마우스 및 피그(아래 참조)에서 동정되었으며, hML4에서의 뉴클레오티드 탈락과 관련되어 동정되었으므로 이 형태는 존재할 것이다.

전길이 ML이 생물학적 활성에 필요한지를 결정하기 위해 이염기성 Arg₁₅₃-Arg₁₅₄서열이 2개의 알라닌 잔기로 치환된 hML 및 hML의 "EPO 도메인" 절융형을 제조하였다. hML(R153A, R154A)로 불리우는, Arg₁₅₃-Arg₁₅₄이염기성 서열 치환 변형체를 실시예 10에 기재된 대로 PCR을 이용하여 제조하였다. "EPO 도메인" 절융형, hML₁₅₃도 또한 Arg153 이후의 중지 코돈을 도입함으로써 PCR을 이용하여 제조하였다.

5. 일시적으로 감염된 인간 배아 신장(293) 세포내의 재조합 인간 mpl 리간드(rhML)의 발현

클로닝된 인간 cDNA가 mpl 리간드를 암호화한다는 것을 확인하기 위하여, 이 리간드를 발현 벡터 pRK5-hML 또는 pRK5-hML₁₅₃를 이용하여 시토메갈로바이러스 중간 초기 프로모터의 조절 하에 포유류의 293 세포중에서 발현시켰다. 일시적으로 감염된 인간 배아 신장 293 세포로부터의 상등액이 Ba/F3-mpl 세포 중에서³H-티미딘 삽입을 자극하지만, 조상 Ba/F3 세포 중에서는 자극하지 않는다는 것이 발견되었다. pRK 벡터 단독에 의해서만 감염된 293 세포로부터의 배양물은 이 활성을 가지지 않았다. 배지에 mpl-IgG를 첨가하면 이 활성이 제거되었다(데이타는 제시하지 않음). 이 결과로부터 클론된 cDNA가 기능가능한 인간 ML(hML)를 암호화한다는 것을 나타낸다.

"EPO-도메인"만이 mpl과 결합하여 활성화하는지를 결정하기 위해, hML,rhML₁₅₃의 절융형을 293 세포 중에서 발현시켰다. 감염된 세포로부터의 상등액은 전길이 hML(도12a)를 발현시키는 세포로부터의 상등액에 존재하는 활성과 유사한 활성을 가짐이 발견되어, ML의 C-말단이 c-mpl의 결합 및 활성화에 필요하지 않다는 것이 밝혀졌다.

6. mpl 리간드는 거핵구 형성 및 혈소판 형성을 자극한다

전길이 rhML 및 재조합 hML의 절융형 rhML₁₅₃형 모두 시험관내에서 인간 거핵구 형성을 자극하였다(제 12B도). 이 효과는 다른 외인적으로 가해진 조혈 성장 인자가 부재한 중에서도 관찰되었다. IL-3을 제외하고는, 상기 ML은 이러한 활성을 보이는 유일한 피험 조혈 성장 인자이다. IL-11, IL-6, IL-1, 에리트로포이에틴, G-CSF, IL-9, LIF, 키트 리간드(KL), M-CSF, OSM 및 GM-CSF는 별도로 본 분석에서 시험되었을때, 거핵구 형성에 영향을 미치지 않았다(데이타는 제시하지 않음). 이 결과는 상기 ML이 거핵구 자극 활성을 가지며, 거핵구 형성을 조절하는데 있어서의 ML의 역할을 나타낸다.

혈소판 감소증 동물의 혈장에 존재하는 혈소판 형성 활성체들은 마우스 반사 혈소판 형성 분석에서 혈소판 생산을 자극하는 것으로 보인다(McDonald, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 14:1006-1001[1973] 및 MecDonald et al., Scand. J. haematol., 16 326-334[1976]). 이 모델에서, 마우스를 항혈소판 혈청을 이용하여 급성으로 혈소판 감소증으로 만들어 예측가능한 반사 혈소판 감소증을 일으킨다. 후저산소증 마우스가 정상 마우스보다 에리트로포이에틴에 더 민감한 것처럼 이러한 면역 트롬보사이테믹 마우스는 정상적인 마우스보다 외인성 트롬보포이에틴 유사 활성에 더 잘 반응한다(McDonald, et al., J. Lab. Clin. Med., 77:134-143[1971]). rML이 생체내에서 혈소판 생산을 자극하는지를 결정하기 위하여, 반사 혈소판 감소증 상태에 있는 마우스에 부분적으로 정제된 rhML을 주사하였다. 혈소판 수 및 혈소판으로의³⁵S삽입 정도를 정량하였다. 마우스에 rML을 64000 또는 32000 유니트를 주사할 경우, 혈소판 생산이 유의하게 증가하는데, 이에 대한 증거로는 처리 마우스에 대한 부형제만을 주사한 대조구 마우스 비교에서 혈소판 수가 20% 까지 증가하고(p=0.0005 및 0.0001 각각) 혈소판으로의³⁵S의 삽입 정도가 40% 까지 증가한 점이다(도12c). 자극량의 이 수준은 이 모델에서의 IL-6의 경우에서 관찰되는 것과 필적할 만한 것이다(데이타는 제시하지 않음). rML을 16000 유니트 처리할 경우에는 유의하게 혈소판 생산을 자극하지는 않았다. 이들 결과로서 ML이 투여량 의존성으로 혈소판 생산을 자극하며 그러므로 트롬보포이에틴 유사 활성을 가진다는 것을 알 수 있다.

293 세포들도 또한 상기 기타 hML 이소폼 구성물로 감염되며 그 상등액들은 Ba/F3-mpl 증식 분석(제 13도)을 이용하여 분석되었다. hML2 및 hML3은 이 분석에서 아무런 검출 가능한 활성을 보이지 않았으나, hML(R153A, R154A)의 활성은 hML 및 hML₁₅₃과 유사하여 Arg₁₅₃-Arg₁₅₄이염기성 위치에서의 프로세싱은 필요하지도 않을 뿐더러 활성을 손상시키지도 않는다는 것을 나타낸다.

7. 거핵구 형성 및 mpl 리간드

거핵구 형성은 다중의 세포 수준에서 조절되는 것으로 제안되었다(Williams et al., J. Cell Phisiol., 110:101-104[1982] 및 Williams et al., Blood Cells, 15:123-133[1989]). 이 제안은 다른 조혈 성장 인자들이 거핵구의 성숙에 주로 영향을 미치는 것으로 보이는 데 반해, 특정 조혈 성장 인자가 거핵구 증식을 자극한다는 관찰에 주로 근거한다. 본 명세서에 제시된 이 결과는 ML이 증식 및 성숙 인자의 역할을 한다는 것을 암시한다. ML이 거핵구 조상세포의 증식을 자극한다는 것은 일련의 증거에 의해 뒷받침된다. 첫째, APP는 시험관내에서 인간 거핵구의 증식 및 성숙을 자극하며 이 자극은 mpl-IgG에 의해 완전히 억제된다(제 7 및 8도). 또한, c-mpl 항감작 올리고뉴클레오티드에 의한 거핵구 집락 형성의 억제(Methia et al., EMBO, 12:2645-2653[1993]) 및 c-mpl이 자신으로 감염된 세포내로 증식 신호를 전달할 수 있다는 발견(Skoda et., EMBO, 12:2645-2653[1993] 및 Vigon et al., Oncogene, 8:2607-2615[1993])도 또한 ML이 증식을 자극한다는 것을 암시한다. 거핵구 분화의 모든 단계 중에 c-mpl의 겉보기 발현(Methia et al., Blood, 82:1395-1401[1993]) 및 재조합 ML의 생체내에서 신속히 혈소판 생산을 자극할 수 있는 능력은 ML이 성숙에도 영향을 미침을 나타낸다. 재조합 ML은 구하기가 쉬워서 기타 조혈 계통에 영향을 미치는 그의 잠재성뿐 아니라 거핵구 형성 및 혈소판 형성의 조절에 있어서의 그의 역할을 면밀히 평가할 수 있다.

8. 인간 mpl 리간드(TPO) 유전자의 단리

TPO 유전자의 인간 게놈 DNA 클론을 pR45를 가진 λ-Gem12중의 인간 게놈 라이브러리를 mpl 리간드를 코딩하는 인간 cDNA의 3' 절반에 해당하는 절편을 이용하여 저조하게 가혹 조건 또는 고도로 가혹 조건하에 검색함으로써 단리하였다. 35 kb에 이르는 2개의 중복되는 람다 클론을 단리하였다. 전체적인 TPO 유전자를 함유하는 2개의 중복되는 절편(BamH1 및 EcoRI)을 서브클로닝하고 서열규명하였다(도14a, 14b 및 14c).

인간 유전자의 구조는 7 kb의 게놈 DNA내의 6개의 엑손으로 구성되어 있다. 모든 엑소/인트론의 연결 부위는 포유류 유전자에 대해 정해진 일치 모티프와 일치한다(Shapiro, M. B. et al., Nucl. Acids Res. 15:7155[1987]). 엑손 1 및 엑손 2는 5' 미번역 서열 및 신호 펩티드의 처음 4개의 아미노산을 포함한다. 이 분비 신호의 나머지 부분 및 성숙한 단백질의 처음 26 아미노산은 엑손 3내에 암호화되어 있다. 이 에리트로포이에틴 유사 도메인의 전체적인 50 까지의 아미노산 및 카르복실 도메인 및 3' 미번역 부분은 엑손 6내에 암호화되어 있다. hML-2(hTPO-2)내에서 관찰되는 탈락에 관련된 4개의 아미노산은 엑손6의 5' 말단에 암호화되어 있다.

서던 블로트에 의한 인간 게놈 DNA 분석에 의하면 TPO의 유전자는 단일 카피로서 존재한다. 이 유전자의 염색체내 위치는 형광 반응기내 혼성화(FISH)에 의해 결정되어 유전자 지도에 3q27-28로 위치되었다.

9. 293 세포로부터의 TPO의 발현 및 정제

293 세포로부터의 ML 또는 TPO 의 제조 및 정제는 실시예 19에 상세하게 기재되어 있다. 요컨대, TPO 전체 개방 판독 프레임에 대응하는 cDNA를 pRK5-hmpl 1을 이용하여 PCR에 의해 제조하였다. 이 PCR 생성물을 정제하고 플라즈미드pRK5tkneo(티미딘 키나제 프로모터의 조절 아래 네오마이신 내성 유전자를 발현시키도록 개질된 pRK5 유도 벡터)의 제한 위치 Clal와 Xbal 사이에서 클로닝되어 벡터 pRK5tkneo.ORF(전체 개방 판독 프레임 코딩 벡터)를 얻었다.

EPO 상동 도메인을 암호화하는 또다른 벡터는 위와 동일한 방법으로 실험하되 단,상이한 PCR 프리머를 이용하여 pRK5-tkneoEPO-D라고 불리우는 최종 생성물을 얻었다.

이들 두 생성물은 CaPO₄법에 의해 인간 배아 신장 세포로 감염시키고 네오마이신 내성 클론을 선택하여 성장시켜 군락을 이루도록 하였다. 이들 클론들로부터의 조건화된 배양물 내의 ML₁₅₃또는 ML₃₃₂의 발현은 Ba/F3-mpl 증식 분석을 이용하여 평가되었다.

rhML₃₃₂의 정제는 실시예 19에 기재된 바와 같이 수행하였다. 요컨대, 293-rhML₃₃₂조건화 배지를 블루-세파로즈(파마시아) 컬럼에 가하고 이어서 2M 우레아를 함유하는 완충액으로 세척하였다. 이 컬럼을 2M 우레아 및 1 M NaCl을 함유하는 완충액으로 용출시켰다. 블루 세파로즈 용출 풀을 바로 이어서 WGA-세파로즈 컬럼에 가하고 2M 우레아 및 1 M NaCl을 함유하는 컬럼 용량 10배 량의 완충액으로 세척하고 0.5 M N-아세틸-D-글루코즈아민을 함유하는 위와 동일한 완충액으로 용출시켰다. WGA-세파로즈 용출물을 C4-HPLC 컬럼(Synchrom, Inc.)에 가하고 불연속적 프로판올 구배를 이용하여 용출시켰다. SDS-PAGE를 이용하여, 정제된 293-rhML₃₃₂를 겔의 68-80 kDa 영역 중에 넓은 밴드로서 전개시켰다(도15 참조).

rhML₁₅₃의 정제도 실시예 19에 기재된 바와 같이 수행하였다. 요컨대, 293-rhML₃₃₂에 대해여 기재된 바와 같이 블루-세파로즈 상에서 분할하였다. 이 블루 세파로즈 용출물을 상기한 바와 같이 직접 mpl 친화 컬럼에 직접 가하였다. mpl 친화 컬럼으로부터 용출된 RhML₁₅₃을 rhML₃₃₂에 대해 이용된 조건과 동일한 조건하에서 작동되는 C4-HPLC 컬럼을 이용하여 정제해서 균질해지도록 하였다. SDS-PAGE를 이용하여 정제된 rhML₁₅₃을 Mr이 18000-22000 이하인 2개의 큰 밴드 및 2개의 작은 밴드로 분할하였다(도15 참조).

10. 쥐의 mpl 리간드

인간 mpl 리간드의 코딩 영역에 대응하는 DNA 절편을 PCR에 의해 제조하고, 겔을 이용하여 정제하고³²P-dATP 및³²P-dCTP의 존재하에 표지하였다. 이 프로브를 λGT10 중의 마우스 간 cDNA 라이브러리의 10⁶개 클론을 검색하는데 이용하였다. 1443 개 염기 삽입부를 함유하는 쥐의 한 클론(도16:[SEQ ID NO:12 & 13])을 단리하고 서열 규명하였다. 138-141 뉴클레오티드 위치의 예상되는 개시 코돈은 진핵 세포의 번역 개시를 용이하게 하는 일치 서열 내에 존재하였다(Kozak, M. J.Cell Biol., 108:229-241[1989]). 이 서열은 1056 뉴클레오티드의 개방된 판독 프레임을 이루는데 이로서 일차적 352개 아미노산의 번역 생성물을 예측할 수 있다. 5' 미번역 서열의 137 개 뉴클레오티드 및 3' 미번역 서열의 247 뉴클레오티드가 이개방 판독 프레임에 연결된다. 3' 미번역 영역 다음에는 폴리(A) 테일이 존재하지 않아 이 클론이 아마도 완전한 것이 아니라는 것을 나타낸다. 예상되는 아미노산 서열의 N-말단은 매우 소수성이며 아마도 신호 펩티드를 나타내는 듯하다. 컴퓨터 분석(von Heijne, G. Eur. J. Biochem. 133:17-21[1983]) 결과 잔기 21과 22 사이가 신호 펩티다제의 잠재적 절단 위치라는 것이 밝혀졌다. 이 위치에서의 절단으로 mML₃₃₁(또는 하기하는 이유로 mML2로도 불리움)로 동정된 331 개 아미노산(35 kDa)의 성숙한 펩티드가 생성될 것이다. 이 서열은 4개의 시스테인(모드 인간 서열에서 보존됨) 및 7개의 잠재적 N-글리코실화 위치(이중 5개가 인간 서열에서 보존됨)를 포함한다. hML과 마찬가지로 이 모든 잠재적 N-글리코실화 위치는 이 단백질의 C-말단에 위치한다.

인간 ML과 비교하였을때, 이들 ML의 "EPO 도메인"의 뉴클레오티드 및 연역된 아미노산 서열에서 상당한 동일성이 관찰되었다. 그러나, 인간 및 마우스 ML의 연역된 아미노산 서열들을 나란히 배열하였을때, 마우스 서열은 인간(상기 사항 참조) 및 피그(하기 사항 참조) cDNA에서 보았을때 뉴클레오티드 위치 618 이후의 12 뉴클레오티드 탈락에 대응하는 잔기 111-114 사이의 테트라펩티드가 탈락된 것으로 보인다. 따라서, 가능한 쥐의 ML 이소폼을 검출하기 위해 추가의 클론을 검사하였다. 한 클론이 "없어진" 테트라펩티드 LPLQ를 포함하는 335 개의 아미노산 연역 서열 폴리펩티드를 암호화하였다. 이 유형은 전길이 쥐의 ML로 믿어지며 mML 또는 mML₃₃₅로 불리운다. mML의 뉴클레오티드 및 연역된 아미노산은 도17(SEQ IDNO:14 & 15)에 제공되었다. 이 cDNA 클론은 1443 개 염기쌍으로 구성되어 있으며 그에 이어 폴리(A)테일이 연결되어 있다. 이 클론은 1068 bp로 된 개방 판독 프레임을 가지며 여기에 134 개 염기의 5' 및 241 개 염기의 3' 미번역 서열이 연결되어 있다. 추정되는 개시 코돈은 뉴클레오티드 138-140 위치에 존재한다. 개방된 판독 프레임은 356 개 아미노산의 예상되는 단백질을 암호화하며, 이중 처음 21개는 매우 소수성이며 분비 신호의 역할을 하는 듯하다. 마지막으로, 세번째 쥐의 클론을 단리하고, 서열 규명하고 hML3와 같이 116개 뉴클레오티드가 탈락된 것이 발견되었다. 그러므로 이 쥐의 이소폼은 mML3으로 명명되었다. 이 두 이소폼의 아미노산 서열의 비교는 도18(SEQ ID NO: 9 & 16)에 도시하였다.

인간 및 쥐의 ML(제 19도[SEQ ID NO: 6 & 16)사이의 전체적 아미노산 서열 동일성은 72%이나 이 상동성은 고르게 분포되지 않았다. "EPO 도메인"으로 정의되는영역(인간 서열의 1-153 아미노산 및 쥐의 서열의 1-149 아미노산)은 이 단백질의 카르복시 영역(62 % 상동성)보다 더 잘 보존되었다(86% 상동성). 이는 또한 이 단백질의 "EPO 도메인"만이 중요하다는 것을 암시한다. 흥미롭게도, hML내에서 발견되는 2개의 이염기 모티프 중에서, 인간 서열에서 "EPO 도메인"직후에 이어지는 이 이염기 모티프(잔기 위치 153-154)만이 쥐의 서열중에 존재한다. 이것은 이 전길이 ML이 제한된 단백질 분해를 거쳐 성숙한 리간드로 형성되는 선구 단백질을 나타낼 수 있는 가능성과 일치한다. 다른 방법에서, Arg₁₅₃-Arg₁₅₄사이의 단백질 분해는 hML의 제거를 용이하게 할 수 있다.

mML의 전체 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터를 일시적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 293 세포에 감염시켰다. 이들 세포로부터의 조건화된 배지는 쥐 또는 인간의 mpl을 발현시키는 Ba/F3 세포로의³H-티미딘의 삽입을 자극하지만 모(무 mpl) 세포주에는 아무런 영향을 미치지 못하였다. 이것은 클로닝된 쥐의 ML dDNA가 쥐 및 인간의 ML 수용체(mpl)을 활성화시키는 기능적 리간드를 암호화한다는 것을 암시한다.

11. 돼지 mpl 리간드

돼지 ML(pML)cDNA를 실시예 13에 기재된 바와 같이 RACE PCR을 이용하여 단리하였다. 1342 bp의 PCR cDNA 생성물은 신장에서 발견되었으며 서브클로닝되었다. 몇개의 클론들의 서열을 규명하였거 pML(또는 pML₃₃₂)로 불리우는 332 개 아미노산 잔기를 가진 피그 mpl 리간드가 도20(SEQ ID NO: 18 & 19)에 도시된 뉴클레오티드 및 연역된 아미노산 서열을 가진다는 것이 밝혀졌다.

4 개의 아미노산 잔기가 탈락된 pML2로 불리우는 두번째 유형(228 개 아미노산 잔기)이 동정되었다(도21(SEQ ID NO:21)). pML 및 pML2 아미노산 서열을 비교한 결과 잔기 11-114에만 대응하는 테트라펩티드 QLPP가 탈락되었다는 점을 제외하고는 후자 유형은 동일하다는 것이 밝혀졌다(제22도[SEQ ID NO:18 & 21]). 쥐 및 돼지의 ML cDNA에서 관찰되는 4개 아미노산의 탈락은 예상되는 단백질내의 정확히 동일한 위치에서 발생한다.

인간, 마우스 및 피그로부터의 성숙한 ML의 예상되는 아미노산 서열을 비교한 결과(도19[SEQ ID NO: 6, 17 & 18]), 전체적 서열 동일성은 마우스와 인간의 경우 72 %, 마우스와 피그의 경우 68% 및 피그와 인간의 경우 73 %이다. 이 상동성은 실질적으로 ML(EPO 상동 도메인)의 아미노 말단 절반에서보다 더 높다. 이 도메인은 어떤 두종 간에도 80 내지 84 %가 동일한 반면, 카르복시 말단 절반(카르복실레이트 도메인)은 57 내지 67 %가 동일하다. 프로테아제 절단 위치를 나타내는 이염기성 아미노산 모티프는 에리트로포이에틴 상동 도메인의 카르복실 말단에 존재한다. 이 모티프는 이 위치에서 3 종간에 보존된다(도19[SEQ ID NO: 6, 17 & 18]). 인간 서열의 245 및 246 위치에 존재하는 두번째 이염기성 위치는 마우스 또는 피그내에 존재하지 않았다. 마우스 및 피그 ML 서열은 4 개의 시스테인을 포함하는데, 이들은 모두 인간 서열내에 보존된다. 마우스 리간드 내에 7 개의 잠재적 N-글리코실화 위치가, 돼지 ML 주에 6 개의 잠재적 N-글리코실화 위치가 존재하며, 이중 5개는 인간 서열에 보존되어 있다. 모든 잠재적 N-글리코실화 위치는 이 단백질의 C-말단에 위치한다.

12. 차이니즈 햄스터 난(CHO)세포로부터의 TPO 발현 및 정제

CHO 세포를 감염시키는데 이용된 발현 벡터는 pSV15.ID.LL.MLORF(전길이 또는 TPO₃₃₂), pSV15.ID.LL.MLEPO-D(절융형 또는 TPO₁₅₃)으로 지칭된다. 이들 플라즈미드의 적절한 특성을 도23 및 도24에 제시하였다.

감염 방법은 실시예 20에 기재하였다. 요컨대, TPO의 전체 개방 판독 프레임에 대응하는 cDNA을 PCR을 이용하여 제조한다. 이 PCR 생성물을 정제하고 플라스미드 pSV15.ID.LL의 2개의 제한 위치(Clal 및 Sall) 사이에 클로닝하여 pSV15.ID.LL.MLORF를 얻었다. EPO 상동 도메인에 대응하는 두번째 구성물을 상이한 역 프리머(EPOD.Sal)을 이용하는 점을 제외하고 나머지는 동일한 방법으로 제조하였다. TPO의 EPO 상동 도메인을 코딩하는 벡터의 최종 구성물은 pSV15.ID.LL.MLEPO-D로 불리운다.

이들 두개의 구성물들을 Notl을 이용하여 직쇄화하고 차이니즈 햄스터 난세포(CHO-DP12 세포)로 전기천공으로 감염시켰다(1989년 3월 15일 공개된 유럽 특허제307,247호). 10⁷세포들을 문헌[Andreason, G.L. J. Tissue Cult. Meth. 15,56[1993]]에 기재된 바와 같이 10, 25 또는 50 mg의 DNA의 존재하에 BRL 전기천공 장치(350 볼트, 330 mF, 저용량) 중에서 전기 천공하였다. 감염시킨 다음날, 세포를 DHFR 선택 배지(무글리신 고포도당 DMEM-F12 50:50, 2 mM 글루타민, 2-5% 투석 태아 송아지 혈청)에서 절단하였다. 10 내지 15일 경과후 개개 집락을 96 웰 플레이트로 이동시키고 군락으로 성장하도록 한다. 이들 클론으로부터의 ML₁₅₃또는 ML₃₃₂의 발현은 Ba/F3-mpl 증식 분석을 이용하여 평가되었다(실시예 1에 기재함).

회수된 CHO 세포 배양액으로부터 TPO를 정제 및 단리하는 방법은 실시예 20에 기재되어 있다. 요컨대. 회수된 세포 배양액(HCCF)를 수지 단위 리터당 액 100 L의 비율로 블루 세파로즈 컬럼(파마시아)에 가하였다. 이어서 이 컬럼을 3 내지 5 배 컬럼 용량의 완충액 및 후속하여 2.0 M 우레아를 포함하는 완충액의 3 내지 5배 컬럼 용량으로 세척한다. 이어서 TPO를 2.0 M 우레아 및 1.0 M NaCl을 함유하는 완충액 3 내지 5 컬럼 용량으로 용출시켰다.

이어서 TPO 함유 블루 세파로즈 용출물 풀을 블루 세파로즈 중에서 평형을 이룬 휘트 점 렉틴(Wheat Germ Lectin) 세파로즈 컬럼 (파마시아)에 수지 단위 리터 당 블루 세파로즈 용출물 8 내지 16 ml의 비율로 완충액을 용출시키면서 가하였다. 이어서 TPO를 2.0 M 우레아 및 0.5 M N-아세틸-D-글루코스아민을 함유하는 2 내지 5 배 컬럼 용량으로 용출시켰다.

TPO를 함유하는 휘트 점 렉틴 용출물을 산성화하고 C₁₂E₈을 최종 농도가 0.04%가 되도록 가하였다. 얻어지는 풀을 0.1% TFA, 0.04 C₁₂E₈중에서 평형을 이룬 C₄역상 컬럼에 수지 단위 리터 당 0.2 내지 0.5 mg의 단백질을 하적(load)하면서 가하였다. 이 단백질은 0.1% TFA, 0.04 C₁₂E₈를 함유하는 아세토니트릴의 2상 직선 구배중에서 용출되며 풀은 SDS-PAGE에 근거하여 제조된다.

C4풀을 희석하고 약 6 용량의 완충액에 대하여 10000 내지 30000 달톤 분자량 차단 제한양을 가지는 Amicon YM과 같은 초여과막 상에서 투석 여과하였다. 얻어지는 투석 여과물약을 직접 가공하거나 또는 초여과에 의해 추가로 농축할 수 있다. 투석 여과/농축물은 통상 Tween-80의 최종 농도가 0.01%가 되도록 조정한다.

계산된 컬럼 용량이 2 내지 5%에 해당하는 투석여과물/농축물 모두 또는 일부분을 0.01% Tween-80을 함유하는 완충액 중에서 평형을 이룬 세파크릴 S-300 HR 컬럼(파라시아)에 가하고 크로마토그래피하였다. 응집물 및 단백질 분해 생성물이없는 TPO 함유 분획을 SDS-PAGE에 근거하여 풀링(Pooling)하였다. 얻어지는 풀을 여과하고 2-8℃에서 보관하였다.

13. 미생물 내에서 TPO 합성을 변형 및 유도하며 그로 부터 제조된 TPO의 단리, 정제 및 리폴딩하는 방법

E.coli TPO 발현 벡터의 구성은 실시예 21에 상세하게 기술된다. 요컨대, 플라즈미드 pMP21, pMP151, pMP41, pMP57 및 pMP202를 상이한 구성물의 작은 리더 하류의 TPO의 처음 155개 아미노산을 발현하도록 조치한다. 리더는 주로 고도의 번역 개시 및 신속한 정제를 위해 제공된다. 플라즈미드 pMP210-1, T8, -21, -22, -24, -25는 개시 메티오닌의 하류에 있는 TPO의 처음 153개 아미노산을 발현시기도록 조치되며 TPO의 처음 6개의 아미노산에서의 코돈 이용에서만 상이한데, 플라즈미드 pMP251은 TPO의 카르복시 말단에 2개의 아미노산이 더 첨가된 pMP210-1의 유도체이다. 모든 상기 플라즈미드는 트립토판 프로모터로 유도되었을 경우, E.coli중에서 고도의 TPO의 세포내 발현을 유발할 것이다(Yansura, D. G. et al.., Methods in Enzymology(Goeddel, D.V., Ed.)185:54-60, Academic Press, San Diego[1990]). 플라즈미드 pMP1 및 pMP172는 상기 TPO의 세포내 발현 플라즈미드의 구성에 있어서의 중간체들이다.

상기 TPO 발현 플라즈미드는 CaCl₂열 쇼크 법을 이용하여 E.coli를 형질 전환시키는데 이용하며[Mandel, M. et al., J. Mol. Biol., 53:159-162[1970]) 기타 방법들을 실시예 21에 기재하였다. 요컨대, 형질변환된 세포들을 배양물의 광학적밀도(600 nm)가 약 2 내지 3에 도달할 때까지 성장시켰다. 이어서 이 배양물을 희석시키고 공기를 공급해 주면서 성장시킨 후, 산을 가하였다. 이어서 이 배양물을 추가로 15 시간 동안 공기 주입하에 성장시킨 후, 이 세포들을 원심 분리로 회수하였다.

생물학적으로 활성인 리폴딩된 인간 TPO 또는 그의 절편의 제조를 위한 하기 단리, 정제 및 리폴딩 방법은 실시예 22 및 23에 기재되어 있으며 N 및 C 말단 연장형을 포함한 모든 TPO의 변형체의 회수에 적용될 수 있다. 재조합 또는 합성 TPO를 리폴딩하는데 적당한 기타 방법들은 하기 특허에서 찾아볼 수 있다; Builder et al.,미합중국 특허 제4,511,502호; Jones 등, 미합중국 특허 제4,512,922호, Olson 등, 미합중국 특허 제4,518,526호 및 E.coli 중에서의 불용형에서 발현된 다양한 재조합 단백질의 회수 및 리폴딩 방법의 일반적 기술에 대해서는 Builder 등 미합중국 특허 제4,620,948호에서 발견할 수 있다.

A. 불용성 TPO의 회수

여하한 적당한 플라즈미드에 의해 암호화한 TPO를 발현하는 E.coli와 같은 미생물은 TPO가 불용성 "굴절체"로 침강하는 조건하에서 발효시킨다. 임의로 세포들을 세포 파괴 완충액 중에서 세척한다. 통상, 약 100 g의 세포들을 세포 파괴 완충액(예: 10 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 8)의 약 10 용량 중에 가령, 폴리트론(Polytorn) 호모지나이져를 이용하여 재현탁시키고 30 분간 5000×g에서 원심분리한다. 이어서 세포들을 토닉 쇼크, 소니케이션, 압력 시클링,화학 또는 효소적 방법과 같은 통상의 기술을 이용하여 용해시킨다. 예를 들어, 상기 세척된 세포 펠리트는 호모지나이져를 이용하여 추가로 세포 파괴 완충액 10 용량 중에 재현탁시킬 수 있고 이 세포 현탁액을 LH 세포 파괴기(LH Inceltech, Inc.) 또는 미세유동화기(Microfluidics International)를 이용하여 제조자의 지침에 따라 통과시킬 수 있다. 이어서 TPO를 함유하는 입자성 물질을 액상으로부터 분리하고 임의로 적당한 액체를 이용하여 세척하였다. 예를 들어, 세포 용해물의 현탁액을 30 분 동안 5000×g에서 원심분리시키고, 재현탁시키고 임의로 또다시 원심분리시켜 세척된 굴절체 펠리트를 제조할 수 있다. 이 세척된 펠리트는 즉시 이용하거나 또는 임의로 냉동 보관할 수 있다(예:-70℃).

B. 단량체 TPO의 가용화 및 정제

굴절제 펠리트 중의 불용성 TPO를 가용화 완충액을 이용하여 가용화한다. 이 가용화 완충액은 차오트로픽 시약을 함유하며 보통 염기 pH로 완충되고 환원제를 함유하여 단량체 TPO의 수율을 향상시킨다. 대표적인 차오트로픽 시약에는 우레아, 구아니딘-HCl, 및 소듐 티오시아네이트가 포함된다. 바람직한 차오트로픽 시약은 구아니딘-HCl이다. 차오트로픽 시약의 농도는 보통 4 내지 9 M, 바람직하게는 6 내지 8 M이다. 가용화 완충액의 pH는 pH 약 7.5-9.5, 바람직하게는 8.0-9.0 및 가장 바람직하게는 8.0으로 임의의 적당한 완충액에 의해 유지된다. 가용화 완충액이 TPO의 단량체 형태의 형성을 돕기 위해 환원제를 함유하는 것도 바람직하다. 적당한 환원제에는 디티오트레이톨(DTT), 디티오에리트리톨(DTE), 머캅토에탄올, 글리타치온(GSH), 시스티아민 및 시스테인이 포함된다. 바람직한 환원제는 디트리트레이톨(DTT)이다. 임의로, 가용화 완충액은 온화한 산화제(예: 분자산소) 및 아황산 염을 함유하여 술피토라이시스를 통해 단량체 TPO를 형성하게 할 수 있다. 이 실시 태양에서, 얻어지는 TPO-S-술포네이트는 산화환원 완충액(예: GSH/GSSG) 중에서 리폴딩하여 적당히 폴딩된 TPO를 제조할 수 있다.

TPO 단백질은 통상 예를 들어, 원심 분리, 겔 여과 크로마토그래피 및 역상 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된다.

실례로서, 하기 방법에 의해 단량체 TPO를 적절한 수율로 제조한다. 굴절체 펠리트를 가용화 완충액(20 mM Tris, pH 8, 6-8 M 구아니딘 및 25 mM DTT)의 중량에 의해 약 5배 용량 중에 재현탁되고 1 내지 3 시간 동안 또는 철야로 4℃에서 교반하여 TPO 단백질을 가용화한다. 고농도(6 내지 8M)의 우레아도 유용성이 있으나 일반적으로 구아니딘에 비해 약간 낮은 수율을 보인다. 가용화 후, 이 용액을 30 분간 30000×g에서 원심 분리하여 변성된 단량체 TPO 단백질을 함유하는 맑은 상등액을 제조한다. 이 상등액을 이어서 2 ml/분의 속도로 수퍼덱스 200 겔 여과 컬럼(파마시아, 2.6×60 cm)상에서 크로마토그래피하고 10 mM DTT를 함유한 pH 6.0의 20 mM Na 포스페이트를 이용하여 단백질을 용출시킨다. 160 내지 200 ml사이에서 용출된 단량체의 변성된 TPO 단백질을 함유하는 분획을 풀링하였다. 이 TPO 단백질을 추가로 반제조 C4 역상 컬럼(2×20 cm VYDAC) 상에서 정제할 수 있다. 이 샘플을 5 ml/분으로 30 % 아세토니트릴을 함유한 0.1 % TFA(삼불화초산) 중에서 평형을 이룬 컬럼에 가한다. 이 단백질을 아세토니트릴의 선형 구배(60 분간 30 내지 60 %)하에 용출시킨다. 정제된 환원 단백질을 약 50% 아세토니트릴로 용출시킨다. 이 물질을 리폴딩하는데 이용하여 생물학적으로 활성인 TPO 변형체를 수득한다.

C. 생물학적 활성형을 제조하기 위한 TPO의 리폴딩

TPO를 가용화 및 추가로 정제한 후, 생물학적 활성형을 산화환원 완충액 중에서 변성된 단량체 TPO를 리폴딩함으로써 제조한다. TPO의 높은 효력으로 인해(Ba/F3 분석 중의 최대 자극치의 절반이 약 3 pg/ml에서 얻어진다), 많은 다양한 완충액, 표백제 및 산화환원 조건을 이용하여 생물학적으로 활성인 물질을 제조하는 것이 가능하다. 그러나, 대부분의 조건하에서는 적절히 폴딩된 물질이 소량으로만 수득된다(>10%). 상업적 제조 방법을 위해서는, 리폴딩 수율이 10% 이상, 보다 바람직하게는 30-50%, 가장 바람직하게는 50% 초과이다. Troton X-100, 도데실-베타-말토사이드, CHAPS, CHAPSO, SDS, 사르코실, Tween 20 및 Tween 80, Zwittergent 3-14 등과 같은 다양한 표백제가 약간 이상의 적절히 폴딩된 물질을 제조하는데 적당하다는 것이 밝혀졌다. 그러나 이들중, 가장 바람직한 표백제는 리폴딩 반응에서 가장 잘 작용하고 단백질 응집 및 부적당한 이황화 결합 형성을 제한하는 것으로 밝혀진 CHAPS류(CHAPS 및 CHAPSO)의 표백제이다. CHAPS의 농도는 약 1% 이상인 것이 바람직하다. 최고의 수율을 얻기 위해서는 0.1 M 내지 0.5 M의 염화나트륨이 필요하다. 산화 환원 완충액 중에 EDTA(1 내지 5 mM)가 존재하는 것도 일부 제제에서 관찰되는 금속 촉매성 산화(및 응집)을 제한한다는 점에서 바람직하다. 15%를 초과하는 글리세롤의 농도는 최적의 리폴딩 조건이다. 최고의 수율을 위해서, 산화환원 완충액 중에 산화 및 환원된 유기 티올(RSH)로 구성되는 산화환원 쌍을 포함시킬 필요가 있다. 적당한 산화환원 쌍에는 머캅토에탄올, 글루타치온(GSH), 시스테아민, 시스테인 및 그에 대응하는 산화형들이다. 바람직한 산화환원 쌍은 글루타치온(GSH):산화형 글루타치온(GSSG)이다. 일반적으로 산화환원 쌍의 산화형의 몰비가 산화환원 쌍의 환원형의 몰비와 같거나 또는 그보다 높을때 보다 높은 수율이 얻어진다. pH 7.5 내지 약 9가 이들 TPO 변형체들의 리폴딩에 가장 최적 pH이다. 유기 용매(예: 에탄올, 아세토니트릴, 메탄올)는 10 내지 15 % 이하의 농도에서 허용되었다. 유기 용매의 농도가 높을 경우, 부적당한 폴딩형이 증가된다. 트리스 및 포스페이트 완충액이 일반적으로 유용하다. 4℃에서의 배양도 또한 고농도의 적당히 폴딩된 TPO를 제조하게 한다.

40-60 %의 리폴딩 수율(리폴딩 반응에 이용되는 환원 및 변성된 TPO의 양을 기준으로 하였을때)이 처음에 C4 단계를 통해 정제된 TPO의 제제에 있어서 통상적인 수율이다. 보다 덜 순수한 제제(예: 수퍼덱스 200 컬럼 또는 초기 굴절체 추출직후)의 경우에도 TPO 리폴딩 반응 도중의 광범위한 침전 및 비 TPO 단백질의 간섭으로 인하여 수율이 다소 낮아지긴 하지만, 활성 물질을 수득할 수는 있다.

TPO는 4개의 시스테인을 함유하는데, 이 단백질은 3개의 상이한 이황화 버젼을 형성하는 것이 가능하다.

버젼 1: 시스테인 잔기 1-4 및 2-3

버젼 2: 시스테인 잔기 1-2 및 3-4

버젼 3: 시스테인 잔기 1-3 및 2-4

리폴딩 조건 결정을 위한 초기 탐색 중에, TPO 단백질을 함유하는 수개의 상이한 피크가 C4 역상 크로마토그래피에 의해 분리되었다. 이들 피크 중 단 하나만이 Ba/F3 분석을 이용하여 결정된 유효한 생물학적 활성을 가졌다. 이어서, 리폴딩 조건을 이 버젼이 선택적으로 형성되도록 최적화하였다. 이러한 조건하에서, 잘못 폴딩된 버젼은 가용화 단계로부터 얻어진 총 단량체 TPO의 10 내지 20% 미만이었다.

생물학적으로 활성인 TPO의 이황화 결합 패턴은 질량 스펙트로메트리 및 단백질 서열 규명에 의해 시스테인 1-4 및 2-3인 것으로 밝혀졌다, 여기서 시스테인들은 아미노 말단에서부터 차례로 번호를 매겼다. 이 시스테인 가교 연결 패턴은 관련 분자인 에리트로포이에틴의 공지된 이황화 결합과 일치한다.

D. 재조합, 리폴딩된 TPO의 생물학적 활성

리폴딩되고 정제된 TPO는 생체내 및 시험관내 분석 모두에서 활성을 가졌다. 예를 들어, Ba/F3 분석에서, TPO(Met^-1, 1-153)의 Ba/F3 세포로의 티미딘 삽입의 최대 자극의 절반치가 3.3 pg(0.3 pM)에서 달성되었다. mpl 수용체에 기초한 ELISA에서, 최대 활성의 절반치는 1.9 ng/ml(120 pM)에서 얻어졌다. 정상 동물 및 근치사 X선 조사로 만들어진 골수억압 동물 내에서, 리폴딩된 TPO(Met^-1, 1-153)는 새로운 혈소판의 생산을 자극하는데 있어서 매우 강력하였다(30 ng/ml의 낮은 투여량에서 활성이 나타났다). 유사한 생물학적 활성이 상기 방법에 따라 리폴딩된 TPO의 다른 형태에서도 관찰되었다(도25, 26 및 28).

14, 혈소판 형성 활성 측정 방법

혈소판 활성은 실시예1에 기재된 Ba/F3 mpl 리간드 분석, 생체내 마우스 혈소판 반사 합성 분석, 인간 백혈병 거핵구 세포주(CMK)에 대한 항 혈소판 면역 분석(항-GPII_bIII_a)에 의해 측정되는 혈소판 세포 표면 항원 유도 분석(Sato 등,, Brit. J. Haenatol., 72:184-190[1989] 참조)(실시예 4에 기재된 액체 현탁액 거핵구 형성 분석 참조) 및 거핵구적아 세포주(DAMI) 중에서의 다배체화 유도(Ogura 등, Blood, 72(1):49-50[1988])를 포함하는 다양한 분석에 의해 측정될 수 있다. 미성숙한, 대체로 비-DNA합성 세포로부터 형태상 동정가능한 거핵구로의 성숙 과정에는 세포 소기관의 출현, 막항원(GPII_bIII_a)의 획득, 상기 발명의 배경에서 설명한 바와 같이 혈소판의 세포내 복제 및 유리 단계가 관여된다. 거핵구 성숙에 있어서의 계통 특이성 프로모터(예: mpl 리간드)가 미성숙 거핵구 중에서 적어도 일부의 상기 변화를 유도하여 혈소판 유리 및 혈소판 감소증의 완화로 이끈다는 것이 예상될 것이다. 이로서, 분석은 미성숙 거핵구 세포주 예를 들어, CMK 및 DAMI 세포 중에서의 이들 파라미터의 출현을 측정하도록 계획되었다. CMK 분석(실시예4)에서는 특이성 혈소판의 표시인 GPII_bIII_a의 출현 및 혈소판 배출을 측정한다. DAMI 분석(실시예 15)에서 다배체의 증가는 성숙한 거핵구의 지표이므로 세포내 복제 양상을 측정한다. 인식 가능한 거핵구는 2N, 4N, 8N, 16N, 32N 등의 배수를 가진다. 마지막으로 생체내 마우스 혈소판 반사 분석(실시예 16)은 시험 화합물(본 명세세에서는 mpl 리간드)을 투여했을때 유발되는 혈소판 수치의 상승을 보여주는데 유용하다.

2개의 추가의 시험관내 분석이 TPO 활성을 측정하기 위해 개발되었다. 첫번째가 mpl 리간드를 mpl-Rse 키메라의 mpl 부분을 mpl 리간드에 노출시킨 후 CHO 세포에 mpl-Rse 키메라를 감염시킨 후, Rse의 티로신 포스포릴화 양상을 ELISA에 의해 측정하는 키나아제 수용체 활성화(Kirase Receptor Activation(KIRA)) ELISA이다. 두번째 방법은 토끼 항인간 IgG로 도포된 ELISA 플레이트가 분석될 mpl 리간드에 결합하는 인간 키메릭 수용체 mpl-IgG를 포획하는 ELISA법에 기초한다. mpl 리간드에 대한 비오티닐화 토끼 폴리클론성 항체(TPO₁₅₅)는 실시예 18에 기재된 바와 같이 스트렙다비딘-퍼옥시다제를 이용하여 측정하는 결합 mpl 리간드의 검출에 이용한다.

15. 정상 및 준치사상태로 조사된 TPO 처리 마우스의 신체내 생물학적 반응

정상 및 준치사상태로 조사된 마우스를 둘다 차이니즈 햄스터 난(CHO)세포, E.coli 및 인간 배아 신장(293) 세포로부터 단리된 절융형 및 전길이 TPO로 처리하였다. 그러나 이 3종의 숙주 중에서 제조된 두 유형의 TPO가 모두 마우스 중에서 혈소판 생산을 자극하지만, CHO 세포로부터 단리된 전길이 TPO가 생체내 반응에서 가장 큰 반응을 일으키는 듯하다. 이들 결과들은 카르복시 도메인의 적절한 글리코실화가 최적의 생체내 활성에 필요할 것이라는 나타낸다.

(a) E.coli-rhTPO(Met ^-1 , 153)

E.coli 내에서 제조된 EPO 도메인의 "Met"형(인간 TPO의 처음 153개 잔기앞 -1 위치에 Met가 위치)을 제25A, 25B 및 25C의 설명에 기재된 바와 같이 정상 암컷 C57 B6 마우스에 매일 주사하였다. 이 그림들은 E.coli 중에서 제조되어 상기한 바와 같이 리폴딩된 비글리코실화 절융형이 정상 마우스 내에서 적혈구 또는 백혈구 무리에 대해 영향을 미치지 않고 혈소판 생산이 2배로 증가하도록 자극할 수 있다는 것을 보여준다.

제26A, 26B 및 26C도의 설명에 기재된 바와 같이 준치사적으로 조사된 (¹³⁷Cs) 암컷 C57 B6 마우스에 매일 주사된 이 동일한 분자는 혈소판 회복을 자극하고 적혈구 또는 백혈구에 대해 영향을 미치는 최저치를 더 낮추었다.

(b) CHO-rhTPO ₃₃₂

TPO의 전길이 형태는 CHO 중에서 제조되며 제27A, 27B 및 27C도의 설명에 기재된 바와 같이 정상의 암컷 C57 B6 마우스에 매일 주사되며 정상 마우스 내에서 적혈구 또는 백혈구 무리에 대해 영향을 미치지 않고 혈소판 생산을 5배로 증가시켰다.

(c) CHO-rhTPO ₃₃₂ ; E.coli-rhTPO(Met ^-1 , 153); 293-rhTPO ₃₃₂ 및 E.coli-rhTPO ₁₅₅

도28의 설명에 기재된 바와 같이 다양한 세포주(CHO-rhTPO₃₃₂; E.coli-rhTPO(Met^-1, 153); 293-rhTPO₃₃₂및 E.coli-rhTPO₁₅₅)로부터의 rhTPO로의 정상 마우스의 처리에 대한 투여량 반응 곡선을 작성하였다. 이 그림은 분자의 모든 시험형태가 혈소판 생산을 자극하지만, CHO 중에서 생산된 전길이 형태가 생체내 활성이 가장 크다는 것을 나타낸다.

(d) CHO-rhTPO ₁₅₃ , CHO-rhTPO _"clipped" 및 CHO-rhTPO ₃₃₂

도29의 설명에 기재된 바와 같이 CHO(CHO-rhTPO₁₅₃, CHO-rhTPO_"clipped"및 CHO-rhTPO₃₃₂)에서 생산된 다양한 형태의 rhTPO로의 정상 마우스의 처리에 대한 투여량 반응 곡선을 작성하였다. 이 그림은 분자의 모든 시험 형태가 혈소판 생산을 자극하지만, CHO 중에서 생산된 전길이 형태가 생체내 활성이 가장 크다는 것을 나타낸다.

16. mpl 리간드 및 변형체의 일반 재조합적 제조

바람직하게는 mpl 리간드는 mpl 리간드 핵산을 발현시키도록 감염된 세포(통상 발현 벡터로 세포를 형질변환시킴)를 배양하고 세포로부터 폴리펩티드를 회수함으로써 mpl 리간드 폴리펩티드를 제조하는 단계로 구성되어 있는 표준 재조합 방법에 의해 제조된다. 그러나, 임의로 이 mpl 리간드가 mpl 리간드를 암호화하는 DNA를 이미 함유하는 세포로 도입된 조절 요소들을 이용하여 상동 재조합 또는 재조합 제조법에 의해 제조할 수 있다는 것을 알 수 있다. 예를 들어, 강력한 프로모터/인핸서 요소, 서프레서 또는 외인성 전사 조절 요소를 목적하는 숙주 세포의 게놈내에 목적하는 mpl 리간드 폴리펩티드를 암호화하는 DNA의 전사에 영향을 미치기에 충분한 거리 및 배향으로 삽입시킬 수 있다. 이 조절 요소들은 mpl 리간드를 암호화하지 않는다, 오히려 이 DNA는 숙주 세포 게놈 고유의 것이다. 이것은 본 발명의 수용체 폴리펩티드를 제조하는 세포를 찾아 검색하거나 또는 목적하는 수준의 증가 또는 감소된 수준의 발현을 위한 검색을 수행한다.

이로서, 본 발명은 전사 조절 요소를 mpl 리간드 핵산 분자 포함 세포의 게놈내에 목적하는 mpl 리간드 폴리펩티드를 암호화하는 그의 전사에 영향을 미치기에 충분한 거리 및 배향으로 삽입하고 임의로 전사 조절 요소 및 핵산 분자를 포함하는 세포를 배양하는 것으로 이루어진 추가의 단계로 구성된 mpl 리간드 제조 방법을 고려한다. 본 발명은 또한 숙주 세포에 의해 인식되는 외인성 조절 서열에 기능가능하게 결합한 세포 본래의 mpl 리간드 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포도 고려한다.

A. mpl 리간드 폴리펩티드를 암호화하는 DNA의 단리

mpl 리간드 폴리펩티드를 암호화하는 DNA는 mpl 리간드 mRNA를 가지며 이것을 검출 가능한 농도로 발현하는 것으로 믿어지는 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 제조될 수 있다. mpl 리간드 유전자는 또한 게놈 DNA 라이브러리로부터 완전한 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열로부터 시험관내 올리고뉴클레오티드 합성에 의해 제조될 수 있다.

라이브러리는 목적하는 유전자 또는 그에 의해 암호화되는 단백질을 동정하도록 계획된 프로브를 이용하여 검색한다. cDNA 라이브러리에 있어서, 적당한 프로브에는 mpl 리간드를 인식하여 특이적으로 결합하는 모노클론성 또는 폴리클론성 항체가 포함된다. cDNA 라이브러리에 있어서, 적당한 프로브에는 동일하거나 또는 상이한 종으로부터의 mpl 리간드 cDNA 및(또는) 동일하거나 또는 유사한 유전자를 암호화하는, 상보적인 또는 상동의 cDNA 또는 그의 절편의 공지되었거나 또는 의심되는 부분을 암호화하는 길이가 약 20 내지 80 염기인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 게놈 DNA 라이브러리를 검색하기 위한 적절한 프로브에는 동일하거나 또는유사한 유전자 및(또는) 상동의 게놈 DNA 또는 그의 절편을 암호화하는 올리고뉴클레오티드, cDNA 또는 그의 절편이 포함된다. 선택된 프로브를 이용한 cDNA 또는 게놈 라이브러리의 검색은 Sambrook et al., Supra의 10 내지 12 장에 기재된 표준 방법을 이용하여 수행한다.

mpl 리간드를 암호화하는 유전자를 단리하는 다른 방법은 Sambrook et al., Supra의 14 섹션에 기재된 PCR 방법을 이용한다. 이 방법에서는 mpl 리간드를 암호화하는 DNA와 혼성화할 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용할 필요가 있다.

본 발명을 실행하는 바람직한 방법은 주의 깊게 선택된 올리고뉴클레오티드 서열을 이용하여 다양한 조직, 바람직하게는 인간 또는 돼지 신장(성인 또는 태아) 또는 간세포주로부터의 cDNA 라이브러리를 검색하는 것이다. 예를 들어, 인간 태아 간세포주 cDNA 라이브러리는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여 검색한다. 또다른 방법에서, 인간 게놈 라이브러리는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여 검색할 수 있다.

프로브로 선택된 올리고뉴클레오티드는 충분한 길이를 가져야 하며 잘못된 긍정적 신호를 최소화하도록 충분히 확실해야 한다. 실제의 뉴클레오티드 서열(들)은 통상 코돈 중복이 최소인 mpl 리간드의 영역에 기초하여 계획된다. 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 위치에서 축퇴할 수 있다. 축퇴 올리고뉴클레오티드를 이용하는 것은 특정 코돈의 이용이 알려져 있지 않은 종으로 부터 라이브러리를 검색할 경우 특히 중요하다.

올리고뉴클레오티드를 표지하여 검색되는 라이브러리 내의 DNA에 혼성화할경우 검출할 수 있도록 하여야 한다. 표지의 바람직한 방법은 ATP(예:γ³²P) 및 폴리 뉴클레오티드 키나아제를 이용하여 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 표지하는 것이다. 그러나, 기타 방법들이 올리고뉴클레오티드를 표지하는데 이용될 수 있는데, 비오티닐화 또는 효소 표지등이 있으며, 여기에만 국한되는 것은 아니다.

전길이 mpl 리간드 폴리펩티드를 암호화하는 mpl 리간드 핵산은 특히 관심을 끈다. 일부 바람직한 실시 태양에서, 핵산 서열은 천연의 mpl 리간드 신호 서열을 포함한다. 이 단백질의 모든 코딩 서열을 가지는 핵산은 연역된 아미노산 서열을 이용하여 선택된 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 검색하여 얻어진다.

B. 천연 mpl 리간드의 아미노산 서열 변형

mpl 리간드의 아미노산 서열은 적당한 뉴클레오티드 변화를 mpl 리간드 DNA에 도입하거나 또는 목적하는 mpl 리간드 폴리펩티드를 시험관내에서 합성함으로써 제조한다. 예를 들어, 이러한 변형체들에는 돼지 mpl 리간드의 아미노산 서열 내의 잔기의 탈락, 삽입 또는 치환형이 포함된다. 예를 들어, 성숙한 전길이 mpl 리간드의 카르복시 말단 부분은 생체내 또는 시험관내에서 단백질 분해성 절단 또는 전길이 mpl 리간드를 암호화하는 절편 또는 DNA를 클로닝 또는 발현시킴으로써 제거하여 생물학적으로 활성 변형체를 제조한다. 최종 구성물이 목적하는 생물학적 활성을 가지기만 한다면, 탈락, 삽입 및 치환형의 어떠한 조합으로도 최종 구성물을 제조한다. 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시키는 것과 같은 아미노산 변화도 또한 번역후 과정을 변경시킬 수 있다. mpl 리간드의 아미노산 서열 변형체의 계획에 있어서, 돌연변이 부위 위치 및 돌연변이 성질은 개질되는 mpl 리간드 특성에 따라 좌우된다. 돌연변이 부위는 개별적으로 또는 일련으로, 예를 들어, (1) 보존 아미노산을 치환한 후 얻어지는 결과에 따라 보다 더 파격적인 아미노산단으로 치환하거나, (2) 목적 잔기를 탈락시키거나, (3) 동일하거나 또는 상이한 과의 잔기들을 위치 파악된 부위에 근접하여 삽입시키거나 또는 1 내지 3 선택 사항의 조합에 의해 개질될 수 있다.

돌연변이 발생에 있어서 바람직한 위치들인, mpl 리간드 폴리펩티드내의 특정 잔기 또는 영역의 동정에 이용되는 유용한 방법은 문헌[Cunningham 및 Wells, Science, 244:1081-1085[1989]]에 기재된 바와 같은 "알라닌 주사 돌연변이 발생"이다. 이 방법에서는, 한개의 잔기 또는 일단의 목적 잔기들이 동정되며(예: arg, asp, his, lys 및 glu와 같은 하전된 잔기들), 모든 아미노산, 그러나 바람직하게는 중성 또는 음이온으로 하전된 아미노산(가장 바람직하게는 알라닌, 폴리알라닌)으로 치환되어 세포 내외의 주변 수성 환경과 아미노산들의 상호작용에 영향이 미친다. 아미노산 잔기의 치환에 기능적 민감성을 보이는 도메인들을 치환 부위에 또는 인근에 추가로 또는 다른 변형을 도입함으로써 정련한다. 이로서, 아미노산 서열 변형을 도입하는 부위가 미리 정해져 있지만, 돌연변이 자체의 성질은 미리 정해져 있을 필요는 없다. 예를 들어, 특정 부위에서의 돌연변이 실행을 최적화하기 위해, ala 주사 또는 임의의 돌연변이를 목적 코돈 또는 영역에서 발생시켜 발형된 이 mpl 리간드 변형체들을 목적 활성의 최적 조합체를 찾아 검색한다.

아미노산 서열 변형체들의 구성에 있어서는 2개의 주요 변수(돌연변이 부위의의 위치 및 돌연변이 성질)가 있다. 예를 들어, mpl 리간드 폴리펩티드의 변형체에는 mpl 리간드 서열의 변형체가 포함되며 이는 자연발생적인 대립 형질(mpl 리간드 DNA의 추가 조작을 필요로 하지 않음)또는 천연에서 발견되지 않는 대립형질 또는 변형체에 도달하기 위해 DNA에서 돌연변이를 일으킴으로써 만들어진 미리 정해진 돌연변이를 가리킬 수 있다. 일반적으로, 돌연변이 발생의 위치 및 성질은 개질될 mpl 리간드 특성에 따라 좌우된다.

아미노산 서열 탈락은 일반적으로 약 1 내지 30 잔기, 더욱 바람직하게는 1 내지 10개의 잔기에서 일어나며 통상 서로 연속되어 있다. 다른 방법에서는, mpl 리간드의 전체 카르복시 말단 당단백질 도메인에서 서열 탈락이 발생할 수 있다. 임의로 "나선형 다발"사이에 존재하는 하나 이상의 루프 영역내의 하나 이상의 탈락이 발생할 수 있다. 연속적 탈락의 경우 통상 짝수개의 잔기로서 발생하나, 하나 또는 홀수개의 탈락 현상도 그의 범위내에 있다. mpl 리간드의 활성을 개질시키기 위하여 최고의 서열 동일성을 가지는 mpl 리간드들내의 상동성이 낮은 영역에서 탈락 현상이 일어날 수 있다. 또는 인간 mpl 리간드와 최고의 서열 동일성을 가지는 인간 및 다른 포유류의 mpl 리간드 폴리펩티드들내의 상동성이 낮은 영역에서 탈락 현상이 일어날 수 있다. 다른 포유류 mpl 리간드와 상당한 상동성을 가지는 영역에서 포유류 mpl 리간드 폴리펩티드의 아미노산 탈락 현상이 일어날 경우, 더욱 유의하게 mpl 리간드의 생물학적 활성을 개질시킬 것으로 보인다. 연속적 탈락 잔기의 수는 피영향 도메인내의 mpl 리간드의 3차구조(예: 베타 플리티드 시트 또는 알파 헬릭스)를 보전할 수 있도록 선택한다.

아미노산 서열 삽입에는 길이가 하나의 잔기에서 100개 이상의 잔기를 포함하는 폴리펩티드까지 이르는 아미노 및(또는) 카르복시 말단부로의 연결융합 및 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열 중간으로의 삽입이 포함된다. 서열 중간 삽입체들(예:성숙한 mpl 리간드 서열내로의 삽입)은 길이가 일반적으로 약 1 내지 10개 잔기, 더욱 바람직하게는 1 내지 5 개의 잔기, 가장 바람직하게는 1 내지 3개의 잔기일 수 있다. 대표적인 바람직한 연결융합은 mpl 리간드 또는 그의 절편 및 다른 시토킨 또는 그의 절편의 연결융합체이다. 말단 삽입의 예에는 N-말단 메티오닐 잔기를 가진 성숙한 mpl 리간드, 재조합 세포 배양물중에서의 성숙한 mpl 리간드의 직접 발현물의 인위 구조 및 재조합 숙주세포로부터의 성숙한 mpl 리간드의 분비를 용이하게 하기 위해 성숙한 mpl 리간드 분자의 N-말단에 이형성의 N-말단 신호서열을 융합시킨것이 포함된다. 이러한 신호 서열은 일반적으로 목적하는 숙주 세포 종으로부터 제조되므로 상동성이다. 적당한 서열에는 E.coli에서는 STII 또는 Ipp가 있고, 이스트의 경우에는, 알파 인자 및 포유류 세포의 경우에는 헤르페즈 gD와 같은 바이러스성 신호가 포함된다.

mpl 리간드 분자의 다른 삽입 변형체에는 면역성 폴리펩티드(예: 융합체가 투여되는 숙주 세포에서 기인하지 않음)의 mpl 리간드의 N- 또는 C-말단으로의 융합체(예: 베타락타마제와 같은 세균성 폴리펩티드 또는 E.coli trp locus에 의해 암호화되는 효소 또는 이스트 단백질) 및 면역글로불린 불변 영역(또는 다른 면역글로불린 영역), 알부민 또는 페리틴과 같은 긴 반감기를 가지는 단백질과의 C-말단 융합체가 포함된다(1989년 4월 6일 공개된 국제공개 제89/02922호에 게재).

세번째 변형체 군은 아미노산 치환 변형체이다. 이들 변형체에서는 하나 이상의 아미노산 잔기가 제거되고 그자리에 다른 잔기가 삽입된다. 치환 돌연변이 발생에 있어서 가장 바람직한 부위에는 mpl 리간드의 활성 부위로 동정된 부위 및 다른 유사체에서 발견되는 아미노산들이 측쇄 부피, 하전량 또는 소수성 측면에서 상이하기는 하지만 다양한 mpl 리간드 종 및(또는) 하나의 mpl 리간드 일원의 다양한 동물 유사체들 중에서의 특정 부위에서의 서열 동일성이 높은 부위가 포함된다.

바람직한 다른 부위는 다양한 과 일원 및(또는) 한 일원 내의 동물종들로부터 얻어지는 mpl 리간드가 동일한 부위들이다. 이러한 부위들, 특히 3개 이상의 다른 동일하게 보존되는 부위의 서열내에 해당하는 부위들은 상대적으로 서열이 보존되도록 치환된다. 이러한 보존성 치환기들은 바람직한 치환기라는 명칭하에 표3에 기재되었다. 이러한 치환기들이 생물학적 활성의 변화를 유발한다면, 표3에 대표적인 치환기로 명명되거나 또는 아미노산 부류를 참조하여 추가로 아래에 기재된 더 상당한 변화가 도입되며 그 생성물들을 검색하였다.

본래 잔기	대표적 치환기	바람직한 치환기
Ala(A)	Val; Leu:Ile	Val
Arg(R)	Lys; Gln; Asn	Lys
Asn(N)	Gln; His; Lys; Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
Gly(I)	Asp	Asp
His(H)	Asp; Gln; Lys; Arg	Arg
Ile(I)	Leu; Val; Met; Ala; Phe노르로이신	Leu
Leu(L)	노르로이신; Ile; Val;Met; Ala; Phe	Ile
Lys(K)	Arg; Gln; Asn	Arg
Met(M)	Leu; Val; Ile; Ala	Leu
Phe(F)	Leu; Val; Ile; Ala	Leu
Pro(P)	Gly	Gly
Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr	Tyr
Tyr(Y)	Trp; Phe; Thr; Ser	Phe
Val(V)	Ile; Leu; Met; Phe;Ala; 노르로이신	Leu

mpl 리간드의 기능 또는 면역적 정체에 있어서의 실질적 개질은 (a) 치환 영역에서의 폴리펩티드 골격 구조(예: 시트 또는 나선형 형태), (b) 목적 부위의 분자의 하전 또는 소수성, (c) 측쇄의 부피를 유지하는데 대한 각각의 영향력이 상이한 치환기를 선택함으로써 달성된다. 자연 발생하는 잔기들은 공통적인 측쇄 특성을 기준으로 하여 몇개의 군으로 나뉜다:

(1) 소수성: 노르로이신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr;

(3) 산성: Asp, Glu;

(4) 염기성: Asn, Gln, His, Lys, Arg;

(5) 체인 배향에 영향을 주는 잔기들: Gly, Pro; 및

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe

비보존성 치환기들은 이들 부류의 한 일원을 다른 부류의 일원과 치환하는 것이다. 이러한 치환 잔기들은 또한 보존 치환 부위 또는 바람직하게는 보존 부위 또는 더욱 바람직하게는 나머지(비보존) 부위에 도입될 수 있다.

본 발명의 실시 태양에서, 분자 중에 존재하는 하나 이상의 프로테아제 부위를 활성화시키는 것이 바람직하다. 이들 부위들은 암호화된 아미노산 서열을 검사(트립신의 경우, 예를 들어, 아르긴 또는 라이신 잔기를 인식함)함으로써 동정된다. 프로테아제 절단 부위가 동정되면, 이들을 다른 잔기, 바람직하게는 글루타민과 같은 염기성 잔기 또는 세린과 같은 소수성 잔기로 치환함으로써; 또는 이 잔기를 탈락시킴으로써; 또는 이 잔기 직후에 프롤릴 잔기를 삽입함으로써 단백질 절단 부위를 불활성화시킨다.

또다른 실시 태양에서, 신호 서열의 출발 메티오닐 잔기를 제외한 모든 메티오일 잔기 또는 각각의 이러한 메티오닐 잔기에 대해 C- 또는 N-말단 쪽으로 3 개 잔기 만큼 떨어진 잔기를 다른 잔기(바람직하게는 표3에 기재된 바와 같이)로 치환하거나 또는 탈락시킨다. 다른 방법에서는, 약 1 내지 3개의 잔기를 이러한 부위에 인접하게 삽입시킨다.

mpl 리간드의 적당한 형태를 유지하는 데 관여하지 않는 모든 시스테인 잔기들도 일반적으로 세린과 치환되어 분자를 산화적 안정성을 개선시키고 이상(異常)적 가교형성을 방지할 수 있다. 아미노 말단에서부터 번호를 매길 경우, epo 도메인의 첫번째 및 네번째 시스테인은 적당한 형태를 유지하는데 필요하며 두번째 및세번째 시스테인은 그렇지 않다는 것이 밝혀졌다. 따라서, epo 도메인의 두번째및 세번째 시스테인은 치환할 수 있다.

mpl 리간드의 아미노산 서열 변형형을 암호화하는 핵산 분자들은 당업계에 공지된 방법에 따라 제조된다. 이들 방법에는 천연 소스로부터의 단리(자연 발생 아미노산 서열 변형형의 경우) 또는 올리고뉴클레오티드 매개(또는 부위 지향) 돌연변이 발생, PCR 돌연변이 발생 및 mpl 리간드 폴리펩티드의 초기 제조 변형체 또는 미변형 버젼의 카세트 돌연변이 발생에 의한 제조법이 포함된다.

올리고뉴클레오티드 매개 돌연변이 발생이 mpl 리간드 DNA의 치환, 탈락, 및 삽입 변형체의 제조에 바람직한 방법이다. 이 기술은 아델만등에 의해 문헌[DNA, 2:183[1983]]에 게재된 바와 같이 당업계에 공지되어 있다. 요컨대, mpl 리간드 DNA를 목적 돌연변이를 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 DNA 주형(이 주형은 mpl 리간드의 변경된 또는 천연의 DNA 서열을 함유하는 플라즈미드 또는 박테리오파지의 단일 스트랜드이다)에 혼성화함으로써 변경한다. 혼성화 이후, DNA 폴리머라제를 이용하여 올리고뉴클레오티드 프리머가 삽입되어 mpl 리간드 DNA에서의 특정의 변경체를 암호화하는 이 주형의 전체적 두번째 상보적 스트랜드를 합성한다.

일반적으로, 길이가 25 뉴클레오티드 이상인 것이 이용된다. 최적의 올리고뉴클레오티드는 돌연변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 양단의 어느 한쪽의 주형과 완전히 상보적인 12 내지 15 뉴클레오티드이다. 이로서 이 올리고뉴클레오티드가 단일 스트랜드의 DNA 주형 분자에 적절히 혼성화할 것이 보장된다. 이 올리고뉴클레오티드들은 Crea 등에 의해 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:5765[1978]]에 기재된 바와 같이 당업계에 공지된 기술을 이용하여 쉽게 합성할 수 있다.

DNA 주형은 Viera 등에 의해 문헌[Meth. Enzymol., 153:3[1987]]에 기재된 바와 같이 박테리오파지 M13 벡터(시판되는 M13mp18 및 M13mp19가 적당함) 또는 단일 스트랜드 파지의 복제 기원을 함유하는 벡터들로부터 유도된 벡터에 의해서 제조될 수 있다. 이 단일 스트랜드 주형은 Sambrook등에 의해 문헌[Molecular Cloning:A Laboratpty Manual(Cold Spring Harbor Labortory Press, NY 1989)]의 4.21-4.41 섹션에 기재되었다.

또다른 방법에서, 단일 스트랜드 DNA 주형은 표준 기술을 이용하여 이중 스트랜드 플라즈미드를 변성시킴으로써 제조할 수 있다.

천연의 DNA 서열의 변경에서(예를 들어 아미노산 서열 변형체의 제조), 올리고뉴클레오티드는 적당한 혼성화 조건 하에서 단일 스트랜드 주형과 혼성화된다. DNA 중합 효소, 통상 DNA 폴리머라제 I의 클레브나우 절편을 가하여 합성에 쓰이는 프리머로서 이 올리고뉴클레오티드를 이용하여 주형의 상보적 스트랜드를 합성한다. 이로서 헤테로 이중 분자가 형성되며 DNA 중 한 스트랜드는 mpl 리간드의 돌연변이형을 암호화하고 다른 스트랜드(본래의 주형)는 천연의 변경되지 않은 서열을 암호화한다. 이 헤테로 이중 분자를 적당한 숙주 세포(통상, E.coli JM101와 같은 원핵세포)로 형질 전환시킨다. 세포들을 성장시키고, 이들을 아가로즈 플레이트 상에 접종하고 32-포스페이트로 방사능 표지된 올리고뉴클레오티드 프리머를 이용하여 검색하여 돌연변이 DNA를 함유하는 세균 집락을 동정한다. 후속하여 돌연변이 영역을 제거하고 단백질 제조를 위한 적당한 벡터, 일반적으로 적당한 숙주 세포의 형질 전환에 통상적으로 이용되는 유형의 발현 벡터에 도입시킨다.

바로 위에 기술한 방법은 두개의 플라즈미드가 돌연변이를 함유하는 호모 이중 분자를 만들어내도록 개질될 수 있다. 개질 방법은 다음과 같다: 단일 스트랜드 올리고뉴클레오티드를 상기 방법과 같이 단일 스트랜드 주형에 결찰시킨다. 3종의 데옥시리보뉴클레오티드(데옥시리보아데노신(dATP), 데옥시리보구아노신(dGTP) 및 데옥시리보티미딘(dTTP)의 혼합물을 dCTP-(aS)로 불리우는 개질된 티오-데옥시리보시토신(Amersham Coporation으로부터 구입가능)과 합친다. 이 혼합물을 주형-올리고뉴클레오티드 착물에 가한다. 이 혼합물에 DNA 폴리머라제를 가하면, 돌연변이 염기를 제외하고 나머지는 상기 주형과 동일한 DNA 스트랜드가 제조된다. 또한, DNA의 이 새로운 스트랜드는 dCTP 대신, dCTP-(aS)를 함유하는데 이는 제한 엔도뉴클레아제 가수분해로부터 보호하는 기능을 한다.

이중 스트랜드 헤테로 이중체의 주형 스트랜드가 적당한 제한 효소에 의해 닉킹된후, 이 주형 스트랜드는 돌연변이화될 부위를 함유하는 영역 이후가 ExoIII 뉴클레아제 또는 다른 적당한 뉴클레아제로 가수분해될 수 있다. 이어서 이 반응을 중지시켜 부분적으로 단일 스트랜드화된 분자를 얻는다. 완전한 이중 스트랜드화 DNA 호모 이중체는 4개 모두의 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, ATP 및 DNA리가제의 존재하에 DNA 폴리머라제를 이용하여 제조한다. 이어서 이 호모듀플렉스 분자를 상기한 바와 같이 E.coli JM101와 같은 적당한 숙주 세포를 형질 전환시키는데 이용한다.

하나 이상의 치환될 아미노산을 가진 mpl 리간드 돌연변이를 암호화하는 DNA는 여러가지 방법에 의해 제조될 수 있다. 아미노산들이 폴리펩티드 체인 중에 가까이 위치해 있을 경우, 이들은 목적 아미노산 치환기 모두를 코딩하는 하나의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 돌연변이화할 수 있다. 그러나, 이 아미노산들이 서로 멀리 떨어져 있을 경우(10개 아미노산만큼 떨어져 있을 경우), 목적하는 변화 모두를 암호화하는 단일 올리고뉴클레오티드를 제조하는 것은 더 어려워진다. 이 방법 대신, 두개의 다른 방법을 이용할 수 있다.

첫번째 방법에서, 별도의 올리고뉴클레오티드가 치환될 각각의 아미노산에 대하여 제조된다. 이어서 올리고뉴클레오티드를 단일 스트랜드화 주형 DNA와 동시에 결찰하고 이 주형으로부터 합성된 두번째 DNA 스트랜드는 목적하는 아미노산 치환기 모두를 암호화할 것이다.

다른 방법에서는 목적 돌연변이를 제조하기 위해서 돌연변이 발생을 2회 이상 수행한다. 첫회는 단일 돌연변이에 대해 기술된 바와 같다: 야생형 DNA를 주형으로 이용하고, 첫번째 목적 아미노산 치환기(들)을 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 이 주형에 결찰시키고 헤테로듀플렉스 DNA 분자를 제조한다. 2회째의 돌연변이 발생에서는 첫회째의 돌연변이 발생에서 제조된 돌연변이 DNA를 주형으로서 이용한다. 이로서, 이 주형은 하나 이상의 돌연변이기를 포함한다. 추가의 목적하는 아미노산 치환기를 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 이 주형에 결찰하고, 이로서 얻어지는 DNA의 스트랜드는 첫회 및 두번째회의 돌연변이 발생으로부터의 돌연변이기를 암호화한다. 얻어지는 이 DNA는 세번째 이후 회의 돌연변이 발생에 이용될 수 있다.

PCR 돌연변이도 mpl 리간드 폴리펩티드의 아미노산 변형체를 제조하는데 적당하다. 하기 기술이 DNA에 관한 것이기는 하지만, 이 기술은 또한 RNA에 적용될 수 있다는 것을 알 수 있다. PCR 기술은 일반적으로 하기 방법에 의한 것이다[Erlich, supra, R. Higudhi, p, 61-70): 소량의 주형 DNA를 PCR에서 출발 물질로서 이용할 경우, 주형 DNA의 대응하는 영역으로부터의 서열과 약간 다른 프리머를 이용하여 프리머가 주형과 다른 위치에서만 주형 서열과 다른 특정 DNA 절편을 비교적 다량 제조할 수 있다. 플라즈미드 DNA로의 돌연변이의 도입을 위해서는 프리머 중 하나를 돌연변이 위치와 중복하여 돌연변이기를 포함하도록 기획해야 하고 프리머 중 다른 하나는 플라즈미드의 상대방 서열의 연장과 동일해야 하나 이 서열은 플라즈미드 DNA내의 어느 곳에도 위치할 수 있다. 그러나 두번째 프리머의 서열은 첫번째 프리머 서열로부터 200 뉴클레오티드이내의 거리에 위치하여 마지막 단계에서 이 프리머에 결합된 DNA의 전체 증량된 영역이 쉽게 서열 규명될 수 있도록 할 수 있다. 상기 프리머 쌍과 같은 프리머 쌍을 이용하여 PCR 증량할 경우 프리머에 의해 규정되는 돌연변이 위치에서 다르고 주형 복사 중 약간의 오차가 발생할 수 있으므로 때에 따라서는 다른 위치에서도 상이한 한 무리의 DNA 절편들이 제조된다.

생성물 물질에 대한 주형의 비율이 아주 저조한 경우, 매우 다량의 생성물 DNA에 목적하는 돌연변이가 삽입된다. 이 생성물질은 표준 DNA 기술을 이용하여 PCR 주형 역할을 하는 플라즈미드에서 대응하는 영역을 치환하는데 이용된다. 별도 위치에서의 돌연변이는 두번째 돌연변이 프리머를 이용하거나 또는 상이한 돌연변이 프리머를 이용하여 제2의 PCR을 수행한후 얻어지는 이 2개의 PCR 절편을 3개(이상) 부분 리게이션으로 벡터 절편에 동시에 연결시킴으로써 도입될 수 있다.

PCR 돌연변이발생의 특정 예에서, 주형 플라즈미드 DNA(1μg)를 증량될 영역 외부에 플라즈미드 DNA내의 독특한 인식 부위를 가지는 제한 엔도뉴클레아제를 이용하여 가수분해함으로써 직쇄화한다. 이 물질중 100 ng을 PCR 완충액을 함유하는 PCR 혼합물(4종의 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트를 함유하며 GeneAmp (등록상표)키트(Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT 및 Emerymille, CA로부터 구입)에 들어 있으며, 각각의 올리고뉴클레오티드 프리머 25 pmole을 함유하며 최종 부피가 50 ul임)에 가한다. 이 반응 혼합물을 광유 35 ul에 가한다. 이 반응 혼합물을 100℃에서 5분간 변성시키고, 얼음위에 단시간 정치한 후, 1 ul Thermus aquaticus(Taq) DNA 폴리머라제(5유니트/ul, Perkin-Elmer Cetus로부터 구입)를 광유층 아래에 가한다.

이 반응 혼합물을 하기 사항과 같이 프로그램된 DNA 터멀 시클러(Perkin-Elmer Cetus로부터 구입)에 가하였다.

2분, 55℃

30초, 72℃

하기 사이클을 19회:

30초, 94℃

30초, 55℃ 및

30초, 72℃.

프로그램 수행 종료후에, 반응 바이알을 터멀 시클러로부터 꺼내서 수상을새 바이알에 옮기고 페놀/클로로포름(50:50 용량)로 추출하고 에탄올로 침전시키고 DNA를 표준 방법에 따라 회수하였다. 이 물질을 후속하여 적당히 처리하여 벡터로 삽입하였다.

변형체를 제조하는 또다른 방법인, 카세트 돌연변이 발생은 Wells 등에 의해 문헌[Gene, 34:315[1985]]에 기재된 바와 같은 기술에 그 근거를 두고 있다. 출발 물질은 돌연변이화할 mpl 리간드 DNA를 포함하는 플라즈미드(또는 다른 벡터)이다. mpl 리간드 DNA 중에서의 코돈을 동정한다. 동정된 돌연변이 부위의 각 측에 독특한 제한 엔도뉴클레아제 부위가 있어야 한다. 이러한 제한 부위가 존재하지 않으면, 이들은 상기 올리고뉴클레오티드 매개 돌연변이 발생을 이용하여 mpl 리간드 DNA 중의 적당한 위치에 이들을 도입함으로써 제조될 수 있다. 제한 부위가 플라즈미드에 도입된 후에는, 플라즈미드를 이 부위에서 절단하여 직쇄화한다. 이 제한 부위들 사이의 DNA를 암호화하지만 목적하는 돌연변이를 포함하는 이중 스트랜드화 올리고뉴클레오티드를 표준 방법을 이용하여 합성한다. 이 두 스트랜드는 별도로 합성한 후, 표준 기술을 이용하여 혼성화하였다. 이 이중 스트랜드화 올리고뉴클레오티드를 카세트라고 부른다. 이 카세트는 플라즈미드에 직접 연결될 수 있도록, 직쇄화 플라즈미드의 말단에 들어 맞는 3' 및 5'말단을 가지도록 계획된다. 이제 이 플라즈미드는 돌연변이된 mpl 리간드 DNA 서열을 포함한다.

C. 복제가능한 벡터로의 핵산의 삽입

천연 또는 변형 mpl 리간드 폴리펩티드를 암호화하는 핵산(예: cDNA 또는 게놈 DNA)를 후속 클로닝 단계(DNA의 증량) 또는 발현 단계를 위해 복제 가능한 벡터에 삽입한다. 많은 벡터가 이용가능하며, 적당한 벡터는 (1) DNA 증량 또는 DNA 발현에 이용될 수 있는지 여부, (2) 벡터에 삽입될 핵산의 크기, (3) 벡터로 형질변환될 숙주 세포에 따라 선택된다. 각각의 벡터는 그의 기능(DNA의 증량 또는 DNA의 발현) 및 적당한 숙주 세포에 따라 다양한 성분들을 포함한다. 벡터성분에는 신호 서열, 복제 시작부, 하나이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종료 서열로 구성되는 군으로부터의 하나 이상의 하기 성분을 포함하며 단, 이에만 국한되는 것은 아니다.

(i) 신호 서열 성분

본 발명의 mpl 리간드는 직접뿐 아니라, 이형성 폴리펩티드, 바람직하게는 신호 서열 또는 성숙한 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특정 절단 부위를 가지는 기타 폴리펩티드와의 융합체로서 발현될 수 있다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 한 성분일 수 있거나 또는 이 벡터가 삽입되는 mpl 리간드 DNA의 한 부분일 수 있다. 선택된 이형성 신호 서열은 숙주 세포에 의해서 인식되고 처리되는(예: 신호 펩티다제에 의해 절단됨) 것이어야 한다. mpl 리간드 신호 서열을 인식하고 처리할 수 없는 원핵세포 숙주세포의 경우, 신호 서열을 예를 들어, 알칼리 포스파타아제, 페니실리나제, Ipp, 또는 열안정성 엔테로톡신 II 리더들로 구성된 군으로부터 선택된 원핵 세포 신호 서열로 치환시켜야 한다. 이스트 분비를 위해서는 천연의 서열 신호를 예를 들어, 이스트 인버타제, 알파 인자, 또는 산 포스포타제 리더즈, C, 알비칸즈 글루코밀라제 리더(1990년 4월 4일 공개된 유럽 특허 제362,179호) 또는 1990년 11월 15일 공개된 국제공개 제90/13646호에 기재된 신호에 의해치환될 수 있다. 포유류 세포 발현에서, 천연의 신호 서열(예: 생체내에서 그의 천연 포유류 세포로부터 mpl 리간드를 통상 분비하게 하는 mpl 리간드 전서열)은 만족할 만하다 그러나, 바이러스성 분비 리더(예: 헤르페스 심플렉스 gD 신호)뿐 아니라 기타 mpl 리간드 폴리펩티드 또는 상이한 동물 종으로 부터의 동일한 mpl 리간드로부터의 신호 서열, mpl 리간드의 신호 서열, 및 동일하거나 또는 관련된 종의 분비 폴리펩티드와 같은 다른 포유류 신호 서열들은 적당할 수 있다.

(ii) 복제 기점 성분

발현 및 클로닝 벡터는 모두 하나 이상의 선택된 숙주 세포 중에서 벡터가 복제할 수 있게 하는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터내에서, 이 서열은 숙주세포의 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있게 하는 것으로서, 복제 기점, 즉 자발적으로 복제하는 서열을 포함한다. 이러한 서열은 다양한 세균, 이스트 및 바이러스에서 잘 공지되어 있다. 플라즈미드 pBR322로부터의 복제 시작서열은 대부분의 그램 양성 세균에 적합하고, 2μ 플라즈미드 시작서열은 이스트에 유용하고 다양한 바이러스성 시작 서열(SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유류 세포중에서의 클로닝 벡터로서 유용하다. 일반적으로, 복제 시작서열 성분은 포유류 발현 벡터에게는 필요하지 않다(SV40 시작 서열은 초기 프로모터를 포함하기 때문에 통상 이용된다).

대부분의 발현 벡터는 "셔틀" 벡터이다, 즉 이들은 하나 이상의 부류의 유기체에서 복제가 가능하나 다른 유기체에 감염되어 발현될 수 있다. 예를 들어, 벡터는 E.coli에서 클로닝된 후, 비록 숙주 세포의 염색체와 무관하게 복제할 수는없지만 이 동일한 벡터를 이스트 또는 포유류 세포로 그 발현을 위해 감염시킨다.

DNA는 또한 숙주 게놈으로의 삽입에 의해 증량될 수 있다. 이는 숙주로서 바실러스 종을 이용하여 예를 들어, 바실러스 게놈 DNA 중에서 발견되는 서열에 상보적인 DNA서열을 벡터에 도입시킴으로써 용이하게 달성될 수 있다. 이 벡터로 바실러스를 감염시키면 게놈과 상동적 재조합되어 mpl 리간드 DNA가 삽입된다. 그러나, mpl 리간드를 암호화하는 게놈 DNA의 회수는 제한 효소 가수분해에는 mpl 리간드 DNA를 절단해야 할 필요가 있기 때문에 외인적으로 복제된 벡터를 회수하는 것보다 더 복잡하다.

(iii) 유전자 성분 선택

발현 및 클로닝 벡터는 선택 유전자(선택가능한 마커라고도 불리움)을 함유하여야 함다. 이 유전자는 선택 배양 배지에서 성장되는 형질 전환된 생존 또는 성장에 필요한 단백질을 암호화한다. 선택 유전자를 포함하는 벡터로 형질 전환되지 않은 숙주 세포들은 선택 배양 배지에서 살아남지 못한다. 전형적인 선택 유전자들은 (a)항생제 또는 톡신, 예를 들어, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라시클린에 대해 내성을 부여하거나, (b) 독립영양 결핍을 보완하거나, 또는 (c) 복합 배지에서 얻을 수 없는 필수 영양소(바실러스의 경우, 유전자 암호화 D-알라닌)를 공급하는 단백질을 암호화한다.

선택 도식의 한가지 예에서는 숙주 세포의 성장을 저지하기 위해 약물을 이용한다. 이형성 유전자로 성공적으로 형질 전환된 이러한 세포들은 약물 내성을 부여하는 단백질을 발현시키고 이로서 선택적 섭생에서 살아남는다. 이러한 우성선택의 한 예에서는 약물 네오마이신(Southern et al.,J.Molec. Appl. Genet., 1:327[1982]), 마이코페놀산(Mulligan et al., Science, 209:1422[1980]) 또는 히그로마이신(Sudgen et al., Mol. Cell. Biol.,5:410-413[1985])을 이용한다. 상기 주어진 세가지 예들은 각각 적당한 약물 G418 또는 네오마이신(제네티신), xgpt(마이코페놀산), 또는 히그로마이신에 내성을 부여하기 위하여 진핵 세포 통제하에 세균성 유전자를 이용한다.

포유류 세포에 이용되는 다른 적당한 선택 가능한 마커의 예로는 디히드로폴레이트(DHFR) 또는 티미딘 키나제와 같은 mpl 리간드 핵산을 취득할 수 있는 세포를 동정할 수 있는 예들이다. 포유류 세포 형질 전환체들은 형질 전환 세포들이 마커를 취득함으로써 살아남을 수 있도록 적응되는 선택 압력하에 놓인다. 선택 압력은 배지에서의 선택 시약의 농도를 단계적으로 변화시켜 선택 유전자 및 mpl 리간드 폴리펩티드를 암호화하는 DNA가 증량되도록 하는 조건 하에서 형질 전환 세포를 배양함으로써 가해진다. 증량이란 성장에 필요한 단백질의 생산에의 요구가 더욱 커진 유전자가 재조합 세포의 연속된 세대의 염색체 내에서 반복되는 과정이다. 증량된 DNA에 의해 mpl 리간드의 양이 증가된다.

예를 들어,DHFR의 상경적 길항제인 메토트렉세이트(Mtx)를 함유하는 배양 배지중에서 형질 전환 세포 모두를 배양함으로써 우선 DHFR 선택 유전자에 의해 형질 전환된 세포들을 동정한다. 야생형 DHFR이 이용될 경우 적당한 숙주 세포는 Urlaub 및 Chasin에 의해 문헌[Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 77:4216[1980]]에 기재된 바와 같이 제조되어 번식된, DHFR 활성이 없는 차이니즈 햄스터 난(CHO)세포주이다. 형질 전환된 세포들을 이어서 증가된 농도의 Mtx에 노출시킨다. 이는 DHFR 유전자의 다중 복제물 및 동시에 발현 벡터를 구성하는 다른 DNA(mpl 리간드를 암호화하는 DNA)의 다중 복제물의 합성을 유발시킨다. 가령, Mtx에 고도의 내성을 가지는 돌연변이 DHFR 유전자가 이용되어 내인성 DHFR이 존재하더라도(유럽특허 제117,060호) 이 증량 기술은 다른 적당한 숙주 세포(예: ATCC No. CCL61 CHO-K1)에서 이용할 수 있다. 다른 방법에서, 형질 전환되거나 또는 mpl 리간드, 야생형 DHFR 단백질 및 아미노글리코사이드 3' 포스포트랜스퍼라제(APH)와 같은 기타 선택 마커를 암호화하는 DNA 서열과 함께 형질 전환된 숙주 세포(특히 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주세포)들은 아미노글리코시딕 항생제(예: 카나마이신, 네오마이신 또는 G418과 같은 선택 가능한 마커의 선택 시약을 함유하는 배지중에서 세포 성장시킴으로써 선택될 수 있다[미합중국 특허 제4,965,199호].

이용할 만한 적당한 선택 유전자는 이스트 플라즈미드 YRp7중에 존재하는 trp1유전자이다[Stinchcomb et al., Nature, 282:39[1979]; Kingsman et al., Gene,7:141[1979]; 또는 Tschemper et al.,Gene, 10:157[1980]). trp1유전자는 트립토판에서 성장할 수 없는 이스트 돌연변이주(예:ATCC No.44076 또는 PEP4-1)에게 선택 마커를 제공한다(Jones, Genetics, 85:12[1977]). 이스트 숙주 세포 게놈 중의 trp1병변의 존재는 트립토판의 부재하에서의 성장에 의해 형질 전환여부를 검출할 수 있는 효과적인 환경을 제공한다. 마찬가지로, Leu-2 결핍 이스트 균주(ATCC No.20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 가지는 공지된 플라즈미드에 의해 보완된다.

(iv) 프로모터 성분

발현 및 클로닝 벡터는 통상 숙주 유기체에 의해 인식되며 mpl 리간드 핵산에 기능가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 프로모터들은 이들이 기능가능하게 연결된, mpl 리간드 핵산 서열과 같은 특정 핵산 서열의 전사 및 번역을 통제하는 구조 유전자(일반적으로 100 내지 1000bp)의 출발 코돈의 상류쪽(5')에 위치하는 미번역 서열이다. 이러한 프로모터들은 통상 유도성 및 구성성의 2가지 부류에 해당한다. 유도성 프로모터들은 배양 조건에 있어서의 변화(예: 영양소의 존재 또는 부재 또는 온도의 변화)에 반응하여, 이들이 조절하고 있는 DNA로부터의 전사 수준을 증가시키는 프로모터들이다. 현재, 다양한 잠재적인 숙주 세포들에 의해 인식되는 많은 프로모터들이 공지되어 있다. 이들 프로모터들은 제한 효소 가수 분해에 의해 소스 DNA로부터의 프로모터를 제거하고 벡터에 단리된 프로모터 서열을 삽입함으로써 mpl 리간드 암호화 DNA에 기능가능하게 결합되어 있다. 천연 mpl 리간드 프로모터 서열 및 많은 이형성 프로모터들이 mpl 리간드 DNA를 증량 및(또는) 발현시키는데 이용될 수 있다. 그러나, 이형성 프로모터들이 천연 mpl 리간드 프로모터에 비하여 일반적으로 더 높은 전사 및 더 높은 수율의 발현 mpl 리간드를 제공하기 때문에 이형성 프로모터들이 바람직하다.

원핵 숙주 세포에 이용하기 적당한 프로모터들에는 β-락타마제 및 락토즈 프로모터계(Chang et al., Nature, 275:615[1978]; 및 Goeddel et al., Nature, 281:544[1979]), 알칼린 포스파타제, 트립토판(trp) 프로모터계(Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057[1980] 및 유럽 특허 제36,776호) 및 tac 프로모터와 같은 혼성프로모터(deBoer et al., Proc. Natl. Sci. USA, 80:21-25[1983])가 포함된다. 그러나, 다른 공지된 프로모터들도 적당하다. 이들의 뉴클레오티드 서열들은 공개되어 있어, 숙련가들이 임의의 요구되는 제한 위치를 제공하기 위하여 링커 또는 어댑터를 이용함으로써 mpl 리간드를 암호화하는 DNA에 이들을 연결시킬 수 있게 한다(Siebenlist et al., Cell, 20:269[1980]). 세균계에서 이용되는 프로모터들도 mpl 리간드 폴리펩티드를 암호화하는 DNA에 기능가능하게 연결된 Shine-Dalgano(S.D.) 서열을 포함할 것이다.

프로모터 서열은 진핵세포에 있어서도 알려져 있다. 사실상 모든 유전자들내 에 전사가 시작되는 부위로부터 약 25 내지 30 염기만큼 상류에 위치한 AT-풍부 영역이 존재한다. 많은 유전자의 전사 시작점으로부터 70 내지 80 염기만큼 상류에서 발견되는 또다른 서열은 X가 임의의 뉴클레오티드일 수 있는 CXCAAT 영역이다. 코딩 서열의 3'말단의 폴리A 테일의 첨가에 대한 신호일 수 있는 AATAAA 서열은 대부분의 유전자의 3'말단에 위치한다. 이들 서열들은 진핵 세포의 발현 벡터에 적당히 삽입된다.

이스트 숙주세포에 이용되는 적당한 프로모터 서열의 예에는 3-포스포글리세레이트 키나재(Hitzeaman et al., J.Biol. Chem 255:2073[1980]) 또는 에놀라제, 글리세알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 디카르복실라제, 포스포프륵토키나제, 글루코즈-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오즈포스페이트 이소머라제, 포스포글로코즈 이소머라제, 및 글루코키나제와 같은 기타 글리콜리틱 효소(Hess et al., J. Adv.Enxyme Reg., 7:149[1968] 및 Holland, Biochemistry, 17:4900[1978])가 포함된다.

성장 조건에 의해 조절되는 전사의 추가의 잇점을 가지는 유도성 프로모터인, 다른 이스트 프로모터들은 알콜 디히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 관련된 분해성 요소, 메탈로티오네인, 글리세알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 및 말토즈 및 갈락토즈 이용에 관여하는 효소의 프로모터 영역이다. 이스트 발현에 이용하는 적당한 벡터 및 프로모토는 추가로 문헌[Hitzman et al., 유럽 특허 공개 제73,657호]에 기재되어 있다. 이스트 인핸서들도 이스트 프로모터와 함께 이용하면 유리하다.

포유류 숙주 세포의 벡터로부터의 mpl 리간드 전사는 예를 들어, 폴리오마 바이러스, 플로우폭스 바이러스(1989년 7월 5일 공개된 영국 특허 2,211,504호), 아데노바이러스(아데노바이러스2), 소 파필로마 바이러스, 아비안 사코마 바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스, 헤파티티스-B 바이러스 및 가장 바람직하게는 시미안 바이러스 40(SV40)와 같은 바이러스의 게놈으로부터 얻어지는 프로모터, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터와 같은 이형성 포유류 프로모터 및 통상 mpl 리간드 서열에 연결되어 있는 프로모터에 의해 조절된다, 단, 이러한 프로모터들은 숙주 세포계에 적합하여야 한다.

SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터들은 SV40 바이러스 복제 기점을 함께 포함하는 SV40 제한 절편으로서 얻어진다[Fiers et al., Nature, 273:113[1978]; Mulligan and Berg, Science, 209:1422-1427[1980]; Pavlakis et al., Proc. Natl. Acad.Sci.USA, 78:7398-7402[1981]. 인간 시토메갈로바이러스의초기 프로모터는 HindIII E 제한 절편으로서 유리하게 얻어진다[Greenaway et al., Gene, 18:355-360[1982]). 벡터로서 소 파필로마 바이러스를 이용하는 포유류 숙주내에서 DNA를 발현하는 계는 미합중국 특허 제4,419,446호에 기재되어 있다. 이 계의 개질계는 미합중국 특허 제4,601,978호에 기재되어 있다. 또한 원숭이 세포내에서 면역 인터페론을 암호화하는 cDNA를 발현하는 것에 대해서는 문헌[Gray et al., 295:503-508[1982], 헤르페즈 심플렉스 바이러스로부터의 티미딘 키나제 프로모터의 조절하에 마우스 세포내에서 인간 β-인터페론 cDNA를 발현시키는 것에 대하여는 문헌[Reyes et al., Nature, 297:598-601[1982]], 마우스 및 래트 배양 세포중에서의 인간 인터페론 β1 유전자를 발현시키는 것에 대해서는 Canaani and Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:5166-5170[1982]] 및 프로모터로서 라우스 사코마 바이러스 장말단 반복체를 이용하여 CV-1 원숭이 신장 세포, 병아리 배 적아, 차이니즈 햄스터 난세포, HeLa 세포 및 마우스 NIH-3T3 세포내에서 세균성 CAT 서열을 발현시키는 것에 대해서는 문헌[Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:6777-6781[1982]를 참조할 수 있다.

(v) 인핸서 요소 성분

고등 진핵세포에 의한 본 발명의 mpl 리간드를 암호화하는 DNA의 전사는 종종 벡터로 인핸서 서열을 삽입함으로써 증가한다. 인핸서들은 프로모터에 작용하여 그의 전사를 증가시키는, 통상 약 10 내지 300 bp의 DNA의 시스-작용 요소이다. 인핸서들은 코딩 서열 자체(Osborne et al., Mol. Cell Bio., 4:1293[1984])내에서 뿐아니라 인트론[Banerji et al., Cell, 33:729[1983]내에서의 전사 유니트의 5'(Laimins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:993[1981] 및 3'[Luski et al., Mol. Cell Bio., 3:1108[1983])에서 발견되어, 상대적으로 배향 및 위치에 무관하다. 많은 인핸서 서열들이 포유류 유전자(글로빈, 엘라스타제, 알부민, a-피토단백질 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 그러나, 통상 진핵 세포 바이러스의 인핸서가 이용된다. 그 예에는 복제기점의 후반측의 SV40 인핸서(100-270 bp), 시토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제기점의 후반측의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서가 포함된다. 진핵 세포 프로모터의 인핸서 요소에 대해서는 문헌 [Yaniv et al., Nature, 297:17-18[1982]]를 참조할 수 있다. 인핸서는 벡터에서 mpl 리간드 암호화 서열의 3' 또는 5' 위치로 연결될 수 있으나, 바람직하게는 프로모터의 5'부위에 위치한다.

(vi) 전사 종료 성분

진핵 숙주 세포(이스트, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다핵 유기체들로부터의 유핵 세포들)내에서 이용되는 발현 벡터들은 또한 전사를 종료하고 mRNA를 안정화하는 데 필요한 서열들을 포함할 것이다. 이러한 서열들은 통상 진핵세포 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 미번역 영역의 5' 및 때때로 3'에 위치한다. 이들 영역들은 mpl 리간드를 암호화하는 mRNA의 미번역 부분내의 폴리아데닐화 절편으로 전사되는 뉴클레오티드 조각을 가진다.

(vii) 벡터의 구성 및 분석

하나 이상의 상기 성분들을 함유하는 적당한 벡터를 만들기 위해서는 표준 결찰 기술이 이용된다. 단리된 플라즈미드 또는 DNA 절편들을 절단하고, 테일러링하고 재결찰시켜 목적하는 플라즈미드를 제조하는데 필요한 형태로 만든다.

제조된 플라즈미드내의 서열의 정확성을 확인하기 위한 분석에서, 상기 결찰 혼합물을 이용하여 E.coli K12 균주 294(ATCC No. 31,446)을 형질 변환시키고 성공적으로 형질 변환된 세포들을 적당히 암피실린 또는 테트라시클린 내성 소유 여부에 따라 선별하였다. 형질 변환체로부터 플라즈미드를 얻고, 제한 엔도뉴클리아제 가수분해에 의해 분석하고 (또는) Messing 등에 의해 문헌[Nucleic Acids Res., 9:309[1981]에 기재된 방법 또는 Mexam 등에 의해 문헌[Methods in Enzymology, 65:499[1980]]에 기재된 방법에 의해 서열 규명하였다.

(viii) 일시적 발현 벡터

mpl 리간드 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포유류 세포중에서 일시적으로 발현할 수 있게 하는 발현 벡터는 본 발명의 실행상 특히 유용하다. 일반적으로, 일시적 발현에는 숙주 세포내에서 능률적으로 복제할 수 있는 발현 벡터가 이용되어 숙주세포내에 발현 벡터의 복제물이 많이 축적되고 따라서 이 발현 벡터에 의해 암호화되는 목적 폴리펩티드가 고농도로 합성되게 된다[Sambrook et al., supra pp16.17-16.22]. 적당한 발현 벡터 및 숙주 세포로 구성되는 일시적 발현계를 이용함으로써 클로닝된 DNA에 의해 암호화된 폴리펩티드를 편리하게 양성적 동정할 수 있고 목적하는 생물학적 또는 생리학적 특성을 가지는 폴리펩티드를 신속하게 검색할 수 있다. 이로서 일시적 발현계들은 mpl 리간드 폴리펩티드 생물학적 활성을 가지는 mpl 리간드 폴리펩티드의 유사체 및 변형체를 동정하는 목적에 있어서 본 발명에서 특히 유용하다.

(ix) 적당한 대표적인 척추동물 세포 벡터

재조합 척추동물 세포 배양물 중의 mpl 리간드의 합성에 적용되기에 적합한 다른 방법, 벡터 및 숙주 세포들이 문헌[Gething et al., Nature, 293:620-625[1981]; Mantei et al., Nature, 281:40-46[1979]; Levinson et al., 유럽 특허 제117,060호; 유럽 특허 제117,058호]에 기재되어 있다. 포유류 세포내에서의 mpl 리간드의 발현에 이용되는 특히 유용한 플라즈미드는 pRK5(유럽 특허 제307,247호, 미합중국 특허 제5,258.287호) 또는 pSV16B(PCT 공개 국제 공개 제91/08291호)이다.

D. 숙주 세포들의 선택 및 형질 전환

본 발명에서 벡터를 클로닝 또는 발현시키기 위해 적당한 숙주 세포들은 상기 원핵세포, 이스트 또는 고등 원핵 세포들이다. 적당한 원핵 세포들에는 그램 음성 또는 그램 양성 유기체(예: E.coli, B. 서브틸리스(subtilis)와 같은 바실러스(Bacilli), P. 아에루지노사(aeruginosa)와 같은 수도모나스(Pseudomonas) 종, 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella tynphimurium) 또는 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans)가 있다. E.coli B, E.coli X1776(ATCC No. 31,536) 및 E.coli W3110(ATCC No. 27,325)와 같은 다른 E.coli가 적당하기는 하지만, 바람직한 E.coli 클로닝 숙주는 E.coli 294(ATCC No. 31,446)이다. 이들 예들은 본 발명의 예시일뿐 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다. 바람직하게는 숙주 세포는 최소한의 양의 단백질 분해 효소를 분비하여야 한다. 다른 방법으로는, PCR 또는 다른 핵산 폴리머라제 반응과 같은 시험관내 클로닝법이 적당하다.

원핵세포뿐 아니라, 필라멘트성 버섯 또는 이스트와 같은 진핵성 미생물도 mpl 리간드 암호화 벡터의 숙주세포로서 적당하다. 사카로마이세스 세레비아에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 통상의 제빵 이스트가 하등 원핵성 숙주 미생물로서 가장 흔히 이용된다. 그러나 많은 다른 속,종 및 균주들을 흔히 구할 수 있고 본 발명에서 이용된다, 예를 들어 Schizosaccharomyces pombe(Beach and Nurse, Nature, 290:140[1981]; 1985년 5월 2일 공개된 유럽특허 139,383호), 예를 들어, K. lactis(Louvencourt et al., J.Bacteriol., 737[1983]), K. fragillis. K.bulgaricus, K.thermotolearns 및 K. marxianus와 같은 Kluyveromyces 숙주 세포(미합중국 특허 제4,943,529호), yarrowia[유럽특허 제402,226호], Pichia pastoris(유럽 특허 제183,070호; Sreekrina et al., J. Basic Microbiol.,28:265-278[1988]), Candida, Trichoderma reesia(유럽 특허 제 244,234호), Neurespora crassa(Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263[1979]),Neurospora, Penicillin, Tolypocalidium(1991년 1월10일 에 공개된 국제 공개 제91/00357호), 및 A. nidulans(Ballancd et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112:284-289[1983]; Tilburn et al., Gene, 26:205-221[1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474[1984]) 및 A. niger(Kelly 및 Hynes, EMBO J., 4:475-479[1985])와 같은 Aspergillus 숙주세포가 있다.

글리코실화 mpl 리간드의 발현을 위한 적당한 숙주 세포들은 다세포 유기체로부터 유래한다. 이러한 숙주 세포들은 복잡한 처리과정 및 글리코실화 활성을가진다. 원칙상, 모든 고등 진핵 세포 배지가 척추 동물 세포 또는 무척추 동물 세포에 관계없이 이용가능하다. 무척추 동물 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포가 있다. Spodoptera frugiperda(모충), Aedes aegypti(모기), Aedes aldopictus(모기), Drosophila melanogaster(프루트플라이) 및 Bombyx mori와 같은 숙주로부터의 많은 바이러스성 균주 및 변형체 및 대응하는 허용 곤충 숙주 세포가 동정되었다. Luckow et al., Bio/Technology, 6:47-55[1988]; Miler et al., Genetic Engineering, Setlow et al., eds., Vol.8(Plenum Publishing, 1986) pp. 277-279; 및 Nature, 315:592-594[1985]참조. 감염에 이용할 다양한 바이러스 균주들이 공지되어 있고(예: Autigrapha californica NPV의 L-1 변형체 및 Bombyx mori NPV의 Bm-5균주) 이러한 바이러스들은 본 발명에서 특히, Spodoptera frugiperda 세포의 감염을 위한 바이러스로서 이용될 수 있다.

목화, 옥수수, 감자, 소이빈, 페튜니아. 토마토 및 담배와 같은 식물 배양물도 숙주로서 이용될 수 있다. 통상, 식물 세포들은 mpl 리간드 DNA를 포함하도록 미리 조작된 세균 Agarobacterium tumefaciens의 특정 균주들과 함께 배양됨으로써 감염된다. 식물 세포 배양물을 A. tumefaciens와 배양함으로써 mpl 리간드를 암호화하는 DNA가 식물 세포로 옮겨져 이 식물 세포가 감염되고 적당한 조건 하에서 mpl 리간드 DNA가 발현된다. 또한 식물 세포에 적합한 조절 및 신호 서열(예: 노팔린 신세타제 프로모터 및 폴리아데닐화 신호 서열)도 구할 수 있다(Depoker et al., J,Mol. Appl. Gen., 1:561[1982]). 또한 T-DNA 780 유전자의 상류 영역에서 단리된 DNA 조각들은 재조합 DNA함유 식물 조직에서 식물 발현 가능 유전자들의 전사 정도를 활성화 및 증가시킬 수 있다(1989년 6월 21일 공개된 유럽 특허 제321,196호).

그러나, 척추동물 세포에 대한 관심이 최고에 달하며 최근 수년간 배양물(조직 배양물) 중에서의 척추 동물의 번식은 통상의 절차가 되었다(Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, editors[1973]]. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예에는 SV40(COS-7, ATCC CRL 1651)에 의해 감염된 원숭이 신장 CV1세포주; 인긴 배 신장 세포주(293세포 또는 현탁 배지내에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포)(Graham et al., J.Gen Viol., 36:59[1977]); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK, ARCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난세포/-DHFR(CHO)(Urlaub 및 Chasin, Proc. Natl. Sci. USA, 77:4216[1980]); 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251[1980]; 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 그린 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 세르비컬 카시노마 세포(HELA, ATCC CCL 2); 카닌 신장 세포(MDCK ATCC CCL 34); 버팔로 래트 신장 세포(BRL 3A ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 포유류 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68[1982]); MRC 5 세포; FS4 세포: 및 인간 헤파토마 세포주(Hep G2)가 있다.

숙주 세포들은 본 발명의 상기 발현 및 클로닝 벡터로 감염시키거나 바람직하게는 형질 변환시키고 프로모터 유도, 형질변이체 선별 또는 목적 서열을 암호화하는 유전자의 증량에 적합하도록 고안된 영양 배지 내에서 배양된다.

감염이란 코딩 서열들이 사실상 발현되는지에 관계없이 숙주세포에 의해 발현 벡터가 섭취되는 것을 의미한다. 많은 감염 방법이 통상의 숙련가에게 공지되어 있다, 예를 들면, CaPO₄법 및 전기 천공법이 있다. 감염의 성공 여부는 숙주 세포내에서 이 벡터의 작동의 표시 반응이 발생하는 것으로써 일반적으로 확인된다.

형질 전환은 DNA를 유기체내로 도입시켜 이 DNA가 염색체외적 요소 또는 염색체 내부에 구성 요소로서 복제가능하도록하는 것을 의미한다. 이용된 숙주 세포에 따라, Sambrook et al., supra에 기재된 바와 같이 염화칼슘을 이용하는 칼슘 처리가 실질적인 세포벽 차단막을 가지는 원핵세포 또는 다른 세포들에게 이용된다. Agarobacterium tumfacience는 Shaw 등에 의해 문헌[Gene, 23:315[1983] 및 1991년 1월 10일 공개된 국제 공개 제89/05859호]에 기재된 바와 같이 특정 식물 세포의 형질 변환에 이용된다. 이러한 세포벽이 없는 포유류 세포의 경우에는, 문헌[Graham 및van der Eb, Virology, 52:456-457]에 기재된 인산칼슘 침전법이 바람직하다. 포유류 세포 숙주계 형질전환의 일반적 사항들은 1983년 8월 16일 Axel에게 부여된 미합중국 특허 제4,399,216호에 기재되어 있다. 이스트로의 형질변환도 Van Solingen et al., J.Bact., 130:946[1977] 및 Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 76:3829[1978]에 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다. 그러나, 핵주입, 전기천공, 또는 원형질체 융합과 같이 세포로 DNA를 도입시키는 다른 방법들도 이용될 수 있다.

E. 숙주 세포 배양

본 발명의 mpl 리간드 폴리펩티드를 생산하는 원핵 세포들은 일반적으로 Sambrook et al., supra에 기재된 바와 같은 적당한 배지내에서 배양된다.

본 발명의 mpl 리간드를 생산하기 위해 이용되는 포유류 숙주 세포들은 다양한 배지 내에서 배양된다. Ham's F10(Sigma), Minimal Essential 배지([MEM], Sigma), RPMI-1640(Sigma) 및 Dulbecco's Modified Medium([DMEM], Sigma)와 같은 시판되는 배지들이 이 숙주 세포들을 배양하는데 적당하다. 또한, [Ham and Wallace, Meth. Enz., 58:44[1979], Barns and Sato, Anal. Biochem.,102:255[1980]; 미합중국 특허 제4,767,704호; 동 제4,657,866호; 동 제4,927,762호; 또는 동 제4,560,655호; 국제 공개 제90/03430; 동 제78/00195호; 미합중국 특허 참고 30,985호 또는 1990년 10월 3일 출원된 계류 중의 소비에트 연방 공화국 특허 07/592,107호 또는 07/592,141호(이들의 명세서들은 모두 본 명세서에 참고로서 채택되었다)에 기재된 임의의 배지가 상기 숙주 세포들의 배양 배지로서 이용될 수 있다. 임의의 이들 배지들은 호르몬 및(또는) 성장 인자(인슐린, 트랜스페리느 또는 에피더멀 성장 호르몬), 염(염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충액(HEPES), 뉴클레오시드(아데노신 및 티미딘), 항생제(겐타마이신^TM약물), 소량의 요소(통상 최종 농도 마이크로 몰농도로 존재하는 무기 화합물로 정의 ) 및 글루코즈 또는 당량의 에너지원이 필요한 만큼 보충될 수 있다. 기타 임의의 필요한 보충물들이 당업계에 공지된 적당한 농도로 포함될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건들은 발현에 선택된 숙주 세포에 대해 앞에서 이용된 조건들이며 통상의 당업계의 숙련가들에게는 주지의 사항들이다.

본 명세서에서 말하는 숙주 세포들은 숙주 동물내의 세포 뿐 아니라 시험관내 배지 내의 세포들을 포함한다.

F. 유전자 증량/발현 검출

유전자 증량 및(또는) 발현 양상은 샘플 중에서 직접 예를 들어, 본 명세서에 제공된 서열에 기초하여, 적절히 표지된 프로브를 이용하여, 서던 블로팅, mRNA 전사를 측정하는 노던 블로팅(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205[1980]) 또는 반응기내 혼성화함으로써 측정할 수 있다. 다양한 표지들, 가장 흔하게는 방사성동위원소, 특히³²P이 이용될 수 있다. 그러나, 다른 기술(예:비오틴으로 개질된 뉴클레오티드를 이용하여 폴리뉴클레오티드로 도입시키는 방법)도 이용될 수 있다. 후속하여 이 비오틴은 아비딘 또는 (방사성뉴클라이드, 형광물질, 효소 등과 같은 다양한 표지에 의해 표지될 수 있는) 항체의 결합 부위를 제공한다. 다른 방법에서 DNA 듀플렉스, RNA 듀플렉스, 및 DNA-RNA 혼성 듀플렉스 또는 DNA-단백질 듀플렉스를 포함하는 특정 듀플렉스를 인식할 수 있는 항체도 이용될 수 있다. 이어서 항체들을 표지하고 상기 듀플렉스가 표면에 부착하고, 표면에 듀플렉스가 존재함에 따라, 이 듀플렉스에 결합한 항체의 존재가 검출될 수 있는 분석을 수행한다.

다른 방법에서, 유전자 발현은 유전자 생성물의 발현을 직접 정량할 수 있는 조직 섹션의 면역 조직 화학적 염색 및 세포 배양물 또는 체액의 분석과 같은 면역학적 방법에 의해 측정된다. 면역 조직 화학적 염색 기술에 있어서, 세포 샘플은 통상 탈수 및 정착시킨 후, 결합되는 유전자 생성물에 특이적이며 표지(여기서 표지들은 효소 표지, 형광 표지, 발광 표지 등과 같이 통상 시각적으로 검출가능한 표지들이다)된 항체들과 반응시킴으로써 제조한다. 본 발명에서 이용하기에 적당한 특히 예민한 염색 기술은 [Hsu et al., Am. J. Clin. Path,m 75:734-738[1980]에 기술되어 있다.

면역 조직 화학적 염색 및(또는) 샘플액의 분석에 유용한 항체는 모노클론성 또는 폴리클론성일 수 있으며, 임의의 포유류내에서 제조될 수 있다. 이 항체들은 mpl 리간드 폴리펩티드 또는 하기하는 DNA에 기초한 합성 펩티드에 대하여 제조되는 것이 유리하다.

G. mpl 리간드 폴리펩티드의 정제

mpl 리간드는 바람직하게는 분비된 폴리펩티드로서 배양 배지로부터 회수될 수 있지만 이는 또한 분비 신호 없이 직접 발현된 경우 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수도 있다.

mpl 리간드가 인간에서 기원된 세포가 아닌 재조합 세포중에서 발현되었을 경우, mpl 리간드는 인간 고유의 단백질 또는 폴리펩티드가 전무하다. 그러나, mpl 리간드 자체의 실질적으로 균질한 제제를 얻고자 할 경우에는 다른 재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 mpl 리간드를 정제할 필요가 있다. 우선, 배양 배지 또는 용해물을 원심분리하여 입자성 세포 파편을 제거한다. 막 및 가용성 단백질 분획을 분리해낸다. 다른 방법으로는, 시판되는 단백질 농축 필터가 이용될수 있다(예:Amicon 또는 Millipore Pellicon ultrafiltration units). 이어서 mpl 리간드를 mpl 리간드가 막에 결합하였는지에 따라 배양물 용해물의 가용성 단백질 분획 및 막 분획으로부터 정제한다. 이후의 mpl 리간드를 염석 및 교환 또는 다양한 겔 메트릭스를 이용하는 크로마토그래피 방법에 의해 오염성 단백질 및 폴리펩티드로부터 정제한다. 이들 메트릭스에는 아크릴아미드, 아가로즈, 덱스트란, 셀룰로즈 및 단백질 정제에 흔히 사용되는 것들이 포함된다. 단백질 정제에 적당한 대표적인 크로마토그래피 방법의 예로는 면역 친화 크로마토그래피(예: 항-hmpl 리간드 Mab), 수용체 친화 크로마토그래피(예: mpl-IgG 또는 단백질 A 세파로즈), 소수성 상호작용 크로마토그래피(예: Con A-세파로즈, 렌틸-렉틴-세파로즈), 분자 배제 크로마토그래피(예:세파덱스 G-75), 양이온 및 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피(예:DEAE 또는 카르복시메틸 및 술포프로필 셀룰로즈), 및 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)(재조합 인간 IL-2의 정제에 두개의 연속적인 RP-HPLC 단계를 이용하는 Urdal et al., J.Chromatog, 296:171[1984] 참조)가 있다. 다른 정제 단계에는 임의로 에탄올 침전, 황산암모늄 침전, 크로마토포커싱, 예비 SDS-PAGE등이 포함된다.

잔기들이 탈락되거나, 삽입되거나 또는 치환된 mpl 리간드 변형체들은 변형에 의해 야기된 특성상의 실질적 변화를 감안하면서, 천연 mpl 리간드와 동일한 방법으로 회수한다. 예를 들어, 다른 단백질 또는 폴리펩티드(예: 세균성 또는 바이러스성 항원)과의 mpl 리간드 융합 제제는 정제를 용이하게 하여 이 항원에 대한 항체를 함유하는 면역 친화 컬럼은 이 융합 폴리펩티드를 흡착하는데 이용될 수 있다. 토끼 폴리클론성 항 mpl 리간드 컬럼과 같은 면역 친화 컬럼은 mpl 리간드 변형체를 하나 이상의 잔류 에피토프에 결합시킴으로써 이를 흡착시키는 데 이용할 수 있다. 다른 방법에서, mpl 리간드는 당업계에 공지된 방법에 따라 Affi-Gel 10(Bio-Rad, 리치몬드, 캘리포니아)등과 같은 (바람직하게는) 고정화 수지에 결합된 정제된 mpl-IgG를 이용한 친화 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 페닐 메틸 술포닐 플루오라이드(PMSF)와 같은 프로테아제 억제제도 또한 정제과정 중의 단백질 분해를 억제하는데 유용하며 항생제들도 우발적인 오염 물질의 성장을 방지하기 위해 함유될 수 있다. 당업계의 숙련가는 천연의 mpl 리간드에 적당한 정제 방법에는 재조합 세포 배양물중에서의 발현에 따라 mpl 리간드 또는 그의 변형체의 특성 변화를 감안한 방법 상의 수정이 필요하다는 것을 알 수 있을 것이다.

H. mpl 리간드 폴리펩티드의 공유 결합적 변성

mpl리간드 폴리펩티드의 공유 결합적 변성은 본 발명의 범위에 포함된다. 천연mpl리간드 및mpl리간드의 아미노산 서열 변이체 모두 공유 결합적으로 변성될 수 있다. 본 발명의 범위에 포함되는 공유 결합적 변성체의 한가지 유형은 mpl 리간드 단편이다. 약 40 개 이하의 아미노산 잔기를 갖는 변이 mpl 리간드 단편은 완전 길이 또는 변이mpl리간드 폴리펩티드의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 또는 화학적 합성에 의해 적절하게 제조될 수 있다.mpl리간드 또는 그의 단편의 다른 유형의 공유 결합적 변성체는mpl리간드 또는 그의 단편의 표적 아미노산 잔기를 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시킴으로써 그 분자 내로 도입된다.

시스테이닐 잔기는 주로 α-할로아세테이트 (및 대응하는 아민), 예를 들면 클로로아세트산 또는 클로로아세트아미드와 반응하여 카르복시메틸 또는 카르복시아미도메틸 유도체를 생성한다. 시스테이닐 잔기는 또한 브로모트리플루오로아세톤, α-브로모-β-(5-이미도조일)프로피온산, 클로로아세틸 포스페이트, N-알킬말레이미드, 3-니트로-2-피리딜 디술피드, 메틸 2-피리딜 디술피드, p-클로로머큐리벤조에이트, 2-클로로머큐리-4-니트로페놀, 또는 클로로-7-니트로벤조-2-옥사-1,3-디아졸과의 반응에 의해 유도체화된다.

디에틸피로카르보네이트는 히스티딜 측쇄에 대해 비교적 특이성을 갖기 때문에, 히스티딜 잔기는 pH 5.5-7.0에서 디에틸카르보네이트와의 반응에 의해 유도체화된다. 파라브로모펜아실 브로마이드도 또한 유용하고; 이 반응은 바람직하게는 pH 6.0에서 0.1M 소듐 카코딜레이트 중에서 수행한다.

리시닐 및 아미노 말단 잔기는 숙신산 또는 다른 카르복실산 무수물과 반응한다. 이들 시약을 이용한 유도체화는 리시닐 잔기의 전하를 역전시키는 효과를 갖는다. 아미노 함유 잔기를 유도체화하는데 적당한 다른 시약으로는 메틸 피콜린이미데이트와 같은 이미도에스테르; 피리독살 포스페이트; 피리독살; 클로로보로히드라이드; 트리니트로벤젠술폰산; O-메틸이소우레아; 2,4-펜탄디온이 있고, 글리옥실레이트와의 트랜스아미나제 촉매 반응도 포함된다.

아르기닐 잔기는 통상의 시약 1종 이상과의 반응에 의해 변성되고, 이러한 시약으로는 페닐글리옥살, 2,3-부탄디온, 1,2-시클로헥산디온 및 닌히드린이 있다. 아르기닌 잔기의 유도체화는 구아니딘 관능기의 pKa가 높기 때문에 이 반응이 알칼리성 조건 하에서 수행되는 것을 필요로 한다. 더우기, 이 시약들은 리신 뿐만 아니라 아르기닌 엡실론-아미노기와 반응할 수도 있다.

티로실 잔기는 특이적으로 변성시킬 수 있으며, 특히 방향족 디아조늄 화합물 또는 테트라니트로메탄과의 반응에 의해 티로실 잔기에 스펙트럼 라벨을 도입시킴으로써 달성된다. 가장 흔하게는, N-아세틸이미디졸 및 테트라니트로메탄을 사용하여 각각 O-아세틸 티로실 종 및 3-니트로 유도체를 형성한다. 방사면역분석에 사용하기 위한 표지된 단백질을 제조하기 위해서는¹²⁵I 또는¹³¹I를 사용하여 티로실 잔기를 요오도화시키며, 상기 클로라민 T법이 적당하다.

카르복실 측쇄기 (아스파르틸 또는 글루타밀)은 카르보디이미드 [R-N=C=N-R' (여기서, R 및 R'은 다른 알킬기임)], 예를 들면 1-시클로헥실-3-(2-모르폴리닐-4-에틸)카르보디이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4-디메틸펜틸)카르보디이미드와의 반응에 의해 선택적으로 변성된다. 게다가, 아스파르틸 및 글루타밀 잔기는 암모늄 이온과의 반응에 의해 아스파라기닐 및 글루타미닐 잔기로 전환된다.

이관능성 시약을 이용한 유도체화는 항-mpl리간드 항체 정제 방법에 사용하기 위한 수불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에mpl리간드를 가교 결합시키는데 유용하고, 그 반대로도 유용하다. 흔히 사용되는 가교결합제로는 예를 들면 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들면 4-아지도살리실산과의 에스테르, 호모이관능성 이미도에스테르 (3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜 에스테르를 포함함) 및 이관능성 말레이미드 (예: 비스-N-말레이미드-1,8-옥탄)을 들 수 있다. 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 유도체화제는 빛 존재 하에서 가교 결합을 형성할 수 있는 광활성 중간체를 생성한다. 다른 한편, 단백질 고정화에는 시아노겐 브로마이드 활성화 탄수화물과 같은 반응성의 수불용성 매트릭스 및 미합중국 특허 제3969287호에 기재된 반응성 기질이 사용된다. 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기는 주로 탈아미드화되어 각각 대응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기를 형성한다. 이 잔기들은 중성 또는 염기성 조건 하에서 탈아미드화된다. 이들 잔기의 탈아미드화 형태도 본 발명의 범위에 포함된다.

다른 변성법으로는 프롤린 및 리신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 포스포릴화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화 (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86, 1983), N-말단 아민의 아세틸화 및 임의의 C-말단 카르복실기의 아미드화가 있다.

본 발명의 범위에 포함된 mpl 리간드 폴리펩티드의 다른 유형의 공유결합적 변성은 폴리펩티드의 천연 글리코실화 패턴을 변경시키는 것이다. 변경이라는 용어는 천연 mpl 리간드에서 발견되는 1개 이상의 탄수화물 부분의 결실, 및(또는) 천연 mpl 리간드에 존재하지 않는 1개 이상의 글리코실화 부위의 삽입을 의미한다.

폴리펩티드의 글리코실화는 대표적으로 N-결합되거나 또는 O-결합된다. N-결합이라는 용어는 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 부분이 부착하는 것을 의미한다. 트리펩티드 서열인 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서,X는 프롤린을 제외한 아미노산임)은 아스파라긴 측쇄에 탄수화물 부분을 효소적으로 부착시키기 위한 인지 서열이다. 따라서, 하나의 폴리펩티드에 이들 트리펩티드 서열 중 어느 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 제공한다. O-결합 글리코실화는 히드록시아미노산(주로, 세린 또는 트레오닌이 사용되지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신도 사용될 수 있음)에 N-아세틸갈락토스아민, 갈락토스 또는 크실로스 당류 중의 하나가 부착되는 것을 의미한다.

mpl리간드 폴리펩티드에 글리코실화 부위를 삽입하는 것은 (N-결합 글리코실화 부위의 경우에는) 이 폴리펩티드가 1개 이상의 상기 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 달성하는 것이 적당하다. 또한, 이 변경은 (O-결합 글리코실화 부위의 경우) 천연mpl리간드 서열에 1개 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 삽입 또는 치환함으로써 달성될 수 있다. 편의상,mpl리간드 아미노산 서열은 DNA 수준에서의 변화에 의해 변경되는 것이 바람직하고, 특히 목적하는 아미노산으로 번역되는 코돈이 생성되도록 소정의 염기에서mpl리간드 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 돌연변이시킴으로써 변경되는 것이 바람직하다. DAN 변이는 상기 "mpl리간드의 아미노산 서열 변이체"라는 제목 하에 기재된 방법을 이용하여 얻을 수 있다.

mpl리간드 상의 탄수화물 부분의 수를 증가시키기 위한 또다른 방법은 폴리펩티드에 대한 글리코시드의 화학적 또는 효소적 커플링이다. 이 방법들은 N- 또는 O-결합 글리코실화를 위한 글리코실화 능력을 갖는 숙주 세포에서 폴리펩티드의 생산을 필요로 하지 않는다는 점에서 유리하다. 사용된 커플링 방법에 따라, 당들은 (a) 아르기닌 및 히스티딘, (b) 유리 카르복실기, (c) 유리 술프히드릴기 (예: 시스테인의 술프히드릴), (d) 유리 히드록실기 (예: 세린, 트레오닌 또는 히드록시프롤린의 히드록실기), (e) 방향족 잔기 (예: 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판의 방향족 잔기), 또는 (f) 글루타민의 아미드기에 부착될 수 있다. 이 방법들은 국제 공개 제87/05330호 (1987년 9월 11일 공개) 및 문헌 [Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp 259-306 (1981)]에 기재되어 있다.

mpl 리간드 폴리펩티드 상에 존재하는 탄수화물 부분의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 수행될 수 있다. 화학적 탈글리코실화는 폴리펩티드를 트리플루오로메탄술폰산 또는 그의 균등 화합물에 노출시키는 것을 필요로 한다. 이 처리 결과, 결합 당 (N-아세틸글루코스아민 또는 N-아세틸갈락토스아민)을 제외한 거의 모든 당이 절단되는 반면, 폴리펩티드는 그대로 유지된다. 화학적 탈글리코실화는 하키무딘(Hakimuddin) 등의 문헌 [Arch. Biochem. Biophys., 259:52, 1987] 및 에지(Edge) 등의 문헌 [Anal. Biochem., 118:131,1981]에 기재되어 있다. 폴리펩티드 상의 탄수화물 부분의 효소적 절단은 도다꾸라(Thotakura) 등의 문헌 [Meth. Enzymol., 138:350, 1987]에 기재된 바와 같이 여러가지 엔도- 및 엑소-글리코시다제를 사용하여 달성될 수 있다.

잠재적 글리코실화 부위에서의 글리코실화는 두스킨(Duskin) 등의 문헌 [J. Biol. Chem., 257:3105, 1982]에 기재된 바와 같이 투니카마이신을 사용하여 방지할 수 있다. 투니카마이신은 단백질-N-글리코사이드 결합의 형성를 차단한다.

mpl 리간드의 다른 유형의 공유결합적 변성은 미합중국 특허 제4640835호,제 4496689호, 제 4301144호, 제4670417호, 제4791192호, 또는 제4179337호에 기재된 방법으로 mpl 리간드 폴리펩티드를 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌 중 하나에 결합시키는 것을 포함한다. 이 중합체에 공유결합적으로 결합된mpl리간드 폴리펩티드를 본 명세서에서는 페길화(pegylated) mpl 리간드 폴리펩티드라 부른다.

회수된 mpl 리간드 변이체를 일부 검색하는 것이 상기 면역학적 및(또는) 생물학적 활성을 가지며 mpl에 결합하는 최적의 변이체를 선택하는데 필요하다. 재조합 세포 배양물 또는 세포질에서 (예를 들면 단백질 분해적 절단에 대한) 안정성, mpl 성분에 대한 높은 친화성, 산화적 안정성, 높은 수율로 분비될 수 있는 능력 등을 위해 검색할 수 있다. 예를 들면, 특정 항체에 대한 친화성과 같은 mpl 리간드 폴리펩티드의 면역학적 특성의 변화는 경쟁형 면역분석법에 의해 측정된다. 산화환원 또는 열 안정성, 소수성 또는 단백질 분해적 분해에 대한 민감성과 같은 단백질 또는 폴리펩티드 특성의 다른 잠재적인 변성은 당업계 공지 방법에 의해 평가된다.

17. mpl 리간드에 대한 항체의 제조에 관한 일반적인 방법

항체 제조

(1) 폴리클로날 항체

mpl리간드 폴리펩티드 또는 단편에 대한 폴리클로날 항체는 일반적으로 동물에 mpl 리간드 및 보조제를 다수회 걸쳐 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사함으로써 생긴다.mpl리간드 또는 표적 아미노산 서열을 함유하는 단편을 면역화될 종의 면역원성 단백질, 예를 들면 키호울(keyhole) 림핏(limpet) 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 이관능성 또는 유도체화 시약, 예를 들면 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르(시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통한 접합), 글리타르알데히드, 무수 숙신산, SOCl₂또는 R¹N=C=NR (여기서, R 및 R¹은 상이한 알킬기임)를 사용하여 접합시키는 것이 유용하다.

펩티드 또는 접합체 (각각, 토끼 또는 마우스) 1 μg을 프론트 완전 보조액 3 부피와 혼합하고, 이 용액을 여러 부위에 피내 주사함으로써 mpl 리간드 폴리펩티드 또는 단편, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 동물들을 면역화시킨다. 1개월 후, 이 동물에 프론트 완전 보조액 중의 펩티드 또는 접합체의 원래 양의 1/5 내지 1/10을 피하 주사로 여러 부위에 투여하여 부스팅(boosting)시킨다. 7 내지 14일 후, 동물에게서 채혈하고, 혈청을 mpl 리간드 항체 역가에 대해 분석한다. 역가가 안정기에 달할 때까지 동물들을 부스팅시킨다. 바람직하게는, 동물들을 동일 mpl 리간드의 접합체로 부스팅하되, 상이한 단백질에 상이한 가교 결합제를 통해 접합시킨다. 또한, 접합체들은 단백질 융합체로서 재조합 세포 배양물에서 제조될 수 있다. 또한, 알룸과 같은 응집제도 면역 반응을 증진시키는데 사용된다.

(ii) 모노클로날 항체

모노클로날 항체는 실질적으로 동종 항체군 (즉, 이 군을 구성하는 개별 항체들은 천연적으로 발생하는 변이가 소량으로 존재할 수 있다는 것을 제외하고는동일함)으로부터 얻는다. 따라서, 변성제 "모노클로날"은 항체의 특성이 개별 항체의 혼합이 아니라는 것을 나타낸다.

예를 들면, 본 발명의mpl리간드 모노클로날 항체는 문헌[Kohler & Milstein, Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법을 이용하여 제조하거나 또는 재조합 DNA 방법 (미합중국 특허 제4816567호, Cabilly 등)에 의해 제조할 수 있다.

하이브리도마 방법에서는, 햄스터와 같은 마우스 또는 다른 적당한 숙주 동물을 상기한 바와 같이 면역화시켜서, 면역화에 사용되는 단백질과 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 또는 생산할 수 있는 임파구를 추론한다. 별법으로, 임파구는 생체내에서 면역화될 수 있다. 이어서, 임파구를 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적당한 융합제를 사용하여 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다. (Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, pp. 59 - 103 [Academic Press, 1986]].

이와 같이 제조된 하이브리도마 세포를 바람직하게는 비융합 모(parent) 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 1종 이상의 물질을 함유하는 적당한 배지에 파종시켜 성장시킨다. 예를 들면, 모 골수종 세포가 히포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT) 효소가 결핍된 경우, 하이브리도마용 배지는 대표적으로 히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (이 물질들은 HGPRT 결핍 세포의 성장을 방해함)를 함유할 것이다 (HAT 배지).

바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체 생산 세포에 의한 안정하고 높은 수준의 항체 발현을 지지하고, HAT 배지와 같은 배지에 대해 민감한 것들이다. 이러한 것들 중에서, 바람직한 골수종 세포주는 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양 (Salk Institute Cell Distribution Center, 미합중국 캘리포니아주 샌디에고 소재)으로부터 유래되는 것과 같은 쥐 골수종 세포, 및 SP-2 세포 (American Type Culture Collection, 미합중국 메릴랜드주 록빌 소재)이다. 또한 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주도 인간 모노클로날 항체 생산에 사용되는 것으로 기재되어 있다 [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur 등, Monoclonal Antibody Production Techniques and Application, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987].

하이브리도마 세포가 성장하고 있는 배지를 mpl 리간드에 대한 모노클로날 항체의 생산에 관해서 분석한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전법 또는 시험관내 결합 분석법 (방사면역분석, RIA) 또는 효소 결합 면역흡착법 (ELISA)에 의해 결정한다.

모노클로날 항체의 결합 친화성은 예를 들면 스캐챠드 분석 [Scatchard analysis; Munson & Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)]에 의해 결정할 수 있다.

목적하는 특이성, 친화성 및(또는) 활성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 동정한 후, 클론들을 제한 희석법에 의해 서브클로닝하고, 표준 방법(상기 Goding 문헌)에 의해 성장시킬 수 있다. 이 목적을 위한 적당한 배지는 예를 들면 둘베코 변성 이글 배지 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수증 종양으로서 생체내에서 성장될 수 있다.

서브클론에 의해 분비되는 모노클로날 항체는 통상의 면역글로불린 정제 방법, 예를 들면 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이드 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배지, 복수증 체액 또는 혈청으로부터 분리시키는 것이 적당하다.

본 발명의 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 쉽게 단리되고, 통상의 방법 (예: 쥐 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브)를 사용하여 서열화한다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원이다. 일단 단리된 후, DNA를 발현 벡터에 넣고, 이어서 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포와 같은 숙주 세포내로 형질감염시켜서 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성한다. 또한, DNA도 예를 들면 동종 쥐 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인을 위한 코딩 서열을 사용하거나 (상기 Cabilly 등의 문헌, Morrison 등의 Proc. Nat. Acad. Sci., 81:6851 (1984)), 또는 면역글로불린 코딩 서열에 비면역글로불린 폴리펩티드를 위한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 공유결합적으로 연결시켜 변성시킬 수 있다.

대표적으로, 이러한 비면역글로불린 폴리펩티드가 본 발명의 항체의 불변 도메인 대신에 치환되거나, 또는 본 발명의 항체의 항원 결합 부위의 가변 도메인 대신에 치환되어 mpl 리간드에 대해 특이성을 갖는 하나의 항원 결합 부위 및 상이한 항원에 대해 특이성을 갖는 다른 하나의 항원 결합 부위로 이루어지는 키메릭 이가항체를 생성한다.

키메릭 또는 하이브리드 항체는 또한 가교 결합제를 이용하는 방법을 포함하여 합성 단백질 화학에서 공지되어 있는 방법들을 이용하여 시험관내에서 제조될 수도 있다. 예를 들면, 면역 독소는 디술피드 교환 반응을 이용하거나 또는 티오에테르 결합을 형성하여 제조될 수 있다. 이러한 목적을 위해 적당한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트를 포함한다.

진단 분야에서 응용하기 위해서는, 본 발명의 항체는 대표적으로 검출가능한 부분에 의해 표지화될 것이다. 검출가능한 부분은 검출가능한 신호를 직접 또는 간접적으로 생산할 수 있는 것들일 수 있다. 예를 들면, 검출가능한 부분은³H,¹⁴C,³²P,³⁵S, 또는¹²⁵I와 같은 방사성 동위원소, 플루오레신 이소티오시아네이트, 로드아민 또는 루시페린과 같은 형광 또는 화학 발광 화합물, 예를 들면¹²⁵I,³²P,¹⁴C, 또는³H와 같은 방사활성 동위원소 표지자, 또는 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 고추냉이 퍼옥시다제와 같은 효소일 수 있다.

검출가능한 부분에 항체를 개별적으로 접합시키는데는 당업계 공지 방법, 예를 들면 문헌 [Hunter 등, Nature, 144:945 (1962); David 등, Biochemistry, 13:1014 (1974); Pain 등, J. Immunol. Meth., 40:219(1981); Nygren, Hystochem. and Cytochem., 30:407 (1982)]에 기재된 방법을 이용할 수 있다.

본 발명의 항체는 경쟁 결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석, 및 면역침전 분석과 같은 공지 분석법에 이용될 수 있다 (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques. pp 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)).

경쟁 결합 분석은 표지된 표준물 (mpl 리간드 또는 그의 면역학적 반응성 부분)이 제한된 양의 항체와의 결합을 위해 시험 샘플 분석물 (mpl 리간드)과 경쟁할 수 있는 능력에 의존한다. 시험 샘플 중의 mpl 리간드의 양은 항체에 결합되는 표준물의 양에 반비례한다. 결합되는 표준물의 양의 결정을 용이하게 하기 위해서는, 일반적으로 항체를 경쟁 전 또는 후에 불용화시켜서, 항체에 결합된 표준물 및 분석물을 결합되지 않은 표준물 및 분석물과 분리시키는 것이 적당하다.

샌드위치 분석은 두 개의 항체를 사용하며, 이들은 각각 검출될 단백질 (mpl 리간드)의 상이한 면역원성 부분 또는 에피토프에 결합할 수 있다. 샌드위치 분석에서, 시험 샘플 분석물은 고상 지지체 상에 고정된 제1 항체에 의해 결합된 후, 이 분석물에 제2 항체가 결합됨으로써 불용성의 3부분 복합체를 형성한다. (David & Greene의 미합중국 특허 제4,376,110호). 제2 항체는 그 자체를 검출가능한 부분으로 표지화될 수 있거나 (직접 샌드위치 분석법), 또는 검출가능한 부분에 의해 표지화된 항면역글로불린 항체를 사용하여 측정될 수 있다 (간접 샌드위치 분석법). 예를 들면, 샌드위치 분석법의 한가지 유형은 ELISA 분석이며, 이 경우, 검출가능한 부분은 효소(예: 고추냉이 퍼옥시다제)이다.

(iii) 인간화된 항체 및 인간 항체

비인간 항체를 인간화하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 비인간 공급원으로부터 도입되는 1개 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이 비인간 아미노산 잔기를 종종 "임포트(import)" 잔기라고 부르며, 이들은 일반적으로 "임포트" 가변 도메인으로부터 채취된다. 인간화는 윈터(Winter) 등의 방법 (Jones 등, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann 등, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen 등, Science, 239:1534-1536 (1988))에 따라 인간 항체의 대응하는 서열을 설취류 CDR 또는 CDR 서열로 치환시킴으로써 수행될 수 있다. 따라서, 이 "인간화된" 항체는 키메릭 항체이고 (상기 Cabilly 등의 문헌), 여기서 무상(intact) 인간 가변 도메인보다 실질적으로 적은 양이 비인간 종으로부터의 대응하는 서열에 의해 치환된다. 사실상, 인간화된 항체는 대표적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하다면, 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기에 의해 치환된 인간 항체이다.

인간화된 항체를 제조하는데 사용되는 중쇄 및 경쇄 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시키는데 매우 중요하다. 소위 "베스트-피트(best-fit)" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열은 공지 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 검색된다. 설치류의 서열과 가장 유사한 인간 서열이 인간화된 항체를 위한 인간 프레임워크 (FR)로 인정된다 (Sims 등, J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia 및 Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987)). 또다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 서브그룹의 모든 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 특정 프레임워크를 사용한다. 수가지 상이한 인간화된 항체에 대해서 동일 프레임워크가 사용될 수 있다 (Carter 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta 등, J. Immol., 151:2623 (1993)).

또한, 항체가 항원에 대한 높은 친화성 및 다른 유리한 생물학적 특성을 보유한 채 인간화되는 것이 중요하다. 이러한 목적을 달성하기 위하여, 바람직한 방법에 따르면, 인간화된 항체를 모 서열 및 인간화된 서열의 삼차원적 모델을 사용하는 모 서열 및 여러가지 개념적인 인간화된 생성물의 분석 방법에 의해 제조된다. 삼차원적 면역글로불린 모델은 흔히 구할 수 있고, 당업계 숙련자에게 잘 알려져 있다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 배치 구조를 예시하고 표시하는 컴퓨터 프로그램을 입수할 수 있다. 이러한 표시를 관찰함으로써, 후보 면역글로불린 서열의 기능화에 있어서 잔기들의 가능한 역활에 대한 분석, 즉, 후보 면역글로불린이 그의 항원과 결합할 수 있는 능력에 영향을 미치는 잔기에 대한 분석이 가능하다. 이와 같은 방법에 의해, FR 잔기를 공통 및 임포트 서열로부터 선택 및 결합시킬 수 있으며, 따라서, 표적 항원(들)에 대한 친화도 증가와 같은 목적하는 항체 특성을 얻을 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 영향을 미치는 것에 직접적으로 상당히 관련있다. 이에 관한 상세한 설명은 1992년 8월 21일자로 출원된 미합중국 특허 출원 제07/934,373호 (1991년 6월 14일자로 출원된 미합중국 특허 출원 제07/715272호의 일부 계속 출원임) 참조.

별법으로, 현재는, 면역화시에 내인성 면역글로불린 생산이 없는 조건 하에서 완전 레퍼토리의 인간 항체를 생산할 수 있는 트랜스유전성 동물 (예: 마우스)를 생산할 수 있다. 예를 들면 키메릭 및 생식계열 변이 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (J_H) 유전자의 호모접합적 결실은 내인성 항체 생산의 완전 억제를 유발하는 것으로 기재되어 있다. 이러한 생식계열 변이 마우스에서 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 배열의 전이는 항원 공격시 인간 항체의 생산을 유발한다 (참조: Jakobovits 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-255 (1993); Jakobovits 등 Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann 등, Year in Immuno., 7:33 (1993)). 인간 항체는 또한 파지 표시 라이브러리에서도 생산될 수 있다 (Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227, 381 (1991); Marks 등, J. Mol. Biol. 222, 581 (1991)).

(iv) 이중특이성 항체

이중특이성 항체는 2개 이상의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날 바람직하게는 인간 또는 인간화된 항체이다. 이중특이성 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다.

통상적으로, 이중특이성 항체의 재조합적 생산은 두개의 면역글로불린 중쇄-경쇄쌍의 공발현을 기본으로 하며, 여기서 두개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (Millstein 및 Cuello, Nature, 305:537-539(1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 랜덤한 분류 때문에, 이들 하이브리도마 (콰드로마; quadroma)는 10개의 상이한 항체 분자 (이들 중 1개만이 올바른 이중특이성 구조를 가짐)의 잠재적인 혼합물이다. 올바른 분자의 정제는 통상 친화성 크로마토그래피 단계에 의해서 수행되는데 다소 귀찮고, 생산 수율이 낮다. 유사한 방법이 국제 공개 제93/08829호 (1993년 5월 13일 공개) 및 문헌 [Trauneker 등, EMBO, 10:3655-3659 (1991)]에 기재되어 있다.

이와는 상이한 보다 바람직한 방법에 따르면, 목적하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인 (항체-항원 결합 부위)는 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 융합은 바람직하게는 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 서열과 이루어진다. 융합체의 적어도 하나에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및 필요에 따라서는 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA가 별개의 발현 벡터에 삽입되고, 적당한 숙주 생물체에 공형질감염된다. 이것은 제조시 사용된 3개의 폴리펩티드쇄의 불균등 비율이 최적 수율을 제공할 때, 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 있어서 상당한 융통성을 제공한다. 그러나, 균등 비율의 2개 이상의 폴리펩티드쇄의 발현이 높은 수율을 제공할때, 또는 그 비율이 그다지 중요하지 않을때는 1개의 발현 벡터에 2개 또는 3개 모두의 폴리펩티드쇄를 위한 코딩 서열을 삽입하는 것도 가능하다. 이러한 방법에 관한 바람직한 실시 태양에서, 이중특이성 항체는 한쪽 아암(arm)에는 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄를, 다른 한쪽 아암에는 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄쌍 (제2 결합 특이성을 제공함)을 갖는다. 이러한 비대칭 구조는, 이중특이성 분자의 절반에만 면역글로불린 경쇄가 존재하는 것이 용이한 분리를 제공하기 때문에, 불필요한 면역글로불린 사슬 조합체로부터 목적하는 이중특이성 화합물의 분리를 용이하게 한다. 이러한 방법은 계류중인 미합중국 특허 출원 제07/931811호 (1992년 8월 17일자 출원)에 기재되어 있다.

이중특이성 항체를 생산하는 것에 대한 상세한 사항은 예를 들면 문헌[Suresh 등의 Methods in Enzymology 121:210 (1986)] 참조.

(v) 헤테로접합 항체

헤테로접합 항체도 본 발명의 범위에 포함된다. 헤테로접합 항체는 공유결합적으로 연결된 두개의 항체로 이루어진다. 이러한 항체는 예를 들면, 불필요한 세포에 면역계 세포를 표적화하고 (미합중국 특허 제 4676980호), HIV 감염을 치료하는(국제 공개 제91/00360호, 국제 공개 제92/00373호, 유럽 특허 제103089호) 것으로 제안되어 있다. 헤테로접합 항체는 적당한 가교결합법을 이용하여 제조할 수 있다. 적당한 가교결합제는 당업계에 공지되어 있고, 많은 가교결합 기술과 함께 미합중국 특허 제4676980호에 기재되어 있다.

IV. 거핵구 생성 단백질 mpl 리간드의 치료 용도

본 명세서에서 거핵구 생성 또는 전구 생성 단백질 (TPO)로 불리는 조혈 에펙터 기능을 갖는 생물학적 활성mpl리간드가 혈소판의 손상, 격리 또는 증가된 파괴로 인한 전구 감소증을 앓고 있는 환자의 거핵구 생성 또는 전구 생성 활성을 자극하는 멸균 제약 제제에 사용될 수 있다. 거핵구 감소증과 관련된 골수 형성 부전증 (예: 화학치료 또는 골수 이식에 수반되는 무형성 빈혈)은 본 발명의 화합물로 효과적으로 치료될 수 있고, 또한 파종성 혈관내 응고 (DIC), 면역성 전구 감소증 (HIV-유발 ITP 및 비 HIV-유발 ITP), 만성 특발성 전구 감소증, 선천성 전구 감소증, 척수이형성 및 혈전성 전구 감소증도 본 발명의 화합물로 효과적으로 치료할 수 있다. 추가로, 이들 거핵구 생성 단백질은 염증성 질환으로부터 유래하는 전구 증가증 뿐만 아니라 척수증식성 전구 증가증의 치료 및 철 결핍증의 치료에도유용할 수 있다.

본 발명의 거핵구 생성 또는 전구 생성 단백질 (TPO)의 바람직한 용도는 백혈병 또는 충실성 종양 치료를 위한 골수독성 화학 요법, 자기 또는 동종 골수 이식을 위한 척수 절제 화학요법, 척수이형성, 특발성 무형성 빈혈, 선천성 전구 감소증 및 면역성 전구 감소증에서의 용도이다.

본 발명의 거핵구 생성 단백질로 유효하게 치료될 수 있는 다른 질환으로는 약물, 독물 또는 인공 표면에 대한 활성화로 인한 혈소판 결함 또는 손상을 포함한다. 이 경우, 본 발명의 화합물은 새로운 "비손상" 혈소판의 "탈락"을 자극하는데 사용될 수 있다. 유용한 응용 분야에 대한 보다 완전한 목록에 대해서는 상기 "발명의 배경" 부분, 특히 (a) 내지 (f) 및 그에 인용된 참고 문헌을 참조한다.

본 발명의 거핵구 생성 단백질은 상기 질환 및 증상 치료시 단독으로 사용하거나 또는 다른 시토킨, 조혈소, 인터루이킨, 성장 인자 또는 항체와 함께 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물은 G-CSF, GM-CSF, LIF, M-CSF, IL-1, IL-3, 적혈구 조혈소(EPO), 키트 리간드, IL-6 및 IL-11을 포함하여 전구 생성 활성을 갖는 다른 단백질 또는 펩티드와 함께 사용할 수 있다.

본 발명의 거핵구 생성 단백질은 제약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 제조한다. 이 치료 조성물은 정맥내 투여하거나, 또는 코 또는 폐를 통해 투여할 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 필요에 따라 비경구 또는 피하 투여할 수 있다. 전신 투여할 경우, 본 발명의 치료 조성물은 발열질이 없어야 하고, pH, 등장성 및 안정성이 적당한 비경구적으로 허용가능한 용액 상태이어야 한다. 이 조건들은 당업계에 공지되어 있다. 간단히 말하자면, 본 발명의 화합물의 제제는 목적하는 순도를 갖는 화합물을 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 저장 또는 투여용으로 제조한다. 이러한 물질은 사용되는 투여량 및 농도에서 복용자에게 무독성이며, 인산염, 시트르산염, 아세트산염 및 다른 유기산염과 같은 완충제; 아스코르브산과 같은 산화방지제; 폴리아르기닌, 단백질, 예를 들면 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 저분자량 (약 10개 미만의 잔기를 갖는) 펩티드; 폴리비닐피롤리디논과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루탐산, 아스파르트산 또는 아르기닌과 같은 아미노산; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 셀룰로오스 또는 그의 유도체를 포함하는 다른 탄수화물, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; EDTA와 같은 킬레이트제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알콜; 나트륨과 같은 카운터 이온 및(또는) 트윈(Tween), 플루로닉스(Pluronics) 또는 폴리에틸렌글리콜과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.

유리 산 또는 염기 형태 또는 제약학적으로 허용되는 염 형태의 거핵구 생성 단백질 화합물 또는 혼합물 약 0.5 내지 500 mg을 허용된 제약 관행상 요구되는 생리학적으로 허용되는 비히클, 담체, 부형제, 결합제, 방부제, 안정화제, 향미제 등과 혼합한다. 이들 조성물 중의 활성 성분의 양은 지시되는 범위의 적당한 투여량을 얻을 수 있는 양이다.

주사용 멸균 조성물은 통상의 제약 관행에 따라 제조될 수 있다. 예를 들면, 비히클, 예를 들면, 물 또는 참깨유, 땅콩유 또는 면실유와 같은 천연 식물성 오일 또는 에틸 올레이트와 같은 합성 지방 비히클 중의 활성 화합물의 용액 또는현택액이 바람직할 수 있다. 완충제, 방부제, 산화 방지제 등을 허용된 제약 관행에 따라 혼입시킬 수 있다.

지속 방출형 제제의 적당한 예는 성형품, 예를 들면 필름 또는 마이크로캡슐 형태의 반투과성 고상 소수성 중합체 매트릭스 내에 본 발명의 폴리펩티드를 함유하는 것이다. 지속 방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 [예: Langer 등, J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277, 1981 및 Langer, Chem. Tech., 12:98-105, 1982에 기재된 폴리(2-히드록시에틸메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)], 폴리락티드 (미합중국 특허 제3773919호, 유럽 특허 제58,481호), L-글루타민산 및 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체 (Sidman 등, Biopolymers, 22:547-556, 1983), 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트 (상기 Langer 등의 문헌), 분해성 락트산-글리콜산 공중합체 (예: 루프론 데포트^TM(Lupron Depot^TM; 락트산-글리콜산 공중합체 및 루프롤라이드 아세테이트로 이루어진 주사가능한 소구) 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산 (유럽 특허 제133988호)을 포함한다.

에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상 동안 분자의 방출을 가능하게 하지만, 일부 히드로겔은 이보다 더 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 단백질이 장기간 동안 체내에 존재할 때, 이들은 37℃에서 습기에 노출된 결과 변성되거나 또는 응집될 수 있고, 이 결과, 생물학적 활성이 손실되고 면역원성에 변화가 일어난다. 관련 메카니즘에 따라 단백질 안정화를 위한 적당한 방법을 고안할 수 있다. 예를 들면, 응집 메카니즘이 디술피드 교환을 통한 분자간 S-S 결합을 형성하는 것으로 발견된 경우, 안정화는 술프히드릴 잔기를 변성하고, 산성 용액으로부터 동결건조시키고, 수분 함량을 조절하고, 적당한 첨가제를 사용하고, 특정 중합체 매트릭스 조성물을 개발함으로써 달성될 수 있다.

또한, 지속 방출형 거핵구 생성 단백질 조성물은 리포좀으로 트래핑된(entrapped) 거핵구 생성 단백질을 포함한다. 거핵구 생성 단백질을 함유하는 리포좀은 공지 방법에 의해 제조된다 : 독일 연방 공화국 특허 제3218121호; Epstein 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692, 1985; Hwang 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030-4034, 1980; 유럽 특허 제52322호; 유럽 특허 제36676호; 유럽 특허 제88046호; 유럽 특허 제143,949호; 유럽 특허 제142641호; 일본 특허 출원 제83-118008호; 미합중국 특허 제4485045호 및 동 제4544545호; 및 유럽 특허 제102324호. 통상적으로, 리포좀은 지질이 약 30몰% 이상의 콜레스테롤인 작은 (약 200 내지 800 Å) 단층형이며, 이 비율은 최적의 거핵구 생성 단백질 치료를 위해 조정된다.

투여량은 질환의 심도 및 종류, 체중, 성별, 식이, 시간 및 투여 경로, 기타 투약 및 관련 임상 인자를 포함하여 약물의 작용을 변화시키는 것으로 알려진 여러가지 인자를 고려하여 담당 의사에 의해 결정할 수 있다. 대표적으로, 1일 투여량은 0.1 내지 100 μg/kg 체중이다. 바람직하게는, 투여량은 0.1 내지 50 μg/kg 체중이다. 더 바람직하게는, 초기 투여량은 1 내지 5 μg/kg/일이다. 임의로, 투여량은 다른 사이토킨, 특히 G-CSF, GM-CSF 및 EPO의 투여량과 동일할 수 있다. 치료적 유효량은 시험관내 또는 생체내 방법에 의해 결정될 수 있다.

실시예

더이상 설명하지 않아도, 당업계의 통상의 기술을 가진 자는 상기 설명 및 실시예를 사용하여 본 발명을 완전히 이용할 것이다. 따라서, 하기 작업 실시예는 본 발명의 바람직한 실시 태양을 구체적으로 나타낸 것이고, 개시 내용의 나머지 부분의 어느 면에서도 제한하지 않을 것이다.

실시예 1

돼지 mpl 리간드의 부분적 정제

혈소판이 결핍된 혈장을 정상 또는 재생불량성 빈혈 돼지로부터 수집하였다. 돼지를 4mEV 선형 가속기를 사용하여 몸체 전체를 900 cGy로 방사선 조사하여 재생불량성 빈혈을 유발하였다. 방사선 조사된 돼지에게 6-8일 동안 세파졸린을 근육내 주사로 투여하였다. 이어서, 전신 마취하에서 그들의 전체 혈액을 제거하고, 헤파린 처리한 후, 1800×g에서 30 분 동안 원심분리하여 혈소판이 결핍된 혈장을 제조하였다. 거핵구 자극 활성은 방사선 조사 6 일 후에 피크를 나타냈다.

방사선 조사된 돼지로부터 얻은 재생불량성 빈혈 돼지 혈장을 NaCl을 사용하여 4M로 제조한 후, 실온에서 30 분 동안 교반하였다. 생성된 침전물을 소르발 (Sorvall) RC3B에서 3800 rpm으로 원심분리하여 제거하고, 상등액을 4M NaCl을 포함하는 10 mM NaPO₄로 평형시킨 페닐-토요퍼얼 (Phenyl-Toyopearl) 컬럼 (220 ㎖) 위에 적하하였다. 컬럼을 A₂₈₀이 0.05 이하가 될 때까지 상기 완충제로 세척하고,dH₂O로 용리시켰다. 용리된 단백질 피크를 dH₂O로 전도도 15 mS까지 희석하고, PBS로 평형시킨 블루-세파로스 (Blue-Sepharose) 컬럼 (240 ㎖) 위에 적하하였다. 이어서, 컬럼을 각각 5배의 컬럼 용량의 2M 요소를 포함하는 PBS 및 NaPO₄(pH 7.4)로 세척하였다. 2M 요소 및 1M NaCl을 포함하는 NaPO₄(pH 7.4)를 사용하여 단백질을 컬럼으로부터 용리하였다. 용리된 단백질의 피크는 0.01 % 옥틸 글로코사이드 (n-옥틸 β-D-글루코피라노사이드) 및 1M의 EDTA 및 페파블록 (Pefabloc : Boehinger Mannheim)으로 제조하고, 직렬로 연결된 CD4-IgG (카폰 (Capon, D.J.) 등의 문헌 [Nature, 337:525-531 (1989)] 참조) 및mpl-IgG 울트라링크 (Ultralink : Pierce 사) 컬럼 위에 직접 적하하였다 (하기 참조). 시료를 적하한 후 CD4-IgG (2 ㎖) 컬럼을 제거하고,mpl-IgG (4 ㎖) 컬럼을 10배 컬럼 용량의 PBS 및 2M NaCl을 포함하는 PBS로 세척하고, 0.1M 글리신-HCl (pH 2.25)을 사용하여 용리하였다. 분획을 1/10 용량의 1M 트리스-HCl (pH 8.0)로 수집하였다.

환원 조건 하의 SDS-PAGE (4-20 %, Novex gel) 실행에 의한 mpl-친화성 컬럼으로부터 용리된 분획의 분석으로 몇가지 단백질의 존재를 밝혀냈다 (도5 참조). 최대 강도로 은 염색한 단백질은 66,000, 55,000, 30,000, 28,000 및 14,000의 겉보기 분자량을 갖는 것으로 분석되었다. 이들 단백질 중에서 Ba/F3-mpl세포 배양 조직의 증식을 자극하는 단백질을 결정하기 위해서 단백질을 하기 실시예 2에서 기재한 것과 같이 겔로부터 용리하였다.

울트라링크 친화성 컬럼

PBS 중의 10-20 ㎎의mpl-IgG 또는 CD4-IgG를 제조업자 지시에 의해 기재된 것과 같이 0.5 g의 울트라링크 수지 (Pierce사)에 결합시켰다.

mpl-IgG의 구성 및 발현

사람mpl(아미노산 1-491)의 전체 세포외 도메인 및 사람 IgG1 분자의 Fc 영역을 포함하는 키메라 분자를 293 세포에서 발현시켰다. 사람mpl의 아미노산 1-491을 코딩하는 cDNA 단편은 사람 거핵구 CMK 세포 cDNA 라이브러리로부터 PCR에 의해 수득되었고, 서열화되었다. ClaI 부위를 5' 말단에 삽입하고, BstEII 부위는 3' 말단에 삽입하었다.mpl의 세포외 도메인을 코딩하는 DNA에 존재하는 2개의 다른 BstEII 부위 때문에 PCR 생성물을 BstEII으로 부분적으로 소화시킨 후, ClaI 및 BstEII 부위 사이에 있는 Bluescript 벡터에 있는 IgG1 Fc 코딩 영역의 업스트림에서 이 단편을 클로닝하였다.mplPCR 생성물의 3' 말단에 도입된 BstEII 부위는 Fc 영역이mpl세포외 도메인의 형태를 갖도록 디자인되었다. 구성물은 ClaI 및 XbaI 부위 사이에 있는 pRK5tkneo 벡터로 서프클로닝되었고, 인산칼슘 방법에 의해 293 사람 배성 신장 세포로 형질감염되었다. 세포는 0.4 ㎎/㎖ G418 중에서 선별되었고, 개개의 클론으로 단리되었다. 단리된 클론으로부터의mpl-IgG 발현은 사람 Fc 특이성 ELISA를 사용하여 측정되었다. 최상 발현 클론은 1-2 ㎎/㎖의mpl-IgG의 발현도를 가졌다.

Ba/F3 mpl P 발현 세포

사람mplP의 전체 코딩 영역에 대응하는 cDNA를 pRK50tkneo로 클로닝하고,이어서 NotI으로 선형화한 후, 전기 천공 (1×10⁷세포, 9605F, 250 볼트)으로 IL-3 의존성 세포주 Ba/F3으로 형질감염시켰다. 3일 후, 2 ㎎/㎖의 G418의 존재 하에서 선별을 시작하였다. 세포를 풀로서 선별하거나, 또는 개개의 클론을 96-웰 플레이트에서 제한 희석에 의해 수득하였다. 선별된 세포를 15 % FBS, 1 ㎎/㎖ G418, 20 mM 글루타민, 10 mM HEPES 및 100 ㎍/㎖의 Pen-Strep을 포함하는 RPMI 중에 보관하였다. 선별된 클론 중의mplP의 발현을 항-mplP 토기 다클론 항체를 사용하여 FACS 분석법으로 측정하였다.

Ba/F3 mpl 리간드 분석

mpl리간드 분석을 도2에서 도시하고 있는 바대로 수행하였다. 여러 공급원으로부터mpl리간드의 존재를 측정하기 위해, 37 ℃의 5 % CO₂및 공기 중의 습윤된 인큐베이터 중에서 5×10⁵세포/㎖의 세포 밀도로mplP Ba/F3 세포를 24 시간 동안 IL-3 스타베이션시켰다. IL-3 스타베이션 후, 세포를 희석된 시료를 넣거나 또는 넣지 않은 200 ㎕의 배지 중의 50,000 세포 밀도로 96-웰 배양 접시에 넣고, 세포 배양 인큐베이터에서 24 시간 동안 배양시켰다. 1 μCi의³H-티미딘을 포함하는 20 ㎕의 혈청이 없는 RPMI 배지를 후반부의 6-8 시간 동안 각 웰에 가하였다. 그리고 나서, 세포를 96-웰 GF/C 필터 플레이트 상에서 수집한 후, 물로 5회 세척하였다. 필터를 팩커드 탑 카운트 카운터 (Packard Top Count counter)에서 40 ㎕의 신틸레이션액 (Microscint 20) 존재 하에서 카운팅하였다.

실시예 2

고도로 정제된 돼지 mpl 리간드

겔 용리 프로토콜

동일량의 친화성 정제된mpl리간드 (mpl-IgG 컬럼으로부터 용리된 분획 6) 및 2X 래밀리 (Laemmli) 시료 완충제를 환원 시약없이 실온에서 혼합하고, 가능한 한 빨리 노벡스 (Novex) 4-20 % 폴리아크릴아미드 겔 위에 적하하였다. 시료를 가열하지는 않았다. 대조용으로, 리간드가 없는 시료 완충제를 옆 레인에 가하였다. 겔을 4-6 ℃에서 135 볼트로 약 2.25 시간 동안 수행하였다. 수행 완충제는 처음에 실온이었다. 그리고 나서, 겔을 겔 박스로부터 제거하고, 겔의 한쪽면 위의 플레이트를 제거하였다.

겔의 레플리카를 다음과 같이 니트로셀룰로스 상에서 제조하였다: 공기 방울을 배제하기 위해 한조각의 니트로셀룰로스를 증류수로 습윤시키고, 노출된 겔 표면 상부에 조심스럽게 놓았다. 염색 후 레플리카가 정확하게 재위치할 수 있도록 기준 표시를 니트로셀룰로스 및 겔 플레이트 상에 놓았다. 약 2 분 후, 니트로셀룰로스를 조심스럽게 제거하고, 겔을 플라스틱랩으로 싸서 냉장고에 넣었다. 니트로셀룰로스를 먼저 3×10 ㎖의 0.1 % 트윈 20 + 0.5 M NaCl + 0.1 M 트리스-HCl (pH 7.5) 중에서 약 45 분에 걸쳐서 교반하고, 3×10 ㎖의 정제수로 5 분에 걸쳐서 교반함으로써 Biorad's 전체 단백질 금 염색으로 염색하였다. 그리고 나서, 금 염색을 가하고, 표준물에 밴드가 나타날 때가지 전개시켰다. 그리고 나서, 레플리카를 물로 세척하고, 겔 상의 플라스틱랩 위에 놓고, 기준 표시를 사용하여 조심스럽게 정렬하였다. 노벡스 표준물의 위치를 겔 플레이트 상에 표시하고, 절단 위치를 나타내기 위해 선을 그었다. 그리고 나서, 니트로셀룰로스 및 플라스틱랩을 제거하고, 예리한 면도날을 사용하여 표시된 선을 따라 겔을 절단하였다. 겔을 염색할 경우, 슬라이스의 위치를 정하는데 사용할 수 있도록 시료 레인 이상까지 절단하였다. 슬라이스를 제거한 후, 남은 겔을 은 염색하고, 표준물의 위치 및 절단 표시를 측정하였다. 절단 위치에 대응하는 분자량을 노벡스 표준물로부터 정하였다.

12개의 겔 슬라이스를 2개의 Biorad 모델 422 전기 용리기 내에 있는 세포에 넣었다. 12-14K 분자량의 절단 막 캡을 세포에 사용하였다. 50 mM의 중탄산 암모늄 + 0.05 %의 SDS (약 pH 7.8)이 용리 완충제였다. 1ℓ의 완충제를 사용 전에 약 1 시간 동안 4-6 ℃의 냉방에서 냉각시켰다. 겔 슬라이스를 4-6 ℃의 냉방에서 10 ma/세포 (초기 40 v)로 용리시켰다. 용리를 약 4 시간 동안 수행하였다. 그리고 나서, 세포를 조심해서 제거하고, 프릿트 상의 액체를 피펫으로 제거하였다. 용리 챔버를 제거하고, 막 캡 상의 액체를 피펫으로 제거하였다. 막 캡내의 액체를 피페트만 (Pipetman)으로 제거하고, 저장하였다. 그리고 나서, 모든 SDS 결정이 용해될 때까지 정제수를 50 ㎕씩 캡내에 넣고, 교반하고 제거하였다. 이들 세척액을 상기 저장한 액체와 혼합하였다. 전체 용리 시료 용량은 겔 슬라이스 당 300-500 ㎕였다. 시료를 10 ㎜의 스펙트라퍼 (Spectrapor) 4 12-14K 절단 투석 튜브에 넣고, 수시간 동안 정제수 내에 침지하였다. 이것을 6개의 시료 당 600 ㎖의 인산염 완충 식염수 (PBS는 칼륨으로 약 4 mM임)로 4-6 ℃에서 하룻밤 동안 투석시켰다. 완충제를 다음날 아침 대치하고, 투석을 2.5 시간 동안 계속하였다. 그리고 나서,시료를 투석 주머니로부터 제거하고, 미세원심분리관에 넣었다. 튜브를 1 시간 동안 얼음 상에 놓았다가 3 분 동안 14 K rpm으로 미세원심분리한 후, 상등액을 침전된 SDS로부터 주의해서 제거하였다. 그리고 나서, 상등액을 약 1 시간 이상 동안 얼음 위에 놓았다가 다시 4 분 동안 미세원심분리하였다. 상등액을 인산염 완충 식염수로 희석하여, 활성도 분석을 위해 제공하였다. 남은 시료를 - 70 ℃에서 동결시켰다.

실시예 3

돼지 mpl 리간드의 미세서열화

mpl-IgG 친화성 컬럼으로부터 얻은 분획 6 (2.6 ㎖)을 마이크로콘 (Microcon)-10 (Amicon 사) 상에서 농축하였다.mpl리간드가 마이크로콘에 흡수되지 않게 하기 위해, 막을 1 % SDS로 세척하고, 5 ㎕의 10 % SDS를 분획 6에 가하였다. 마이크로콘 농축 (20 ㎕) 후, 2X의 시료 완충제 (20 ㎕)를 분획 #6에 가하고, 전체 용량 (40 ㎕)을 4-20 % 구배의 아크릴아미드 겔 (노벡스 사)의 단일 레인 상에 적하하였다. 겔을 노벡스 프로토콜에 따라 수행하였다. 그리고 나서, 10 %의 메탄올을 포함하는 10 mM의 3-(시클로헥실아미노)-1-프로판술폰산 (CAPS) 완충제 (pH 11.0)으로 전기 블롯팅하기 전에 겔을 5 분 동안 평형화하였다. 임모빌론 (Immobilon)-PSQ 막 (Millipore 사) 상으로의 전기 블롯팅을 BioRad Trans-Blot 이동 세포 (32)에서 250 mA의 일정한 전류로 45 분 동안 수행하였다. PVDF 막을 40 % 메탄올 중의 0.1 % 쿠마씨 블루 (Coomassie Blue) R-250, 0.1 % 아세트산으로 1 분 동안 염색하고, 50 % 메탄올 중의 10 % 아세트산으로 2-3 분 동안 탈색하였다.블롯의 분자량 18,000-35,000 영역에서 가시화된 유일한 단백질의 분자량은 30,000, 28,000 및 22,000이었다.

30, 28 및 22 kDa에서의 밴드를 단백질 서열화하였다. 자동화된 단백질 서열화를 온라인 PTH 분석기가 장착된 모델 470A Applied Biosystem 서열화기 상에서 수행하였다. 서열화기를 변형시켜 80-90 %의 시료를 주입하였다 (로드리구에즈 (Rodriguez)의 문헌 [J. Chromatogr., 350:217-225 (1985)] 참조). 아세톤 (~ 12 ㎕/ℓ)을 용액 A에 가하여 UV 흡광기의 균형을 맞추었다. 전기 블롯팅된 단백질을 Blott 카트리지에서 서열화하였다. 피크를 Nelson Analytical 970 접속 장치를 사용한 Justice Innovation 소프트웨어로 적분하였다. 서열 판독을 VAX 5900 상에서 수행하였다 (헨젤 (Henzel) 등의 문헌 [J. Chromatogr., 404 :41-52 (1987)]). N-말단 서열 (괄호 안에 불확실한 잔기를 기재한 1 문자 코드를 사용함) 및 수득된 물질의 양 (모난 괄호 안에 기재함)을 표 2에 기재해 놓았다.

<표 2>

30 kDa [1.8 pmol]1 5 10 15 20 25(S)PAPPA(C)DPRLLNKLLRDD(H/S)VLH(G)RL	(서열 동정 번호 : 30)
28 kDa [0.5 pmol]1 5 10 15 20 25(S)PAPPAXDPRLLNKLLRDD(H)VL(H)GR	(서열 동정 번호 : 31)
18-22 kDa [0.5 pmol]1 5 10XPAPPAXDPRLX(N)(K)	(서열 동정 번호 : 32)

실시예 4

액체 현탁액 거핵구 신생 분석

사람 말초 간 세포 (PSC) (동의한 환자로부터 얻음)를 IMDM 배지 (Gibco 사)로 5배 희석하고, 실온에서 800×g로 15 분 동안 원심분리하였다. 세포 펠릿을 IMDM에 재현탁시키고, 60 % 퍼콜 (Percoll : 밀도 1.077 gm/㎖) 상에 층을 이루게 한 후, 800×g에서 30 분 동안 원심분리하였다. 낮은 밀도의 단핵 세포를 계면에서 흡출하고, IMDM으로 2회 세척한 후, 24-웰 조직 배양 클러스터 (Costar 사)의 30 % FBS를 포함하는 IMDM (최종 용량 1 ㎖) 중에 1-2×10⁶세포/㎖로 플레이팅하였다. APP 또는 APP가 고갈된mpl리간드를 10 % 까지 가하고, 배양물을 37 ℃의 5 % CO₂및 공기 중의 습윤된 인큐베이터에서 12-14 일 동안 배양하였다. 또한, 0, 2 및 4 일에 0.5 ㎍의mpl-IgG을 가한 배양물을 10 % APP 존재 하에서 배양하였다.mpl-IgG 친화성 컬럼을 통해 APP를 통과시킴으로써 APP를mpl리간드로부터 고갈시켰다.

상기 액체 현탁액 배양물 중의 거핵구 신생을 정량하기 위해, 솔베르그 (Solberg) 등의 변형을 사용하였고, GPIIbIIIa (Dr. Nichols, Mayo Clinic에서 제공함)에 대한 방사성 표지화된 쥐의 IgG 단일클론 항체 (HP1-1D)를 사용하였다. 100 ㎍의 HP1-1D (그랜트 (Grant, B.)등의 문헌 [Blood 69:1334-1339 (1987)] 참조)를 제조업자의 지시로 기재한 바와 같이 Enzymobeads (캘리포니아주 리치몬드 소재의 Biorad 사)를 사용한 1mCi의 Na¹²⁵I로 방사성 표지화하였다. 방사성 표지화된 HP1-1D를 0.01 % 옥틸-글루코사이드를 포함하는 PBS 중에서 - 70 ℃로 보관하였다. 전형적 비활성은 1-2×10⁶cpm/㎍ (12.5 % 트리클로로아세트산에 의해 95 %이상 침전됨)이었다.

액체 현탁액 배양물을 각 실험 시점에 대해 3개씩 준비해 놓았다. 12-14 일 동안 배양한 후, 1 ㎖의 배양물을 1.5 ㎖ 에펜도르프 (eppendorf) 튜브에 옮기고, 실온에서 10 분 동안 800×g로 원심분리하고, 생성된 세포 펠릿을 0.02 % EDTA 및 20 % 송아지 혈청을 포함하는 100 ㎕의 PBS 중에 재현탁시켰다. 50 ㎕의 분석용 완충제 중의 10 ng의¹²⁵I-HP1-1D를 재현탁된 배양물에 가하고, 실온 (RT)에서 때때로 진탕하면서 60 분 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 RT에서 10 분 동안 800×g로 원심분리하여 수집하고, 분석용 완충제로 2회 세척하였다. 펠릿을 감마 카운터 (gamma counter : Packard 사)에서 1 분 동안 카운팅하였다. 비특이적 결합은 표지화된 HP1-1D를 가하기 전에 1 ㎍의 비표지화된 HP1-1D를 60 분 동안 가함으로써 측정되었다. 특이적 결합은 과량의 비표지화된 HP1-1D 존재 하에서 결합한 것을 전체¹²⁵I-HP1-1D 결합에서 제함으로써 측정되었다.

실시예 5

올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머

30 kDa, 28 kDa 및 18-22 kDa 단백질로부터 얻은 아미노-말단의 아미노산 서열을 근거로 하여, 축퇴성 올리고뉴클레오티드를 폴리메라제 연쇄 반응 (PCR) 프라이머로 사용하기 위해 디자인하였다 (표 4 참조). 아미노산 잔기 2-8 (mpl1)을 코딩하는 양의 센스 20-mer 풀 및 아미노산 18-24 (mpl2)를 코딩하는 서열에 대해 상보적인 안티센스 21-mer 풀의 2개의 프라이머 풀을 합성하였다.

축퇴성 올리고뉴클레오티드 프라이머 풀

mpl 1 : 5' CCN GCN CCN CCN GCN TGY GA 3'(2,048배 축퇴성)	(서열 동정 번호 : 35)
mpl 2 : 5' NCC RTG NAR NAC RTG RTC RTC 3'(2,048배 축퇴성)	(서열 동정 번호 : 36)

돼지 말초 혈액 임파구로부터 단리한 돼지 게놈 DNA를 PCR에 대한 주형으로 사용하였다. 50 ㎕의 반응물은 10 mM 트리스-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 100 ㎍/㎖ BSA, 400 μM dNTPs, 1 μM의 각 프라이머 풀 및 2.5 단위의Taq폴리메라제 중의 0.8 ㎍의 돼지 게놈 DNA를 포함하였다. 먼저 주형을 94 ℃에서 8 분 동안, 이어서 94 ℃에서 45 초, 55 ℃에서 1 분, 72 ℃에서 1 분씩 35회 변성화시켰다. 마지막 변성화는 72 ℃에서 10 분 더 연장하여 수행하였다. PCR 생성물을 12 % 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기 영동에 의해 분리하고, 에티듐 브로마이드로 염색하여 가시화하였다. 아미노-말단의 아미노산 서열이 단일 엑손에 의해 코딩될 경우, 온당한 PCR 생성물이 69 bp라고 기대하는 것은 타당하였다. 이러한 크기의 DNA 단편을 겔로부터 용리하고, pGEMT (Promega 사)로 서브클로닝하였다. 3개의 클론의 서열을 하기 표 5에 기재해 놓았다.

69 bp의 돼지 게놈 DNA 단편

gem T35'CCAGCGCCGC CAGCCTGTGACCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCCTCGTGA3' GGTCGCGGCG GTCGGACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGGAGCACTTGACCACGTT CAGCACGGC [69 bp] (서열 동정 번호 : 37)ACTGGTGCAA GTCGTGCCG(서열 동정 번호 : 38)

gem T75'CCAGCACCTC CGGCATGTGACCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCTTCGTGA3' GGTCGTGGAG GCCGTACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGAAGCACTCGACCACGTC CATCACGGC [69 bp] (서열 동정 번호 : 39)GCTGGTGCAG GTAGTGCCG(서열 동정 번호 : 40)

gem T9P R L L N K L L R(서열 동정 번호 : 32)5'CCAGCACCGCCGGCATGTGACCCCCGACTCCTAAATAAACTGCTTCGTGACG3' GGTCGTGGCGGCCGTACACTGGGGGCTGAGGATTTATTTGACGAAGCACTGCATCATGTCTATCACGGT 3' (서열 동정 번호 : 41)TAGTACAGATAGTGCCA5' (서열 동정 번호 : 42)

PCR 프라이머의 위치는 밑줄친 염기로 나타내었다. 이러한 결과는 30 kDa, 28 kDa 및 18-22 kDa 단백질에 대한 아미노산 9-17에 대해 얻은 N-말단 서열을 입증하고, 이들 서열이 돼지 DNA의 단일 엑손에 의해 코딩됨을 나타내었다.

실시예 6

사람 mpl 리간드 유전자

실시예 5의 결과에 의하면, pR45로 명명되는 45-mer 데옥시올리고뉴클레오티드를 디자인하고 합성하여 게놈 라이브러리를 검색하였다. 45-mer는 하기 서열을 가졌다:

5' GCC-GTG-AAG-GAC-GTG-GTC-GTC-ACG-AAG-CAG-TTT-ATT-TAG-GAG-TCG 3'

(SEQ ID NO : 28)

상기 올리고뉴클레오티드를 (γ³²P)-ATP 및 T4 키나제를 사용하여³²P로 표지화하고, 낮은 절박 혼성화 및 세척 조건 하에서 사용하여 λgem12 내에서 사람 게놈 DNA 라이브러리를 검색하였다 (실시예 7 참조). 양의 클론을 수집하여 플레이크를 정제한 후, 제한 유전자 지도 작성 및 사우선 블롯팅에 의해 분석하였다. 클론 #4를 추가 분석을 위해 선택하였다.

45-mer로 혼성화한 2.8 kb BamHI-XbaI 단편을 pBluescript SK-로 서브클로닝하였다. 이 클론의 부분적 DNA 서열화를 프라이머로서 돼지mpl리간드 DNA 서열에 특이성이 있는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행하였다. 수득된 서열은 돼지mpl리간드의 사람 유사체를 코딩하는 DNA가 단리되었음을 입증하였다. EcoRI 제한 부위는 2.8 kb BamHI-XbaI으로부터 390 bp EcoRI-XbaI 단편을 단리하고, pBluescript SK-에서 그것을 서브클로닝하도록 하는 서열 중에서 검출되었다.

상기 단편의 이중쇄 모두를 서열화하였다. 사람 DNA 서열 및 추정되는 아미노산 서열을 도9 (SEQ ID NO : 3 및 4)에 도시하고 있다. 또한, 게놈 서열 중 인트론의 추정 위치를 화살표로 나타내었고, 추정 엑손 ("엑손 3")을 정의하였다.

추정 아미노산 서열의 조사 (직접적인 아미노산 서열 분석으로 측정됨)는 세린 잔기가 성숙된mpl리간드의 제1 아미노산임을 입증하였다. 이 코돈의 바로 업스트림의 추정 아미노산 서열이 성숙된mpl리간드 분비에 연관된 시그날 서열인 것으로 추정되었다. 이 시그날 서열의 코딩 서열은 아마도 인트론에 의해 뉴클레오티드 위치 68에서 단속될 것이다.

3' 방향에 있는 엑손은 뉴클레오티드 196에서 종결되는 것으로 보인다. 따라서, 이 엑손은 42개의 아미노산 서열을 코딩하고, 이 중 16개는 시그날 서열의 일부일 것이고, 이 중 26개는 성숙된 사람mpl리간드의 일부이다.

실시예 7

전체 길이의 사람 mpl 리간드 cDNA

사람의 "엑손 3" 서열 (실시예 6)을 근거로 하여, "엑손 3" 서열의 3' 및 5' 말단에 대응하는 2개의 비축퇴성 올리고뉴클레오티드를 합성하였다 (표 6).

사람의 cDNA 비축퇴성 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머

Fwd 프라이머:5' GCT AGC TCT AGA AAT TGC TCC TCG TGG TCA TGC TTC T 3'	(서열 동정 번호 : 43)
Rvs 프라이머 :5' CAG TCT GCC GTG AAG GAC ATG G 3'	(서열 동정 번호 : 44)

이들 2개의 프라이머는 실시예 5에 기재한 조건을 사용하여 다양한 사람 cDNA 라이브러리로부터 얻은 주형 DNA으로서 또는 다양한 조직으로부터 얻은 1 ng의 Quick Clone cDNA (Clonetech 사)를 사용하여 PCR 반응에 사용되었다. 온당한 PCR 생성물의 예상 크기는 140 bp였다. PCR 생성물을 12 % 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분석한 후, 예상 크기의 DNA 단편을 성인 신장, 293 태아 신장 세포로부터 제조한 cDNA 라이브러리 및 사람 태아 간으로부터 제조한 cDNA (Clonetech cat. #7171-1)에서 검출하였다.

λ DR2 중의 태아 간 cDNA 라이브러리 (Clonetech cat. #HL1151x)를 사람 게놈 라이브러리를 검색하는데 사용했던 동일한 45-mer 올리고뉴클레오티드를 사용하여 검색하였다. 올리고뉴클레오티드를 T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 사용하여 (γ³²P)-ATP로 표지화하였다. 라이브러리를 낮은 절박 혼성화 조건 하에서 검색하였다. 필터를 2 시간 동안 예비 혼성화한 후, 42 ℃의 20 % 포름아미드, 5xSSC, 10xDenhardt's, 0.05 M 인산나트륨 (pH 6.5), 0.1 % 피로인산나트륨, 50 ㎍/㎖ 초음파분쇄된 연어 정충 DNA 중에서 하룻밤 동안 프로브와 혼성화하였다. 그리고 나서, 필터를 2xSSC로 세척하고, 42 ℃에서 0.5xSSC, 0.1 % SDS로 1회 세척하였다. 필터를 코닥 (Kodak) X-선 필름에 하룻밤 동안 노출시켰다. 양의 클론을 수집하여 플레이크를 정제한 후, 삽입 크기를 λ DR2 (Clonetech cat. #6475-1)에서 클로닝한 BamHI-XbaI을 플랭킹한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR에 의해 측정하였다. 5 ㎕의 파지 농축액을 주형 공급원으로 사용하였다. 먼저 94 ℃에서 7 분 동안 변성화한 후, 30 회 (94 ℃에서 1 분, 52 ℃에서 1 분 및 72 ℃에서 1.5 분) 증폭하였다. 마지막은 72 ℃에서 15 분 더 연장하였다. 클론 # FL2b는 1.8 kb의 삽입을 가졌고, 다른 분석을 위해 선택되었다.

λDR2 파지 암 (arm) 내에 포함된 플라스미드 pDR2 (Clonetech 사, λDR2 & pDR2 cloning and Expression System Library Protocol Handbook, p 42)를 제조업자의 지시에 의해 기재한 바와 같이 구해내었다 (Clonetech 사, λDR2 & pDR2 cloning and Expression System Library Protocol Handbook, p 29-30). BamHI 및 XbaI을 사용한 플라스미드 pDR2-FL2b의 제한 분석에 의하면 약 위치 650의 삽입에서 내부 BamHI 제한 부위가 존재하였다. BamHI-XbaI을 사용하여 플라스미드를 소화함으로써 삽입을 2개의 단편 (0.65 kb 및 1.15 kb)으로 절단하였다. DNA 서열을 플라스미드 pDR2-FL2b에서 유래하는 3개의 상이한 부류의 주형을 사용하여 측정하였다. 이중쇄 플라스미드 DNA의 DNA 서열화를 염색 표지화된 디데옥시 뉴클레오사이드 트리포스페이트 전사 종결 인자 (염색-전사 종결 인자)에 대한 표준 프로토콜 및 통상적으로 합성된 워킹 프라이머를 사용하여 AB1373 (캘리포니아주 포스터 시티 소재의 Applied Biosystems 사) 자동화된 형광 DNA 서열화기로 수행하였다 (상거 (Sanger) 등의 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 : 5463-5467 (1977)] 및 스미쓰 (Smith) 등의 문헌 [Nature, 321 : 674-679 (1986)] 참조). 플라스미드로부터 폴리메라제 연쇄 반응으로 증폭된 단편의 직접 서열화는 통상적인 프라이머 및 염색-전사 종결 인자 반응을 사용하여 AB1373 서열화기로 수행되었다. 단일쇄 주형은 M13 Janus 벡터 (위스콘신주의 매디슨 소재의 DNASTAR, Inc.사)로 제조되었다 (버랜드 (Burland) 등의 문헌 [Nucl. Acids Res., 21 : 3385-3390 (1993)] 참조). BamHI-XbaI (1.15 kb) 및 BamHI (0.65 kb) 단편을 플라스미드 pDR2-FL2b로부터 단리하고, 말단을 데옥시뉴클레오티드 존재 하에서 T4 DNA 폴리메라제로 채운 후, M13 Janus의 SmaI 부위로 서브클로닝하였다. 서열화를 염색-표지화된 M13 통상 프라이머 및 역 프라이머, 또는 워킹 프라이머 및 염색-전사 종결 인자에 대한 표준 프로토콜을 사용하여 수행하였다. 수동식 서열화 반응을 워킹 프라이머 및 표준 디데옥시-전사 종결 인자 화학 (상거 (Sanger) 등의 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 : 5463-5467 (1977)),³³P 표지화된 α-dATP 및 시퀘나제 (Sequenase : 오하이오주의 클리브랜드 소재의 United States Biochemical Corp.사)를 사용하여 단일쇄 M13 DNA 상에서 수행하였다. DNA 서열 조합을 시퀀서 (Sequencher) V2.1b12 (미시간주의 앤 아르보 소재의 Gene Codes Corporation 사)로 수행하였다.hML의 뉴클레오티드 및 추정 서열을 도1 (SEQ ID NO :1)에 제공하였다.

실시예 8

사람의 mpl 리간드 (TPO) 유전자의 단리

mpl리간드를 코딩하는 사람 cDNA의 3' 절반 (BamHI 부위에서 3' 말단까지)에 대응하는 단편을 사용하여 TPO 유전자의 사람 게놈 DNA 클론은 낮은 절박 조건 (실시예 7 참조) 또는 높은 절박 조건 하에서 상기 올리고뉴클레오티드 프로브인 pR45를 갖는 λ-Gem 12 내의 사람 게놈 라이브러리를 검색함으로써 단리되었다. 35 kb에 달하는 2개의 중첩 람다 클론을 단리하였다. 완전한 TPO 유전자를 포함하는 2개의 중첩 단편 (BamHI 및 EcoRI)을 서브클로닝하고, 서열화하였다. 사람 유전자의 구조는 게놈 DNA의 7kb 내의 6개의 엑손으로 구성된다 (제14A, B 및 C). 모든 엑손/인트론 연결의 경계는 포유 동물 유전자에 대해 형성된 공통 모티프와 일치한다 (샤피로 (Shapiro, M. B.) 등의 문헌 [Nucl. Acids Res., 15 : 7155 (1987)] 참조). 엑손 1 및 엑손 2는 5'의 번역되지 않는 서열 및 시그날 펩티드의 처음 4개의 아미노산을 포함한다. 분비 시그날의 나머지 부분 및 성숙된 단백질의 처음 26개의 아미노산은 엑손 3 내에 코딩되어 있다. 전체 카르복실 도메인 및 3'의 번역되지 않는 부분 및 에리트로포이에틴류 도메인의 약 50개의 아미노산은 엑손 6 내에 코딩되어 있다. hML-2 (hTPO-2) 내에서 관찰되는 결실에 연관된 4개의 아미노산은 엑손 6의 5' 말단에 코딩되어 있다.

실시예 9

사람의 mpl 리간드 (hML)의 일시적 발현

pDR2-FL2b에 포함된 전체 길이 삽입을 서브클로닝하기 위해, 플라스미드를 XbaI으로 완전히 소화시킨 후, BamHI로 부분 소화시켰다. 1.8 kb의 삽입에 대응하는 DNA 단편을 겔 정제하고, 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus)의 초기 프로모터의 조절 하에서 pRK5 (pRK5-hmplI)에서 서브클로닝하였다 (pRK5의 구성에 관한 미합중국 특허 제5,258,287호 참조). pRK5-hmplI 구조물로부터 얻은 DNA를 PEG 방법에 의해 제조하고, F-12 영양분 혼합물, 20 mM 헤페스 (Hepes : pH 7.4) 및 10 % 태아 소 혈청으로 보충된 둘베코 (Dulbecco)의 변형된 이글 (Eagle) 배지 (DMEM)에 보관 중인 사람의 배성 신장 293 세포에 형질감염시켰다. 세포를 문헌 (골만 (Gorman)의 DNA Cloning : A Practical Approach (글로버 (Glover, D.M.) 편집) 제II권, pp 143-190, IRL Press, Washington, D.C.)에 기재한 바와 같이 인산칼슘 방법에 의해 형질감염시켰다. 형질감염 36 시간 후, 형질감염된 세포의 상등액을 증식 분석에 있어서의 활성에 대해 분석하였다 (실시예 1 참조). pRK 벡터로 형질감염된 293 세포의 상등액은 Ba/F3 또는 Ba/F3-mpl세포를 자극하지 않았다 (도12a 참조). pRK5-hmplI으로 형질감염된 세포의 상등액은 Ba/F3 세포에는 영향을 주지 않았으나, Ba/F3-mpl 세포의 증식을 크게 자극하였는데 (도12a도 참조), 이는 상기 cDNA가 기능적으로 활성 있는 사람의mpl리간드를 코딩함을 나타낸다.

실시예 10

사람의 mpl 리간드의 이형 : hML2, hML3, 및 hML4

hML의 다르게 스플라이싱 (splicing)된 형태를 확인하기 위해, hML의 코딩 서열의 각 말단에 대응하는 프라이머를 합성하였다. 이러한 프라이머는 사람의 성인 간 RNA를 증폭하기 위해 RT-PCR에 사용되었다. 또한, 선택된 해당 영역을 플랭킹하는 내부 프라이머 (하기 참조)도 구성하여 유사하게 사용하였다. PCR 생성물의 말단의 직접 서열화로 사람 태아 간 라이브러리로부터 단리한 cDNA의 서열에 정확하게 대응하는 단일 서열을 밝혀내었다 (도1의 SEQ ID NO : 1 참조). 그러나, EPO-도메인 (PCR 생성물의 중간 부분)의 C-말단 부근의 영역은 그 영역에 여러 가능한 스플라이스가 존재함을 제안하는 복합 서열 페턴을 나타내었다. 이러한 여러 스플라이스 이형을 단리하기 위해, 해당 영역을 플랭킹하는 표 7에 제공된 프라이머를 사람의 성인 간 cDNA에 대한 주형으로서 PCR에 사용하였다.

사람의 ML 이형 PCR 프라이머

phmpllcdna.3e 1 :5' TGTGGACTTTAGCTTGGGAGAATG 3'	(서열 동정 번호 : 45)
pbx4.f2 :5' GGTCCAGGGACCTGGAGGTTTG 3'	(서열 동정 번호 : 46)

PCR 생성물을 M13으로 서서히 서브클로닝하였다. 개개의 서브클론의 서열화로 3개 이상의 ML 이형이 존재함으로 밝혀내었다. 그 중 하나인 hML (또는 hML₃₃₂로 나타냄)은 가장 긴 형태이고, 태아 간 라이브러리로부터 단리한 서열에 정확하게 일치한다. 가장 긴 것 (hML)부터 가장 짧은 것 (hML-4) 순으로 4개의 사람mpl리간드 이형의 서열을 도11 (SEQ ID NO : 6, 8, 9 및 10)에 나타내고 있다.

실시예 11

사람 mpl 리간드 이형 및 대용 이형의 구성 및 일시적 발현

hML2, hML2, 및 hML (R153A, R154A)

이형 hML2 및 hML3, 및 대용 이형 hML (R153A, R154A)를 루셀 (Russell Higuchi)의 문헌 [PCR Protocols, A guide to Methods and Application, Acad. Press, M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky & T.J. White Editors]에 기재하고 있는 재조합 PCR 기술을 사용하여 hML로부터 재구성하였다.

모든 구성물에 있어서, 사용된 "외부" 프라이머를 표 8에 도시하고 있고, "중첩" 프라이머를 표 9에 도시하고 있다.

외부 프라이머

Cla.FL.F2 :5' ATC GAT ATC GAT AGC CAG ACA CCC CGG CCA G 3'	(서열 동정 번호 : 47)
HMPLL-R :5' GCT AGC TCT AGA CAG GGA AGG GAG CTG TAC ATG AGA 3'	(서열 동정 번호 : 48)

중첩 프라이머

hML-2 :MLΔ4.F :5' CTC CTT GGA ACC CAG GGC AGG ACC 3'MLΔ4.R :5' GGT CCT GCC CTG GGT TCC AAG GAG 3'	(서열 동정 번호 : 49)(서열 동정 번호 : 50)
hML-3 :hMLΔ116+ :5' CTG CTC CGA GGA AAG GAC TTC TGG ATT 3'hMLΔ116- :5' AAT CCA GAA GTC CTT TCC TCG GAG CAG 3'	(서열 동정 번호 : 51)(서열 동정 번호 : 52)
hML (R153A, R154A) :RR-KO-F :5' CCC TCT GCG TCG CGG CGG CCC CAC CCA C 3'RR-KO-R :5' GTG GGT GGG GCC GCC GCG ACG CAG AGG G 3'	(서열 동정 번호 : 53)(서열 동정 번호 : 54)

모든 PCR 증폭은 다음 조건을 사용하여 클로닝된 Pfu DNA 폴리메라제 (Stratagene)로 수행되었다 :

먼저 주형을 94 ℃에서 7 분 동안, 이어서 94 ℃에서 1 분, 55 ℃에서 1 분, 72 ℃에서 1.5 분씩 30회 변성화시켰다. 마지막 변성화는 72 ℃에서 10 분 더 연장하여 수행하였다. 최종 PCR 생성물을 ClaI-XbaI으로 소화시키고, 겔 정제한 후, pRK5tkneo에서 클로닝하였다. 293 세포를 상기와 같이 여러 구성물로 형질감염시키고, 상등액을 Ba/F3-mpl증식 분석법을 사용하여 분석하였다. hML-2 및 hML-3은 이 분석에서 더이상 활성이 검출되지 않았으나, hML (R153A, R154A)의 활성은 hML과 유사하였는데, 이는 상기 이염기 부위에서의 처리가 활성에는 필요하지 않음을 나타낸다 (도13 참조).

실시예 12

쥐의 mpl 리간드 cDNA : mML, mML-2 및 mML-3

mML cDNA의 단리

사람mpl리간드의 전체 코딩 영역에 대응하는 DNA 단편을 PCR에 의해 수득하고, 겔 정제한 후,³²P-dATP 및³²P-dCTP 존재 하에서 램덤 프라이밍 (priming)에 의해 표지화하였다. 이 프로브를 λGT10 (Clontech cat# ML3001a) 내에서 생쥐 간 cDNA 라이브러리의 10⁶클론을 검색하는데 사용하였다. 프로브 존재 하에서 2개의 필터를 35 % 포름아미드, 5xSSC, 10xDenhardt's, 0.1 % SDS, 0.05 M 인산나트륨 (pH 6.5), 0.1 % 피로인산나트륨, 100 ㎍/㎖의 초음파분쇄된 연어 정충 DNA 중에서하룻밤 동안 혼성화하였다. 필터를 2xSSC로 세척한 후, 42 ℃에서 0.5xSSC, 0.1 % SDS로 1회 세척하였다. 혼성화한 파지를 플레이크 정제하고, cDNA 삽입을 Bluescript SK- 플라스미드의 Eco RI 부위로 서브클로닝하였다. 1.5 kb의 삽입을 갖는 클론 "LD"를 다른 분석을 위해 선별하고, 이중쇄를 사람의 ML cDNA에 대해 상기와 같이 서열화하였다. 클론 LD로부터 얻은 뉴클레오티드 및 추정 아미노산 서열을 도14 (SEQ ID NO : 1 및 11)에 제공하였다. 상기 클론으로부터 얻은 추정된 성숙 ML 서열은 331개 길이의 아미노산 잔기이고, mML₃₃₁(또는 하기와 같은 이유로 mML-2)로서 확인되었다. 뉴클레오티드 및 추정 아미노산 서열에 있어서의 상당한 동일성이 이들 ML의 EPO 유사 도메인에서 관찰되었다. 그러나, 사람 및 생쥐 ML의 추정 아미노산 서열을 정렬할 경우, 생쥐의 아미노산 서열은 사람 (상기 참조) 및 돼지 (하기 참조)의 cDNA에서 나타나는 뉴클레오티드 위치 618 다음의 12개의 뉴클레오티드 결실에 대응하는 사람의 아미노산 잔기 111-114 사이에서 테트라펩티드가 결실된 것으로 나타난다. 따라서, 추가 클론을 가능한 쥐의 ML 이형을 검출하기 위해 조사하였다. 하나의 클론인 "L7"은 "빠진" 테트라펩티드 LPLQ를 포함하는 335개의 아미노산 추정 서열을 갖는 1.4 kb 삽입을 갖는다. 이 형태는 전체 길이의 쥐 ML로 여겨지며, mML 또는 mML₃₃₅로서 나타내어진다. mML에 대한 뉴클레오티드 및 추정 아미노산 서열을 도16 (SEQ ID NO : 12 및 13)에 나타내고 있다. 마지막으로, 클론 "L2"를 단리하고, 서열화하였다. 이 클론은 hML3에 대응하는 116개의 뉴클레오티드가 결실되어 있어서, mML-3으로 명명되었다. 상기 2개의 이형의추정 아미노산 서열의 비교는 도16에 도시되어 있다.

재조합 mML의 발현

쥐의 ML에 대한 발현 벡터를 본질적으로 실시예 8에서 기재하고 있는 것과 같이 제조하였다. mML 및 mML-2를 코딩하는 클론을 CMV 프로모터 및 SV40 폴리아데닐화 시그날의 조절 하에서 발현되는 포유 동물 발현 벡터인 pRK5tkneo로 서브클로닝하였다. 생성된 발현 벡터인 mMLpRKtkneo 및 mML2pRKtkneo를 인산칼슘 방법을 사용하여 293 세포로 순간적으로 형질감염시켰다. 순간적 형질감염 후, 5일 동안 배지의 신선도를 유지하였다. 세포를 10 % 태아 송아지 혈청으로 보충된 글루코스 함량이 높은 DMEM 배지 중에 보관하였다.

Ba/F3 세포에서 쥐의 mpl (mmpl)의 발현

c-mpl을 발현하는 적합한 세포주를 본질적으로 실시예 1의 사람mpl에 대해 기재한 것과 같이 mmplpRKtkneo의 형질감염에 의해 얻었다. 간단히, 쥐의mpl의 전체 코딩 서열 (스코다 (Skoda, R.C.) 등의 문헌 [EMBO J. 12 : 2645-2653 (1993)] 참조)을 포함하는 발현 벡터 (20 ㎍ : 선형화됨)를 전기 천공 (5×10⁶세포, 250 볼트, 960 μF)에 의해 Ba/F3 세포로 형질감염시키고, 2 ㎎/㎖의 G418을 사용하여 네오마이신 저항에 대해 선별하였다.mpl발현을 항-쥐mpl-IgG 항혈청을 사용하여 유동 세포 분석법에 의해 분석하였다. Ba/F3 세포를 IL-3의 공급원으로 WEHI -3B 세포로부터 RPMI 1640 배지 중에 보관하였다. mML 및 mML-2로 순간적 형질감염시킨 293 세포로부터 얻은 상등액을 실시예 1에서 기재한 것과 같은 mmpl및 hmpl로 형질감염시킨 BaF3 세포 중에서 분석하였다.

실시예 13

돼지 mpl 리간드 cDNA : pML 및 pML-2

돼지 ML (pML) cDNA를 RACE PCR에 의해 단리하였다. 간단히, 올리고 dT 프라이머 및 2개의 특정 프라이머를 재생불량성 빈혈 돼지 혈청으로부터 정제한 ML의 아미노 말단을 코딩하는 돼지 ML 유전자 엑손의 서열을 근거로 하여 디자인하였다. 여러 재생불량성 돼지 조직으로부터 제조한 cDNA를 수득하여 증폭시켰다. 1342 bp의 PCR cDNA 생성물을 신장에서 발견하여 서브클로닝하였다. 몇개의 클론을 서열화하여 그것이 성숙한 돼지mpl리간드를 코딩한다는 것을 발견하였다 (완전한 분비 시그날을 포함하지 않음). cDNA가 도18 (SEQ ID NO : 9 및 16)에서 도시하고 있는 서열을 갖는 332개 아미노산의 성숙한 단백질 (pML₃₃₂)을 코딩한다는 것을 발견하였다.

방법:

pML 유전자 및 cDNA의 단리

돼지 ML 유전자의 게놈 클론을 EMBL3 (Clontech Inc.사) 중에서 돼지 게놈 라이브러리를 pR45로 검색함으로써 단리하였다. 라이브러리를 본질적으로 실시예 7에서 기재하고 있는 바와 같이 검색하였다. 몇개의 클론을 단리하고, 정제된 ML로부터 얻은 것과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 엑손을 서열화하였다. 돼지 ML cDNA를 RACE PCR 프로토콜의 변형을 사용하여 수득하였다. 2개의 특정 ML 프라이머를 돼지 ML 유전자의 서열을 근거로 하여 디자인하였다. 폴리아데닐화된 mRNA를 본질적으로 상기와 같이 재생불량성 빈혈 돼지의 신장으로부터 단리하였다. cDNA를 mRNA의 폴리아데노신 테일과 연관된 BamdT 프라이머를 역전사하여 제조하였다:

(BamdT : 5' GACTCGAGGATCCATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT 3')

(SEQ ID NO : 55)

PCR 증폭 (95 ℃에서 60초 동안, 58 ℃에서 60초 동안, 및 72 ℃에서 90초 동안 28회 증폭)의 제1 증폭을 ML 특정 h-forward-1 프라이머 및 BAMAD 프라이머를 사용하여 100 ㎖의 반응액 (50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 10 mM 트리스 (pH 8.0), 0.2 mM dNTPs 및 0.05 U/㎖ Amplitaq 폴리메라제 [Perkin Elmer Inc.사]) 중에서 수행하였다.

(h-forward-1 : 5' GCTAGCTCTAGAAATTGCTCCTCGTGGTCATGCTTCT 3')

(SEQ ID NO : 43)

(BAMAD : 5' GACTCGAGGATCCATCG 3')

(SEQ ID NO : 56)

그리고 나서, PCR 생성물을 Cla 1으로 소화시키고, 페놀-클로로포름 (1:1)으로 추출하고, 에탄올로 침전시킨 후, Cla 1 및 Kpn 1로 절단된 0.1 ㎎의 Bluescript SK- 벡터 (Stratagene inc.사)에 결찰시켰다. 실온에서 2 시간 동안 배양한 후, 결찰 혼합물의 1/4을 제2 ML 특정 forward-1 프라이머 및 T3-21 (Bluescript SK- 벡터내에 있는 다클로닝 영역에 인접한 서열에 결합하는 올리고뉴클레오티드)을 사용하여 PCR (상기와 같이해서 22회)의 제2 증폭에 직접 가하였다.

(forward-1 : 5' CGTAGCTCTAGAAGCCCGGCTCCTCCTGCCTG 3')

(SEQ ID NO : 57)

(T3-21 : 5' CGAAATTAACCCTCACTAAAG 3')

(SEQ ID NO :58)

생성된 PCR 생성물을 XbaI 및 ClaI으로 소화시키고, Bluescript SK-로 서브클로닝하였다. 독립적인 PCR 반응으로부터 얻은 몇개의 클론을 서열화하였다.

다시 4개의 아미노산 잔기 결실을 갖는 단백질을 코딩하는 pML-2로 명명되는 제2형을 동정하였다 (도21의 [SEQ ID NO :21] 참조). pML 및 pML-2 아미노산 서열을 비교해 보면, pML-2가 잔기 111-114에 대응하는 테트라펩티드 QLPP가 결실된 것을 제외하고는 동일하다 (도22의 [SEQ ID NO : 18 및 21] 참조). 쥐, 사람 및 돼지의 ML cDNA에서 관찰된 4개의 아미노산 결실은 추정 단백질 내 동일 위치에서도 정확하게 나타난다.

실시예 14

혈소판 항원 GPII _b III _a 발현의 트롬보포이에틴 (TPO) 유도에 대한 CMK 분석

CMK 세포를 10 % 태아 소 혈청 및 10 mM 글루타민으로 보충된 RMPI 1640 배지 (Sigma) 중에 보관하였다. 상기 분석을 위해 제조할 경우, 세포를 수집, 세척 및 5 ㎎/ℓ 소 인슐린, 10 ㎎/ℓ 아포-트랜스페린, 1×미량 원소로 보충된 혈청이없는 GIF 배지 중에 5×10⁵세포/㎖로 재현탁시켰다. 96-웰의 평평한 바닥 플레이트에서, TPO 표준 시료 또는 실험 시료를 100 ㎕ 용량으로 적절하게 희석하여 각 웰에 가하였다. 100 ㎕의 CMK 세포 현탁액을 각 웰에 가하고, 플레이트를 37 ℃의 5 % CO₂인큐베이터에서 48 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 플레이트를 4 ℃에서 5 분 동안 1000 rpm으로 회전시켰다. 상등액을 따라내고, 100 ㎕의 FITC-공액된 GPII_bIII_a단일클론 2D2 항체를 각 웰에 가하였다. 4 ℃에서 1 시간 동안 배양한 후, 플레이트를 5 분 동안 1000 rpm에서 다시 회전시켰다. 결합하지 않은 항체를 포함하는 상등액을 따라내고, 200 ㎕의 0.1 % BSA-PBS 세척액을 각 웰에 가하였다. 0.1 % BSA-PBS 세척 단계를 3회 반복하였다. 그리고 나서, 세포를 상대 형광 강도를 측정하는 표준 1 변수 분석법을 사용하여 FASCAN 상에서 분석하였다.

실시예 15

96-웰 미세 적정 플레이트 상의 DAMI 세포의 핵내 유사분열 활성을 측정함으로써 트롬보포이에틴 (TPO)에 대한 DAMI 분석

DAMI 세포를 10 mM 글루타민, 100 ng/㎖ 페니실린 G 및 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신으로 보충한 IMDM + 10 % 말 혈청 (Gibco 사) 중에 보관하였다. 상기 분석을 위해 제조할 경우, 세포를 수집하고 세척한 후, IMDM + 1 % 말 혈청 중에 1×10⁶세포/㎖로 재현탁시켰다. 96-웰의 둥근 바닥 플레이트에서, 100 ㎕의 TPO 표준 시료 또는 실험 시료를 DAMI 세포 현탁액에 가하였다. 그리고 나서, 세포를 37 ℃의 5% CO₂인큐베이터에서 48 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 플레이트를 4 ℃에서 5 분 동안 1000 rpm으로 Sorvall 6000B 원심분리기에서 회전시켰다. 상등액을 따라내고, 200 ㎕의 PBS-0.1 % BSA 세척 단계를 반복하였다. 200 ㎕의 얼음으로 냉각한 70 % 에탄올-PBS를 가해 세포를 고정하고, 흡출에 의해 재현탁시켰다. 4 ℃에서 15 분 동안 배양한 후, 플레이트를 5 분 동안 2000 rpm에서 다시 회전시키고, 0.1 ㎎/㎖의 프로피듐 요오다이드 및 0.05 % 트윈-20을 포함하는 150 ㎕의 1 ㎎/㎖ RNAse를 각 웰에 가하였다. 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한 후, DNA 함량의 변화를 유동 세포 분석에 의해 측정하였다. 배수체를 하기와 같이 측정하고 정량하였다:

TPO : (>G2+M 내의 세포 %/<G2+M 내의 세포 %)

정규화된 배수체비 (NPR) = ------------------------------------------------;

대조용 : (>G2+M 내의 세포 %/<G2+M 내의 세포 %)

실시예 16

트롬보포이에틴 (TPO)의 생체내 분석

(쥐의 혈소판 반도 (反跳) 분석)

혈소판 생산의 ³⁵ S 결정에 대한 생체내 분석

제1일에 C57BL6 생쥐 (Charles River에서 구입)에게 1 ㎖ 염소 항-생쥐 혈소판 혈청 (6 amps)을 복강내 주사하여 혈소판 감소증을 유발하였다. 제5일 및 제6일에, 생쥐에게 인자 또는 대조용으로 PBS를 2회 복강내 투여하였다. 제7일에 0.1㎖의 식염수 중의 30 μCi의 Na₂ ³⁵SO₄를 정맥내 주사하고, 순환 혈소판으로 주입된 용약의³⁵S 혼입%를 처리된 생쥐 및 대조 생쥐로부터 얻은 혈액 시료에서 측정하였다. 혈소판 및 백혈구를 안와후 (眼窩後) 동으로부터 얻은 혈액에서 동시에 카운팅하였다.

실시예 17

mpl-Rse.gD 키메라 수용체 인산화의 측정에 의한

트롬보포이에틴 (TPO)에 대한 KIRA ELISA

비곤 (Vigon) 등의 문헌 [PNAS, USA 89 : 5640-5644 (1992)]은 사람의mpl수용체를 개시하고 있다.mpl수용체의 세포외 도메인 (ECD) 및 막 관통 (TM) 및 Rse의 세포내 도메인 (ICD) (마크 (Mark) 등의 문헌 [J. of Biol. Chem. 269 (14) : 10720-10728 (1994)] 참조)과 카르복실-말단 플래그 (즉, Rse.gD) 폴리펩티드로 이루어진 키메라 수용체를 본 명세서에 기재한 KIRA ELISA에서 사용하기 위해 제조하였다 (분석법의 도식적 설명은 도30 및 도31 참조).

(a) 표식 물질 제조

단일클론 항 gD (클론 5B6)를 헤르페스 심플렉스 (Herpes simplex) 바이러스 당단백질 D로부터 얻은 펩티드에 대해 제조하였다 (파보르스키 (Paborsky) 등의 문헌 [Protein Engineering 3(6) : 547-553 (1990)] 참조). 정제된 농축 제조물을 인산염 완충 식염수 (PBS : pH 7.4)로 3.0 ㎎/㎖까지 조정하고, 1.0 ㎖ 분취액을 -20 ℃에서 저장하였다.

(b) 항-포스포티로신 항체 제조

단일클론 항-포스포티로신 (클론 4G10)을 UBI (뉴욕 레이크 프래시드 소재)로부터 구입하고, 롱-암 (long-arm) 비오틴-N-히드록시숙신아미드 (Biotin-X-NHS, Research Organics, Cleveland, OH)를 사용하여 비오티닐화하였다.

(c) 리간드

mpl리간드를 본 명세서에 기재한 재조합 기술을 사용하여 제조하였다. 정제된mpl리간드를 농축액으로서 4 ℃에서 저장하였다.

(d) Rse.gD 핵산의 제조

합성 이중쇄 올리고뉴클레오티드를 사용하여 사람 Rse의 C-말단의 10개의 아미노산 (880-890)에 대한 코딩 서열을 재구성하고, 항체 5B6에 대한 에피토프 및 정지 코돈을 포함하는 21개의 아미노산을 추가로 가하였다. 표 10은 융합 유전자의 합성 부분의 최종 서열을 나타내고 있다.

사람의 Rse 융합 유전자의 합성 이중쇄 부분

코딩 스트랜드 :5'-TGCAGCAAGGGCTACTGCCACACTCGAGCTGCGCAGATGCTAGCCTCAAGATGGCTGATCCAAATCGATTCCGCGGCAAAGATCTTCCGGTCCTGTAGAAGCT-3'	(서열 동정 번호 : 59)
비코딩 (안티-센스) 스트랜드 :5'-AGCTTCTACAGGACCGGAAGATCTTTGCCGCGGAATCGATTTGGATCAGCCATCTTGAGGCTAGCATCTGCGCAGCTCGAGTGTGGCAGTAGCCCTTGCTGCA-3'	(서열 동정 번호 : 60)

합성 DNA를 공개된 사람 Rse cDNA 서열 (마크 (Mark) 등의 문헌 [Journal of Biological Chemistry 269 (14) : 10720-10728 (1994)] 참조)의 뉴클레오티드 2644에서 시작하는 PstI 부위 및 발현 벡터 pSV17.ID.LL (제32A-L도의 SEQ ID NO : 22 참조)의 폴리링커에 있는 HindIII 부위에 있는 사람 Rse의 아미노산 1-880을 코딩하는 cDNA로 결찰하여 발현 플라스미드 pSV.ID.Rse.gD를 생성하였다. 간단히, 발현 플라스미드는 5' 스플라이스 공여자 및 3' 스플라이스 수용자 인트론 스플라이스 부위에 의해 결합된 DHFR을 코딩하는 서열, 및 이어서 Res.gD를 코딩하는 서열을 포함하는 2 시트론성 제1 전사를 포함한다. 전체 길이 (스플라이싱되지 않은 길이)의 메시지는 제1 오픈 리딩 프레임으로서 DHFR을 포함하고, 따라서 안정한 형질전환물을 선별하기 위한 DHFR 단백질을 생성한다.

(e) mpl-Rse.gD 핵산의 제조

상기와 같이 제조한 발현 플라스미드 pSV.ID.Rse.gD를 변형시켜 Rse.gD (아미노산 429-911)의 막 관통 도메인 및 세포내 도메인으로 융합된 사람의mpl(아미노산 1-491)의 ECD의 코딩 서열을 포함하는 플라스미드 pSV.ID.M.tmRd6를 제조하였다. 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 마크 (Mark) 등의 문헌 [J.l of Biol. Chem. 267 : 26166-26171 (1992)]에 기재되어 있는 것과 같은 2 단계 PCR 클로닝 반응으로 사람mpl의 세포외 도메인의 일부 코딩 서열을 Rse 코딩 서열의 일부에 연결하였다. 제1 PCR 반응에 사용된 프라이머는 M1 및 M2와mplcDNA 주형, 및 R1 및 R2와 Rse cDNA 주형이었다.

(M1 : 5'-TCTCGCTACCGTTTACAG-3')

(SEQ ID NO : 61)

(M2 : 5'-CAGGTACCCACCAGGCGGTCTCGGT-3')

(SEQ ID NO : 62)

(R1 : 5'-GGGCCATGACACTGTCAA-3')

(SEQ ID NO : 63)

(R2 : 5'-GACCGCCACCGAGACCGCCTGGTGGGTACCTGTGGTCCTT-3')

(SEQ ID NO : 64)

상기 융합 연결의 PvuII-SmaI 부분을 전체 길이 키메라 수용체의 구성을 위해 사용하였다.

(f) 세포 형질전환

DP12.CHO 세포 (1989년 3월 15일에 공개된 유럽 특허 제307,247호 참조)를 플라스미드 골격에 있는 유일한 NotI 부위에서 선형화된 pSV.ID.M.tmRd6로 전기 천공하였다. 페놀/클로로포름으로 추출한 후, DNA를 에탄올 침전시키고, 20 ㎕의 0.1 트리스 EDTA에 재현탁시켰다. 그리고 나서, 400 볼트 및 330 μf에서 전기 천공하기 전에 10 ㎍의 DNA를 얼음 상의 1 ㎖ PBS 중의 10⁷CHO DP12 세포로 10 분 동안 배양하였다. 비선택성 배지에 넣기 전에 세포를 10 분 동안 얼음으로 회수하였다. 24 시간 후, 세포에 안정한 DHFR+ 클론을 선별하기 위해 뉴클레오티드가 없는 배지를 공급하였다.

(g) KIRA ELISA에 사용하기 위한 형질전환된 세포의 선별

MPL/Rse.gD를 발현하는 클론을 gD 에피토프 태그를 검출하는 항체 5B6을 사용하여 SDS-PAGE에 의한 전체 세포 용해물 후분획화의 웨스턴-블롯팅에 의해 확인하였다.

(h) 배지

세포를 R12/DMEM 50 : 50 (Gibco/BRL, Life Technologies, 뉴욕주의 그랜드 아일랜 소재)에서 배양하였다. 배지를 10 % 여과해낸 FBS (유타주 로간 소재의 HyClone 사), 25 mM HEPES 및 2 mM L-글루타민으로 보충하였다.

(i) KIRA ELISA

mpl-Rse.gD 형질전환된 DP12.CHO 세포를 평평한 바닥의 96-웰 배양 플레이트의 웰의 100 ㎕의 배지 중에 파종 (3×10⁴/ 웰)하고, 37 ℃의 5 % CO₂에서 하룻밤 동안 배양하였다. 다음날 아침 웰의 상등액을 따라내고, 플레이트를 종이 타월 상에서 가볍게 눌렀다. 그리고 나서, 실험 시료, 또는 200, 50, 12.5, 3.12, 0.78, 0.19, 0.048 또는 0 ng/㎖의mpl리간드를 포함하는 50 ㎕ 배지를 각 웰에 가하였다. 세포를 37 ℃에서 30 분 동안 자극하고, 웰 상등액을 따라내고, 플레이트를 종이 타월에서 다시 한번 가볍게 눌렀다. 세포를 용해하고, 키메라 수용체를 가용화시키기 위해, 100 ㎕의 용해 완충제를 각 웰에 가하였다. 용해 완충제는 50 mM HEPES를 포함하는 150 mM NaCl (Gibco 사), 0.5 % Triton-X 100 (Gibco 사), 0.01 % 티메로살, 30 KIU/㎖ 아프로티닌 (오하이오주 아우로라 소재의 ICN Biochemicals 사), 1 mM 4-(2-아미노에틸)-벤젠술포닐 플루오라이드 HCl (AEBSF : ICN Biochemicals 사), 50 μM 루펩틴 (ICN Biochemicals 사) 및 2 mM 오르토바나드산나트륨 (NaVO : 미주리주 세인트 루이스 소재의 Sigma Chemical Co 사 : pH 7.5)으로 이루어졌다. 그리고 나서, 플레이트를 실온에서 플레이트 진탕기 (뉴저지주 바인랜드 소재의 Bellco Instruments 사) 상에서 60 분 동안 완화하게 교반하였다.

세포를 가용화시키면서, 5B6 단일클론 항-gD 항체 (50 mM의 탄산염 완충제 중의 5.0 ㎍/㎖, pH 9.6, 100 ㎕/웰)로 4 ℃에서 하룻밤 동안 코팅된 ELISA 미세적정기 플레이트 (Nunc Maxisorp, Inter Med, Denmark)를 따라내고, 종이 타월 상에서 누르고, 완화하게 교반하면서 실온에서 60 분 동안 150 ㎕/웰의 Block Buffer [0.5 % BSA (뉴저지주 퍼체이스 소재의 Intergen Company 사) 및 0.01 % 티메로살을 포함하는 PBS]로 블록킹하였다. 60 분 후, 자동화된 플레이트 세척기 (버지니아주 스터링 소재의 Skatron Instruments, Inc 사의 ScanWasher 300)를 사용하여 항-gD 5B6로 코팅된 플레이트를 세척 완충제 (0.05 % 트윈-20 및 0.01 % 티메로살을 포함하는 PBS)로 6회 세척하였다.

세포-배양 미세적정 웰로부터 얻은 가용화된 MPL/Rse.gD를 포함하는 용해물을 항-gD 5B6로 코팅하고, 블록킹된 ELISA 웰에 옮기고, 완화하게 교반하면서 실온에서 2 시간 동안 배양하였다. 결합하지 않은mpl-Rse.gD를 세척 완충제로 세척하여 제거하고, 희석 완충제 (0.5 % BSA, 0.05 % 트윈-20, 5 mM EDTA, 및 0.01 % 티메로살을 포함하는 PBS)로 1:18000 희석한 100 ㎕의 비오티닐화된 4G10 (항-포스포티로신) (즉, 56 ng/㎖)를 각 웰에 가하였다. 2 시간 동안 실온에서 배양한 후, 플레이트를 세척하고, 희석 완충제로 1:60000 희석한 100 ㎕의 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO)-공액된 스트렙타비딘 (캘리포니아주 샌프란시스코 소재의 Zymed Laboratories, S.)을 각 웰에 가하였다. 플레이트를 완화하게 교반하면서 실온에서 30 분 동안 배양하였다. 유리 아비딘-공액물을 세척하여 제거하고, 100 ㎕의 새로 제조한 기질 용액 (테트라메틸 벤지딘 [TMB] ; 2-성분 기질 킷트; 머릴랜드주 가이더스버그 소재의 Kirkegaard and Perry)을 각 웰에 가하였다. 반응을 10 동안 진행시킨 후, 색 발생을 100 ㎕/웰의 1.0 M H₃PO₄를 가하여 중단시켰다. Macintosh Centris 650 (캘리포니아주 쿠페르티노 소재의 Apple Computers 사) 및 DeltaSoft 소프트웨어 (뉴저지주의 프린스턴 소재의 BioMetallics, Inc)로 조절되는 vmax 플레이트 판독기 (캘리포니아주 팔로 알토 소재의 Molecular Devices)를 사용하여 450 ㎚에서의 흡광도를 650 ㎚의 비교 파장 (ABS_450/650)으로 판독하였다.

dp12.trkA,B 또는 C.gD 세포를 200, 50, 12.5, 3.12, 0.78, 0.19, 0.048 또는 0 ng/㎖mpl리간드로 자극하여 표준 곡선을 작성하고, DeltaSoft 프로그램을 사용하여 ng/㎖ TPO 대 평균 ABS_450/650± sd로서 나타내었다. 표준 곡선 상에 시료의 흡광도를 보간하여 시료 농도를 수득하고, 그것을 ng/㎖ TPO 활성으로 나타내었다.

mpl리간드가 농도 의존적 및 리간드 특이적 방법으로mpl-Rse.gD 키메라 수용체를 활성화할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 또한, 분석법을 환자 및 pK 시료를 쉽게 검색하는데 사용하도록mpl-Rse.gD KIRA ELISA는 100 % 사람 혈청 (도시됨) 또는 100 % 혈장 (도시되지 않음)까지 내성이 있는 것으로 밝혀졌다.

293-제조된 TPO ₃₃₂ 표준 곡선

TPO EC50 요약

TPO 형태 (세포)	EC 50(중량/용량)	EC50(몰농도)
사람 TPO 332 (293)	2.56 ng/㎖	67.4 pM
쥐 TPO 332 (293)	3.69 ng/㎖	97.1 pM
사람 TPO 153 (293)	~41ng/㎖	~1.08 nM
사람 TPO 155 (이.콜리)	0.44 ng/㎖	11.6 pM
사람 TPO 153met (이. 콜리)	0.829 ng/㎖	21.8 pM

실시예 18

트롬보포이에틴 (TPO)에 대한 수용체를 기초로 한 ELISA

ELISA 플레이트를 4 ℃에서 하룻밤 동안 pH 9.6의 탄산염 완충제 중에서 토끼 F(ab')₂항-사람 IgG로 코팅하였다. 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 PBS 중의 0.5 % 소 혈청 알부민으로 블록킹하였다. 키메라 수용체 (mpl-IgG)를 포함하는 발효조 수확물을 플레이트에 가하고, 2 시간 동안 배양하였다. 표준 시료 (정량적아미노산 분석에 의해 측정된 농도를 갖는 293 세포에서 생산된 TPO₃₃₂)의 2배 연속 희석 (0.39-25 ng/㎖) 및 0.5 % 소 혈청 알부민, 0.05 % 트윈 20 중의 연속 희석된 시료를 플레이트에 가하고 2 시간 동안 배양하였다. 결합된 TPO를 이. 콜리 (E. Coli)에서 생산된 (1 시간 배양) TPO₁₅₅에 대한 단백질 A로 정제되고 비오티닐화된 토기 항체, 이어서 스트렙타비딘-퍼옥시다제 (30 분 배양) 및 기질로서 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘을 사용하여 검출하였다. 흡광도를 450 ㎚에서 측정하였다. 플레이트를 단계마다 세척하였다. 자료 분석을 위해, 표준 곡선을 Kaleidagraph에 의한 4-변수 곡선 적합 프로그램을 사용하여 적합화하였다. 시료의 농도를 표준 곡선으로부터 환산하였다.

실시예 19

293 세포로부터의 TPO 발현 및 정제

1. 293 세포 발현 벡터의 제조

TPO 전체 오픈 리딩 프레임에 대응하는 cDNA를 프라이머로서 하기 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR에 의해 얻었다.

293 PCR 프라이머

Cla.FL.F :5' ATC GAT ATC GAT CAG CCA GAC ACC CCG GCC AG 3'	(서열 동정 번호 : 65)
hmpll-R :5' GCT AGC TCT AGA CAG GGA AGG GAG CTG TAC ATG AGA 3'	(서열 동정 번호 : 48)

pfu DNA 폴리메라제 (Stratagene 사) 존재 하에서 PRK5-hmplI (실시예 6에서 기재함)을 반응의 주형으로 사용하였다. 먼저 94 ℃에서 7 분 동안, 이어서 25회 증폭 (94 ℃에서 1 분, 55 ℃에서 1 분 및 72 ℃에서 1 분)으로 변성화시켰다. 마지막 변성화를 72 ℃에서 15 분 더 연장하였다. PCR 생성물을 정제하고, 플라스미드 pRK5tkneo (티미딘 키나제 촉진 조절 하에서 네오마이신 저항 유전자를 발현하도록 변형된 pRK5에서 유래된 벡터)의 ClaI 및 XbaI 제한 부위 사이에서 클로닝하여 벡터 pRK5tkneo.ORF를 얻었다. EPO 균질 도메인에 대응하는 제2 구성물을 동일한 방법으로, 그러나 forward 프라이머로서 Cla.FL.F 및 하기 역 프라이머를 사용하여 생산하였다:

Arg.STOP.Xba :

5' TCT AGA TCT AGA TCA CCT GAC GCA GAG GGT GGA CC 3'

(SEQ ID NO : 66)

최종 구성물을 pRK5-tkneoEPO-D로 명명하였다. 2개의 구성물의 서열은 실시예 7에 기재한 바와 같이 확인되었다.

2. 사람의 배성 신장 세포의 형질감염

상기 2개의 구성물을 실시예 9에서 기재하고 있는 것과 같이 CaPO₄방법에 의해 사람의 배성 신장 세포로 형질감염시켰다. 형질감염 24 시간 후, 네오마이신 저항 클론의 선별을 0.4 ㎎/㎖의 G418.10 존재 하에서 시작하였다. 10 내지 15 일 후, 개별적 콜로니를 96-웰 플레이트에 옮기고, 배양기 바닥이 세포로 덮힐 때까지 배양하였다. Ba/F3-mpl증식 분석법 (실시예 1에 기재함)을 사용하여 이들 클론으로부터 조절된 배지에서 ML₁₅₃또는 ML₃₃₂의 발현을 측정하였다.

3. rhML₃₃₂의 정제

293-rhML₃₃₂조절된 배지를 10 mM 인산나트륨 (pH 7.4 : 완충제 A)으로 평형화한 Blue-Sepharose (Pharmacia 사) 컬럼에 가하였다. 이어서, 컬럼을 10 배 컬럼 용량의 완충제 A 및 2 M 요소를 포함하는 완충제 A로 각각 세척하였다. 그리고 나서, 컬럼을 2 M 요소 및 1 M NaCl을 포함하는 완충제 A로 용리시켰다. 이어서, Blue-Sepharose 용리 풀을 완충제 A로 평형화한 WGA-Sepharose 컬럼에 직접 가하였다. 그리고 나서, WGA-Sepharose 컬럼을 10 배 컬럼 용량의 2 M 요소 및 1 M NaCl을 포함하는 완충제 A로 세척하고, 0.5 M N-아세틸-D-글루코사민을 포함하는 동일한 완충제로 용리하였다. WGA-Sepharose 용리물을 0.1 % TFA로 평형화한 C4-HPLC 컬럼 (Synchrom, Inc.사)에 가하였다. C4-HPLC 컬럼을 불연속적인 프로판올 구배 (0-25 %, 25-35 %, 35-70 %)를 사용하여 용리하였다. rhML₃₃₂는 구배의 28-30 % 프로판올 영역에서 용리된다는 것이 밝혀졌다. SDS-PAGE에 의해 정제된 rhML₃₃₂는 겔의 68-80 kDa 영역에서 넓은 밴드로서 이동하였다 (도15 참조).

4. rhML₁₅₃의 정제

293-rhML₁₅₃조절된 배지를 rhML₃₃₂에 대해 기재한 것과 같이 Blue-Sepharose 상에서 분석하였다. Blue-Sepharose 용리물을 상기한 바와 같이 -친화성 컬럼에 직접 가하였다.mpl-친화성 컬럼으로부터 용리된 rhML₁₅₃을 rhML₃₃₂에 대해 기재한 것과 동일한 조건 하에서 C4-HPLC 컬럼 실행을 사용하여 균질하게 정제하였다. SDS-PAGE에 의해 정제된 rhML₁₅₃은 분자량 ~18,000-21,000을 갖는 2개의 주밴드 및 2개의 부밴드로 분석되었다 (도15 참조).

실시예 20

CHO로부터의 TPO 발현 및 정제

1. CHO 발현 벡터의 정의

하기의 전기 천공 프로토콜을 사용한 발현 벡터는 다음과 같았다:

pSV15.ID.LL.MLORF (전체 길이 또는 hTPO₃₃₂), 및

pSV15.ID.LL.MLEPO-D (끝이 잘린 길이 또는 hTPO₁₅₃)

이들 플라스미드의 적절한 특징을 도23 및 도24에 나타내고 있다.

2. CHO 발현 벡터의 제조

hTPO 전체 오픈 리딩 프레임에 대응하는 cDNA를 표 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한 PCR에 의해 얻었다.

CHO 발현 벡터의 PCR 프라이머

Cla.FL.F2 :5' ATC GAT ATC GAT AGC CAG ACA CCC CGG CCA G 3'	(서열 동정 번호 : 47)
ORF.Sal :5' AGT CGA CGT CGA CGT CGG CAG TGT CTG AGA ACC 3'	(서열 동정 번호 : 67)

pfu DNA 폴리메라제 (Stratagene 사)의 존재 하에서 PRK5-hmplI (실시예 7및 9에서 기재함)을 반응에 대한 주형으로 사용하였다. 먼저 94 ℃에서 7 분 동안, 이어서 25회 증폭 (94 ℃에서 1 분, 55 ℃에서 1 분 및 72 ℃에서 1 분)으로 변성화시켰다. 마지막 변성은 72 ℃에서 15 분 더 연장하였다. PCR 생성물을 정제하고, 플라스미드 pSV15.ID.LL의 제한 부위 ClaI 및 Sal1 사이에서 클로닝하여 벡터 pSV15.ID.LL.MLORF를 얻었다. EPO 균질 도메인에 대응하는 제2 구성물을 동일한 방법으로, 그러나 forward 프라이머로서 Cla.FL.F2 및 하기 역 프라이머를 사용하여 생산하였다:

EPOD.Sal :

5' AGT CGA CGT CGA CTC ACC TGA CGC AGA GGG TGG ACC 3'

(SEQ ID NO : 68)

최종 구성물을 pSV15.ID.LL.MLEPO-D로 명명하였다. 2개의 구성물의 서열을 실시예 7 및 9에 기재한 바와 같이 확인하였다.

본질적으로, 전체 길이 및 끝을 절단한 길이의 리간드에 대한 코딩 서열을 CHO 발현 벡터 pSV15.ID.LL의 다클론 부위에 도입하였다. 이 벡터는 SV40의 초기 프로모터/인헨서 (enhancer) 영역, 생쥐의 DHFR cDNA를 포함하는 변형된 스플라이스 단위, 해당되는 SV40 폴리아데닐화 시그날 및 복제 원점의 유전자 (이 경우, 기재된 TPO 서열) 도입에 대한 다클로닝 부위 및 세균에서 플라스미드 선별 및 증폭에 대한 베타-락타마제 유전자를 포함한다.

3. 재조합 사람 TPO₃₃₂및 TPO₁₅₃을 발현하는 안정한 CHO 세포주를 형성하는 방법

a. CHO 모세포주의 설명

본 명세서에 기재된 TPO 분자를 발현하는데 사용되는 숙주 CHO (Chinese Hamster Ovary) 세포주는 CHO-DP12로서 공지되어 있다 (1989년 3월 15일 공개된 유럽 특허 제307,247호 참조). 상기 포유동물 세포주를 프리프로인슐린을 발현하는 벡터를 사용한 모세포주 (Dr. L. Chasin의 승인을 얻어 Stanford University의 Dr. Frand Lee로부터 얻은 CHO-K1 DUX-B11(DHFR-)-)의 형질감염으로부터 클론적으로 선별하여 인슐린 요구가 감소된 클론을 얻었다. 또한, 이들 세포는 DHFR-이고, 뉴클레오사이드 (글리신, 하이포크산틴, 및 티미딘)를 전혀 보충하지 않은 배지 상에서 배양함으로써 DHFR cDNA 벡터 서열의 존재에 대해 클론을 선별할 수 있다. 안정하게 발현하는 CHO 세포주에 대한 이러한 선별 시스템은 통상적으로 이용된다.

b. 형질감염 방법 (전기 천공)

TPO₃₃₂및 TPO₁₅₃을 발현하는 세포주는 DP12 세포를 전기 천공을 거쳐서 선형화된 pSV15.ID.LL.MLORF 또는 pSV15.ID.LL.MLEPO-D 플라스미드를 각각 사용한 형질감염에 의해 생산되었다. 3개의 제한 효소 반응 혼합물을 각 플라스미드 절단을 위해 준비하였다 : 표준 분자 생물학 방법에 의한 효소 NOTI와 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍의 벡터. 이 제한 부위는 선형화 영역 3'내에 있고, TPO 리간드 전사 단위 이외의 벡터내에서 한곳만 발견되었다 (도23 참조). 100 ㎕의 반응물을 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 다음날, 혼합물을 페놀-클로로포름-이소아밀 알콜 (50:49:1)로 1회 추출하고, 드라이아이스 상에서 약 1 시간 동안 에탄올 침전시켰다. 그리고 나서, 침전물을 15 분 동안의 미세원심분리에 의해 수집하고, 건조시켰다. 선형화된 DNA를 표준 항생제 및 2mM의 글루타민을 보충한 50 ㎕의 Ham's DMEM-F12 1:1 배지에 재현탁시켰다.

DP12 세포를 배양하는 현탁액을 수집하고, DNA 재현탁용으로 기재한 배지 중에서 1회 세척한 후, 마지막으로 750 ㎕ 당 10⁷세포의 농도로 동일한 배지에 재현탁시켰다. 세포 분취액 (750 ㎕) 및 각 선형화된 DNA 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 함께 배양한 후, BRL 전기 천공 챔버에 옮겼다. 그리고 나서, 각 반응 혼합물을 330 μF 및 낮은 용량으로 셋팅한 350 볼트의 표준 BRL 전기 천공 장치에서 전기 천공하였다. 전기 천공한 후, 세포를 장치에 5 분 동안 방치하고, 얼음 상에서 추가로 10 분 더 배양하였다. 전기 천공된 세포를 CHO 세포용 표준 완전 배양 배지 (1×GHT, 2 mM 글루타민 및 5 % 태아 송아지 혈청을 보충하고 글리신이 없는 글루코스가 많은 DMEM-F12 50 : 50)를 5 ㎖ 함유하는 60 ㎜ 세포 배양 접시에 옮기고, 5 % CO₂세포 배양 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양하였다.

c. 선별 및 검색 방법

다음날, 표준 방법에 의해 플레이트로부터 세포를 트립신에 의해 제거하고, DHFR 선별 배지 (사용한 표준 DHFR 선별 배지는 2 % 또는 5 %의 투석된 태아 송아지 혈청을 보충하고, 글리신, 하이포크산틴 및 티미딘은 전혀없는 상기 Ham's DMEM-F12, 1 : 1 배지임)를 포함하는 150 ㎜ 조직 배양 접시에 옮겼다. 이어서, 각 60 ㎜ 접시로부터 세포를 5/150 ㎜ 접시로 재플레이팅하였다. 그리고 나서, 세포를 클론이 나타나서 96-웰 접시로 옮기기에 충분한 크기에 다다를 때까지 37 ℃/5 % CO₂에서 10 내지 15일 동안 (배지는 1회 갈아줌) 배양하였다. 4-5일에 걸쳐서 세포주를 50 ㎖의 피페트만 셋트 상에서 멸균 황색 팁을 사용하여 옮겼다. 세포를 배양기 바닥이 세포로 덮힐 때까지 배양 (통상 3-5 일)한 후, 트레이를 트립신화하고, 원 트레이의 2개의 복사본을 재생산하였다. 이들 복사본 중 2개를 DMSO 중의 50 ㎕의 10 % FCS로 희석한 각 웰에 세포와 함께 동결기 내에 단기간 저장하였다. 혈청이 없는 조절된 배지에서 5 일 후, 시료를 TPO 발현을 위한 제3 트레이 중의 배양기 바닥이 세포로 덮힌 웰로부터 Ba/F 세포를 기초로 한 활성 분석에 의해 정량하였다. 이 분석법을 기초로 하여 가장 발현이 높은 클론을 저장으로부터 소생시켜서 현탁액의 적합화, 재분석 및 뱅킹용 세포 배양군으로 옮기기 위해 150 ㎜ T-플라스크에 2 배로 배양기 바닥이 세포로 덮히도록 만들었다.

d. 증폭 프로토콜

이어서, 상기 선별로부터 얻은 몇개의 가장 정량이 높은 세포주를 표준 메토트렉세이트 증폭 계획을 통해 보다 높은 정량의 클론을 생산하였다. CHO 세포 클론을 팽창시켜 2 또는 3가지 세포수 (105, 5×105 및 106 세포/접시)로 4가지 농도의 메토트렉세이트 (즉, 50 nM, 100 nM, 200 nM 및 400nM)에서 10 ㎝ 접시에 플레이팅하였다. 그리고 나서, 클론이 형성되어 다른 분석을 위해 96-웰 접시로 옮기기에 충분할 정도까지 이들 배양물을 37 ℃/5 % CO에서 배양하였다. 이러한 선별로부터 얻은 몇개의 높은 정량의 클론을 다시 보다 높은 농도의 메토트렉세이트 (즉, 600 nM, 800 nM, 1000 nM 및 1200 nM)에 가하고, 전과 같이 내성 클론을 형성시킨 후, 96-웰 접시로 옮기고 분석하였다.

4. 배양이 안정한 CHO 세포주를 발현하는 재조합 사람 TPO₃₃₂및 TPO₁₅₃

뱅킹된 세포를 풀고, 세포 집단을 혈청이 없는 또는 혈청을 포함한 배지 중에서 표준 세포 배양 방법에 의해 팽창시켰다. 충분한 세포 밀도로 팽창시킨 후, 세포를 세척하여 소비된 세포 배양 배지를 제거하였다. 그리고 나서, 세포를 배치, 페드-배치 또는 연속 배양을 포함하는 임의의 표준 방법에 의해 5 % 이상의 용해된 O₂함량, 25-40 ℃, 중성 pH에서 본질적으로 분비된 TPO가 축적될 때까지 배양하였다. 그리고 나서, 세포 배양액을 원심분리와 같은 기계적 방법으로 세포로부터 분리하였다.

5. CHO 배양액으로부터 재조합 사람 TPO의 정제

수집된 세포 배양액 (HCCF)을 직접 약 100ℓ의 HCCF/ℓ수지의 비율 및 약 300 ㎖/시/㎠의 선형 유속으로 0.01 M 인산나트륨 (pH 7.4), 0.15 M NaCl로 평형화한 Blue Sepharose 6 Fast Flow 컬럼 (Pharmacia 사)에 가하였다. 그리고 나서, 컬럼을 3 내지 5배의 컬럼 용량의 평형화 완충제로 세척한 후, 3 내지 5배의 컬럼 용량의 0.01 M 인산나트륨 (pH 7.4), 2.0 M 요소로 세척하였다. 그리고 나서, TPO를 3 내지 5배의 컬럼 용량의 0.01 M 인산나트륨 (pH 7.4), 2.0 M 요소, 1.0 M NaCl로 용리하였다.

TPO를 포함하는 Blue Sepharose Pool을 8 내지 16 ㎖의 Blue SepharosePool/ ㎖ 수지의 비율 및 약 50 ㎖/시/㎠의 유속으로 0.01 M 인산나트륨 (pH 7.4), 2.0 M 요소 및 1.0 M NaCl로 평형화한 Wheat Germ Lectin Sepharose 6MB 컬럼 (Pharmacia 사)에 가하였다. 그리고 나서, 컬럼을 2 내지 3배의 컬럼 용량의 평형화 완충제로 세척하였다. TPO를 2 내지 5배의 컬럼 용량의 0.01 M 인산나트륨 (pH 7.4), 2.0 M 요소 및 0.5 M N-아세틸-D-글루코사민으로 용리하였다.

그리고 나서, Wheat Germ Lectin Pool을 0.04 %의 C₁₂E₈및 0.1 %의 트리플루오로아세트산 (TFA)의 최종 농도로 조정하였다. 생성된 풀을 약 0.2 내지 0.5 ㎎의 단백질/ ㎖ 수지의 적하 및 157 ㎖/시/㎠의 유속으로 0.1 % TFA, 0.04 % C₁₂E₈로 평형화한 C₄역상 컬럼 (Vydac 214TP1022)에 가하였다.

단백질을 0.1 % TFA, 0.04 % C₁₂E₈를 포함하는 아세토니트릴의 2상 선형 구배로 용리하였다. 제1상은 15 분 내에 0 내지 30 %의 아세토니트릴의 선형 구배로 구성되었다. 제2상은 60 분 내에 30 내지 60 %의 아세토니트릴의 선형 구배로 구성되었다. TPO를 약 50 % 아세토니트틸로 용리하였다. 풀을 SDS-PAGE를 근거로 하여 제조하였다.

그리고 나서, C₄Pool을 2배 용량의 0.01 M 인산나트륨 (pH 7.4), 0.15 M NaCl을 사용하여 희석하고, 10,000 내지 30,000 달톤 분자량을 갖는 Amicon YM 등의 초여과막 상에서 약 6배 용량의 0.01 M 인산나트륨 (pH 7.4), 0.15 M NaCl에 대해 여과해 내었다. 생성된 여액을 직접 처리하거나 또는 초여과에 의해 더 농축시켰다. 여액/농축액을 0.01 % 트윈-80의 최종 농도로 조정하였다.

계산된 컬럼 용량의 2 내지 5 %에 대응하는 여액/농축액의 전부 또는 일부를 0.01 M 인산나트륨 (pH 7.4), 0.15 M NaCl, 0.01 % 트윈-80으로 평형화한 Sephacryl D-300 HR 컬럼 (Pharmacia 사)에 가하고, 약 17 ㎖/시/㎠의 유속으로 크로마토그래피하였다. 응집물 및 단백질 분해 생성물이 없는 분획을 포함하는 TPO를 SDS-PAGE를 근거로 한 풀로 제조하였다. 생성된 풀을 0.22 μ 필터, Millex-GV 등에서 여과하고, 2-8 ℃에서 저장하였다.

실시예 21

이. 콜리에서 TPO 단백질 합성의 형질전환 및 유도

1. 이. 콜리 TPO 발현 벡터의 구성

플라스미드 pMP21, pMP151, pMP41, pMP57 및 pMP202를 모두 상이한 구성물 중의 다른 작은 리더의 TPO 다운스트림의 처음 155개의 아미노산을 발현하도록 디자인하였다. 리더는 주로 고도의 번역 개시 및 신속한 정제를 제공한다. 플라스미드 pMP210-1, T8, -21, -22, -24, -25는 개시 메티오닌의 TPO 다운스트림의 처음 153개의 아미노산을 발현하고, TPO의 처음 6개 아미노산의 코돈 사용에서만 다르도록 디자인한 반면에, 플라스미드 pMP251은 TPO의 카르복시 말단이 2개의 아미노산에 의해 연장되는 pMP210-1의 유도체였다. 상기 플라스미드는 모두 트립토판 프로모터로 유도하자마자 이. 콜리에서 높은 정도로 TPO를 세포내 발현하였다 (얀수라 (Yansura, D.G.) 등의 문헌 [Methods in Enzymology (Goeddel, D.V., Ed) 185 : 54-60, Academic Press, San Diego (1990)] 참조). 플라스미드 pMP1 및 pMP172는상기 TPO 세포내 발현 플라스미드 구성의 중간체이다.

(a) 플라스미드 pMP1

플라스미드 pMP1은 TPO의 처음 155개의 아미노산에 대한 분비 벡터이고, 도33에 도시되어 있는 5개의 DNA 단편을 함께 결찰하여 구성되었다. 이들 중 제1 단편은 작은 Mul-BamHI 단편이 제거된 벡터 pPho21이었다. pPho21은 사람의 성장 호르몬 유전자를 이. 콜리의 phoA 유전자로 대치하고, Mul 제한 부위를 아미노산 20-21에서 STII 시그날 서열에 대한 코딩 서열로 공작한 phGH1 (Chang, C.N. 등의 문헌 [Gene 55 : 189-196 (1987)] 참조)의 유도체이다.

그 다음 2개의 단편인 TPO 아미노산 19-103을 코딩하는 pRK5-hmpl(실시예 9)로부터 얻은 DNA의 258 염기쌍의 HinfI-PstI 조각, 및 아미노산 1-18을 코딩하는 하기의 합성 DNA를 T4-DNA 리가제로 예비 결찰한 후, PstI으로 절단하였다.

5' CGCGTATGCCAGCCCGGCTCCTCCTGCTTGTGACCTCCGAGTCCTCAGTAAACTTCGTG

ATACGGTCGGGCCGAGGAGGACGAACACTGGAGGCTCAGGAGTCATTTGACGAAGCACTGA-5'

(SEQ ID NO :69)

(SEQ ID NO :70)

제4 단편은 TPO의 아미노산 104-155를 코딩하는 pRKhmplI으로부터 얻은 152 염기상의 PstI-HaeIII 단편이었다. 마지막 단편은 상기와 같이 전사 종결 인자에 람다를 포함하는 pdh108로부터 얻은 412 염기쌍의 Stul-BamHI 단편이었다 (Scholtissek, S. 등의 문헌 [NAR 15 : 3185 (1987)] 참조).

(b) 플라스미드 pMP21

플라스미드 pMP21은 STll 시그날 서열의 13개의 아미노산 리더 구성 부분과 함께 TPO의 처음 155개의 아미노산을 발현하도록 디자인되었다. 그것은 도34에 도시하고 있는 것과 같이 3개의 DNA 단편을 함께 결찰하여 구성되었는데, 제1 단편은 작은 XbaI-SphI 단편이 제거된 벡터 pVEG31이었다. 벡터 pVEG31은 사람 성장 호르몬의 유전자를 혈관 내피 성장 인자의 유전자로 대치한 pHGH207-1 (de Boer, H.A. 등의 문헌 [in Promoter Structure and Function (Rodriguez, R.L. 및 Chamberlain, M.J. Ed.) 462, Praeger, New York (1982)] 참조)의 유도체이다 (이것과 동일한 벡터 단편을 후자의 플라스미드로부터 얻을 수 있다).

결찰에 있어서 제2 단편은 하기 서열의 합성 DNA 이중쇄였다:

5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTAA

TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGAAGAATTGCGC-5'

(SEQ ID NO : 71)

(SEQ ID NO : 72)

마지막 단편은 TPO의 155 아미노산을 코딩하는 pMP1으로부터 얻은 1072 염기쌍의 MluI-SphI 단편이었다.

(c) 플라스미드 pMP151

플라스미드 pMP151을 STII 시그날 서열의 7 아미노산, 8개의 히스티딘, 및 인자 Xa 절단 부위로 구성된 리더의 TPO 다운스트림의 처음 155개의 아미노산을 발현하도록 디자인하였다. 도35에 도시한 바와 같이, pMP151은 3개의 DNA 단편을 함께 결찰하여 구성되었고, 제1 단편은 작은 XbaI-SphI 단편이 제거된 상기 벡터pVEG31이었다. 제2 단편은 하기 서열의 합성 DNA 이중쇄였다:

5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCATCACCATCACCATCACCATC

ACATCGAAGGTCGTAGCC

TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTAG

TGTAGCTTCCAGCAT-5'

(SEQ ID NO : 73)

(SEQ ID NO : 74)

마지막 단편은 TPO의 154 아미노산을 코딩하는 pMP11로부터 얻은 1064 염기쌍의 BgII-SphI 단편이었다. 플라스미드 pMP11은 STII 시그날 서열의 몇개의 코돈을 제외하고는 pMP1과 동일하였다 (이 단편은 pMP1으로부터 얻을 수 있다).

(d) 플라스미드 pMP202

플라스미드 pMP202는 리더의 인자 Xa 절단 부위가 트롬빈 절단 부위로 대치된 것을 제외하고는 발현 벡터 pMP151과 매우 유사하였다. 도36에서 도시하고 있는 것과 같이, pMP202는 3개의 DNA 단편을 함께 결찰하여 구성되었다. 제1 단편은 작은 XbaI-SphI 단편이 제거된 상기 pVEG31이었다. 제2 단편은 하기 서열의 합성 DNA 이중쇄였다.

5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCATCACCATCACCATCACCATCACATCGAACCACGTAGCC

TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTAGTGTAGCTTGGTGCAT-5'

(SEQ ID NO : 75)

(SEQ ID NO : 76)

마지막 단편은 상기 플라스미드 pMP11로부터 얻은 1064 염기쌍의 BgII-SphI이었다.

(e) 플라스미드 pMP172

플라스미드 pMP172는 TPO의 처음 153 아미노산에 대한 분비 벡터이고, pMP210 구성의 중간체이다. 도37에서 도시되고 있는 것과 같이, pMP172는 3개의 DNA 단편을 함께 결찰하여 제조되고, 제1 단편은 작은 EcoRI-HindIII 부분이 제거된 벡터 pLS32lamB였다. 제2 단편은 상기 플라스미드 pMP11로부터 얻은 946 염기쌍의 EcoRI-HgaI 단편이었다. 마지막 단편은 하기 서열의 합성 DNA 이중쇄였다:

5'-TCCACCCTCTGCGTCAGGT (SEQ ID NO : 77)

GGACGCAGTCCATCGA-5' (SEQ ID NO : 78)

(f) 플라스미드 pMP210

플라스미드 pMP210은 변역 개시 메티오닌이후의 TPO의 처음 153 아미노산을 발현하도록 디자인되었다. 이 플라스미드는 사실상 TPO의 처음 6개의 코돈을 각 코돈의 제3 위치에 무작위화한 플라스미드의 뱅크로서 제조되었고, 도38에 도시하고 있는 것과 같이 3개의 DNA 단편을 결찰하여 구성되었다. 제1 단편은 작은 XbaI-SphI 단편이 제거된 상기 벡터 pVEG31이었다. 제2 단편은 DNA 폴리메라제 (Klenow)로 먼저 처리된 후, XbaI 및 HinfI으로 소화된 하기의 합성 DNA 이중쇄로 개시 메티오닌 및 TPO의 무작위화된 처음 6개의 코돈을 코딩한다:

5'-GCAGCAGTTCTAGAATTATGTCNCCNGCNCCNCCNGCNTGTGACCTCCGA

GTTCTCAGTAAA (SEQ ID NO : 79)

ACACTGGAGGCT

CAAGAGTCATTTGACGAAGCACTGAGGGTACAGGAAG-5' (SEQ ID NO : 80)

제3 단편은 TPO의 아미노산 19-153을 코딩하는 pMP172로부터 얻은 890 염기쌍의 HinfI-SphI 단편이었다.

높은 번역 개시 클론을 선별해 내기 위해 약 3700 클론의 플라스미드 pMP210 뱅크를 고농도의 테트라사이클린 (50 ㎍/㎖) LB 플레이트 위로 재형질전환시켰다 (Yansura, D.G. 등의 문헌 [Methods:A Companion to Methods in Enzymology 4 : 151-158 (1992)] 참조). 고농도의 테트라사이클린 플레이트 상에 나타난 8개의 콜로니 중에서 TPO 발현이 가장 잘된 5개의 콜로니를 DNA 서열화시키고, 그 결과를 도39에 도시하고 있다 (SEQ ID NO : 23, 24, 25, 26, 27 및 28).

(g) 플라스미드 pMP41

플라스미드 pMP41을 STII 시그날 서열의 7개 아미노산으로 이루어진 리더 및 이어서 인자 Xa 절단 부위에 융합된 TPO의 처음 155 아미노산을 발현하도록 디자인하였다. 플라스미드를 도40에서 도시하고 있는 것과 같이 3개의 DNA 조각을 함께 결찰하여 구성하였고, 제1 단편은 작은 XbaI-SphI 단편이 제거된 상기 벡터 pVEG31였다. 제2 단편은 하기의 합성 DNA 이중쇄였다:

5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTATCGAAGGTCGTAGCC

(SEQ ID NO : 81)

TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAATAGCTTCCAGCAT-5'

(SEQ ID NO : 82)

결찰의 마지막 단편은 상기 플라스미드 pMP11로부터 얻은 1064 염기쌍의 BgII-SphI 단편이었다.

(h) 플라스미드 pMP57

플라스미드 pMP57은 STII 시그날 서열의 9개의 아미노산 및 2염기성 부위 Lys-Arg으로 이루어진 리더의 TPO 다운스트림의 처음 155개의 아미노산을 발현한다. 이 2염기성 부위는 리더를 프로테아제 ArgC로 제거하는 수단을 제공한다. 이 플라스미드는 도41에서 도시하고 있는 것과 같이 3개의 DNA 조각을 결찰하여 구성되었다. 제1 단편은 작은 XbaI-SphI 단편이 제거된 상기 pVEG31이었다. 제2 단편은 하기의 합성 DNA 이중쇄였다:

5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTAAACGTAGCC

(SEQ ID NO : 83)

TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGAAGAATTTGCAT-5'

(SEQ ID NO : 84)

결찰의 마지막 단편은 상기 플라스미드 pMP11의 1064 염기쌍의 BgII-SphI이었다.

(i) 플라스미드 pMP251

플라스미드 pMP251은 TPO의 2개의 추가 아미노산을 카르복시 말단 상에 포함하는 pMP210-1의 유도체이다. 제42도에서 도시하고 있는 바와 같이, 이 플라스미드는 2개의 DNA 조각을 함께 결찰하여 구성되었는데, 제1 단편은 작은 XbaI-ApaI 단편이 제거된 상기 pMP21이었다. 결찰의 제2 단편은 pMP210-1로부터 얻은 316 염기쌍의 XbaI-ApaI 단편이었다.

2. TPO 발현 벡터를 사용한 이. 콜리의 형질전환 및 유도

상기 TPO 발현 플라스미드를 사용하여 CaCl₂열쇼크 방법으로 이. 콜리 균주 44C6 (w3110 tonA_ΔrpoH_tslon_ΔclpP_ΔgalE)을 형질전환시켰다. 배양물의 광학 밀도 (600 ㎚)가 약 2-3에 이를 때까지 형질전환된 세포를 먼저 37 ℃의 50 ㎍/㎖ 카르베니실린을 포함하는 LB 배지 중에서 배양하였다. 그리고 나서, LB 배양물을 0.49 w/v% 카스아미노산 및 50 ㎍/㎖의 카르베니실린을 포함하는 M9 배지로 20× 희석하였다. 30 ℃에서 1 시간 동안 통기하면서 배양한 후, 인돌-3-아크릴산을 50 ㎍/㎖의 최종 농도까지 가하였다. 그리고 나서, 배양물을 통기하면서 30 ℃에서 15 시간 더 배양을 계속한 후, 세포를 원심분리에 의해 수집하였다.

실시예 22

이. 콜리에서 생물학적 활성이 있는 TPO (Met ^-1 1-153)의 생산

생물학적 활성이 있고, 리폴딩된 TPO (Met^-11-153)의 생산을 위한 하기 과정을 N 및 C 말단이 연장된 형태를 포함하는 다른 TPO 이형의 회수를 위해 유사하게 가할 수 있다 (실시예 23 참조).

A. 용해되지 않은 TPO (Met^-11-153)의 회수

플라스미드 pMP210-1에 의해 코딩된 TPO (Met^-11-153)을 발현하는 이. 콜리를 상기와 같이 효소처리하였다. 전형적으로, 약 100 g의 세포를 Polytron homogenizer를 사용하여 세포 붕괴 완충제 1ℓ에 재현탁시키고, 세포를 5000×g로30 분 동안 원심분리하였다. 세척된 세포 펠릿을 Polytron homogenizer를 사용하여 다시 1ℓ의 세포 붕괴 완충제에 재현탁시키고, 세포 현탁액을 제조업자의 지시에 따라 LH Cell Disrupter (LH Inceltech, Inc.사) 또는 Microfluidizer (Microfluidics International 사)을 통해 통과시켰다. 현탁액을 5,000g로 30 분 동안 원심분리시키고, 재현탁시킨 후, 2회 원심분리하여 세척된 R체 (refractile body) 펠릿을 제조하였다. 상기 세척된 펠릿을 바로 사용하거나 또는 - 70 ℃에서 동결 저장하였다.

B. 단량체 TPO (Met^-11-153)의 가용화 및 정제

상기에서 얻은 펠릿을 6-8 M 구아니딘 및 25 mM DTT (디티오트레이톨)와 5배 (중량)의 용량의 20 mM 트리스 중에 재현탁시키고, 4 ℃에서 1-3 시간 또는 하룻밤 동안 교반하여 TPO 단백질의 가용화를 수행하였다. 또한, 고농도 (6-8 M)의 요소도 유용하나, 통상적으로 구아니딘에 비해 수율이 낮다. 가용화 후, 용액을 30,000×g로 30 분 동안 원심분리하여 변성화된 단량체 TPO 단백질을 포함하는 투명한 상등액을 얻었다. 그리고 나서, 상등액을 2 ㎖/분의 유속으로 Superdex 200 겔 여과 컬럼 (Pharmacia 사, 2.6×60 ㎝) 상에서 크로마토그래피하고, 20 mM 인산나트륨 (pH 6.0)으로 용리된 단백질을 160 내지 200 ㎖에서 용리하는 변성화된 단량체 TPO 단백질을 포함하는 10 mM DTT와 함께 풀로 제조하였다. TPO 단백질을 반예비용 C4 역상 컬럼 (2×20㎝ VYDAC) 상에서 더 정제하였다. 시료를 5 ㎖/분의 속도로 0.1 % TFA (트리플루오로아세트산) 및 30 % 아세토니트릴로 평형화한 컬럼에 가하였다. 단백질을 아세토니트릴의 선형 구배 (60 분 내에 30-60 %)로 용리하였다. 정제된 환원 단백질을 약 50 % 아세토니트릴로 용리하였다. 이 물질을 리폴딩에 사용하여 생물학적 활성이 있는 TPO 이형을 얻었다.

C. 생물학적 활성이 있는 TPO (Met^-11-153)의 생산

40 ㎖의 0.1 % TFA/50 % 아세토니트릴 중의 약 20 ㎎의 환원되고 변성화된 단량체 TPO를 하기 시약을 적절하게 포함하는 360 ㎖의 리폴딩 완충제로 희석하였다:

50 mM 트리스

0.3 M NaCl

5 mM EDTA

2 % CHAPS 세정제

25 % 글리세롤

5 mM 산화된 글루타티온

1 mM 환원된 글루타티온

pH를 8.3으로 조정

혼합한 후, 리폴딩 완충제를 4 ℃에서 12-48 시간 동안 완화하게 교반하여 TPO의 온당한 디술피드-결합된 형태의 최대 리폴딩 수율을 얻었다 (하기 참조). 그리고 나서, 이 용액을 TFA로 산성화하여 최종 농도를 0.2 %로 하고, 0.45 또는 0.22 미크론 필터를 통해 여과한 후, 1/10 용량의 아세토니트릴을 가하였다. 이용액을 직접 C4 역상 컬럼 위로 펌핑하여, 정제되고 리폴딩된 TPO (Met^-11-153)을 상기와 동일한 구배 프로그램으로 용리하였다. 리폴딩된 생물학적 활성이 있는 TPO를 상기 조건 하에서 약 45 % 아세토니트릴로 용리하였다. TPO의 부적절한 디술피드-결합된 이형이 먼저 용리되었다. 최종적으로 정제된 TPO (Met^-11-153)은 SDS 겔 및 분석용 C4 역상 크로마토그래피에 의해 분석된 결과 95 % 이상의 순도를 가졌다. 동물 연구에 있어서, C4 정제된 물질을 생리학적 상용성이 있는 완충제로 투석하였다. 150 mM NaCl 및 0.01 % 트윈 80을 포함하는 등장성 완충제 (10 mM 아세트산나트륨 (pH 5.5), 10 mM 숙신산나트륨 (pH 5.5) 또는 10 mM 인산나트륨 (pH 7.4))가 이용되었다.

Ba/F3 분석법에 있어서 TPO의 효력이 크기 때문에 (약 3 pg/㎖에서 최대 절반 자극이 성취됨), 많은 다른 완충제, 세정제 및 산화환원 조건을 이용하여 생물학적 활성이 있는 물질을 얻을 수 있다. 그러나, 대부분의 조건 하에서는 단지 소량 (<10 %)의 적절하게 폴딩된 물질만을 얻었다. 상업적 제조 방법에 있어서는 리폴딩 수율이 10 % 이상, 더욱 바람직하게는 30-50 %, 가장 바람직하게는 50 5 이상인 것이 바람직하다. 많은 다른 세정제 (트리톤 X-100, 도데실-베타-말토사이드, CHAPS, CHAPSO, SDS, 사르코실, 트윈 20 및 트윈 80, Zwittergent 3-14 및 기타)를 높은 리폴딩 수율을 지지하는 유효성에 대해 평가하였다. 이러한 세정제 중 CHAPS류 (CHAPS 및 CHAPSO)만이 단백질 응집 및 부적절한 디술피드 형성을 제한하는 리폴딩 반응에 통상적으로 유용하다는 것이 밝혀졌다. 1 % 이상의 CHAPS 농도가 매우 유용하였다. 높은 수율을 얻기 위해서는 0.1 M 내지 0.5 M의 최적 농도를 갖는 NaCl이 필요하였다. EDTA의 존재 (1-5 mM)는 몇몇 제조에서 관찰되는 금속 촉매 산화 (및 응집)의 양을 제한하였다. 15 % 이상의 글리세롤 농도가 최적 리폴딩 조건을 제공하였다. 최대 수율에 있어서는 산화환원 시약의 쌍으로, 산화된 글루타티온 및 환원된 글루타티온 또는 산화된 시스테인 및 환원된 시스테인이 반드시 필요하였다. 통상적으로, 산화된 시약의 몰비가 산화환원 쌍의 환원된 시약과 동일하거나, 또는 환원된 시약보다 과량일 경우 보다 높은 수율이 관찰되었다. 7.5 내지 약 9의 pH값이 이들 TPO 이형의 리폴딩에 적합하였다. 유기 용매 (예를 들어, 에탄올, 아세토니트릴, 메탄올)는 10-15 % 이하에서 내성이 있었다. 보다 높은 농도의 유기 용매는 부적절하게 폴딩된 형태의 양을 증가시켰다. 트리스 및 인산염 완충제가 통상적으로 유용하였다. 또한 4 ℃에서의 배양은 적절하게 폴딩된 TPO를 보다 높은 정도로 생산하게 하였다.

40-60 %의 리폴딩 수율 (리폴딩 반응에 사용된 환원되고 변성화된 TPO의 양을 기준으로 함)이 먼저 C4 단계를 통해 정제된 TPO의 제조에 있어서 전형적이다. TPO 리폴딩 과정 동안 비TPO 단백질의 광범위한 침전 및 방해로 인해 수율이 적다고 할 지라도 보다 덜 순수한 제조물일 경우 (예를 들어, Superdex 200 컬럼 또는 초기 R체 추출 후에 직접) 활성 물질을 얻을 수 있다.

TPO (Met^-11-153)가 4개의 시스테인 잔기를 포함하기 때문에, 상기 단백질의 3개의 다른 디술피드 이형을 생산할 수 있다:

제1형 : 시스테인 잔기 1-4 및 2-3 사이의 디술피드

제2형 : 시스테인 잔기 1-2 및 3-4 사이의 디술피드

제3형 : 시스테인 잔기 1-3 및 2-4 사이의 디술피드

리폴딩 조건을 결정하는 초기 조사 동안, TPO 단백질을 포함하는 몇개의 상이한 피크를 C4 역상 크로마토그래피에 의해 분리하였다. 이들 중 1개의 피크만이 Ba/F3 분석법을 사용하여 결정한 것과 같이 큰 생물학적 활성을 가졌다. 이어서, 리폴딩 조건을 최적화하여 선택적으로 상기 이형을 수득하였다. 이러한 조건 하에서, 잘못 폴딩된 이형은 수득된 전체 단량체 TPO의 10-20 % 이하였다.

질량 분석 및 단백질 서열화에 의해 생물학적 활성이 있는 TPO의 디술피드 패턴은 1-4 및 2-3인 것으로 정해졌다 (즉, 제1형). 다양한 C4 분석 피크의 분취액 (5-10 nmole)을 트립신으로 소화시켰다 (트립신 대 단백질의 몰비 = 1 : 25). 소화 혼합물을 DTT 환원전 및 환원후에 매트릭스의 원조를 받는 레이저 탈착 질량 분석기에 의해 분석하였다. 환원 후, TPO의 보다 큰 트립신성 펩티드의 대부분에 대응하는 덩어리가 검출되었다. 환원되지 않은 시료에서, 이들 덩어리의 일부가 빠지고, 새 덩어리가 관찰되었다. 개개의 트립신성 펩티드의 합에 기본적으로 대응하는 새 피크의 덩어리는 디술피드 쌍과 관련이 있었다. 따라서, 리폴딩되고 생물학적 활성이 있는 재조합 TPO의 디술피드 패턴이 1-4 및 2-3에 명확하게 할당될 수 있다. 이는 관련된 에리트로포이에틴 분자의 공지된 디술피드 패턴과 일치한다.

D. 리폴딩된 재조합 TPO (met 1-153)의 생물학적 활성

리폴딩되고 정제된 TPO (Met^-11-153)는 시험관 내 및 생체 내 분석에서 모두 활성이 있었다. Ba/F3 분석에서, Ba/F3 세포로 혼입된 티미딘의 최대 절반 자극을 3.3 pg/㎖ (0.3 pM)에서 성취하였다.mpl수용체를 기초로 한 ELISA에 있어서, 최대 절반 활성은 1.9 ng/㎖ (120 pM)에서 나타났다. 정상 동물, 및 거의 치명적인 X-조사에 의해 유발된 골수억제 동물에서, TPO (Met^-11-153)는 새 혈소판의 생산을 자극하는데 효력이 매우 컸다 (30 ng/생쥐 정도로 낮은 용량에서 활성을 나타냄).

실시예 23

이. 콜리에서 다른 생물학적 활성이 있는 TPO 이형의 생산

이. 콜리에서 생산되고, 정제되고, 생물학적 활성 형태로 리폴딩된 3개의 상이한 TPO 이형을 하기에 제공하고 있다.

(1) MLF - 세균에서 유래하는 시그날 서열 STII로부터 얻은 13개의 잔기를 TPO의 N-말단 도메인 (잔기 1-155)에 융합시켰다. 생성된 서열은 다음과 같고, 여기에서 리더 서열은 밑줄을 그었고, C C는 Cys⁷내지 Cys¹⁵¹를 나타낸다:

MKKNIAFLLNAYASPAPPAC CVRRA (SEQ ID NO : 85)

상기 이형은 수용체 및 생물학적 연구를 위한 TPO의 방사성 요오드첨가용 티로신을 제공하도록 구성되었다.

(2) H8MLF - STII 서열로부터 얻은 7개의 잔기, 8개의 히스티딘 잔기 및 인자 Xa의 효소적 절단 서열 IEGR을 TPO의 N-말단 도메인 (잔기 1-155)에 융합시켰다. 그 서열을 다음과 같고, 여기에서 리더 서열은 밑줄을 그었고, C C는 Cys⁷내지 Cys¹⁵¹를 나타낸다:

MKKNIAFHHHHHHHHIEGRSPAPPAC CVRRA (SEQ ID NO : 86)

정제되고 리폴딩될 경우, 상기 이형은 서열 IEGR의 아르기닌 잔기 다음을 절단하는 효소 인자 Xa로 처리되어 천연적 세린 N-말단 아미노산을 갖는 155 잔기 길이의 TPO 이형을 수득할 수 있다.

(3) T-H8MLF - 이것은 트롬빈 감성 서열 IEPR이 TPO의 N-말단 도메인에 융합된 것을 제외하고는 상기 이형 (2)와 같이 제조된다. 생성된 서열은 다음과 같고, 여기에서 리더 서열은 밑줄을 그었고, C C는 Cys⁷내지 Cys¹⁵¹를 나타낸다:

MKKNIAFHHHHHHHHIEPRSPAPPAC CVRRA (SEQ ID NO : 87)

정제 및 리폴딩 후, 상기 이형을 효소 트롬빈으로 처리하여 155 잔기의 길이를 갖는 TPO의 천연적 N-말단 이형을 생산할 수 있다.

A. 생물학적 활성이 있는 단량체 TPO 이형 (1), (2) 및 (3)의 회수, 가용화 및 정제

이형은 모두 이. 콜리에서 발현되었다. 이형의 대부분은 TPO (Met^-11-153)에 대해 실시예 22에서 관찰되는 것과 같이 R체에서 발견되었다. 단량체 TPO 이형의 회수, 가용화 및 정제에 대해 실시예 22에서 기재한 것과 동일한 방법을 실행하였다. TPO (Met^-11-153)에 사용한 것과 동일한 조건을 30-50 %의 전체 수율로 사용하였다. 리폴딩 후, TPO 이형을 상기 아세토니트릴 구배를 이용한 0.1 % TFA 중의 C4 역상 크로마토그래피에 의해 정제하였다. TPO의 모든 이형 (단백질 분해되지 않은 형태)은 Ba/F3 분석법에 의해 분석한 바와 같이 생물학적 활성이 있었고, 2-5 pM에서 최대 절반 활성을 나타내었다.

B. 이형 (2) 및 (3)을 단백질 분해시켜 인증된 N-말단 TPO (1-155)를 생산함

상기 TPO 이형 (2) 및 (3)을 TPO의 정상적 N-말단 아미노산 잔기에 앞서 효소적으로 절단 가능한 리더 펩티드를 갖도록 디자인하였다. 상기와 같은 이형 (2) 및 (3)을 리폴딩 및 정제한 후, 각각을 적절한 효소로 소화시켰다. 각 이형에 있어서, 용액 상에 완화한 질소 스트림을 취입하여 C4 역상 단계로부터 아세토니트릴을 제거하였다. 그런 후, 상기 2개의 이형을 하기와 같이 인자 Xa 또는 트롬빈으로 처리하였다.

TPO 이형 (2)에 있어서, 1 M의 트리스 완충제(pH 8)를 아세토니트릴이 없는 용액에 가해 최종 농도를 50 mM로 하고, 필요에 따라 pH를 8로 조정하였다. NaCl 및 CaCl₂를 각각 0.1 M 및 2 mM로 가하였다. 인자 Xa (New England Biolabs 사)를 가하여 약 1 : 25 내지 1 : 100의 효소 대 이형의 몰비를 얻었다. 시료를 실온에서 1-2 시간 동안 배양하여 리더 서열의 상실을 나타내는 SDS 겔 상의 이동에 있어서의 변화에 의해 측정되는 것과 같은 최대 절단을 얻었다. 그런 후, 상기 적절하게 폴딩된 이형의 정제에 있어서의 동일한 구배 및 조건을 사용하여 반응 혼합물을 C4 역상 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 절단되지 않은 이형 B를 상기 조건에 의해 절단된 이형 (2)로부터 분리해내었다. N-말단 아미노산은 SPAPP인 것으로 나타났는데, 이는 N-말단 리더 서열의 제거가 성공했음을 나타낸다. 또한, 인자 Xa는 TPO 도메인 내의 다양한 양의 내부 절단을 생성하였고, 절단은 추가 N-말단 서열인 TTAHKDP (SEQ ID NO : 88)를 생성하는 위치 번호 118에 있는 아르기닌 잔기 다음에서 관찰되었다. 아르기닌 118에서의 절단과 같이, 환원되지 않은 SDS 겔 상에서는 약 17000 달톤의 1개의 밴드가 인자 Xa로 절단된 이형에서 나타났고, 환원 겔 상에서는 약 12000 및 5000 달톤의 분자량에서 2개의 밴드가 나타났다. 또한, 이러한 관찰은 상기 트립신 소화 실험에서 추정된 바와 같이 분자의 2개의 부분이 제1 및 제4 시스테인 잔기 사이에서 디술피드 결합으로 함께 연결되어 있음을 확인해 주었다. Ba/F3 생물학적 분석에서, 정제된 TPO (1-155) 이형은 N-말단 리더 서열의 제거 및 내부 절단 후 2-4 pmole의 최대 절반 활성을 가졌다.

이형 (3)에 있어서, 1 : 25 내지 1 : 50의 효소 대 TPO 이형 단백질의 중량비에 대해 소화 완충제는 50 mM 트리스 (pH 8), 2% CHAPS, 0.3 M NaCl, 5 mM EDTA 및 사람 또는 소의 트롬빈 (Calbiochem 사)으로 이루어졌다. 실온에서 2-6 시간 동안 소화를 수행하였다. 소화의 진행을 인자 Xa 절단 반응에 대해 상기한 바와 같이 SDS 겔에 의해 측정하였다. 통상적으로, 이때 90 % 이상의 리더 서열 절단이 달성되었다. 생성된 TPO를 상기와 같이 C4 역상 컬럼 상에서 정제하고, 아미노상 서열화에 의해 목적하는 N-말단을 갖는 것을 알 수 있었다. 상기 관찰된 바와 같이 동일한 아르기닌-트레오닌 결합에 있어서 단지 아주 소량 (5 % 이하)의 내부 절단이 인자 Xa에 의해 얻어졌다. 생성된 TPO 단백질은 Ba/F3 분석에서 0.2-0.4 pmole 단백질에서 최대 절반 반응을 갖는 높은 생물학적 활성을 가졌다.mpl수용체를 기초로 한 ELISA에 있어서, 상기 단백질은 2-4 ng/㎖의 정제된 단백질 (120-240 pmole)에서 최대 절반 반응을 갖는 반면, 리더 서열을 포함하는 무상 이형은 2가지 분석법에서 5-10배 보다 낮은 효력을 나타내었다. 동물 연구에 있어서, HPLC로 정제된 절단된 단백질을 150 mM NaCl, 0.01 % 트윈 80 및 10 mM 숙신산나트륨 (pH 5.5), 또는 10 mM 아세트산나트륨 (pH 5.5), 또는 10 mM 인산나트륨 (pH 7.4)의 생리학적 허용 완충제로 투석하였다. HPLC 및 SDS 겔에 의해 정제된 단백질을 4 ℃에서 저장할 경우, 수주 동안 안정함을 알아내었다. 정상 생쥐 및 골수 억제 생쥐에서, 인증된 N-말단 서열을 갖는 정제된 TPO는 30 ng/생쥐보다 낮은 용량에서 혈소판의 생산을 높은 활성으로 자극하였다.

실시예 24

합성 mpl 리간드

통상적으로 사람mpl리간드 (hML)가 재조합 방법을 이용하여 제조됨에도 불구하고, 그것은 또한 하기 방법을 사용하여 합성 펩티드 단편을 효소적으로 결찰하여 합성될 수도 있다. 폴리에틸렌 글리콜과 같은 비천연적 아미노산 또는 합성 관능기가 혼입되어 hML이 합성 생산된다. 이전에는 세린 프로테아제 서브틸리신 BPN의 변이체인 서브틸리가제 (S221C/P225A)를 공작하여 수용액 중에서 펩티드 에스테르를 효과적으로 결찰하였다 (Abrahmsen 등의 문헌 [Biochem. 30 : 4151-4159 (1991)] 참조). 합성 펩티드를 일련의 방법으로 효소적으로 결찰하여 효소적 활성이 있는 긴 펩티드 및 단백질 (예를 들어, 리보뉴클레아제 A)을 생산할 수 있다는 것이 현재 알려져 있다 (Jackson 등의 문헌 [Science (1994)] 참조). 하기에 더 상세히 기재하고 있는 상기 기술로 인해 이전에는 재조합 DNA 기술로만 제조할 수 있었던 긴 단백질을 화학적으로 합성할 수 있게 되었다.

서브틸리가제를 사용한 hML₁₅₃의 합성에 대한 전반적 계획이 도시되어 있다 (반응도 1). 단백질의 C-말단 단편에 대응하는 완전히 탈보호된 펩티드에서 시작하여, N-말단은 보호되고 C-말단은 활성화된 에스테르 펩티드를 서브틸리가제와 함께 가하였다. 반응이 완결되었을 때, 생성물을 역상 HPLC에 의해 단리하고, 보호기를 N-말단으로부터 제거하였다. 다음 펩티드 단편을 결찰하고, 탈보호하고, 전체 단백질 길이가 얻어질 때까지 연속 펩티드를 사용하여 이 과정을 반복하였다. 이러한 방법은 N-말단이 보호되고 C-말단이 활성화된 펩티드를 선행 펩티드의 N-말단에 결찰하여 단백질을 C -> N 방향으로 합성하는 점에서 고체상 방법과 유사하다. 그러나, 각 커플링마다 50개 이하의 잔기가 생기고, 생성물을 각 결찰 후 단리하기 때문에, 휠씬 더 길고 매우 순수한 단백질을 적당한 수율로 합성할 수 있다.

서브틸리가제를 사용한 hML의 합성 계획

R-NH-펩티드₂-CO-R' + H₂N-펩티드₁-CO₂

↓ 1) 서브틸리가제

R-NH-펩티드₂-CO-NH-펩티드₁-CO₂

↓ 2)Zn/CH₃CO₂H

H₂N-펩티드₂-CO-NH-펩티드₁-CO₂

↓ 3) 반복 1+2

H₂N-펩티드₃-CO-NH-펩티드₂-CO-NH-펩티드₁-CO₂

서브틸리가제의 서열 특이성 및 hML의 생물학적 활성이 있는 "EPO-도메인"의 아미노산 서열에 대한 지식을 근거로 하여, 본 발명자들은 hML₁₅₃을 18-25 잔기 길이를 갖는 7개의 단편으로 나누었다. 테트라펩티드의 시험 결찰을 합성하여 18-25mer에 대한 적합한 결찰 연결을 정하였다. 표 13에 상기 시험 결찰의 결과를 나타내었다.

hML 시험 결찰 : 공여체 및 친핵성 펩티드를 22 ℃에서 100 mM 트리신 (pH 7.8) 중에 10 mM의 농도로 용해시켰다. 리가제를 가하여 1.6 ㎎/㎖의 농축액(~ 70 μM)으로부터 10 μM의 최종 농도로 제조하고, 결찰을 하룻밤 동안 수행하였다. 수율은 % 결찰 대 공여체 펩티드의 가수분해를 기준으로 한다.

부위	공여체(glc-K-NH2)	친핵성-NH2	% 가수 분해	%결찰
1 (23/24)	HVLH(서열 동정 번호 : 89)	SRLS(서열 동정 번호 : 90)	92	08
(22/23)	SHVL(서열 동정 번호 : 91)	HSRL(서열 동정 번호 : 92)	48	52
2 (46/47)	AVDF(서열 동정 번호 : 93)	SLGE(서열 동정 번호 : 94)	22	78
3 (69/70)	AVTL(서열 동정 번호 : 95)	LLEG(서열 동정 번호 : 96)	53	47
4 (89/90)	LSSL(서열 동정 번호 : 97)	LGQL(서열 동정 번호 : 98)	95	05
(88/89)	C(acm)LSS(서열 동정 번호 : 99)	LLGQ(서열 동정 번호 : 100)	00	00
(90/91)	SSLL(서열 동정 번호 : 101)	GQLS(서열 동정 번호 : 102)	45	55
(88/89)	CLSS(서열 동정 번호 : 103)	LLGQ(서열 동정 번호 : 100)	90	10
5 (107/108)	LQSL(서열 동정 번호 : 104)	LGTQ(서열 동정 번호 : 105)	99	01
(106/107)	ALQS(서열 동정 번호 : 106)	LLGT(서열 동정 번호 : 107)	70	30
6 (128/129)	NAIF(서열 동정 번호 : 108)	LSFQ(서열 동정 번호 : 109)	60	40

상기 실험을 근거로 하여, 표 14에 나타나 있는 결찰 펩티드는 서브틸리가제에 의해 효과적으로 결찰될 것이다. 자기 결찰을 방지하기 위해 각 공여체 에스테르 펩티드의 N-말단에 적합한 보호기가 필요하였다. 본 발명자들은 수용성이고, 고체상 펩티드 합성의 마지막 단계에서 혼입될 수 있고, 탈보호 및 고체상 수지로부터 펩티드를 절단하는데 사용하는 HF 무수물에 안정하기 때문에 이소니코티닐 (iNOC) 보호기를 선택하였다 (Veber 등의 문헌 [J. Org. Chem. 42 : 3286-3289 (1977)] 참조). 또한, 그것은 온화한 환원 조건 (Zn/CH₃CO₂H) 하의 각 결찰 후 펩티드로부터 제거되어 다음 결찰을 위한 유리 N-말단을 제공할 수 있다. 서브틸리가제에 의해 효과적으로 아실화되는 것을 보여주는 이전 실험을 근거로 하여 글리콜레이트-리실-아미드 (glc-K-NH₂) 에스테르를 C-말단 활성화에 사용하였다(Abrahmsen 등의 문헌 [Biochem. 30 : 4151-4159 (1991)] 참조). iNOC로 보호되고, glc-K-NH₂로 활성화된 펩티드를 반응도 2에 개요한 바와 같은 표준 고체상 방법을 사용하여 합성할 수 있다. 그리고 나서, 전체 단백질이 제조될 때까지 펩티드를 계속해서 결찰하고, 최종 생성물을 시험관 내에서 리폴딩하였다. EPO와 유사하게, 시스테인 잔기 7과 151 사이 및 28과 85 사이에서 디술피드 쌍이 형성되는 것으로 여겨진다. 디술피드의 산화는 간단히 산소 분위기 하에서 수 시간 동안 환원된 물질을 교반함으로써 이루어질 수 있다. 그리고 나서, 리폴딩된 물질을 HPLC로 정제하고, 활성 단백질을 포함하는 분획을 풀로 제조하여 동결 건조시켰다. 별법으로, 디술피드를 다르게 보호하여 특정 디술피드 쌍 사이의 연속적 산화를 조절할 수 있다. 아세트아미도메틸 (acm)기를 사용한 시스테인 7 및 151의 보호로 28 및 85만 산화될 것이다. 그리고 나서, acm기를 제거하고, 잔기 7 및 151를 산화할 수 있다. 반대로, 연속 산화가 온당한 폴딩에 요구될 경우, 잔기 28 및 85는 acm으로 보호되어, 산화될 수 있다. 임의로, 시스테인 7 및 151의 적절한 산화를 위해 시스테인 28 및 85를 Cys 이외의 다른 천연 또는 비천연 잔기로 치환할 수 있다.

서브틸리가제를 사용한 h-ML의 전체 합성에 사용되는 펩티드 단편

단편 / 서열

1 (SEQ ID NO : 110)iNOC-HN-SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVL-glc-K-NH2(1-22)

2 (SEQ ID NO : 111)iNOC-HN-HSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDF-glc-K-NH2(23-46)

3 (SEQ ID NO : 112)iNOC-HN-SLGEWKTQMEETKAQDILGAVTL-glc-K-NH2(47-69)

4 (SEQ ID NO : 113)iNOC-HN-LLEGVMAARGQLGPTCLSSLL-glc-K-NH2(70-90)

5 (SEQ ID NO : 114)iNOC-HN-GQLSGQVRLLLGALQS-glc-K-NH2(90-106)

6 (SEQ ID NO : 115)iNOC-HN-LLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIF-glc-K-NH2(107-128)

7 (SEQ ID NO : 116)H2N-LSFQHLLRGKVRFLMLVGGSTLCVR-CO2(129-153)

펩티드 결찰을 25 ℃의 100 mM 트리신 (pH 8 : 새로 제조하고 5 μM 필터를 통한 진공 여과에 의해 가스를 제거함) 중에서 수행하였다. 전형적으로, C-말단 단편을 완충제 (2-5 mM 펩티드) 중에 용해시키고, 서브틸리가제의 10× 농축액 (100 mM의 트리신 중의 1 ㎎/㎖, pH 8)을 가하여 ~ 5 μM의 최종 효소 농도를 얻었다. 과량의 3-5 몰 glc-K-NH₂로 활성화된 공여체 펩티드를 고체로서 가하여 용해시키고, 혼합물을 25 ℃에 방치하였다. 결찰을 역상 C18 HPLC (0.1 % TFA와 CH₃CN/H₂O의 구배) 분석에 의해 모니터링하였다. 결찰 생성물을 예비 HPLC에 의해 정제하고, 동결 건조하였다. HCl로 활성화된 아연 분말과 아세트산 중의 보호된 펩티드를 교반함으로써 이소니코티닐 (iNOC)의 탈보호를 수행하였다. 아연 분말을 여과에 의해 제거하고, 아세트산을 진공 하에서 증발시켰다. 생성된 펩티드는 다음 결찰에 직접 사용할 수 있었고, 이 방법을 반복하였다. 합성 hML₁₅₃을 합성 또는 재조합 hML_154-332에 대해 상기한 것과 유사한 방법으로 결찰하여 합성 또는 반합성의 hML의 전길이를 제조할 수 있었다.

합성 hML은 재조합 hML에 비해 많은 잇점을 가진다. 비천연 측쇄를 도입하여 효력 또는 특이성을 개선시킬 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체 관능기를 혼입하여 작용 시간을 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜은 하나 이상의 결찰 단계를 수행하기 전 또는 수행한 후 개개의 단편 (표 14)의 리신 잔기에 결합될 수 있다. 프로테아제 감성 펩티드 결합을 제거 또는 변화시켜 생체 내 안정성을 개선시킬 수 있다. 또한, 중 원자 유도체를 합성 하여 구조 결정에 이용될 수도 있다.

a) 리실-파라메틸벤즈히드릴아민 (MBHA) 수지 1 (0.63 meq./qm., Advanced ChemTech 사)을 1 시간 동안 25 ℃의 디메틸아세트아미드 (DMA) 중에서브로모아세트산 (5 eq.) 및 디이소프로필 카르보디이미드 (5 eq.)와 함께 교반하여 브로모아세틸 유도체 2를 얻었다.

b) 수지를 DMA로 광범위하게 세척하고, 개개의 Boc로 보호된 아미노산 (3 eq., Bachem 사)을 24 시간 동안 50 ℃의 디메틸포름아미드 (DMF) 중에서 중탄산나트륨 (6 eq.)과 함께 교반함으로써 에스테르화하여 대응하는 글리콜레이트-페닐알라닐-아미드-수지 3을 얻었다. 아미노 아세틸화된 수지 3을 DMF (3×) 및 디클로로메탄 (CH₂Cl₂: 3×)으로 세척한 결과, 수개월 동안 실온에서 저장할 수 있었다. 그리고 나서, 수지 3을 자동화된 펩티드 합성기 (Applied Biosystems 430 A)에 적하하고, 표준 고체상 방법을 사용하여 펩티드를 연장할 수 있었다.

c) N-α-Boc기를 CH₂Cl₂중의 45 % 트리플루오로아세트산 용액으로 제거하였다.

d) 생성된 Boc로 보호된 아미노산 (5 eq.)을 DMA 중의 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(디메틸아미노) 포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (BOP, 4 eq.) 및 N-메틸포르폴린 (NMM, 10 eq.)을 사용하여 예비 활성화시키고, 1-2 시간 동안 결합시켰다.

e) 최종 N-α-Boc기를 제거하여 (TFA/CH₂Cl₂) 4를 얻고, 이소니코티닐 (iNOC) 보호기를 24 시간 동안 25 ℃의 DMA 중의 4-이소니코티닐-2,4-디니트로페닐 카르보네이트 (3 eq.) 및 NMM (6 eq.)과 함께 교반하여 상기 (4)와 같이 도입하였다.

f) 1 시간 동안 0 ℃에서 HF 무수물 (5 % 아니솔/5 % 에틸메틸 술피드)로 처리하여 펩티드를 절단 및 탈보호시켜 iNOC로 보호되고 글리콜레이트-리실-아미드로 활성화된 펩티드 5를 얻고, 이것을 역상 C18 HPLC (0.1 % TFA 중의 CH₃CN/H₂O 구배)로 정제하였다. 모든 기질의 동정은 질량 분석으로 확인하였다.

보충 자료

주장된 바와 같이 본 발명은 상기 명세서와 일치할 수 있고, 비교용 및 출발 물질을 용이하게 입수할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 본 출원인들은 하기 세포주를 미합중국 머릴랜드주의 록빌 소재의 American Type Culture Collection에 기탁하였다:

Escherichia coli, DH10B-pBSK-hmplI 4.8 : ATCC 소장 번호 CRL 69575, 1994년 2월 24일에 기탁됨.

플라스미드, pSV15.ID.LL.MLORF : ATCC 소장 번호 CRL 75958, 1994년 12월 2일에 기탁됨.

CHO DP-12 세포, ML 1/50 MCB (#1594로 표지화됨) : ATCC 소장 번호 CRL 11770, 1994년 12월 6일에 기탁됨.

상기 기탁은 특허 절차의 목적을 위한 미생물 기탁의 국제 승인에 대한 부타페스트 조약의 규정 및 규칙 하에서 행해졌다 (부다페스트 조약). 이는 기탁일로부터 30년 동안 살아있는 배양물을 유지시켜준다. 생물은 부다페스트 조약 하에서 ATCC에 의해 입수될 것이고, 출원인과 ATCC의 동의로 타당한 미합중국 특허의 허여시 비제한적으로 유용하게 된다. 기탁 균주의 유용성은 특허법에 따라 정부 권한 하에서 부여된 임의의 권리 위배시 본 발명을 실시하는 특허로서 해석되지 않는다.

본 발명은 필요시 바람직한 실시 태양 및 특정 작업예와 연결되어 기재되어서 상기 명세서를 읽은 후 통상의 기술자는 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고, 본 명세서에 기재한 내용의 다양한 변화, 상당 내용의 대치 및 변경을 수행할 수 있을 것이다. 즉, 본 발명은 본 명세서에 특정하게 기재된 것 이외의 방법으로 수행될 수 있다. 따라서, 여기에서 특허증에 의해 부여된 보호는 첨부된 청구 범위 및 그와 동등한 것에 의해서만 제한될 것이다.

본 명세서에 언급된 모든 참고 문헌은 이에 의해 참고 문헌으로 분명히 인용된다.

본 발명에는 단리된 트롬보포이에틴(TPO), TPO를 암호화하는 단리된 DNA, 및 TPO를 제조 및 정제하는 재조합 또는 합성 방법이 게재되어 있다. 다양한 형태의 TPO가 혈액 세포, 특히 거핵구 및 거핵구 조상세포의 복제, 분화 또는 성숙에 영향을 미친다는 것이 밝혀져 있다. 따라서, 이러한 화합물들은 혈소판 감소증의 치료에 이용될 수 있다.

Claims (47)

1. (a) 인간 mpl P로 형질감염된 IL-3 의존성 Ba/F3 세포의 DNA로의 표지된 뉴클레오티드(³H-티미딘)의 혼입을 자극하고,

   (b) 혈소판 반사 분석에서, 순환하는 혈소판으로의³⁵S 혼입을 자극하고,

   (c) pH 2.5, 0.1%의 SDS 및 2M 우레아 중에서 안정하고,

   (d) 당단백질이고,

   (e) 이 폴리펩티드의 아미노산 말단 서열이

   SPAPPACDPRLLNKLLRDDHVLHGR 또는 SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVLHSRL 인 것이 특징인 실질적으로 균질한 단리된 mpl 리간드 폴리펩티드.
2. 제1항에 있어서, 생물학적으로 활성인 단리된 mpl 리간드 폴리펩티드.
3. 제1항의 폴리펩티드와 70% 이상의 서열 동일성을 공유하는 mpl 리간드 폴리펩티드.
4. mpl 리간드 폴리펩티드와 하나 이상의 생물학적 성질을 공유하는 제1항의 폴리펩티드의 대립형질체 또는 변형체, 또는 상기 mpl 리간드, 대립형질체 또는 변형체의 단편인 mpl 리간드 폴리펩티드.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 종으로부터 유래한 mpl 리간드 폴리펩티드.
6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 종으로부터 유래한 mpl 리간드 폴리펩티드.
7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 글리코실화되지 않은 mpl 리간드 폴리펩티드.
8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 암호화하는 단리된 핵산 분자.
9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에서 정의된 mpl 리간드를 암호화하는 서열을 가지는 천연 핵산 분자와 중간 정도 내지 고도의 엄격한 조건 하에서 혼성화하며 mpl 리간드 유전자의 적어도 일부분에 상응하는 게놈 DNA 또는 cDNA.
10. 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제8항의 핵산.
11. 숙주 세포에 의해 인식되는 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 제8항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
12. 제8항의 핵산을 발현하여 mpl 리간드 폴리펩티드를 생산할 수 있도록 상기 핵산으로 형질 감염된 숙주 세포.
13. 제8항의 재조합 핵산을 적당한 숙주 세포 중에서 발현시켜 mpl 리간드 폴리펩티드를 제조하는 것을 포함하는 방법.
14. 제13항에 있어서, mpl 리간드 폴리펩티드가 숙주세포 또는 숙주 세포 배양물 배지로부터 회수되는 방법.
15. mpl 리간드 폴리펩티드를 암호화하는 DNA의 전사에 영향을 미치기에 충분한 근접 거리 및 배향으로 세포의 게놈에 삽입된 프로모터/인핸서 요소, 서프레서, 또는 외인성 전사 조절 요소의 조절 하에 내인성 mpl 리간드 유전자를 세포 내에서 발현시키는 것을 포함하는 방법.
16. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 mpl 리간드 또는 제13항의 방법에 의하여 얻어진 mpl 리간드 및 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 혈소판 감소증 치료 또는 예방을 위한 조성물.
17. 제16항에 있어서, 시토킨, 집락(colony) 자극 인자 및 인터루킨으로부터 선택되는 치료 유효량의 약제를 추가로 포함하는 조성물.
18. 제17항에 있어서, 약제가 LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, Epo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 및 IL-11로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
19. 제9항의 게놈 DNA 또는 cDNA의 적어도 일부분에 상응하는 핵산을 이용하여 핵산 폴리머라제 반응을 프라이밍(priming)시키는 것을 포함하는 핵산 시험 샘플의 증폭 방법.
20. 시험 샘플 핵산에 제9항의 핵산을 혼성화하여 mpl 리간드 폴리펩티드 핵산의 존재 여부를 결정하는 단계를 포함하는, mpl 리간드 폴리펩티드의 존재 여부 결정 방법.
21. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 mpl 리간드 폴리펩티드 또는 제13항의 방법에 의하여 얻어진 mpl 리간드 폴리펩티드를 mpl 리간드 특이 항체의 제조에 이용하는 것을 포함하는 방법.
22. 제21항에 있어서, 모노클로날 항체가 제조되는 것인 방법.
23. 제21항의 방법에 의하여 수득 가능한 항체.
24. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 mpl 리간드 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체.
25. 제24항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
26. 제25항의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주.
27. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제 절단에 대해 내성을 갖도록 하나 이상의 잠재적 프로테아제 절단 부위가 변형된 mpl 리간드 폴리펩티드.
28. 제27항에 있어서, 상기 잠재적 절단 부위가 도14에 기재된 mpl 리간드의 아미노산 위치 153-154 및(또는) 245-246인 mpl 리간드 폴리펩티드.
29. 제28항에 있어서, 위치 153-154의 절단 부위가 치환에 의하여 불활성화된 것인 mpl 리간드 폴리펩티드.
30. 제29항에 있어서, 위치 153-154의 Arg-Arg 잔기가 알라닌(Ala) 잔기로 치환된 것인 mpl 리간드 폴리펩티드.
31. 이종 폴리펩티드에의 융합체를 포함하는 제4항의 mpl 리간드의 변형체.
32. 제4항 또는 제31항에 있어서, 아미노 말단 및(또는) 카르복시 말단에서 하나 이상의 아미노산 잔기에의 융합체를 포함하는 mpl 리간드 폴리펩티드.
33. 제32항에 있어서, N-말단 메티오닌을 갖는 mpl 리간드 폴리펩티드.
34. 비-단백질성 중합체에 결합되어 있는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 mpl 리간드 폴리펩티드.
35. 제34항에 있어서, 상기 중합체가 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌인 mpl 리간드 폴리펩티드.
36. 제13항에 있어서, 숙주 세포가 CHO 세포주인 방법.
37. 이종 폴리펩티드 (heterologous polypeptide) 및, 도1(SEQ ID NO:1)의 mpl 리간드의 단편 또는 SEQ ID NO:9의 mpl 리간드의 단편을 포함하는 키메릭 폴리펩티드.
38. 제37항에 있어서, 도1 (SEQ ID NO:1)의 mpl 리간드의 단편을 포함하며, 도1 (SEQ ID NO:1)의 mpl 리간드의 단편이 하기 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 키메릭 폴리펩티드.

    MPPA, (SEQ ID NO:117)

    MAPPA, (SEQ ID NO:118)

    MPAPPA, (SEQ ID NO:119)

    MSPAPPA, (SEQ ID NO:120)

    APPA, (SEQ ID NO:121)

    PAPPA, (SEQ ID NO:122)

    SPAPPA, (SEQ ID NO:123)

    VRRA, (SEQ ID NO:124)

    VRRAP, (SEQ ID NO:125)

    VRRAPP, (SEQ ID NO:126)

    VRRAPPT, (SEQ ID NO:127)

    VRRAPPTT, (SEQ ID NO:128)

    VRRAPPTTA, (SEQ ID NO:129)

    VRRAPPTTAV, (SEQ ID NO:130)

    VRRAPPTTAVP, (SEQ ID NO:131)

    VRRAPPTTAVPS, (SEQ ID NO:132)

    VRRAPPTTAVPSR, (SEQ ID NO:133)

    VRRAPPTTAVPSRT, (SEQ ID NO:134)

    VRRAPPTTAVPSRTS, (SEQ ID NO:135)

    VRRAPPTTAVPSRTSL, (SEQ ID NO:136)

    VRRAPPTTAVPSRTSLV, (SEQ ID NO:137)

    VRRAPPTTAVPSRTSLVL, (SEQ ID NO:138)

    VRRAPPTTAVPSRTSLVLT, (SEQ ID NO:139)

    VRRAPPTTAVPSRTSLVLTL, (SEQ ID NO:140)

    VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLN, (SEQ ID NO:141)

    VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNE, (SEQ ID NO:142)

    VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNEL, (SEQ ID NO:143)

    VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNELP, (SEQ ID NO:144)

    하나 이상의 도1 (SEQ ID NO:1)에 제공되는 인간 ML의 176 내지 332번째 잔기,

    또는 이들의 조합
39. 제37항에 있어서, 도1 (SEQ ID NO:1)의 mpl 리간드의 단편를 포함하며, 도1 (SEQ ID NO:1)의 mpl 리간드의 단편이 하기 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로하는 키메릭 폴리펩티드.

    SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVL, (SEQ ID NO:110)

    HSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDF, (SEQ ID NO:111)

    SLGEWKTQMEETKAQDILGAVTL, (SEQ ID NO:112)

    LLEGVMAARGQLGPTCLSSLL, (SEQ ID NO:113)

    GQLSGQVRLLLGALQS, (SEQ ID NO:114)

    LLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIF, (SEQ ID NO:115)

    LSFQHLLRGKVRFLMLVGGSTLCVR, (SEQ ID NO:116)

    또는 이들의 조합.
40. 제37항에 있어서, 도1 (SEQ ID NO:1)의 mpl 리간드의 단편을 포함하며, 도1 (SEQ ID NO:1)의 mpl 리간드의 단편이 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 1, 3-6, 9, 13-15, 17-28, 30, 32-34, 36-41, 43-50, 53-59, 61-68, 71, 73, 75-80, 82-88, 90-96, 98-99, 102-103, 105-107, 110, 112-113, 115-119, 121-130, 132-133, 135, 137-140, 143-150 및 152-156, 및 이들의 조합 중 적어도 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 키메릭 폴리펩티드.
41. 제37항에 있어서, 도1 (SEQ ID NO:1)의 mpl 리간드의 단편을 포함하며, 도1 (SEQ ID NO:1)의 mpl 리간드의 단편이 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 7-8, 10-12, 16, 29, 31, 35, 42, 51-52, 60, 69, 72, 74, 81, 89, 97, 100-101, 104, 108-109, 111, 114, 120, 131, 134, 136, 141-142 및 151, 및 이들의 조합 중 적어도 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 키메릭 폴리펩티드.
42. 제37항에 있어서, 도1 (SEQ ID NO:1)의 mpl 리간드의 단편을 포함하며, 도1 (SEQ ID NO:1)의 mpl 리간드의 단편이 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 111-114, 139-140, 142-144 및 147-150, 및 이들의 조합 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 키메릭 폴리펩티드.
43. 제37항에 있어서, 도1 (SEQ ID NO:1)의 mpl 리간드의 단편을 포함하며, 도1 (SEQ ID NO:1)의 mpl 리간드의 단편이 도14a, 14b 및 14c (SEQ ID NO:1)에 기재된 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5 및 엑손 6, 및 이들의 조합 중 적어도 하나에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메릭 폴리펩티드.
44. 제37항에 있어서, 도1 (SEQ ID NO:9)의 mpl 리간드의 단편을 포함하며, SEQ ID NO:9의 mpl 리간드의 단편이 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열 1-2, 5-8, 10, 12, 13-20, 22-30, 32, 34-35, 38-54, 56, 59-67, 69-81, 83, 85-105, 107-113, 115-126, 128-130, 132, 134-145, 147, 149 및 151-153, 및 이들의 조합 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 키메릭 폴리펩티드.
45. 제37항에 있어서, 이종 폴리펩티드가 이뮤노글로불린 사슬이나 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메릭 폴리펩티드.
46. 제45항에 있어서, 이종 폴리펩티드가 IgG, IgM, IgA, IgD, IgE 또는 이들의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메릭 폴리펩티드.
47. 제45항에 있어서, 이종 폴리펩티드가 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 이들의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메릭 폴리펩티드.