BE1019732A4

BE1019732A4 - Peptide de hsp70 simulant l'activite de cellules tueuses naturelles (nk) et ses utilisations.

Info

Publication number: BE1019732A4
Application number: BE2009/0695A
Authority: BE
Original assignee: Multimmune Gmbh
Priority date: 2000-09-13
Filing date: 2009-11-12
Publication date: 2012-12-04
Also published as: EP1319023A2; ES2326114T3; EP1319023B1; ATE430161T1; WO2002022656A2; DE60138558D1; US7745399B2; EP1319023B8; AU2002212236A1; US20090239802A1; WO2002022656A3; US20040063173A1; US7517948B2

Description

PEPTIDE DE HSP70 STIMULANT L'ACTIVITE DE CELLULES TUEUSES NATURELLES (NK) ET SES UTILISATIONS

RÉSUMÉ L’invention présente se rapporte à un peptide immuno stimulateur dérivé de la protéine Hsp70 et de peptides composés de peptide immuno stimulateur De plus l’invention présente concerne des polynucléaires codés appelé peptide, des vecteurs composés de poly nucléotides, une fusion de (poly) peptides composés de peptide et des compositions composées de peptide. En plus de l’invention présente se rapporte à Putilisation dudit peptide, poly nucléotide, vecteur ou fusion (poly)peptide, pour la préparation des compositions pharmaceutiques pour le traitement des maladies et pour la stimulation de l’activité du lymphocyte T naturellement tueur (cellule NK ) .

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DETAILS

L’invention présente se rapporte à un peptide immun stimulateur dérivé de la protéine Hsp70 et de peptides composé de peptide immuno stimulateur. De plus l’invention présente concerne des polynucléaires codés appelé peptide, des vecteurs composés de 5 t. S P;, vst, poly nucléotides, une fusion de (poly) peptides composés de peptide et des compositions composées de peptide. En plus l’invention présente se rapporte à l’utilisation dudit L:.;:Cü \ !. de pepîCos ceenço.Cs Je !e.ni.:dé n'nn.ui'.o r'isn.uCicur ;>e plut ί Invention peptide, poly nucléotide, vecteur ou fusion (poly)peptide, pour la préparation des compositions pharmaceutiques pour le traitement des maladies et pour la stimulation de l’activité du lymphocyte T naturellement tueur (cellule NK ) .

Les protéines; qui ont souffert un choc thermique (HSP) sont des protéines hautement conservées qui sont inductibles par une variété de stimuli de stress et par des processus physiologiques qui ihcluéfit lai différenëiàtion éellulairéietïdéveloppement (Lindquist and

Craig. 1988). Les HSPnntràcëllulâifes fonctionnent commé dès -chàpërons moléculaires,

L5 A Λ H. S

elles prennent part dans un repliement de la protéine , transport, processus antigène processus et présentation (DeNagel and Pierce, 1992; Hartl, 1996). Les HSP avec un . î , J ' > ' 1 ' ' ‘ ’ ’ 5 : ' ‘ \ ^ ' ' ' ' ‘ ’ ' '· poids niqjéçulaire de 70 et de 90 kDa ont également montré qu’elles fonctionnaient comme des molécules porteuses de protéines pour des tumeurs immunogènes -dérivée de peptides1 qui induisent une réponse immune cellule T contre le cancer (Tamura et al., 1997; Schild et al., 1999; Srivastava et al., 1998). Les cellules présentatrices d’antigènés présentes sont essentielles dans l’internalisation du complexe peptides HSP récepteur (Arnold-Schild et al., 1999) Plusieurs groupes ont signalé une localisation de la membrane de plasma inhabituelle de HSP sur des cellules tumorales (Altmeyer et al., 1996; Fertarini et al., 1992; Piselli et al., 1995; Tamura et al., 1993). Les inventeurs ont été lés prémiers à démontrer que les cellules NK doivent également être considérées comme des cellules effectrices pertinentes pour la reconnaissance de lq membrane liée Hsp70 sur les cellules tumorales. (Multhoff et al., 1995a, 1995b; Multhoff et al., 1997; Botzler et a}., 1996a, 1996b). En tenant compte de ces considérations et du au fait que les cellules normales manquent d’expression de Hsp70, le membre inductible du groupe HspjO sur là membrane du plasma, nous pouvons faire des spéculations sur le fait que les Hsp70 agissent comme une structure de reconnaissance sélectjve pour les cellules. Des études sur les bloqueurs d’anticorps ont révélé que le Hsp70 est une structure de reconnaissance pertinente pour les cellules NK présentant une adhérence plastique transitoire (Multhoff et al., 1995a, 1995b; Multhoff et al., 1997; Botzler et al., 1998). Malgré le fait que plusieurs anticorps détectent la membrane liée Hsp70 sur les cellules tumorales, uniquement le mAb RPN1197 était capable de bloquer l’activité cytolytique des cellules NK (Multhoff et al. 1995a). Il a été démontré récemment que la prolifération et l’activité cytolytique des cellules NK contre les cellules d’expression tumorale Hsp70 pourraient être stimulées avec une protéine recombinée Hsp70 mais pas avec une Hsc70 ou une ADNK (Multhoff et al. 1999). Vu que les cellules cible pour l’activité cytolytique des cellules NK des sous lignées tumorales CX+ et CX- avec une MHC identique et le modèle de l’expression de la molécule d’adhésion qui se différencie par rapport à la capacité d’expression Hsp70 sur la membrane du plasma, étaient utilisées. (Multhoff et al. 1997). Dans le 9949881W0AW099/49881, il a été démontré en plus que> non seulement là prètéine intacte Hsp70 mais aussi le domaine terminal C de Hsp70horrt active les cellules NK. Le Hsp7()hom, un testicule mëmbre de la famille Hsp70 , est à 94% homologue au domaine terminal C de Hsp70. · ;S.·1

Pour la production d’un (poly) peptide et sa formulation dans les compositions pharmaceutiques, il est généralement recommandé de réduire sa taille dans les limites du raisonnable par rapport à son activité biologique. Une réduction de la taille et de la complexité, augmente le rendement d’un peptide recombiné exprimé et augmente généralement sa stabilité chimique. Quand on produit un peptide de manière synthétique, le rendement et la capacité du processus sont également augmentés avec un peptide de taille réduite tandis que le coût de production est minimisé.

Par la suite, le problème technique sous-jacent de l’invention présente était de fournir une molécule petite, que l’on obtient plus facilement avec une activité immuno stimulatrice qui peut être produite de la manière synthétique ou recombiné en grande quantité et à moindre coût. La solution audit problème technique est obtenue en fournissant les mises en application caractérisées dans les réclamations.

En conséquence, l’invention présente fournit un peptide composé de ou en ayant une séquence d’acide aminé TKDNNLLGRFELXG ou X ou T ou S, ou si l’on préfère S (aussi à travers les autres mises en application citées dans les spécificationsj.L’invention englobe également des fragments ou des dérivés dudit peptide ce qui sera expliqué pliis loin.

Le terme “peptide” utilisé ici évoque des séquences d’acides aminés comprenant 30 acides aminés ou moins.

De façon surprenante, il a été découvert qu’un peptide comprenant ou ayant la séquence TKDNNLLGRFELXG, tandis que X ou T ou S, même si l’on préfère S, est suffisant pour la stimulation de l’activation de la cellule NK. Au moins en ce qui concerne les objectifs in vitro, on a découvert une concentration finale avantageuse des peptides de l’ordre de 0.2 à 2.5 pg/ml.

Avec les données disponibles antérieures, on ne pouvait pas déduire qué la structure d’un peptide qui englobe à peine plus qu’un épitope de- fixation de l’anticôrps pourrait déclencher une telle cascade d’événements. En revanche, on a toujours cru qu’un peptide . : , : t seul n’est pas suffisant pour déclencher Γactivation de la cellule T. La taille de la structure qui a été trouvée comme étant suffisante pour déclencher de tels événements résultats exclue que les réticulations soient concernées dans la stimulation de l’activité NK par le mécanisme sous-jacent qui, de nouveau, est surprenant vu les croyances générales des expériences antérieures. '

Les fragments et des dérivés du peptide de l’invéntion sont également compris dans f invention tandis que les dérivés ont une séquence acide aminé différents qui sé dévie de celle du peptide de l’invention par substitution, insertion, délétion, duplication, inversion etc. démontrent que les dits fragments ou dérivés stimulent l’activation de |a cellule NK . Généralement on préfère que dans ces peptides, les acides aminés TKDN en position 450 à 453 (de Hsp70) R en position 458 et S en position 462 soient maintenus. Lesdits dérivés ou fragments peuvent être dérivés plus tard par exemple, peptidomimétiques comme nous le montrerons ci-dessous. Ils peuvent également faire partie d’une protéine de fusion comme décrit ci-dessous. Les dérivés et fragments composées par l’invention présente peuvent être testés, sans fardeau excessif pour la fonctionnalité de l’utilité médicale comme décrit dans cette spécification et comme décrit en détails dans les exemples annexes. Les dérivés ou fragments ont de préférence la longueur de 13 acides aminés et de préférence pas de longueur de 30 acides aminés, de préférence pas plus de 20 acides aminés.

L’invention présente également concerne un peptide défini au dessus ou ayant la séquence acide aminé EGEfGVMTKDNNLLGRFELXG ou X soit T ou S. L’invention comprend également des fragments ou des dérivés dudit peptide qui a la fonction d’activation et peut être choisi comme décrit au-dessus.

Le peptide de l’invention présente peut être relié à d’autres séquences de (poiy)peptide ou peut faire partie plusieurs fusion(s) de (poly)péptide(s): De telles fusions dé (poly)peptidesA fusions de protéines · peuvent être construits * pour améliorer les caractéristiques des dits fragments; dérivatifs ou des variantès. Par exemple, on peut ajouter d’autres acides aminés;pour améliorer la stabilité et/ou la persistance pendant la· purification,, le manutention ou les processus de conservation ou pour améliorer: la stabilité, la demie vie et/ou la persistance in vitro et dans des organismes hôtes et/ou les patients. De plus, le peptide de l’invention peut être fusionné à d’autres protéines ou peptides qui jouent un rôle dans les réponses immunes ou dans leurs traitements potentiels. Dans la portée de l’invention présente, il y a également des molécules qui comprennent le peptide de l’invention qui sont liés à des molécules marqueurs et/ou des séquences d’acides aminés marqueurs de telles séquences comprise mis ne sont pas limitées à des marqueurs de peptides, marqueurs de histidines, des molécules par fluorescence, GFP, FLAG et GST.

Par conséquent, l’invention se rapporte plus loin à une fusion de (poly)peptide comprenant le peptide de l’invention.

L’invention se rapporte également à poly nucléotide codé le peptide de l’invention ou de ladite fusion (poly)peptide comprenant le peptide de l’invention.

slabiltk·. !a q ciViic v;c ci'un ki m \ uro ci dans de.·» oruaiüM'iiCs isoles ·Λ·ο·λ les

Le poly nucléotide tel qu’il est employé en accord avec cette invention a codé le peptide décrit ci-dessus pseut, par exemple, ADN, cADN, RNA un ADN produit de manière synthétique ADN ou RNA ou recombiné produit une molécule chimérique d’acide nucléique comprenant une des poly nucléotides soit seule soit combinée.

Un peu plus loin, l’invention se rapporte à une molécule d’acide nucléique d’au moins 15 nucléotides en longueur qui hybrident avec un poly nucléotide tel qu’il est décrit ci- dessus avec une chaîne complémentaire en conséquence. Les hybridations spécifiques

ikir CiîlTî-CqïiOi' ;. : ; t <' C ·'. î ·'ί M r SC loin il me iOS'iOn -t.se fjKky jpv'piidC

de préférence sous des conditions rigoureuses s’impliquent aucune hybridisàtion croisée avec des nucléotide séquences codées ou des peptides substantiellement différents ou non . De telles molécules d’acide nucléique peuvent être utilisées comme des sondes et/ou pour le contrôle de l’expression des gèneSi La technologie des sondes d’acide; nucléiqüe est bien connue de ceux qui sont connaisseurs; qui apprécieront rapidement que de telles sondes peuvent varier en longueur. Les référés sont les sondes d’acide nucléique de17 a 35 nucléotides en longueur. Bien entendu, il est également recommandé:d’utiliser les acides nucléiques jusqu’à 100 nucléotides et plus en longueur. Donc, les poly -nucléotides codés le peptide de l’invention peut être utilisé comme des sondes d’acide nucléique pour identifier les molécules d’acides nucléiques codés (poly)peptides différents du HP70 comprenant le peptide de l’invention. De tels (poly)peptides peuvërit être des outils utiles pour investiguer les différentes voies qui peuvent avoir un rôle dans l’activation des cellules NK . Ladite sonde d’acide nucléique est également utile pour de nombreux et/ou applications de diagnostic. D’une part, ils peuvent être utilisés comme des amorces PCR pour l’amplification des poly nucléotides codés le peptide de l’invention. Dans ce contexte, ils peuvent servir comme outils de diagnostic afin de «déterminer par exemple le niveau d’expression de (poly)peptides comprenant le peptide de l’invention, ainsi contrôler ou prédire le statut de l’activité de la cellule NK . Les «molécules d’acide nucléique'qui sont de préférence comprises dans l’invention et sont complémentaires d’un poly nucléotide comme il est décrit ci-dessus et peut être également utilisé pour répression de l’expression d’un gène comprenant un tel poly -nucléotide, par exemple due à μη anti sens ou un effet triple hélice ou pour la construction de ribozymes appropriés (voir, par ex., 0291533EPA1EP-A1 0 291 533, 0321201HPA1EP Al 0 321 201, 0360257EPA2EP-A2 0 360 257) qui en particulier sépare le (pre)-mRNA d’un gène composé d’un poly nucléotide décrit ci-dessous. On peut sélectionner des sites cibles appropriés et des ribozymes correspondants comme il est décrit par exemple dans« Steinecke, Ribozymes, Methods in Cell Biology » 50, Galbraith et al, eds Academie Press, Inc. (1995), 449-460”. Des méthodes standards en rapport avec la technologie anti sens ont également été décrite (Melani, Cancer Res. (1991), 2897-2901 ).Ledit anti sens ou un effet triple hélice ainsi que la construction de ribozymes pertinents est/sont partiellement utiles dans des compositions pharmaceutiques à employer dans la suppression de l’activité de la cellule NK, par ex., clans des maladies auto immunes ou inflammatoires, des infections virales, le sepsis, etc. De plus, la personne qui s’y connaît'est parfaitement consciente qu’il est également possible de classer« une telle sonde d’acide nucléique avec un marqueur approprié pour des applications spécifiques (Inter alia, diagnostic) comme pour la détection de la présence de poly nucléotide tel qu’il est décrit ci-dessus dans un échantillon dérivé d’un « organisme. Les molécules d’acide nucléiques décrites ci-dessus peuvent être soit ADN ou RNA ou même un hybride. De plus, ladite molécule d’acide nucléique contient, par exemple, des liaisons de Thioester et/ou des nucléotides analogues, couramment utiisés dans des approches oligo nucléotide anti-sens. Lesdites modifications peuvent être utiles pour la stabilisation de la molécule d’acide nucléique contre endo- et/ou exo nucléases dans la cellule. Les dites molécules d’acide nucléique peuvent être transcrites par un vecteur approprié contenant un gène chimérique qui permet la transcription de ladite molécule d’acide aminé dans la cellule.

En ce qui concerne les séquences nucléotides caractérisées ci-dessus, le terme "hybridisation" dans ce contexte se comprend comme une référence à des conditions conventionnelles d’hybridisation , de préférence tel que Γhybridisation dans 50% formamide/6><SSC/0.1%SDS/100pg/ml ssADN, où les températures pour l’hybridisation sont au dessus de 37°C et les températures pour lavage dans 0.1xSSC/0.1%SDS sont au dessus de 55°C. Le plus préférable, le terme « hybridisation » se réfère à des conditions d’hybridisation rigoureuses , par exemple celles décrites dans parambrook, « Molecular Cloning A Laboratory Manual », Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.V. Les conditions d’hybridisation rigoureuses incluent P hybridisation à 65°C dans 0.2 x SSC, O.Ï%SDS. ’: ' ’ " ' ’ ' " ; ' ' 7 ' / ;; :‘i ; ; ;;, ;: , .·.·.:· I :.!·, ;· ? * i- ; i s·.. ;. ά, ; , ;· * j ) _.i :· λ π ·; ;; : ; {·,. < i .. î.-.;; îî'

Dans une autre réalisation, l’invention appartient à un vecteur compose de poly

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nucléotide codé le peptide de l’invention.

De nombreux vecteurs appropriés sont connus des personnes qualifiées en biologie moléculaire, choix qui dépend de la fonction désirée et inclue des plasmides, cosmides, virus, bactériophages et autres vecteurs utilisés en général en engineering de la génétique. Des méthodes bien connues des personnes qualifiées peuvent être utijisées pour construire différents plasmides et vecteurs; voir, par exemple, les techniques décrites dans Sambrook, « Molecular Cloning A Laboratory Manual », Cold Spring Harbor Laboratory (.1989) N.Y. et Ausùbel, « Current Protocole in Molecular Biology », Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994). Sinon, les poly nucléotides et les vecteurs de l’invention peuvent être reconstitués en liposomes pour la livraison des cellules cibles. Comme nous l’avons mentionné en détails ci-dessous, on utilisé un vecteur de clonage pour isoler des séquences individuelles de ADN, Des séquences pertinentes peuvent être transférées dans des vecteurs expression quand on a besoin de l’expression d’un polypeptide particulier. Les vecteurs de clonage typiques incluent pBscpt sk, pGEM, pUC9, pBR322 et pGBT9. Les typiques vecteurs d’expression incluent pTRE, pCAL-n-EK, pESP-1, pOP 13CAT.

Donc, dans un réalisation faite , l’invention présente les poly nucléotides codant le peptide de l’invention soit tout seul ou en présence d’un vecteur sont liés à des séquences de contrôle qui permettent l’expression des poly nucléotide dans des cellules procaryotes et/ou des cellules eucaryote. Le terme "séquence, de contrôle” se réfère à des séquences régulatrices d’ADN qui sont nécessaires pour effectuer l’expression de séquences de codage auxquelles elles sont liées. La nature de telles séquences de contrôle diffèrent selon, l’organisme hôte. Dans les procaryotes, les séquences de contrôles incluent généralement un promoteur, un site de fixation ribosomale , et des terminateurs. Dans les eucaryotes généralement, les séquences de contrôle incluent des promoteurs, des terminateurs et, dans certains cas, amplificateurs, des transactivateurs ou des facteurs de ; L Λ [ 'i C ‘‘L·· u * î .1 i.·. ' î ‘ΐ! \ I ;v', ‘i ; L. . j KH : ·...' : ; ; ; l J v. ' Tn v- ; î ’· V„r..;. s ν' ; u t. ' j ·. 11 ; i · u ί ·. * transcription. Le terme "séquence contrôle" veut inclure, au minimum, tous les composants dont la présence est nécessaire pour l’expression, et peut également inclure des composants supplémentaires avantageux. Le terme "lié de manière opérationnelle" se réfère à une juxtaposition dans lequel les composants ainsi décrits sont en relation leur permettant de fonctionner comme prévu. Line séquence de contrôle "lié de manière opérationnelle" à une séquence encodage est ligaturée de telle manière que l’expression de la séquence de codage est obtenue dans des conditions compatibles avec les séquences contrôle. Dans le cas ou la séquence contrôle est un promoteur, il est évident pour une personne qualifiée qu’il est préférable d’utiliser l’acide nucléique bicaténaire .□ Ainsi, le vecteur de l’invention est de préférence un vecteur d’expression. Un "vecteur d’expression" est un concept qui peut être utilisé pour transformer une cellule hôte et fournir l’expression d’une séquence de codage daris Î’ hôte sélectionné.’ Les .vecteurs d’expression peuvent, par exemple, être des vecteurs de donation, vecteurs binaires: où des vecteurs intégrateurs . Expression compose de transcription de la molécule d’acide nucléique de préférence dans un mRNA traduisible. Des; éléments, régulateurs qui

Ji.: .'r .ü'iL: ·. ο;..·· c ·. :. .r. .o;;. ‘ ; · . : ; oc v···;;·. .·.* . :·ο: ;· ;·· ce 0,'i '· Oise : ·; ' c : · 'k.CÎS '·.·'·. ·ν · ·· .HCi.i.OciC ,0' 0 O! ; Λ c' .1 :; COOO.ïiç "i,.; i î c c :.j jk; assurent l’expression dans des cellules procaryotes et/ou eucaryotes sont bien connues par les personnes qualifiées en la matière. Dans le cas ou les cellules eucaryotes sont composées normalement de promoteurs en assurant l’initiation de la transcription et dé façon optionnelle poly-A signaux assurant l’arrêt de la transcription et la stabilisation de transcrit. Possible éléments régulateurs permettant l’expression dans des cellules hôtes procaryote comprise, par ex., the PL, lac, trp ou tac promoteur dans E. coli, et des exemples d’éléments régulateurs permettant 1’ expression dans les cellules hôtes eucaryotes sont les AOX1 ou GAL1 promoteur en levure ou le CMV-, SV40-, RSV-promoteur (Virus du sarcome Rous), activateur-CMV, activateur SV40 ou un intron de globine dans les cellules mammifères et autres cellules animales. Dans ce contexte, les vecteurs d’expression adéquats sont connus pr les personnes qualifiées comme Okayama-Berg cADN vecteur d’expression pcDVl (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcADN 1, pcADN3 (gène In-vitro gène), pSPORTÏ (GIBCO BRL). Un système alternatif d’expression qui peut être utilisé pour exprimer un cycle de cellule de protéine interagissant est un système insecte . Dans un tel système, le virus ,« Autographa califomica nuclear polyhedrosis « (AcNPV) est utilisé comme vecteur pour exprimer des gènes étrangers sans les cellules Spodoptera ffugiperda ou dans la Trichopjusia larvae. La séquence de codage de la molécule de l’acide nucléique de l’invention, peut être cloné dans une région non essentielle du virus, comme le gène polyèdre, et placé sous le contrôle du polyèdre promoteur. L’insertion réussie de ladite séquence de codage rendra le gène polyèdre inactif et produit un virus recombinant qui manque de couche de oucarvo-cs · »:·· ·. AUX! pi: XAiX φ. ; :.p :.;vp:p = -.i!·.: ' MV-. SVJO-. RsV- protéine. Les virus recombinés sont alors utilités pour infecter les cellules S. frugiperda p!'<:ïïi'vci;;· : '.'y-’ü·; ,Α pp:: Ά/ X<. ; ··. ^ .;,'P ·. :.: '· -p ·..·? ,). :· .>··:· ou Trichoplusia larvae dans laquelle la protéine de l’invention est exprimée (Smith et al., 1983; Engelhard et al., 1994).

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Pour obtenir des agents dérivés du peptide de l’invention présente avec une amélioration de la stabilité et améliorer l’absorption via le tract gastro-intestinal ou des voies différentes d’une application pariétale comme par exemple la peau ou le peptidomimétiques des poumons peuvent être utilisés pour · le design des pseudos peptides analogues. Un nouveau design sur ordinateur de la structure i du peptide de l’invention peut être fait en utilisant des programmes ordinateurs apprôpriés (Olszewski et al., 1996; Hoffman et al., 1995). En particulier, les programmes appropriés peuvent être utilisés pour l’identification de sites interactifs du peptide et, s’il est présent, son récepteur ou d’autres protéines interactives par assistance sur ordinateur examine des séquences de peptide complémentaires. (Fassina, 1994). D’autres systèmes appropriés par ordinateur pour le design de protéines et de peptides ont décrit antérieurement, par exemple dans Berry et al. (1994), Wodak et al., (1987) ou Pabo et al. (1986). Les résultants obtenus de l’analyse par ordinateur décrite plus haut peut-être utilisée par ex., pour a préparation de peptidomimétiques du peptide de l’invention. De tel psëudo pèptide analogue à la séquence d’acide aminé naturel du peptide peut de manière très efficace mimique la protéine parente (Benkirane et al., 1996). Par exemple, l’incorporation facilement disponible achiral Ω- résidus d’acides aminés dans le peptide de l’invention résulte dans la substitution de liens d’amide bonds par des unités de polyéthylène d’une chaîne aliphatique , fournissant ainsi une bonne stratégie pour construire un peptide par des peptidomimetiques (Banerjee et al., 1996). Des peptidomimetiques analogues super ci ni..· ! 99( : ! in-Tman a: Lan paruculicr, les prygraimnes appropnes peuvent actifs de petites hormones de peptides dans d’autres systèmes sont décrits dans des cire uidises pour Iddep'ü fiearion du.Site,··.· interaclifs du peptide et, s’il est présent, son travaux antérieurs (Zhang et al., 1996). Des peptidomimetiques appropriés de peptide de récepteur ou dkuU'es proianc··; uilcrucd', us par as.-ivlancc sur oribn.deui' exemun: des l’invention présente peuvent également être identifiés par la synthèse de bibliothèques Séquences du peptide compiéincr.lai-.us. <kxxn;e 1994). IV-.u.a", s>:dus;ie> cppe-ere : par peptidomimétiques combinées à travers des alkylations d’amides successifs et en testant ordiiuüeiu ούυΓ k ue uu;. bu iixCeiêcs U Je ivpixk.·. eu;. deern imkoeereuk:.;;. par les composants résultants, par ex., pour leurs propriétés immunologiques. Lés méthodes ev.\.vupk dans keue et ;d, \ i ' ; \Vou;:!·. al., Î.Î987' nu kde: cri .·· (ipoé). ·, pour la. génération et l’utilisation de bibliothèques peptidomimétiques combinées sont décrites dans des travaux antérieurs, par exemple dans Ostresh et al. (1996), and Domer èt al. (1996). De plus, une structure en trois dimensions et/ou cristallographique du peptide de l’invention peut-être utilisée pour le design d’inhibiteurs peptidomimetiques de Γactivité biologique de.la protéine de l’invention (Rose et al., 1996; Rutenber et al., ΐ996)Γ7' 7"' 7 7!" 7" .77"'·.....7 ' '. 7 17^ 7' '77 L’invention par conséquent se réfère également à une méthode d’affinage du peptide de 1?inventibh composé (un) modélisation dudit peptide par: des peptidomimétiques et (b) synthétisé/ chimiquement : le peptide modelé. Un meilleur : {joint de départ · pour 4a modélisation dés peptidomimétiques est de mettre à l’essai des bibliothèques1 de: peptides dé différentes longùeurs ;et séquences pour stimuler l’activation de la cellule ;NK: En déterminant où (c’est-à-dire à quels résidus d’acide aminés de quelle protéine) le peptide de l’invention se lie à une cellule NK les acides aminés cruciaux pour la liaison dans le le peptide de l’invention peuvent être identifiés. Dans les pas suivants, le peptide çle l’invention peut être optimisé par des modifications chimiques de manière qu’on obtienne une meilleure stimulation de l’activation de la cellule NK. D’autres activateurs putatifs de la cellule Nk peuvent être modelés de la même manière.

Dans un autre forme de réalisation l’invention présente se réfère plus loin à une composition qui comprend ledit peptide ou un fragment ou dérivé de en conséquence le poly nucléotide codage ledit peptide ou un fragment ou dérivé, un vecteur qui comprend ledit poly nucléotide ou une fusion de (poly)peptide composé dudit peptide ou un fragment ou dérivé et un porteur pharmaceutique acceptable et/ou diluant.

Le terme "composition" utilisé ici comprend également des produits médicaux et des adjuvants médicaux et des vaccins.

En accord avec l’invention, les produits médicaux sont toutes les substances pour préparations utilisées individuellement ou en combinaison avec chacune des autres substances, ou d’autres matières qui, selon le producteur, sont supposes être appliqués à des êtres humains dus a leurs fonctions dans le but de détecter, prévenir, contrôler, traiter ou soulager des maladies et dont les effets principaux dans ou sur le corps humain ne sont obtenus ni par la pharmacologie ou par les préparations efficaces au niveau immunologique ni par un métabolisme dont l’efficacité peut être bien supportée par de telles préparations.

En accord avec l’invention, les adjuvants médicaux sont les substances qui sont utilisées pour la production (comme ingrédients actifs) de préparations pharmaceutiques ou des compositions. ; : .; · .

Dans un mode de réalisation la composition est une composition pharmaceutiqué, de préférence. > - .·.· ' \ '

Ladite composition pharmaceutique est également composée de manière avantageuse d’un porteur pharmaceutique et/ou d’un diluent acceptables. On préfère généralement que la composition pharmaceutique cités ici ou produite selon des modes de réalisation de cette invention comprend IL-2 and/or IL-18 dans une dose raisonnable, de préférence dans une concentration de 1 ng à 1 pg/ml.

Le terme pharmaceutique porteur et/ou diluant acceptables , généralement se rapporte à des véhicules couramment utilisés pour la formulation de compostions pharmaceutiques pour être administrés à des animaux ou des êtres humains. Le diluant est sélectionné de manière à ne pas affecter l’activité biologique de la combinaison. Des exemples de tels diluants sont de l’eu distillée stérile, sérum physiologique, Ringer's solutions, solution de dextrose, Hank's solution, RPMI 1640 Medium and Solution Saline Tamponnée au Phosphate (PBS). En plus, la composition pharmaceutique ou formulation peut également inclure d’autres porteurs, adjuvants, ou des stabilisateurs non toxiques, non thérapeutiques, non immunogène et autres similaires. Line dose efficace au niveau thérapeutique se réfère à la somme de protéines ou d’anticorps, antagonistes, ou inhibiteurs qui améliorent les symptômes ou la condition. L’efficacité thérapeutique et la toxicité de tels composants peuvent être déterminé par des procédures pharmaceutiques standards dans des cellules de culture ou des expérimentations animales, par ex., ED50 (la dose thérapeutique efficace chez 50% de la population) et LD50 (la dose létale chez 50% de la population). La dose ratio entre les effets thérapeutiques et toxiques est l’indice thérapeutique, et il peut être exprimé comme le ratio, LD50/ÉD50. D’autres exemples de porteurs pharmaceutiques utiles sont bien connus dans le secteur et incluent des solutions salines phosphate tamponnés, de l’eau, des émulsions, comme des émulsions d’huile/eau , différents types d’agents de sûreté , des solutions stériles etc. Les compositions contenant de tels porteurs peuvent être formulés par des méthodes conventionnelles connues. Ces compositions pharmaceutiques peuvent être administrées au sujet à une dose raisonnable. L’administration dès compostions convenables peut être effectuée de différentes manières, par expar voie intraveineuse, intra péritonéale, sous cutanée, intra musculaire, topique ou intra dermique administration. Le régime de dosage sera dëtèrminé par le médecin traitant et des facteurs cliniques. Comme chacun sait dans le monde médical, les dosages selon les patients dépendent de nombreux facteufs, en incluant la taille du patient, Paire de surface du corps, l’âge, le composait particulier administrer, le sexe, le temps et la route de l’administration, la santé générale et autres médicaments administrés généralement. Une dose typique peut, par exemple, dans une gamme de 0.001 à 1000 pg (ou par acide nucléique pour expression ou pour inhibition d’expression dans cette gamme); cependant, les doses en dessous ou au-dessus de cette gamme d’exemple sont visualisées, spécialement si l’on considère les facteurs mentionnés auparavant. Généralement, le régime comme une administration régulière de la composition pharmaceutique devrait être dans la gamme de 1 pg à 10 mg unités par jour. Si le régime est une infusion continuelle, cela devrait être également dans la gamme de 1 pg à 10 mg unités par kilogramme de poids du corps par minute, respectivement. Les progrès peuvent être contrôlés par ùn contrôle régulier. Les compositions i.

comprenant, le peptide, le composant du médicament, pro-médiçament ou ceux acceptés au niveau pharmaceutique peuvent être donc administrés de façon convenable par toutes les voies utilisées d’habitude pour administrer des médicaments, par exemple, par voie orale, topique, voie pariétale ou par inhalation. Des tels produits acceptés qui comprennent de l’acétate, du méthylester, HCL, sulfate, chloride et autres. Les médicaments peuvent être administrés sous forme de dosages conventionnels préparés en combinant les médicaments avec des porteurs pharmaceutiques en accord avec les procédures conventionnelles. Les médicaments et les pro médicaments identifies et obtenus en accord avec l’invention présente peuvent également être administrés dans des doses conventionnelles en combinaison avec un composé actif second thérapeutique connu. De tels composés actifs thérapeutiques comprennent, par exemple, ceux mentionnés plus haut. Ces procédés peuvent demander le mélange, la granulation et la compression ou la dissolution des ingrédients en accord à la préparation désirée. Il faut prendre en considération que la forme et le caractère du caractère pharmaceutique acceptable ou du diluant soit dicté par la somme d’ingrédients actifs qui doit être ' combiné, la voie d’administration et autres variables bien connues. Les" « porteurs » doivént être "acceptable" dans le sens où ils doivent être compatibles ; avec des1 autrés ingrédients de la formulation et non nocifs pour le receveur. Le porteur pharmaceutique employé doit être, par exemple, soit solide soit liquide. Des exemples de porteurs solides sont la lactose, terra alba, sucrose, le talc, la gélatine, agar, pectine, acacia, stéarate de magnésium, acide stéarique et autres. Des exemples de porteurs liquides sont le sel de phosphate tamponné, le sirop, de l’huile comme l’huile d’arachide et l’huile d’olive, de l’eau, des émulsions, différents types d’agents mouillants, des solutions stériles et autres. Parallèlement, le porteur ou le diluant peut inclure du matériel retardé bien connu des personnes qualifiées, comme le glycérol mono-stéarate ou glycérol distéarate seul ou avec de la cire. Une grande variété de formes pharmaceutiques peut être employée. Ainsi, si on utilise un porteur'solide, la préparation peut être en comprimé, placé dans une capsule de gélatine durcie en poudre ou sous forme de bolus ou sous la forme d’un comprimé à dissoudre ou en pastille. La quantité de porteur solide variera grandement mais de préférence elle sera d’environ 25 mg à environ 1 g. Quand on utilise Un carrier liquide, la préparation se fera sous forme de! sirop, d’émulsion, se capsule gélatine molle, liquide injectable liquide comme une ampoule ou une suspension liquide non aqueuse. La composition peut être administrée de façon topique, c’est-à-dire par une administration non systématique. Ceci inclue l’application externe à l’épiderme ou à la cavité buccale et l’instillation d’un tel composant dans l’oreille, dans les yeux ou dans le nez, de façon que le composant ne rentre pas de façon significative dans je sang. Par contre, l’administration systématique se réfère à l’administration orale, intra veineuse, intra péritonéale et intra musculaire. Les formulations adéquates pour une administration topique incluent des préparations liquides ou semi liquides qui se prêtent à la pénétration à travers la peau au site d’inflammation, comme les produits pour frictions, les lotions, les crèmes, les pommades ou les pâtes, et les gputtes adéquates pour l’administration dans les yeux, les oreilles ou le nez. L’ingrédient actif peut comprise, pour une administration topique, de 0.001% à 10% w/w, par exemple de 1% à 2% par poids de formulation. Il peut cependant comprend jusqu’à 10% w/w mais de préférence il comprend moins de 5% w/w, de préférence de 0.1 % à 1% w/w de la formulation. Les lotions en accord avec l’invention présente incluent celles qui sont adéquates pour application sur la peau ou dans les yeux qui sont adaptées par exemple, pour la protection des UV. Une lotion aqueuse stérile qui contient éventuellement un bactéricide et peut être préparé par des méthodes similaires de' celles de la préparation des gouttes. Les lotions ou produits pour . i ·- i ; i. ·. = : ; .i'.’.· ' : ' l i \ : : ;r · : - .

; i 11 ; . . ' : i;1 : ... i j i . : ' frictions pour application sur la peau peuvent également inclure un agent pour hâter le séchage et pour rafraîchir la peau, comme l’alcool ou l’acétone, et/ou un hydratant comme le glycérol ou une huile comme l’huile de castor ou l’huile d’arachide. Les crèmes, pommades ou les pâtes en accord avec l’invention présente sont des formulations se mi solides de l’ingrédient actif pour application externe. Elles peuvent sè faire en mélangeant l’ingrédient actif en le dispersant ou sous forme de poudre, seule ou en solution ou suspension dans un fluide aqueux ou non aqueux, avec l’aide d’une machine adéquate, avec une base graisseuse ou non graisseuse. La base peut comprendre des hydro carbones comme de la paraffine dure, molle ou liquide, glycérol, de la cire d’abeilles, un savon métallique ; un mucilage; une huile d’origine naturelle comme Γamande, l’arachide, l’huile de castor ou l’huile d’olive; lanoline o des dérivés ou un acide gras comme le stérique ou l’acide oléique avec un alcool comme le propylène glycol ou un macro gel. La formulation peut incorporer n’importe quel agent actif de surface adéquat comme l’anionique, cationique ou non ionique agent de surface comme l’ester de sorbitane ou un dérivé de polyoxyéthylène. Les agents renforçant comme les gommes naturelles les dérivés de cellulose ou des matériaux inorganiques comme la silicaceous silicas, et d’autres ingrédients comme la lanoline, peuvent également être inclus. Les gouttes en accord avec l’invention présente peuvent être des solutions stériles aqueuses ou des solutions huileuses ou des suspensions et peuvent être préparées en dissolvant Γingrédient actif dan une solution aqueuse adéquate d’un bactéricide et/ou un agent fongicide et/ou tout autre conservatrice, et de préférence incluant un agent de surface actif. La solution conservatrice résultante peut être alors clarifiée par filtration, transférée à un container adéquat qui sera lors scellé et stérilisé par autoclave ou conservé à 98-100°C pendant une demi-heure. Sinon, la solution peut être stérilisée par filtration et transféré au container par une technique aseptisée. Des exemples d’agents bactéricides et fongicides adéquats pour inclusion dans les gouttes sont le nitrate de phénylmercurique ou acétate (0.002%), benzalkonium chloride (0.01%) et acétate de chlorhexidine (0.01%). Des solvants appropriés pour la préparation d’une solution; huileuse inclue le glycérol, dilution d’alcool et le glycol propylène. La composition en accord’ avec l’invention présente peut être Administrée par voie parentérale c’est-à-dire par. voie intraveineuse, intra musculaire, intra nasale, sous cutanée, intra rectal, intra vaginal ou intra péritonéale administration. Les formules sous cutanées et intra musculaires de l’administration pariétale sont généralement les plus utilisées. Les formules de dosages appropriées pour de telles administrations doivent être préparées par des techniques conventionnelles. La composition doit également être administrée par inhalation, que ce soit par la voie intra nasale ou par administration inhalatrice orale. Les formules de dosage appropriées pour de telles administrations, comme un aérosol pu un inhalateur à dose mesurée, doivent être préparés avec des techniques conventionnelles.

Pour toutes les méthodes expliquées ici pour les compositions en accord avec l’invention, le régimé de dosage journalier sera de préférence d’environ 0.1 to à 80 mg/kg du poids total, de préférence de 0.2 à. 30 mg/kg, encore mieux de 0.5 mg à 15 mg. Le régime de dosage journalier parentéral d’environ 0.1 à 80 mg/kg du poids total, de préférence environ 0.2 à 30 mg/kg, et encore mieux dé 0.5 mg à 15 mg/kg. Le régime de dosage topique journalier sera de préférence de 0.1 mg à 150 mg, en administrant d’une à quatre doses, de préférence deux à trois fois par jour. Le régime de dosage de l’inhalation sera de préférence d’environ 0.01 mg/kg à environ 1 mg/kg par jour. Il est reconnu par les personnes qualifiées en la matière que la quantité optimale et l’espace des dosages individuels des compositions sera déterminée par la nature et l’étendue de la condition à traiter, la forme, la voie et le site d’administration, et les caractéristiques particulières du patient à traiter, et que de tels optimums peuvent être déterminés de préférence par les méthodes décrites ici. Nous apprécierons, nous les connaisseurs, que le cours optimal du traitement, c’est-à-dire, le nombre de doses des compostions données par pour un nombre défini de jours, peut être vérifié par les personnes qualifiées en utilisant un course de traitement conventionnel de tests de détermination. Le régime de dosage sera déterminé par le médecin traitant et autres facteurs cliniques. Comme il est su dans le monde médical, les dosages pour chaque patient dépendent de nombreux facteurs, incluant la taille du patient, la surface du corps, l’âge, le composé particulier à administrer; le sexe, le temps et la voie de l’administration; la santé générale et autres, médicaments administrés de façon courante. Le progrès peut être contrôlé par un suivi périodique. ' .·.

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Dans un autre mode d’application, la séquence NA ou vecteur de Γinvention, comme décrit ci-dessus, peut-être administré directement à un patient dans le besoin . Ce type d’administration se réfère généralement à une vaccination ADN.Les voies de vaccinations pour l’administration des vaccins de gènes sont bien connus dans le secteur et la vaccination ADN a été utilisée avec succès pour susciter des réponses immunes allo immune, anti-tumeur et anti idiotype (Tighe M. et al., 1998). De plus, l’inoculation avec des molécules d’acide nucléique/ADN ont été reconnues pour être protective dans différents modes de maladies virales (Fynan, et al., 1993; Boyer, 1997; Webster, et al., 1994; Montgomery et al., 1993; Barry, 1995; Xu and Liew, 1995; Zhong et al., 1996; Luke et al., 1997; Mor, 1998; MacGregor et al., 1998). Le codage ADN du peptide de l’invention utilisé dans une composition pharmaceutique comme le vaccin ADN peut-être formulé par ex. sous forme neutre ou sous forme de sel. Des sels pharmaceutiques acceptables, comme des additions de sels acides, et autres, sont connus dans le secteur, les vaccins ADN sont administrés dans des dosages compatibles avec la méthode de formulation, et dans des quantités telles que cela sera effectif au niveau pharmaceutique pour les traitements prophylactiques ou thérapeutiques. De préférence, le vaccin est composé d’un vecteur expression tel qu’il est décrit ci-dessous.

D’habitude, les vaccins sont préparés pour être injectable, soit comme des solutions liquides ou des suspensions; des formes solides adéquates pour la solution ou suspension en liquide préalable à l’injection peut-être également préparée. La préparation peut être émulsifiée ou la protéine peut-être encapsulée dans des liposomes. Les ingrédients immunogène actifs sont souvent mélangés avec des excipients acceptable au niveau pharmaceutique qui sont compatibles avec l’agent actif. Des excipients adéquats mais non limité à de l’eau, saline, dextrose, glycérol, éthanol et autres similaires; des combinaisons de ces excipients en quantités variées peuvent également utilisées. Le vaccin peut également contenir de petites quantités de substances auxiliaires comme le mouillant ou les réactifs émulsifiants, les agents tampons pli , et/ou des adjuvants qui renforcent l’efficacité du vaccin. Par exemple, de tels; adjuvants peuvent inclure de l’hydroxide d’aluminium, N-acétyle-muramyl-L-threonyl-Ddso glutamine (thr-DMP), N-acétÿle-nomuramyl-L-alanyl-D-iso glutamine (CGP 11687, également appelé nor-MDP), N-acetylmuramyul-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanine-2-(l'2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxphaosphoryloxy)-ethiylamine (CGP 19835A, se réfère aussi au MTP-PE), et RIBI (MPL + TDM + CWS) avec 2% émulsion scalène/Tween-80® .

Les vaccins sont généralement administrés par injection intra veineuse ou intramusculaire. Des formulations supplémentaires qui sont adéquates pour d’autres modes d’administration incluent les suppositoires et, dans certains cas, des formulations orales ou nasales. Pour les suppositoires, les liens et porteurs traditionnels peuvent inclure, mais sans s’y limiter, polyalkylène glycols ou triglycérides. La formulation orale inclue des excipients normalement utilités comme, par exemple, des gons pharmaceutiques de mannitol, lactose, amidon, stéarate de magnésium, sodium ,saccharine, cellulose, carbonate de magnésium et autres similaires. Ces compositions peuvent prendre la forme de solutions, de suspensions, de comprimés, de pilules, de capsules, des formulations de libérations ou des poudres et contiennent aux alentours de 10% à approximativement 95% d’ingrédients actif, de préférence de 25% à 70%.

Le peptide de l’invention ou de codage ADN est/ sont administré(s) comme un vaccin d’une manière compatible avec la formulation du dosage, et dans une telle quantité comme le serait le prophylactique et/ou effective au niveau thérapeutique. La quantité à administrer en général est entre 0.2 nanogrammes jusqu’à approximativement 500 microgrammes de peptide ou ADN par dose, et en fonction du sujet à doser, et du degré d’activation immune. Des quantités précises de l’ingrédient actif requis à administrer peuvent également dépendre selon le jugement du médecin et peut-être unique selon chaque sujet. Le peptide ou ADN peut être donné en une dose unique ou multiple . Une dose multiple est celle ou un premier course de vaccination peut être une dose séparée sur dix , suivi d’autres doses données à des intervalles subséquents requis pour maintenir et /ou pour renforcer la réponse immunitaire, par exemple, une semaine à quatre mois pour une seconde dose, et si la personne le demande, des doses subséquentes hebdomadaires ou mensuelles; Le régime de dosage sera également déterminé, au moins en partie par le besoin de l’individu, et dépendra du jugement du médecin. On envisage que le vaccin contenant les composants immuno géniques de l’invention peuvent être administrés conjointement avec d’autres agents immuno régulateurs, par exemple, avec des immunoglobulines ou avec des cytokines.

Dans une forme d’application, la méthode de l’invention se rapporte à une méthode de production de peptide immuno stimulateurs comprenant (a) une mutation de ADN ou un niveau d’acide aminé une molécule ADN codage ou un peptide comprenant la séquence TKDNNLLGRFELXG, wherein X ou T ou S, dans une ou plus nucléotide ou positions d’acide aminés; (b) un test de la réponse de prolifération des cellules NK à la stimulation avec IL-2 et/ou IL-18 conjointement avec le peptide muté; (c) une comparaison de la réponse de prolifération des cellules NK de IL-2 et/ou IL-18 conjointement avec le peptide mute a la réponse de prolifération de ÏL-2 et/ou IL-18 sans le peptide muté ou avec le peptide ayant la séquence citée en (a); (d) une sélection d’un peptide comprenant la séquence mutée ou une molécule de codage recombinant ADN pour un peptide comprenant la séquence mutée, dans , lequel ledit peptide mute affiche une augmentation dans la réponse de prolifération comme il a été comparé dans IL-2 et/ou IL-18 sans le peptide muté ou avec une séquence citée dans (a) dans l’étape (c).

Si les nucléotides sont mütës(c’ést-adire échangés par dés nucléotides qui sont différents ou non différents nucléotides naturellement όύ non naturellement),! 1 est entendu qu’au moins un échange de devrait mener à un échange de niveau d’aciâë arhirié’ Il est généralèment préféré que dans ces peptides, les acides aminés TKDN en positions 450 à 453 (de Hsp70) R en position 458 et S en position 462 sont conservés.

Le terme "réponse de la prolifération des cellules NK " ' utilisé ici se rapporte à la prolifération de la cellule NK ,1a population ' qui peut être déterminée par des essais standards de proliférations. De tels essais comprennent la mesure de l’incorporation de bromodeoxyiiridine (BrdU) ou de thymidine dans le génome cellulaire pendant la S- phase comme il est mentionné dans les exemples ci-dessous. Le pourcentage d’augmentation devrait être au moins de 10%, de préférence au moins 20%, de préférence au moins de 50%. Si la réponse de prolifération du peptide muté est comparé au peptide ayant la séquence citée dans (a),et l’on observe une augmentation, alors on sélectionnera un composant avec une activité de stimulation.

Dans la méthode de l’invention, la séquence ADN peut être mutée sur un peptide et est exprimée dans un hôte recombinant tel que le E. coli, une cellule mammifère ou une autre cellule. Pour cela, la séquence ADN est généralement exprimée dans un vecteur.

Dans une autre méthode, le produit est raffiné par un design fait par oriADNter et/ou des peptidomimétiques.

L’invention se réfère également à une méthode de production d’une composition phai^naçeutique, produit, médical, uni adjuvant médiçal „ou un vaccin comprenant... la formulation d’qn peptide qu une:molécule recombinant-ADN sectionnée par la méthode de l’inyention avec unipprteur pharmaceutique acceptable et /ou.μη diluant. . ! . in v/unci;;;'.. ci k/o tians l'on o’ve rno -i/icUk·;::; „î a L’invention se réfère plus loin à une méthode de production d’une composition pharmaceutique qui comprend une molécule stimulant l’activation des cellules NK comprenant; les pas (a) qui modifient le peptide de l’invention comme, un .composant pour obtenir (i) un site rpodifié d’action, activité de speictrum, spécificité d’qrgane, et/ou (ii); de, puissance améliorée, et/ou (iii.) une toxicité réduite, (indice d’amélioration thérapeutique),et/ou (iv) effets secondaires réduits, et/ou (v) modifiés d’action thérapeutique, durée des effets, et/ou (vi) paramètres pharmakinétiques’ modifiés (résorption^ distribution, métabolisme et excrétion), et/ou (vii) paramètres physicochimiques (solubilité, hygroscopicité, couleur, goût, odeur, stabilité, état),et/ou (viii) spécificité générale améliorée, spécificité dé i’ôfgane/tissüé, ’et/öü (ix) application de la formulé et dé la voié optimiseé par (i) estérification dés groupés de carbdxÿle , ou (ii) esténficâtion des groupës hydroxyle avec des acides de carbone , ou (iii) estérification des groupes hÿdroxyle pour par ex.dcs phosphates, pyrophôsphates ou des sulfates ou ; :n' · =-:ijv·. ; 11 : ; ;k: ; ;' ί, : ‘ .·- '· i\ \ ']' .'i ' ; / y, , ..·.·· ' . 'i ·. i.'-i ; ; i .·% i · : ; : .. . ί, ; i ' 1 , 1: ; i,; :.7 -7,f · ’ 7 ;· î > ; ; ; )!.\si ."(i . : , 1 ' * 1 . ' : ' ‘ ' ' . ’ . . . ' ' : ·. . · : . · .. · . : 7 : ·· : ; : ' .: 1 - ; . - · ' ΙΓ. · : : ’ · · > ·Λ· des succinates hemi, ou la formation des sels pharmaceutiques acceptables (iv), ou (v) la formation de complexes pharmaceutiques acceptables , ou (vi) la synthèse de polymères actifs au niveau pharmaceutique, ou (vii) l’introduction de moitiés hydrophiles , ou (viii) l’introduction/échange de substituants sur les aromates ou les chaînes latérales, changement de modèle sustituant, ou (ix) la modification par introduction de moitiés isostériques ou bioisostériques, ou (x) la synthèse de composants homologués, ou (xi) l’introduction de chaînes latérales ramifiées, ou (xii)la conversion de alkyl substituent à des analogues cycliques, ou (xiii) une dérivation du groupe hydroxyle à des kétales, acétales,our (xiv) N-acétylation d’amides, phénylcarbamates, ou (xv) synthèse de bases de Mannich , imines, ou (xvi) transformation de ketones ou aldéhydes à des bases de Schiffs, oximes, acétales, kétales, énolesters, oxazolidines, thiozolidines ou combinations ; et (b) la formulation du produit de ladite modification avec un porteur pharmaceutique acceptable.

lies différents pas' cités ci-cléssus sont''généralement' corihüs daihs iè secteur. Ils ihclùèht l’action quantitative structure action (QSAR) analyses (Kubinyi, 1993)) biochimie combinatoire, ctiiriïié1 classique ' ét autres (voir, par exemple, Holzgrabe êt Beclitold, 2000)1 Λ.: uu »,·; cp.imes .l.iiemles.

Dans un autre mode de réalisation, Π invention se réfère à une méthode pour produire Une composition pharmaceutique^ un produit médical, ùn adjuvant médical ou un ! vaccin comprenant- la formulation du produit obtenu par la méthode mentionnée éi-dessUs de l’invention avec un porteur pharmaceutique acceptable/ ou un diluant. < > : n '· : -.k: ;s

En .employantes données obtenues avec le peptide de, l’invention, on peut obtenir de nouvelles,substances immunes stimulantes. La,séquence du peptide de l’inyentipn fpumie ici pennet de faire Je, design de molécules modifiées ou alternatives avec une activité immuno stimulante. Une. possibilité est que les substances immuno stimulantes alternatives peuvent être testées sur des cellules naturelles NK .ces substances qui , en co traitement avec IL-2 et/ou 1L-18) stimulant une réponse de prolifération qui est plus grande que la réponse de prolifération de IL-2 et/ou IL-18; seul,' doivent être fonnulées dans des compositions pharmaceutiques pour le développement en aval des substances immuno stimulantes adéquates pour la formulation dans les compositions pharmaceutiques. Les nouvelles substances stimulantes peuvent être plus loin raffinées par les peptidomimétiques ou autrement comme nous le savons , cela dépend de l’objectif médical spécifique ou de la route d’administration ou peut-être préparé comme une protéine de fusion. Les formes citées dans ce paragraphe appartiennent également è l’invention présente.

Les concentrations préférées de of IL-2 et/ou IL-18 sont dans l’ordre de lng - lpg/ml.

Dans la mesure où l’invention se réfère également a une méthode préférée comme nous l’avons commenté plus haut, dans lequel ledit produit est par un re-esign fait par ordinateur et/ou peptidomimétiques. .¾ : ,

Dans un autre mode de réalisation l’invention se réfère à l’usage du peptide de F invention présente la fusion (poly)peptide de l’invention, le poly nucléotide de l’invention, le vecteur de l’invention ou le peptide raffiné par la méthode de l’invention ou d’être formulé dans une. composition pharmaceutique produite par la méthode de l’invention pour la préparation d’une composition pharmaceutique pour l’activation des cellules NK.

Le terme “cellules NK” ("cellules tueuses naturelles") utilisé ici se rapporte aux lymphocèles de grand granulat ayant une expression de surface CD45 et qui ont de plus une activité de cellule tueuse sans stimulation préalable. Les cellules NK sont particulièrement caractérisées par expression de CD16 et/ou par leur susceptibilité à la stimulation de Iriterléukin-2 et/ou n?exprime pas CD3 et/ou n’expriment pas a/ß- γ/δ- T-récepteurs de cellules. . . · , . : . . . ..

Les cellules NK de ^invention présente sont de préférence caractérisées par les caractéristiques suivantes:

Elles sont des adhérences au plastique transitoire après stimulation avec IL-2 dans une dose de 10 à 10.000 unités, par ex 100 unités, IL-2 peuvent être obtenues de Chiron Corp.;

On peut observer les adhérences après 3-18 heures après la stimulation de PBLs préalablement isolés (Peripheral Blood Lymphocytes) avec IL-2.; les cellules NK expriment le CDlôdim (la valeur signifie que la fluorescence est faible); ....

les cellules NK expriment CD56 et CD57 comme des marquers typiques de NK-; les cellules NK expriment CD94 (Ckiller lectine type cellule récepteur); les cellules NK secrétent du IFNgamma après activation de Hsp70 et cytokines; les cellules NK peuvent être activées (croissance et activité cytotoxique) par Hsp70 (protéine purifiée); elles ne dépendent pas du type MHC du patient.

Dans l’ihventiön présente différentes populations de cellules NK peuvent être appliquées. Il est nécessaire, néanmoins, que les cellules NK comme nous les avons caractérisées ici peuvent être activées par le peptide de l’invention. Il est possible d’utiliser dès cellules NK mais dès mélangés contenant différents typés de céllülè comme les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) qui cômpréhnènf aussi des cellules NK puissent également être appliqués.

Dans un mode préféré de réalisation, - la dite activation comprend l’activation de la prolifération des cellules NK et/ou l’activité cytolytique des cellules NK .

Dans un mode, de. réalisation final, l’invention se réfère à l’usage du peptide de l’invention la fusion (poly)peptide de l’invention, le poly nucléotide de l’invention, le vecteur de l’invention du peptide raffiné par la méthode de l’invention ou doit être formulé en une composition pharmaceutique produite par une méthode de l’invention pour la préparation d’Une composition pharmaceutique dans 1 ’immuno thérapie ; et/ou pour le traitement de maladies depuis des carcinomes des poumons, du colon et du rectum, pancréas, larynx, estomac, système nerveux central et périphérique, d’autres carcinomes, sarcomes, leucémie chronique myéloique (CML), leucémie myéloique aigue (AML), leucémie lymphatique aïgue (ALL), Lymphome non Hodgkin (NHL), syndrome myéloproliferatif (MPS), syndrome myélodysplasique (MDS), plasmocytome, autres leucémies, autres maladies malignes, Hsp70 est présent sur la surface des cellules malignes, une infection avec un virus HI, autres infectons virales ou bactériennes Hsp7Q est présent sur la surface des cellules infectées, arthrite rhumatoïde, lupus érythémateux, autres maladies auto immunes, bronchite asthmatique, ou d’autres maladies inflammatoires.

Les schémas montrent :

Schéma 1. Comparaison de la réponse de prolifération des cellules NK contre les peptides Hsp70 . Les cellules NK ont été stimulée soit par IL-2 (100 IU/ml) seul ou par'IL-l plus peptides NLL iS-mer/Figure la), TKD (14-mër,'Figure l b) !et GÎPP (13 mer,· Schéma le) à'des< concentrations1 de 0.02, 0.2, % 4 et Sipg/ml. ; Dans iun, contrôle positif) lés;cellules!NK bnt été stimulées par protéine Hsp70 dans une concentration de 40 pg/rhLiIra réponse proliférative des cellules NK a étémesuré 72 heures après incubation du· peptide et 18 heures de période d’incubation avec 3H thymidine fl pCi/ml);La stimulation avec différents peptides en une concentration de 2pg peptide par ml. est montré dans le schéma ld. Dans le schéma le la stimulation! avec1 TKD dans;üheiéchelle plüs - fine ëhtre 0.1 ef 3 pg est montrée. Le schéma 1 l f montre la stimulation i avec différents1 peptides. Les valeurs sont données au moyen de quatre expériences indépendantes +/- SD.

1 .S :;Chcn:.>< r.h. . '

Schéma 2. L’activité Cytolytique des cellules NK stimulée avec IL-2 seul ou avec IL- 2 plus le peptide TKD 14-mer ou avec IL-2 plus le peptide NLL 8- L’activité A:· Le:·. "d;.>:··- >.K ·: · L LLu;'-·': -vi· <?..·7 ; LL Π n i ί ? î

Cytolytique des cellules NK est soit stimulée avec une faible dose IL-2 (100 IU/ml) seule

soit avec IL-2 plus le peptide TKD 14-mer (2 pg/ml) ou avec IL-2 plus le peptide NLL

8-mer (2 pg/ml) pour 4 jours. Comme les cellules cibles 51Çr marquées ÇX+ (Schéma 2a) et CX- (Schéma 2b) les cellules tumorales, qui diffèrent en rapport avec leur capacité

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ni-llc L;LlL i % Lvl·-* 3' l l ; ·· : î r ; ? ;;n LL !· ! s; î U" i.·* · ! r pour exprimer Hsp70 sur la membrane du plasma, ont été utilisées. Les résultants sont exprimés as le pourcentage d’une analyse spécifiques à des ratios E:T différents allaient de 2:1 jusqu’à 40:1. Le pourcentage de libération spontanée pour chaque ligne de cellule cible de tumeur était de moins de 20%. Une caractérisation phénotypique des cellules NK révèle la chose suivante: les cellules NK plus TKD: CD3, 6%; CD16/56, 79%; les cellules NK plus NLL: CD3, 8%; CD16/56 80%; les cellules NK : CD3, 5%; CD16/56:81%.DLes données représentent une expérience représentative sur trois.

Une meilleure compréhension de l’invention présente et de ses nombreux avantages sera fait avec des exemples suivants, à titre d’illustration.

Exemple 1 Analyse de la cartographie Epitope du Hsp70 spécifique mAb

Auparavant, nous avons montré une localisation inhabituelle de la membrane plasmique de Hsp70 sélectivement sur des cellules tumorales avec le Hsp70 spécifique mAb RPNΓ197 (Multhôi'f et al.,'11995a/b; Bótzléf af al., 1996; Ndülthoff et al., 1997). Cet anticorps a égarement été trouve pour inhiber 1 ’activité cytolytique dé cellules contre lés céHüles tumorales exprimant Hsp70 s (Multhoff et al., 1995bj. En üti 1 isant les mutants dé délétion Hsp70 qui manquent soit de C-ou de N-domàiné terminal de l’épitope contraignant dit mAb RPN1197 pourrait être lócaiisé danà le dbmainé C-tèrrhinàl de liaison dii sùbstràf Hsp7Ô entte àa 428-618 (Botzlér ét al., 1998). En ràison du fait que RPN1197 montre un effet inhibiteur sur l’activité cytolytiquès cellulês hJK' contre les cellules tumorales exprimant Hsp70 , il était intéressant de cartographier l’épitope cöritraigriarit. Pair lé pépscàndudbmairié C-tehninäl de liaisonauseindü substrat àa 384-618 , le peptide NLLüRFEL 8 mer (aa 454-461 ) pourrait être déterminé comme une structure de reconnaissance pertinente le mAb RPN 1197 (Tableau la).

ί.. :¾ î : ] i î :f ï il·.: C î;p; ;/ Cil1,;, ί i =. ‘ * ,ϋ'Ά ;:<·.· m Λ :¾ · Απ;;:ιΓ;:ν:·η·. ;:oo:·, οόο;'· r ; : : : -.: h ·: .Α-οόο iohCC. i -.'H'.' C.: C nvjmbniuc. Γ'ϊ:’> ; ' ; ; :c :.:0 ! !κρ :1 ; si.j ’ ·_'ί.· : ιοό-ίοπι -o' o·':·· cd ok-i s s r···. ί · : = ί i." - ovc; k ! C/dï '--n-'x: : ; : >.j i ;u\h

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Tableau Ia.

Exemple 2 Analyse de la capacité immunostimulante des différentes peptides Hsp70

Une incubation des cellules NK avec des;doses faibles IL-2 (100 IU/ml) et des protéines Hsp 70 recombinantes humaines (rllsp70) ou le domaine exterminai dpV· ,Hsp70hom a été trouvé pour augmenter la réponse proliférative des cellules NK humaines,; en comparaison avec les cellules NK qui ont été stimulées avec IL-2 seulement (Multhoff et al. 1999). Dans un effort pour définir la séquence minimale d’immuno stimulation dans lé domaine C-terminal de Hsp70, trois peptides ont été synthétisés. Sur la base des épitope de liaison à l’anticorps (NLLGRFLL) de RPN1197 mAb, a C- (GIPP) et une N-terminal (TKD) les peptides étendus ont été produits pour les tester dans une norme standard 3H; absorption de dosage thymidine . Lés extensions terminales .Cf· et N- étaient conformes à là séquence primaire de l’homme Hsp70 (Tableau 1 b).

-AU.'1....... Tableau I b. ' :Λ. " l 1J :/λλ ,Λ.>.ί.ν.. ...

Ί .

Nous avons investigué à titre de contrôle interne la capacité de prolifération des cellules NK contre un intact recombinant Hsp70 protéine (rHsp70).Une concentration de 10 pg/ml de rHsp70 a été défini comme une dose de stimulation optimale, (loc. sit). En ce qui concerne le poids moléculaire des diffèrent peptides ,1a concentration qui est équivalente à pg de longueur totale Hsp70 protéine (72 kDa) a été calculée comme 0.2 pg/ml pour TKD (1563 Da) et GIPP (1452 Da) et dans un ordre 0.1 pg/ml pour NLL (942 Da). En ce qui concerne ces résultants tous les peptides ont été testés à un ordre de concentration 0.02 pg jusqu’à 8 pg/ml. Comme il est montré dans le Schéma lie peptide NLL 8-mer et le C-terminal étendu peptide GIPP ne stimule pas la capacité de prolifération des cellules NK de n’importe quelle des concentrations des peptides testés. Néanmoins, le N-terminal étendu le peptide 14-mer TKD montre une capacité d’immuno stimulation comparable comme la longueur totale de la protéine Hsp70 à un ordre de concentration entre 0.2 jusqu’à 2 pg/ml. Cette concentration de peptide est comparable à la concentration de 10 -100 pg/ml de longueur totale de la protéine Hsp70 . La réponse proliférative des cellules T dérivées des mêmes donneurs a également été testée contre les peptides une faible dose IL-2 (100 ÏU/mÎ). Comme nous l’attendions, aucun des trois peptides NLL, GIPP ou TKD ne stimule la croissance de la cellule T dans aucun dès tests de concentration (données non montrés). Néanmoins, des expériences sont en progrès pour investiguer la réponse immune des cellules T contre les complexes qui consistent en une protéine de rHsp70 et les peptides Hsp70 NLL, GIPP, TKD.

Depuis que le TKÖ est apparu pour stimuler l’activité de prolifération des cellules NK , la question s’est posée de savoir si le peptide, similaire à la protéine Hsp70 , stimule également l’activité cytolytique. Le rôle de l’expression de la membrane Hsp70 comme une structure de reconnaissance d’une tumeur spécifique pour l’activité cytolytique dés cellules NK a été démontré avec les sous lignées identiques du carcinome du colon HLA CX+ and CX- qui diffèrent profondément par rapport à leur capacité d’exprimer le Hsp70 sur la membrane plasmique (14). Pans l’étude présente, la réponse cytolytique des cellules NK a stimulé pendant 4 jours soit avec IL-2 seul (100 IU/ml) ou soit avec IL-2 plus NLL ou IL-2 avec un peptide TKD (2 pg/ml) qui étaient comparés. Une caractérisation phénotypique des cellules effectrices a été misé en marche directement avant la stimulation et le jour 4 après stimulation. Les résultats sont montré dans la légende du schéma 2. IL-2 plus les cellules stimulées NK TKD démontrent une activité lytique très renforcée contre le Hsp70 exprimant CX+des cellules tumorales comparées aux cellules NK qui étaient soit stimulées avec IL-2 seul ou soit avec IL-2 plus le peptide NLL . Néanmoins, nous n’avons pas observé de différences significatives dans la lyse des cellules tumorales CX- après stimulation avec n’importe quel peptide. Cette découverte indique que les effets immuno stimulateurs des 14 peptides -mer TKD sur les cellules NK est spécifique à Hsp70 .

Exemple 3 Comparaison de peptides Hsp70 NK stimulants et non stimulants et des séquences de protéines.

Une Comparaison de séquences de peptides stimulants 14-mer (TKD) de Hsp70 (indiqué en gras) avec la région adéquate de Hsp70hom révèle que l’échange d’acide aminé conserve la position 462 de serin ( S ) à thréonine ( T ) comme il est montré dans la Tableau II.

Tableau II.

Les deux protéines Hsp70 et Hsp70hom et le peptide TKD 14-mer sont capable de stimuler les cellules NK le aa à la position 462 semble ne pas être pertinent pour la stimulation des cellules NK. En revanche, l’échange aà conservatrice à la position 458 de arginine (R) à lysine (K) entre Hsp70 et Hsc70 pourrait avoir de l’importance vu que seulement Hsp70 mais pas Hsc70 est capable d’activer les cellules NK. De plus, cet aa échangé pourrait être responsable pour la spécificité du Hsp70 anticorps spécifique RRN1197. Cet anticorps est connu pour réagir avec le Hsp70 mais n’a pas de réaction croisée avec le Hsc70. La seule différence aa de Hsp70 et Hsc70 dans le anticorps 8-mer épitope'(aa 454-460) est l’échange à la position 458 de arginine (R) à lysine (K).

Dans une autre expérience qui a été prévue comme nous le signalons ci-dessus, seulement les peptides ont été testés pour leur capacité pour stimuler les cellules NK, voir le Tableau III, ci-dessous. Toutes ces expériences permettent de conclure que les acides aminés TKDN en postions 450 à 453, R en position 458 et S en position 462 sont cruciales pour l’efficacité du peptide.

'k- aaiaNa-: NK a iVaaa.v· ~ K:’ aa aa.· N;-·.. r-N i; R·; a aaaa I;' u, i·,!. •i.i . l· : a : :!aias ‘‘s ·-.. aa. . : ‘ ,.a < a,.’ a a a./.:: i r.j: a a; ·ι ::l a a

Tableau III

'’.araaa ,a. a: Λ. N1 : î: .a:'··'!··.. .. : : v : ! : aa i a/aaN.::·: Kji/p i ·. : : i···: \ ri'::, ; 'K aaKaN'.··.·.NaK a. ' K " .. aa.N';' N.:/·.. ’ N Ksa' a,\ ' Ïa;N:aN': 'i’nàaaa;· ; !.. ;aa;.: .... : a 1 / TaiNN· {'KN K li-V-K ; a,1.' -, aa / à;.·.

Conclusions

En résumé ces données montrent la preuve que non seulement la longueur de la protéine Hsp70 ou du domaine C-terminal de Hsp70hom soit capable de stimuler la prolifération et l’activité cytolytique des cellules NK contre le Hsp70cellules exprimant la tumeur mais seulement un peptide 14-mer qui est une partie du domaine C-terminal de Hsp70. La séquence du peptide 14-mer est une extension de la N-terminal du 8-mer epitope de Hsp70 anticorps spécifique RPN1197. Ce mAb non seulement détecte le membrane plasmique Hsp70 mais on a également trouvé qu’il inhibe la lyse NK- contre les cellules tumorales positives Hsp70. Ceci est le premier report que les cellules NK peuvent être stimulées par le peptide 14-mer dérivé de la région C-terminal de Hsp70.DRécemment, l’existence des récepteurs spécifiques HSP a été montré pour les cellules qui présentent ·_ <·; des antigènes par des expériences en internalisation « gold-labeled » HSP et par microscope confocal (Amold-Schild et al., 1999; Asea et al., 2000). Sur le plan fonctionnel, nous avons démontré que les r'récepteurs spécifiques Hsp70 pourraient également exister sur des cellules NK (Multhoff et al., 1999). Des recherches sont en progrès pour répondre à la question si le peptide 14-mer dérivée du domaine C-terminal de Hsp70 physiquement interacts avec les récepteurs spécifiques Hsp70 sur les cellules

Des matériaux et Analyses de méthodes de cartographie Epitope L’anticorps monoclonal RPN1197 réagit seulement avec 1’ inductible 72 kDa HSP, et il une réactivité similaire à l’anticorps mentionné par Welch and Suhan (1986). Sa spécifîté a été confirmée par immuno précipitation de la protéine 72 kDa des cellules ayant subi un choc thermique. L’analyse de la cartographie Epitope de mAb RJPN1197 a été réalisée en utilisant des membranes pepspot avec de la peroxydase de raifort et luminol chemiluminescent (Jerini Bio Tools GmbH, Berlin, Germany): La liaison cellulose 13-mer peptides de C-terminal domain de Hsp70 (aa 384-618) qui montre un recouvrement des peptides 11-mer ont été utilisées (Reineke et al., 1996).

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Hsp70 et peptides Hsp70

La protéine humaine Hsp70 recombinante (rHsp70) a été obtenue par StressGen, Victoria, British Columbia, Canada (SPP-755). Les peptides 8-mer, 14-mer et 13-mer NLLGRFEL (NLL), TKDNNLLGRFELS (TKD), NLLGRFELSGIPP (GIPP) ont été produit par le F-synthèse moc (fluorenylmethoxycarbonyl/ t-butyl-based solid-phase peptide chimique méthode sur SMPS 850 (Zinser Analytic) et ABI 488A (Perkin Eimer, Norwalk, Conn.) synthesizers. La pureté des protéines Hsp70 et les peptides Hsp70 a été déterminé par l’essai « Limulus amebeocyte lysate »i (BioWhittaker, Maryland, USA).

Les cellules NK

En bref, les lymphocyte monocyte du sang périphérique dépiété en monocytes (PBL) ont e'te isolés à partir de la couche leucocyte de volontaires en bonne santé (Multhoff et al., 1995a). Les cellules NK ont été purifiées par sélection d’adhérence en suivant un protocole modifié de Vujanovic (1993). Les lymphocytes T restent dans la population celui laire en surnageant.

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Analyse FACS

La mAb fluorescéine conjuguée (CD3 /CD16/CD56 , Becton Dickinson, Heidelberg, Germany) a été directement ajouté aux suspensions cellulaires (0.1 x 106 cellules), incubées pendant 20 min sur la glace, nettoyé et analysé sur un instrument FACScan (Becton Dickinson, Heidelberg, Germany). Le pourcentage des cellules positives colorées a été defirii comme le nombre de couleurs spécifiques, viable (iodure de propidium-négatif) moins le nombre de cellules colorées avec un anticorps contrôle iso typique sur un instrument FACScan (Becton Dickinson, Heidelberg, Germany).

Lignées de cellules tumorales

Les lignées du carcinome du colon CX+ (>90% Hsp70 cellules positives) et CX- (<20% J-Isp70 cellules positives) décrite dans la demande de brevet 08430Ö5EPA2EP -A2-084 300 5 et originalement dérivées de cellules de carcinome du colon GX2 (Tumorzentrum Heidelberg, TZB 610005; Allemagne) qui diffère ,par rapport à leur capacité d’expfimer le Hsp70 sur leur membrane de plasmique ont été mis sous culture à 37°C, 5% CO2 dans du RPMI-1640 (Gibco, Eggenstein, Allemagne) avec en plus Γinactivation de la chaleur à 10% FCS (Gibco) et 2 mM L-glutamine et des antibiotiques (pénicilline/streptomycine). Les lignées cellulaires ont été maintenues en culture sous des conditions de croissance exponentielles, et récoltées avec une solution de trypsine/EDTA . Les expériences ont été faites entre le passage 10-30.Toutes les lignées cellulaires étaient libres de contamination par mycoplasmes comme nous l’avons déterminé avec plusieurs tests en utilisant les 6 dosages -méthylpurine désoxyribose (Boehringer Mannheim, Allemagne).

3H thymidine essai

La capacité proliférative de NK et des cellules T contre différents peptides Hsp70 et la protéine Hsp70 (loc. sit) a été déterminée dans un essai standard 3H thymidine (22). Des cellules viable (5 x 104 cellules/100 μΐ) ont été ensemencées dans des micrbplaques 96 puit fond en U (Greiner Nuertingen, Allemagne) alors complétée dans RPMI-1640 contenant 100 IU IL-2 et la protéine Hsp70 (10 pg/ml) ou différentes quantités de peptides Hsp70 de l’ordre de 0.02 à 10 pg/ml. Au cours d’un contrôle interne la prolifération contre IL-2 seul a été mesurée en parallèle. Après 24 ou 48 heures d’incubation les cellules furent pulsée avec de la 3H thymidine (1 pCi/puits) et le total a été mesuré après une incubation de 18 heures à 37°C dans un compteur à scintillation liquide (Beckmann instruments, Munich, Allemagne).

Essai cellules par médiation de lymphose (CML) L’activité cytolytique des cellules NK a été contrôlée dans un essai standard 5lCr (23).

Les dilutions des cellules effectrices ont été incubées avec 51Cr-labeled (100 pCi of '.H ’· tï'vriudiî:;;îù;.î

Na5lCr04, NEN-Dupont, Boston, MA) cellules cible tumorales (3 x 103 cellules par puits) en dupïicatat dans un volume final de 200 pl RPMI-1640 ajouté de 10% FCS à 37°C pendant 4 heures dans un puits microplaques 96 fond en U (Greiner, Nuertingen, Allemagne). Après la période d’incubation, les surnageants ont été ramassés et la radioactivité a été comptée dans un compteur γ- (Packard Instruments). Le pourcentage de lysé spécifique a été déterminé selon 'l’équation: (dissémination expérifnentale-libération spontanée) / (libération maximale - libération spontanée) x 100. Le : i i -. ! · : ! ί ,'î1 . i.- \l ' m - i i , ·.: Ap;V· A- l’i· -AH l'iOUi-.

pourcentage -de libération a toujours été de <15% pour chaque ligriée cellulaire cible.

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Claims

1. Peptide constitué de 30 acides aminés ou moins, ledit peptide comprenant (a) la séquence d'acides aminés TKDNNLLGRFELXG, dans laquelle X représente T ou S, ou (b) une séquence d'acides aminés qui diffère de la séquence d'acides aminés de (a) par une substitution d'acides aminés, où les acides aminés TK.DN et X tels que définis en (a) sont conservés, et où ledit peptide stimule l'activité des cellules NK (cellules tueuses naturelles).

2. Peptide selon la revendication 1, comprenant en outre la séquence d'acides aminés EGERAM à l'extrémité N-terminale.

3. (Poly)peptide de fusion comprenant le peptide selon la revendication 1 ou 2.

4. Polynucléotide codant pour le peptide selon la revendication 1 ou 2 ou pour le polypeptide de fusion selon la revendication 3.

5. Polynucléotide selon la revendication 4 qui est un ADN. \b'; '-i'-c sJ a ci A:·' aci.cm o i L î c de mcuciU,;.: k;:.:s crrmk;:· iic

6. Vecteur comprenant ΓADN selon la revendication 5.

7. Composition contenant le peptide selon la revendication 1 ou 2, le (poly)peptide de fusion selon la revendication 3, le polynucléotide selon la revendication 4 ou 5, ou le vecteur selon la revendication 6 et un véhicule et/ou diluant pharmaceutiquement acceptable.

8. Composition selon la revendication 7 qui est une composition pharmaceutique, un produit médical, un adjuvant médical ou un vaccin. d .-‘él cl(k' scie·,! d: i /·, '7 }'·..

9. Composition selon la revendication 7 ou 8, contenant en outre de l'interleukine-2 et/ou de l'interleukine-18.

10. Procédé de production d'un peptide immunostimulateur, comprenant (a) la mutation, au niveau de l'ADN ou des acides aminés, d'une molécule d'ADN codant pour ou d'un peptide comprenant la séquence TKDNNLLGRFELXG, dans laquelle X représente T ou S, sur une ou plusieurs positions de nucléotides ou d'acides aminés ; (b) l'exploration de la réponse proliférative des cellules NK à une stimulation avec IL-2 et/ou IL-18 conjointement avec le peptide muté ; (c) la comparaison de la réponse proliférative des cellules NK à IL-2 et/ou IL-18 conjointement avec le peptide muté, à la réponse proliférative à IL-2 et/ou IL-18 sans le peptide muté ou avec un peptide ayant la séquence mentionnée en (a) ; (d) la sélection d'un peptide comprenant la séquence mutée ou d'une molécule d'ADN recombinante codant pour un peptide comprenant la séquence mutée, ledit peptide muté présentant une augmentation de la réponse proliférative par rapport à IL-2 et/ou IL-18 sans le peptide muté ou avec un peptide ayant la séquence mentionnée en (a) dans l'étape (c).

11. Utilisation du peptide selon la revendication 1 ou 2 en tant que principal composé dans un procédé de production d'une composition pharmaceutique destinée à stimuler l'activation des cellules NK.

12. Utilisation du peptide selon la revendication 1 ou 2, du (poly)peptiide de fusion selon la revendication 3, du polynuçléotide selon la revendication 4 ou 5, ou du vecteur selon la revendication 6, et d'un véhicule et/ou diluant pharmaceutiquement acceptable, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à l'activation des cellules NK.

13. Utilisation selon la revendication 12, dans laquelle ladite activation comprend l'activation de la prolifération des cellules NK et/ou de l'activité cytolytique des cellules NK.

14. Utilisation du peptide selon la revendication 1 ou 2, du (poly)peptide de fusion selon la revendication 3, du polynucléotide selon la revendication 4 ou 5, ou du vecteur selon la revendication 6, et d'un véhicule et/ou diluant pharmaceutiquement acceptable, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être utilisée en immunothérapie et/ou pour le traitement de maladies sélectionnées parmi les cancers et carcinomes du poumon, du côlon et du rectum, du pancréas, du larynx, de l'estomac, du système nerveux central et périphérique, d'autres carcinomes, les sarcomes, la leucémie myéloïde chronique (LMC), la leucémie myéloïde aiguë (LMA), la leucémie lymphoblastique aiguë (LLA), les lymphomes non hodgkiniens (LNH), le syndrome myéloprolifératif (SMP), le syndrome myélodysplasique (SMD), le plasmocytome, d'autres leucémies, d'autres maladies malignes, dans lesquelles Hsp70 est présente à la surface des cellules malignes, une infection par un virus IH, d'autres infections bactériennes ou virales dans lesquelles Hsp70 est présente à la surface des cellules infectées, la polyarthrite rhumatoïde, le lupus érythémateux disséminé, d'autres maladies auto-immunes, l'asthme bronchique, ou d'autres maladies inflammatoires. , -.Ô'· ί : 11. ;y. : ,·..·^. ü'riu. : ; a --n î < ‘‘ î”i : i! ·. ' J. ,· . : ν·-'.ί.· ·.;' î ; ; ; n ; ! ; ù i τ i " ; :ίΠΚ O; „ > i · -poui ic :i , i ;; . -[ ,v\:: ;ül· Os ·. ;:i ; i 1 ; u n v.'·:: d ·. : po v! î π > : . ' ! : .· ; IV. 1 ; \ l'.i' ,· ; .J ’ ! IC k W , ü - y m ..· VîH! ·-:(’· '· ' i pi ,wï'. îk.,· · . .' - j = > .Ή;. : ' ' ; k. p/i i : i ' . ·\ i ! i K; !. : :,r · s :. .'.·: . ; : ί ; ί : .'i ,ï S ·.·. /κί;γ· iM/:, n1 : .: . :.;v Κ,ηλ ·· ’· s a y iSVi)y U.* i·· .k. ' ·; ·. i i · ·. , .. ,v m . .y! kk, · :..,1..0 . ; , ’ ' , ! 1 , . ^ , [ [ , _