BE1023213B1

BE1023213B1 - Complexes issus du cytomegalovirus et leurs utilisations

Info

Publication number: BE1023213B1
Application number: BE2015/5327A
Authority: BE
Inventors: Andrea Carfi; Sumana Chandramouli; Claudio Ciferri; Rachel GERREIN; Ethan Settembre; Yingxia Wen
Original assignee: Glaxosmithkline Biologicals Sa
Priority date: 2014-05-27
Filing date: 2015-05-26
Publication date: 2016-12-21
Also published as: AR100608A1; WO2015181142A1; BE1023213A1

Abstract

Cette divulgation concerne des protéines gL modifiées du cytomégalovirus (CMV) et des complexes comprenant des protéines gL, en particulier des complexes pentamères comprenant gH, gL, pUL128, pUL130, pUL131. La divulgation concerne également des méthodes de purification des complexes pentamères et de réduction des complexes dimères contaminants constitués par gH et gL. Les utilisations des complexes pentamères dans des compositions immunogènes et des vaccins sont en outre décrites.

Description

COMPLEXES ISSUS DU CYTOMEGALOVIRUS ET LEURS UTILISATIONS DOMAINE TECHNIQUE

Cette invention relève du domaine des vaccins à cytomégalovirus (CMV).

CONTEXTE

Le cytomégalovirus est un genre de virus qui appartient à la famille virale connue sous le nom des Herpesviridae ou des herpèsvirus. L'espèce qui infecte l'homme est couramment connue sous le nom de cytomégalovirus humain (HCMV) ou herpèsvirus-5 humain (HHV-5). Dans la famille des Herpesviridae, le HCMV appartient à la sous-famille des Bêta-herpesviridae, qui comprend également des cytomégalovirus provenant d'autres mammifères.

Bien qu'on puisse les trouver dans tout le corps, les infections à HCMV sont fréquemment associées aux glandes salivaires. Le HCMV infecte entre 50 et 80 % des adultes aux Etats-Unis (40 % dans le monde), comme en atteste la présence d'anticorps chez une grande proportion de la population. L'infection à HCMV passe typiquement inaperçue chez les personnes saines, mais peut s'avérer mortelle chez les immunocompromis, tels que les personnes infectées par le VIH, les receveurs de greffes d'organes, ou les nouveau-nés. Le HCMV est le virus le plus fréquemment transmis à un foetus en cours de développement. Après infection, le HCMV peut rester latent dans le corps pendant toute la durée de vie de l'hôte, et sortir de sa latence au cours de réactivations occasionnelles. Compte tenu de la sévérité et de l'importance de cette maladie, l'obtention d'un vaccin efficace est considérée comme une priorité de santé publique absolue (Sung, H., et al., (2010) Expert review of vaccines 9, 1303-1314 ; Schleiss, Expert Opin Ther Pat. Apr 2010 ; 20(4) : 597-602).

Les génomes de plus de 20 souches différentes du HCMV ont été séquencés, y compris des souches de laboratoire et des isolats cliniques. Par exemple, les souches suivantes du HCMV ont été séquencées : Towne (GL239909366), AD169 (GI: 21987 9600), Toledo (GL290564358) et Merlin (GI: 155573956). Les souches AD169, Towne et Merlin du HCMV peuvent être obtenues auprès de 1'American Type Culture Collection (ATCC VR538, ATCC VR977 et ATCC VR1590, respectivement).

Le CMV contient un nombre inconnu de complexes protéiques membranaires. Sur les environ 30 glycoprotéines connues dans l'enveloppe virale, gH et gL ont émergé de manière particulièrement intéressante en raison de leur présence dans plusieurs complexes différents : dimère gH/gL, trimère gH/gL/gO (également connu sous le nom de complexe gCIII), et pentamère gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131 (pUL131 est également appelé "pUL131A", "pUL131a", ou "UL131A" ; et les sous-unités pUL128, pUL130, et pUL131 sont également parfois appelées UL128, UL130, UL131) . On pense que le CMV utilise les complexes pentamères pour pénétrer dans les cellules épithéliales et endothéliales par endocytose et fusion pH bas-dépendante mais on pense qu'il pénètre dans les fibroblastes par fusion directe au niveau de la membrane plasmatique dans un processus impliquant gH/gL ou éventuellement gH/gL/gO. Les complexes gH/gL et/ou gH/gL/gO suffisent pour infecter les fibroblastes, tandis que le complexe pentamère est requis pour infecter les cellules endothéliales et épithéliales.

Le complexe pentamère est considéré comme une cible majeure pour la vaccination contre le CMV. Les gènes viraux UL128, UL130 et UL131 sont requis pour l'entrée endothéliale (Hahn, Journal of Virology 2004 ; 78:10023-33). Les souches tropiques non endothéliales adaptées aux fibroblastes contiennent des mutations dans au moins un de ces trois gènes. La souche Towne, par exemple, contient une insertion de 2 paires de bases provoquant un décalage du cadre de lecture dans le gène UL130, tandis qu'AD169 contient une insertion d'une seule paire de bases dans le gène UL131. Les souches Towne et AD169 ont pu toutes les deux être adaptées pour la croissance dans des cellules endothéliales, et dans les deux cas, les mutations par décalage du cadre de lecture dans les gènes UL130 ou UL131 ont été réparées. US7704510 décrit que pUL131A est requis pour le tropisme des cellules épithéliales. US7704510 décrit également que pUL128 et pUL130 forment un complexe avec gH/gL, qui est incorporé dans des virions. Ce complexe est requis pour infecter les cellules endothéliales et épithéliales mais pas les fibroblastes. Des anticorps anti-CD46 se sont avérés inhiber l'infection par le HCMV des cellules épithéliales.

Les vaccins contre le CMV testés dans des essais cliniques comprennent le vaccin Towne, les chimères Towne-Toledo, un réplicon d'alphavirus avec gB à titre d'antigène, le vaccin gB/MF5 9, un vaccin gB produit par GlaxoSmithKline, et un vaccin à ADN utilisant gB et pp65, pp65 étant une protéine virale qui est un puissant inducteur des réponses en CD8+ dirigées contre le CMV. Ces vaccins sont de piètres inducteurs d'anticorps qui bloquent l'entrée virale dans les cellules endothéliales/épithéliales (Adler, S. P. (2013),

British Medical Bulletin, 107, 57-68. doi: 10.1093/bmb/ldt023) .

Des études animales précliniques sur les vaccins contre le CMV comprennent une souche AD169 inactivée qui a été réparée dans le gène UL131, un vaccin à ADN utilisant un gène UL130 de type sauvage et des vaccins peptidiques utilisant des peptides provenant de pUL130 et 131 (Sauer, A, et al., Vaccine 2011 ; 29:2705-1. doi: 10.1016) . L'antigène gB du CMV est considéré comme un piètre inducteur d'anticorps qui bloquent l'entrée dans les cellules endothéliales/épithéliales. Dans un essai clinique en Phase II, le vaccin gB/MF59 a démontré une efficacité de seulement 50 % dans la prévention de la primo-infection chez des jeunes femmes ayant un enfant à domicile (Pass, RF, et al., N Engl J Med 2009 ; 360 :1191-9) .

De manière générale, on pense que les anticorps neutralisants dirigés contre le complexe pentamère (gH/gLpUL128/pUL130/pULl31) seront significativement plus puissants que les anticorps neutralisants dirigés contre la sous-unité gB du CMV, ou le complexe dimère gH/gL. Par conséquent, un complexe pentamère purifié serait utile à titre d'antigène pour des applications diagnostiques, et à titre d'immunogène pour des vaccins contre le CMV.

Un des problèmes pour obtenir un complexe pentamère du CMV purifié est la présence de dimères gH/gL contaminants. Les anticorps neutralisants dirigés contre les dimères gH/gL étant beaucoup moins puissants comparés à ceux dirigés contre le pentamère, il existe un besoin en termes de développement de techniques pour obtenir un pentamère de CMV purifié renfermant une quantité réduite de dimères gH/gL contaminants.

RESUME DE L'INVENTION

Les inventeurs ont découvert que, quand le complexe pentamère (gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131) est exprimé par des techniques recombinantes et purifié, une quantité substantielle de dimères gH/gL contaminants se forme. Les dimères gH/gL contaminants réduisent l'efficacité des vaccins à pentamères, dans la mesure où l'on estime que les anticorps neutralisants dirigés contre les pentamères sont 100 fois plus puissants que ceux dirigés contre les dimères gH/gL.

Pour résoudre ce problème, l'invention propose des compositions et des procédés de production d'un complexe pentamère gH/gL/pUL128/pUL130/pULl31 renfermant une quantité significativement réduite de complexes dimères gH/gL contaminants.

Selon un aspect, l'invention propose une protéine gL modifiée du CMV qui interfère avec la formation des dimères gH/gL. De manière surprenante, la modification réduit la formation du dimère gH/gL sans affecter significativement la formation du pentamère gH/gL/pUL128/pUL130/pULl31. Les complexes pentamères obtenus à l’aide des protéines gL modifiées ont des propriétés qui ne sont pratiquement pas différentes du pentamère formé par la gL de type sauvage. Dans des modes de réalisation particuliers, les protéines gL modifiées portent des modifications d’acides aminés sur les résidus d’acides aminés correspondant à Cys47 de SEQ ID No : 1, Cys54 de SEQ ID No : 1, ou Cysl44 de SEQ ID No : 1 .

Selon un autre aspect, l’invention propose une méthode de purification du complexe pentamère du CMV comprenant gH, gL, pUL128, pUL130 et pUL131 (ou un fragment formant complexe de chacune de ces sous-unités) par chromatographie par échange d’ions.

Selon un autre aspect, l’invention propose une méthode de purification du complexe pentamère du CMV comprenant gH, gL, pUL128, pUL130 et pUL131 (ou un fragment formant complexe de chacune de ces sous-unités) par chromatographie d’affinité. L’invention propose également des protéines gL du CMV et des complexes protéiques du CMV pouvant être utilisés pour induire une réponse immunitaire chez un sujet. L’invention propose en outre des protéines gL du CMV et des complexes protéiques du CMV pouvant être utilisés dans la fabrication d’un médicament destiné à induire une réponse immunitaire chez un sujet.

BREVE DESCRIPTION DES DESSINS

Les FIG. 1A-1D montrent que les mutations sur Cys47 et Cys54 ont efficacement éliminé les dimères gH/gL du complexe pentamère. La FIG. IA montre qu'une quantité substantielle de dimères gH/gL contaminants (formes monomères et formes dimères) s'était formée, comme illustré dans le gel Coomassie non réduit. La FIG. IB montre que les dimères gH/gL contaminants (formes dimères, notamment) n'ont pas pu être éliminés par la colonne d'exclusion de tailles, dans la mesure où ils ont été co-élués avec le pentamère. La FIG. IC montre les résultats d'études de mutagenèse. Les cystéines en position 47, 54, 144, 154, 159, et 233 dans gL ont été mutées en Ser, respectivement. Parmi ces mutations, les mutants Cys47, Cys54, et Cysl44 ont réduit la contamination par le dimère gH/gL, permettant ainsi la purification du pentamère. Quand elles sont co-exprimées avec la gH et les sous-unités pUL128-131, les protéines ont formé un complexe pentamère stable. La FIG. 1D est un graphique de chromatographie SEC montrant que le mutant gL incorporant le complexe pentamère (C54S) peut se lier à des anticorps neutralisants comme le complexe pentamère de type sauvage.

La FIG. 2 montre que le mutant gL incorporant le complexe pentamère (C54S, carrés vides et pleins) a suscité une réponse immunitaire chez la souris Balb C, similaire à celle suscitée par le pentamère de type sauvage (cercles vides et pleins) . Dans cette expérience, 1 pg de complexe pentamère de type sauvage soluble ou de complexe pentamère mutant C54S a été formulé avec MF59. Les protéines formulées ont été utilisées pour immuniser des souris Balb C (5 animaux par groupe) trois fois aux jours 0, 21, et 42. Des échantillons de sang ont été collectés par phlébotomie rétro-orbitaire (RO) 3wpl, 3wp2, et 3wp3. Les titres de neutralisation ont été déterminés à l'aide de la souche VR1814 du CMV sur des cellules ARPE19, et les titres de liaison spécifique du pentamère ont été déterminés par ELISA. 3wpl : 3 semaines après la lere vaccination ; 3wp2 : 3 semaines après la 2eme vaccination ; 3wp3 : 3 semaines après la 3ème vaccination.

DESCRIPTION DETAILLEE

1 . GENERALITES

Comme décrit et illustré dans la présente, un des problèmes pour obtenir un complexe pentamère du CMV purifié est la présence de dimères gH/gL contaminants. Les inventeurs ont découvert que, lors de l'expression et de la purification du complexe pentamère, il se formait une quantité significative de dimères gH/gL contaminants. Dans une méthode de purification typique, les dimères gH/gL contaminants représentaient environ 10-20 % de la quantité totale des complexes purifiés. Dans un montage expérimental particulier, la quantité de dimères gH/gL s'élevait jusqu'à 40-50 %. Les dimères gH/gL existent à la fois sous forme de dimères "monomères" (dimères constitués par une sous-unité gH et une sous-unité gL), ou de dimères "dimères" (deux dimères "monomères" s'associent l'un à l'autre, pour former un complexe constitué par deux copies de la sous-unité gH et deux copies de la sous-unité gL) .

La présence des dimères gH/gL contaminants est indésirable. Les inventeurs ont surmonté ce problème par trois stratégies différentes. Premièrement, les inventeurs ont identifié trois mutations dans la sous-unité gL, sur Cys47, Cys54, ou Cysl44, susceptibles d'interférer avec la formation du dimère gH/gL. De manière surprenante, les protéines gL mutantes n'interfèrent pratiquement pas avec la formation du pentamère gH/gL/pUL128/pUL130/pULl31. En effet, les complexes pentamères obtenus à l'aide des protéines gL mutantes ont des propriétés qui ne sont substantiellement pas différentes de celles des pentamères formés par la gL de type sauvage. En utilisant cette méthode, des quantités importantes de complexe pentamère peuvent être purifiées, à une contamination gH/gL pratiquement indétectable.

Deuxièmement, les inventeurs ont utilisé une méthode d'échange de cations pour purifier le complexe pentamère, et ont éliminé avec succès les dimères gH/gL contaminants jusqu'à un niveau indétectable.

Troisièmement, en attachant une étiquette Strep sur la région C-terminale de la sous-unité pUL130, et en utilisant la purification d'affinité, les inventeurs ont obtenu un pentamère sensiblement homogène en une seule étape. Là encore, la contamination gH/gL était pratiquement indétectable après purification.

Par conséquent, selon un aspect, l'invention concerne une protéine gL modifiée provenant du CMV qui favorise la formation du pentamère gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131, et/ou défavorise la formation du dimère gH/gL. Dans certains modes de réalisation, en présence de quantités molaires sensiblement égales des protéines gH, gL, pUL128, pUL130, et pUL131 du CMV (ou d'un fragment formant complexe de chacune de ces sous-unités) , au moins 90 % des molécules de la protéine gL, ou du fragment formant complexe de celle-ci, forment un complexe pentamère comprenant gH, gL, pUL128, pUL130, et pUL131 (ou un fragment formant complexe de chacune de ces sous-unités). Dans certains modes de réalisation, en présence de quantités molaires sensiblement égales des protéines gH, gL, pUL128, pUL130, et pUL131 du CMV (ou d'un fragment formant complexe de chacune de ces sous-unités), pas plus de 10 % des molécules de la protéine gL, ou du fragment formant complexe de celle-ci, forment un complexe dimère constitué par gH et gL (ou un fragment formant complexe de chacune de ces sous-unités). Dans certains modes de réalisation, la modification dans gL réduit la quantité des complexes dimères constitués par gH et gL (ou un fragment formant complexe de chacune de ces sous-unités) d'au moins 50 %, par rapport à une protéine gL, ou à un fragment formant complexe de celle-ci, sans ladite modification d'acide aminé.

Selon un autre aspect, l'invention concerne une méthode de purification du complexe pentamère du CMV à partir d'un échantillon par chromatographie d'échange d'ions. La méthode comprend : (i) l'utilisation d'un échantillon comprenant le mélange suivant : (a) complexe pentamère comprenant gH, gL, pUL128, pUL130, et pUL131 (ou un fragment formant complexe de chacune de ces sous-unités), et (b) complexe dimère constitué par gH et gL (ou un fragment formant complexe de chacune de ces sous-unités) ; (ii) le passage dudit échantillon dans une colonne de chromatographie d'échange d'ions ; et (iii) la collecte de la fraction qui comprend ledit complexe pentamère à partir de la colonne d'échange d'ions. Les méthodes décrites ici peuvent donner un produit purifié dans lequel : (i) pas plus de 10 % des complexes protéiques obtenus par purification par affinité sont des complexes dimères constitués par gH et gL (ou un fragment formant complexe de chacune de ces sous-unités) ; ou (ii) au moins 90 % des complexes protéiques obtenus par purification par affinité sont des complexes pentamères comprenant les protéines gH, gL, pUL128, pUL130, et pUL131 du CMV (ou un fragment formant complexe de chacune de ces sous-unités) .

Selon un autre aspect, l'invention concerne une méthode de purification du complexe pentamère du CMV qui comprend les protéines gH, gL, pUL128, pUL130, et pUL131 du CMV (ou un fragment formant complexe de chacune de ces sous-unités) comprenant : (i) l'utilisation d'un échantillon comprenant le mélange suivant : (a) complexe pentamère comprenant gH, gL, pUL128, pUL130, et pUL131 (ou un fragment formant complexe de chacune de ces sous-unités), et (b) complexe dimère constitué par gH et gL (ou un fragment formant complexe de chacune de ces sous-unités), dans laquelle une étiquette de purification par affinité est attachée à l'un des sites suivants : (i) région C-terminale de pUL130, (ii) région N-terminale de pUL130, (iii) région C-terminale de pUL131, (iv) région N-terminale de pUL131, (v) région C-terminale de pUL128, (vi) région N-terminale de pUL128, ou une combinaison de ceux-ci, ladite étiquette de purification par affinité se liant spécifiquement à un partenaire de liaison ; (ii) la purification dudit complexe pentamère par une matrice de chromatographie d'affinité, ladite matrice de chromatographie d'affinité comprenant ledit partenaire de liaison immobilisé sur un support solide. Les méthodes décrites ici peuvent donner un produit purifié dans lequel : (i) pas plus de 10 % des complexes protéiques obtenus par purification d'affinité sont des complexes dimères constitués par gH et gL (ou un fragment formant complexe de chacune de ces sous-unités) ; ou (ii) au moins 90 % des complexes protéiques obtenus par purification d'affinité sont des complexes pentamères comprenant les protéines gH, gL, pUL128, pUL130, et pUL131 du CMV (ou un fragment formant complexe de chacune de ces sous- unités) .

Les trois stratégies (modification de la gL, purification par échange d'ions, et affinité) peuvent être utilisées individuellement, ou dans une combinaison quelconque, pour obtenir le complexe pentamère purifié. L'invention concerne également des complexes purifiés comprenant les protéines gH, gL, pUL128, pUL130, et pUL131 du CMV (ou un fragment formant complexe de chacune de ces sous- unités) , et des méthodes d'utilisation des complexes pentamères purifiés. 2. Proteines gL modifiées du CMV et complexes A. Protéines gL modifiées

Selon un aspect, l'invention concerne une protéine gL modifiée du CMV, ou un fragment formant complexe de celle-ci, qui réduit la formation du dimère gH/gL contaminant.

La protéine gL décrite ici, ou un fragment formant complexe de celle-ci, porte une modification d'acide aminé telle, qu'en présence de quantités molaires sensiblement égales de protéines gH, gL, pUL128, pUL130, et pULl31 du CMV (ou d'un fragment formant complexe de chacune de ces sous- unités) : (i) au moins environ 80 % (de préférence environ 90 %) des molécules gL, ou du fragment formant complexe de celles-ci, forment un complexe pentamère comprenant gH, gL, pUL128, pUL130, et pUL131 (ou un fragment formant complexe de chacune de ces sous-unités) ; (ii) pas plus d'environ 20 % (de préférence environ 10 %) des molécules gL, ou du fragment formant complexe de celles-ci, forment un complexe dimère constitué par gH et gL (ou un fragment formant complexe de chacune de ces sous-unités) ; ou (iii) ladite modification d'acide aminé réduit la quantité des complexes dimères constitués par gH et gL (ou un fragment formant complexe de chacune de ces sous-unités) d'au moins environ 30 % (de préférence 50 %) , par rapport à une protéine gL, ou à un fragment formant complexe de celle-ci, sans ladite modification d'acide aminé.

La glycoprotéine L (gL) du CMV humain est codée par le gène UL115. On pense que la gL est essentielle pour la réplication virale et que toutes les propriétés fonctionnelles connues de la gL sont directement associées à sa dimérisation avec la gH. Le complexe gH/gL est requis pour la fusion des membranes virale et plasmatique permettant l'entrée du virus dans la cellule hôte. Il a été rapporté que la gL provenant de la souche Merlin du HCMV (GI: 39842115, SEQ ID No : 1) et de la souche Towne du HCMV (GI : 239909463, SEQ ID No : 2) ont une

longueur de 278 acides aminés. Il a été rapporté que la gL provenant de la souche AD169 du HCMV (GI:2506510, SEQ ID No : 3) a une longueur de 278 acides aminés, comprend une séquence signal à son extrémité N-terminale (résidus d'acides aminés 1-35), a deux sites de N-glycosylation (aux résidus 74 et 114) et est dépourvue du domaine TM (Rigoutsos, I, et al., Journal of Virology 77 (2003) : 4326-44). La séquence signal à l’extrémité N-terminale de SEQ ID No : 1 devrait comprendre les résidus d'acides aminés 1-30. SEQ ID No : 2 partage une identité d’acides aminés de 98 % avec SEQ ID No : 1. Le séquençage du gène gL pleine longueur provenant de 22 à 39 isolats cliniques, ainsi que des souches de laboratoire AD169, Towne et Toledo a révélé une variation inférieure à 2 % dans les séquences d’acides aminés parmi les isolats (Rasmussen, L, et al., Journal of Virology 76 (2002) : 10841-10888).

Typiquement, la séquence signal à l’extrémité N-terminale des protéines gL est clivée par la peptidase signal de la cellule hôte pour produire des protéines gL matures. Les protéines gL dans les complexes membranaires du HCMV selon l’invention peuvent être dépourvues de séquence signal N-terminale. Un exemple de protéine gL dépourvue de séquence signal N-terminale est SEQ ID No : 4, qui est dépourvue de séquence signal et est constituée par les résidus d'acides aminés 31-278 de SEQ ID No : 1.

Bien que l’on pense que la gL soit essentielle pour la réplication virale, toutes les propriétés fonctionnelles connues de la gL sont directement associées à sa dimérisation avec la gH.

Les protéines gL selon l’invention peuvent être des variants de gL présentant divers degrés d’identité avec SEQ ID No : 1 comme par exemple une identité d’au moins 60, 70, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 % avec la séquence indiquée dans SEQ ID No : 1, SEQ ID No : 2, ou SEQ ID No : 3. Les protéines gL selon l'invention peuvent présenter divers degrés d'identité avec SEQ ID No : 4 comme par exemple une identité d'au moins 60, 70, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 % avec la séquence indiquée dans SEQ ID No : 4. Dans certains modes de réalisation, les variants de la protéine gL : (i) ne forment pas de quantités importantes de complexes dimères avec gH ; (ii) font partie du complexe trimère gH/gL/gO ; (iii) font partie du complexe pentamère gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131 ; (iv) comprennent au moins un épitope provenant de SEQ ID No : 1, SEQ ID No : 2, SEQ ID No : 3, ou SEQ ID No : 4 ; et/ou (v) peuvent déclencher la production d'anticorps in vivo qui ont des réactions immunologiques croisées avec un virion du CMV.

Les fragments formant complexe des protéines gL décrites ici font également partie de l'invention. Un fragment formant complexe de gL peut être toute partie ou portion de la protéine gL qui conserve l'aptitude à former un complexe avec d'autres protéines du CMV. Dans certains modes de réalisation, un fragment formant complexe de gL fait partie du complexe pentamère gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131. Un fragment formant complexe de gL peut être obtenu ou déterminé par des dosages standards connus dans l'état de la technique, tels que le dosage par co-immunoprécipitation, la réticulation, ou la colocalisation par coloration fluorescente, etc. Dans certains modes de réalisation, le fragment formant complexe de gL (i) comprend également au moins un épitope provenant de SEQ ID No : 1, SEQ ID No : 2, SEQ ID No : 3, ou SEQ ID No : 4 ; et/ou (ii) peut également déclencher la production d'anticorps in vivo qui ont des réactions immunologiques croisées avec un virion du CMV.

Dans certains modes de réalisation, la protéine gL décrite ici, ou un fragment formant complexe de celle-ci, porte une modification d'acide aminé telle, qu'en présence de quantités molaires sensiblement égales de protéines gH, gL, pUL128, pUL130, et pUL131 du CMV (ou d'un fragment formant complexe de chacune de ces sous-unités), au moins environ 80 % des molécules gL, ou du fragment formant complexe de celles-ci, forment un complexe pentamère comprenant gH, gL, pUL128, pUL130, et pUL131 (ou un fragment formant complexe de chacune de ces sous-unités) . Par exemple, la modification peut résulter en ce qu'au moins environ 80 %, au moins environ 85 %, au moins environ 90 %, au moins environ 91 %, au moins environ 92 %, au moins environ 93 %, au moins environ 94 %, au moins environ 95 %, au moins environ 96 %, au moins environ 97 %, au moins environ 98 %, ou au moins environ 99 %, des molécules gL, ou du fragment formant complexe de celles-ci, forment un complexe pentamère comprenant gH, gL, pUL128, pUL130, et pUL131 (ou un fragment formant complexe de chacune de ces sous-unités) .

Dans certains modes de réalisation, la protéine gL décrite ici, ou un fragment formant complexe de celle-ci, porte une modification d'acide aminé telle, qu'en présence de quantités molaires sensiblement égales de protéines gH, gL, pUL128, pUL130, et pUL131 du CMV (ou d'un fragment formant complexe de chacune de ces sous-unités), pas plus d'environ 20 % des molécules gL, ou du fragment formant complexe de celles-ci, forment un complexe dimère constitué par gH et gL (ou un fragment formant complexe de chacune de ces sous- unités) . Par exemple, la modification peut résulter en ce que pas plus d'environ 20 %, pas plus d'environ 15 %, pas plus d'environ 10 %, pas plus d'environ 9 %, pas plus d'environ 8 %, pas plus d'environ 7 %, pas plus d'environ 6 %, pas plus d'environ 5 %, pas plus d'environ 4 %, pas plus d'environ 3 %, pas plus d'environ 2 %, ou pas plus d'environ 1 % des molécules gL, ou du fragment formant complexe de celles-ci, forment un complexe dimère constitué par gH et gL (ou un fragment formant complexe de chacune de ces sous-unités).

Dans certains modes de réalisation, la protéine gL décrite ici, ou un fragment formant complexe de celle-ci, porte une modification d'acide aminé telle, qu'en présence de quantités molaires sensiblement égales de protéines gH, gL, pUL128, pUL130, et pUL131 du CMV (ou d'un fragment formant complexe de chacune de ces sous-unités), ladite modification d'acide aminé réduit la quantité des complexes dimères constitués par gH et gL (ou un fragment formant complexe de chacune de ces sous-unités) d'au moins environ 50 %, par rapport à une protéine gL, ou à un fragment formant complexe de celle-ci, sans ladite modification d'acide aminé (telle que la gL de type sauvage ou un fragment formant complexe de celle-ci) . Par exemple, la modification d'acide aminé peut réduire la quantité des complexes dimères constitués par gH et gL (ou un fragment formant complexe de chacune de ces sous- unités) d'au moins environ 30 %, d'au moins environ 40 %, d'au moins environ 50 %, d'au moins environ 60 %, d'au moins environ 70 %, d'au moins environ 75 %, d'au moins environ 80 %, d'au moins environ 85 %, d'au moins environ 90 %, d'au moins environ 95 %, d'au moins environ 96 %, d'au moins environ 97 %, d'au moins environ 98 %, ou d'au moins environ 99 %, par rapport à une protéine gL, ou à un fragment formant complexe de celle-ci, sans ladite modification d'acide aminé (telle que la gL de type sauvage ou un fragment formant complexe de celle-ci). En variante, la modification d'acide aminé peut réduire la quantité des complexes dimères constitués par gH et gL (ou un fragment formant complexe de chacune de ces sous-unités) d'au moins 2 fois, d'au moins 3 fois, d'au moins 4 fois, d'au moins 5 fois, d'au moins 6 fois, d'au moins 7 fois, d'au moins 8 fois, d'au moins 9 fois, d'au moins 10 fois, d'au moins 15 fois, d'au moins 20 fois, d'au moins 25 fois, d'au moins 30 fois, d'au moins 40 fois, ou d'au moins 50 fois, par rapport à une protéine gL, ou à un fragment formant complexe de celle-ci, sans ladite modification d'acide aminé (telle que la gL de type sauvage ou un fragment formant complexe de celle-ci).

Dans certains modes de réalisation, la modification d'acide aminé s'opère sur un résidu d'acide aminé correspondant à Cys47 de SEQ ID No : 1, Cys54 de SEQ ID No : 1, Cysl44 de SEQ ID No : 1, ou une combinaison de ceux-ci. Des procédés d’alignement standards peuvent être utilisés pour identifier les résidus qui correspondent à Cys47 de SEQ ID No : 1, Cys54 de SEQ ID No : 1, Cysl44 de SEQ ID No : 1, ou une combinaison de ceux-ci. La modification peut être une addition, une délétion, ou une substitution d'un résidu d'acide aminé. La modification peut également être l'introduction d'un acide aminé non naturel ou d'un analogue d'acide aminé dans une chaîne polypeptidique.

On a découvert que les mutations sur le résidu correspondant à Cys47 de SEQ ID No : 1 ou Cys54 de SEQ ID No : 1 donnaient une protéine gL modifiée qui ne forme avec gH ni dimère "monomère" (une copie de gH et une copie de gL) , ni dimère "dimère" (deux copies de gH et deux copies de gL) . En variante, les dimères gH/gL "monomères" ou "dimères" sont présents à un niveau qui n'était pas détectable quand les inventeurs ont utilisé des procédés de détection standards.

De manière intéressante, la modification sur le résidu d'acide aminé correspondant à Cysl44 de SEQ ID No : 1 permet également une purification efficace du pentamère dans la mesure où cette modification a pratiquement éliminé la forme "dimère" du dimère gH/gL. Il est possible qu'une quantité résiduelle de la forme "monomère" du dimère gH/gL subsiste encore avec des modifications sur un résidu correspondant à Cysl44 de SEQ ID No : 1. Toutefois, la forme "monomère" du dimère gL/gH peut être séparée du pentamère par une colonne d'exclusion de tailles, alors que la forme "dimère" est co^ éluée avec le pentamère (voir, FIG. IB) . En fait, même si la protéine gL portant une modification sur le résidu correspondant à Cysl44 forme toujours un dimère "monomère" avec gH, le pic du dimère monomère gH/gL est suffisamment séparé du pic du pentamère (comparer FIG. IB) , pour que le pentamère et le dimère "monomère" ne soient pas co-élués, et que le pentamère puisse être purifié par une colonne d'exclusion de tailles standard.

De préférence, la modification d'acide aminé altère la capacité d'un résidu cystéine à former un pont disulfure, comme par exemple une modification de type délétion du résidu cystéine, mutation de cystéine à autre acide aminé (tel que glycine, sérine, thréonine, alanine, valine, leucine, isoleucine, etc.).

Dans certains modes de réalisation, la modification d'acide aminé s'opère sur le résidu d'acide aminé adjacent à la position correspondant à Cys47 de SEQ ID No : 1, Cys54 de SEQ ID No : 1, Cysl44 de SEQ ID No : 1, ou une combinaison de ceux-ci. Le résidu d'acide aminé peut être soit un résidu immédiatement voisin (à savoir, résidus correspondant aux positions 46, 48, 53, 55, 143, ou 145 dans SEQ ID No : 1), soit un résidu en proximité conformationnelle (p. ex., dans les 30 angströms, ou dans les 25 angströms, ou dans les 20 angströms, ou dans les 15 angströms, ou dans les 10 angströms, ou dans les 7 angströms, ou dans les 5 angströms, par rapport à un des atomes du résidu correspondant à Cys47 de SEQ ID No : 1, à Cys54 de SEQ ID No : 1, à Cysl44 de SEQ ID No : 1). Dans certains modes de réalisation, le résidu d'acide aminé adjacent à la position correspondant à Cys47, Cys54, ou Cysl44 de SEQ ID No : 1 comprend une chaîne latérale encombrante. Une chaîne latérale encombrante peut, par encombrement sérique, empêcher la formation d’un pont disulfure. L'invention concerne également une gL modifiée (p. ex., modification Cysl44) qui réduit la formation de dimères gH/gL "dimères" (deux copies de gH et deux copies de gL) . Dans certains modes de réalisation, la protéine gL décrite ici, ou un fragment formant complexe de celle-ci, porte une modification d'acide aminé telle, qu'en présence de quantités molaires sensiblement égales de la protéine gH du CMV, et de ladite gL ou d'un fragment formant complexe de celles-ci, au moins environ 80 % des molécules gL, ou du fragment formant complexe de celles-ci, forment un dimère "monomère" constitué par : une copie de gH, et une copie de ladite gL ou du fragment formant complexe de celles-ci. Par exemple, la modification peut résulter en ce qu'au moins environ 80 %, au moins environ 85 %, au moins environ 90 %, au moins environ 91 %, au moins environ 92 %, au moins environ 93 %, au moins environ 94 %, au moins environ 95 %, au moins environ 96 %, au moins environ 97 %, au moins environ 98 %, ou au moins environ 99 %, des molécules gL, ou du fragment formant complexe de celles-ci, forment un dimère "monomère" constitué par : une copie de gH, et une copie de ladite gL ou du fragment formant complexe de celles-ci.

Dans certains modes de réalisation, la protéine gL décrite ici, ou un fragment formant complexe de celle-ci, porte une modification d'acide aminé telle, qu'en présence de quantités molaires sensiblement égales de la protéine gH du CMV, et de ladite gL ou du fragment formant complexe de celles-ci, pas plus d'environ 20 % des molécules gL, ou d'un fragment formant complexe de celles-ci, forment un dimère "dimère" constitué par : deux copies de gH, et deux copies de ladite gL ou du fragment formant complexe de celle-ci. Par exemple, la modification peut résulter en ce que pas plus d'environ 20 %, pas plus d'environ 15 %, pas plus d'environ 10 %, pas plus d'environ 9 %, pas plus d'environ 8 %, pas plus d'environ 7 %, pas plus d'environ 6 %, pas plus d'environ 5 %, pas plus d'environ 4 %, pas plus d'environ 3 %, pas plus d'environ 2 %, ou pas plus d'environ 1 % des molécules gL, ou du fragment formant complexe de celles-ci, forment un dimère "dimère" constitué par : deux copies de gH, et deux copies de ladite gL ou du fragment formant complexe de celles-ci.

Dans certains modes de réalisation, la protéine gL décrite ici, ou un fragment formant complexe de celle-ci, porte une modification d'acide aminé telle, qu'en présence de quantités molaires sensiblement égales de la protéine gH du CMV, et de ladite gL ou d'un fragment formant complexe de celle-ci, ladite modification d'acide aminé réduit la quantité de dimères "dimères", constitués par deux copies de gH, et deux copies de ladite gL ou du fragment formant complexe de celles-ci, d'au moins environ 50 %, par rapport à une protéine gL, ou à un fragment formant complexe de celle-ci, sans ladite modification d'acide aminé. Par exemple, la modification d'acide aminé peut réduire la quantité de dimères "dimères" constitués par : deux copies de gH, et deux copies de ladite gL (ou d'un fragment formant complexe de chacune de ces sous-unités) d'au moins environ 30 %, d'au moins environ 40 %, d'au moins environ 50 %, d'au moins environ 60 %, d'au moins environ 70 %, d'au moins environ 75 %, d'au moins environ 80 %, d'au moins environ 85 %, d'au moins environ 90 %, d'au moins environ 95 %, d'au moins environ 96 %, d'au moins environ 97 %, d'au moins environ 98 %, ou d'au moins environ 99 %, par rapport à une protéine gL, ou à un fragment formant complexe de celle-ci, sans ladite modification d'acide aminé (telle qu'une gL de type sauvage ou un fragment formant complexe de celle-ci). En variante, la modification d'acide aminé peut réduire la quantité de complexes dimères constitués par : deux copies de gH, et deux copies de ladite gL (ou un fragment formant complexe de chacune de ces sous-unités) d'au moins 2 fois, d'au moins 3 fois, d'au moins 4 fois, d'au moins 5 fois, d'au moins 6 fois, d'au moins 7 fois, d'au moins 8 fois, d'au moins 9 fois, d'au moins 10 fois, d'au moins 15 fois, d'au moins 20 fois, d'au moins 25 fois, d'au moins 30 fois, d'au moins 40 fois, ou d'au moins 50 fois, par rapport à une protéine gL, ou à un fragment formant complexe de celle-ci, sans ladite modification d'acide aminé (telle qu'une gL de type sauvage ou un fragment formant complexe de celle-ci).

B. Complexes protéiques du CMV

Selon un autre aspect, l'invention concerne un complexe comprenant la protéine gL modifiée du CMV, ou un fragment formant complexe de celle-ci, comme décrit ici. Ces complexes comprennent, p. ex., un complexe trimère isolé comprenant la protéine gL modifiée du CMV, ou un fragment formant complexe de celle-ci, comme décrit ici, et les protéines du CMV gH ou un fragment formant complexe de celle-ci, et gO ou un fragment formant complexe de celle-ci ; un complexe pentamère isolé comprenant la protéine gL modifiée, ou un fragment formant complexe de celle-ci, comme décrit ici, et les protéines du CMV pUL128 ou un fragment formant complexe de celle-ci, pUL130 ou un fragment formant complexe de celle-ci, pUL131 ou un fragment formant complexe de celle-ci, et gH ou un fragment formant complexe de celle-ci. Est également compris tout autre complexe comprenant la gL (ou un fragment formant complexe de celle-ci) à titre de composant.

Bien que les gH, gL, gO, gB et pUL130 puissent être considérées comme des glycoprotéines, cette nomenclature ne doit pas être interprétée comme signifiant que ces protéines doivent être glycosylées quand elles sont utilisées dans le cadre de la présente invention. Au contraire, dans certains modes de réalisation selon l'invention, un ou plusieurs des polypeptides ne sont pas glycosylés. Généralement, toutefois, un ou plusieurs (voire tous les) polypeptides dans un complexe selon l'invention sont glycosylés. Dans certains modes de réalisation, un ou plusieurs (voire tous les) polypeptides dans un complexe selon l'invention sont glycosylés par des mutants de glycosylation de cellules cultivées, telles que des cellules de mammifères mutées. Ces mutants de glycosylation génèrent un profil de glycosylation polypeptidique qui diffère du profil de glycosylation du type sauvage, à savoir que les glycoformes polypeptidiques obtenues diffèrent des glycoformes de type sauvage.

Dans certains modes de réalisation, le profil de glycosylation de la gL (ou d'un fragment formant complexe de celle-ci), ou d'un complexe comprenant la gL (ou un fragment formant complexe de celle-ci) a un profil de glycosylation de mammifères ; et/ou n'a pas de profil de glycosylation de cellules d'insectes. Dans certains modes de réalisation, une ou plusieurs des protéines du complexe contient des chaînes latérales liées à N complexes avec un galactose en avant-dernier et un acide sialique terminal. C. Acide nucléique codant pour des protéines gL modifiées et des complexes

Selon un autre aspect, l'invention concerne un acide nucléique comprenant une séquence qui code pour la protéine gL modifiée, ou un fragment formant complexe de celle-ci, comme décrit ici. L'acide nucléique peut être un ADN ou ARN.

Dans certains modes de réalisation, l'acide nucléique est l'ADN. Les systèmes d'expression basés sur l'ADN pour l'expression et la purification de protéines recombinantes sont bien connus dans l'état de la technique. Par exemple, le système d'expression peut être un vecteur comprenant une séquence de nucléotides qui code pour la gL modifiée ou le fragment de gL décrit ici, qui est fonctionnellement liée à une séquence de contrôle de l'expression qui régule l'expression de la gL modifiée ou du fragment gL chez une cellule hôte, telle qu'une cellule hôte de mammifère(s), une cellule hôte bactérienne, ou une cellule hôte d'insecte (s) . La séquence de contrôle de l'expression peut être un promoteur, un activateur, un site d'entrée des ribosomes, ou une séquence de polyadénylation, par exemple. Les autres séquences de contrôle de l'expression envisagées pour une utilisation dans l'invention comprennent les introns et les séquences 3' ÜTR.

La protéine gL modifiée exprimée par des techniques de recombinaison ou un fragment de celle-ci, ou un complexe comprenant la protéine gL modifiée ou un fragment de celle-ci peut être purifié à l'aide des méthodes décrites dans la présente, telles que les méthodes de purification décrites dans WO 2014/005959, ou d'autres méthodes connues dans l'état de la technique.

Dans certains modes de réalisation, la molécule d'acide nucléique est un vecteur dérivé d'un adénovirus, d'un virus adéno-associé, d'un lentivirus, ou d'un alphavirus. Dans certains modes de réalisation, la molécule d'acide nucléique est un vecteur viral déficient en réplication.

Dans certains modes de réalisation, l'acide nucléique est l'ARN. Dans certains modes de réalisation, l'acide nucléique est une molécule d'ARN à auto-réplication, telle qu'un réplicon d'ARN dérivé d'un alphavirus.

Les molécules d'ARN à auto-réplication sont bien connues dans l'état de la technique et peuvent être produites à l'aide d'éléments de réplication dérivés, p. ex., d'alphavirus, qui substituent les protéines virales structurales par une séquence de nucléotides codant pour une protéine d'intérêt. Une molécule d'ARN à auto-réplication est typiquement une molécule à brin ( + ) qui peut être directement traduite après introduction dans une cellule, et cette traduction fournit une ARN polymérase dépendante de 1'ARN qui produit ensuite à la fois des transcrits antisens et sens à partir de l'ARN introduit. Par conséquent, l'ARN introduit engendre la production de multiples ARN-filles. Ces ARN-filles, ainsi que les transcrits sous-génomiques colinéaires, peuvent eux-mêmes être traduits pour fournir l'expression in situ d'un antigène codé, ou ils peuvent être transcrits pour fournir des transcrits supplémentaires de même sens que l'ARN introduit qui sont traduits pour fournir l'expression in situ de l'antigène. Le résultat global de cette séquence de transcriptions est une gigantesque amplification du nombre d'ARN réplicons introduits, de sorte que l'antigène codé devient un produit polypeptidique majeur des cellules. Les cellules transfectées avec l'ARN à auto-réplication produisent brièvement l'antigène avant de subir une mort par apoptose. Cette mort est un résultat vraisemblable des intermédiaires d'ARN double brin (db) requis, dont il a été démontré qu'ils sur-activent les cellules dendritiques. Par conséquent, l'immunogénicité améliorée de l'ARN à auto-réplication peut être un résultat de la production d'ARNdb pro-inflammatoires, qui miment une infection des cellules hôtes par un virus à ARN.

Un système convenable pour obtenir une telle autoréplication consiste à utiliser un réplicon dérivé d'un alphavirus. Les alphavirus regroupent un ensemble de virus de la famille des Togaviridae, véhiculés par les arthropodes, génétiquement, structuralement, et sérologiquement apparentés. Vingt-six virus et sous-types viraux connus ont été classés dans le genre alphavirus, dont le virus de Sindbis, le virus de la forêt de Semliki, le virus de la rivière Ross, et le virus de l'encéphalite équine du Vénézuela. A ce titre, l'ARN à auto-réplication selon l'invention peut incorporer une ARN réplicase dérivée du virus de la forêt de Semliki (SFV), du virus Sindbis (SIN), du virus de l'encéphalite équine du Vénézuela (VEE) , du virus de la rivière Ross (RRV) , du virus de l'encéphalite équine orientale, ou autres virus appartenant à la famille des alphavirus.

Des vecteurs d'expression à "réplicons" dérivés d'alphavirus peuvent être utilisés dans l'invention. Les vecteurs à réplicons peuvent être utilisés sous plusieurs formats, comprenant des particules recombinantes d'ADN, d'ARN, et de réplicons. Ces vecteurs à réplicons ont été dérivés d'alphavirus qui comprennent, par exemple, le virus Sindbis (Xiong et al. (1989) Science 243:1188-1191 ; Dubensky et al., (1996) J. Virol. 70:508-519 ; Hariharan et al. (1998) J. Virol. 72:950-958 ; Polo et al. (1999) PNAS 96:4598-4603), le virus de la forêt de Semliki (Liljestrom (1991) Bio/Technology 9:1356-1361 ; Berglund et al. (1998) Nat. Biotech. 16:562-565), et le virus de l'encéphalite équine du Vénézuela (Pushko et al. (1997) Virology 239:389-401). De manière générale, les réplicons dérivés d'alphavirus ont des caractéristiques globales (p. ex., structure, réplication) très similaires, des alphavirus individuels pouvant cependant présenter une propriété particulière (p. ex., liaison au récepteur, sensibilité aux interférons, et profil pathologique) qui est unique. Par conséquent, les réplicons d'alphavirus chimériques constitués à partir de familles de virus divergentes peuvent également être utiles. L'utilisation d'un réplicon d'ARN dérivé d'alphavirus est connue dans l'état de la technique, voir, p. ex., WO 2013006837, paragraphes [0155] à [0179]. Le réplicon d'ARN peut être administré sans qu'il soit besoin de purifier la protéine pour laquelle il code.

Dans certains modes de réalisation, la molécule d'acide nucléique fait partie d'un vecteur dérivé d'un adénovirus. Le génome des adénovirus est une molécule d'ADN double brin linéaire d'environ 36 000 paires de bases, une protéine terminale de 55 kDa étant liée par covalence à l'extrémité 5'-terminale de chaque brin. L'ADN adénoviral ("Ad") contient des Répétitions Terminales Inversées ("ITR") identiques d'environ 100 paires de bases, dont la longueur exacte dépend du sérotype. Les origines de réplication virales se trouvent à l'intérieur des ITR exactement aux extrémités du génome. Les vecteurs adénoviraux utilisables dans la présente invention peuvent être dérivés de l'un quelconque des divers sérotypes adénoviraux, comprenant, entre autres, l'un quelconque des plus de 40 sérotypes de 1 ' adénovirus, tels que les sérotypes 2, 5, 12, 40, et 41.

Dans certains modes de réalisation, la molécule d'acide nucléique fait partie d'un vecteur dérivé d'un virus adéno-associé (AAV) . Le génome de 1 'AAV est une molécule d'ADN simple brin linéaire contenant environ 4681 nucléotides. De manière générale, le génome de l'AAV comprend un génome sans répétitions internes flanqué à chaque extrémité par des répétitions terminales inversées (ITR). Les ITR ont une longueur d'environ 145 paires de bases (pb) . Les ITR remplissent de multiples fonctions, y compris pour servir d'origines de réplication de 1'ADN et en tant que signaux d'encapsulation pour le génome viral. L'AAV est un virus dépendant d'un virus auxiliaire ; c'est-à-dire qu'il requiert une co-infection avec un virus auxiliaire (p. ex., adénovirus, herpèsvirus ou virus de la vaccine) pour pouvoir former des virions AAV dans le type sauvage. En l'absence de co-infection avec un virus auxiliaire, l'AAV établit un état latent dans lequel le génome viral s'insère dans le chromosome d'une cellule hôte, mais aucun virion infectieux n'est produit. L'infection ultérieure par un virus auxiliaire vient au secours du génome intégré, lui permettant de se répliquer et de s'encapsuler dans des virions AAV infectieux. Bien que l'AAV puisse infecter des cellules provenant d'espèces différentes, le virus auxiliaire doit appartenir à la même espèce que la cellule hôte. Ainsi, par exemple, l'AAV humain se répliquera dans des cellules canines co-infectées par un adénovirus canin.

Dans certains modes de réalisation, la molécule d'acide nucléique fait partie d'un vecteur dérivé de rétrovirus. Un gène sélectionné peut être inséré dans un vecteur et encapsulé dans des particules rétrovirales à l'aide de techniques connues de l'état de l'art. Le virus recombinant peut ensuite être isolé et administré aux cellules du sujet soit in vivo, soit ex vivo. Un certain nombre de systèmes rétroviraux ont été décrits. Voir, p. ex., le brevet U. S. No. 5 219 740 ; Miller et Rosman (1989) BioTechniques 7:980-90 ; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1 :5-14 ; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-52 ; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:8033-37 ; Boris-Lawrie et Temin (1993) Curr. Opin. Genet. Develop. 3 : 102-09. L'invention concerne également des cellules hôtes comprenant les molécules d'acides nucléiques décrites ici. Les cellules hôtes convenables pour héberger des molécules d'acides nucléiques et/ou pour exprimer des protéines recombinantes, et les méthodes pour introduire un acide nucléique chez un hôte convenable, sont connues dans l'état de la technique. 3. Purification des complexes pentameres du CMV par échangé d 1 ions

Selon un autre aspect, l'invention concerne une méthode de purification du complexe pentamère du CMV à partir d'un échantillon, ledit complexe pentamère comprenant les protéines gH, gL, pUL128, pUL130, et pUL131 du CMV, et la méthode comprenant : (i) l'utilisation d'un échantillon comprenant (a) le complexe pentamère comprenant gH, gL, pUL128, pUL130, et pUL131 (ou un fragment formant complexe de chacune de ces sous-unités), et (b) le complexe dimère constitué par gH et gL (ou un fragment formant complexe de chacune de ces sous-unités) ; (ii) le passage dudit échantillon dans une colonne de chromatographie d'échange d'ions ; et (iii) la collecte de la fraction qui comprend ledit complexe pentamère à partir de la colonne d'échange d'ions.

Comme décrit et illustré dans la présente, on a découvert de manière étonnante que la chromatographie d'échange d'ions éliminait efficacement les dimères gH/gL contaminants du complexe pentamère. Dans certains modes de réalisation, pas plus d'environ 20 % des complexes protéiques collectés dans la fraction collectée sont des complexes dimères constitués par gH et gL (ou un fragment formant complexe de chacune de ces sous-unités). Par exemple, pas plus d'environ 20 %, pas plus d'environ 15 %, pas plus d'environ 10 %, pas plus d'environ 9 %, pas plus d'environ 8 %, pas plus d'environ 7 %, pas plus d'environ 6 %, pas plus d'environ 5 %, pas plus d'environ 4 %, pas plus d'environ 3 %, pas plus d'environ 2 %, ou pas plus d'environ 1 % des complexes protéiques collectés dans la fraction collectée sont des complexes dimères constitués par gH et gL (ou un fragment formant complexe de chacune de ces sous-unités).

Dans certains modes de réalisation, au moins environ 80 % des complexes protéiques collectés dans la fraction collectée sont des complexes pentamères comprenant les protéines gH, gL, pUL128, pUL130, et pUL131 du CMV (ou un fragment formant complexe de chacune de ces sous-unités). Par exemple, au moins environ 85 %, au moins environ 90 %, au moins environ 91 %, au moins environ 92 %, au moins environ 93 %, au moins environ 94 %, au moins environ 95 %, au moins environ 96 %, au moins environ 97 %, au moins environ 98 %, ou au moins environ 99 %, des complexes protéiques collectés dans la fraction collectée sont des complexes pentamères comprenant gH, gL, pUL128, pUL130, et pUL131 (ou un fragment formant complexe de chacune de ces sous-unités) . A titre d'exemples de matériaux utiles dans la chromatographie d'échange d'ions, il y a la DEAE-cellulose, QAE-cellulose, DEAE-céphalose, QAE-céphalose, DEAE-Toyopearl, QAE-Toyopearl, Mono Q, Mono S, Q sépharose, SP sépharose, etc. Dans un mode de réalisation proposé en exemple, la méthode utilise une colonne Mono S. Dans un autre mode de réalisation proposé en exemple, la méthode utilise une colonne Mono Q. 4. Purification des complexes protéiques du CMV par Etiquettes

D'AFFINITE

Selon un autre aspect, l'invention concerne une méthode de purification du complexe pentamère du CMV à partir d'un échantillon, ledit complexe pentamère comprenant les protéines gH, gL, pUL128, pUL130, et pUL131 du CMV, et la méthode comprenant : (i) l'utilisation d'un échantillon comprenant : (a) le complexe pentamère comprenant gH, gL, pUL128, pUL130, et pUL131 (ou un fragment formant complexe de chacune de ces sous-unités), et (b) le complexe dimère constitué par gH et gL (ou un fragment formant complexe de chacune de ces sous-unités) , dans laquelle une étiquette de purification par affinité est attachée à l'un des sites suivants : (i) région C-terminale de pUL130, (i i) région N-terminale de pUL130, (iii) région C-terminale de pUL131, (iv) région N-terminale de pUL131, (v) région C-terminale de pUL128, (vi) région N- terminale de pUL128, ou une combinaison de ceux-ci, ladite étiquette de purification par affinité se liant spécifiquement à un partenaire de liaison ; et (ii) la purification dudit complexe pentamère par une matrice de chromatographie d'affinité, ladite matrice de chromatographie d'affinité comprenant ledit partenaire de liaison immobilisé sur un support solide.

La structure du complexe pentamère gH/gL/pUL128/pUL130/ pUL131 est inconnue ; par conséquent, si l'étiquette de purification par affinité est attachée à un site qui interfère avec la formation du complexe pentamère, ou à un site qui est enfoui au sein du complexe, la purification par affinité n'aboutira pas. Comme décrit et illustré dans la présente, on pense que les sites suivants conviennent pour attacher une étiquette de purification par affinité, dans la mesure où l'étiquette ne semble pas interférer avec la formation du complexe pentamère, et semble être exposé à la surface du pentamère assemblé : (i) région C-terminale de pUL130, (il) région N-terminale de pUL130, (iii) région C-terminale de pUL131, (iv) région N-terminale de pUL131, (v) région C- terminale de pUL128, (vi) région N-terminale de pUL128, ou une combinaison de ceux-ci.

Les exemples d'étiquettes de purification par affinité comprennent, p. ex., l'étiquette His (se lie à un ion métallique), un anticorps (se lie à la protéine A ou à la protéine G), la protéine se liant au maltose (MBP) (se lie à l'amylose), la glutathione-S-transférase (GST) (se lie à la glutathione), l'étiquette FLAG (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) (se lie à un anticorps anti-FLAG), l'étiquette Strep (se lie à la streptavidine ou à un dérivé de celle-ci).

Un mode de réalisation illustratif est l'étiquette Strep (ou étiquette d'affinité envers la streptavidine), une étiquette qui se lie à la streptavidine ou à un dérivé de celle-ci, telle que la Strep-Tactine. L'étiquette Strep comprend un peptide de neuf acides aminés : Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly, ou de huit acides aminés (également appelée Etiquette Strep II) : Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys. L'élution d'une protéine attachée à une étiquette Strep à partir de la colonne peut être réalisée en utilisant une biotine ou un dérivé ou homologue de celle-ci, tel que la desthio-biotine. L'étiquette de purification par affinité peut être attachée par tout moyen convenable, et ce, directement ou indirectement. Par exemple, l'étiquette peut être attachée à l'extrémité N-terminale de la séquence polypeptidique, ou à l'extrémité C-terminale de la séquence polypeptidique. L'opération peut être effectuée par l'expression recombinante d'une protéine de fusion comprenant le polypeptide et l'étiquette, ou par des techniques de conjugaison standards qui lient le polypeptide à l'étiquette. L'étiquette peut être attachée au groupe fonctionnel de chaîne latérale d'un résidu d'acide aminé du polypeptide en utilisant des techniques de conjugaison standards.

En variante, l'étiquette peut être attachée par non-covalence, par exemple, un anticorps qui se lie à la région C-terminale de pUL130 peut être utilisé à titre d'étiquette. L'anticorps est attaché au pentamère par non-covalence. Le complexe pentamère-anticorps peut ensuite être purifié sur une colonne protéine-A ou protéine-G, protéine-A ou protéine-G étant le partenaire de liaison pour l'étiquette anticorps.

Dans un mode de réalisation, l'étiquette est attachée au résidu C-terminal de pUL130 (ou d'un fragment formant complexe de celle-ci). Dans un mode de réalisation, l'étiquette est attachée à un résidu qui se trouve dans les limites de 20 acides aminés, 15 acides aminés, 10 acides aminés, 9 acides aminés, 8 acides aminés, 7 acides aminés, 6 acides aminés, 5 acides aminés, 4 acides aminés, 3 acides aminés, ou 2 acides aminés, par rapport au résidu C-terminal de pUL130 (ou du fragment formant complexe de celle-ci).

Dans un mode de réalisation, l'étiquette est attachée au résidu C-terminal de pUL131 (ou d'un fragment formant complexe de celle-ci). Dans un mode de réalisation, l'étiquette est attachée à un résidu qui se trouve dans les limites de 20 acides aminés, 15 acides aminés, 10 acides aminés, 9 acides aminés, 8 acides aminés, 7 acides aminés, 6 acides aminés, 5 acides aminés, 4 acides aminés, 3 acides aminés, ou 2 acides aminés, par rapport au résidu C-terminal de pUL131 (ou du fragment formant complexe de celle-ci) . L'attachement de l'étiquette peut être direct, ou indirect (par l'intermédiaire d'un lieur (« linker ») ) . Les lieurs (« linkers ») convenables sont connus de l'homme du métier et comprennent, p. ex., les lieurs (« linkers ») de type carbone à chaîne droite ou ramifiée, les lieurs (« linkers ») de type carbone hétérocyclique, les lieurs (« linkers ») glucidiques et les lieurs (« linkers ») polypeptidiques.

Dans un mode de réalisation, des lieurs (« linkers ») clivables peuvent être utilisés pour attacher la molécule d'intérêt à l'étiquette. Ceci permet à l'étiquette d'être séparée du complexe purifié, par exemple par l'ajout d'un agent capable de cliver le lieur (« linker »). Un certain nombre de lieurs (« linkers ») clivables différents est connu de l'homme du métier. Ces lieurs (« linkers ») peuvent être clivés par exemple, par exposition d'une liaison photolabile à la lumière ou par hydrolyse catalysée par un acide. Il existe également des lieurs (« linkers ») polypeptidiques qui contiennent un site de reconnaissance de protéase et qui peuvent être clivés par l'ajout d'une enzyme protéasique convenable. 5. Compositions pharmaceutiques et administration L'invention concerne également des compositions pharmaceutiques comprenant les protéines du CMV, les complexes, et les acides nucléiques décrits ici. L'invention concerne également des compositions pharmaceutiques comprenant des acides nucléiques codant pour les protéines du CMV, les complexes, et les acides nucléiques décrits ici.

Les protéines du CMV, les complexes, et les acides nucléiques décrits ici peuvent être incorporés dans une composition immunogène, ou une composition vaccinale. Ces compositions peuvent être utilisées pour susciter la production d'anticorps chez un mammifère (p. ex. sujet humain). L'invention concerne des compositions pharmaceutiques comprenant les protéines du CMV, les complexes, et les acides nucléiques décrits ici, et des procédés de préparation d'une composition pharmaceutique impliquant la combinaison des protéines du CMV, des complexes, et des acides nucléiques décrits ici avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention comprennent typiquement un véhicule pharmaceutiquement acceptable, et une revue complète de ces véhicules est disponible dans

Remington : The Science and Practice of Pharmacy.

Le pH de la composition est généralement entre environ 4,5 et environ 9,0, comme par exemple entre environ 5 et environ 9, entre environ 5,5 et environ 9, entre environ 6 et environ 9, entre environ 5 et environ 8,5, entre environ 5,5 et environ 8,5, entre environ 6 et environ 8,5, entre environ 5 et environ 8,5, entre environ 5,5 et environ 8, entre environ 6 à environ 8, d'environ 4,5, d'environ 5, d'environ 5,5, d'environ 6, d'environ 6,5, d'environ 7, d'environ 7,5, d'environ 8, d'environ 8,5, d'environ 9, etc. Un pH stable peut être maintenu en utilisant un tampon p. ex. un tampon Tris, un tampon citrate, un tampon phosphate, ou un tampon histidine. Par conséquent, une composition contiendra généralement un tampon.

Une composition peut être stérile et/ou apyrogène. Les compositions peuvent être isotoniques vis-à-vis de l'homme.

Une composition comprend une quantité immunologiquement efficace de son ou de ses antigènes. Une "quantité immunologiquement efficace" est une quantité qui, quand elle est administrée à un sujet, suscite efficacement une réponse en anticorps contre l'antigène. Cette quantité peut varier en fonction de l'état de santé et de la condition physique de l'individu à traiter, de son âge, de la capacité de son système immunitaire à synthétiser des anticorps, du degré de protection recherché, de la formulation du vaccin, de l'avis du médecin traitant sur le cas médical, et autres facteurs pertinents. Cette quantité devrait s'inscrire dans une plage relativement large qui peut être déterminée par des essais de routine. La teneur en antigène des compositions selon l'invention sera généralement exprimée en termes de poids de protéine par dose. Une dose de 10 à 500 pg (p. ex. 50 pg) d'antigène peut être utile.

Les compositions immunogènes peuvent contenir un adjuvant immunologique. A titre d'exemples, les adjuvants peuvent comprendre : 1. des compositions contenant un minéral ; 2. des émulsions huileuses ; 3. des formulations de saponine ; 4. des virosomes et des particules viroïdes ; 5. des dérivés bactériens ou microbiens ; 6. des bioadhésifs et des muco-adhésifs ; 7. des liposomes ; 8. des formulations à base d'éthers de polyoxyéthylène et d'esters de polyoxyéthylène ; 9. des polyphosphazènes (pcpp) ; 10. des peptides de type muramyle ; 11. des composés d'imidazoquinolone ; 12. des composés de thiosemicarbazone ; 13. des composés de tryptanthrine ; 14. des immunomodulateurs humains ; 15. des lipopeptides ; 16. des benzonaphtyridines ; 17. des microparticules ; 18. des polynucléotides immunostimulateurs (tels que l'ARN ou l'ADN ; p. ex., des oligonucléotides contenant des motifs cpg).

Par exemple, la composition peut comprendre un adjuvant de type sel d'aluminium ou émulsion huile dans l'eau (p.ex. une émulsion huile dans l'eau comprenant un squalène, tel que MF59 ou AS03). Les sels d'aluminium convenables comprennent les hydroxydes (p. ex. oxyhydroxydes), les phosphates (p. ex. hydroxyphosphates, orthophosphates), (voir p. ex. les Chapitres 8 & 9 de Vaccine Design... (1995) Eds. Powell & Newman. ISBN: 030644867X. Plenum), ou leurs mélanges. Les sels peuvent prendre toute forme convenable (p. ex. gel, formes cristallines, amorphes, etc.), l'adsorption de l'antigène sur le sel étant un exemple. La concentration d'Al+++ dans une composition destinée à être administrée à un patient peut être inférieure à 5 mg/ml p. ex. <4 mg/ml, <3 mg/ml, <2 mg/ml, <1 mg/ml, etc. Une plage préférée est entre 0,3 et 1 mg/ml. Un maximum de 0,85 mg/dose est préféré. Les adjuvants de type hydroxyde d'aluminium et phosphate d'aluminium sont convenables dans le cadre de la présente l'invention.

Un adjuvant immunologique convenable comprend un composé de Formule (I) tel que défini dans WO2011/027222, ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, adsorbé sur un sel d'aluminium. De nombreux autres adjuvants peuvent être utilisés, y compris l'un quelconque de ceux décrits dans Powell & Newman (1995).

Les compositions peuvent comprendre un antimicrobien, notamment quand elles sont conditionnées sous un format multidose. Des antimicrobiens tels que le thiomersal et le 2^ phénoxy-éthanol sont couramment utilisés dans les vaccins, mais parfois il peut être souhaitable d’utiliser soit un conservateur sans mercure, soit pas de conservateur du tout.

Les compositions peuvent comprendre un détergent, p. ex. un polysorbate, tel que le polysorbate 80. Les détergents sont généralement présents à de faibles niveaux, p. ex. <0,01 %.

Les compositions peuvent comprendre des sels de sodium (p. ex. chlorure de sodium) pour gagner en tonicité. Une concentration de 10+2 mg/ml de NaCl est typique, p. ex. environ 9 mg/ml.

Les compositions selon l'invention seront généralement administrées directement au sujet. L’administration directe peut se faire par injection parentérale (p. ex. sous-cutanée, intrapéritonéale, intraveineuse, intramusculaire, ou dans l'espace interstitiel d'un tissu), ou par toute autre voie convenable. Par exemple, l'administration par voie intramusculaire peut être pratiquée, p. ex. dans la cuisse ou la partie supérieure du bras. L'injection peut se faire par l’intermédiaire d'une aiguille (p. ex. aiguille hypodermique), mais en variante une injection sans aiguille peut être utilisée. Un volume typique pour une dose intramusculaire est de 0,5 ml.

La dose peut être administrée selon un schéma à dose unique ou un schéma multidose. Les doses multiples peuvent être utilisées selon un schéma de primo-immunisation et/ou de rappel. Dans un schéma multidose, les diverses doses peuvent être administrées par des voies identiques ou différentes, p. ex., primo-immunisation par voie parentérale et rappel par voie muqueuse, primo-immunisation par voie muqueuse et rappel par voie parentérale, etc. Les multidoses seront typiquement administrées à un intervalle d'au moins 1 semaine (p. ex., environ 2 semaines, environ 3 semaines, environ 4 semaines, environ 6 semaines, environ 8 semaines, environ 10 semaines, environ 12 semaines, environ 16 semaines, etc.).

Le sujet peut être un sujet humain, et peut également être, p. ex., une vache, un porc, un poulet, un chat ou un chien, dans la mesure où les pathogènes couverts par la présente peuvent poser problème chez une large plage d'espèces. Quand le vaccin est à visée prophylactique, le sujet humain est de préférence un enfant (p. ex., tout-petit ou nourrisson), un adolescent, ou un adulte ; quand le vaccin est à visée thérapeutique, le sujet humain est de préférence un adolescent ou un adulte. Un vaccin envisagé pour des enfants peut également être administré à des adultes, p. ex., pour évaluer l'innocuité, le dosage, l'immunogénicité, etc.

Les vaccins selon l'invention peuvent être prophylactiques (à savoir pour prévenir la maladie) ou thérapeutiques (à savoir pour réduire ou éliminer les symptômes d'une maladie).

Les molécules d'acides nucléiques décrites ici peuvent être formulées et administrées sous la forme d'un vaccin à acides nucléiques selon les normes connues dans l'état de la technique.

Les protéines isolées et/ou purifiées du CMV, les complexes, et les acides nucléiques décrits ici peuvent être administrés seuls, ou à titre de primo-immunisation ou de rappel dans des stratégies à modalité mixte, telles qu'une primo-immunisation par ARN, suivie d'un rappel par protéines. Les avantages de la stratégie primo-immunisation/rappel ARN/protéines, comparativement à la stratégie immunisation/ rappel protéines/protéines, comprennent, par exemple, des titres d'anticorps accrus, un profil plus équilibré des sous-types IgGl:IgG2a, l'induction d'une réponse immunitaire à médiation cellulaire T CD4+ de type TH1 similaire à celle obtenue avec des particules virales, et une production réduite d'anticorps non-neutralisants. La primo-immunisation ARN peut accroître l'immunogénicité des compositions, indépendamment de la présence ou de l'absence d'un adjuvant.

Dans la stratégie primo-immunisation/rappel ARN/ protéines, l'ARN et la protéine sont dirigés contre le même antigène cible. A titre d'exemples de modes d'administration d'ARN convenables, il y a les particules de réplicon viroïdes (VRP), l'ARN d'alphavirus, les réplicons encapsulés dans des nanoparticules lipidiques (LNP) ou les ARN formulés, tels que les réplicons formulés avec des nano-émulsions cationiques (CNE). Des nano-émulsions huile dans l'eau cationiques convenables, comprenant p. ex. un cœur lipidique (p. ex. comprenant du squalène) et un lipide cationique (p. ex. DOTAP, DMTAP, DSTAP, DC-cholestérol, etc.), sont décrites dans W02012/006380. W02012/051211 décrit que des anticorps dirigés contre le complexe pentamère sont produits chez les souris qui ont été immunisées avec des VRP et des ARN formulés (CNE et LNP) qui codent pour les constituants protéiques du complexe pentamère. Ces anticorps se sont avérés capables de neutraliser l'infection par le CMV dans des cellules épithéliales. La stratégie primo-immunisation/rappel ARN/protéines peut impliquer d'abord (p. ex. entre 0-8 semaines) une ou plusieurs primo-immunisations avec un ARN (qui peut être administré sous forme de VRP, LNP, CNE, etc.) qui code pour un ou plusieurs des composants protéiques du complexe protéique du CMV selon l'invention, puis une ou plusieurs immunisations de rappel ultérieures (p. ex. entre 24-58 semaines) avec : un complexe protéique isolé du CMV selon l'invention, éventuellement formulé avec un adjuvant ou un complexe protéique purifié du CMV selon l'invention, éventuellement formulé avec un adj uvant.

Dans certains modes de réalisation, la molécule d'ARN est encapsulée dans, liée à ou adsorbée sur un lipide cationique, un liposome, un cochléate, un virosome, un complexe immuno-stimulateur, une microparticule, une microsphère, une nanosphère, une vésicule unilamellaire, une vésicule multilamellaire, une émulsion huile dans l'eau, une émulsion eau dans l'huile, un émulsome, un peptide polycationique, une nano-émulsion cationique, ou des combinaisons de ceux-ci.

Des kits pour administrer l'acide nucléique (p. ex., ARN), les protéines purifiées, et les complexes purifiés décrits ici, et des instructions d'utilisation sont également fournis. L'invention propose également un dispositif d'administration prérempli avec une composition ou un vaccin décrit dans la présente.

Les compositions pharmaceutiques décrites ici peuvent être administrées conjointement avec un ou plusieurs autres agents thérapeutiques. Ces autres agents thérapeutiques peuvent comprendre, entre autres, des antibiotiques ou des antibactériens, des antiémétiques, des antifongiques, des anti-inflammatoires, des antiviraux, des immunomodulateurs, des cytokines, des antidépresseurs, des hormones, des agents d'alkylation, des antimétabolites, des antibiotiques antitumoraux, des antimitotiques, des inhibiteurs de topoisomérase, des agents cytostatiques, des agents antiinvasion, des antiangiogéniques, des inhibiteurs de la fonction facteur de croissance, des inhibiteurs de réplication virale, des inhibiteurs enzymatiques viraux, des agents anticancéreux, des interférons a, des interférons ß, la ribavirine, des hormones et autres modulateurs des récepteurs Toll-like, des immunoglobulines (Ig), et des anticorps modulant la fonction Ig (tels que des anti-IgE (omalizumab)).

Dans certains modes de réalisation, les compositions décrites ici peuvent être utilisées à titre de médicament, p. ex., pour servir à induire ou à améliorer une réponse immunitaire chez un sujet en ayant besoin, tel qu'un mammifère.

Dans certains modes de réalisation, les compositions décrites ici peuvent être utilisées dans la fabrication d'un médicament destiné à induire ou à améliorer une réponse immunitaire chez un sujet en ayant besoin, tel qu'un mammifère.

Une façon de vérifier l'efficacité du traitement thérapeutique implique la surveillance de l'infection par un pathogène après l’administration des compositions ou des vaccins décrits ici. Une façon de vérifier l'efficacité du traitement prophylactique implique la surveillance des réponses immunitaires, par voie systémique (comme par exemple surveillance du niveau de production des IgGl et IgG2a) et/ou par voie muqueuse (comme par exemple la surveillance du niveau de production des IgA), dirigées contre l'antigène. Typiquement, les réponses en anticorps sériques spécifiques de l'antigène sont déterminées après l'immunisation mais avant la stimulation (« challenge »), tandis que les réponses en anticorps muqueux sont déterminées après l'immunisation et après la stimulation (« challenge »). 6. Définitions

Le terme "fragment formant complexe" d'une protéine du CMV (telle que gL) désigne toute partie ou portion de la protéine qui conserve l'aptitude à former un complexe avec d'autres protéines du CMV. Ces complexes comprennent, p. ex., le complexe dimère gH/gL, le complexe trimère gH/gL/gO, ou le complexe pentamère gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131.

Tel qu'il est utilisé ici, "complexe dimère gH/gL" ou "dimère gH/gL" désigne un complexe protéique formé par gH et gL. Les sous-unités gH et gL du CMV peuvent former soit un dimère "monomère" (dimère constitué par une sous-unité gH et une sous-unité gL) , soit un dimère "dimère" (deux dimères "monomères" qui s'associent l'un à l'autre pour donner un complexe constitué par deux copies de la sous-unité gH et deux copies de la sous-unité gL) . Les deux formes de dimères sont généralement désignées "complexe dimère gH/gL", ou "dimère gH/gL". Bien que généralement désignées "dimère gH/gL" dans la description, les sous-unités gH et gL n'ont pas besoin d'être de type pleine longueur ; le terme englobant également les dimères "monomères" et les dimères "dimères" formés par des fragments formant complexe de gH et gL.

Tel qu'il est utilisé ici, "complexe pentamère" ou "pentamère" désigne un complexe du CMV qui comprend cinq sous-unités différentes : gH, gL, pUL128, pUL130, et pUL131. Bien que généralement désignées "pentamère gH/gL/pUL128/pUL130/ pUL131" (ou complexe pentamère comprenant gH, gL, pUL128, pUL130, et pUL131) dans la description, chacune de ces cinq sous-unités n'a pas besoin d'être de type pleine longueur ; le terme englobant également les pentamères formés par des fragments formant complexe de gH, gL, pUL128, pUL130, et PÜL131.

Le terme "sensiblement égal" désigne ici toute valeur numérique ayant une variance de +/- 20 % par rapport à la valeur numérique de base.

Le terme "environ", tel qu'il est utilisé ici, signifie à +/- 5 % d'une valeur de base.

Le terme "modification d'acide aminé" désigne une addition, délétion, ou substitution d'un résidu d'acide aminé. Le terme englobe également les modifications qui introduisent un acide aminé non naturel ou un analogue d'acide aminé dans une chaîne polypeptidique.

Un résidu d'acide aminé d'une séquence requête "correspond à" une position indiquée dans une séquence de référence (p. ex., Cys47 ou Cys54 de SEQ ID No : 1) quand, en alignant la séquence d'acides aminés requête avec la séquence de référence, la position du résidu correspond à la position indiquée. Ces alignements peuvent être effectués manuellement ou à l'aide de programmes d'alignement de séquences très connus tels que ClustalW2, ou "BLAST 2 Sequences" en utilisant les paramètres par défaut.

Un résidu d'acide aminé comprend une "chaîne latérale encombrante" quand la chaîne latérale comprend un substituant ramifié ou cyclique. A titre d'exemples de résidus d'acides aminés ayant une chaîne latérale encombrante, il y a le tryptophane, la tyrosine, la phénylalanine, 1'homophényl- alanine, la leucine, 1'isoleucine, l'histidine, le 1-méthyl-tryptophane, 1'α-méthyltyrosine, 1 ' a-méthylphénylalanine, 1 ' a- méthyl-leucine, 1'a-méthyl-isoleucine, 1'a-méthylhistidine, la cyclopentylalanine, la cyclohexylalanine, la naphtylalanine, etc.

EXEMPLES

Les inventeurs ont découvert que, quand un complexe pentamère (gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131) est exprimé par des techniques recombinantes et purifié, une quantité considérable de dimères gH/gL contaminants se formait. Dans une expérience typique, la présence régulière de dimères gH/gL contaminants, représentant environ 10 à 20 % de la quantité totale, a été observée. Les sous-unités gH/gL du CMV peuvent former soit un complexe "monomère" (dimère de gH et gL) , soit un complexe "dimère" (dimère d'hétérodimères). Les deux complexes co^ existent avec le complexe pentamère et doivent être éliminés.

Les inventeurs ont identifié plusieurs stratégies pour limiter ou éliminer les dimères gH/gL en excédent décrits ici pendant la production des pentamères destinée à la mise au point d'un vaccin. 2. Exemple 1 : gL modifiée

Les inventeurs ont identifié 3 mutants ponctuels sur la sous-unité gL qui interfèrent avec la formation des complexes gH/gL (à la fois pour les formes "monomères" et "dimères" des dimères gH/gL). Ces mutants n'interfèrent pratiquement pas avec la formation des pentamères et peuvent être utilisés pour purifier de grandes quantités de pentamères. Le complexe pentamère purifié ne comprend pas de contamination gH/gL (du moins, pas détectable par des méthodes standards).

La séquence de la gL de type sauvage utilisée pour la production des pentamères est la suivante (peptide signal en gras ; Cys47, Cys54, et Cysl44 soulignées) :

MCKRPDCGFSFSPGPVILLWCCLLLPIVSSAAVSVAPTAAEKVPAECPELTRRCLLGEVFEGDKYESWLRPLVNV

TGRDGPLSQLIRYRPVTPEAANSVLLDEAFLDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECGDGSPA

VYTCVDDLCRGYDLTRLSYGRSIFTEHVLGFELVPPSLFNWVAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGL

YNAVKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPPELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR

Les mutants gL utilisés pour éviter la contamination gH/gL sont les suivants (peptide signal en gras ; Cys47-Ser, Cys54-Ser, et Cysl44-Ser soulignées) : gL Cys47-Ser

MCKRPDCGFSFSPGPVILLWCCLLLPIVSSAAVSVAPTAAEKVPAESPELTRRCLLGEVFEGDKYESWLRPLVNV

TGRDGPLSQLIRYRPVTPEAANSVLLDEAFLDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECGDGSPA

VYTCVDDLCRGYDLTRLSYGRSIFTEHVLGFELVPPSLFNWVAIRNEATRTNRAVRLPVSTAÄAPEGITLFYGL

YNAVKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPPELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR gL Cys54-Ser

MCKRPDCGFSFSPGPVILLWCCLLLPIVSSAAVSVAPTAAEKVPAECPELTRRSLLGEVFEGDKYESWLRPLVNV

TGRDGPLSQLIRYRPVTPEAANSVLLDEAFLDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECGDGSPA

VYTCVDDLCRGYDLTRLSYGRSIFTEHVLGFELVPPSLFNVWAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGL

YNAVKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPPELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR gL Cysl44-Ser

MCRRPDCGFSFSPGPVILLWCCLLLPIVSSAAVSVAPTAAEKVPAECPELTRRCLLGEVFEGDKYESWLRPLVNV

TGRDGPLSQLIRYRPVTPEAANSVLLDEAFLDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSESGDGSPA

VYTCVDDLCRGYDLTRLSYGRSIFTEHVLGFELVPPSLFNWVAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGL

YNAVKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPPELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR

Des cellules 293EBNA ont été transfectées avec des plasmides codant pour des sous-unités individuelles portant des mutations ponctuelles dans gL. Les protéines ont été purifiées à partir des surnageants de cellules de mammifères par chromatographie d'affinité sur résine Strep-Tactine

Superflow Plus (Qiagen, Valencia, CA, Etats-Unis) en utilisant une étiquette Strep-tag II sur des sous-unités pUL130. Le complexe a été élué à partir de la résine par compétition avec un tampon d'élution (25 mM Hepes pH 7,5, 300 mM NaCl) contenant 5 mM de Desthiobiotine. Les complexes ont ensuite été soumis à une chromatographie par exclusion de tailles (SEC) sur une colonne Superose 6 PC 3.2/30 (GE Healthcare, Uppsala, Suède) équilibrée dans le tampon d'élution. Les protéines étiquetées Strep ont été surexprimées et purifiées à l'aide d'une stratégie similaire et éluées dans un tampon 25 mM Hepes pH 7,5, 150 mM NaCl. Les complexes HCMV ont été incubés pendant 2 heures sur de la glace et purifiés par SEC.

Des grilles EM ont été préparées par dépôt d'une couche mince de carbone continue sur une couche de carbone à trous sur une grille en cuivre 400 mesh (Electron Microscopy Sciences). Cinq microlitres d'échantillon purifié (environ 30 ng) ont été placés sur une grille ayant été récemment soumise à une décharge luminescente. Après 30 secondes d'incubation, la grille a été déposée sur des gouttelettes de 75 μΐ d'une solution de formiate d'uranyle à 2 % (p/v) fraîchement préparée et doucement agitée pendant les cinq étapes de coloration de 10 s ultérieures. Les échantillons ont été imagés à l'aide d'un microscope électronique à transmission Tecnai Spirit T12 opérant à 120 keV à un grossissement nominal de x49 000 (1,57 À/pixel au niveau du détecteur) en utilisant une plage de défocalisation de -0,8 à -1,2 pm. Les images ont été enregistrées dans des conditions faible dose par une caméra CCD Gatan 4096 χ 4096 pixels. Pour le jeu de données de reconstruction à inclinaison conique aléatoire (RCT) , les images ont été collectées à -56° et 0°. Le prélèvement des particules a été effectué en mode semi-automatique à l'aide d'un e2boxer (Tang, G., Peng, L., Baldwin, P.R., Mann, D.S., Jiang, W. , Rees, I., et Ludtke, S. J. (2007). EMAN2: an extensible image processing suite for électron microscopy. Journal of structural biology 157, 38-46)

Une fenêtre à particules de 224 χ 224 pixels a été utilisée pour tous les jeux de données. Tous les jeux de données ont

été filtrés par un filtre passe-bande à une coupure passe-haut à 200 Â ou une coupure passe-bas à 20 Â. L'analyse statistique multivariée itérative (MSA) et l'alignement multi-référence (MRA) sous Imagic (van Heel, M. , Harauz, G., Orlova, E.V., Schmidt, R., et Schatz, M. (1996) . A new génération of the IMAGIC image processing System. Journal of structural biology 116, 17-24) des particules extraites ont généré des vues 2D représentatives des complexes du HCMV. En moyenne, environ 20 particules étaient incluses par classe.

Le complexe pentamère obtenu à l'aide de la procédure décrite avait des propriétés sensiblement identiques au type sauvage. Il a été capable de se lier à des Fab neutralisants, il a été analysé par SDS-PAGE et SEC à un poids moléculaire apparent similaire, et n'a pas pu être distingué en microscopie électronique. Voir, FIG. 1A-1D.

De manière significative, ces mutants ont également suscité une réponse immunitaire similaire à celle du type sauvage chez les souris Balb C. Voir, FIG. 2. 3. Exemple 2 : Purification par affinité

Dans cet exemple, nous montrons qu'en attachant une étiquette Strep sur la région C-terminale de pUL130, et qu'en procédant ensuite à une purification d'affinité, la contamination gH/gL a été considérablement éliminée.

Des cellules 293EBNA ont été transfectées avec des plasmides codant pour des sous-unités individuelles. Les protéines ont été purifiées à partir des surnageants de cellules de mammifères par chromatographie d'affinité sur résine Strep-Tactine Superflow Plus (Qiagen, Valencia, CA,

Etats-Unis) en utilisant une étiquette Strep-tag II sur des sous-unités pUL130. Le complexe a été élué à partir de la résine par compétition avec un tampon d'élution (25 mM Hepes pH 7,5, 300 mM NaCl) contenant 5 mM de Desthiobiotine. Les complexes ont ensuite été soumis à une chromatographie par exclusion de tailles (SEC) sur une colonne Superose 6 PC 3.2/30 (GE Healthcare, Uppsala, Suède) équilibrée dans le tampon d'élution.

La purification peut s'effectuer en une seule étape et le complexe pentamère obtenu était sensiblement homogène, et sensiblement exempt de dimères gH/gL (données non illustrées). 4 . Exemple 3 : Echange d ' ions

Dans cet Exemple, nous montrons que, par chromtographie d'échange d'ions, la contamination gH/gL a été considérablement éliminée.

Plus spécifiquement, une colonne d'échange d'ions a été utilisée. Le complexe pentamère contenant la contamination gH/gL a été initialement dialysé dans un tampon 20mM MES pH 6,0, 50 mM NaCl. Cet échantillon a ensuite été chargé sur une colonne MonoS PC 1.6/5. Le complexe pentamère a été retenu sur la colonne tandis que l'excédent de gH/gL était présent dans la fraction non liée. Le complexe pentamère a été purifié sans contamination gH/gL à partir de la colonne MonoS avec un tampon 20 mM MES pH 6,0, 250 mM NaCl (données non illustrées).

La description sera mieux comprise au vu des enseignements des références citées dans la présente. Les modes de réalisation figurant dans la description illustrent des modes de réalisation selon l'invention et ne doivent pas être interprétés comme en limitant sa portée. L'homme du métier comprendra facilement que de nombreux autres modes de réalisation sont englobés par l'invention. Toutes les publications et tous les brevets cités dans la présente divulgation sont incorporés par référence dans leur totalité. Dans le cas où la littérature incorporée par référence contredit ou est incohérente avec la présente description, la présente description prévaudra. La citation de références dans la présente n'est pas une admission selon laquelle ces références représenteraient l'art antérieur vis-à-vis de la présente invention. L'homme du métier comprendra, reconnaîtra, ou sera capable d'établir, juste par une expérimentation de routine, de nombreux équivalents aux modes de réalisation spécifiques de l'invention décrits ici. Ces équivalents sont destinés à être englobés par les modes de réalisation revendiqués.

Les modes de réalisation particuliers de l'invention comprennent : 1. Une protéine gL isolée du cytomégalovirus (CMVj , ou un fragment formant complexe de celle-ci, portant une modification d'acide aminé telle, qu'en présence de quantités molaires sensiblement égales de protéines gH, pULl28, pUL130, pUL131, et de ladite gL du CMV ou du fragment formant complexe de celles-ci : (i) au moins 90 % des molécules gL, ou du fragment formant complexe de celles-ci, forment un complexe pentamère comprenant gH, pUL128, pUL130, pUL131, et ladite gL ou un fragment formant complexe de celles-ci ; (ii) pas plus de 10 % des molécules gL, ou du fragment formant complexe de celles-ci, forment un complexe dimère constitué par gH et ladite gL ou un fragment formant complexe de celles-ci ; ou (iii) ladite modification d'acide aminé réduit la quantité de complexes dimères, constitués par gH, et ladite gL ou un fragment formant complexe de celles-ci, d'au moins 50 %, par rapport à une protéine gL, ou à un fragment formant complexe de celle-ci, sans ladite modification d'acide aminé. 2. La protéine gL selon le mode de réalisation 1, dans laquelle au moins 90 % des molécules gL, ou du fragment formant complexe de celles-ci, forment un complexe pentamère comprenant gH, püL128, pUL130, pUL131, et ladite gL ou un fragment formant complexe de celles-ci. 3. La protéine gL selon le mode de réalisation 1 ou 2, dans laquelle au moins 95 % des molécules gL, ou du fragment formant complexe de celles-ci, forment un complexe pentamère comprenant gH, pUL128, pUL130, pUL131, et ladite gL ou un fragment formant complexe de celles-ci. 4. La protéine gL selon le mode de réalisation 1, dans laquelle pas plus de 10 % des molécules gL, ou du fragment formant complexe de celles-ci, forment un complexe dimère constitué par gH et gL ou un fragment formant complexe de celles-ci. 5. La protéine gL selon le mode de réalisation 1 ou 4, dans laquelle pas plus de 5 % des molécules gL, ou du fragment formant complexe de celles-ci, forment un complexe dimère constitué par gH, et gL ou un fragment formant complexe de celles-ci. 6. La protéine gL selon le mode de réalisation 1, dans laquelle ladite modification d'acide aminé réduit la quantité de complexes dimères, constitués par gH, et gL ou un fragment formant complexe de celles-ci, d'au moins 50 %, par rapport à une protéine gL, ou à un fragment formant complexe de celle-ci, sans ladite modification d'acide aminé. 7. La protéine gL selon le mode de réalisation 1 ou 6, dans laquelle ladite modification d'acide aminé réduit la quantité de complexes dimères, constitués par gH, et gL ou un fragment formant complexe de celles-ci, d'au moins 75 %, par rapport à une protéine gL, ou à un fragment formant complexe de celle-ci, sans ladite modification d'acide aminé. 8. La protéine gL selon l'un quelconque des modes de réalisation 1 et 6-7, dans laquelle ladite modification d'acide aminé réduit la quantité de complexes dimères constitués par gH, et gL ou un fragment formant complexe de celles-ci, d'au moins 90 %, par rapport à une protéine gL, ou à un fragment formant complexe de celle-ci, sans ladite modification d'acide aminé. 9. La protéine gL selon l'un quelconque des modes de réalisation 1-8, dans laquelle ladite modification d'acide aminé s'opère sur un résidu d'acide aminé correspondant à Cys47 de SEQ ID No :1, Cys54 de SEQ ID No :1, Cysl44 de SEQ ID No : 1. 10. La protéine gL selon le mode de réalisation 9, dans laquelle le résidu d'acide aminé correspondant à Cys47 de SEQ ID No :1 est absent, ou est un résidu d'acide aminé autre que Cystéine. 11. La protéine gL selon le mode de réalisation 10, dans laquelle le résidu d'acide aminé correspondant à Cys47 de SEQ ID No :1 est Glycine, Sérine ou Alanine. 12. La protéine gL selon l'un quelconque des modes de réalisation 9-11, dans laquelle le résidu d'acide aminé correspondant à Cys54 de SEQ ID No :1 est absent, ou est un résidu d'acide aminé autre que Cystéine. 13. La protéine gL selon le mode de réalisation 12, dans laquelle le résidu d'acide aminé correspondant à Cys54 de SEQ ID No :1 est Glycine, Sérine ou Alanine. 14. La protéine gL selon l'un quelconque des modes de réalisation 9-13, dans laquelle le résidu d'acide aminé correspondant à Cysl44 de SEQ ID No :1 est absent, ou est un résidu d'acide aminé autre que Cystéine. 15. La protéine gL selon le mode de réalisation 14, dans laquelle le résidu d'acide aminé correspondant à Cysl44 de SEQ ID No :1 est Glycine, Sérine ou Alanine. 16. La protéine gL selon l'un quelconque des modes de réalisation 1-15, dans laquelle ladite modification d'acide aminé s'opère sur un résidu d'acide aminé adjacent à la position correspondant à Cys47 de SEQ ID No :1, Cys54 de SEQ ID No :1, ou Cysl44 de SEQ ID No :1. 17. La protéine gL selon le mode de réalisation 16, dans laquelle le résidu d'acide aminé adjacent à la position correspondant à Cys47 de SEQ ID No :1 comprend une chaîne latérale encombrante. 18. La protéine gL selon le mode de réalisation 16 ou 17, dans laquelle le résidu d'acide aminé adjacent à la position correspondant à Cys54 de SEQ ID No :1 comprend une chaîne latérale encombrante. 19. La protéine gL selon le mode de réalisation 16-17, dans laquelle le résidu d'acide aminé adjacent à la position correspondant à Cysl44 de SEQ ID No :1 comprend une chaîne latérale encombrante. 20. Un complexe trimère isolé comprenant la protéine gL selon l'un quelconque des modes de réalisation 1-19, et qui comprend en outre les protéines du CMV suivantes : gH ou un fragment formant complexe de gH, et gO ou un fragment formant complexe de gO. 21. Un complexe pentamère isolé comprenant la protéine gL selon l'un quelconque des modes de réalisation 1-19, et qui comprend en outre les protéines du CMV suivantes : pUL128 ou un fragment formant complexe de pUL128, pULl30 ou un fragment formant complexe de pUL130, pUL131 ou un fragment formant complexe de pUL131, et gH ou un fragment formant complexe de gH. 22. Un acide nucléique comprenant une séquence qui code pour la protéine gL selon l'un quelconque des modes de réalisation 1-19. 23. L'acide nucléique selon le mode de réalisation 22, comprenant en outre une séquence qui code pour une protéine du CMV choisie dans le groupe constitué par : pUL128 ou un fragment formant complexe de pUL128, pUL130 ou un fragment formant complexe de pUL130, pUL131 ou un fragment formant complexe de pULl31, et gH ou un fragment formant complexe de gH, et une combinaison de ceux-ci. 24. L'acide nucléique selon le mode de réalisation 22 ou 23, dans lequel ledit acide nucléique est une molécule d'ADN. 25. L'acide nucléique selon le mode de réalisation 22 ou 23, dans lequel ledit acide nucléique est une molécule d'ARN. 26. L'acide nucléique selon le mode de réalisation 25, dans lequel ladite molécule d'ARN est une molécule d'ARN à auto-réplication. 27. Une cellule hôte comprenant l'acide nucléique selon l'un quelconque des modes de réalisation 22-26. 28. Une composition comprenant (i) la protéine gL selon l'un quelconque des modes de réalisation 1-19, le complexe selon le mode de réalisation 20 ou 21, ou l'acide nucléique selon l'un quelconque des modes de réalisation 22-26, et (ii) un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 29. La composition selon le mode de réalisation 28, comprenant en outre un adjuvant. 30. La protéine gL selon l'un quelconque des modes de réalisation 1-19, le complexe selon le mode de réalisation 20 ou 21, l'acide nucléique selon l'un quelconque des modes de réalisation 22-26, ou la composition selon le mode de réalisation 28 ou 29, destiné à être utilisé pour induire une réponse immunitaire chez un sujet. 31. L'utilisation selon le mode de réalisation 30, dans laquelle la réponse immunitaire comprend la production d’anticorps neutralisants. 32. L'utilisation selon le mode de réalisation 31, dans laquelle lesdits anticorps neutralisants sont indépendants du complément. 33. Une méthode d'induction d'un réponse immunitaire contre le CMV chez un sujet en ayant besoin, comprenant l'administration audit sujet d'une quantité immunologiquement efficace (i) de la protéine gL selon l'un quelconque des modes de réalisation 1-19, (ii) du complexe selon le mode de réalisation 20 ou 21, (iii) de l'acide nucléique selon l'un quelconque des modes de réalisation 22-26, ou (iv) de la composition selon le mode de réalisation 28 ou 29. 34. La méthode selon le mode de réalisation 33, dans laquelle la réponse immunitaire comprend la production d'anticorps neutralisants. 35. La méthode selon le mode de réalisation 34, dans laquelle lesdits anticorps neutralisants sont indépendants du complément. 36. Une méthode de purification du complexe pentamère du CMV à partir d'un échantillon, dans laquelle ledit complexe pentamère comprend les protéines du CMV suivantes : gH ou un fragment formant complexe de gH, gL ou un fragment formant complexe de gL, pUL128 ou un fragment formant complexe de pUL128, pUL130 ou un fragment formant complexe de pUL130, et pUL131 ou un fragment formant complexe de pUL131, comprenant : (i) l'utilisation d'un échantillon comprenant (a) ledit complexe pentamère, et (b) des complexes dimères constitués par : gH ou un fragment formant complexe de gH, et gL ou un fragment formant complexe de gL ; (ii) le passage dudit échantillon dans une colonne de chromatographie d'échange d'ions ; et (iii) la collecte de la fraction qui comprend ledit complexe pentamère à partir de la colonne d'échange d'ions ; dans laquelle (i) pas plus de 10 % des complexes protéiques collectés à partir de ladite fraction sont lesdits complexes dimères ; ou (ii) au moins 90 % des complexes protéiques collectés à partir de ladite fraction sont lesdits complexes pentamères. 37. La méthode selon le mode de réalisation 36, dans laquelle pas plus de 10 % des complexes protéiques collectés à partir de ladite fraction sont des complexes dimères. 38. La méthode selon le mode de réalisation 36 ou 37, dans laquelle pas plus de 5 % des complexes protéiques collectés à partir de ladite fraction sont des complexes dimères. 39. La méthode selon l'un quelconque des modes de réalisation 36-38, dans laquelle au moins 90 % des complexes protéiques collectés à partir de ladite fraction sont des complexes pentamères. 40. La méthode selon l'un quelconque des modes de réalisation 36-39, dans laquelle au moins 95 % des complexes protéiques collectés à partir de ladite fraction sont des complexes pentamères. 41. La méthode selon l'un quelconque des modes de réalisation 36-40, dans laquelle ladite colonne d'échange d'ions est une colonne Mono-S. 42. Une méthode de purification du complexe pentamère du CMV à partir d'un échantillon, dans laquelle ledit complexe pentamère comprend les protéines du CMV suivantes : gH ou un fragment formant complexe de gH, gL ou un fragment formant complexe de gL, pUL128 ou un fragment formant complexe de pUL128, pUL130 ou un fragment formant complexe de pUL130, et pUL131 ou un fragment formant complexe de pUL131, comprenant : (i) l'utilisation d'un échantillon comprenant : (a) ledit complexe pentamère, et (b) des complexes dimères constitués par gH ou un fragment formant complexe de gH, et gL ou un fragment formant complexe de gL, dans laquelle une étiquette de purification par affinité est attachée à l'un des sites suivants : région C-terminale de pUL130, région N-terminale de pUL130, région C-terminale de pUL131, région N-terminale de pUL131, région C-terminale de pUL128, région N-terminale de pUL128, ou une combinaison de ceux-ci, ladite étiquette de purification par affinité se liant spécifiquement à un partenaire de liaison ; (ii) la purification dudit complexe pentamère par une matrice de chromatographie d'affinité, ladite matrice de chromatographie d'affinité comprenant ledit partenaire de liaison immobilisé sur un support solide ; dans laquelle (i) pas plus de 10 % des complexes protéiques obtenus par purification d'affinité sont lesdits complexes dimères ; ou (ii) au moins 90 % des complexes protéiques obtenus par purification d'affinité sont lesdits complexes pentamères. 43. La méthode selon le mode de réalisation 42, dans laquelle pas plus de 10 % des complexes protéiques obtenus par purification d'affinité sont lesdits complexes dimères. 44. La méthode selon le mode de réalisation 42 ou 43, dans laquelle pas plus de 5 % des complexes protéiques obtenus par purification d'affinité sont lesdits complexes dimères. 45. La méthode selon l'un quelconque des modes de réalisation 42-44, dans laquelle au moins 90 % des complexes protéiques obtenus par purification d'affinité sont lesdits complexes pentamères. 46. La méthode selon l'un quelconque des modes de réalisation 42-45, dans laquelle au moins 95 % des complexes protéiques obtenus par purification d'affinité sont lesdits complexes pentamères. 47. La méthode selon l'un quelconque des modes de réalisation 42-46, dans laquelle ladite étiquette de purification par affinité est attachée à l'un des sites suivants : région C-terminale de pUL130, région N-terminale de pUL130, région C-terminale de pUL131, région N-terminale de pUL131, région C-terminale de pUL128, région N-terminale de pULl28, ou une combinaison de ceux-ci, par une liaison covalente. 48. La méthode selon l'un quelconque des modes de réalisation 42-47, dans laquelle ladite étiquette de purification par affinité est une étiquette Strep. 49. La méthode selon l'un quelconque des modes de réalisation 42-48, comprenant en outre l'élimination de ladite étiquette de purification par affinité du complexe pentamère purifié. 50. Une protéine pUL130 recombinante du cytomégalovirus (CMV) , ou un fragment formant complexe de celle-ci, comprenant une étiquette de purification par affinité qui est attachée à l'extrémité N-terminale ou à l'extrémité C-terminale de ladite protéine pUL130. 51. Une protéine pUL128 recombinante du cytomégalovirus (CMV), ou un fragment formant complexe de celle-ci, comprenant une étiquette de purification par affinité qui est attachée à l'extrémité N-terminale ou à l'extrémité C-terminale de ladite protéine pUL128. 52. Une protéine pUL131 recombinante du cytomégalovirus (CMV), ou un fragment formant complexe de celle-ci, comprenant une étiquette de purification par affinité qui est attachée à l'extrémité N-terminale ou à l'extrémité C-terminale de ladite protéine pUL131. 53. La protéine recombinante selon l'un quelconque des modes de réalisation 50-52, dans laquelle ladite étiquette de purification par affinité est une étiquette Strep. 54. La protéine recombinante selon l'un quelconque des modes de réalisation 50-53, dans laquelle ladite étiquette de purification par affinité est attachée par covalence à l'extrémité N ou à l'extrémité C de ladite protéine. 55. Un complexe pentamère isolé comprenant la protéine pUL130, ou un fragment formant complexe de celle-ci, selon l'un quelconque des modes de réalisation 50 et 53-54, et comprenant en outre les protéines du CMV : gH ou un fragment formant complexe de gH, gL ou un fragment formant complexe de gL, pUL128 ou un fragment formant complexe de pUL128, et pUL131 ou un fragment formant complexe de pUL131. 56. Un complexe pentamère isolé comprenant la protéine pUL128, ou un fragment formant complexe de celle-ci, selon l'un quelconque des modes de réalisation 51 et 53-54, et comprenant en outre les protéines du CMV : gH ou un fragment formant complexe de gH, gL ou un fragment formant complexe de gL, pUL130 ou un fragment formant complexe de pUL130, et pUL131 ou un fragment formant complexe de pUL131. 57. Un complexe pentamère isolé comprenant la protéine pUL131, ou un fragment formant complexe de celle-ci, selon l'un quelconque des modes de réalisation 52-54, et comprenant en outre les protéines du CMV : gH ou un fragment formant complexe de gH, gL ou un fragment formant complexe de gL, pUL130 ou un fragment formant complexe de pUL130, et pUL128 ou un fragment formant complexe de pUL128. 58. Une protéine gL isolée du cytomégalovirus (CMV), ou un fragment formant complexe de celle-ci, portant une modification d'acide aminé telle, qu'en présence de quantités molaires sensiblement égales de protéine gH, et de ladite gL du CMV ou d'un fragment formant complexe de celles-ci : (i) au moins 90 % des molécules gL, ou du fragment formant complexe de celles-ci, forment un dimère "monomère" constitué par : une copie de gH, et une copie de ladite gL ou du fragment formant complexe de celles-ci ; (ii) pas plus de 10 % des molécules gL, ou du fragment formant complexe de celles-ci, forment un dimère "dimère" constitué par : deux copies de gH, et deux copies de ladite gL ou du fragment formant complexe de celles-ci ; ou (iii) ladite modification d'acide aminé réduit la quantité de dimères "dimères", constitués par deux copies de gH, et deux copies de ladite gL ou du fragment formant complexe de celles-ci, d'au moins 50 %, par rapport à une protéine gL, ou à un fragment formant complexe de celle-ci, sans ladite modification d'acide aminé. 59. La protéine gL selon le mode de réalisation 58, dans laquelle au moins 90 % des molécules gL, ou du fragment formant complexe de celles-ci, forment un dimère "monomère" constitué par : une copie de gH, et une copie de ladite gL ou du fragment formant complexe de celles-ci. 60. La protéine gL selon le mode de réalisation 58 ou 59, dans laquelle au moins 95 % des molécules gL, ou du fragment formant complexe de celles-ci, forment un dimère "monomère" constitué par : une copie de gH, et une copie de ladite gL ou du fragment formant complexe de celles-ci. 61. La protéine gL selon le mode de réalisation 58, dans laquelle pas plus de 10 % des molécules gL, ou du fragment formant complexe de celles-ci, forment un dimère "dimère" constitué par : deux copies de gH, et deux copies de ladite gL ou du fragment formant complexe de celles-ci. 62. La protéine gL selon le mode de réalisation 58 ou 61, dans laquelle pas plus de 5 % des molécules gL, ou du fragment formant complexe de celles-ci, forment un dimère "dimère" constitué par : deux copies de gH, et deux copies de ladite gL ou du fragment formant complexe de celles-ci. 63. La protéine gL selon le mode de réalisation 58, dans laquelle ladite modification d'acide aminé réduit la quantité de dimères "dimères", constitués par deux copies de gH, et deux copies de ladite gL ou du fragment formant complexe de celles-ci, d'au moins 50 %, par rapport à une protéine gL, ou à un fragment formant complexe de celle-ci, sans ladite modification d'acide aminé. 64. La protéine gL selon le mode de réalisation 58 ou 63, dans laquelle ladite modification d'acide aminé réduit la quantité de dimères "dimères", constitués par deux copies de gH, et deux copies de ladite gL ou du fragment formant complexe de celles-ci, d'au moins 75 %, par rapport à une protéine gL, ou à un fragment formant complexe de celle-ci, sans ladite modification d'acide aminé. 65. La protéine gL selon l'un quelconque des modes de réalisation 58 et 63-64, dans laquelle ladite modification d'acide aminé réduit la quantité de dimères "dimères", constitués par deux copies de gH, et deux copies de ladite gL ou du fragment formant complexe de celles-ci, d'au moins 90 %, par rapport à une protéine gL, ou à un fragment formant complexe de celle-ci, sans ladite modification d'acide aminé. 66. La protéine gL selon l'un quelconque des modes de réalisation 58-65, dans laquelle ladite modification d'acide aminé s'opère sur un résidu d'acide aminé correspondant à Cysl44 de SEQ ID No :1. 67. La protéine gL selon le mode de réalisation 66, dans laquelle le résidu d'acide aminé correspondant à Cysl44 de SEQ ID No :1 est absent, ou est un résidu d'acide aminé autre que Cystéine. 68. La protéine gL selon le mode de réalisation 67, dans laquelle le résidu d'acide aminé correspondant à Cysl44 de SEQ ID No :1 est Glycine, Sérine ou Alanine. 69. La protéine gL selon l'un quelconque des modes de réalisation 58-65, dans laquelle ladite modification d'acide aminé s'opère sur un résidu d'acide aminé adjacent à la position correspondant à Cysl44 de SEQ ID No :1. 70. La protéine gL selon le mode de réalisation 69, dans laquelle ledit résidu d'acide aminé adjacent à la position correspondant à Cysl44 de SEQ ID No :1 comprend une chaîne latérale encombrante. 71. Un dimère "monomère" isolé constitué par une copie de la protéine gL selon l'un quelconque des modes de réalisation 58-70, et une copie de gH ou d'un fragment formant complexe de gH. Séquences SEQ ID NO : 1 (gL issue de la souche Merlin du HCMV = GI:39842115)

MCRRPDCGFSFSPGPVILLWCCLLLPIVSSAAVSVAPTAAEKVPAECPELTRRCLLGEVFEGDKYESWLRPLVNV TGRDGPLSQLIRYRPVTPEAANSVLLDEAFLDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECGDGSPA VYTCVDDLCRGYDLTRLSYGRSIFTEHVLGFELVPPSLFNVWAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGL YNAVKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPPELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR SEQ ID NO : 2 (gL issue de la souche Towne du HCMV = GI: 239909463)

MCRRPDCGFSFSPGPVALLWCCLLLPIVSSATVSVAPTVAEKVPAECPELTRRCLLGEVFQGDKYESWLRPLVNV TRRDGPLSQLIRYRPVTPEAANSVLLDDAFLDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECGDGSPA VYTCVDDLCRGYDLTRLSYGRSIFTEHVLGFELVPPSLFNVWAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGL YNAVKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPPELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR SEQ ID NO : 3 (gL issue de la souche AD169 du HCMV = GI:2506510)

MCRRPDCGFSFSPGPWLLWCCLLLPIVSSVAVSVAPTAAEKVPAECPELTRRCLLGEVFQGDKYESWLRPLVNV

TRRDGPLSQLIRYRPVTPEAANSVLLDDAFLDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECGDGSPA

VYTCVDDLCRGYDLTRLSYGRSIFTEHVLGFELVPPSLFNWVAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGL

YNAVKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPPELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR SEQ ID NO : 4 (protéine gL mature constituée par les résidus d'acides aminés 31-278 de SEQ ID NO : 1)

AAVSVAPTAAEKVPAECPELTRRCLLGEVFEGDKYESWLRPLVNVTGRDGPLSQLIRYRPVTPEAANSVLLDEAF

LDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECGDGSPAVYTCVDDLCRGYDLTRLSYGRSIFTEHVLG

FELVPPSLFNVWAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGLYNAVKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPP

ELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR

Claims

REVENDICATIONS

1. Protéine gL isolée du cytomégalovirus (CMV), ou fragment formant complexe de celle-ci, portant une modification d'acide aminé telle, qu'en présence de quantités molaires sensiblement égales de protéines gH, pUL128, pUL130, pUL131, et de ladite gL du CMV ou du fragment formant complexe de celles-ci : (i) au moins 90 % des molécules gL, ou du fragment formant complexe de celles-ci, forment un complexe pentamère comprenant gH, pUL128, pUL130, pUL131, et ladite gL ou un fragment formant complexe de celles-ci ; (ii) pas plus de 10 % des molécules gL, ou du fragment formant complexe de celles-ci, forment un complexe dimère constitué par : gH et ladite gL ou un fragment formant complexe de celles-ci ; ou (iii) ladite modification d'acide aminé réduit la quantité de complexes dimères, constitués par : gH et ladite gL ou un fragment formant complexe de celles-ci, d'au moins 50 %, par rapport à une protéine gL, ou à un fragment formant complexe de celle-ci, sans ladite modification d'acide aminé.
2. Protéine gL selon la revendication 1, dans laquelle au moins 95 % des molécules gL, ou du fragment formant complexe de celles-ci, forment un complexe pentamère comprenant gH, pUL128, pUL130, pUL131, et ladite gL ou un fragment formant complexe de celles-ci.
3. Protéine gL selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle pas plus de 5 % des molécules gL, ou du fragment formant complexe de celles-ci, forment un complexe dimère constitué par gH, et gL ou un fragment formant complexe de celles-ci.
4. Protéine gL selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle ladite modification d'acide aminé s'opère sur un résidu d'acide aminé correspondant à Cys47 dans SEQ ID No : 1, Cys54 dans SEQ ID No : 1, Cysl44 dans SEQ ID No : 1, ou une combinaison de ceux-ci.
5. Protéine gL selon la revendication 4, dans laquelle le résidu d'acide aminé correspondant à Cys47 de SEQ ID No : 1, Cys54 de SEQ ID No : 1, Cysl44 de SEQ ID No : 1, ou une combinaison de ceux-ci, est absent, ou est un résidu d'acide aminé autre que Cystéine.
6. Protéine gL selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle ladite modification d'acide aminé s'opère sur un résidu d'acide aminé adjacent à la position correspondant à Cys47 de SEQ ID No : 1, Cys54 de SEQ ID No : 1, Cysl44 de SEQ ID No : 1, ou une combinaison de ceux-ci.
7. Protéine gL selon la revendication 6, dans laquelle le résidu d'acide aminé adjacent à la position correspondant à Cys47 de SEQ LD No : 1, Cys54 de SEQ ID No : 1, Cysl44 de SEQ ID No : 1, ou une combinaison de ceux-ci, comprend une chaîne latérale encombrante.
8. Complexe trimère isolé comprenant la protéine gL selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, et qui comprend en outre les protéines du CMV suivantes : gH ou un fragment formant complexe de gH, et gO ou un fragment formant complexe de gO.
9. Complexe pentamère isolé comprenant la protéine gL selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, et qui comprend en outre les protéines du CMV: pUL128 ou un fragment formant complexe de pUL128, pUL130 ou un fragment formant complexe de pUL130, pUL131 ou un fragment formant complexe de pUL131, et gH ou un fragment formant complexe de gH.
10. Acide nucléique comprenant une séquence qui code pour la protéine gL selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 .
11. Cellule hôte comprenant l'acide nucléique selon la revendication 10.
12. Composition comprenant (i) la protéine gL selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, le complexe selon la revendication 8 ou 9, ou l'acide nucléique selon la revendication 10, et (ii) un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
13. Protéine gL selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, complexe selon la revendication 8 ou 9, acide nucléique selon la revendication 10, ou composition selon la revendication 12, destiné à être utilisé pour induire une réponse immunitaire chez un sujet.
14. Méthode de purification du complexe pentamère du CMV à partir d’un échantillon, dans laquelle ledit complexe pentamère comprend les protéines du CMV suivantes : gH ou un fragment formant complexe de gH, gL ou un fragment formant complexe de gL, pULl28 ou un fragment formant complexe de pUL128, pUL130 ou un fragment formant complexe de pUL130, et pUL131 ou un fragment formant complexe de pUL131, comprenant : (i) l'utilisation d'un échantillon comprenant (a) ledit complexe pentamère, et (b) des complexes dimères constitués par : gH ou un fragment formant complexe de gH, et gL ou un fragment formant complexe de gL ; (ii) le passage dudit échantillon dans une colonne de chromatographie d'échange d'ions ; et (iii) la collecte de la fraction qui comprend ledit complexe pentamère à partir de la colonne d'échange d'ions ; dans laquelle (i) pas plus de 10 % des complexes protéiques collectés à partir de ladite fraction sont lesdits complexes dimères ; ou (ii) au moins 90 % des complexes protéiques collectés à partir de ladite fraction sont lesdits complexes pentamères.
15. Méthode de purification du complexe pentamère du CMV à partir d'un échantillon, dans laquelle ledit complexe pentamère comprend les protéines du CMV suivantes : gH ou un fragment formant complexe de gH, gL ou un fragment formant complexe de gL, pUL128 ou un fragment formant complexe de pUL128, pUL130 ou un fragment formant complexe de pUL130, et pUL131 ou un fragment formant complexe de pUL131, comprenant : (i) l'utilisation d'un échantillon comprenant : (a) ledit complexe pentamère, et (b) des complexes dimères constitués par : gH ou un fragment formant complexe de gH, et gL ou un fragment formant complexe de gL ; dans laquelle une étiquette de purification par affinité est attachée à l'un des sites suivants : région C-terminale de pUL130, région N-terminale de pUL130, région C-terminale de pUL131, région N-terminale de pUL131, région C-terminale de pUL128, région N-terminale de pUL128, ou une combinaison de ceux-ci, ladite étiquette de purification par affinité se liant spécifiquement à un partenaire de liaison ; (ii) la purification dudit complexe pentamère par une matrice de chromatographie d'affinité, ladite matrice de chromatographie d'affinité comprenant ledit partenaire de liaison immobilisé sur un support solide ; dans laquelle (i) pas plus de 10 % des complexes protéiques obtenus par purification d'affinité sont lesdits complexes dimères ; ou (ii) au moins 90 % des complexes protéiques obtenus par purification d'affinité sont lesdits complexes pentamères.