BE1032965B1 - Primerpaar und sonde für recombinase-polymerase-amplifikation zum schnellen nachweis von rhizoctonia solani - Google Patents
Primerpaar und sonde für recombinase-polymerase-amplifikation zum schnellen nachweis von rhizoctonia solaniInfo
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Abstract
Die Erfindung offenbart ein Primerpaar und eine Sonde für RPA zum schnellen Nachweis von Rhizoctonia solani und gehört zum technischen Gebiet des Pathogennachweises. Die Nukleotidsequenzen des Primerpaares sind in SEQ ID NO. 1 und SEQ ID NO. 2 dargestellt, und die Nukleotidsequenz der Sonde ist in SEQ ID NO. 3 gezeigt. Die Erfindung entwirft Primerpaare und Sonden für RPA auf der Grundlage der ITS-Gensequenz von Rhizoctonia solani, optimiert die Reaktionsbedingungen und etabliert eine Echtzeit-Fluoreszenz-Schnellnachweisverfahren für RPA von Rhizoctonia solani. Das durch die Erfindung bereitgestellte Verfahren zum schnellen Nachweis von Rhizoctonia solani weist eine hohe Spezifität und Empfindlichkeit auf und ist einfach handzuhaben, so dass es eine technische Unterstützung für den schnellen Nachweis von Rhizoctonia solani bietet.
Description
PRIMERPAAR UND SONDE FUR RECOMBINASE-POLYMERASE-AMPLIFIKATION ZUM
SCHNELLEN NACHWEIS VON RHIZOCTONIA SOLANI
TECHNISCHES GEBIET
Die Erfindung betrifft das technische Gebiet des Pathogennachweises und insbesondere ein Primerpaar und eine Sonde für Recombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) zum schnellen Nachweis von Rhizoctonia solani.
STAND DER TECHNIK
Rhizoctonia solani ist ein wichtiger bodenbürtiger pathogener Pilzschädling der Gattung
Rhizoctonia, der eine große Anzahl von Wirten hat und 263 Pflanzenarten aus 43 Familien infiziert, darunter Leguminosae, Poaceae und Cruciferae und andere wichtige Nutzpflanzen.
Der Pilz kann in Krankheitsrückständen in Form von Myzel oder Sklerotien vorkommen und hat ein breites Spektrum von Wirten. Sobald sich der Pilz durch den Transport und andere
Mittel ausbreitet und die Anbaufläche schädigt, kann er zu Ertragsminderungen und in schwerwiegenden Fällen sogar zu Ernteausfällen führen, wodurch in der landwirtschaftlichen
Produktion erhebliche wirtschaftliche Verluste entstehen. Rhizoctonia solani wird entspre- chend der Fusionsfähigkeit zwischen Myzelzellen in mehrere Fusionsgruppen eingeteilt.
Derzeit erfolgt die Klassifizierung und Identifizierung hauptsächlich über die Methoden wie
Myzelfusion, internal transcribed spacer (ITS) von rDNA, Isoenzym usw. Gegenwärtig wer- den Schäden durch Rhizoctonia solani in Kartoffelanbaugebieten gemeldet, und die Kartoffe- lerträge sind ernsthaft beeinträchtigt. Daher sind eine frühzeitige Erkennung und Prävention erforderlich. Die Erkennung von Krankheiten im Feld und andere Technologien sind dabei wichtige Instrumente, um eine gute Feldbewirtschaftung sicherzustellen und landwirtschaftli- che Verluste durch den Pilz zu verringern. Bei Feldtests vor Ort ist eine hohe Effizienz bei der Identifizierung erforderlich, und die vorhandenen Technologien können die tatsächlichen
Arbeitsanforderungen hinsichtlich Geschwindigkeit und Empfindlichkeit nur schwer erfüllen.
Mit der Entwicklung der molekularen Biotechnologie werden DNA-basierte molekulare
Markertechniken wie RAPD, RFLP, Echtzeit-Fluoreszenz-PCR, LAMP, RPA-LFD usw. in großem Umfang zum Nachweis und zur Identifizierung von Arten eingesetzt. Bei der Re- kombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) handelt es sich um eine isotherme Nukleinsäu- reamplifikationstechnik, die aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit, hohen Spezifität und einfa- chen Handhabung in vielen Bereichen weit verbreitet ist und in den letzten Jahren zum schnellen Nachweis und zur frühzeitigen Identifizierung von Pflanzenpathogenen eingesetzt wurde. RPA-Amplifikationsprodukte können durch Gelelektrophorese, Fluoreszenzmarkie- rung und Teststreifen nachgewiesen werden, wobei die RPA-Echtzeit-Fluoreszenzdetektion die Ergebnisse in Echtzeit während des Amplifikationsprozesses beobachten kann und über die schnellste Detektionsgeschwindigkeit verfügt. Derzeit ist die molekulare Technologie für
Rhizoctonia solani nur TaqMan qPCR-Nachweistechnologie, und es gibt weniger Studien über den schnellen Nachweis von RPA von Rhizoctonia solani, und es gibt nur ein Teststrei- fen-Nachweismethode von RPA für Rhizoctonia solani, die Blattfleckenkrankheit des Tabaks verursacht, konstruiert. Die vorliegende Erfindung schafft ein Echtzeit-Fluoreszenz-
Nachweisverfahren für RPA von Rhizoctonia solani, das eine technische Unterstützung für den schnellen Nachweis von Rhizoctonia solani bietet.
INHALT DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Primerpaar und eine Sonde für RPA zum schnellen Nachweis von Rhizoctonia solanı bereitzustellen, um die bestehenden Probleme des Standes der Technik zu lösen, und das durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte
Verfahren zum schnellen Nachweis von Rhizoctonia solani hat eine hohe Spezifität, eine hohe Empfindlichkeit und ist einfach zu bedienen, was eine technische Unterstützung für den schnellen Nachweis von Rhizoctonia solani bietet.
Um die oben genannten Ziele zu erreichen, sieht die vorliegende Erfindung folgende Lö- sungen vor:
Die vorliegende Erfindung stellt ein ein Primerpaar und eine Sonde für RPA zum schnel- len Nachweis von Rhizoctonia solani bereit, wobei Nukleotidsequenzen des Primerpaares wie in SEQ ID NO. 1 und SEQ ID NO. 2 gezeigt sind und eine Nukleotidsequenz der Sonde wie in SEQ ID NO. 3 gezeigt ist.
Optional ist die Sonde mit 6-FAM an einem 5'-Ende und BHQ1 an einem 3'-Ende modi- fiziert.
Die vorliegende Erfindung sieht auch eine Anwendung des Primerpaares und der Sonde bei der Herstellung eines Kits zum schnellen Nachweis von Rhizoctonia solani vor.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Kit zum schnellen Nachweis von Rhizoctonia solani bereit, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es das Primerpaar und die Sonde um- fasst.
Die vorliegende Erfindung sieht auch eine Anwendung des Primerpaares und der Sonde oder des Kits beim Nachweis von Rhizoctonia solani vor.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Nachweis von Rhizoctonia so-
Jani bereit, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es folgende Schritte umfasst:
Verwenden einer DNA einer zu testenden Probe als Vorlage und Durchführen einer
Echtzeit-Fluoreszenz-RPA-Reaktion unter Verwendung des Primerpaars und der Sonde und dann Bestimmen auf der Grundlage des Vorhandenseins oder Fehlens einer Amplifikations- kurve, ob es sich bei der zu testenden Probe um Rhizoctonia solani handelt.
Optional, wenn die Amplifikationskurve erscheint, wird bestimmt, dass es sich bei der zu testenden Probe um Rhizoctonia solani handelt; wenn keine Amplifikationskurve erscheint, wird bestimmt, dass es sich bei der zu testenden Probe nicht um Rhizoctonia solani handelt.
Optional beträgt eine Temperatur der Echtzeit-Fluoreszenz-RPA-Reaktion 39°C.
Optional umfasst ein System der Echtzeit-Fluoreszenz-RPA-Reaktion jeweils 2 uL Vor- wärts- und Rückwärts-Primer, 29,5 uL Rehydrationspuffer, 1 uL DNA-Vorlage, 12,4 uL dop- pelt destilliertes Wasser (ddH2O), 0,6 uL Sonde und 2,5 uL Magnesiumacetat-Lôsung.
Die vorliegende Erfindung offenbart folgende technische Effekte:
In dieser Studie werden auf der Grundlage der ITS-Gensequenz von Rhizoctonia solani
Primer bzw. Fluoreszenzsonden für RPA entwickelt und ein Echtzeit-Fluoreszenz- Schnell- nachweisverfahren für RPA von Rhizoctonia solani etabliert sowie die Reaktionsbedingun- gen optimiert. Die vorliegende Erfindung stellt ein Echtzeit-Fluoreszenznachweisverfahren für RPA zur Verfügung, das Rhizoctonia solani mit einer Empfindlichkeit von bis zu 6x 1072 ng/uL spezifisch von seinen herkunftsnahen Arten unterscheiden kann, und bietet eine tech- nische Unterstützung für den schnellen Nachweis von Rhizoctonia solani.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
Um die Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung oder die technischen Lôsun- gen im Stand der Technik deutlicher zu veranschaulichen, werden die beigefügten Zeich- nungen, die in den Ausführungsbeispielen verwendet werden sollen, nachfolgend kurz be- schrieben, und es ist offensichtlich, dass die in folgende Beschreibungen begleitenden
Zeichnungen lediglich einige Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung sind, und
Fachleute können weitere Zeichnungen gemäß diesen Zeichnungen erhalten, ohne dass ein erfinderischer Aufwand beteiligt ist.
Fig. 1 zeigt eine Optimierung der Reaktionstemperatur des Nachweissystems für RPA von
Rhizoctonia solani.
Fig. 2 zeigt eine Validierung der RPA-Spezifität von Rhizoctonia solani durch Gelelektro- phorese; wobei M: DL2000-Marker; 1: Rhizoctonia solani, 2: Fusarium oxysporum; 3:
Colletotrichum gloeosporioides penz.; 4: Botrytis cinerea; 5: Puccinia polysora; 6:
Puccinia striiformis; CK: ddH20.
Fig. 3 zeigt eine Validierung der RPA-Empfindlichkeit von Rhizoctonia solani durch Gel- elektrophorese; wobei M: DL2000 Marker; 1-7 sind in der Reihenfolge Verdünnungen der ursprünglichen Konzentration von 10719-10°8; CK: ddH:O.
AUSFUHRLICHE BESCHREIBUNG
Verschiedene beispielhafte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden nun im Detail beschrieben, und diese ausführliche Beschreibung sollte nicht als Einschränkung der vorliegenden Erfindung betrachtet werden, sondern als eine ausführlichere Beschreibung bestimmter Aspekte, Merkmale und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verstan- den werden.
Es ist zu verstehen, dass die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Begriffe le- diglich zur Beschreibung spezifischer Ausführungsformen dienen, und nicht zur Beschrän- kung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zusätzlich sollen die in der vorliegen- den Erfindung angegebenen Wertebereiche als die spezifische Offenlegung jedes Zwi- schenwerts zwischen der oberen und unteren Grenze dieses Bereichs verstanden werden.
Jeder kleinere Bereich zwischen jedem angegebenen Wert oder Bereich von Aussagen und jedem anderen angegebenen Wert oder einem Zwischenwert innerhalb des Bereichs ist ebenfalls in der vorliegenden Erfindung enthalten. Die oberen und unteren Grenzen dieser kleineren Bereiche können unabhängig voneinander in den Bereich einbezogen oder ausge- schlossen werden.
Sofern nicht anders angegeben, haben alle hierin verwendeten technischen und wis- senschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, wie sie von Fachleuten auf dem Gebiet der vorliegenden Erfindung allgemein verstanden werden. Während die vorliegende Erfindung nur bevorzugte Verfahren und Materialien beschreibt, kann jedes Verfahren und Material, das ähnlich oder äquivalent zu dem hierin beschriebenen ist, auch bei der Durchführung oder Prüfung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Alle in dieser Beschreibung erwähnten Dokumente werden durch Bezugnahme aufgenommen, um Verfahren und/oder
Materialien zu offenbaren und zu beschreiben, die sich auf die genannten Dokumente bezie- hen. Im Falle eines Konflikts mit allen einbezogenen Dokumenten haben die Inhalte dieser
Spezifikation Vorrang.
Verschiedene Modifikationen und Variationen können an den spezifischen Ausführungs- formen der vorliegenden Erfindung vorgenommen werden, ohne vom Umfang oder Geist der vorliegenden Offenbarung abzuweichen, was für Fachleute auf dem Gebiet der Technik of- fensichtlich ist. Andere Ausführungsformen, die durch die Beschreibung der vorliegenden
Erfindung erhalten werden, sind für Fachleute ebenfalls offensichtlich. Die Beschreibungen und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind nur beispielhaft.
Wie hierin verwendet, sind „einschließlich“, „umfassen“, „aufweisen“, „enthalten“ und dergleichen alle offenen Begriffe, d. h. die Bedeutung „einschließlich“, aber nicht „beschränkt auf“.
Ausführungsform 1
1. Materialien und Methoden 1.1 Materialien 1.1.1 Experimentelle Materialien
Teststämme: vier Stämme von Rhizoctonia solani (zwei Stämme der Fusionsgruppe 5 AG-1 und jeweils ein Stamm von AG-4 und AG-5) wurden erfindungsgemäß ausgewählt, von denen AG-4, AG-5 und ein Stamm von AG-1 von Professor Wu Xuehong von der China Ag- ricultural University zur Verfügung gestellt wurden; der andere Stamm von AG-1 wurde von
Herrn Li Mingzhu von der Shaanxi Normal University zur Verfügung gestellt. Fünf Stämme von herkunftsnahen Arten von Rhizoctonia solani wurden verwendet, drunter sind ein Stamm von Puccinia polysora (Hinterlegungsnummer: pdel-PP-3, Hinterlegungsdatum: 23.08.2023) und ein Stamm von Puccinia strijformis (Hinterlegungsnummer: pdel-PR-1, Hinterlegungsda- tum: 14.05.2023), konserviert und zur Verfügung gestellt vom Laboratory of Plant Disease
Epidemiology, China Agricultural University; und darunter sind ein Stamm von Co/letotrichum gloeosporioides penz. (Hinterlegungsnummer: 24137, Hinterlegungsdatum: 13.12.2023), ein
Stamm von Botytis cinerea (Hinterlegungsnummer: 24136, Hinterlegungsdatum: 10.12.2023) und ein Stamm von Fusarium oxysporum (Hinterlegungsnummer: 24138, Hinter- legungsdatum: 14.12.2023), zur Verfügung gestellt von Mingzhu Li, Shaanxi Normal Univer- sity, Shaanxi Province, China.
Tabelle 1: Verwendete Stämme
OO Wissenschaftlicher Name AnzahlderStämme 1 Rhlzoctoniasolani 4
Fusarium oxysporum 1
Colletotrichum gloeosporioides penz. 1
Botrytis cinerea 1
Puccinia polysora 1
Puccinia striformis 1 1.1.2 Hauptreagenzien
PDA-Medium: 200 g Kartoffeln, 16 g Glukose, 16 g Agar-Pulver, mit deionisiertem Was- ser auf 1000 ml auffüllen, in Erlenmeyerkolben zu je 250 ml aufteilen und 20 Minuten lang bei hoher Temperatur (121°C) autoklavieren.
Reagenzien: DNA-Schnellamplifikationskit bei konstanter Temperatur (Basistyp), Amp-
Future (Changzhou) Biotechnology Co., Ltd.; TwistAmpTM Basic Quick Guide Kit, und
TwistAmpTM exo Quick Guide Kit, TwistDx Inc., UK; Rapid Plant Genomic DNA Isolation Kit,
Sangon Biotech; Lösung für Nukleinsäureextraktion, Shanghai Acmec Biochemical Techno- logy Co. Ltd; enzymfreies steriles Wasser, ultrareines Wasser und MIilli-Q-
Reinwassersystem (Millipore, Deutschland); 2% CTAB-Puffer, Beijing Solarbio Science &
Technology Co. Ltd. 1.1.3 Hauptinstrumente
DS-11 Ultra-Mikrovolumen-UV-Spektrophotometer, DeNovix, USA; Elektrophoresegerät
Tanon DYY-11, Beijing Liuyi Biotechnology Co., LTD. Verit'TM 96-Well Schnell-
Thermocycler, Thermo Fisher Scientific; LightCycler 480 Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-
Instrument, Roche, Schweiz. 1.2 DNA-Extraktion
Die DNA sowohl von Rhizoctonia solani als auch von jeder Kontrollprobe wurde mit dem
Rapid Plant Genomic DNA Isolation Kit (Sangon Biotech) extrahiert. Die extrahierte DNA wurde in 50 ul ddH:O gelöst und dann im Kühlschrank bei -20°C für spätere Verwendung aufbewahrt. 1.3 Primer- und Sondenentwurf
Auf der Grundlage der Genomsequenzen der Fusionsgruppe von Rhizoctonia solani und der Kontrollstämme in der NCBI-Datenbank wurden RPA-Primer für Rhizoctonia solani in der
ITS-Region entworfen. Die DNAMAN-Software wurde verwendet, um die ITS-Sequenzen von Rhizoctonia solani (MF447834.1, LC384929.1, HE667746.1) mit den ITS-Sequenzen von anderen Kontrollstämmen (MT968495.1, KC913203.1, KY031689.1, EUO14048.1) zu vergleichen, und je nach der Region, in der sich die Sequenzen unterscheiden, wurde die
Software Primer Premier 5 für den Primerentwurf verwendet, und die Primerspezifität wurde mit Blast getestet, und für den Entwurf der Fluoreszenzsonde RS-P mit 6-FAM-Modifikation am 5'-Ende und BHQ1-Modifikation am 3'-Ende wurde das Online-Sondendesign-Tool Pri- merQuest Tool IDT verwendet. Die Sequenzen von Primer und Sonden wurden zur Synthe- se an Sangon Biotech geschickt, und Sequenzen von Primer und Sonden sind in Tabelle 2 aufgeführt.
Tabelle 2: Sequenzen von Primer und Sonden
Name Sequenz psp -—Ÿÿ ATGTAACGCATCTAATACTAAGTTTCAACAACGG (SEQ ID NO. 1)
RSR AGCATAACACTGAGATCCAGCTAATGAACGA
(SEQ ID NO. 2)
RS-P CAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGGCGTTCTTCATC (SEQ ID NO. 3)
1.4 Aufbau des RPA-Gelelektrophorese-Reaktionssystems
Unter Verwendung der DNA von Rhizoctonia solani als Vorlage und unter Bezugnahme auf die Gebrauchsanweisung des Kits aus Amp-Future wurde das Reaktionssystem wie in
Tabelle 3 dargestellt aufgebaut und die RPA-Reaktionen wurden mit den entsprechenden
RPA-Primern durchgeführt. Das Programm wurde auf eine Reaktionstemperatur von 39°C und eine Reaktionszeit von 30 Minuten eingestellt, und die Produkte wurden nach der Reak- tion bei 4°C gelagert. Die Amplifikationsreaktion wurde auf einem PCR-Gerät durchgeführt.
Am Ende der Reaktion wurden die Amplifikationsprodukte durch 2%ige Agarosegel-
Elektrophorese mit einem Probenvolumen von 5 uL nachgewiesen und die Elektropho- reseergebnisse mit einem Gelbildgebungssystem beobachtet.
Tabelle 3: RPA-Gelelektrophorese-Reaktionssystem von Rhizoctonia solani
OO Reagenzname à Zugabemenge des Reagenz
Vorwärts-/Rückwärts-Primer (10 umol/uL) 2 UL
Ein Puffer 29,5 ul
DNA 2 uL ddH2O 12 pL
Mg°* (280 mmol!) 2,5 ul
Gesamt 50 ul 1.4.1 Optimierung des RPA-Reaktionssystems
Auf der Grundlage des Reaktionssystems in Tabelle 3 wurden sechs Temperaturgradi- enten zur Optimierung eingerichtet, nämlich 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, 41°C und 42°C; nach der Amplifikationsreaktion wurden die Amplifikationsprodukte durch 2%ige Agarosegel-
Elektrophorese mit einem Volumen von 5 uL nachgewiesen, und die optimale Temperatur wurde durch Beobachtung der Elektrophoreseergebnisse bestimmt. 1.4.2 Nachweis der RPA-Spezifität
Die DNA der einzelnen Stämme in Tabelle 1 wurde als Vorlage verwendet, während ddH2O als Leerwertkontrolle festgelegt wurde, und die RPA-Reaktion wurde gemäß dem in
Abschnitt 1.4 beschriebeben RPA-Reaktionssystem durchgeführt. Nach der Reaktion wurden die Amplifikationsprodukte durch 2%ige Agarosegel-Elektrophorese nachgewiesen, und das
Volumen der Probe betrug 5 uL, und die Elektrophoreseergebnisse wurden durch das Gel- bildgebungssystem beobachtet. 1.4.3 RPA-Empfindlichkeitstest
Auf der Grundlage der untersuchten RPA-spezifischen Primer und der untersuchten op- timalen Reaktionsbedingungen wurde die DNA von Rhizoctonia solani als Verdünnungsvor- lage (Anfangskonzentration von 60 ng/uL) verwendet und eine 10-fache Gradientenverdün-
nung durchgeführt, und es wurden sieben Konzentrationsgradienten, d. h. 10°-10%, einge- richtet, die als Vorlage für die RPA-Reaktion verwendet wurden. Die Amplifikationsergebnis- se der Reaktion wurden durch 2%ige Agarosegel-Elektrophorese analysiert. 1.5 Etablierung des RPA-Echtzeit-Fluoreszenz-Reaktionssystems
Das Echtzeit-Fluoreszenz-RPA-Reaktionssystem für Rhizoctonia solani wurde gemäß den Anweisungen des TwistAmp'M exo Quick Guide-Kits (wie in Tabelle 4 dargestellt) vorbe- reitet, und das Reaktionsgefä wurde in das Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-Gerät gestellt, wobei die Reaktionstemperatur 39°C und die Reaktionszeit 30 Minuten betrug und der Fluores- zenzwert des FAM-Kanals einmal alle 30 Sekunden erfasst wurde und die Temperaturände- rungsrate auf 2,2 °C/s eingestellt war.
Tabelle 4: RPA-Echtzeit-Fluoreszenz-Reaktionssystem für Rhizoctonia solani
OO Reaktionssystem 0 SO-pL-System
Vorwärts-/Rückwärts-Primer (10 umol/L) 2 UL
Rehydrationspuffer 29,5 ul
DNA 1 HL ddH2O 12,4 pl
Sonde 0,6 ul
Magnesiumacetat 2,5 ul
Gesamt 50 ul 1.5.1 RPA-Echtzeit-Fluoreszenz-Spezifitätstest
Der RPA-Echtzeit-Fluoreszenz-Spezifitätstest wurde unter Verwendung der DNA von
Rhizoctonia solani und seiner herkunftsnahen Arten als Vorlagen durchgeführt. Das Reakti- onssystem ist in Tabelle 4 dargestellt, und die Spezifität wurde anhand von Fluoreszenzkur- ven nachgewiesen. 1.5.2 RPA-Echtzeit-Fluoreszenzempfindlichkeits-Test
Die Proben von Rhizoctonia solani wurden als DNA-Vorlagen verwendet und in sieben
Gradienten der Verdünnungskonzentration von 10°-107° 10-fach verdünnt, und ddH2O wurde als Negativkontrolle verwendet, und die Empfindlichkeit wurde mit der RPA-
Gelelektrophorese verglichen. 2 Ergebnisse und Analysen 2.1 Optimierung des RPA-Reaktionssystems von Rhizoctonia solani
Um die optimale RPA-Reaktionstemperatur zu ermitteln, wurden insgesamt sechs Tem- peraturgradienten von 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, 41°C und 42°C eingestellt, und die RPA-
Reaktion mit RS-F/RS-R-Primern wurde auf der DNA von Rhizoctonia solani durchgeführt, wobei die Reaktionszeit 25 min betrug. Nach der Reaktion wurden die Amplifikationsproduk-
te durch 2%ige Agarosegel-Elektrophorese nachgewiesen, wie in Fig. 1 dargestellt. Bei der
Betrachtung der Elektrophoreseergebnisse zeigt sich, dass unter den Temperaturbedingun- gen von 37°C, 41°C und 42°C kein Amplifikationsprodukt auftritt, es wird vermutet, dass eine zu hohe oder zu niedrige Temperatur die Aktivität des Enzyms im System beeinflusst; unter den Temperaturbedingungen von 38°C, 39°C und 40°C ist die Helligkeit der amplifizierten
Banden ähnlich, und da die Reaktionstemperaturen an den beiden Enden des Spektrums nahe dem Bereich der Enzyminaktivierung liegen, wird die optimale Reaktionstemperatur des RPA-Nachweissystems in der vorliegenden Erfindung auf 39°C. 2.2 Bewertungsergebnisse der Spezifität
RPA-Elektrophorese und RPA-Echtzeit-Fluoreszenzdetektion wurden unter Verwendung der DNA von Rhizoctonia solani und seiner herkunftsnahen Arten als Vorlagen durchgeführt, und die Ergebnisse der RPA-Echtzeit-Fluoreszenz zeigen, dass nur Rhizoctonia solani of- fensichtliche Amplifikationskurven zeigt, während die anderen herkunftsnahen Arten und die
Negativkontrolle keine offensichtlichen Amplifikationskurven zeigen; die Ergebnisse der
RPA-Elektrophorese zeigen, dass bei Rhizoctonia solani offensichtliche Amplifikationsban- den beobachtet werden kônnen, während bei anderen herkunftsnahen Arten und der Nega- tivkontrolle keine Amplifikationsbanden zu beobachten sind (Fig. 2). Es zeigt, dass sowohl die RPA-Elektrophorese als auch die RPA-Echtzeit-Fluoreszenz Rhizoctonia solani spezi- fisch nachweisen kônnen. 2.3 Ergebnisse des Empfindlichkeitstests
Unter Verwendung der in dieser Studie etablierten RPA-Elektrophorese- und RPA-
Echtzeit-Fluoreszenz-Nachweissysteme werden sieben Gradienten der Verdünnungskon- zentration mit einem 10-fachen Verdünnungsgradienten unter Verwendung der DNA von
Rhizoctonia solani-Proben mit einer anfänglichen Nukleinsäurekonzentration von 60 ng/uL als Vorlage eingerichtet, und der RPA-Echtzeit-Fluoreszenztest weist eine deutliche Amplifi- kationskurve bei einer Konzentration der Vorlage von mehr als 6x107* ng/uL auf, was darauf hindeutet, dass die minimale Nachweisgrenze der RPA-Echtzeit-Fluoreszenzdetektion 6x 10% ng/uL beträgt; die RPA-Gelelektrophorese hat eine deutliche Amplifikationskurve bei einer
Konzentration der Vorlage von mehr als 6x10? ng/uL (Fig. 3), was bedeutet, dass die mini- male Nachweisgrenze des RPA-Gelelektrophorese-Tests 6x 10"! ng/uL beträgt, was niedriger ist als die Empfindlichkeit der RPA-Echtzeit-Fluoreszenzdetektion.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass erfingdungshemäl ein Schnellnachweisver- fahren für Rhizoctonia solani auf der Grundlage der RPA-Echtzeit-Fluoreszenznachweis-
Technologie entwickelt wird, und dass das Verfahren den Prozess und die Ergebnisse der — Amplifikationsreaktion in Echtzeit und genau überwachen kann, und dass die Reaktionsge- schwindigkeit viel schneller ist und es von der Nukleinsäureextraktion bis zur Beobachtung der Ergebnisse nur 40 Minuten dauert, so dass in kürzerer Zeit zuverlässige Ergebnisse er- zielt werden können. Daher ist das in der vorliegenden Erfindung entwickelte Verfahren bes- ser für den Einsatz durch Mitarbeiter an der Basis geeignet, denen die Forschungsgrundlage von Rhizoctonia solani fehlt, um eine frühzeitige Diagnose und Prävention von Rhizoctonia solani auf dem Feld zu realisieren und eine zuverlässigere und effizientere technische Unter- stûtzung für die landwirtschaftliche Produktion und den Pflanzenschutz bereitzustellen.
Die obigen Ausführungsformen beschreiben nur in Bezug auf die bevorzugte Weise der vorliegenden Erfindung, und sind nicht auf den Umfang der vorliegenden Erfindung be- schränkt, und verschiedene Modifikationen und Verbesserungen, die von Fachleuten auf dem Gebiet der technischen Lösungen der vorliegenden Erfindung vorgenommen werden, sollen in den durch die Ansprüche der vorliegenden Erfindung bestimmten Schutzumfang fallen, ohne vom Geist der vorliegenden Erfindung abzuweichen.
Claims (9)
1. Primerpaar und Sonde für RPA zum schnellen Nachweis von Rhizoctonia solani, wobei die Nukleotidsequenzen des Primerpaars sind wie in SEQ ID NO. 1 und SEQ ID NO. 2 gezeigt, und die Nukleotidsequenz der Sonde ist wie in SEQ ID NO. 3 gezeigt.
2. Primerpaar und Sonde nach Anspruch 1, wobei die Sonde mit 6-FAM am 5'-Ende und BHQ1 am 3'-Ende modifiziert ist.
3. Anwendung des Primerpaars und der Sonde nach Anspruch 1 bei der Herstellung eines Kits zum Nachweis von Rhizoctonia solani.
4. Kit zum schnellen Nachweis von Rhizoctonia solani, das das Primerpaar und die Sonde nach Anspruch 1 umfasst.
5. Anwendung des Primerpaars und der Sonde nach Anspruch 1 oder des Kits nach An- spruch 4 beim Nachweis von Rhizoctonia solani.
6. Verfahren zum Nachweis von Rhizoctonia solani, das die folgenden Schritte umfasst: Verwenden einer DNA einer zu testenden Probe als Vorlage und Durchführen einer Echtzeit-Fluoreszenz-RPA-Reaktion unter Verwendung des Primerpaars und der Sonde nach Anspruch 1, und dann Bestimmen auf der Grundlage des Vorhandenseins oder Fehlens einer Amplifikationskurve, ob es sich bei der zu testenden Probe um Rhizocto- nia solani handelt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei bestimmt wird, dass es sich bei der zu testenden Probe um Rhizoctonia solani handelt, wenn die Amplifikationskurve erscheint; und wobei bestimmt wird, dass es sich bei der zu testenden Probe nicht um Rhizoctonia solani handelt, wenn keine Amplifikationskurve erscheint.
8. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Temperatur der Echtzeit-Fluoreszenz-RPA- Reaktion 39°C beträgt.
9. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das System der Echtzeit-Fluoreszenz-RPA-Reaktion jeweils 2 uL Vorwärts- und Rückwärts-Primer, 29,5 uL Rehydrationspuffer, 1 UL DNA- Vorlage, 12,4 uL doppelt destilliertes Wasser, 0,6 uL Sonde und 2,5 uL Mag- nesiumacetat-Lösung umfasst.
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Publications (1)
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108977562A (zh) * | 2018-08-05 | 2018-12-11 | 安徽农业大学 | 一种用于检测土壤中小麦纹枯病菌的rpa引物、探针、试剂盒及检测方法 |
| CN114958835A (zh) * | 2022-05-25 | 2022-08-30 | 三亚中国检科院生物安全中心 | 用于检测水稻细菌性谷枯病菌的组合产品及试剂盒 |
| CN119799940A (zh) * | 2024-11-01 | 2025-04-11 | 天津市农业科学院 | 一种谷物镰孢菌的田间检测试剂盒及应用 |
-
2025
- 2025-05-27 BE BE20255335A patent/BE1032965B1/de active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108977562A (zh) * | 2018-08-05 | 2018-12-11 | 安徽农业大学 | 一种用于检测土壤中小麦纹枯病菌的rpa引物、探针、试剂盒及检测方法 |
| CN114958835A (zh) * | 2022-05-25 | 2022-08-30 | 三亚中国检科院生物安全中心 | 用于检测水稻细菌性谷枯病菌的组合产品及试剂盒 |
| CN119799940A (zh) * | 2024-11-01 | 2025-04-11 | 天津市农业科学院 | 一种谷物镰孢菌的田间检测试剂盒及应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| PARAGUISON-ALILI RUBIGILDA: "Evaluation of the Molecular Sensors for the Detection of Soil and Waterborne Pathogens of Onion", 27 June 2023 (2023-06-27), XP093343825, Retrieved from the Internet <URL:https://ssrn.com/abstract=4477501> DOI: 10.2139/ssrn.4477501 * |
| SALAZAR O ET AL: "Primers based on specific rDNA-ITS sequences for PCR detection of Rhizoctonia solani, R. solani AG 2 subgroups and ecological types, and binucleate Rhizoctonia", MYCOL. RES., vol. 104, no. 3, 1 March 2000 (2000-03-01), pages 281 - 285, XP093343807 * |
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