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Procédé pour la production simultanée d'alcool butylique et d'acétone par fermentation.
L'invention a pour objet la production d'alcool bu- tylique et d'acétone par fermentation d'hydrates de carbone au moyen de bactéries de l'espèce du Bac.Amylobacter A.M. et Bredemann (Zentralblatt f.Bakteriologie 1909 (IIe Partie) 23, page 385), accoutumées par culture à des quantités croissan- tes d'acide.
Après que Fernbach eut établi que., par la fermen- tation d'hydrates de carbone ou de matières contenant des hydrates de carbone par des ferments du type Bac. butylicus Fitz à l'abri de l'air, on obtient comme produit principal de l'alcool butylique et de l'acétone conjointement avec de petites quantités d'autres alcools, ce procédé s'est rapide- ment développé aux Etats-Unis d'Amérique jusqu'à présenter une
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grande importance industrielle. Comme matières premières on pouvait se servir aussi bien de substances brutes natu- relles amylacées que de substances saccharifères, les fer- ments de la fermentation acétono-butylique étant suscepti- bles de transformer eux-mêmes facilement l'amidon en mono- saccharides par action enzymatique.
L'alcool butylique et l'acétone sont produits par toutes les bactéries employées jusqu'ici dans un rapport immuable de 2:1. Le rendement en "dissolvants" varie entre 21 et 25% sur le mais sec. Il se forme en outre de l'acide carbonique et de l'hydrogène comme produits de fermentation gazeux.
Le développement de cette sorte de fermentation jusqu'à l'état actuel de la technique a été particulièrement favorisé par la connaissance du fait que pour l'obtention régulière de fermentationvigoureuses, on doit partir de cultures qui ne renferment pas de formes végétatives mais uniquement des spores. On emploie par conséquent pour l'en- semencement des cultures qui ont été chauffées pendant un courts laps de temps à environ 95 . On a constaté en outre que les acides engendrés pendant la fermentation ne peuvent pas être neutralisés par la craie. Au contraire, il est né- cessaire pour que la fermentation se fasse dans des condi- tions normales que l'acidité augmente au début d'une manière. continue, jusqu'à ce qu'elle atteigne un maximum, pour dimi- nuer alors de nouveau d'une façon continue jusqu'à la fin de la fermentation.
L'allure de la courbe de l'acidité a été reconnue comme constituant un moyen important de contrôle de la marche de l'opération: lorsque l'acidité diminue très lentement ou même ne diminue pas, c'est un signe certain que le moût est contaminé ou que le ferment est affaibli.
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La teneur en hydrate de carbone du moût doit être nota- blement inférieure aux degrés de concentration qui sont admissibles pour la fermentation alcoolique; la limite supé- rieure est donnée par une concentration à 8 %. Les ferments acétono-butyliques supportent donc beaucoup moins facilement que la levure les produits engendrés par eux-mêmes au cours de la fermentation. Toutefois, malgré une concentration plus faible, la viscosité du moût qui est obtenue par cuisson sous pression du produit initial, notamment dans le traite- ment de la farine du mais, est importante; c'est pourquoi l'on a proposé d'effectuer cette cuisson sous pression avec addition de quantités réduites d'acide chlorhydrique qui suffisent pour transformer en monophosphates les diphospha- tes contenus dans la farine.
Enfin, Fernbach a déjà recommandé d'ajouter au be- soin au moût contenant l'hydrate de carbone, de la levure désagrégée ou partiellement dégradée comme matière nutri- tive.
A côté de ces propositions plus ou moins impor- tantes pour le développementtechnique du procédé on trouve, particulièrement dans les brevetsdes indications sur dif- férents organismes auxquels on prête des qualités spéciales pour ce procédé. D'après Weizmann on devrait employer en général des bactéries propres à résister à l'action de la chaleur et qui se trouvent entre autres dans le sol ou sur les fruits de la terre, qui liquéfient la gélatine et peu- vent sans addition de levure ou autre agent analogue trans- former la plus grande partie de l'amidon de mais ou autre amidon de céréale, dans les conditions aérobies ou anaérobies, directement en un mélange d'alcool butylique et d'acétone.
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D'autres ont pensé avoir trouvé des espèces distinctes de micro-organismes provoquant la fermentation acétono-butyli- que et les ont décrits et désignés par des noms. Cependant des savants renommés ont prétendu et quelquefois établi que ces organismes ne diffèrent quepar le nom et qu'ils appar- tiennent tous à l'espèce du Bacillus Amylobacter A.M. et Bre- demann, les différences morphologiques et physiologiques qui se présentent éventuellement n'étant occasionnées que par l'action des différents milieux nutritifs et procédés de culture. En réalité, par des essais effectués pendant de lon- gues années on a réussi à agir sur les propriétés du Bac.
Amylobacter A.M. et Bredemann par un procédé de culture spé- cial, de telle manière que des variétés quelconques soient capables dans des conditions appropriées, d'amener la fer- menta.tion complète de l'amidon ou autre hydrate de carbone, en donnant lieu à la formation, à côté de produits de fer- mentation gazeux (acide carbonique et hydrogène), d'un mé- lange d'alcool butylique normal et d'acétone dans le rapport de 2:1 en outre.- de faibles quantités d'autres alcools.
La présente invention a d'abord pour objet ce pro- cédé de culture spécial qui est basé sur le fait que tous les ferments acétono-butyliques, quels que soient les noms qu'on leur a donnés, sont extrêmement sensibles aux acides, étant donné qu'ils dégénèrent dans les milieux nutritifs acides, deviennent asporogènes et finalement se détruisent. Le but de l'invention est de réduire la sensibilité des ferments de ce genre à l'action des acides libres en les y acclimatant graduellement. Le procédé imaginé pour réaliser cette idée consiste essentiellement à cultiver le Bacillus A.M. et Bre- demann en milieux nutritifs présentant une acidité initiale croissante sans neutralisation de l'acide qui se forme par la fermentation, jusqu'à ce qu'il soit devenu indifférent à l'action des acides dans la mesure désirée.
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Suivant une forme d'exécution préférée de l'invention on intercale entre deux cultures successives dans un tel mi- lieu nutritif (appelées ci-après "fermentations d'acclimata- tion") une fermentation en milieu neutre ou alcalin avec neu- tralisation de l'acide qui se forme par la fermentation (ap- pelée ci-après fermentation de sporulation) et on chauffe pendant un court laps de temps les cultures avant d'ensemen- cer avec celles-ci le milieu de la fermentation d'acclimata- tion suivante à acidité initiale plus forte,pour anéantir les formes végétatives, de telle sorte qu'on ne continue à cultiver que les spores pendant la fermentation d'acclimata- tion.
De préférence on empêche par tamponnement du milieu nutritif de la fermentation d'acclimatation que la concentra- tion en ions d'hydrogène dépasse certaines limites malgré l'augmentation de l'acidité pendant la fermentation, les va- leurs de tamponnage Ò des milieux nutritifs étant augmen- tées suivant l'acidité initiale croissante,dans les fermen- tations d'acclimatation successives. Pour le tamponnage, les systèmes connus: mélanges d'acides faibles avec leurs sels al- calins (voir Michaelis: La concentration en ions d'hydrogène p.37 et suivantes et p.89 et suivantes) conviennent particu- lièrement.
La valeur de tamponnage Ò ets exprimée mathématique- ment comme quotient différentiel de ph par rapport à l'ajoute d'acide ou de base, et dans le sens précis comme quotient dif- férentiel partiel pour un ph déterminé. Le montant du tampon- nage est comme on le sait déterminé en constatant les varia- tions du ph résultant de l'addition d'une petite quantité dé- terminée d'acide ou de base dans une quantité déterminée du milieu de fermentation. Les ajoutes doivent théoriquement être infiniment petites, mais pratiquement la limite infé- rieure est déterminée par l'exactitude de la méthode de dé- termination du ph.
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Pour obtenir des résultats comparables, la quantité d'acide (ou de base) ajoutée doit être constante dans tous les es- sais. Les valeurs Ò indiquées ci-dessous sont obtenues par la méthode de détermination suivante: On prélève en même temps trois échantillons du milieu de fermentation,chacun de 1 cm3.On détermine par une méthode habituelle le Ph dans un de ces échantillons. On ajoute au second échantillon 0,5 cm3 de n/100 H SO4 ( solution centi-normale d'acide sulfurique ) et au troisième 0,5 cm3 de n/100/N a OH, ( solution centi- normale de soude caustique), après quoi on détermine aussi le ph dans ces deux échantillons, par la même méthode. Les varia- tions de la valeur Ph sont inversement proportionnelles au tamponnage. Les variations doivent avoir théoriquement la même valeur avec des signes différents.
Pratiquement, il se présente souvent des écarts importants entre les variations de la valeur Ph obtenus par ajoute de doses équivalentes d'acide ou de base. Dans la détermination pratique on prend comme va- leur de tamponnage la moyenne arithmétique des variations de la valeur Ph du coté acide ou du coté alcalin.
Pour la déter- mination du ph on emploie la méthode du Dr.Peter Wulff ( bre- vet allemand n 405. 091 ).'
La valeur du tamponnage du milieu nutritif des fermentations d'acclimatation successives est réglée par l'em- ploi de cette méthode de détermination de telle façon qu'elle s'élève lentement à partir de 4 environ au commencement de la série des culturel On a trouvé particulièrement avantageux dans ces conditions d'employer pour le tamponnage des milieux de culture pour les ferments acétono-butyliques des mélanges de substances à bon pouvoir de tamponnage de même genre que ceux qui sont ajoutés dans les fermentations principales à la. matière première hydrocarbonée, comme aliment azoté ( par
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exemple les germes de malt, la levure mortifiée et de préférence dégradée, l'urée,
le phosphate d'ammonium, etc )
De cette manière, le micro-organisme en s'habituant à des quan- tités croissantes d'acides, s'acclimate simultanément à des additions croissantes de telles additions servant pour l'alimen- tation azotée.
Pour aciduler le milieu nutritif de ces fermenta- tions d'acclimatetion, on emploie avantageusement des acides organiques, de préférence l'acide lactique.On obtient les résul- tats les plus favorables lorsqu'on laisse augmenter de 0,1 à 1,6 l'acidité initiale du milieu de fermentation pour un Ò d'environ 4 dans les fermentations d'acclimatation successives.
( Les degrés d'acidité donnés ici et dans la suite indiquent le nombre de cm3 d'une solution de soude caustique normale né- cessaire pour neutraliser 100 cm3 de milieu, ( le bleu brom - thymol étant employé comme indicateur). En même temps qu'aug- mentent l'acidité et la valeur du tamponnage on peut en outre laisser croître continuellement la concentration des milieux nutritifs en hydrates de carbone d'une fermentation d'acclima- tation à l'autre. On commence avantageusement avec des milieux nutritifs qui contiennent 1% d'hydrate de carbone ( calculé comme amidon ) et on termine avec une teneur en hydrate de carbone de 6 à 8%.
Le milieu nutritif de composition variable, qui est employé pour les fermentations d'acclimatation peut contenir par exemple des pommes de terre, de la farine de maïs ou de la farine de riz comme matière première hydrocarbonéeo Les mélanges de sels tampons azotés contiennent par exemple les germes de malt ou la levure autolysée, l'urée ou le phosphate d'ammonium ou le sulfate d'ammonium en différentes combinai - sons. Le milieu nutritif pour les fermentations de sporula- tion présente une composition constante et est formé par exem-
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ple de 100 parties en poids de puréede pommes de terre, 100 parties d'eau, 10 parties en poids de germes de malt ou de sang et 2 parties de craie ( Ca C03 ). Les deux milieux nutri- tifs sont versés dans des éprouvettes et stérilisées trois fois par fractions.
On isole le bacille soit du sol soit des fruits de la terre par les méthodes indiquées par Bredemann et on le cultive à l'état pur ( Zentralblatt f. Bakteriologie 1909, IIe partie, 23, page 390 et suivantes ) ou bien on peut employer des spores de différentes variétés du Bac. Amylobacter A.M. et Bredemann de cultures déjà existantes. On se sert de ces organismes pour inoculer un milieu nutritif de sporulation.
La culture est incubée pendant 24 heures et puis chauffée pendant 5 minutes environ à 90 . Elle sert alors à l'inocula- tion du milieu nutritif de la première fermentation d'acclima- tation. Après une fermentation de 48 heures on examine les cultures de la manière habituelle au point de vue de leurs propriétés bactériologiques, morphologiques et physiologiques.
Les microorganismes les plus appropriés sont ensuite soumis à une seconde fermentation dans un milieu nutritif de sporula- tion et, après destruction des formes végétatives, ils sssent la seconde fermentation d'acclimatation dans un milieu nutri- tif approprié préparé d'avance. Toutes les fermentations sont effectuées à une température de 37 à 38 d'une manière complè- tement aérobie.
Ce procédé par fermentation d'acclimatation et fermentation de sporulation alternées est prolongé jusqu'à ce qu'une fermentation d'essai ait montré que les organismes sont en mesure de faire fermenter un moût contenant 6 à 8% d'amidon qui a été acidifié par l'addition d'acides jusqu'à une acidité titrable de 1,4 à 1,6 et qui possède un Ph de 5-4,7 pour une valeur de tamponnage initiale Ò d'au moins 4, jusqu'à complète disparition des hydrates de carbone, c'est- à-dire qu'à la fin de la fermentation le milieu de culture ne doit contenir pratiquement ni sucre ni amidon.
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(Comme les cultures sont susceptibles de dégager beaucoup de gaz, on se sert pour exécuter cette fermentation d'essai de petits ballons qui, comme d'ordinaire pour la culture de microorganismes anaérobies, sont pourvus de fermetures appro- priées perméables aux gaz). On n'arrive à atteindre ce but qu'après une très grande série de fermentations d'acclimata- tion, sans cependant être limité de prime abord au choix des variétés déterminées et exactement caractérisées morphologi- quement du Bac. amylobacter A.M. et BREDEMANN.
De toute façon on est parvenu par cette méthode à cultiver dans des séries de plus d'une centaine de fermen- tations d'acclimatation deux variétés de cette espèce parti- culièrement propres à réaliser la fermentation acétono-butyli- que et pouvant être désignées par Bacillus amylobacter W. et Bacillus amylobacter S. Ces deux variétés se distinguent l'une de l'autre porphologiquement dans leurs formes végétatives uniquement par le fait que le Bacillus amylobacter W. forme des batonnets plus longs, tandis que les formes végétatives de l'autre variété présentent une forme moins élancée. Dans le stade de sporulation, les formes plestridiennes sont pré- dominantes dans le Bacillus amylobacter Wo tandis que dans l'autre variété ce sont les formes clostridiennes qui sont prépondérantes.
Les formes oidiennes des deux organismes sont très mobiles. Les deux variétés ne liquéfient pas la gélatine et sont obligatoirement anaérobies; sous ces deux rapports elles sont donc en opposition avec les bactéries recommandées par Weizmann.
Pour effectuer la fermentation sur une grande échel- le, les semences qui doivent servir au travail courant se préparent à partir des cultures contenant uniquement des spores comme cela se fait d'habitude, par propagation en plu- sieurs parties de volumes croissants, jusqu'à ce qu'on obtienne
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finalement la quantité nécessaire 'pour amorcer le moût principal.
Les moûts pour les grandes fermentations sont préparés de la manière habituelle. La concentration optimum en amidon ou en sucre est de 6 à 7%.
Contrairement aux procédés connus, on laisse toute- fois, suivant la présente invention, la fermentation principale s'accomplir dans un moût qui a été acidifié avant le commen- cement de la fermentation par l'addition ou la formation fer- mentative d'acides organiques, particulièrement d'acide lac- tique. En outre, on peut aussi ajouter avantageusement au moût principal des mélanges de substances à bon pouvoir tampon, qui constituent en même temps des aliments azotés, par exemple les mélanges albumineux d'origine végétale, de même que des composés¯d'ammonium, notamment des sels d'ammoniaque ou de l'urée.
On a trouvé qu'il était avantageux de ramener l'aci- dité initiale du moût principal (acidité titrable déterminée en employant le bleu bromthymol comme indicateur ) à au moins 1.4 - 1.6 . La Ph pour une valeur de tamponnage d'au moins 4 doit être compris entre 5 et 4.6. En outre, en dehors du contrôle de la fermentation pratiqué habituellement par l'exa- men bactériologique et par l'allure de la courbe d'addité, une méthode de contrôle supplémentaire a été adoptée qui consiste à surveiller la marche de la;fermentation par des mesures périodiques du degré de tamponnage, la valeur Ò devant être adaptée aux variations de l'acidité, c'est-à-dire qu'elle doit augmen- ter en même temps que celle-ci et doit avantageusement atteindre sa valeur maximum lorsque l'acidité est maximum.
Si l'on cons- tate une valeur de tamponnage insuffisante il faut y remé- dier par l'addition de substances à haut pouvoir tampon par exemple, l'acide lactique, l'acide tartrique.
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l'acide citrique ou l'acide oxalique, au cours de la fermen- tation principale. De cette manière on utilise la réduction de la sensibilité aux acides de ferment obtenue par la fer- mentation d'acclimatation ci-dessus décrite, pour assurer la pureté de la fermentation principale à un dégré inconnu jus- qu'ici et en même temps l'obtention régulière de rendements maxima. Dans ces conditions de travail on obtient au point le, plus élevé de la fermentation principale un maximum d'acidité de 8 à 9 .
Il se forme donc par les organismes habitués aux acides, aussi au cours de la fermentation du moût principal, des quantités d'acides beaucoup plus grandes que celles qui ont été observées jusqu'ici dans la fermentation acétono-butylique.
EXEMPLE D'EXECUTION
100 litres de moût contiennent environ 35 à 37 kg. de pommes de terre ou 8 à 10 kg. de farine de riais. D'autres matières amylacées sont préparées suivant leur teneur en ami- don pour former des moûts de même concentration (6 à 7% d'ami- don pur). On introduit les pommes de terre entières, le mais ou autres matières sous forme de farine, avec la quantité d'eau appropriée, dans des autoclaves qui sont pourvus de mécanismes agitateurs et on procède à la cuisson sous une pression de 2 à 3 atmosphères pendant 1 heure ou 2.
Les additions de matières nutriti- ves (levure mortifiée ou autolysée ou germes de malt en combinai- son avec de l'urée ou du phosphate d'ammonium ou du sulfate d'am- monium, ou avec des matières azotées analogues en différentes com- binaisons) sont introduites dans le moût de préférence déjà dans l'autoclave. Des compositions appropriées sont par exemple constituées par: 100 1. de moût, 125 g. de levure mortifiée ou dégradée, 125 g. de germes de malt et 40 g. de sulfate d'ammonium.
Le moût est chassé directement dans des cuves de fermentation soi- gneusement stérilisées au préalable et pourvues d'agitateurs, qui sont complètement fermées et doivent être munies de rallonges
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appropriées pour recueillir les gaz qui s'échappent. Après avoir établi l'acidité initiale voulue, pour l'obtention de laquelle on ajoute de préférence 80 à 90 cm3 d'acide lactique à 80% pour 100 1. de moût, on refroidit le moût, par exemple à l'aide d'un dispositif réfrigérant adapté à l'intérieur de la cuve, jusqu'à la température de fermentation de 37 à 38 C; on peut toutefois-aussi le faire circuler dans ce but à travers des échangeurs de chaleur intercalés.
Lorsque le moût principal est prêt à être amorcée l'amorce de bactéries doit aussi être préparée en volumes appropriés. Pour. sa préparation, le Bacterium Amylobacter W ou S est transféré après un court chauffage à environ 90 , dans 100 cm3 d'un milieu nutritif préparé de la même maniè- re que le moût principal, après quoi on le laisse se dévelop- per à une température de 37 à 38 C dans les conditions anaé- robies. Après 48 heures environ, la croissance et le dévelop- pement des oides commencent. Après qu'on s'est assuré de la qualité irréprochable de la culture, on procède au transfert dans deux litres environ de moût stérile de même nature et, au bout de 24 heures, dans 20 litres environ de moût sembla- ble.
Après une nouvelle période de 24 heures, on ajoute ces 20 litres à un moût de 200 à 300 litres, qui sert au bout de 24 heures à inoculer le moût principal qu'on a rendu entretemps prêt à être ensemencé.
Pendant la fermentation du moût principal, en dehors du contrôle bactériologique et de la détermination périodique de l'acidité titrable, on détermine le Ph et le degré de tamponnage au moins quatre fois par jour, ce qui même dans certains cas à l'addition de nouvelles matières tampon.
Après une fermentation d'environ 30 à 32 heures, pendant lesquelles le moût fermentant doit être agité avec précau- tion, le point culminant de la fermentation est atteint et t
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en même temps le maximum d'acidité (jusqu'à 8 à 9 ). Cette forte teneur en acide est supportée sans affaiblir les organismes habitués aux acides, en raison du degré de tamponnage élevé du moût. Après environ 48 heures,la fermentation est terminée, c'est à dire que le moût ne contient pratiquement ni amidon hi sucre.
Après que la fermentation est terminée,on retire les produits principaux formés (alcool butylique et acétone) sui- vant le procédé habituel par distillation fractionnée. La récupération séparée des autres alcools ne parait pas en raison de leurs faibles quantités pouvoir se faire économiquement.
L'hydrogène et¯l'acide carbonique qui se dégagent pendant la fermentation peuvent, comme cela se fait déjà, être utilisés ainsi que les résidus qui contiennent des matières nutritives appréciables pour le bétail.
On a déjà proposé d'amener les ferments de la fermen- tation acétono-butylique,par acclimatation à certaines matiè- res qui se trouvent dans le moût en cas de fermentation ralen- tie (sluggish fermentation) dans un état qui permet d'éviter l'apparition de cette perturbation épidémique. Ces matières res- tent dans le moût,même si on filtre soigneusement celui-ci à l'aide de filtres à bactéries; pour d'autres raisons ausion peut conclure à la nature ultramicroscopique de la matière provo- quant la fermentation ralentie. Il s'agit donc ici,comme on le suppose, de l'acclimatation des organismes à un virus invisible ou un bactériophage.
De même il est aussi déjà connu de soumettre les cultu- res à une ou plusieurs opérations sélectives;les cultures s'effectuant dans une solution nutritive dans laquelle on ajoute de faibles quantités des produits qui résultent enfin de la fermentation . Dans ce cas il s'agit de rendre le
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ferment susceptible de résister à l'acétone et à l'alcool butylique. Ces deux procédés n'ont de commun avec le procède suivant l'invention que la méthode bactériologique générale- ment connue de l'acclimatation de microorganismes à des substances déterminées par cultures répétées en présence de ces substances.
REVENDICATIONS ---------------------------
1.- Procédé pour la production simultanée d'alcool butylique et d'acétone par fermentation, caractérisé en ce qu'on emploie comme ferments, des variétés de l'espèce Bac.
Amylobacter A.M. et Bredemann qu'on habitue par culture à des quantités croissantes d'acides.