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" Procédé d'extraction de pénicilline".
La présente invention est relative à un procédé d'extration,de concentration et de purification d'anti- biotiques. Elle concerne plus spécialement l'extraction de pénicilline d'un bouillon de fermentation et la puri- fivation de,l'extrait de manière à produire un concentrât de grande pureté et de haut rendement.
Les substances antibiotiques, comme la pénicilline, sont les produits de certaines pousses de champignons. On sonnait un certain nombre d'antibiotiques, mais seule la pénicilline a aujourd'hui acquis une valeur commerciale, bien qu'il soit très probable que d'autres substances
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antibiotiques puissent être produites dans un avenir prochain. pour connaitre les sources d'antibiotiques et particulièrement. delles de pénicilline, on s'en référera à " Endeavor" ( Kyn- oek Peess London for I.C.I.)vol. 3, N 9 janvier 1944, pages 3 à 14.
La pénicilline esun acide organique, un agent bactériostatique, et un remède important pour combattre les maladies et pour empêcher la diffusion d'infections.
Elle est produite pendant la croissance de certaines moisis- usures, comme le pénicillium notatum, dans une solution aqueuse. Il existe différentes méthodes pour faire croître ces moisissures. Ainsi on peut les faire croître à l'état submergé en cultures liquides, ou bien à la surface de culture;, liquides ou bien encore sur du son humide.
Le bouillon aqueux obtenu à partir des diverses cultures conti- ent ordinairement entre environ 0,01 et 0,001-;,: en poids de pénicilline ou entre environ 25 et 200 unités Oxford par ml ( voir l'article de Houry et Jennings dans "British Journal Of expérimental Pathology " vol 23 - page 120 juin 1942) Le bouillon contient également des quantités variables de solides, d'impuretés non-ioniques, de matières amphotères diverses impurretés organiques parmi lesquelles des acides plus fort et plus faibles que la pénicilline etc.. On connait plusieurs pénicillines par exemple , les pénicillines F et G l'allo-pénicilline etc. Certaines de ces pénicillines possèdent des solubilités différentes dans divers solvants.
La présente invention a pour objet d'améliorer la récupération d'antibiotiques et particulièrement de péni- cilline de leurs bounllons de fermentation et d'augmenter leur pureté au delà de celle pouvant être obtenue jusqu'à présent. L'invention a encore pour objet la réalisation de cette purification et de cette récupération en un minimum de temps. Elle concerne en outre l'élimination effective et appropriée des impuretés organiques telles que.
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les acides plus faibles et plus forts que la péniHj - 2 6 lei/
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normalement associés à la pénicilline, hors des solutions aqueuses contenant ces impuretés et la pénicilline. Enfin l'invention a encore pour objet de réaliser les opérations susmentionnées par un procédé continu impliquant une série d'extractions contrôlées.
Généralement parlant,l'invention est relative à l'extraction de la pénicilline, de même que des autres impuretés organiques précitées, hors du bouillon à l'aide d'un solvant polaire organique approprié, à l' limination subséquente des acides plus aibles que la pénicilline hors de l'extrait et à l'élimination hors de l'extrait restant des acides plus forts et des acides plus solubles dans l'eau que la pénicilline.
La description du procédé peutêtre subdivisée comme suit : (1) Traitement préliminaire (2) Extraction principale (3) Elimination d'acides plus faibles (4) Elimination d'acides plus forts (5) Récupération et concentration de la pénicilline (6) Solvants.
Etant donné que la présent procédé comporte plusieurs extractions, la nomenclature d'identification des divers extraits est difficile. Dans un but de charté un extrait obtenu par exemple à l'aide d'un solvant "S" sera appelé "extrait solvant S ". De même un extrait obtenu par lavage à l'eau sera dénommé "extrait aqueux" etc...
Les fig. 1 et 2 combinées sont des vues schématiques d'une forme de réalisation préférée du procédé suivant l'invention.
La fig.3 est un graphique établissant la relation approximative entre le pH de la phase aqueuse et les rap- x ports des concentrations des acides organiques dans les deus phases liquides.
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le traitement pré limna ire. La pénicilline acide se décompose très facilement
Supérieures
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à des températures léèrement a^0 C. Des acides forts, 6es bases fortes, des métaux lourds, et certains autres réactifs la détruisent.
L'entièreté du procédé d'extraction s'effec- tue à une température aussi voisine que possible de 0 C, sans congélation de l'eau en présence. Tou.' les aeibes ou les bases introduits pour régler les valeurs du PH dans en l'installation sont additionnés aux solutions aqueuses diluées, et les extractions dans les acides et les bases même diluées s'effectuent aussi rapidement que possible.
En se référant aux dessins annexés, 1,représente une installation de fermentation dans laquelle la pénicilline est produite. Celle -ci renfermée dans un bouillon aqueux est amenée par un conduit 2 à un réfrigérant 3. Des solutions aqueuses de pénicilline provenant d'autres sources peuvent être amenées au conduit 2 par un conduit 4 à soupape. Dans le réfrigérant % le bouillon est refroidit à une température très voisine de son point de congélation, soit environ 0 C. Le bouillon est ensuite extrait du réfrigérant par le conduit 5 et peut être débarrassé des solides qu'il confient par passage au travers du filtre 6, ou dans la centrifugeuse 7, ou à la fois dans les deux dispositifs
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mentionnés cita:rant. Il est ensuite errait par le conduit 8.
Si on le désire, un agent émulsifiant peut être ajouté au bouillon nar le conduit 9 soit avant soit après le traitement ultérieur.
Le bouillon est acidifie jusqu'à un pH d'environ 2,0 et 3,5 en vue de libérer la pénicilline acide qui est soluble dans le solvant employé au stade suivant. Les acides destinés à l'acidification précitée doivent être plus forts que les acides organiques faibles à séparer de la pénicilline Il doivent en outre être solubles dans l'eau, et doivent posséder un faible coéfficient de répartition dans le solvant c'est-à-dire, un coéfficient inférieur à 1, et de préférence
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inférieur à 0,1. Comme acides appropriés on peut citer les acides sulfuriques et phosphoriques en solutions dont les concentrations sont comprises approximativement entre 0,01 et 10% en volume, et de préférence entre 0,05 et 5%.
II. Extraction principale.
Le bouillon du conduit 12 peut être extrait à l'aide du solvant S par l'une ou l'autre des méthodes suivants :(1) en le faisant passer à travers une colonne d'extraction à plusieurs étages ou (2) en le faisant passer à travers une série de mélangeurs et de centrifugeuses et/ou de décanteurs.
Dans la première méthode, le bouillon aqueux est introduit par le conduit 13 en un point intemédiaire entre les extrémités de la colonne 20. Si le solvant organique S est plus léger que le bouillon, il est introduit au voisinage de la base de la colonne par le conduit 21. Ce solvant S s'élève alors dans la colonne en sens opposé à celui de la. phase aqueuse et il didsout la pénicilline et les autres acides organiques contenus dans le bouillon et ayant des coéfficients de répartition similaires vis-à-vis du solvant au pH de l'extraction. L'eau est ajoutée au sommet de la colonne pour l'extraction des sels d'acides plus faibles que la pénicilline .et d'autres impuretés se dissol- vant mieux dans l'eau.
La quantité d'eau introduite est suffisante pour élever le pH depuis la valeur qu'il a à l'orifice d'entrée du bouillon dans la colonne (conduit 13) jusqu'à une valeur comprise approximativement entre 3,0 et 4,5 au voisinage du sommet de la colonne.
L'eau peut contenir une faible quantité,soit moins de 1% en poids, d'un sel tampon destiné à empêcher que le pH ne change trop rapidement étant donné. l'extraction des acides par le solvant. Les sels tampons appropriés sont ceux qui contiennent divers niuveaux d'ionisation comme les phosphates de sodium et de potassium.
Si l'on désire, on peut introduire de la cire par
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les ponduits 14 en un ou plusieurs endroits de la colonne entre les orifices d'entrevu bouillon et du solvant, et de préférence au voisinage de l'orifice d'entrée du solvant Ceci est spécialement souhaitable si la phase aquease ne contient pas de tampon. L'addition d'acide par les conduits 14 peut avoir un double but ; (1) permettre l'aci- dification du bouillon directement dans la zone d'extraction de la colonne si le bouillon n'est pas ou n'est qu'insuffi- samment acidifié lorsqu'il entre dans la colonne par le conduit 13 ; (2) produire un pH s'élevant Graduellement entre les orifices d'entrée du solvant et du bouillon ce qui est plus favorable à la séparation que la tendance d'accroissement naturelle du pH .
Ceci augmente le coéffi- cient de répartition de la pénicilline et des autres acides organiques en faveur de la phase solvant, ce qui permet d'employer moins de solvant pour la même quantité de pro- duits récupérés. Ainsi le pH dans la phase aqueuse à la base de la colonne peut s'étendreapproximatjvement entre 2,5 et 4.
L'introduction d'eau par le conduit 22,ou l'introduction d'acide par les conduits 14 ou les deux introductions, ont pour effet d'augmenter la sélectivité du solvant vis-à-vis de la pénicilline d'une part et des adides organiques plus faibles d'autre part. La phase aqueuse acide résultante est éloignée de le. b:.se de la colonne par le conduit 23. La phase extrait solvant S riche est extraite du sommet de la colonne par la conduit 24.
Dans la seconde méthode d'extraction, on fait passer le bouilion acidifié ayant un pH approximatjvement compris entre 2 et 3 par des conduits 14, puis on le mélange avec du solvant S introduit par le conduit 28 dons le mélangeur 30. Le mélange résultant est alors séparé en deux phases dans la centrifugeuse 34 et/oju le décanteur 38, l'emploi
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d'un ou des deux dispositifs mentionnés ci-avant dépendant de la facilité de la séparation. Il est souhaitable de prévoir plusieurs étages d'extration constitués par une série de mélangeurs et de décanteurs. La phase aqueuse sépa- rée est déchargée par les conduits 35.
La phase extrait- solvant S est amenée par le conduit 39 dans un condenseur 40, où elle est lavée à l'eau (introduite par le conduit 41), cette eau étant similaire à celle prévue au sommet de la colonne 20. La phase aqueuse provenant de la colonne 40 est extraite par le conduit inférieur 42 et la phase extrait solvant S est extraite par le conduit supérieur 42'. Si on le désire , la colonne 40 peut être remplacée par un appareil équivalent tels qu'un mélangeur et un décanteur. Comme dans la première méthode susmentionnée, il est souhaitable que le pH augmente graduellement,ce qui est plus favorable à la séparation que la tendance naturelle d'accroissement du pH dans le système mélangeur-décanteur.
Cet accroissement graduel peut être obtenu en ajoutant de l'acide à différents étages de manière à obtenir un pH s'étendant dans l'intervale approximativement compris entre 2,0 et 4 à l'orifice de sortie de la phase aqueuse c'est-à-dire au conduit collecteur 35, et pour produire un pH approximativement compris entre 3 et 4,5 dans la phase aqueuse au voisinage du sommet du condenseur 40, où l'eau dst introduite. Les rapports de solvant à fournir dans cette première extraction sont ordinairement compris entre 2:1 et 1 :5, bienque des rapports plus élevés et moins élevés puissent être employés III. ELIMINATION D'ACIDES PLUS FAIBLES.
L'extrait solvant S comprenant la pénicilline et d'autres acides dissous duns le solvant Sn. obtenus poit par le conduit 24 soit par le conduit 42 soit par une autre sour- ce non représentée dont il est enlevé par le conduit 43, passe à travers le conduit 44 et est mélangé dans un mélan- geur 46 à une base aqueuse diluée possédant,de préférence, une activité tampon et constituée,de préférence,par un
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composé inorganique introduit par le conduit 45.
La présente étape d'extraction a pour but de concen- trer la pénicilline dans une phase aqueuse et de séparer des acides plus faibles de la pénicilline. La solution de base aqueuse force une plus grande partie de pénicilline et d'acides plus forts à s'ioniser que d'acides plus faibles que la pénicilline. Etant donné que les ions et les sels ioniques de ces acides organiques sont plus solubles dans l'eau que dans le solvant, en comparaison des acides nnn dissociés, les premiers sont extraits dans la phase aqueuse. Il en résulte une séparation préliminaire entre les acides plus faibles d'ùne part et la pénicilline et les acides plus forts d'autre part.
Comme bases aqueuses faibles nn peut citer les
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hydroxydes de Ca,Sr,et Ba, 1 bïcariaonates,phosphates,cïtra- tes,tartrates etc. de Na et K. La base aqueuse contient habituellement entre environ 0,2 et 2% en poids du composé alcalin, et la quantité de solution de base aqueuse ajou- tée est ordinairement comprise entie environ 1/5 et 1/50 du volume de l'extrait -solvant S. Cette quantité de base aqueuse devrait être telle qu'elle donne lieu à un extrait aqueux ayant un pH compris entre environ 4,5 et 8,0, ce pH variant comme sl sera décrit 0 plus tard. Le mélange d'exbrait aqueux et de solvant S est alors amené .par un conduit 47 dans un décanteur 48 pour être séparé.
Le solvant est extrait par un conduit spérieur 49 et peut être récupéré, purifié et réintroduit dans l'installation par les conduits 21 et 28. L'extrait aqueux est déchargé par un conduit inférieur 50 et peut à présent être traité suivant deux méthodes différentes, d'après son pH et la pureté que l'on désire obtenir pour la pénicilline. Si le pH est approximativement compris entre 5 et 8, et s'il est, de préférence,supérieur environ 6,2 les acides plus faibles que la pénicilline restants doivent
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être éliminés par extraction dans un- extracteur 55. Mais si le pH est inférieur à 5 l'extrait aqueux peut être amené par le conduit 53 au stade suivant d'extraction (décrit plus tard) pour éliminer les acides plus forts que la pénicilline.
Toutefois il est préférable d'opérer à un pH supérieur à 5 dans le décanteur 48, en vue d'obtenir une meilleure récu- pération de la pénicilline.
Si l'on adopte la méthode préférée, l'extrait aqueux se trouvant dans le conduit 50 est introduit par le conduit
55 53 dans la colonne d'extraction(.dans laquelle les acides plus faibles que la pénicilline restent sont extraits de l'extrait aqueux acidifié par un solvant organique approprié,' S'se dirigeant à contre courant. Le solvant S'qui peut être identique ou différent du solvant S, est introduit (s'il est plus léger que l'extrait aqueux) du voisinage du fond de la colonne par un conduit 56.
Entre ou au voisinage des orifices d'entrée de solvant S'et d'extrait aqueux, on introduit en un ou plusieurs points de la colonne un acide plus fort que la pénicilline, similaire à celui utilisé on au stade d'extraction principale, mats ayant une concentrati comprise environ entre 0,01 et 10% en volume, et de préféren entre o;05 et 5%. Lorsque la capacité tampon dans l'extrait aqueux fourni à la colonne est élevée, l'acide peut être introduit au voisinage ou au niveau de l'orifice d'entrée de l'extrait aqueux par un conduit 51 ou par l'un des conduits supérieurs issus du conduit 59. Mais si la capacité tampon est faible,l'acide fort doit être introduit plus près de l'orifice d'entrée du solvant par l'un des conduits inférieurs issus de 58.
La quantité d'acide fort ajoutée doit être suffisante dans chaque cas pour donner dans la ph phase aqueuse à la base de la colonne,un pH compris entre 3 et 8 et de préférence entre 3,0 et 6,5. L'introduction de cet acide fort dans la colonne produit un pH augmentant graduellement dans l'extracteur 55, ce qui est plus favora-
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ble pour la séparation d'acides lus faibles que la pénicilline que l'accroissement naturel du pH obtenu lorsque tout l'acide est introduit dans la fourniture initiale.
L'extrait solvant S'résultant est déchargé par le conduit supérieur 57 et le solvant S'peut être récupéré, purifié et réintroduit dans la colonne 55 par lu conduit
56. La phase aqueuse ext.raite contens@t encore la pénicilline et les acides plus forts que la pénicilline est extraite par le conduit inférieur 58.
Les rapports solvant S'à fournir dans @@ @@ @@@@tion sont ordinairement compris entre 2:1 et 1:5, bien que des rapports plus élevés ou plus bas puissent être employés.
La figure III est un graphique illustratif expliquant la raison pour laquelle le pH de la solution aqueuse conte- nant la pénicilline et les acides plus faibles que la pénicilline constitue un facteur important dans le procédé.
Dans cette figure, les valeurs du pH sont déterminées par rapport aux logar thems des valeurs K de trois types d'acides.
K -concentration en acide dans, la phase solvent -concentration en acide dans la phase aqueuse
La position des courbes représentées dans le graphique doit être considérée seulement comme approximative, dans un but d'ill @ustration, et peut être déplacée par rapport aux .axes de coordonnées, ces courbes pouvant également occuper d'autres positions l'une par rapport à l'autre pour divers solvants. pour diverses températures, etc...
,-,.tant donné que les acides organiques libres dans la solution aqueuse sont plus solubles dans les solvants organiques que leurs sels ioniques correspondants, et étant donné que des sels sont plus solubles dans l'eau que dans le solvant, un abaissement du pH aura pour résultat un abaissement des valeurs de K. C'est pourquoi, il est important, que le pH de la solution aqueuse soit ajusté, de telle sorte ne que la moyenne partie des acides plus faibles que la pénicillip soit à l'état d'acide libre, tandis que la moyenne partie.
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de la pénicilline et des acides plus forts que la pénicilline sont présents ou restent dans la solution aqueuse sous forme de sesl ioniques.
Ainsi , à un pH inférieur à 1 environ, plus de la moitié de la pénicilline est perdue dans la phase solvant, tandis qu'à un pH supérieur à 6,5 environ, la plu- part des acides forts restent dans la phase aqueuse et ne sont pas séparés. A noter que la séparation doit être entière- ment effectuée d'un côté de la région, où les courbes d'acide faible se rapprochent ou coupent la courbe de pénicilline.
Ainsi pour toutes les concentrations pratiques et raisonnables en pénicilline qui peuvent se rencontrer dans les solutions aqueuses, et pour tous les rapports de solvant à fournir raisonnables, le maintien du pH dans la solution aqueuse à une valeur comprise approximativement entre 4 et 6,5 au sommet de l'extracteur assure une séparation des acides plus faibles que la pénicilline et de la pénicilline.
VI ELILINATION D'ACIDES - PLUS FORTS. n
La phase aqueus-e provenant du fond de la colonne 55 dans le conduit 58, ou la phase extrait aqueux provenant du fond du décanteur 48 dans le conduit 53, suivant le cas , est à présent amenée par le conduit 61 dans l'extracteur de solvant 60. Cette extraction s'effectue à un pH généralement inférieur à celui de l'extraction dans la colonne 55 obtenu par addition d'acide identique à celui utilisé par l'extrac- tion dans la dite colonne 55. Cet acide peut être introduit dans le conduit 61 par le conduit 62 ou dans la colonne 60 par les conduits 63, ou encore par les deux voies men- tionnées ci-avant.
L'extracteur 60 est similaire à l'extracteur 20 au point de vue fonctionnement. La phase aqueuse contenant la pénicilline et les acides plus forts que la pénicilline est aménée à contre courant en contact avec un solvant organique S"approprié, qui peut être identique aux solvants S et S', mais de préférence différent du solvant S. Les deux
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es solvants S" et S' peuvent être employés , s'ils sont différent l'un de l'autre, soit dans le même extracteur (comme reprisent' soit dans des extracteurs séparés. Des extracteurs séparés sont particulièrement à conseiller, si l'un des solvants est plus lourd que l'eau , tandis que l'autre est plus léper que l'eau. Le solvant S" est introduit (s'il est plus lord que la phase aqueuse) par les conduits 64 au voisinage du sommet de la colonne 60.
Au voisinage de la base de la colonne 60, de l'eau est introduite par le conduit 66 pour éliminer par lavage des sels d'acides plus forts .,ue la pénicilline et les autres impuretés qui se dissolvent mieux dans l'eau 'est (c/-à-dire qui ont un meilleur coefficient de répartition vis- à-vis de l'eau). Si on le désire, on peut introduire de 1(acide par un ou plusieurs conduits 65 entre les orifices d'entrée de la phase aqueuse et du solvant, de manière à produire un accroissement graduel de pH, qui est plus favorable à la séparation que la. tendance naturelle d'accroissement du pH dans la colonne. De cette façon , le pH de la phase aqueuse au voisinage de la base de la colonne est compris approximativement entre 3 et 5, tandis que le pH de la phase aqueuse au sommet de la colonne est compris approxima- tivement entre 2,0 et 5,0 .
Si on le désire, l'extracteur 60 de même que l'extracteur 55 mentionné ci-avant,peut comprendre une série de mélangeurs et de décanteurs au lieu d'une colonne. L'eau introduite par le conduit 66 peut contenir entre 0,001% et 1% en poids environ d'un tampon ou d'un hydroxyde ou sel alcalin, tel que mentionné ci-dessus, Le solvant S" extrait la pénicilline acide pour produire un extrait solvant S" qui est déchargé par le conduit de base 67. La phase aqueuse restante contenant les acides plus forts que la pénicilline est extraite par le conduit 65.
V. RECUPERATION & CONCENTRATION.
L'extrait solvant S" provenant de l'extracteur 60 est amené par un conduit 67,soit directement dans un mélangeu
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70, soit d'abord dans un appareil de décoloration 68 conte- nant un adsorbant tel que le charbon de bois. Cet appareil de décoloration peut être une colonne d'asorption ou un mélangeur suivant d'un décanteur, ou une centrifugeuse ou encore un appareil de filtration. Dans le mélangeur 70, l'extrait solvant S" est mélangé à une base aqueuse intro- duite par le conduit 69, la dite base étant pimilaire à celle introduite par le conduit 45 mentionné ci-dessus. Il se forme ainsi un sel de métal alealin de pénicilline et un second extrait aqueux ayant un pH d'environ 7, et de préférence compris entre 6,5 et 6,9. Le mélange est amené par un conduit 71, dans un décanteur 75.
Le solvant S" est extrait par le conduit de base 72 et est,de préférence, purifié , récupéré, et renvoyé dans l'installation . La seconde phase aqueuse contient d'habitude de la pénicilline de très pure en concentration égale 1 50 à 100/fois celle du bouillon introduit dans l'extracteur 20. Le dit extrait est déchargé par un conduit supérieur 73 et peut, si on le désire, être amené à travers un appareil de décoloration 79, similaire à l'appareil de décoloration 68. La solution de pénicilline peut être traitée dans l'un de ces appareils de décoloration ou dans les deux.
Le second extrait aqueux peut à présent être déchargé par le conduit 74, ou bien il peut être amené par un conduit 76 dans une zone d'évaporatior 80, dans laquelle 75 à 95% d'eau en est évaporé aussi rapidement que possible sous un vide absolu d'au moins 10mm. environ de Hg et à une température n'excédant pas 10 C environ.
La solution aqueuse évaporée résultante est prête à l'usage , elle peut être conditionnée (emballée),séchéa ou soumise aux autres traitements souhaitables. pour plus de clarté et de simplicité, les dessins annexés ne représentent pas les pompes auxiliaires, les conduits, les soupapes, les orifices de sortie et d'entrée, les réservoirs, les conduits de chauffage, les conduits
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de refroidissement, les systèmes de récupération de/solvant, les indicateurs de pH et appareils de contrôle de pH..., qui peuvent être nécessaires pour réaliser le procédé, étant donné que l'agencement de ces éléments est évident pour les hommes de métier.
VI. SOLVANTS.
Le solvant organique S et les mélangea SI et S" de ce solvant doivent avoir une densité différente (de préfé- rence une différence d'au moins 10%) de la phase aqueuse avec laquelle ils sont mis en contact. Ce sont des solvants polaires qui ne peuvent réagir avec la pénicilline ou la dé- composer. Ils doivent être liquides et ne peuvent trop visqueux à des températures de l'ordre de-5 C. Pour posséder le degré de polarité voulu, ils doivent être solubles à moins de 5 ' et à plus de 1% dans l'eau 20 C, ils ont, de préfé- rence une solulilité dans l'eau comprise approximativement entre 1% et 2%. Ils doivent être sélectifs visais de la pénicilline et doivent fondre à une température inférieure à-5 C.
Si des quantités substantielles de solvant se dissolvent dans les phases aqueuses du procédé, il est souhaitable que le dit solvant ait une température d'ébul- libition inférieure 100 C, de sorte qu'il puisse faci- lement être récupéré par distillation. Comme solvants or- aniques appropriés on peut citer les formiates, acétates profionates, butyrates, etc...
contenant de 4 à 8 atomes de carbone, tels que l'acétate de n-propyle, l'acétate d'isopropyle, l'acétate de n -butyle, l'acétate d'isobutyle les acétates d'amyle, le choroacétate de propyle ou d'éthyle les lactates @@@@@ contenant de 5 à 10 atomes de carbone, le chloroforme, le bichlorure d'éthylène, le phtalate de diméthys, l'éther diéthylique, l'éther diso- propylique, les méthylpropylcétones, la méthylsobutylcétone l'isop.hDrone etc...
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Il est souhaitable d'Utiliser un solvant de polarité relativement élevée,tel que l'acétate-d'amyle, pour l'extrao. tion principale comme solvant S, tandis que pour les autres extractions par solvant organique il est préférable d'emplo- oyer des solvants à faible polarité mais à forte sélectivité vis-à-vis de la pénicilline. Parmi ces divers solvants l'isobutylcétone convient comme solvant S'et le chloroforme comme solvant S". Le type de solvants S'et S" employé dépend également du milieu dont la pénicilline est extraite.
Des mélanges de méthylisobutylcétone et de chloro- forme sont très efficaces comme solvant S" ou solvant S' ou comme solvant S'et S" pour les diverses formes de pénicilline.
Les essais suivants servent à illustrer le procédé suivant l'invention.
EXEMPLE 1.
Un échantillon de 1, 745 ml d'une solution aqueuse de pénicilline obtenue à partir d'une culture en surface et contenant 36 unites Oxford par ml est acidifié à l'acide sulfurique dilué jusqu'à un pH de 2,5 et introduit au voisinage du centre d'une collnne d'extraction dans laquelle il est extrait à contre uourant par 265 ml de phtalate de diméthyle introduit au voisinage du sommet de la colonne, pour produire une phase aqueuse de rejet extraite du sommet de la colonne, et une phase extrait solvant contenant de la pénicilline qui est lavée au moyen d'une solution tampon de sulfate acide de sodium et de sulfate de sodium ayant un pH de 3,3 avant d'être extraite de la base de la colonne.
L'extrait résultant est alors traité par une solution diluée de bicarbonate de sodium aqueux pour produire une solution ayant un pH de 6,6 et contenant le sel sodique de la pénicilline'.
Cette solution aqueuse est évaporée sous vide jusqu'à
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siécité et révèle, après analyse, une concentration en pénicilline de 50 unités Oxford par mg.
EXEMPLE 2.
Un échantillon de 11,800 ml d'un bouillon filtré de pénicilline ayant un pH de 7,5, obtenu à partir d'une culture submergée et contenant 64 unités Oxford par ml, est acidifié à l'aide d'une solution à 6% d'acide sulfurique jusqu'à un pH de 2,5. Laéolution acidifiée est extraite à contre courant dans une série de mélangeurs et de centrifugeuses par un volume à peu près égal d'acétate d'amyle, pour produire un raffinat aqueux de rejet qui contient, à l'analyse, 7,7% de pénicilline et un extrait solvant qui contient à l'analyse 93% de pénicilline. L'extrai t solvant est d'abord lavé à l'aide de 2,210 ml d'eau distillée et la phase aqueuse de rejet contient, à l'analyse 15,5% de la pénicilline. Ensuite, l'extrait lavé est traité par une solution aqueuse de bicarbonate sodique jusqu'à un pH de 6,8.
La phase aqueuse résultante est évaporée sous vide pour produire le sel sodique sec de la pénicilline qui contient, à l'analyse, 135 unités Oxford par mg.
EXEMPLE 3.
Un échantillon de 2,800 ml de bouillon filtré de pénicilline ayant un pH de 7,5 obtenu à partir d'une culture en surface contenant 81 untités Oxford par ml, est acidifié jusqu'à un pH de 2,1 à l'aide d'une solution à 6% d'acide sulfurique . La solution acidifiée est intro- duite près du centre d'une cellnne à extraction, et extraite à contre courent par une oitié environ de son volume de phtalate de diméthyle introduite près du sommet de la colonne. Elle est ensuite lavée à l'aide de 567ml d'eau distillée introduite près de la base de la colonne, pour produire un raffinat aqueux de rejet que l'on extrait du sommet de la colonne et un extrait solvant que l'on extrait
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mx%-9d de la colonne R %12XÜ:!mf.ü 5txdxxa de la colonne.
Le raffinat aqueux contient à l'analyse, 19,8 % de la pénicilline du bouillon de départ et l'extrait solvant en contient 85,6%. L'extrait est alors traité par une solution aqueuse de bicarbonate sodique pour former une solution saline ayant un pH de 6,8. Cette solu- tion est évaporée sous vide pour donner le sel sodique sec de pénicilline qui contient, à l'analyse, 179 unités Oxford par mg. En comparant la concentration en pénicilline- dans le produit sec à la quantité de pénicilline calculée présente dans les solides dissous dans le bouillon de départ; (2,7 unités par mg), on constate que la concentration en pénicilline a augmenté environ de 67 fois grâce à l'extrac- tion.
EXEMPLE 4.
Un échantillon de 755 ml de bouillon de péni- cilline, obtehu au départ d'une culture en surface contenant 69 unités Oxford par ml, est acidifié à l'aide d'acide sulfurique dilué jusqu'à un pH de 2,1 et est extrait à contrcourant dans une colonne à extraction à l'aide de 380ml de phtalate dediméthyle pour produire une phase aqueuse de rebut et une phase extrait solvant contenant de la pénicilline. L'extrait solvant est lavé à l'aide d'une solution aqueuse de bicarbonate sodique pour produire une solution aqueuse ayant un pH de 6,2 et contenant le sel sodique de la pénicilline. Cette solu- tion est évaporée sous vide, séchée, et analysée. Elle contient 320 unités Oxford par mg.
EXEMPLE 5
Un échantillon de 1, 150 ml d'une solution aqueuse de pénicilline, obtenue au départ d'une culture en suface ayant un pH de 6,9 et contenant 149 unités /d/o xford par ml, ce qui correspond par calcul à 149 unités Oxford par mg de solide dissous, est acidifiée à l'aide d'acide sulfu-
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rique dilué aqueux jusqu'à un pH de ,95.
La solution acidifiée est extraite à contre-courant dans une colonne à. extraction avec environ 1/2fois son volume de méthyliso- butylcétone pour produire un extrait solvant contenant les acides plus faibles que la pénicilline ( cet extrait contient à l' analyse, environ 7,6 de la pénicilline dedépart) et une solution aqueuse ayant un pH de 5,9 et contenant, à 1!analyse, 152 mg de solides dissous dont la concentration en pénicilline est de 26 unités Oxford par Cette solu- tion aqueuse est à nouveau acidifiée à l'aide d'acide sulfurique dilué jusqu'à un pH de 2,3, introduite près du centre d'une colonne d'extraction , et extraite contre-courant par 1,
150ml d'un mélange à parties égales de chloroforme et de méthylisobutylcétone introduit au voisinage du sommet de la colonne. Elle est ensuite lavée' à l'aide de 575 ml d'eau distillée introduite près de le base de la dite colonne, pour produire une phase raffinât de rebut contenant les acides plus forts que la pénicilline et environ 5-1/2 % de la pénicilline et une phase extrait solvant contenant environ 99% de la pénicilline du mélange de départ. La phase extrait est traitée par 65 mg de bicarbonate sodique en solution aqueuse diluée pour produire une solution saline ayant un pH de 7,1. La solution saline est évaporée sous vide pour donner 580 [le; de sel sodique sec de pénicilline contenant 550 unités Oxford de pénicilline par mg.
L'échantillon de départ contenant , d'après les calculs, 1,840 mg de solides dissous contenant 149 unités Oxford de pénicilline par mg. Ainsi si 152 mg de solides dissous n'étaient pas éliminés dans le solvant pour acides plus faibles que la pénicilline, l'entièreté de ces solides dissous subsisterait dans le produit séché final, diminuant ainsi sa concentration en pénicilline de 550 unités Oxford par mg jusqu'à environ 442 unités Oxford par mg. Ceci montre l'avante qu'on
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@@@@@ a de se servir d'une colonne d'extraction pour éliminer les acides plus faibles que la pénicilline.
EXEMPLE 6.
Un échantillon de 1,590 ml de solution aqueuse de pénicilline , obtenu à partir d'une culture en surface ayant une concentration en pénicilline de 64 unités Oxford par ml, est acidifié à l'aide d'acide sulfurique dilué jusqu'à un pH de 5,5 et extrait à contre-oourant dans une colonne à extraction à l'aide de 440 ml de chloroforme pour produire une phase solvant de rebut contenant les acides plus faibles que la pénicilline (qui contient à l'analyse, 50 mg de solides dissous et 0,3% de la péni- cilline de départ) et une phase aqueuse contenant la pénicilline. (La phase solvant de rebut est analysée en la traitant par une solution diluée de bicarbonate sodique pour obtenir une phase aqueuse ayant un pH de 6,6, et en évaporant ensuite la dite phase aqueuse sous vide jusqu'à siccité).
La phase aqueuse contenant la pénicilline est acidifiée à l'aide d'acide sulfurique dilué jusqu'à un pH de 2,2 et introduite près du centre d'une colonne à extraction. Elle est alors extraite à contre courant par 563 ml de chloroforme introduit p.rès du sommet de la colonne, et lavée àvec 170 ml d'eau distillée introduite à la base de la colonne pour produire un raffinat aqueux contenant les acides plus forts que la pénicilline et un extrait solvant contenant la pénicilline. L'extrait solvant est traité avec environ 1/5 de son volume d'une solution aqueuse diluée de bicarbonate sodique jusqu'à un pH de 6,5 et ensuite évaporé sous vide pour produire 106 mg de sel
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sodique* sec de pércilline contenant 308 unités Oxford de pénicilline par mg.
Si la solution aqueuse de départ de pénicilline n'avait pas été traitée au chloroforme pour élimher les acides plus faibles que la pénicilline
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et 58 grammes de solides dissous, le produit séché restant
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aurait contenu,en substance,ltentièreté de ces solides ce qui aurait fait diminuer la concentration en pénicilline de 308 à 205 unités Oxford par mg .
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R.TkïiDTC ,TIF,lis.
1. Procédé de séparation de pénicilline d'acides ayant des constantes de dissociation différentes en solution qqueuse,caractérisé en ce qu'on acidifie la dite solution à l'aide d'acide sulfurique et en ce qu'on extrait la pénicilline à l'aide d'un solvant organique.
Procédé pour purifier la pénicilline- dans une solution aqueuse la contenant et contenant des acides organiques plus faibles que la pénicilline, caractérisé en ce qu'on paintient dans ladite solution un pH approxi- mativement compris entre 7,5 et 8,0 tandis qu'on introduit ladite solution dans une zone d'extraction, en ce qu'on amè- ne ladite solution dans ladite zone en contact avec un solvant organique sélectif pour les acides libres plus faibles que la/pénicilline de manière à produire deux phases,/en ce qu'on sépare les deux phases l'une de l'autre
3.
Procédé pour purifier la pénicilline à partir d'une solution .caractérisé en ce qu'on extrait ladite pénicilline de ladite solution à l'aide d'une bas e aqueuse de manière à produire une solution aqueuse contenant la pénicilline, en ce qu'on acidifie ladite solution aqueuse jusqu'à
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un pH compris approxi.r tivenent entre -.,5 et 8, en ce qu'on amène la solution aqueuse acidifiée en contact avec un solvant organique sélectif pour éliminer les acides plus faibles que la pénicilline et pour produire deux phases, et en ce qu'on sépare les dites phases l'une de l'autre .
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"Penicillin Extraction Process".
The present invention relates to a process for extracting, concentrating and purifying antibiotics. More particularly, it relates to the extraction of penicillin from a fermentation broth and the purification of the extract so as to produce a concentrate of high purity and high yield.
Antibiotic substances, such as penicillin, are the products of certain mushroom shoots. There were rumors of a number of antibiotics, but only penicillin has today acquired commercial value, although it is very likely that other substances
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antibiotics may be produced in the near future. to know the sources of antibiotics and particularly. dels of penicillin, we refer to "Endeavor" (Kyn- oek Peess London for I.C.I.) vol. 3, N January 9, 1944, pages 3 to 14.
Penicillin is an organic acid, a bacteriostatic agent, and an important remedy for combating disease and preventing the spread of infections.
It is produced during the growth of certain molds, such as penicillium notatum, in an aqueous solution. There are different methods of growing these molds. Thus they can be grown in the submerged state in liquid cultures, or on the culture surface ;, liquids or even on moist bran.
The aqueous broth obtained from the various cultures usually contains between about 0.01 and 0.001% by weight of penicillin or between about 25 and 200 Oxford units per ml (see the article by Houry and Jennings in "British Journal Of Experimental Pathology "vol 23 - page 120 June 1942) The broth also contains varying amounts of solids, non-ionic impurities, amphoteric materials various organic impurities including acids stronger and weaker than penicillin etc. Several penicillins are known, for example, penicillins F and G allo-penicillin, etc. Some of these penicillins have different solubilities in various solvents.
The object of the present invention is to improve the recovery of antibiotics, and particularly of penicillin, from their fermentation bounces and to increase their purity beyond that which can be obtained hitherto. A further subject of the invention is to achieve this purification and this recovery in a minimum of time. It further relates to the effective and appropriate removal of organic impurities such as.
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acids weaker and stronger than peniHj - 2 6 lei /
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normally associated with penicillin, apart from aqueous solutions containing these impurities and penicillin. Finally, a further object of the invention is to carry out the aforementioned operations by a continuous process involving a series of controlled extractions.
Generally speaking, the invention relates to the extraction of penicillin, as well as the other aforementioned organic impurities, out of the broth using an appropriate organic polar solvent, with the subsequent removal of acids which are more palatable than. penicillin out of the extract and removing out of the remaining extract stronger acids and more water soluble acids than penicillin.
The process description can be subdivided as follows: (1) Preliminary treatment (2) Main extraction (3) Removal of weaker acids (4) Removal of stronger acids (5) Recovery and concentration of penicillin (6) Solvents .
Since the present process involves several extractions, the nomenclature for identifying the various extracts is difficult. For charting purposes, an extract obtained for example using a solvent “S” will be called “solvent extract S”. Likewise, an extract obtained by washing with water will be called an "aqueous extract", etc.
Figs. 1 and 2 taken together are schematic views of a preferred embodiment of the process according to the invention.
Fig. 3 is a graph showing the approximate relationship between the pH of the aqueous phase and the ratios of the concentrations of organic acids in the two liquid phases.
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pre-limna ire treatment. Penicillin acid breaks down very easily
Superior
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at temperatures slightly below 0 ° C. Strong acids, strong bases, heavy metals, and certain other reagents destroy it.
The entire extraction process is carried out at a temperature as close as possible to 0 ° C., without freezing the water present. Tou. ' the aeibes or the bases introduced to regulate the values of the PH in the installation are added to the dilute aqueous solutions, and the extractions in acids and even dilute bases are carried out as quickly as possible.
Referring to the accompanying drawings, 1 shows a fermentation plant in which penicillin is produced. This enclosed in an aqueous broth is supplied through line 2 to a condenser 3. Aqueous solutions of penicillin from other sources can be supplied to line 2 through a valve line 4. In the condenser%, the broth is cooled to a temperature very close to its freezing point, i.e. around 0 C. The broth is then extracted from the condenser via line 5 and can be freed of the solids which it confers by passing through the filter 6, or in the centrifuge 7, or both in both devices
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mentioned quoted: rant. It was then wandered through conduit 8.
If desired, an emulsifying agent can be added to the broth through line 9 either before or after subsequent processing.
The broth is acidified to a pH of about 2.0 and 3.5 in order to release the acidic penicillin which is soluble in the solvent used in the next step. The acids intended for the aforementioned acidification must be stronger than the weak organic acids to be separated from the penicillin. They must also be soluble in water, and must have a low distribution coefficient in the solvent, that is to say say, a coefficient less than 1, and preferably
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less than 0.1. As suitable acids, mention may be made of sulfuric and phosphoric acids in solutions, the concentrations of which are approximately between 0.01 and 10% by volume, and preferably between 0.05 and 5%.
II. Main extraction.
The broth from line 12 can be extracted with solvent S by either of the following methods: (1) passing it through a multistage extraction column or (2) by passing it through a multistage extraction column. passing through a series of mixers and centrifuges and / or decanters.
In the first method, the aqueous broth is introduced through line 13 at an intermediate point between the ends of column 20. If the organic solvent S is lighter than the broth, it is introduced near the base of the column by line 21. This solvent S then rises in the column in the direction opposite to that of. aqueous phase and it dissolves the penicillin and the other organic acids contained in the broth and having similar partition coefficients with respect to the solvent at the pH of the extraction. Water is added to the top of the column to extract salts of acids weaker than penicillin and other impurities which dissolve better in water.
The quantity of water introduced is sufficient to raise the pH from the value it has at the inlet of the broth into the column (line 13) to a value between approximately 3.0 and 4.5 near the top of the column.
The water may contain a small amount, less than 1% by weight, of a buffering salt to prevent the pH from changing too quickly given. the extraction of acids by the solvent. Suitable buffer salts are those which contain various levels of ionization such as sodium and potassium phosphates.
If desired, we can introduce wax by
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layers 14 at one or more locations on the column between the broth and solvent inspection ports, and preferably adjacent to the solvent inlet. This is especially desirable if the aquease phase does not contain a buffer. The addition of acid through conduits 14 can have a dual purpose; (1) allow the acidification of the broth directly in the extraction zone of the column if the broth is not or is only insufficiently acidified as it enters the column through line 13; (2) produce a gradually rising pH between the solvent and broth inlet ports which is more favorable to separation than the natural increasing tendency of pH.
This increases the distribution coefficient of penicillin and the other organic acids in favor of the solvent phase, which makes it possible to use less solvent for the same quantity of products recovered. Thus the pH in the aqueous phase at the base of the column can range approximately between 2.5 and 4.
The introduction of water through the line 22, or the introduction of acid through the lines 14 or both introductions, have the effect of increasing the selectivity of the solvent vis-à-vis penicillin on the one hand and weaker organic adids on the other hand. The resulting acidic aqueous phase is removed from the. b: .se of the column via line 23. The rich solvent extract phase S is extracted from the top of the column via line 24.
In the second extraction method, the acidified broth having a pH of approximately between 2 and 3 is passed through lines 14, then mixed with solvent S introduced through line 28 into mixer 30. The resulting mixture is then separated into two phases in the centrifuge 34 and / oju the decanter 38, the use
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one or both of the devices mentioned above depending on the ease of separation. It is desirable to provide several extraction stages constituted by a series of mixers and settlers. The separated aqueous phase is discharged through conduits 35.
The extract-solvent phase S is brought through line 39 into a condenser 40, where it is washed with water (introduced through line 41), this water being similar to that provided at the top of column 20. The aqueous phase from column 40 is extracted through lower pipe 42 and the solvent extract phase S is extracted through upper pipe 42 '. If desired, column 40 can be replaced with equivalent apparatus such as a mixer and settler. As in the above-mentioned first method, it is desirable that the pH increase gradually, which is more favorable to separation than the natural tendency of increasing pH in the mixer-settler system.
This gradual increase can be obtained by adding acid at different stages so as to obtain a pH ranging in the range approximately between 2.0 and 4 at the outlet of the aqueous phase. that is to say to the collecting duct 35, and to produce a pH of approximately between 3 and 4.5 in the aqueous phase near the top of the condenser 40, where the water is introduced. The ratios of solvent to be supplied in this first extraction are usually between 2: 1 and 1: 5, although higher and lower ratios can be used III. ELIMINATION OF LOWER ACIDS.
The solvent extract S comprising penicillin and other acids dissolved in the solvent Sn. obtained by conduit 24 either by conduit 42 or by another source, not shown, from which it is removed by conduit 43, passes through conduit 44 and is mixed in a mixer 46 with a dilute aqueous base having , preferably, a buffer activity and preferably consisting of a
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inorganic compound introduced through line 45.
The purpose of the present extraction step is to concentrate the penicillin in an aqueous phase and to separate weaker acids from the penicillin. The aqueous base solution forces more penicillin and stronger acids to ionize than acids weaker than penicillin. Since the ions and ionic salts of these organic acids are more soluble in water than in the solvent, in comparison with dissociated acids, the former are extracted into the aqueous phase. This results in a preliminary separation between the weaker acids on the one hand and the penicillin and stronger acids on the other.
As weak aqueous bases nn can be mentioned
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hydroxides of Ca, Sr, and Ba, bicariaonates, phosphates, citrates, tartrates etc. of Na and K. The aqueous base usually contains between about 0.2 and 2% by weight of the alkali compound, and the amount of aqueous base solution added is usually between about 1/5 and 1/50 of the volume of. extract -solvent S. This amount of aqueous base should be such as to give rise to an aqueous extract having a pH between about 4.5 and 8.0, this pH varying as s1 will be described later. The mixture of aqueous extract and solvent S is then brought via a line 47 into a decanter 48 to be separated.
The solvent is extracted through an upper pipe 49 and can be recovered, purified and reintroduced into the installation through pipes 21 and 28. The aqueous extract is discharged through a lower pipe 50 and can now be treated according to two different methods, according to its pH and the desired purity for penicillin. If the pH is approximately between 5 and 8, and if it is preferably greater than about 6.2 the remaining acids weaker than penicillin should
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be removed by extraction in an extractor 55. But if the pH is lower than the aqueous extract can be taken through line 53 to the next stage of extraction (described later) to remove acids stronger than penicillin.
However, it is preferable to operate at a pH greater than 5 in the decanter 48, in order to obtain a better recovery of the penicillin.
If the preferred method is adopted, the aqueous extract in line 50 is introduced through line
55 53 in the extraction column (. In which the acids weaker than penicillin remain are extracted from the aqueous extract acidified with a suitable organic solvent, 'S'working against the current. The solvent S'which may be identical or different from the solvent S, is introduced (if it is lighter than the aqueous extract) from the vicinity of the bottom of the column via a line 56.
Between or near the inlet ports for solvent S'and for aqueous extract, an acid stronger than penicillin is introduced at one or more points in the column, similar to that used in the main extraction stage, mats having a concentrate of approximately between 0.01 and 10% by volume, and preferably between 0.05 and 5%. When the buffering capacity in the aqueous extract supplied to the column is high, the acid can be introduced near or at the inlet of the aqueous extract through a line 51 or through one of the lines. from line 59. But if the buffering capacity is low, the strong acid must be introduced closer to the solvent inlet through one of the lower conduits from 58.
The amount of strong acid added must be sufficient in each case to give, in the pH aqueous phase at the base of the column, a pH of between 3 and 8 and preferably between 3.0 and 6.5. The introduction of this strong acid into the column produces a gradually increasing pH in extractor 55, which is more favorable.
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ble for the separation of more weak acids than penicillin as the natural increase in pH obtained when all the acid is introduced into the initial supply.
The resulting solvent extract S is discharged through the upper line 57 and the solvent S can be recovered, purified and reintroduced into column 55 through the line.
56. The extracted aqueous phase still contains penicillin and acids stronger than penicillin is withdrawn through the lower duct 58.
Solvent ratios to be provided in the solvent are ordinarily between 2: 1 and 1: 5, although higher or lower ratios may be employed.
Figure III is an illustrative graph explaining why the pH of the aqueous solution containing penicillin and acids weaker than penicillin is an important factor in the process.
In this figure, the pH values are determined relative to the logar thems of the K values of three types of acids.
K -concentration of acid in the solvent phase -concentration of acid in the aqueous phase
The position of the curves shown in the graph should be considered only as approximate, for the purpose of illustration, and may be displaced with respect to the coordinate axes, these curves may also occupy other positions with respect to each other to the other for various solvents. for various temperatures, etc ...
, - ,. since the free organic acids in the aqueous solution are more soluble in organic solvents than their corresponding ionic salts, and since some salts are more soluble in water than in the solvent, a lowering of the pH will result in a lowering of the values of K. Therefore, it is important that the pH of the aqueous solution is adjusted so that the average part of the acids weaker than the penicillip is in the state of free acid, while the middle part.
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penicillin and acids stronger than penicillin are present or remain in the aqueous solution as ionic sesl.
Thus, at a pH below about 1, more than half of the penicillin is lost in the solvent phase, while at a pH above about 6.5, most of the strong acids remain in the aqueous phase and are not separated. Note that the separation should be done entirely on one side of the region, where the weak acid curves approach or intersect the penicillin curve.
Thus, for all practical and reasonable concentrations of penicillin which may be found in aqueous solutions, and for all reasonable ratios of solvent to be supplied, the maintenance of the pH in the aqueous solution at a value between approximately 4 and 6.5 at Top of the extractor ensures separation of acids weaker than penicillin and penicillin.
VI ELILINATION OF ACIDS - STRONGER. not
The aqueous phase from the bottom of column 55 in line 58, or the aqueous extract phase from the bottom of settler 48 in line 53, as the case may be, is now fed through line 61 into the extractor. solvent 60. This extraction is carried out at a pH generally lower than that of the extraction in column 55 obtained by adding an acid identical to that used for the extraction in said column 55. This acid can be introduced in the conduit 61 via the conduit 62 or in the column 60 via the conduits 63, or alternatively via the two routes mentioned above.
The extractor 60 is similar to the extractor 20 in terms of operation. The aqueous phase containing penicillin and acids stronger than penicillin is brought up against the current in contact with an appropriate organic solvent S ", which may be identical to solvents S and S ', but preferably different from solvent S. Both
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Solvents S "and S 'can be used, if they are different from each other, either in the same extractor (as drafts' or in separate extractors. Separate extractors are particularly advisable, if the one of the solvents is heavier than water, while the other is heavier than water. The solvent S "is introduced (if it is heavier than the aqueous phase) through the conduits 64 near the top of column 60.
In the vicinity of the base of column 60, water is introduced through line 66 to wash off salts of stronger acids. Penicillin and other impurities which dissolve better in water are (i.e. which have a better distribution coefficient with respect to water). If desired, one can introduce 1 (acid through one or more conduits 65 between the inlet ports of the aqueous phase and the solvent, so as to produce a gradual increase in pH, which is more favorable to the separation than the natural tendency for the pH to increase in the column. In this way, the pH of the aqueous phase near the base of the column is approximately between 3 and 5, while the pH of the aqueous phase at the top of the column. the column is approximately between 2.0 and 5.0.
If desired, the extractor 60, like the extractor 55 mentioned above, may comprise a series of mixers and settlers instead of a column. The water introduced through line 66 may contain between 0.001% and 1% by weight approximately of a buffer or an alkali hydroxide or salt, as mentioned above. Solvent S "extracts the acidic penicillin to produce a solvent extract S "which is discharged through the base line 67. The remaining aqueous phase containing acids stronger than penicillin is extracted through line 65.
V. RECOVERY & CONCENTRATION.
The solvent extract S "coming from the extractor 60 is fed through a line 67, or directly into a mixer.
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70 or first in a bleaching apparatus 68 containing an adsorbent such as charcoal. This discoloration device can be an aspiration column or a mixer following a decanter, or a centrifuge or a filtration device. In mixer 70, the solvent extract S "is mixed with an aqueous base introduced through line 69, said base being similar to that introduced through line 45 mentioned above. A metal salt is thus formed. penicillin alealin and a second aqueous extract having a pH of about 7, and preferably between 6.5 and 6.9 The mixture is brought through a line 71, into a decanter 75.
The solvent S "is extracted through the base line 72 and is preferably purified, recovered, and returned to the installation. The second aqueous phase usually contains very pure penicillin in a concentration equal to 150 to 100. / times that of the broth introduced into the extractor 20. Said extract is discharged through an upper duct 73 and can, if desired, be fed through a decolouring apparatus 79, similar to the decoloring apparatus 68. The penicillin solution can be processed in one or both of these bleaching devices.
The second aqueous extract can now be discharged through line 74, or it can be brought through line 76 to an evaporator zone 80, where 75 to 95% of the water is evaporated as quickly as possible under a absolute vacuum of at least 10mm. approximately Hg and at a temperature not exceeding approximately 10 C.
The resulting evaporated aqueous solution is ready for use, it can be conditioned (wrapped), dried or subjected to other desirable treatments. for clarity and simplicity, the accompanying drawings do not show auxiliary pumps, conduits, valves, outlet and inlet ports, tanks, heating conduits, conduits
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cooling systems, solvent / recovery systems, pH indicators and pH controllers ..., which may be necessary to carry out the process, since the arrangement of these elements is obvious to those skilled in the art .
VI. SOLVENTS.
The organic solvent S and the mixtures S1 and S "of this solvent must have a different density (preferably a difference of at least 10%) from the aqueous phase with which they are contacted. These are polar solvents. which cannot react with or break down penicillin They must be liquid and cannot be too viscous at temperatures in the order of -5 C. To have the desired degree of polarity, they must be soluble at less than 5 C. and at greater than 1% in water at 20 ° C. they preferably have a water solulility of between approximately 1% and 2%. They should be selective for penicillin and should melt at a temperature. less than -5 C.
If substantial amounts of solvent dissolve in the aqueous phases of the process, it is desirable that said solvent has a boiling temperature below 100 ° C, so that it can easily be recovered by distillation. As suitable organic solvents, mention may be made of formates, acetate profionates, butyrates, etc.
containing 4 to 8 carbon atoms, such as n-propyl acetate, isopropyl acetate, n -butyl acetate, isobutyl acetate amyl acetates, propyl choroacetate or ethyl lactates containing 5 to 10 carbon atoms, chloroform, ethylene bichloride, dimethys phthalate, diethyl ether, disopropyl ether, methylpropyl ketones, methylsobutyl ketone isop.hDrone etc ...
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It is desirable to use a solvent of relatively high polarity, such as amyl acetate, for the extra. mainly as solvent S, while for the other extractions by organic solvent it is preferable to use solvents with low polarity but high selectivity towards penicillin. Among these various solvents, isobutyl ketone is suitable as the solvent S "and chloroform as the solvent S". The type of solvents S "and S" employed also depends on the medium from which the penicillin is extracted.
Mixtures of methyl isobutyl ketone and chloroform are very effective as a solvent S "or solvent S 'or as a solvent S and S" for the various forms of penicillin.
The following tests serve to illustrate the process according to the invention.
EXAMPLE 1.
A sample of 1.745 ml of an aqueous solution of penicillin obtained from a surface culture and containing 36 Oxford units per ml is acidified with dilute sulfuric acid to a pH of 2.5 and introduced into vicinity of the center of an extraction collnne in which it is extracted against the current with 265 ml of dimethyl phthalate introduced near the top of the column, to produce an aqueous phase of discharge extracted from the top of the column, and a solvent extract phase containing penicillin which is washed with a buffer solution of sodium acid sulfate and sodium sulfate having a pH of 3.3 before being extracted from the base of the column.
The resulting extract is then treated with dilute aqueous sodium bicarbonate solution to produce a solution having a pH of 6.6 and containing the sodium salt of penicillin.
This aqueous solution is evaporated under vacuum to
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siécité and reveals, after analysis, a penicillin concentration of 50 Oxford units per mg.
EXAMPLE 2.
An 11.800 ml sample of a filtered penicillin broth having a pH of 7.5 obtained from submerged culture and containing 64 Oxford units per ml is acidified with a 6% solution of sulfuric acid to a pH of 2.5. The acidified solution is countercurrently extracted in a series of mixers and centrifuges with an approximately equal volume of amyl acetate, to produce an aqueous reject raffinate which contains, on analysis, 7.7% penicillin. and a solvent extract which, on analysis, contains 93% penicillin. The solvent extract is first washed with 2.210 ml of distilled water and the aqueous reject phase contains, on analysis, 15.5% of the penicillin. Then, the washed extract is treated with an aqueous solution of sodium bicarbonate to a pH of 6.8.
The resulting aqueous phase is evaporated in vacuo to produce the dry sodium salt of penicillin which contains, on analysis, 135 Oxford units per mg.
EXAMPLE 3.
A 2,800 ml sample of filtered penicillin broth having a pH of 7.5 obtained from a surface culture containing 81 Oxford units per ml, is acidified to a pH of 2.1 using a 6% solution of sulfuric acid. The acidified solution is introduced near the center of an extraction cell, and counter-extracted with about one part of its volume of dimethyl phthalate introduced near the top of the column. It is then washed with 567ml of distilled water introduced near the base of the column, to produce an aqueous reject raffinate which is extracted from the top of the column and a solvent extract which is extracted.
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mx% -9d of column R% 12XÜ:! mf.ü 5txdxxa of column.
The aqueous raffinate contains, on analysis, 19.8% of the penicillin of the starting broth and the solvent extract contains 85.6% thereof. The extract is then treated with an aqueous solution of sodium bicarbonate to form a saline solution having a pH of 6.8. This solution is evaporated in vacuo to give the dry sodium salt of penicillin which, on analysis, contains 179 Oxford units per mg. By comparing the penicillin- concentration in the dry product to the calculated amount of penicillin present in the solids dissolved in the starting broth; (2.7 units per mg), it was found that the penicillin concentration increased by approximately 67 times with the extraction.
EXAMPLE 4.
A 755 ml sample of penicillin broth, obtained from a surface culture containing 69 Oxford units per ml, is acidified with dilute sulfuric acid to a pH of 2.1 and is countercurrently extracted in an extraction column using 380 ml of dimethyl phthalate to produce a waste aqueous phase and a solvent extract phase containing penicillin. The solvent extract is washed with an aqueous solution of sodium bicarbonate to produce an aqueous solution having a pH of 6.2 and containing the sodium salt of penicillin. This solution is evaporated in vacuo, dried, and analyzed. It contains 320 Oxford units per mg.
EXAMPLE 5
A sample of 1.150 ml of an aqueous solution of penicillin, obtained from a surface culture having a pH of 6.9 and containing 149 units / d / o xford per ml, which corresponds by calculation to 149 Oxford units per mg of dissolved solid, is acidified with sulfuric acid
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Risky diluted aqueous to a pH of .95.
The acidified solution is extracted against the current in a column. extraction with approximately 1/2 times its volume of methyl isobutyl ketone to produce a solvent extract containing acids weaker than penicillin (this extract contains, on analysis, approximately 7.6 of the starting penicillin) and an aqueous solution having a pH of 5.9 and containing, on analysis, 152 mg of dissolved solids with a penicillin concentration of 26 Oxford units per This aqueous solution is again acidified with dilute sulfuric acid to a pH of 2.3, introduced near the center of an extraction column, and extracted against the current by 1,
150ml of a mixture of equal parts of chloroform and methyl isobutyl ketone introduced near the top of the column. It is then washed with the aid of 575 ml of distilled water introduced near the base of said column, to produce a waste raffinate phase containing acids stronger than penicillin and about 5-1 / 2% of penicillin and a solvent extract phase containing approximately 99% of the penicillin of the starting mixture. The extracted phase is treated with 65 mg of sodium bicarbonate in dilute aqueous solution to produce a saline solution having a pH of 7.1. The saline solution is evaporated in vacuo to give 580 [le; of dry penicillin sodium salt containing 550 Oxford units of penicillin per mg.
The starting sample was calculated to contain 1.840 mg of dissolved solids containing 149 Oxford units of penicillin per mg. Thus if 152 mg of dissolved solids were not removed in the solvent for acids weaker than penicillin, all of these dissolved solids would remain in the final dried product, thus reducing its penicillin concentration from 550 Oxford units per mg up to to about 442 Oxford units per mg. This shows that we
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Using an extraction column to remove acids weaker than penicillin.
EXAMPLE 6.
A 1.590 ml sample of aqueous penicillin solution, obtained from a surface culture having a penicillin concentration of 64 Oxford units per ml, is acidified with dilute sulfuric acid to a pH of 5 , 5 and countercurrently extracted in an extraction column using 440 ml of chloroform to produce a waste solvent phase containing acids weaker than penicillin (which on analysis contains 50 mg of dissolved solids and 0.3% of the starting penicillin) and an aqueous phase containing the penicillin. (The waste solvent phase is analyzed by treating it with a dilute solution of sodium bicarbonate to obtain an aqueous phase having a pH of 6.6, and then evaporating said aqueous phase in vacuo to dryness).
The aqueous phase containing the penicillin is acidified with dilute sulfuric acid to a pH of 2.2 and introduced near the center of an extraction column. It is then extracted against the current with 563 ml of chloroform introduced near the top of the column, and washed with 170 ml of distilled water introduced at the base of the column to produce an aqueous raffinate containing acids stronger than the column. penicillin and a solvent extract containing penicillin. The solvent extract is treated with about 1/5 of its volume of a dilute aqueous solution of sodium bicarbonate to pH 6.5 and then evaporated in vacuo to produce 106 mg of salt.
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Percillin sodium * dry containing 308 Oxford units of penicillin per mg.
If the starting aqueous penicillin solution had not been treated with chloroform to remove acids weaker than penicillin
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and 58 grams of dissolved solids, the dried product remaining
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would have contained, in substance, all of these solids which would have reduced the penicillin concentration from 308 to 205 Oxford units per mg.
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R.TkïiDTC, TIF, lis.
1. A process for separating penicillin from acids having different dissociation constants in qqueuse solution, characterized in that said solution is acidified with sulfuric acid and in that the penicillin is extracted with using an organic solvent.
A process for purifying penicillin in an aqueous solution containing it and containing organic acids weaker than penicillin, characterized in that said solution is painted at a pH approximately between 7.5 and 8.0 while said solution is introduced into an extraction zone, in that said solution is brought into said zone in contact with an organic solvent which is selective for free acids weaker than / penicillin so as to produce two phases, / in what we separate the two phases from each other
3.
A process for purifying penicillin from a solution, characterized in that said penicillin is extracted from said solution with an aqueous base so as to produce an aqueous solution containing penicillin, in that it is extracted from said solution. acidifies said aqueous solution to
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a pH of approximately between -. 5 and 8, in that the acidified aqueous solution is brought into contact with a selective organic solvent to remove acids weaker than penicillin and to produce two phases, and in this that the said phases are separated from one another.