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" Procédé d'extraction de pénicilline".
La présente invention est relative à un procédé d'extration,de concentration et de purification d'anti- biotiques. Elle concerne plus spécialement l'extraction de pénicilline d'un bouillon de fermentation et la puri- fivation de,l'extrait de manière à produire un concentrât de grande pureté et de haut rendement.
Les substances antibiotiques, comme la pénicilline, sont les produits de certaines pousses de champignons. On sonnait un certain nombre d'antibiotiques, mais seule la pénicilline a aujourd'hui acquis une valeur commerciale, bien qu'il soit très probable que d'autres substances
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antibiotiques puissent être produites dans un avenir prochain. pour connaitre les sources d'antibiotiques et particulièrement. delles de pénicilline, on s'en référera à " Endeavor" ( Kyn- oek Peess London for I.C.I.)vol. 3, N 9 janvier 1944, pages 3 à 14.
La pénicilline esun acide organique, un agent bactériostatique, et un remède important pour combattre les maladies et pour empêcher la diffusion d'infections.
Elle est produite pendant la croissance de certaines moisis- usures, comme le pénicillium notatum, dans une solution aqueuse. Il existe différentes méthodes pour faire croître ces moisissures. Ainsi on peut les faire croître à l'état submergé en cultures liquides, ou bien à la surface de culture;, liquides ou bien encore sur du son humide.
Le bouillon aqueux obtenu à partir des diverses cultures conti- ent ordinairement entre environ 0,01 et 0,001-;,: en poids de pénicilline ou entre environ 25 et 200 unités Oxford par ml ( voir l'article de Houry et Jennings dans "British Journal Of expérimental Pathology " vol 23 - page 120 juin 1942) Le bouillon contient également des quantités variables de solides, d'impuretés non-ioniques, de matières amphotères diverses impurretés organiques parmi lesquelles des acides plus fort et plus faibles que la pénicilline etc.. On connait plusieurs pénicillines par exemple , les pénicillines F et G l'allo-pénicilline etc. Certaines de ces pénicillines possèdent des solubilités différentes dans divers solvants.
La présente invention a pour objet d'améliorer la récupération d'antibiotiques et particulièrement de péni- cilline de leurs bounllons de fermentation et d'augmenter leur pureté au delà de celle pouvant être obtenue jusqu'à présent. L'invention a encore pour objet la réalisation de cette purification et de cette récupération en un minimum de temps. Elle concerne en outre l'élimination effective et appropriée des impuretés organiques telles que.
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les acides plus faibles et plus forts que la péniHj - 2 6 lei/
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normalement associés à la pénicilline, hors des solutions aqueuses contenant ces impuretés et la pénicilline. Enfin l'invention a encore pour objet de réaliser les opérations susmentionnées par un procédé continu impliquant une série d'extractions contrôlées.
Généralement parlant,l'invention est relative à l'extraction de la pénicilline, de même que des autres impuretés organiques précitées, hors du bouillon à l'aide d'un solvant polaire organique approprié, à l' limination subséquente des acides plus aibles que la pénicilline hors de l'extrait et à l'élimination hors de l'extrait restant des acides plus forts et des acides plus solubles dans l'eau que la pénicilline.
La description du procédé peutêtre subdivisée comme suit : (1) Traitement préliminaire (2) Extraction principale (3) Elimination d'acides plus faibles (4) Elimination d'acides plus forts (5) Récupération et concentration de la pénicilline (6) Solvants.
Etant donné que la présent procédé comporte plusieurs extractions, la nomenclature d'identification des divers extraits est difficile. Dans un but de charté un extrait obtenu par exemple à l'aide d'un solvant "S" sera appelé "extrait solvant S ". De même un extrait obtenu par lavage à l'eau sera dénommé "extrait aqueux" etc...
Les fig. 1 et 2 combinées sont des vues schématiques d'une forme de réalisation préférée du procédé suivant l'invention.
La fig.3 est un graphique établissant la relation approximative entre le pH de la phase aqueuse et les rap- x ports des concentrations des acides organiques dans les deus phases liquides.
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le traitement pré limna ire. La pénicilline acide se décompose très facilement
Supérieures
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à des températures léèrement a^0 C. Des acides forts, 6es bases fortes, des métaux lourds, et certains autres réactifs la détruisent.
L'entièreté du procédé d'extraction s'effec- tue à une température aussi voisine que possible de 0 C, sans congélation de l'eau en présence. Tou.' les aeibes ou les bases introduits pour régler les valeurs du PH dans en l'installation sont additionnés aux solutions aqueuses diluées, et les extractions dans les acides et les bases même diluées s'effectuent aussi rapidement que possible.
En se référant aux dessins annexés, 1,représente une installation de fermentation dans laquelle la pénicilline est produite. Celle -ci renfermée dans un bouillon aqueux est amenée par un conduit 2 à un réfrigérant 3. Des solutions aqueuses de pénicilline provenant d'autres sources peuvent être amenées au conduit 2 par un conduit 4 à soupape. Dans le réfrigérant % le bouillon est refroidit à une température très voisine de son point de congélation, soit environ 0 C. Le bouillon est ensuite extrait du réfrigérant par le conduit 5 et peut être débarrassé des solides qu'il confient par passage au travers du filtre 6, ou dans la centrifugeuse 7, ou à la fois dans les deux dispositifs
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mentionnés cita:rant. Il est ensuite errait par le conduit 8.
Si on le désire, un agent émulsifiant peut être ajouté au bouillon nar le conduit 9 soit avant soit après le traitement ultérieur.
Le bouillon est acidifie jusqu'à un pH d'environ 2,0 et 3,5 en vue de libérer la pénicilline acide qui est soluble dans le solvant employé au stade suivant. Les acides destinés à l'acidification précitée doivent être plus forts que les acides organiques faibles à séparer de la pénicilline Il doivent en outre être solubles dans l'eau, et doivent posséder un faible coéfficient de répartition dans le solvant c'est-à-dire, un coéfficient inférieur à 1, et de préférence
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inférieur à 0,1. Comme acides appropriés on peut citer les acides sulfuriques et phosphoriques en solutions dont les concentrations sont comprises approximativement entre 0,01 et 10% en volume, et de préférence entre 0,05 et 5%.
II. Extraction principale.
Le bouillon du conduit 12 peut être extrait à l'aide du solvant S par l'une ou l'autre des méthodes suivants :(1) en le faisant passer à travers une colonne d'extraction à plusieurs étages ou (2) en le faisant passer à travers une série de mélangeurs et de centrifugeuses et/ou de décanteurs.
Dans la première méthode, le bouillon aqueux est introduit par le conduit 13 en un point intemédiaire entre les extrémités de la colonne 20. Si le solvant organique S est plus léger que le bouillon, il est introduit au voisinage de la base de la colonne par le conduit 21. Ce solvant S s'élève alors dans la colonne en sens opposé à celui de la. phase aqueuse et il didsout la pénicilline et les autres acides organiques contenus dans le bouillon et ayant des coéfficients de répartition similaires vis-à-vis du solvant au pH de l'extraction. L'eau est ajoutée au sommet de la colonne pour l'extraction des sels d'acides plus faibles que la pénicilline .et d'autres impuretés se dissol- vant mieux dans l'eau.
La quantité d'eau introduite est suffisante pour élever le pH depuis la valeur qu'il a à l'orifice d'entrée du bouillon dans la colonne (conduit 13) jusqu'à une valeur comprise approximativement entre 3,0 et 4,5 au voisinage du sommet de la colonne.
L'eau peut contenir une faible quantité,soit moins de 1% en poids, d'un sel tampon destiné à empêcher que le pH ne change trop rapidement étant donné. l'extraction des acides par le solvant. Les sels tampons appropriés sont ceux qui contiennent divers niuveaux d'ionisation comme les phosphates de sodium et de potassium.
Si l'on désire, on peut introduire de la cire par
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les ponduits 14 en un ou plusieurs endroits de la colonne entre les orifices d'entrevu bouillon et du solvant, et de préférence au voisinage de l'orifice d'entrée du solvant Ceci est spécialement souhaitable si la phase aquease ne contient pas de tampon. L'addition d'acide par les conduits 14 peut avoir un double but ; (1) permettre l'aci- dification du bouillon directement dans la zone d'extraction de la colonne si le bouillon n'est pas ou n'est qu'insuffi- samment acidifié lorsqu'il entre dans la colonne par le conduit 13 ; (2) produire un pH s'élevant Graduellement entre les orifices d'entrée du solvant et du bouillon ce qui est plus favorable à la séparation que la tendance d'accroissement naturelle du pH .
Ceci augmente le coéffi- cient de répartition de la pénicilline et des autres acides organiques en faveur de la phase solvant, ce qui permet d'employer moins de solvant pour la même quantité de pro- duits récupérés. Ainsi le pH dans la phase aqueuse à la base de la colonne peut s'étendreapproximatjvement entre 2,5 et 4.
L'introduction d'eau par le conduit 22,ou l'introduction d'acide par les conduits 14 ou les deux introductions, ont pour effet d'augmenter la sélectivité du solvant vis-à-vis de la pénicilline d'une part et des adides organiques plus faibles d'autre part. La phase aqueuse acide résultante est éloignée de le. b:.se de la colonne par le conduit 23. La phase extrait solvant S riche est extraite du sommet de la colonne par la conduit 24.
Dans la seconde méthode d'extraction, on fait passer le bouilion acidifié ayant un pH approximatjvement compris entre 2 et 3 par des conduits 14, puis on le mélange avec du solvant S introduit par le conduit 28 dons le mélangeur 30. Le mélange résultant est alors séparé en deux phases dans la centrifugeuse 34 et/oju le décanteur 38, l'emploi
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d'un ou des deux dispositifs mentionnés ci-avant dépendant de la facilité de la séparation. Il est souhaitable de prévoir plusieurs étages d'extration constitués par une série de mélangeurs et de décanteurs. La phase aqueuse sépa- rée est déchargée par les conduits 35.
La phase extrait- solvant S est amenée par le conduit 39 dans un condenseur 40, où elle est lavée à l'eau (introduite par le conduit 41), cette eau étant similaire à celle prévue au sommet de la colonne 20. La phase aqueuse provenant de la colonne 40 est extraite par le conduit inférieur 42 et la phase extrait solvant S est extraite par le conduit supérieur 42'. Si on le désire , la colonne 40 peut être remplacée par un appareil équivalent tels qu'un mélangeur et un décanteur. Comme dans la première méthode susmentionnée, il est souhaitable que le pH augmente graduellement,ce qui est plus favorable à la séparation que la tendance naturelle d'accroissement du pH dans le système mélangeur-décanteur.
Cet accroissement graduel peut être obtenu en ajoutant de l'acide à différents étages de manière à obtenir un pH s'étendant dans l'intervale approximativement compris entre 2,0 et 4 à l'orifice de sortie de la phase aqueuse c'est-à-dire au conduit collecteur 35, et pour produire un pH approximativement compris entre 3 et 4,5 dans la phase aqueuse au voisinage du sommet du condenseur 40, où l'eau dst introduite. Les rapports de solvant à fournir dans cette première extraction sont ordinairement compris entre 2:1 et 1 :5, bienque des rapports plus élevés et moins élevés puissent être employés III. ELIMINATION D'ACIDES PLUS FAIBLES.
L'extrait solvant S comprenant la pénicilline et d'autres acides dissous duns le solvant Sn. obtenus poit par le conduit 24 soit par le conduit 42 soit par une autre sour- ce non représentée dont il est enlevé par le conduit 43, passe à travers le conduit 44 et est mélangé dans un mélan- geur 46 à une base aqueuse diluée possédant,de préférence, une activité tampon et constituée,de préférence,par un
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composé inorganique introduit par le conduit 45.
La présente étape d'extraction a pour but de concen- trer la pénicilline dans une phase aqueuse et de séparer des acides plus faibles de la pénicilline. La solution de base aqueuse force une plus grande partie de pénicilline et d'acides plus forts à s'ioniser que d'acides plus faibles que la pénicilline. Etant donné que les ions et les sels ioniques de ces acides organiques sont plus solubles dans l'eau que dans le solvant, en comparaison des acides nnn dissociés, les premiers sont extraits dans la phase aqueuse. Il en résulte une séparation préliminaire entre les acides plus faibles d'ùne part et la pénicilline et les acides plus forts d'autre part.
Comme bases aqueuses faibles nn peut citer les
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hydroxydes de Ca,Sr,et Ba, 1 bïcariaonates,phosphates,cïtra- tes,tartrates etc. de Na et K. La base aqueuse contient habituellement entre environ 0,2 et 2% en poids du composé alcalin, et la quantité de solution de base aqueuse ajou- tée est ordinairement comprise entie environ 1/5 et 1/50 du volume de l'extrait -solvant S. Cette quantité de base aqueuse devrait être telle qu'elle donne lieu à un extrait aqueux ayant un pH compris entre environ 4,5 et 8,0, ce pH variant comme sl sera décrit 0 plus tard. Le mélange d'exbrait aqueux et de solvant S est alors amené .par un conduit 47 dans un décanteur 48 pour être séparé.
Le solvant est extrait par un conduit spérieur 49 et peut être récupéré, purifié et réintroduit dans l'installation par les conduits 21 et 28. L'extrait aqueux est déchargé par un conduit inférieur 50 et peut à présent être traité suivant deux méthodes différentes, d'après son pH et la pureté que l'on désire obtenir pour la pénicilline. Si le pH est approximativement compris entre 5 et 8, et s'il est, de préférence,supérieur environ 6,2 les acides plus faibles que la pénicilline restants doivent
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être éliminés par extraction dans un- extracteur 55. Mais si le pH est inférieur à 5 l'extrait aqueux peut être amené par le conduit 53 au stade suivant d'extraction (décrit plus tard) pour éliminer les acides plus forts que la pénicilline.
Toutefois il est préférable d'opérer à un pH supérieur à 5 dans le décanteur 48, en vue d'obtenir une meilleure récu- pération de la pénicilline.
Si l'on adopte la méthode préférée, l'extrait aqueux se trouvant dans le conduit 50 est introduit par le conduit
55 53 dans la colonne d'extraction(.dans laquelle les acides plus faibles que la pénicilline restent sont extraits de l'extrait aqueux acidifié par un solvant organique approprié,' S'se dirigeant à contre courant. Le solvant S'qui peut être identique ou différent du solvant S, est introduit (s'il est plus léger que l'extrait aqueux) du voisinage du fond de la colonne par un conduit 56.
Entre ou au voisinage des orifices d'entrée de solvant S'et d'extrait aqueux, on introduit en un ou plusieurs points de la colonne un acide plus fort que la pénicilline, similaire à celui utilisé on au stade d'extraction principale, mats ayant une concentrati comprise environ entre 0,01 et 10% en volume, et de préféren entre o;05 et 5%. Lorsque la capacité tampon dans l'extrait aqueux fourni à la colonne est élevée, l'acide peut être introduit au voisinage ou au niveau de l'orifice d'entrée de l'extrait aqueux par un conduit 51 ou par l'un des conduits supérieurs issus du conduit 59. Mais si la capacité tampon est faible,l'acide fort doit être introduit plus près de l'orifice d'entrée du solvant par l'un des conduits inférieurs issus de 58.
La quantité d'acide fort ajoutée doit être suffisante dans chaque cas pour donner dans la ph phase aqueuse à la base de la colonne,un pH compris entre 3 et 8 et de préférence entre 3,0 et 6,5. L'introduction de cet acide fort dans la colonne produit un pH augmentant graduellement dans l'extracteur 55, ce qui est plus favora-
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ble pour la séparation d'acides lus faibles que la pénicilline que l'accroissement naturel du pH obtenu lorsque tout l'acide est introduit dans la fourniture initiale.
L'extrait solvant S'résultant est déchargé par le conduit supérieur 57 et le solvant S'peut être récupéré, purifié et réintroduit dans la colonne 55 par lu conduit
56. La phase aqueuse ext.raite contens@t encore la pénicilline et les acides plus forts que la pénicilline est extraite par le conduit inférieur 58.
Les rapports solvant S'à fournir dans @@ @@ @@@@tion sont ordinairement compris entre 2:1 et 1:5, bien que des rapports plus élevés ou plus bas puissent être employés.
La figure III est un graphique illustratif expliquant la raison pour laquelle le pH de la solution aqueuse conte- nant la pénicilline et les acides plus faibles que la pénicilline constitue un facteur important dans le procédé.
Dans cette figure, les valeurs du pH sont déterminées par rapport aux logar thems des valeurs K de trois types d'acides.
K -concentration en acide dans, la phase solvent -concentration en acide dans la phase aqueuse
La position des courbes représentées dans le graphique doit être considérée seulement comme approximative, dans un but d'ill @ustration, et peut être déplacée par rapport aux .axes de coordonnées, ces courbes pouvant également occuper d'autres positions l'une par rapport à l'autre pour divers solvants. pour diverses températures, etc...
,-,.tant donné que les acides organiques libres dans la solution aqueuse sont plus solubles dans les solvants organiques que leurs sels ioniques correspondants, et étant donné que des sels sont plus solubles dans l'eau que dans le solvant, un abaissement du pH aura pour résultat un abaissement des valeurs de K. C'est pourquoi, il est important, que le pH de la solution aqueuse soit ajusté, de telle sorte ne que la moyenne partie des acides plus faibles que la pénicillip soit à l'état d'acide libre, tandis que la moyenne partie.
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de la pénicilline et des acides plus forts que la pénicilline sont présents ou restent dans la solution aqueuse sous forme de sesl ioniques.
Ainsi , à un pH inférieur à 1 environ, plus de la moitié de la pénicilline est perdue dans la phase solvant, tandis qu'à un pH supérieur à 6,5 environ, la plu- part des acides forts restent dans la phase aqueuse et ne sont pas séparés. A noter que la séparation doit être entière- ment effectuée d'un côté de la région, où les courbes d'acide faible se rapprochent ou coupent la courbe de pénicilline.
Ainsi pour toutes les concentrations pratiques et raisonnables en pénicilline qui peuvent se rencontrer dans les solutions aqueuses, et pour tous les rapports de solvant à fournir raisonnables, le maintien du pH dans la solution aqueuse à une valeur comprise approximativement entre 4 et 6,5 au sommet de l'extracteur assure une séparation des acides plus faibles que la pénicilline et de la pénicilline.
VI ELILINATION D'ACIDES - PLUS FORTS. n
La phase aqueus-e provenant du fond de la colonne 55 dans le conduit 58, ou la phase extrait aqueux provenant du fond du décanteur 48 dans le conduit 53, suivant le cas , est à présent amenée par le conduit 61 dans l'extracteur de solvant 60. Cette extraction s'effectue à un pH généralement inférieur à celui de l'extraction dans la colonne 55 obtenu par addition d'acide identique à celui utilisé par l'extrac- tion dans la dite colonne 55. Cet acide peut être introduit dans le conduit 61 par le conduit 62 ou dans la colonne 60 par les conduits 63, ou encore par les deux voies men- tionnées ci-avant.
L'extracteur 60 est similaire à l'extracteur 20 au point de vue fonctionnement. La phase aqueuse contenant la pénicilline et les acides plus forts que la pénicilline est aménée à contre courant en contact avec un solvant organique S"approprié, qui peut être identique aux solvants S et S', mais de préférence différent du solvant S. Les deux
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es solvants S" et S' peuvent être employés , s'ils sont différent l'un de l'autre, soit dans le même extracteur (comme reprisent' soit dans des extracteurs séparés. Des extracteurs séparés sont particulièrement à conseiller, si l'un des solvants est plus lourd que l'eau , tandis que l'autre est plus léper que l'eau. Le solvant S" est introduit (s'il est plus lord que la phase aqueuse) par les conduits 64 au voisinage du sommet de la colonne 60.
Au voisinage de la base de la colonne 60, de l'eau est introduite par le conduit 66 pour éliminer par lavage des sels d'acides plus forts .,ue la pénicilline et les autres impuretés qui se dissolvent mieux dans l'eau 'est (c/-à-dire qui ont un meilleur coefficient de répartition vis- à-vis de l'eau). Si on le désire, on peut introduire de 1(acide par un ou plusieurs conduits 65 entre les orifices d'entrée de la phase aqueuse et du solvant, de manière à produire un accroissement graduel de pH, qui est plus favorable à la séparation que la. tendance naturelle d'accroissement du pH dans la colonne. De cette façon , le pH de la phase aqueuse au voisinage de la base de la colonne est compris approximativement entre 3 et 5, tandis que le pH de la phase aqueuse au sommet de la colonne est compris approxima- tivement entre 2,0 et 5,0 .
Si on le désire, l'extracteur 60 de même que l'extracteur 55 mentionné ci-avant,peut comprendre une série de mélangeurs et de décanteurs au lieu d'une colonne. L'eau introduite par le conduit 66 peut contenir entre 0,001% et 1% en poids environ d'un tampon ou d'un hydroxyde ou sel alcalin, tel que mentionné ci-dessus, Le solvant S" extrait la pénicilline acide pour produire un extrait solvant S" qui est déchargé par le conduit de base 67. La phase aqueuse restante contenant les acides plus forts que la pénicilline est extraite par le conduit 65.
V. RECUPERATION & CONCENTRATION.
L'extrait solvant S" provenant de l'extracteur 60 est amené par un conduit 67,soit directement dans un mélangeu
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70, soit d'abord dans un appareil de décoloration 68 conte- nant un adsorbant tel que le charbon de bois. Cet appareil de décoloration peut être une colonne d'asorption ou un mélangeur suivant d'un décanteur, ou une centrifugeuse ou encore un appareil de filtration. Dans le mélangeur 70, l'extrait solvant S" est mélangé à une base aqueuse intro- duite par le conduit 69, la dite base étant pimilaire à celle introduite par le conduit 45 mentionné ci-dessus. Il se forme ainsi un sel de métal alealin de pénicilline et un second extrait aqueux ayant un pH d'environ 7, et de préférence compris entre 6,5 et 6,9. Le mélange est amené par un conduit 71, dans un décanteur 75.
Le solvant S" est extrait par le conduit de base 72 et est,de préférence, purifié , récupéré, et renvoyé dans l'installation . La seconde phase aqueuse contient d'habitude de la pénicilline de très pure en concentration égale 1 50 à 100/fois celle du bouillon introduit dans l'extracteur 20. Le dit extrait est déchargé par un conduit supérieur 73 et peut, si on le désire, être amené à travers un appareil de décoloration 79, similaire à l'appareil de décoloration 68. La solution de pénicilline peut être traitée dans l'un de ces appareils de décoloration ou dans les deux.
Le second extrait aqueux peut à présent être déchargé par le conduit 74, ou bien il peut être amené par un conduit 76 dans une zone d'évaporatior 80, dans laquelle 75 à 95% d'eau en est évaporé aussi rapidement que possible sous un vide absolu d'au moins 10mm. environ de Hg et à une température n'excédant pas 10 C environ.
La solution aqueuse évaporée résultante est prête à l'usage , elle peut être conditionnée (emballée),séchéa ou soumise aux autres traitements souhaitables. pour plus de clarté et de simplicité, les dessins annexés ne représentent pas les pompes auxiliaires, les conduits, les soupapes, les orifices de sortie et d'entrée, les réservoirs, les conduits de chauffage, les conduits
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de refroidissement, les systèmes de récupération de/solvant, les indicateurs de pH et appareils de contrôle de pH..., qui peuvent être nécessaires pour réaliser le procédé, étant donné que l'agencement de ces éléments est évident pour les hommes de métier.
VI. SOLVANTS.
Le solvant organique S et les mélangea SI et S" de ce solvant doivent avoir une densité différente (de préfé- rence une différence d'au moins 10%) de la phase aqueuse avec laquelle ils sont mis en contact. Ce sont des solvants polaires qui ne peuvent réagir avec la pénicilline ou la dé- composer. Ils doivent être liquides et ne peuvent trop visqueux à des températures de l'ordre de-5 C. Pour posséder le degré de polarité voulu, ils doivent être solubles à moins de 5 ' et à plus de 1% dans l'eau 20 C, ils ont, de préfé- rence une solulilité dans l'eau comprise approximativement entre 1% et 2%. Ils doivent être sélectifs visais de la pénicilline et doivent fondre à une température inférieure à-5 C.
Si des quantités substantielles de solvant se dissolvent dans les phases aqueuses du procédé, il est souhaitable que le dit solvant ait une température d'ébul- libition inférieure 100 C, de sorte qu'il puisse faci- lement être récupéré par distillation. Comme solvants or- aniques appropriés on peut citer les formiates, acétates profionates, butyrates, etc...
contenant de 4 à 8 atomes de carbone, tels que l'acétate de n-propyle, l'acétate d'isopropyle, l'acétate de n -butyle, l'acétate d'isobutyle les acétates d'amyle, le choroacétate de propyle ou d'éthyle les lactates @@@@@ contenant de 5 à 10 atomes de carbone, le chloroforme, le bichlorure d'éthylène, le phtalate de diméthys, l'éther diéthylique, l'éther diso- propylique, les méthylpropylcétones, la méthylsobutylcétone l'isop.hDrone etc...
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Il est souhaitable d'Utiliser un solvant de polarité relativement élevée,tel que l'acétate-d'amyle, pour l'extrao. tion principale comme solvant S, tandis que pour les autres extractions par solvant organique il est préférable d'emplo- oyer des solvants à faible polarité mais à forte sélectivité vis-à-vis de la pénicilline. Parmi ces divers solvants l'isobutylcétone convient comme solvant S'et le chloroforme comme solvant S". Le type de solvants S'et S" employé dépend également du milieu dont la pénicilline est extraite.
Des mélanges de méthylisobutylcétone et de chloro- forme sont très efficaces comme solvant S" ou solvant S' ou comme solvant S'et S" pour les diverses formes de pénicilline.
Les essais suivants servent à illustrer le procédé suivant l'invention.
EXEMPLE 1.
Un échantillon de 1, 745 ml d'une solution aqueuse de pénicilline obtenue à partir d'une culture en surface et contenant 36 unites Oxford par ml est acidifié à l'acide sulfurique dilué jusqu'à un pH de 2,5 et introduit au voisinage du centre d'une collnne d'extraction dans laquelle il est extrait à contre uourant par 265 ml de phtalate de diméthyle introduit au voisinage du sommet de la colonne, pour produire une phase aqueuse de rejet extraite du sommet de la colonne, et une phase extrait solvant contenant de la pénicilline qui est lavée au moyen d'une solution tampon de sulfate acide de sodium et de sulfate de sodium ayant un pH de 3,3 avant d'être extraite de la base de la colonne.
L'extrait résultant est alors traité par une solution diluée de bicarbonate de sodium aqueux pour produire une solution ayant un pH de 6,6 et contenant le sel sodique de la pénicilline'.
Cette solution aqueuse est évaporée sous vide jusqu'à
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siécité et révèle, après analyse, une concentration en pénicilline de 50 unités Oxford par mg.
EXEMPLE 2.
Un échantillon de 11,800 ml d'un bouillon filtré de pénicilline ayant un pH de 7,5, obtenu à partir d'une culture submergée et contenant 64 unités Oxford par ml, est acidifié à l'aide d'une solution à 6% d'acide sulfurique jusqu'à un pH de 2,5. Laéolution acidifiée est extraite à contre courant dans une série de mélangeurs et de centrifugeuses par un volume à peu près égal d'acétate d'amyle, pour produire un raffinat aqueux de rejet qui contient, à l'analyse, 7,7% de pénicilline et un extrait solvant qui contient à l'analyse 93% de pénicilline. L'extrai t solvant est d'abord lavé à l'aide de 2,210 ml d'eau distillée et la phase aqueuse de rejet contient, à l'analyse 15,5% de la pénicilline. Ensuite, l'extrait lavé est traité par une solution aqueuse de bicarbonate sodique jusqu'à un pH de 6,8.
La phase aqueuse résultante est évaporée sous vide pour produire le sel sodique sec de la pénicilline qui contient, à l'analyse, 135 unités Oxford par mg.
EXEMPLE 3.
Un échantillon de 2,800 ml de bouillon filtré de pénicilline ayant un pH de 7,5 obtenu à partir d'une culture en surface contenant 81 untités Oxford par ml, est acidifié jusqu'à un pH de 2,1 à l'aide d'une solution à 6% d'acide sulfurique . La solution acidifiée est intro- duite près du centre d'une cellnne à extraction, et extraite à contre courent par une oitié environ de son volume de phtalate de diméthyle introduite près du sommet de la colonne. Elle est ensuite lavée à l'aide de 567ml d'eau distillée introduite près de la base de la colonne, pour produire un raffinat aqueux de rejet que l'on extrait du sommet de la colonne et un extrait solvant que l'on extrait
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mx%-9d de la colonne R %12XÜ:!mf.ü 5txdxxa de la colonne.
Le raffinat aqueux contient à l'analyse, 19,8 % de la pénicilline du bouillon de départ et l'extrait solvant en contient 85,6%. L'extrait est alors traité par une solution aqueuse de bicarbonate sodique pour former une solution saline ayant un pH de 6,8. Cette solu- tion est évaporée sous vide pour donner le sel sodique sec de pénicilline qui contient, à l'analyse, 179 unités Oxford par mg. En comparant la concentration en pénicilline- dans le produit sec à la quantité de pénicilline calculée présente dans les solides dissous dans le bouillon de départ; (2,7 unités par mg), on constate que la concentration en pénicilline a augmenté environ de 67 fois grâce à l'extrac- tion.
EXEMPLE 4.
Un échantillon de 755 ml de bouillon de péni- cilline, obtehu au départ d'une culture en surface contenant 69 unités Oxford par ml, est acidifié à l'aide d'acide sulfurique dilué jusqu'à un pH de 2,1 et est extrait à contrcourant dans une colonne à extraction à l'aide de 380ml de phtalate dediméthyle pour produire une phase aqueuse de rebut et une phase extrait solvant contenant de la pénicilline. L'extrait solvant est lavé à l'aide d'une solution aqueuse de bicarbonate sodique pour produire une solution aqueuse ayant un pH de 6,2 et contenant le sel sodique de la pénicilline. Cette solu- tion est évaporée sous vide, séchée, et analysée. Elle contient 320 unités Oxford par mg.
EXEMPLE 5
Un échantillon de 1, 150 ml d'une solution aqueuse de pénicilline, obtenue au départ d'une culture en suface ayant un pH de 6,9 et contenant 149 unités /d/o xford par ml, ce qui correspond par calcul à 149 unités Oxford par mg de solide dissous, est acidifiée à l'aide d'acide sulfu-
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rique dilué aqueux jusqu'à un pH de ,95.
La solution acidifiée est extraite à contre-courant dans une colonne à. extraction avec environ 1/2fois son volume de méthyliso- butylcétone pour produire un extrait solvant contenant les acides plus faibles que la pénicilline ( cet extrait contient à l' analyse, environ 7,6 de la pénicilline dedépart) et une solution aqueuse ayant un pH de 5,9 et contenant, à 1!analyse, 152 mg de solides dissous dont la concentration en pénicilline est de 26 unités Oxford par Cette solu- tion aqueuse est à nouveau acidifiée à l'aide d'acide sulfurique dilué jusqu'à un pH de 2,3, introduite près du centre d'une colonne d'extraction , et extraite contre-courant par 1,
150ml d'un mélange à parties égales de chloroforme et de méthylisobutylcétone introduit au voisinage du sommet de la colonne. Elle est ensuite lavée' à l'aide de 575 ml d'eau distillée introduite près de le base de la dite colonne, pour produire une phase raffinât de rebut contenant les acides plus forts que la pénicilline et environ 5-1/2 % de la pénicilline et une phase extrait solvant contenant environ 99% de la pénicilline du mélange de départ. La phase extrait est traitée par 65 mg de bicarbonate sodique en solution aqueuse diluée pour produire une solution saline ayant un pH de 7,1. La solution saline est évaporée sous vide pour donner 580 [le; de sel sodique sec de pénicilline contenant 550 unités Oxford de pénicilline par mg.
L'échantillon de départ contenant , d'après les calculs, 1,840 mg de solides dissous contenant 149 unités Oxford de pénicilline par mg. Ainsi si 152 mg de solides dissous n'étaient pas éliminés dans le solvant pour acides plus faibles que la pénicilline, l'entièreté de ces solides dissous subsisterait dans le produit séché final, diminuant ainsi sa concentration en pénicilline de 550 unités Oxford par mg jusqu'à environ 442 unités Oxford par mg. Ceci montre l'avante qu'on
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@@@@@ a de se servir d'une colonne d'extraction pour éliminer les acides plus faibles que la pénicilline.
EXEMPLE 6.
Un échantillon de 1,590 ml de solution aqueuse de pénicilline , obtenu à partir d'une culture en surface ayant une concentration en pénicilline de 64 unités Oxford par ml, est acidifié à l'aide d'acide sulfurique dilué jusqu'à un pH de 5,5 et extrait à contre-oourant dans une colonne à extraction à l'aide de 440 ml de chloroforme pour produire une phase solvant de rebut contenant les acides plus faibles que la pénicilline (qui contient à l'analyse, 50 mg de solides dissous et 0,3% de la péni- cilline de départ) et une phase aqueuse contenant la pénicilline. (La phase solvant de rebut est analysée en la traitant par une solution diluée de bicarbonate sodique pour obtenir une phase aqueuse ayant un pH de 6,6, et en évaporant ensuite la dite phase aqueuse sous vide jusqu'à siccité).
La phase aqueuse contenant la pénicilline est acidifiée à l'aide d'acide sulfurique dilué jusqu'à un pH de 2,2 et introduite près du centre d'une colonne à extraction. Elle est alors extraite à contre courant par 563 ml de chloroforme introduit p.rès du sommet de la colonne, et lavée àvec 170 ml d'eau distillée introduite à la base de la colonne pour produire un raffinat aqueux contenant les acides plus forts que la pénicilline et un extrait solvant contenant la pénicilline. L'extrait solvant est traité avec environ 1/5 de son volume d'une solution aqueuse diluée de bicarbonate sodique jusqu'à un pH de 6,5 et ensuite évaporé sous vide pour produire 106 mg de sel
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sodique* sec de pércilline contenant 308 unités Oxford de pénicilline par mg.
Si la solution aqueuse de départ de pénicilline n'avait pas été traitée au chloroforme pour élimher les acides plus faibles que la pénicilline
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et 58 grammes de solides dissous, le produit séché restant
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aurait contenu,en substance,ltentièreté de ces solides ce qui aurait fait diminuer la concentration en pénicilline de 308 à 205 unités Oxford par mg .
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R.TkïiDTC ,TIF,lis.
1. Procédé de séparation de pénicilline d'acides ayant des constantes de dissociation différentes en solution qqueuse,caractérisé en ce qu'on acidifie la dite solution à l'aide d'acide sulfurique et en ce qu'on extrait la pénicilline à l'aide d'un solvant organique.
Procédé pour purifier la pénicilline- dans une solution aqueuse la contenant et contenant des acides organiques plus faibles que la pénicilline, caractérisé en ce qu'on paintient dans ladite solution un pH approxi- mativement compris entre 7,5 et 8,0 tandis qu'on introduit ladite solution dans une zone d'extraction, en ce qu'on amè- ne ladite solution dans ladite zone en contact avec un solvant organique sélectif pour les acides libres plus faibles que la/pénicilline de manière à produire deux phases,/en ce qu'on sépare les deux phases l'une de l'autre
3.
Procédé pour purifier la pénicilline à partir d'une solution .caractérisé en ce qu'on extrait ladite pénicilline de ladite solution à l'aide d'une bas e aqueuse de manière à produire une solution aqueuse contenant la pénicilline, en ce qu'on acidifie ladite solution aqueuse jusqu'à
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un pH compris approxi.r tivenent entre -.,5 et 8, en ce qu'on amène la solution aqueuse acidifiée en contact avec un solvant organique sélectif pour éliminer les acides plus faibles que la pénicilline et pour produire deux phases, et en ce qu'on sépare les dites phases l'une de l'autre .