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Procédé de fractionnement de protéines et produits ainsi obtenus.
La présente invention est relative au fractionnement d'un mélange de protéines et a pour objet de fournir des procédés améliorés pour cette opération ainsi que de nou- veaux produits à base de protéine.
Une grande diversité de protéines très utiles sont conte- nues, par exemple, dans le sang. Certaines de ces protéi- nes se trouvent dans les globules rouges du sang, d'autres existent en solution dans le plasma ou sérum . La présente invention a pour but la séparation des protéines contenues dans le sang ou dàns d'autres extraits fluides anm aux ou
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végétaux, comme le lait, l'extrait de foie, l'extrait de grains, etc.
L'invention a pour objet un procédé de fractionne- ment de protéines, contenant les opérations de séparation d'une ou plusieurs protéines à partir d'un mélange ou d'une masse de protéines, en mettant le dit mélange en contact avec un solvant liquide et en réglant la concen- tration en ions hydrogènes, la température, la puissance ionique et la concentration de l'agent de précipitation or- ganique dans cette solution, de sorte que, grâce aux diffé- rences de solubilité des protéines constituant le mélange ou la masse dans les conditions déterminées spécifiées ci- avant, la protéine désirée soit séparée des autres protéi- nes du mélange.
On peut précipiter successivement différentes fractions de protéines, par exemple à partir du sérum ou plasma hu- main ou animal, par addition à celui-ci de quantités varia- bles de sels neutres comme des phosphates et des sulfates, de molécules organiques comme l'éthanol ou un autre agent de précipitation , comme le méthanol, le butanol, l'acétone, un élément de la série du glycol, du dioxane, etc ou par addition d'un mélange d'agents de précipitation tels que des alcools et des sels ou des alcools et des éthers. Un fractionnement ultérieur peut être obtenu en faisant Varier la température, la c une entrât ion en ions, hydrogènes et/ou la concentration ou la nature du sel en présence.
Le plasma peut être obtenu en séparant tout d'abord les globules du sang par centrifugation ou par sédimenta- tion, la coagulation du fibrinogène étant empêchée par l'addition de citrates' ou d'agents analogues .
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Les fractions de protéines précipitées peuvent,par exemple, comprendre en majeure partie du fibrinogène, de la globuline ou de l'albumine ou des mélanges. de ces produits, suivant le choix de la combinaison des fac- teurs affectant la solubilité des protéines.
Le fibrinogène se sépare facilement du plasma si l'on y ajoute un alcool ou un ,autre agent de précipitation par un tube capillaire ou si le plasma est réparti dans l'alcool, des précautions étant prises pour réaliser un mélange intime et instantané, dans des conditions telles que la décomposition de la protéine soit maintenue à un minimum.
Le fibrinogène provenant du plasma humain se coa- gule lorsqu'on lui ajoute les autres agents de coagulation du sang et peut dès lors être employé comme agent théra- peutique . -Le fibrinogène donne également des matières plastiques thermodurcissables dont les propriétés sont dé- crites en détail dans la demande de brevet belge dé-
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posée le et d,0c,. / ( sous le nu 3 z . i X4
Les globulines sont plus labiles que les albumines,et certaines propriétés de quelques unes d'entre elles,par exemple,celles des xxxx serums normaux conservés ou celles des serums de convalescents ne seconservent en général pas à moins que les précautions les plus grandes ne soient prises dans leur purification.
Ainsi une globuline la prothrombine, qui constitue un facteur intervenant dans le phénomène de coagulation défini ci-dessus, ne s'avère stable que lorsqu'elle est précipitée en prenant des pré- cautions particulières , d'autres constituants de globuli- ne , tels que ceux de complément , étant même encore plus labiles.
Les protéines albuminiques sont particulièrement
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intéressantes, notamment dans le traitement de choc chez les humains par injection intraveineuse de solutions d'al- bumine .
L'albumine du sérum sanguin est isoélectrique vers pH 4,8 , ceci étant du moins vrai pour l'albumine du sérum ou plasma humain chevalin et bovin . Comme lepH du sang se maintient vers 7,4, les albumines y sont loin de leur point isoélectrique, et elles sont combinées avec plus d'éléments basiques par gramme que les globulines . Elles ont dès lors une plus grande mobilité électrophorétique que ces dernières même lorsqu'elles sont de même poids moléculaire . Le poids moléculaire de la plupart des albu- mines est voisin de 70.000 , soit à peu près la moitié de celui de la plupart des globulines, ceci donnant égale- ment des mobilités électrophorétiques plus grandes, de même que des pressions osmotiques plus grande par gramme de protéine .
Bien que les albumines aient , en réactions neutres,une charge propre par gramme, plus grande que les globulines, de même qu'un plus grand nombre de groupes chargés, à l'état isoélectrique, ces groupes sont disposés beaucoup plus symétriquement . 11 en résulte que les albu- mines ont des moments électriques plus petits que ceux des globulines, ces moments sont en fait plus petits que ceux de la plupart si pas de toutes les autres protéines.
Les conditions à choisir pour le fractionnement dé- pendent des solubilités des divers constituants protéini- ques des système et sont déterminées par les cinq variables suivantes : température, pH, puissance ionique, concentra- tion de l'agent de précipitation et concentration- des cons- tituants protéiniques . Ce dernier facteur est de la plus grande importance lorsque la concentration des diverses
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protéines du système est élevée et son importance dirai- nue dans les solutions , de protéines diluées. ues effets de la concentration en protéine empêchent souvent la déna- turation des protéines Labiles .
Les quatre autres varia- bles sont importantes dans tous les cas et doivent tou- jours être contrôlées si l'on veut effectuer dans des systèmes protéiniques des séparations pouvant être répétées.
Dans les solutions de protéines suffisamment diluées,ils suffisent à eux seuls à définir les séparations . Dans les solutions concentrées, l'effet d'une protéine sur une autre, dû à la formation de sel ou à l'interaction entre ions bipolaires; n'aura qu'une influence secondaire sur les séparations. Dans le cas d'e la formation de sel,il peut en résulter soit une augmentation soit une diminution de la sobulitit.. Dans le cas d'interactions entre protéi- nes comme ions bàpolaires au voisinage de leurs points isoélectriques, l'influence d'une protéine sur l'autre dé- pend des moments électriques des protéines et aura un effet additionnel comparable à celui dela puissance ionique des électrolytes.
Les conditions pour la précipitation successive de protéines doivent être chosies de façon à faire alterner la précipitation de la fractiop pure la plus large possi- ble avec celle d'une fraction impure la plus étroite possible. L'application de ce principe donne des rende- ments maxima en protéines pures .
Les rapports en volume donnés ci-après pour l'éthanol sont ceux des mélanges à 25 C. Le pH et la puissance ionique dans les mélanges éthanol-eau sont ceux qui se- raient obtenus si les sels dissous dans de l'eau pure à 25 C avaient la même concentration . Cette convention est employée étant donné l'imprécision existant dans tou-
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tes les définitions de ces quantités dans les mélanges éthanol-eau . Le pH des fractions protéiniques voulues est celui mesuré avec une électrode de verre pour des solutions aqueuses d'une concentration d'environ 1% en protéine .
Les séparations réalisées ne sont pas empiriquement déterminées mais ont été effectuées à l'side d'un ultra- centrifugeuse pour révéler la dimension et avec l'aide de mesures d'électrophorèse pour enregistrer la charge des par- ticules de protéine, de faon à obtenir des produits sensi- blement homogènes pour ce qui est de leur dimension et de leur charge propre.
Le fibrinogène est d'abord précipité du plasma au moyen d'éthanol comme aent de précipitation à une concen- tration en volume de 10 %, en milieu neutre, la température étant inférieure à 0 C et voisine du point de congélation de la solution (-3 C)
Les globulines gamma, ainsi dénommées à cause de leur mobilité électrophorétique caractéristique, sont sépa- rées en augmentant la concentration de l'éthanol jusqu'à 25 %, la température étant abaissée à -5 C.
Les globulines alpha et bêta sont ensuite séparées en amenant le pH à 5,5-6,0 et la concentration de l'alcool à 40 % en volume, la température étant maintenue à -5 C.
L'albumine restant , dans ces condiqions en solution dans le sérum u plasma est précipitée en grande partie à un pli de 4,4 - 4,8 ou par abaissement de la température à -15 C. On a préparé de l'albumine, ant humaine que bovine , par cette méthode et le produit est pur tant à l'analyse par électrophorèse qu'à l'analyse par ultracentri- fugation. Il n'y a pratiquement aucune limite à la quantité d'albumine qui peut facilement être obtenue .
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Cette méthode de fractionnement à. basse température et en milieu alcool-eau donne de l'albumine bovine cris- talline, alors que les méthodes anciennes ne pouvaient le réaliser . Cette cristallisation peut même être obte- ou nue à partir de plasma contaminé/à partir de plasma hémo- lysé . Une albumine pure peut donc être obtenue méme à par- tir de sources contaminées.
Pour certains usages, il peut être avantageux de sépa- rer simultanément diverses protéines du plasma . Ainsi avec de l'éthanol à 25 % , à une température de -5 C, sans ajustement du pH , le fibrinogène et les globulines gamma précipitent ensemble .Le produit protéinique ainsi obtenu peut être employé pour la fabrication de composés plasti- ques.
La solubilité de chaque protéine, dans le plasma humain ou animal, sera minimum aux environs de son point isoélectrique . La séparation des globulines ou de la casé) ne de l'eau, par addition d'une quantité'd'acide ou de base suffisante pour amener la protéine à son point iso- électrique, démontre l'importance du pH.
-De nombreuses protéines , notamment des albumines, sont solubles dans l'eau même à leur point dsoélectri- que . Ces dernières peuvent être précipitées, soit près de leurs points isoélectriques soit dans un intervalle de pH pas' trop éloigné de leurs points isoélectriques, préci- pitation au moyen d'un sel ou par addition d'un agent de précipitation organique, tel que l'éthanol , l'acétone, le méthanol, lebutanol, ledioxane, un élément approprié de la série du glycol etc. La quantité nécessaire d'un tel agent de précipitation est en général minimum, au point isoélectrique de la protéine ou au voisinage de celui-ci.
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Plus la température est basse, plus les solvants organi- ques auront en général un pouvoir précipitant élevé. Des sels neutres suffisamment concentrés, comme des phosphates et des sulfates, ont souvent l'effet inverse , la solubili- té de la protéine décroissant avec l'augmentation de tempé- ratur e.
Dans le cas de sels neutres , une partie de l'action précipitante est comparable à celle de la molécule organi- que, uais une autre partie a pour effet de provoquer une augmentation de la solubilité par accroissement de la concentration en ions (puissance ionique) . Ceci est dû à la puissance ionique qui doit également être prise en considération comme variable importante lorsqu'on emploie des solvants organiques comme agents de précipitation de protéine .
Ainsi pour séparer les albumines des globulines de plasma , il est nécessaire de contrôler non seulement la concentration des protéines et du solvant organique mais également la température, le pH et la puissance ioni- que, si l'on veut obtenir une séparation satisfaisante et la cristallisation effective de l'albumine . une méthode appropriée pour contrôler à la fois le pH et la puissance ionique par le même réactif, consiste à utiliser des solutions tampons . Ainsi des solutions tam- pons de phosphate ou d'acétate, d'un pH, et d'une puissan- ce ionique déterminés, ont été employées dans ce but dans diverses conditions ,
L'influence des quatre variables définies ci-dessus peut êtreillustrée comme suit :
(1) Si la concentration en alcool de la solution de plasma est amenée à 40 % en volume, à température ambiante, la fibrinogène et les globulines gamma sont précipités et
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en partie dénaturés, mais les globulines alpha et bêta et l'albumine ne sont pas précipitées complètement du plasma.
(2) Un abaissement de la température à -5 C diminue très sensiblement la dénaturation, augmente la précipitation des globulines, mais ne précipite pas encore complètement les globulines alpha et bêta, dont les points isoélectriques se trouvent entre les pH a et 6.
(3) Si la concentration en alcool est augmentée ou si la température est abaissée, ou si ces deux facteurs res- tant constants, et si le pH est changé par addition d'acide ou d'un tampon et est amené au voisinage de 5,5 , la précipitation de grandes parties des globulines alpha et bêta est réalisée.
(4) L'intensité de cette précipitation dépend toute- fois encore de la, puissance ionique, une augmentation de celle-ci augmentant la solubilité , non seulement des globuli- nes mais également de l'albumine . L'importance de cette action est différente pour les globulineset l'albumine, et comme les globulines sont beaucoup moins solubles dans de l'éthanol à 40 %, dans cet intervallede pH, une puissan- ce ionique de 0,05 peut être employée pour augmenter suffi- samment la solubilité de l'albumine sans accroître la solu- bilité de la globuline au point de rendre la séparation non satisfa i sante.
Dans ces conditions de pH, de concentration en alcool, de puissance ionique et de température, l'albumine est suffi- samment soluble pour être extraite quasi quant'itativement du précipité si ces protéines sont présentes à une concentra- tion d'environ un quart de celle qu'elles dut dans le plasma originel . Ainsi la concentration en albumine est d'environ 10 gr/litre, tandis que celle de la globuline soluble dans les marnes conditions n'excède jamais un demi gramme/litre et est même souvent abaissée à moins de 0,10 gr. si la sépa-
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ration est réalisée soigneusement.
Comme autre exemple de l'influence du pH aour une puissance ionique constante, on .peut précipiter l'albumine, à puissance ionique constante, en amenant le pH près du point isoélectrique de l'albumine, c'est-à-dire à une va- leur de pH 4,7, la température et la concentration en al- coul restant constantes.
En vue de ne pas soumettre l'albumine à l'action d'un excès d'acide même localement, on achève la dite précipi- tation en ajoutant un tampon d'acétate d'un pH de 4-,2,la puissance ionique passant de 0,05 à 0,06 tandis que le pH passe de 0,0 à 4,7.
En aj outantdes quantités croissontes d'alcool et en faisant varier la température pour obtenir la précipita- tion, de fractions successives de protéines, la tempéra- ture et le pourcentage d'alcool peuvent être choisis de façon que la température employée soit juste supérieure au point de congélation de la solution pour le pourcenta- ge d'alcool présent.
donne
La fraction fibrinogène,/après redissolution une solution présentant le phénomène de double réfraction de la lumière .Le fibrigonèe est constitué de molécules, qui se déposent à l'ultracentrifugation dans du chlorure de potassium u,2 molaire avec une constante de vitesse de 7,0 à 7,9 x 10-13, qui se déplacent dans l'appareil à élec- trophorèse à 0 C dans une solution tampon de phosphate de puissance ionique de 0,2 et d'un pH de 7,7 avec une mobilité de 1,8 à 2,3 x 10-5 Ces molécules de fibrino- gène se présentent sous forme de bâtonnets donnant ainsi des solutions très visqueuses . Ce produit a la propriété de se coaguler pour former le caillot,,caractéristique du sang, en présence de calcium et de prothrombine.
La prothrombine est une autre protéine produite par le frac-
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tionnement du plasma sanguin.
Une faction de globuline a la propriété de se poly- mériser pour former desaggrégate de poids moléculaire varia- ble . Cette protéine possède généralement une constante de sédimentation à l'ultracentrifugation d'environ s 18 x 10-13 ou s = 12 x 10-13 et ses molécules se présentent également sous la forme de bâtonnets et provo- quent la double réfraction de la lumière.
Bien que les protéines qui se séparent d'une solution d'éthanol à 15 % lorsque la température est abaissée de 0 à-5 C et bien que le précipité suivant qui se sépare lorsque la concentration en éthanol est portée à 20 % ou 22 % , la température restant -5 C, comprennent un certain nombre d'éléments chimiques différents, certains ayant un point isoélectrique d'environ 7, d'autres ayant des points isoélectriques plus acides, certains près de 6, certains étant des euglobulines et d'autres des pseudo- globulines, la fraction est dans son ensemble très unifor- me en ce qui concerne la mobilité électropuor étique. mesu- rée dans une solution-tampon de phosphate d'une puissance ionique de 0,2 àt d'un pH de 7,7 , la constante de mobilité ayant une valeur de 0,8 à 2,2 x 10-5 cm2/ ou à 0 C.
La di- mension des molécules de cette fraction est également cons- tante , à l'exception d'une petite quantité de composé de poids moléculaire élevé, ayant une constante de sédimen- tation de 12 o u IX 18 x 10-13,la constante de sédimenta- tion de tout le reste de la fraction étant d'environ 5,9 à 6,7 x 10-13 dans une solution u, molaire de chlorure de potassium . Cette fraction soluble dans des solutions de sels mais pouvant être en grande partie précipitée et séparée en ses divers constituants par dialyse à pH varia- ble, a été obtenue sous-forme d'un abondant précipité,blanc,
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inodore . Il est moins soluble et plus visqueux que les fractions albuminoques et possède une très faible charge électrique propre, .
Contrairement aux fractions de protéi- ne formées de molécules asymétriques et degrande viscois- té qui sont précipitées en solution neutre au moyen de faibles concentrations d'éthanol dans l'eau, la fvaction qui se sépare en milieu acide (pH 5 environ) d'une solution d'éthanol à 40 % et à -5 C consiste presqu'entièrement en albumines dont la constante de sédimentation, eh solu- tion 0,2 molaire , de chlorure de potassium est de 4,0 à 4,4 x 10-13 et dont la mobilité électrophorétique est de 4,7 à 6,0 x 10-5, à 0 C dans une solution -tampon de phosphate de puissance ionique 0,2 et de pH 7,7. Ces molé- cules étant beaucoup plus sphériques et beaucoup plus solubles, se dissolvent rapidement dans l'eau pour former une solution à 20% de faible viscosité.
Suivant un autreprocédé, on peut obtenir l'une ou l'autre fraction de protéine ou groupe de fractions protéinique par extraction à partir d'un mélange solide.
Ainsi, on peut utiliser l'un ou l'autre mélange solide de ces protéines, obtenu par l'un ou l'autre des procédés décrits précédemment d'une autre manière . On peut alors la fraction obtenir/albuminique , par exemple, à partir de ce plasma solide par extractions dans des conditions telles que seules les albumines soient solubles ,les autres protéines étant insolubles dans des conditio:.s telles que les protéi- nes qui restent non dissoutes ne soient pas dénaturées et puissent être extraites ultérieurement et fractionnées.
L'albumine peut ensuite être séparée en traitant la solu- tion d'albumine d'une manière analogue à celle décrite précédemment.
L'ensemble des conditions d'équilibre dans lesquelles
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on réalise l'extraction de l'une ou l'autre fraction choisie à partir du mélange solide , peut être déterminé à volonté en choisissant un pH, une température, une puissance ioni- que et une concentration en alcool convenable . La solution ainsi obtenue peut être traitée de la façon décrite précédem- ment en vue d'un fractionnement ultérieur.
De plus, on peut effectuer des extractions successives en partant d'un mélange sec de protéines, par différents solvants et à des températures et dans des conditions ioni- ques et depH d iff érentes. certains agents précipitant les protéines , comme l'al- cool, ont tendance à altérer de nombreuses protéines avec lesquelles ils viennent en contact. Ce danger d'altération augmentant avec la concentration en alcool et l'accroisse- ment de température . Pour beaucoup de protéines on a jugé nécessaire de prendre de nombreuses précautions pour mé- langer l'agent de précipitation avec le plasma, ou avec une autre solution deprotéines , dans le but d'éviter l'altéra- tion de celles-ci.
Pour ces protéines, on peut employer des procédés dans lesquels l'agent de précipitation (par exemple l'éthanol) est ajouté par diffusion à travers une membrane semi-perméable. La cellophane est une matière convenable pouvant être employée pour une telle membrane, tout en maintenant le plasma à une température faible,par exemple 0 C, on peut suspendre dans celui-ci un sac en cello phanecontenant une solution d'éthanol ou d'autres p roduits, dont/est question ci-dessus .
Si on suppose que la première fraction de protéine doit se séparer à une concentration en éthanol de 10 %, la quantité d'éthanol en solution dans la poche semi-perméable devra être calculée, en tenant compte du volume total- de liquidetant à l'intérieur qu'à
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l'extérieur de la membrane, de faon qu'au moment où l'équilibre est atteint, le plasma contienne exactement 10 % d'alcool. il est souvent utile de refroidir préalablement l'al- cool, ou autre réactif, en-dessous dela températuredu plasma, de façon qu'à l'équilibre la température du mélange soit proche du point de congélation . Ceci consti- tue une précaution supplémentaire contre l'altération des protéines.
Au lieu de placer l'agent de précipitation à l'intérieur de la membrane semi-perméaole et de suspendre celle-ci dans le plasma, on ¯: eu mettre le plasma dans la membrane et suspendre celle-ci dans un bain d'agent de pré- cipitation . vans leseux cas il est à conseiller et il est même généralement nécessaire d'agiter le plasma . Si le plasma est placé à l'intérieur de la membrane il est également recommandé d'agiter le bain et de faire circu- ler l'agent de précipitation par une pompe. Il est néces- saire d'agiter pour empêcher une trop grande concentra- tion d'agent de précipitation à la surface de séparation entrele plasma et l'agent de précipitation.
Les méthodes comprenant l'emploi d'une membrane semi-perméable sont utiles non seulement pour l'addition d'agent de précipitation ;nais également pour l'addition de l'un ou l'autre réactif utilisé pour modifier ou puri- fier des protéines , si ce réactif risque d'altérer celles- ci . On peut ajouter, travers une membrane semi-per- méable/sans provoquer 1 altérationdes protéines par exem- ple, des chlorures ou des anhydrides acides, qui se combi- nent avec les groupes hydroxylesaminés et phényles des protéines, l'iode qui forme des protéines iodées ou la pyridine ou d'autreh bases qui agissait sur lesprotéines et tendent à provoquer des altérations.
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Un appareillage convenable comportant des écrans en cellophane séparent le plasma de l'agent de précipitation s'avère commode pour une production commerciale . Le plasma et l'agent de précipitation peuvent circuler à travers un tel appareil selon le principe du contre courant.
Au lieu de cellophane on peut employer comme membrane semi-perméable , des boyaux de porcs ou de collodion ou des produits semblables etc. Toutefois le collodion ne peut être employé lorsque l'agent de précipitation est un alcool parce qu'il est soluble dans celui-ci.
On a constaté que certaines protéines , résistent ce- beaucoup pendant/mieux à l'altération par l'alcool.Par exemple,les albumines possèdent comme il a été dit cette propriété.
Lorsque le produit que l'on désire est de cette nature,il est possible d'employer des procédés qui ne conviendraient pas pour la production d'autres protéines moins stables comme, par exemple, certaines globulines. L'agent de préci- pitation (par exemple l'éthanol) peut dans le cas de protéi- nes plus stables, comme l'albumine et le fibrinogène, être ajouté directement à la solution sans employer de membrane semi-perméable, En fait il est même possible de purifier l'albumine de certaines impuretés , comme de certaines globu- lines, en permettant à ces globulines de s'altérer dans une solution d'éthanol à 15 à 20 % à un pH de 4,8 et à températu- re comprise entre 0 C et la température ambiante, et en sépa- rant le précipité formé par bas protéines altérées, laissant ainsi en solution l'albumine purifiée.
Cette albumine peut être précipitée saus forme cristalline dans des conditions adéquates, .comme il sera dit plus loin.
Lorsque la stabilité de la protéine que l'on veut obte- nir permet l'addition d'alcool sans employer une membrane semi-perméable, on peut utiliser un certain nombre de procédés
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pour faire cette addition. Ainsi le fibrinogène a été précipité du plasma en versant le plasma dans une solution éthanol-eau ou en faisant l'opération inverse. Un raccord en T a également été employé pour faire le mélange , 'en ame- nant la solution éthanol-eau par une extrémité supérieure du T et le plasma par l'autre extrémité supérieure . Les deux solutions sont intimement mélangées dans ce tube xx et pas- sent ensemble par la partie verticale ou âme du T.
L'al- cool a également été ajouté par injection de mélanges étha- nol-eau ou dans certains cas d'éthanol pur à travers un tube de faible diamètre (dimension capillaire ou plus gran- de) ou à travers une plaque de verre percée de petits, trous, dans la solution de protéine , celle-ci étant agitée pendant l'opération.
Les précàutions nécessaires pour prévenir l'altéra- ent tion dépend/dans tous ces cas de la stabilité de la protéi- ne ou des protéines que l'on veut obtenir. Les protéines très altérables ou très labiles peuvent être obtenues à l'état non dénaturé si l'on évite soigneusement tout ex- cès local de concentrations en alcool. Le degré d'altéra- tion. des protéines par excès local d'alcool augmente for- tement si la température augmente.
La méthode employée paur ajouter l'agent de précipita- tion à la protéine de même que la nature de celle-ci détermi- nent le degré j'altération et l'état de division du précipi- té, ce dernier facteur a une grande importance dans la pro- duction de protéines à l'échelle commerciale.
La stabilité de l'albumine est tellequ'on a jugé qu'il était possible d'ajouter la solution tampon, dans la plupart des procédés susdits, à. travers un capillaire tout en agi- tant, sans recourir à l'emploi d'une membrane semi-pérrueable.
Comme les précipités de protéines tendent à êtresoit fine-
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ment divisés soit collants, le problème se pose d'obtenir un précipité pouvant être facilement recueilli . Ene addi- tion rapide d'agent de précipitation, par les méthodes dé- crites ci-dessus ou par des méthodes semblables ou même en versant directement l'agent de précipitation dans la solu- tion d'albumine, produit un précipité moins fin et donc plus facile à manipuler.
Les protéines précipitées peuvent être xx séchées en congelant le précipité mouillé, par exemple au moyen d'air liquide ou d'anhydride carbonique solide, et en soumettant la masse congelée au vide de façon que le solvant s'évapore.
La protéine est ainsi obtenue sous forme de poudre sèche.
Toutefois étant donné la stabilité relativement plus grande de l'albumine on a constaté qu'il était possible de sécher celle-ci, demême que d'autres protéines stables,par le vide à température ordinaire ou en faisant passer des gaz xxxx secs au-dessus du précipité ou en extrayant l'eau par un solvant organique suivant les méthodes classiques.
Le précipité d'albumine se présente sous la forme d'une poudre blanche , sans éléments réducteurs. Lorsqu'il est suffisamment purifié, ce précipité se dissout facile- ment dans l'eau en donnant des solutions claires même à des concentrations de 70 % en protéine, c'est-à-dire 70 grammes dans 100 oc. Il semble être complètement miscibleà l' eau.
Aucun précipité n'apparaît en solution concentrée même après un temps considérable . Ainsi des solutions à 25 % ont été maintenues à 37 C pendant plus de deux mois et à 45 C pendant plus d'un moins sans se troubler.
Des solutions d'albumine humaine, qui avaient été maintenues dans ces conditions pendant les temps ci-des- sus, ont été injectées à un être humain comme sérum de transfusion sans provoquer aucune réaction interne. L'albu-
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mine purifiée de cette façon s'est révélée stable pendant un temps considérable même en solution dans l'éthanol à 20 % à. température ordinaire .
En réalité, l'albumine possède une stabilité telle qu'au lieu de la concentrer par précipitation, isoélectri- que à partir d'éthanol à 40 %, on peut la concentrer par distillation sous vide à basse température dans des con- ditions pour lesquelles les glopulines seraient altérées.
Cette découverte inattendue de la stabilité de l'albumine à même en solution éthanol-eau à température supérieure 0 C a permis de simplifier les méthodes de purification et de concentra.tion de l'albumine .
L'albumine du serum bovin purifiée par le procédé suivant l'invention, qui se base sur le fait que la stabili- té de l'albumine est plus grande que celle des globulines, peut même être cristallisée dans certaines conditions.
On peut faire cristalliser l'albumine qui a été précipitée, en la redissolvant dans de l'éthanol à 40 %, à 0 C, à un pH de 5,5 - 6,0 , et en employant une puissance ionique plus grande que celle qui a été employée précédemment, de sorte que la solubilité de l'albumine dans la solution soit beaucoup plus grande . Si la puissance ionique du tampon d'acétate est dede 0,3, on peut obtenir dans de l'é- thanol à 40 %, à un pH 5,5 et à 0 C une solution à 20 % d'albumine. Si la température est de -5 C et si la concen- tration en alcool est maintenue à 40 % avec un pH d'environ 5,5, la puissance ionique du tampon d'acétate devra être plus grande, soit aux environs de 0,5 . En lais- sant une telle solution au repos, des cristaux se séparent.
Si la puissance ionique ou la température était plus grande, ces cristaux se redissolveraient. Avec une concentration
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en alcool plus faible (soit 15 %) , à la même température et au même pH, une partie au moins des cristaux serait recristallisée, si la puissance ionique était inférieure à 0,01. Le contenu en hydrate de carbone de ces cristaux est plus petit 'que 0,1 %.
Il faut se rappeler que lorsque l'on sépare les albu- un de mines des globulines à pH 5,5- 6,0 , température-5 C et concentration en alcool 40 %, la puissance ionique n'est que de 0,05 et l'albumine setrouve dans la liqueur mère à moins de 1 %. En décuplant la puissance ionique , on peut produire un accroissement de la solubili- té des protéines beaucoup plus grand, le logarithme de la solubilité, plutôt que la solubilité, étant une fonction de la puissance ionique pour les solutions éthanol-eau.
C'est dans ces solutions très concentrées de protéines que la cristallisation a lieu avec la plus grande facilité.
En recristallisant successivement , à des puissances ioniques de plus en p.lus basses et avec des concentrations en alcool de plus en plus faibles, on peut extraire les impuretés, celles-ci n'ayant des solubilités différentes dans ces différentes conditions.
Si l'on emploie les mêmes conditions de température, de pH et de concentration en alcool, une puissance ionique plus faible doit être employée pour la cristallisation de l'albumine humaine que pour celle de l'albumine bovine.
Ainsi on a constaté qu'avec de l'éthanol à 40 %, à -5 C et à un pH d'environ 5,5, une puissance ionique de 0,2 est suffisante . Si les cristaux formés dans ces conditions sont r edissous dans une quantité minimum d'eau et side l'é- thanol à 40 % estajouté à la solution jusqu'à ce que celle- ci se trouble, des cristaux se forme nt de nouveau, la cristal-
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lisation ayant lieu cette fois pour une concentration en alcool et une puissanceionique plus basses. Ce pro cédé peut être répété, la cristallisation se faisant chaque fois pour une puissance ionique et une concentration en alcool plus basses. Des puissances ioniques comprises entre0,01 et 0,2 se sont avérées souhaitables dans la mise en oeuvre du procédé suivant l'invention.
Il est également possible d'obtenir la cristallisa- tion dans les liqueurs-mères dechacune de ces masses cristallines en réglant le pH pour une réaction légèrement plus acide ou en abaissant la température . ceci peut parfois être commode, mais généralement il est plus facile de combiner les liqueurs-mères, de précipiter l'albumine à son point isoélectrique par la méthode décrite précé- demment, de reprendre le précipité par filtration ou centri- fugation et de dissoudre le précipité à la puissance ioni- quela plus-grande, dans de l'éthanol à 40 %, la recristalli- sation étant alors réalisée comme décrit ci-dessus.
L'ensemble des conditions particulières choisi pour la précipitation ou l'extraction de n'importe quelle fraction de protéines dépend de la protéine ou des protéines que l'on veut obtenir pour l'usage en vue . Les conditions défi- nies ci-dessus ont été données à titre d'exemples. Comme déjà noté de nombreux autres ensables de conditions sont possibles , par lesquels diverses fractions de protéines peuvent être obtenues, à des degrés de pureté variables.
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Process for fractionating proteins and products thus obtained.
The present invention relates to the fractionation of a mixture of proteins and it is an object to provide improved methods for this operation as well as new protein products.
A wide variety of very useful proteins are contained, for example, in the blood. Some of these proteins are found in red blood cells, others exist in solution in plasma or serum. The object of the present invention is the separation of the proteins contained in the blood or in other fluid extracts anm aux or
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plants, such as milk, liver extract, grain extract, etc.
The subject of the invention is a process for the fractionation of proteins, comprising the operations of separating one or more proteins from a mixture or from a mass of proteins, by bringing said mixture into contact with a solvent. liquid and by adjusting the concentration of hydrogen ions, the temperature, the ionic power and the concentration of the organic precipitating agent in this solution, so that, thanks to the differences in solubility of the proteins constituting the mixture or the mass under the determined conditions specified above, the desired protein is separated from the other proteins of the mixture.
Different protein fractions can be precipitated successively, for example from human or animal serum or plasma, by adding thereto varying amounts of neutral salts such as phosphates and sulphates, organic molecules such as ethanol or other precipitating agent, such as methanol, butanol, acetone, a member of the glycol, dioxane, etc. series or by adding a mixture of precipitating agents such as alcohols and salts or alcohols and ethers. Subsequent fractionation can be obtained by varying the temperature, the entry into ions, hydrogens and / or the concentration or nature of the salt present.
Plasma can be obtained by first separating the cells from the blood by centrifugation or by sedimentation, the coagulation of fibrinogen being prevented by the addition of citrates or the like.
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The precipitated protein fractions may, for example, predominantly comprise fibrinogen, globulin or albumin or mixtures. of these products, depending on the choice of the combination of factors affecting the solubility of the proteins.
Fibrinogen is readily separated from the plasma if an alcohol or other precipitating agent is added to it through a capillary tube or if the plasma is distributed in the alcohol, precautions being taken to achieve an intimate and instantaneous mixing, in conditions such that the breakdown of the protein is kept to a minimum.
Fibrinogen from human plasma coagulates with the addition of other blood clotting agents and can therefore be used as a therapeutic agent. -Fibrinogen also gives thermosetting plastics whose properties are described in detail in the Belgian patent application described.
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Globulins are more labile than albumins, and some properties of some of them, for example, those of normal preserved xxxx sera or those of convalescent sera are generally not preserved unless the greatest precautions are taken. taken in their purification.
Thus a globulin prothrombin, which constitutes a factor involved in the phenomenon of coagulation defined above, only proves to be stable when it is precipitated by taking special precautions, other constituents of globulin, such as than those of complement, being even more labile.
Albumin proteins are particularly
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of interest, especially in the treatment of shock in humans by intravenous injection of albumina solutions.
The albumin of the blood serum is isoelectric at about pH 4.8, this being at least true for the albumin of the human serum or equine and bovine plasma. As the blood pH is maintained at around 7.4, the albumins are far from their isoelectric point, and they are combined with more basic elements per gram than the globulins. They therefore have greater electrophoretic mobility than the latter even when they are of the same molecular weight. The molecular weight of most albumin is around 70,000, or about half that of most globulins, which also gives greater electrophoretic mobilities, as well as greater osmotic pressures per gram. protein.
Although albumins have, in neutral reactions, a specific charge per gram, greater than globulins, as well as a greater number of charged groups, in the isoelectric state, these groups are arranged much more symmetrically. As a result, albumin have electrical moments smaller than those of globulins, these moments are in fact smaller than those of most if not all other proteins.
The conditions to be chosen for the fractionation depend on the solubilities of the various protein constituents of the system and are determined by the following five variables: temperature, pH, ionic strength, concentration of the precipitating agent and concentration of the cons - protein constituents. This last factor is of the greatest importance when the concentration of the various
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system protein is high, and its importance in dilute protein solutions, is said to be. These effects of protein concentration often prevent the denaturation of Labile proteins.
The other four variables are important in any case and must always be controlled if repeatable separations are to be carried out in protein systems.
In sufficiently diluted protein solutions, they alone are sufficient to define the separations. In concentrated solutions, the effect of one protein on another, due to the formation of salt or the interaction between bipolar ions; will only have a secondary influence on the separations. In the case of the formation of salt, it can result from it either an increase or a decrease in sobulity. In the case of interactions between proteins as bapolar ions in the vicinity of their isoelectric points, the influence of one protein over the other depends on the electrical moments of proteins and will have an additional effect comparable to that of the ionic power of electrolytes.
The conditions for the successive precipitation of proteins should be chosen so as to alternate the precipitation of the largest possible pure fractiop with that of the narrowest possible impure fraction. The application of this principle gives maximum yields in pure protein.
The volume ratios given below for ethanol are those of the mixtures at 25 C. The pH and the ionic strength in the ethanol-water mixtures are those which would be obtained if the salts dissolved in pure water at 25 C had the same concentration. This convention is used in view of the imprecision existing in all
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see the definitions of these quantities in ethanol-water mixtures. The pH of the desired protein fractions is that measured with a glass electrode for aqueous solutions with a concentration of about 1% protein.
The separations carried out are not empirically determined but were carried out on the side of an ultra-centrifuge to reveal the dimension and with the aid of electrophoresis measurements to record the charge of the protein particles, in order to obtain products which are substantially homogeneous in terms of their size and their own load.
The fibrinogen is first precipitated from the plasma by means of ethanol as precipitation agent at a concentration by volume of 10%, in a neutral medium, the temperature being below 0 C and close to the freezing point of the solution ( -3 C)
Gamma globulins, so named because of their characteristic electrophoretic mobility, are separated by increasing the concentration of ethanol to 25%, the temperature being lowered to -5 ° C.
The alpha and beta globulins are then separated by bringing the pH to 5.5-6.0 and the alcohol concentration to 40% by volume, the temperature being maintained at -5 C.
The albumin remaining under these conditions in solution in the serum or plasma is precipitated largely at a fold of 4.4 - 4.8 or by lowering the temperature to -15 C. Albumin was prepared, ant human and bovine by this method and the product is pure both by electrophoresis analysis and ultracentrifugation analysis. There is virtually no limit to the amount of albumin that can easily be obtained.
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This method of splitting to. low temperature and in an alcohol-water medium gives crystalline bovine albumin, whereas the old methods could not achieve it. This crystallization can even be obtained or obtained from contaminated plasma / from hemolyzed plasma. Pure albumin can therefore be obtained even from contaminated sources.
For some uses, it may be advantageous to simultaneously separate various proteins from plasma. Thus with 25% ethanol, at a temperature of -5 ° C., without adjustment of the pH, the fibrinogen and the gamma globulins precipitate together. The protein product thus obtained can be used for the manufacture of plastic compounds.
The solubility of each protein, in human or animal plasma, will be minimum around its isoelectric point. The separation of the globulins or the case from the water, by the addition of an amount of acid or base sufficient to bring the protein to its isoelectric point, demonstrates the importance of pH.
-Many proteins, especially albumins, are soluble in water even at their dsoelectric point. The latter can be precipitated, either near their isoelectric points or in a pH range not too far from their isoelectric points, precipitation by means of a salt or by the addition of an organic precipitating agent, such as. ethanol, acetone, methanol, butanol, dioxane, a suitable part of the glycol series etc. The required amount of such a precipitating agent is generally minimum, at or near the isoelectric point of the protein.
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The lower the temperature, the higher the organic solvents will generally have a high precipitating power. Neutral salts that are sufficiently concentrated, such as phosphates and sulphates, often have the opposite effect, with the solubility of the protein decreasing with increasing temperature.
In the case of neutral salts, part of the precipitating action is comparable to that of the organic molecule, but another part has the effect of causing an increase in solubility by increasing the concentration of ions (ionic power) . This is due to the ionic strength which must also be taken into consideration as an important variable when using organic solvents as protein precipitators.
Thus in order to separate the albumins from the plasma globulins, it is necessary to control not only the concentration of the proteins and the organic solvent but also the temperature, the pH and the ionic power, if one wants to obtain a satisfactory separation and the effective crystallization of albumin. a suitable method of controlling both pH and ionic strength by the same reagent is to use buffer solutions. Thus, buffer solutions of phosphate or acetate, of a determined pH and ionic power, have been used for this purpose under various conditions,
The influence of the four variables defined above can be illustrated as follows:
(1) If the alcohol concentration of the plasma solution is brought to 40% by volume, at room temperature, fibrinogen and gamma globulins are precipitated and
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partially denatured, but alpha and beta globulins and albumin are not completely precipitated from plasma.
(2) Lowering the temperature to -5 C very significantly decreases denaturation, increases precipitation of globulins, but does not yet completely precipitate alpha and beta globulins, whose isoelectric points are between pH a and 6.
(3) If the alcohol concentration is increased or the temperature is lowered, or if these two factors remain constant, and if the pH is changed by adding acid or a buffer and is brought to the neighborhood of 5 , 5, the precipitation of large parts of alpha and beta globulins is achieved.
(4) The intensity of this precipitation still depends, however, on the ionic power, an increase in the latter increasing the solubility not only of the globulins but also of the albumin. The magnitude of this action is different for globulins and albumin, and since globulins are much less soluble in 40% ethanol, at this pH range an ionic strength of 0.05 can be used for Sufficiently increasing the solubility of albumin without increasing the solubility of globulin to such an extent as to render the separation unsatisfactory.
Under these conditions of pH, alcohol concentration, ionic strength and temperature, albumin is sufficiently soluble to be extracted almost quantitatively from the precipitate if these proteins are present at a concentration of about a quarter. of that which they owed in the original plasma. Thus the albumin concentration is about 10 gr / liter, while that of globulin soluble in marl conditions never exceeds half a gram / liter and is often even lowered to less than 0.10 gr. if the sepa-
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ration is carried out carefully.
As another example of the influence of pH on constant ionic strength, albumin can be precipitated at constant ionic strength by bringing the pH close to the isoelectric point of albumin, i.e. to a pH 4.7, temperature and alcohol concentration remaining constant.
In order not to subject albumin to the action of an excess of acid, even locally, the said precipitation is completed by adding an acetate buffer with a pH of 4-, 2, the ionic power going from 0.05 to 0.06 while the pH goes from 0.0 to 4.7.
By adding increasing amounts of alcohol and by varying the temperature to obtain the precipitation, successive fractions of protein, the temperature and the percentage of alcohol can be chosen so that the temperature employed is just above the minimum. freezing point of the solution for the percentage of alcohol present.
given
The fibrinogen fraction, / after redissolving a solution exhibiting the phenomenon of double refraction of light. The fibrigoe consists of molecules, which are deposited on ultracentrifugation in potassium chloride u, 2 molar with a rate constant of 7, 0 to 7.9 x 10-13, which move in the electrophoresis apparatus at 0 C in a phosphate buffer solution of ionic strength of 0.2 and a pH of 7.7 with a mobility of 1.8 to 2.3 x 10-5 These fibrinogen molecules are in the form of rods thus giving very viscous solutions. This product has the property of coagulating to form the clot, characteristic of blood, in the presence of calcium and prothrombin.
Prothrombin is another protein produced by the frac-
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tion of blood plasma.
A globulin fraction has the property of polymerizing to form aggregate of varying molecular weight. This protein generally has an ultracentrifugation sedimentation constant of about s 18 x 10-13 or s = 12 x 10-13 and its molecules are also in the form of rods and cause the double refraction of light. .
Although the proteins which separate from a 15% ethanol solution when the temperature is lowered from 0 to -5 C and although the following precipitate which separates when the ethanol concentration is increased to 20% or 22% , the temperature remaining -5 C, include a number of different chemical elements, some having an isoelectric point of about 7, others having more acidic isoelectric points, some near 6, some being euglobulins and Other pseudo-globulins, the fraction as a whole is very uniform with regard to electrophoretic mobility. measured in a phosphate buffer solution with an ionic strength of 0.2 àt with a pH of 7.7, the mobility constant having a value of 0.8 to 2.2 x 10-5 cm2 / or at 0 C.
The dimension of the molecules of this fraction is also constant, except for a small amount of high molecular weight compound, having a sedimentation constant of 12 or IX 18 x 10-13, the constant sediment for the remainder of the fraction being about 5.9 to 6.7 x 10-13 in a 1 molar solution of potassium chloride. This fraction soluble in salt solutions but which can be largely precipitated and separated into its various constituents by dialysis at varying pH, was obtained in the form of an abundant white precipitate.
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odorless. It is less soluble and more viscous than the albuminoque fractions and has a very low inherent electric charge,.
Unlike the protein fractions formed of asymmetric molecules and large viscosity which are precipitated in neutral solution by means of low concentrations of ethanol in water, the fraction which separates in an acid medium (pH 5 approximately) of a 40% ethanol solution at -5 C consists almost entirely of albumins whose sedimentation constant, in 0.2 molar solution, of potassium chloride is 4.0 to 4.4 x 10- 13 and whose electrophoretic mobility is 4.7 to 6.0 x 10-5, at 0 C in a phosphate buffer solution of ionic strength 0.2 and pH 7.7. These molecules, being much more spherical and much more soluble, dissolve quickly in water to form a 20% solution of low viscosity.
According to another method, either protein fraction or group of protein fractions can be obtained by extraction from a solid mixture.
Thus, one or the other solid mixture of these proteins, obtained by one or the other of the methods described above in another way, can be used. We can then obtain the / albumin fraction, for example, from this solid plasma by extractions under conditions such that only the albumins are soluble, the other proteins being insoluble in conditions such as the proteins which remain. undissolved are not denatured and can be subsequently extracted and fractionated.
The albumin can then be separated by treating the albumin solution in a manner analogous to that previously described.
The set of equilibrium conditions under which
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one or the other selected fraction is extracted from the solid mixture, can be determined at will by choosing a suitable pH, temperature, ionic strength and alcohol concentration. The solution thus obtained can be treated as described above with a view to subsequent fractionation.
In addition, it is possible to carry out successive extractions starting from a dry mixture of proteins, with different solvents and at different temperatures and under different ionic and depH conditions. some protein precipitators, such as alcohol, tend to damage many proteins with which they come in contact. This danger of deterioration increases with the concentration of alcohol and the increase in temperature. For many proteins it has been found necessary to take many precautions in mixing the precipitating agent with plasma, or with some other protein solution, in order to avoid spoilage thereof.
For these proteins, methods can be employed in which the precipitating agent (eg, ethanol) is added by diffusion through a semi-permeable membrane. Cellophane is a suitable material which can be employed for such a membrane, while maintaining the plasma at a low temperature, for example 0 C, a cellophane bag containing a solution of ethanol or the like can be suspended therein. p roducts, which / is discussed above.
If it is assumed that the first fraction of protein is to separate at an ethanol concentration of 10%, the amount of ethanol in solution in the semi-permeable bag will have to be calculated, taking into account the total volume of liquidetant at the inside than
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outside the membrane, so that by the time equilibrium is reached, the plasma contains exactly 10% alcohol. it is often useful to pre-cool the alcohol, or other reagent, below the temperature of the plasma, so that at equilibrium the temperature of the mixture is near the freezing point. This constitutes an additional precaution against the deterioration of the proteins.
Instead of placing the precipitating agent inside the semi-permeable membrane and suspending it in the plasma, we ¯: put the plasma in the membrane and suspend it in a bath of agent of precipitation. In both cases it is advisable and it is even generally necessary to stir the plasma. If the plasma is placed inside the membrane, it is also recommended to agitate the bath and to circulate the precipitating agent by a pump. Agitation is necessary to prevent too great a concentration of precipitating agent at the separation surface between the plasma and the precipitating agent.
Methods comprising the use of a semi-permeable membrane are useful not only for the addition of precipitating agent; but also for the addition of either reagent used to modify or purify compounds. proteins, if this reagent may affect them. It is possible to add, through a semi-permeable membrane, without causing the deterioration of proteins, for example, chlorides or acid anhydrides, which combine with the hydroxylamino and phenyl groups of proteins, iodine which forms proteins. iodinated proteins or pyridine or other bases which acted on the proteins and tend to cause damage.
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A suitable apparatus with cellophane screens separating the plasma from the precipitating agent is found to be convenient for commercial production. The plasma and the precipitating agent can circulate through such an apparatus according to the principle of counter current.
Instead of cellophane, hog or collodion casings or similar products, etc. can be used as a semi-permeable membrane. However, collodion cannot be used when the precipitating agent is an alcohol because it is soluble therein.
It has been found that certain proteins, during / better resist alteration by alcohol. For example, albumins have this property as has been said.
When the desired product is of this nature, it is possible to employ methods which would not be suitable for the production of other less stable proteins such as, for example, certain globulins. The precipitating agent (eg ethanol) can in the case of more stable proteins, such as albumin and fibrinogen, be added directly to the solution without employing a semi-permeable membrane. It is even possible to purify the albumin of certain impurities, such as certain globulins, by allowing these globulins to deteriorate in a solution of 15 to 20% ethanol at a pH of 4.8 and at temperature. re between 0 C and room temperature, and separating the precipitate formed by low altered proteins, thus leaving the purified albumin in solution.
This albumin can be precipitated in its crystalline form under suitable conditions, as will be discussed later.
When the stability of the protein to be obtained allows the addition of alcohol without employing a semi-permeable membrane, a number of methods can be used.
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to make this addition. Thus the fibrinogen was precipitated from the plasma by pouring the plasma into an ethanol-water solution or by doing the reverse operation. A T-fitting was also used to make the mixture, supplying the ethanol-water solution through one upper end of the T and the plasma through the other upper end. The two solutions are intimately mixed in this tube xx and pass together through the vertical part or core of the T.
Alcohol has also been added by injecting ethanol-water mixtures or in some cases pure ethanol through a small diameter tube (capillary size or larger) or through a pierced glass plate. small holes in the protein solution, the latter being stirred during the operation.
The precautions necessary to prevent the deterioration depend / in all these cases on the stability of the protein or proteins which one wants to obtain. Very alterable or very labile proteins can be obtained in an undenatured state if any local excess of alcohol concentrations is carefully avoided. The degree of deterioration. protein by local excess alcohol increases sharply if the temperature rises.
The method employed to add the precipitating agent to the protein as well as the nature of the latter determine the degree of alteration and the state of division of the precipitate, this last factor is of great importance. in the production of proteins on a commercial scale.
The stability of albumin is such that it has been judged that it is possible to add the buffer solution, in most of the above methods, to. through a capillary while agitating, without resorting to the use of a semi-ruptured membrane.
As protein precipitates tend to be fine-
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Either divided or sticky, the problem arises of obtaining a precipitate which can be easily collected. A rapid addition of the precipitating agent, by the methods described above or by similar methods or even by pouring the precipitating agent directly into the albumin solution, produces a less fine precipitate and therefore easier to handle.
The precipitated proteins can be dried by freezing the wet precipitate, for example using liquid air or solid carbon dioxide, and subjecting the frozen mass to vacuum so that the solvent evaporates.
The protein is thus obtained in the form of a dry powder.
However, given the relatively greater stability of albumin it has been found that it is possible to dry it, as well as other stable proteins, by vacuuming at room temperature or by passing dry xxxx gases through it. above the precipitate or by extracting the water with an organic solvent according to conventional methods.
The albumin precipitate is in the form of a white powder, without reducing elements. When sufficiently purified, this precipitate readily dissolves in water giving clear solutions even at concentrations of 70% protein, ie 70 grams in 100 oc. It appears to be completely miscible with water.
No precipitate appears in concentrated solution even after a considerable time. Thus 25% solutions were maintained at 37 ° C for more than two months and at 45 ° C for more than one minus without becoming cloudy.
Solutions of human albumin, which had been kept under these conditions for the above times, were injected into a human as transfusion serum without causing any internal reaction. Albu-
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mine purified in this way has been shown to be stable for a considerable time even in solution in 20% ethanol. ordinary temperature.
In fact, albumin has such a stability that instead of concentrating it by precipitation, isoelectrically from 40% ethanol, it can be concentrated by vacuum distillation at low temperature under conditions in which the glopulins would be altered.
This unexpected discovery of the stability of albumin even in an ethanol-water solution at a temperature above 0 ° C. has made it possible to simplify the methods of purification and of concentra.tion of albumin.
Bovine serum albumin purified by the process according to the invention, which is based on the fact that the stability of albumin is greater than that of globulins, can even be crystallized under certain conditions.
The albumin which has been precipitated can be crystallized by redissolving it in 40% ethanol, at 0 C, at a pH of 5.5 - 6.0, and using an ionic strength greater than that. which has been used previously, so that the solubility of albumin in solution is much greater. If the ionic strength of the acetate buffer is 0.3, a 20% albumin solution can be obtained in 40% ethanol, at pH 5.5 and at 0 C. If the temperature is -5 C and if the alcohol concentration is maintained at 40% with a pH of around 5.5, the ionic strength of the acetate buffer should be greater, ie around 0, 5. On leaving such a solution to stand, crystals separate.
If the ionic strength or the temperature were greater, these crystals would redissolve. With concentration
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in lower alcohol (ie 15%), at the same temperature and at the same pH, at least part of the crystals would be recrystallized, if the ionic power were less than 0.01. The carbohydrate content of these crystals is less than 0.1%.
It must be remembered that when one separates the albu- un of mines from the globulins at pH 5.5-6.0, temperature -5 C and alcohol concentration 40%, the ionic power is only 0.05 and albumin is found in the mother liquor at less than 1%. By increasing ionic strength tenfold, a much greater increase in protein solubility can be produced, the log solubility, rather than solubility, being a function of ionic strength for ethanol-water solutions.
It is in these highly concentrated solutions of proteins that crystallization takes place most easily.
By recrystallizing successively, at increasingly low ionic powers and with increasingly low alcohol concentrations, the impurities can be extracted, the latter having different solubilities under these different conditions.
If the same conditions of temperature, pH and alcohol concentration are employed, a lower ionic strength should be employed for crystallization of human albumin than for that of bovine albumin.
Thus it has been observed that with 40% ethanol, at -5 ° C. and at a pH of approximately 5.5, an ionic power of 0.2 is sufficient. If the crystals formed under these conditions are dissolved in a minimum amount of water and 40% ethanol is added to the solution until it becomes cloudy, crystals will form again. crystal-
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lisation taking place this time for a lower alcohol concentration and ionic potency. This process can be repeated, the crystallization taking place each time for a lower ionic strength and a lower alcohol concentration. Ionic powers of between 0.01 and 0.2 have proven to be desirable in the implementation of the process according to the invention.
It is also possible to achieve crystallization in the mother liquors of each of these crystal masses by adjusting the pH for a slightly more acidic reaction or by lowering the temperature. this can sometimes be convenient, but generally it is easier to combine the mother liquors, to precipitate the albumin at its isoelectric point by the method described above, to take up the precipitate by filtration or centrifugation and to dissolve the albumin. precipitated at the highest ionic power in 40% ethanol, the recrystallization then being carried out as described above.
The set of particular conditions chosen for the precipitation or extraction of any fraction of protein will depend on the protein or proteins to be obtained for the intended use. The conditions defined above have been given by way of example. As already noted many other sets of conditions are possible, by which various protein fractions can be obtained, in varying degrees of purity.
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