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Procédé de fractionnement de protéines et produits ainsi obtenus.
La présente invention est relative au fractionnement d'un mélange de protéines et a pour objet de fournir des procédés améliorés pour cette opération ainsi que de nou- veaux produits à base de protéine.
Une grande diversité de protéines très utiles sont conte- nues, par exemple, dans le sang. Certaines de ces protéi- nes se trouvent dans les globules rouges du sang, d'autres existent en solution dans le plasma ou sérum . La présente invention a pour but la séparation des protéines contenues dans le sang ou dàns d'autres extraits fluides anm aux ou
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végétaux, comme le lait, l'extrait de foie, l'extrait de grains, etc.
L'invention a pour objet un procédé de fractionne- ment de protéines, contenant les opérations de séparation d'une ou plusieurs protéines à partir d'un mélange ou d'une masse de protéines, en mettant le dit mélange en contact avec un solvant liquide et en réglant la concen- tration en ions hydrogènes, la température, la puissance ionique et la concentration de l'agent de précipitation or- ganique dans cette solution, de sorte que, grâce aux diffé- rences de solubilité des protéines constituant le mélange ou la masse dans les conditions déterminées spécifiées ci- avant, la protéine désirée soit séparée des autres protéi- nes du mélange.
On peut précipiter successivement différentes fractions de protéines, par exemple à partir du sérum ou plasma hu- main ou animal, par addition à celui-ci de quantités varia- bles de sels neutres comme des phosphates et des sulfates, de molécules organiques comme l'éthanol ou un autre agent de précipitation , comme le méthanol, le butanol, l'acétone, un élément de la série du glycol, du dioxane, etc ou par addition d'un mélange d'agents de précipitation tels que des alcools et des sels ou des alcools et des éthers. Un fractionnement ultérieur peut être obtenu en faisant Varier la température, la c une entrât ion en ions, hydrogènes et/ou la concentration ou la nature du sel en présence.
Le plasma peut être obtenu en séparant tout d'abord les globules du sang par centrifugation ou par sédimenta- tion, la coagulation du fibrinogène étant empêchée par l'addition de citrates' ou d'agents analogues .
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Les fractions de protéines précipitées peuvent,par exemple, comprendre en majeure partie du fibrinogène, de la globuline ou de l'albumine ou des mélanges. de ces produits, suivant le choix de la combinaison des fac- teurs affectant la solubilité des protéines.
Le fibrinogène se sépare facilement du plasma si l'on y ajoute un alcool ou un ,autre agent de précipitation par un tube capillaire ou si le plasma est réparti dans l'alcool, des précautions étant prises pour réaliser un mélange intime et instantané, dans des conditions telles que la décomposition de la protéine soit maintenue à un minimum.
Le fibrinogène provenant du plasma humain se coa- gule lorsqu'on lui ajoute les autres agents de coagulation du sang et peut dès lors être employé comme agent théra- peutique . -Le fibrinogène donne également des matières plastiques thermodurcissables dont les propriétés sont dé- crites en détail dans la demande de brevet belge dé-
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posée le et d,0c,. / ( sous le nu 3 z . i X4
Les globulines sont plus labiles que les albumines,et certaines propriétés de quelques unes d'entre elles,par exemple,celles des xxxx serums normaux conservés ou celles des serums de convalescents ne seconservent en général pas à moins que les précautions les plus grandes ne soient prises dans leur purification.
Ainsi une globuline la prothrombine, qui constitue un facteur intervenant dans le phénomène de coagulation défini ci-dessus, ne s'avère stable que lorsqu'elle est précipitée en prenant des pré- cautions particulières , d'autres constituants de globuli- ne , tels que ceux de complément , étant même encore plus labiles.
Les protéines albuminiques sont particulièrement
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intéressantes, notamment dans le traitement de choc chez les humains par injection intraveineuse de solutions d'al- bumine .
L'albumine du sérum sanguin est isoélectrique vers pH 4,8 , ceci étant du moins vrai pour l'albumine du sérum ou plasma humain chevalin et bovin . Comme lepH du sang se maintient vers 7,4, les albumines y sont loin de leur point isoélectrique, et elles sont combinées avec plus d'éléments basiques par gramme que les globulines . Elles ont dès lors une plus grande mobilité électrophorétique que ces dernières même lorsqu'elles sont de même poids moléculaire . Le poids moléculaire de la plupart des albu- mines est voisin de 70.000 , soit à peu près la moitié de celui de la plupart des globulines, ceci donnant égale- ment des mobilités électrophorétiques plus grandes, de même que des pressions osmotiques plus grande par gramme de protéine .
Bien que les albumines aient , en réactions neutres,une charge propre par gramme, plus grande que les globulines, de même qu'un plus grand nombre de groupes chargés, à l'état isoélectrique, ces groupes sont disposés beaucoup plus symétriquement . 11 en résulte que les albu- mines ont des moments électriques plus petits que ceux des globulines, ces moments sont en fait plus petits que ceux de la plupart si pas de toutes les autres protéines.
Les conditions à choisir pour le fractionnement dé- pendent des solubilités des divers constituants protéini- ques des système et sont déterminées par les cinq variables suivantes : température, pH, puissance ionique, concentra- tion de l'agent de précipitation et concentration- des cons- tituants protéiniques . Ce dernier facteur est de la plus grande importance lorsque la concentration des diverses
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protéines du système est élevée et son importance dirai- nue dans les solutions , de protéines diluées. ues effets de la concentration en protéine empêchent souvent la déna- turation des protéines Labiles .
Les quatre autres varia- bles sont importantes dans tous les cas et doivent tou- jours être contrôlées si l'on veut effectuer dans des systèmes protéiniques des séparations pouvant être répétées.
Dans les solutions de protéines suffisamment diluées,ils suffisent à eux seuls à définir les séparations . Dans les solutions concentrées, l'effet d'une protéine sur une autre, dû à la formation de sel ou à l'interaction entre ions bipolaires; n'aura qu'une influence secondaire sur les séparations. Dans le cas d'e la formation de sel,il peut en résulter soit une augmentation soit une diminution de la sobulitit.. Dans le cas d'interactions entre protéi- nes comme ions bàpolaires au voisinage de leurs points isoélectriques, l'influence d'une protéine sur l'autre dé- pend des moments électriques des protéines et aura un effet additionnel comparable à celui dela puissance ionique des électrolytes.
Les conditions pour la précipitation successive de protéines doivent être chosies de façon à faire alterner la précipitation de la fractiop pure la plus large possi- ble avec celle d'une fraction impure la plus étroite possible. L'application de ce principe donne des rende- ments maxima en protéines pures .
Les rapports en volume donnés ci-après pour l'éthanol sont ceux des mélanges à 25 C. Le pH et la puissance ionique dans les mélanges éthanol-eau sont ceux qui se- raient obtenus si les sels dissous dans de l'eau pure à 25 C avaient la même concentration . Cette convention est employée étant donné l'imprécision existant dans tou-
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tes les définitions de ces quantités dans les mélanges éthanol-eau . Le pH des fractions protéiniques voulues est celui mesuré avec une électrode de verre pour des solutions aqueuses d'une concentration d'environ 1% en protéine .
Les séparations réalisées ne sont pas empiriquement déterminées mais ont été effectuées à l'side d'un ultra- centrifugeuse pour révéler la dimension et avec l'aide de mesures d'électrophorèse pour enregistrer la charge des par- ticules de protéine, de faon à obtenir des produits sensi- blement homogènes pour ce qui est de leur dimension et de leur charge propre.
Le fibrinogène est d'abord précipité du plasma au moyen d'éthanol comme aent de précipitation à une concen- tration en volume de 10 %, en milieu neutre, la température étant inférieure à 0 C et voisine du point de congélation de la solution (-3 C)
Les globulines gamma, ainsi dénommées à cause de leur mobilité électrophorétique caractéristique, sont sépa- rées en augmentant la concentration de l'éthanol jusqu'à 25 %, la température étant abaissée à -5 C.
Les globulines alpha et bêta sont ensuite séparées en amenant le pH à 5,5-6,0 et la concentration de l'alcool à 40 % en volume, la température étant maintenue à -5 C.
L'albumine restant , dans ces condiqions en solution dans le sérum u plasma est précipitée en grande partie à un pli de 4,4 - 4,8 ou par abaissement de la température à -15 C. On a préparé de l'albumine, ant humaine que bovine , par cette méthode et le produit est pur tant à l'analyse par électrophorèse qu'à l'analyse par ultracentri- fugation. Il n'y a pratiquement aucune limite à la quantité d'albumine qui peut facilement être obtenue .
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Cette méthode de fractionnement à. basse température et en milieu alcool-eau donne de l'albumine bovine cris- talline, alors que les méthodes anciennes ne pouvaient le réaliser . Cette cristallisation peut même être obte- ou nue à partir de plasma contaminé/à partir de plasma hémo- lysé . Une albumine pure peut donc être obtenue méme à par- tir de sources contaminées.
Pour certains usages, il peut être avantageux de sépa- rer simultanément diverses protéines du plasma . Ainsi avec de l'éthanol à 25 % , à une température de -5 C, sans ajustement du pH , le fibrinogène et les globulines gamma précipitent ensemble .Le produit protéinique ainsi obtenu peut être employé pour la fabrication de composés plasti- ques.
La solubilité de chaque protéine, dans le plasma humain ou animal, sera minimum aux environs de son point isoélectrique . La séparation des globulines ou de la casé) ne de l'eau, par addition d'une quantité'd'acide ou de base suffisante pour amener la protéine à son point iso- électrique, démontre l'importance du pH.
-De nombreuses protéines , notamment des albumines, sont solubles dans l'eau même à leur point dsoélectri- que . Ces dernières peuvent être précipitées, soit près de leurs points isoélectriques soit dans un intervalle de pH pas' trop éloigné de leurs points isoélectriques, préci- pitation au moyen d'un sel ou par addition d'un agent de précipitation organique, tel que l'éthanol , l'acétone, le méthanol, lebutanol, ledioxane, un élément approprié de la série du glycol etc. La quantité nécessaire d'un tel agent de précipitation est en général minimum, au point isoélectrique de la protéine ou au voisinage de celui-ci.
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Plus la température est basse, plus les solvants organi- ques auront en général un pouvoir précipitant élevé. Des sels neutres suffisamment concentrés, comme des phosphates et des sulfates, ont souvent l'effet inverse , la solubili- té de la protéine décroissant avec l'augmentation de tempé- ratur e.
Dans le cas de sels neutres , une partie de l'action précipitante est comparable à celle de la molécule organi- que, uais une autre partie a pour effet de provoquer une augmentation de la solubilité par accroissement de la concentration en ions (puissance ionique) . Ceci est dû à la puissance ionique qui doit également être prise en considération comme variable importante lorsqu'on emploie des solvants organiques comme agents de précipitation de protéine .
Ainsi pour séparer les albumines des globulines de plasma , il est nécessaire de contrôler non seulement la concentration des protéines et du solvant organique mais également la température, le pH et la puissance ioni- que, si l'on veut obtenir une séparation satisfaisante et la cristallisation effective de l'albumine . une méthode appropriée pour contrôler à la fois le pH et la puissance ionique par le même réactif, consiste à utiliser des solutions tampons . Ainsi des solutions tam- pons de phosphate ou d'acétate, d'un pH, et d'une puissan- ce ionique déterminés, ont été employées dans ce but dans diverses conditions ,
L'influence des quatre variables définies ci-dessus peut êtreillustrée comme suit :
(1) Si la concentration en alcool de la solution de plasma est amenée à 40 % en volume, à température ambiante, la fibrinogène et les globulines gamma sont précipités et
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en partie dénaturés, mais les globulines alpha et bêta et l'albumine ne sont pas précipitées complètement du plasma.
(2) Un abaissement de la température à -5 C diminue très sensiblement la dénaturation, augmente la précipitation des globulines, mais ne précipite pas encore complètement les globulines alpha et bêta, dont les points isoélectriques se trouvent entre les pH a et 6.
(3) Si la concentration en alcool est augmentée ou si la température est abaissée, ou si ces deux facteurs res- tant constants, et si le pH est changé par addition d'acide ou d'un tampon et est amené au voisinage de 5,5 , la précipitation de grandes parties des globulines alpha et bêta est réalisée.
(4) L'intensité de cette précipitation dépend toute- fois encore de la, puissance ionique, une augmentation de celle-ci augmentant la solubilité , non seulement des globuli- nes mais également de l'albumine . L'importance de cette action est différente pour les globulineset l'albumine, et comme les globulines sont beaucoup moins solubles dans de l'éthanol à 40 %, dans cet intervallede pH, une puissan- ce ionique de 0,05 peut être employée pour augmenter suffi- samment la solubilité de l'albumine sans accroître la solu- bilité de la globuline au point de rendre la séparation non satisfa i sante.
Dans ces conditions de pH, de concentration en alcool, de puissance ionique et de température, l'albumine est suffi- samment soluble pour être extraite quasi quant'itativement du précipité si ces protéines sont présentes à une concentra- tion d'environ un quart de celle qu'elles dut dans le plasma originel . Ainsi la concentration en albumine est d'environ 10 gr/litre, tandis que celle de la globuline soluble dans les marnes conditions n'excède jamais un demi gramme/litre et est même souvent abaissée à moins de 0,10 gr. si la sépa-
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ration est réalisée soigneusement.
Comme autre exemple de l'influence du pH aour une puissance ionique constante, on .peut précipiter l'albumine, à puissance ionique constante, en amenant le pH près du point isoélectrique de l'albumine, c'est-à-dire à une va- leur de pH 4,7, la température et la concentration en al- coul restant constantes.
En vue de ne pas soumettre l'albumine à l'action d'un excès d'acide même localement, on achève la dite précipi- tation en ajoutant un tampon d'acétate d'un pH de 4-,2,la puissance ionique passant de 0,05 à 0,06 tandis que le pH passe de 0,0 à 4,7.
En aj outantdes quantités croissontes d'alcool et en faisant varier la température pour obtenir la précipita- tion, de fractions successives de protéines, la tempéra- ture et le pourcentage d'alcool peuvent être choisis de façon que la température employée soit juste supérieure au point de congélation de la solution pour le pourcenta- ge d'alcool présent.
donne
La fraction fibrinogène,/après redissolution une solution présentant le phénomène de double réfraction de la lumière .Le fibrigonèe est constitué de molécules, qui se déposent à l'ultracentrifugation dans du chlorure de potassium u,2 molaire avec une constante de vitesse de 7,0 à 7,9 x 10-13, qui se déplacent dans l'appareil à élec- trophorèse à 0 C dans une solution tampon de phosphate de puissance ionique de 0,2 et d'un pH de 7,7 avec une mobilité de 1,8 à 2,3 x 10-5 Ces molécules de fibrino- gène se présentent sous forme de bâtonnets donnant ainsi des solutions très visqueuses . Ce produit a la propriété de se coaguler pour former le caillot,,caractéristique du sang, en présence de calcium et de prothrombine.
La prothrombine est une autre protéine produite par le frac-
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tionnement du plasma sanguin.
Une faction de globuline a la propriété de se poly- mériser pour former desaggrégate de poids moléculaire varia- ble . Cette protéine possède généralement une constante de sédimentation à l'ultracentrifugation d'environ s 18 x 10-13 ou s = 12 x 10-13 et ses molécules se présentent également sous la forme de bâtonnets et provo- quent la double réfraction de la lumière.
Bien que les protéines qui se séparent d'une solution d'éthanol à 15 % lorsque la température est abaissée de 0 à-5 C et bien que le précipité suivant qui se sépare lorsque la concentration en éthanol est portée à 20 % ou 22 % , la température restant -5 C, comprennent un certain nombre d'éléments chimiques différents, certains ayant un point isoélectrique d'environ 7, d'autres ayant des points isoélectriques plus acides, certains près de 6, certains étant des euglobulines et d'autres des pseudo- globulines, la fraction est dans son ensemble très unifor- me en ce qui concerne la mobilité électropuor étique. mesu- rée dans une solution-tampon de phosphate d'une puissance ionique de 0,2 àt d'un pH de 7,7 , la constante de mobilité ayant une valeur de 0,8 à 2,2 x 10-5 cm2/ ou à 0 C.
La di- mension des molécules de cette fraction est également cons- tante , à l'exception d'une petite quantité de composé de poids moléculaire élevé, ayant une constante de sédimen- tation de 12 o u IX 18 x 10-13,la constante de sédimenta- tion de tout le reste de la fraction étant d'environ 5,9 à 6,7 x 10-13 dans une solution u, molaire de chlorure de potassium . Cette fraction soluble dans des solutions de sels mais pouvant être en grande partie précipitée et séparée en ses divers constituants par dialyse à pH varia- ble, a été obtenue sous-forme d'un abondant précipité,blanc,
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inodore . Il est moins soluble et plus visqueux que les fractions albuminoques et possède une très faible charge électrique propre, .
Contrairement aux fractions de protéi- ne formées de molécules asymétriques et degrande viscois- té qui sont précipitées en solution neutre au moyen de faibles concentrations d'éthanol dans l'eau, la fvaction qui se sépare en milieu acide (pH 5 environ) d'une solution d'éthanol à 40 % et à -5 C consiste presqu'entièrement en albumines dont la constante de sédimentation, eh solu- tion 0,2 molaire , de chlorure de potassium est de 4,0 à 4,4 x 10-13 et dont la mobilité électrophorétique est de 4,7 à 6,0 x 10-5, à 0 C dans une solution -tampon de phosphate de puissance ionique 0,2 et de pH 7,7. Ces molé- cules étant beaucoup plus sphériques et beaucoup plus solubles, se dissolvent rapidement dans l'eau pour former une solution à 20% de faible viscosité.
Suivant un autreprocédé, on peut obtenir l'une ou l'autre fraction de protéine ou groupe de fractions protéinique par extraction à partir d'un mélange solide.
Ainsi, on peut utiliser l'un ou l'autre mélange solide de ces protéines, obtenu par l'un ou l'autre des procédés décrits précédemment d'une autre manière . On peut alors la fraction obtenir/albuminique , par exemple, à partir de ce plasma solide par extractions dans des conditions telles que seules les albumines soient solubles ,les autres protéines étant insolubles dans des conditio:.s telles que les protéi- nes qui restent non dissoutes ne soient pas dénaturées et puissent être extraites ultérieurement et fractionnées.
L'albumine peut ensuite être séparée en traitant la solu- tion d'albumine d'une manière analogue à celle décrite précédemment.
L'ensemble des conditions d'équilibre dans lesquelles
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on réalise l'extraction de l'une ou l'autre fraction choisie à partir du mélange solide , peut être déterminé à volonté en choisissant un pH, une température, une puissance ioni- que et une concentration en alcool convenable . La solution ainsi obtenue peut être traitée de la façon décrite précédem- ment en vue d'un fractionnement ultérieur.
De plus, on peut effectuer des extractions successives en partant d'un mélange sec de protéines, par différents solvants et à des températures et dans des conditions ioni- ques et depH d iff érentes. certains agents précipitant les protéines , comme l'al- cool, ont tendance à altérer de nombreuses protéines avec lesquelles ils viennent en contact. Ce danger d'altération augmentant avec la concentration en alcool et l'accroisse- ment de température . Pour beaucoup de protéines on a jugé nécessaire de prendre de nombreuses précautions pour mé- langer l'agent de précipitation avec le plasma, ou avec une autre solution deprotéines , dans le but d'éviter l'altéra- tion de celles-ci.
Pour ces protéines, on peut employer des procédés dans lesquels l'agent de précipitation (par exemple l'éthanol) est ajouté par diffusion à travers une membrane semi-perméable. La cellophane est une matière convenable pouvant être employée pour une telle membrane, tout en maintenant le plasma à une température faible,par exemple 0 C, on peut suspendre dans celui-ci un sac en cello phanecontenant une solution d'éthanol ou d'autres p roduits, dont/est question ci-dessus .
Si on suppose que la première fraction de protéine doit se séparer à une concentration en éthanol de 10 %, la quantité d'éthanol en solution dans la poche semi-perméable devra être calculée, en tenant compte du volume total- de liquidetant à l'intérieur qu'à
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l'extérieur de la membrane, de faon qu'au moment où l'équilibre est atteint, le plasma contienne exactement 10 % d'alcool. il est souvent utile de refroidir préalablement l'al- cool, ou autre réactif, en-dessous dela températuredu plasma, de façon qu'à l'équilibre la température du mélange soit proche du point de congélation . Ceci consti- tue une précaution supplémentaire contre l'altération des protéines.
Au lieu de placer l'agent de précipitation à l'intérieur de la membrane semi-perméaole et de suspendre celle-ci dans le plasma, on ¯: eu mettre le plasma dans la membrane et suspendre celle-ci dans un bain d'agent de pré- cipitation . vans leseux cas il est à conseiller et il est même généralement nécessaire d'agiter le plasma . Si le plasma est placé à l'intérieur de la membrane il est également recommandé d'agiter le bain et de faire circu- ler l'agent de précipitation par une pompe. Il est néces- saire d'agiter pour empêcher une trop grande concentra- tion d'agent de précipitation à la surface de séparation entrele plasma et l'agent de précipitation.
Les méthodes comprenant l'emploi d'une membrane semi-perméable sont utiles non seulement pour l'addition d'agent de précipitation ;nais également pour l'addition de l'un ou l'autre réactif utilisé pour modifier ou puri- fier des protéines , si ce réactif risque d'altérer celles- ci . On peut ajouter, travers une membrane semi-per- méable/sans provoquer 1 altérationdes protéines par exem- ple, des chlorures ou des anhydrides acides, qui se combi- nent avec les groupes hydroxylesaminés et phényles des protéines, l'iode qui forme des protéines iodées ou la pyridine ou d'autreh bases qui agissait sur lesprotéines et tendent à provoquer des altérations.
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Un appareillage convenable comportant des écrans en cellophane séparent le plasma de l'agent de précipitation s'avère commode pour une production commerciale . Le plasma et l'agent de précipitation peuvent circuler à travers un tel appareil selon le principe du contre courant.
Au lieu de cellophane on peut employer comme membrane semi-perméable , des boyaux de porcs ou de collodion ou des produits semblables etc. Toutefois le collodion ne peut être employé lorsque l'agent de précipitation est un alcool parce qu'il est soluble dans celui-ci.
On a constaté que certaines protéines , résistent ce- beaucoup pendant/mieux à l'altération par l'alcool.Par exemple,les albumines possèdent comme il a été dit cette propriété.
Lorsque le produit que l'on désire est de cette nature,il est possible d'employer des procédés qui ne conviendraient pas pour la production d'autres protéines moins stables comme, par exemple, certaines globulines. L'agent de préci- pitation (par exemple l'éthanol) peut dans le cas de protéi- nes plus stables, comme l'albumine et le fibrinogène, être ajouté directement à la solution sans employer de membrane semi-perméable, En fait il est même possible de purifier l'albumine de certaines impuretés , comme de certaines globu- lines, en permettant à ces globulines de s'altérer dans une solution d'éthanol à 15 à 20 % à un pH de 4,8 et à températu- re comprise entre 0 C et la température ambiante, et en sépa- rant le précipité formé par bas protéines altérées, laissant ainsi en solution l'albumine purifiée.
Cette albumine peut être précipitée saus forme cristalline dans des conditions adéquates, .comme il sera dit plus loin.
Lorsque la stabilité de la protéine que l'on veut obte- nir permet l'addition d'alcool sans employer une membrane semi-perméable, on peut utiliser un certain nombre de procédés
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pour faire cette addition. Ainsi le fibrinogène a été précipité du plasma en versant le plasma dans une solution éthanol-eau ou en faisant l'opération inverse. Un raccord en T a également été employé pour faire le mélange , 'en ame- nant la solution éthanol-eau par une extrémité supérieure du T et le plasma par l'autre extrémité supérieure . Les deux solutions sont intimement mélangées dans ce tube xx et pas- sent ensemble par la partie verticale ou âme du T.
L'al- cool a également été ajouté par injection de mélanges étha- nol-eau ou dans certains cas d'éthanol pur à travers un tube de faible diamètre (dimension capillaire ou plus gran- de) ou à travers une plaque de verre percée de petits, trous, dans la solution de protéine , celle-ci étant agitée pendant l'opération.
Les précàutions nécessaires pour prévenir l'altéra- ent tion dépend/dans tous ces cas de la stabilité de la protéi- ne ou des protéines que l'on veut obtenir. Les protéines très altérables ou très labiles peuvent être obtenues à l'état non dénaturé si l'on évite soigneusement tout ex- cès local de concentrations en alcool. Le degré d'altéra- tion. des protéines par excès local d'alcool augmente for- tement si la température augmente.
La méthode employée paur ajouter l'agent de précipita- tion à la protéine de même que la nature de celle-ci détermi- nent le degré j'altération et l'état de division du précipi- té, ce dernier facteur a une grande importance dans la pro- duction de protéines à l'échelle commerciale.
La stabilité de l'albumine est tellequ'on a jugé qu'il était possible d'ajouter la solution tampon, dans la plupart des procédés susdits, à. travers un capillaire tout en agi- tant, sans recourir à l'emploi d'une membrane semi-pérrueable.
Comme les précipités de protéines tendent à êtresoit fine-
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ment divisés soit collants, le problème se pose d'obtenir un précipité pouvant être facilement recueilli . Ene addi- tion rapide d'agent de précipitation, par les méthodes dé- crites ci-dessus ou par des méthodes semblables ou même en versant directement l'agent de précipitation dans la solu- tion d'albumine, produit un précipité moins fin et donc plus facile à manipuler.
Les protéines précipitées peuvent être xx séchées en congelant le précipité mouillé, par exemple au moyen d'air liquide ou d'anhydride carbonique solide, et en soumettant la masse congelée au vide de façon que le solvant s'évapore.
La protéine est ainsi obtenue sous forme de poudre sèche.
Toutefois étant donné la stabilité relativement plus grande de l'albumine on a constaté qu'il était possible de sécher celle-ci, demême que d'autres protéines stables,par le vide à température ordinaire ou en faisant passer des gaz xxxx secs au-dessus du précipité ou en extrayant l'eau par un solvant organique suivant les méthodes classiques.
Le précipité d'albumine se présente sous la forme d'une poudre blanche , sans éléments réducteurs. Lorsqu'il est suffisamment purifié, ce précipité se dissout facile- ment dans l'eau en donnant des solutions claires même à des concentrations de 70 % en protéine, c'est-à-dire 70 grammes dans 100 oc. Il semble être complètement miscibleà l' eau.
Aucun précipité n'apparaît en solution concentrée même après un temps considérable . Ainsi des solutions à 25 % ont été maintenues à 37 C pendant plus de deux mois et à 45 C pendant plus d'un moins sans se troubler.
Des solutions d'albumine humaine, qui avaient été maintenues dans ces conditions pendant les temps ci-des- sus, ont été injectées à un être humain comme sérum de transfusion sans provoquer aucune réaction interne. L'albu-
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mine purifiée de cette façon s'est révélée stable pendant un temps considérable même en solution dans l'éthanol à 20 % à. température ordinaire .
En réalité, l'albumine possède une stabilité telle qu'au lieu de la concentrer par précipitation, isoélectri- que à partir d'éthanol à 40 %, on peut la concentrer par distillation sous vide à basse température dans des con- ditions pour lesquelles les glopulines seraient altérées.
Cette découverte inattendue de la stabilité de l'albumine à même en solution éthanol-eau à température supérieure 0 C a permis de simplifier les méthodes de purification et de concentra.tion de l'albumine .
L'albumine du serum bovin purifiée par le procédé suivant l'invention, qui se base sur le fait que la stabili- té de l'albumine est plus grande que celle des globulines, peut même être cristallisée dans certaines conditions.
On peut faire cristalliser l'albumine qui a été précipitée, en la redissolvant dans de l'éthanol à 40 %, à 0 C, à un pH de 5,5 - 6,0 , et en employant une puissance ionique plus grande que celle qui a été employée précédemment, de sorte que la solubilité de l'albumine dans la solution soit beaucoup plus grande . Si la puissance ionique du tampon d'acétate est dede 0,3, on peut obtenir dans de l'é- thanol à 40 %, à un pH 5,5 et à 0 C une solution à 20 % d'albumine. Si la température est de -5 C et si la concen- tration en alcool est maintenue à 40 % avec un pH d'environ 5,5, la puissance ionique du tampon d'acétate devra être plus grande, soit aux environs de 0,5 . En lais- sant une telle solution au repos, des cristaux se séparent.
Si la puissance ionique ou la température était plus grande, ces cristaux se redissolveraient. Avec une concentration
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en alcool plus faible (soit 15 %) , à la même température et au même pH, une partie au moins des cristaux serait recristallisée, si la puissance ionique était inférieure à 0,01. Le contenu en hydrate de carbone de ces cristaux est plus petit 'que 0,1 %.
Il faut se rappeler que lorsque l'on sépare les albu- un de mines des globulines à pH 5,5- 6,0 , température-5 C et concentration en alcool 40 %, la puissance ionique n'est que de 0,05 et l'albumine setrouve dans la liqueur mère à moins de 1 %. En décuplant la puissance ionique , on peut produire un accroissement de la solubili- té des protéines beaucoup plus grand, le logarithme de la solubilité, plutôt que la solubilité, étant une fonction de la puissance ionique pour les solutions éthanol-eau.
C'est dans ces solutions très concentrées de protéines que la cristallisation a lieu avec la plus grande facilité.
En recristallisant successivement , à des puissances ioniques de plus en p.lus basses et avec des concentrations en alcool de plus en plus faibles, on peut extraire les impuretés, celles-ci n'ayant des solubilités différentes dans ces différentes conditions.
Si l'on emploie les mêmes conditions de température, de pH et de concentration en alcool, une puissance ionique plus faible doit être employée pour la cristallisation de l'albumine humaine que pour celle de l'albumine bovine.
Ainsi on a constaté qu'avec de l'éthanol à 40 %, à -5 C et à un pH d'environ 5,5, une puissance ionique de 0,2 est suffisante . Si les cristaux formés dans ces conditions sont r edissous dans une quantité minimum d'eau et side l'é- thanol à 40 % estajouté à la solution jusqu'à ce que celle- ci se trouble, des cristaux se forme nt de nouveau, la cristal-
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lisation ayant lieu cette fois pour une concentration en alcool et une puissanceionique plus basses. Ce pro cédé peut être répété, la cristallisation se faisant chaque fois pour une puissance ionique et une concentration en alcool plus basses. Des puissances ioniques comprises entre0,01 et 0,2 se sont avérées souhaitables dans la mise en oeuvre du procédé suivant l'invention.
Il est également possible d'obtenir la cristallisa- tion dans les liqueurs-mères dechacune de ces masses cristallines en réglant le pH pour une réaction légèrement plus acide ou en abaissant la température . ceci peut parfois être commode, mais généralement il est plus facile de combiner les liqueurs-mères, de précipiter l'albumine à son point isoélectrique par la méthode décrite précé- demment, de reprendre le précipité par filtration ou centri- fugation et de dissoudre le précipité à la puissance ioni- quela plus-grande, dans de l'éthanol à 40 %, la recristalli- sation étant alors réalisée comme décrit ci-dessus.
L'ensemble des conditions particulières choisi pour la précipitation ou l'extraction de n'importe quelle fraction de protéines dépend de la protéine ou des protéines que l'on veut obtenir pour l'usage en vue . Les conditions défi- nies ci-dessus ont été données à titre d'exemples. Comme déjà noté de nombreux autres ensables de conditions sont possibles , par lesquels diverses fractions de protéines peuvent être obtenues, à des degrés de pureté variables.
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