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MinistèredesAffaires Economiques etdes ClassesMoyennes ROYAUME D E BELGIQUE
DirectionGénérale del'IndustrieetduCommerce ¯J'j
Administration du Commerce
Servicedela PropriétéIndustrielleetCommerciale
EMI1.1
N' ......480...602.......
LE MINISTRE DES AFFAIRES ECONOMIQUES ET DES CLASSES MOYENNES,
Vu l'arrêté-loi du 8 juillet 1946, prorogeant, en raison des événements de guerre, les délais en matière de propriété industrielle et la durée des brevets d'invention;
EMI1.2
Vu là loi du 31 àt'CC111ble. , portant approbation dû l'Arrangomont conoGrnant la i:..::. ,-ii:., ou la rootaumtion doc.droite do propriété induotriclle atteinte par la deuxième guerre mondiale, signe à NouM4e)r- le 8 février 1047. / Vu la loi du 30 mars 1948, portant modification à l'arrêté-loi dù 8juillet1946,prorogeant,en raison des événements de guerre, les délais en matière de propriété industrielle et la durée des brevets d'invention.
Revu l'arrêté ministériel du 15-3-48 , délivrant sous le N 480.602 ,àE.R. Squibb & Sons. un brevet d'invention pour : Procédé pour la préparation de pro- duits antibiotiques
ARRETE :
ARTICLE PREMIER.- Les considérants suivants sont insérés dans l'arrêté ministériel N 480.602 du 15 mars 1948 , après le considérant " Vu la loi du 24 mai 1854 sur les brevets d'inven- tion,, :
Vu l'arrêté-loi du 8 juillet 1946, prorogeant en raison des événements de guerre, les délais 'en matière de propriété industrielle et la durée des brevets d'invention, modifié par la loi du 30 mars 1948; Vu la Convention d'Union pour la Protection de la Propriété Industrielle; ART. 2. - Le présent arrêté sera annexé à l'arrêté ministériel visé à l'article premier.
Bruxelles, le 11 janvier 1949.
AU NOM DU MINISTRE :
Le Fonctionnaire délégué,
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" Procédé Pour la préparation de produits antibiotiques "
L'invention a trait à un procédé pour la préparation de produits antibiotiques.
Il a déjà été établi que :
1 - Un produit à pouvoir antibiotique, de la strepto- mycine, existe dans un liquide de culture obtenu lorsque l'organisme Actinomyces griseus est cultivé en contact avec (c'est-à-dire dans ou sur) certains milieux liquides;
2 - La composition du milieu dans lequel est cultivé l'organisme a une importance considérable dans la produc- tion du produit antibiotique ;
3 - La présence de peptone (ou d'un autre hydroly- sat de protéine, tel que la tryptone) et d'une substance spécifique provoquant la culture et fournie par un extrait
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de viande (ou une liqueur à mcération de grains) est nécessaire pour la production du produit antibiotique (Schatz, Bugie et Waksman, Proc. Soc. Exp. Biol. and Med., 1944, 55; 66).
Cependant, il a été établi, dans la pratique que l'hydrolysat de protéine (ou certains constituants de ce composé) et/ou l'extrait de viande rendent difficile l'iso- lement du produit antibiotique, et que l'emploi de milieux contenant ces composés est indésirable pour cette ra&son, également comme pour d'autres raisons. Il a été @ établi qu'en utilisant la liqueur à macération de grains comme source sensiblement unique de composés azotés et provoquant la culture du milieu, il ne se forme pratiquement aucun produit antibiotique .
L'invention a pour objet de préparer un produit anti- biotique analogue à la streptomycine et fortement actif et d'indiquer des procédés pour la préparation de ce pro- duit; un autre objet de l'invention réside dans l'améliora- tion des procédés pour la préparation d'un produit antibio- tique .
(Bien que la nature du milieu dans lequel est cultivé un organisme puisse affecter qualitativement le produit antibiotique préparé, et qu'un milieu différent soit utili- sé dans la pratiquee la mise en oeuvre de l'invention, il est possible que le produit antibiotique préparé conformé- ment à l'invention diffère qualitativement de la strepto- mycine préparée par Schatz & autres (ouvrage cité ci- dessus). Par suite, le produit antibiotique préparé con- formément à l'invention est désigné, dans le mémoire, comme "analogue à la streptomycine", même s'il peut être, en fait, de la streptomycine ou un dérivé de celle-ci.
De plus, bien que le produit antibiotique préparé conformé- ment à l'invention, soit mentionné au singulier, il doit être bien entendu quil peut comprendre plus qu'un compo- se).
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Il a été établi que certaines farines (végétales), fleurs, macérations de farines et macérations de fleurs peuvent être utilisées comme source unique de substances azotées et provoquant la culture pour l'actinomyces griseus , ce qui ne rend plus nécessaire l'emploi de l'hydrolysat de protéine et de l'extrait de viande (et ce qui supprime les inconvénients correspondants), et que la substitution de ces farines, fleurs, macérations de farines ou macérations de fleurs aux composés de peptone (ou tryptone) et d'extrait de viande (ou liqueur à macération de grains) des milieux antérieurement utilisés ne gêne pas le rendement de la préparation du produit antibiotique (mais, en général, augmente matériellement ce rende- ment).
Les farines suivantes (et les fleurs, macérations de farines et macérations de fleurs correspondantes) sont susceptibles d'être utilisées dans la mise en oeuvre pra- tique de l'invention : farines de fèv-es (les farines de soja, la farine de ricin, les fèves de Jack et les fèves de Lima entre autres), la farine d'arachide, la farine de coton et la farine de lin.
Le procédé de mise en oeuvre de l'invention consis- te essentiellement à cultiver l'organisme Actinomyces griseus dans ou sur un liquide d'un milieu nutritif dont la source sensiblement unique de substances azotées et provoquant la culture est constituée par cette farine, fleur, macération de farine ou macération de fleur (par- ticulièrement une farine de fève, une fleur de fèv=e, une macération de farine de fève ou une macération de fleur de fève, notamment de la farine de soja); et les compo- sés obtenus conformément à l'invention comprennent essen- tiellement le produit antibiotique analogue à la strepto- mycmne, fortement actif et obtenu à la suite de cette culture .
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Le produit antibiotique existe à la fois dans le liquide et dans les solides (mycélia, spores et autres solides susceptibles de sédimentation) d'une culture de ce genre; ce. produit peut être récupéré des solides par extraction avec un acide aqueux.
Le liquide de culture contenant le produit antibiotique et/ou l'extrait des solides de la culture peuvent être utili- sés ou être traités à nouveau comme un liquide de culture contenant de la streptomycine; ces liquides peuvent aussi être traités (soit séparément, soit ensemble) pour obtenir sous une forme fortement purifiée ou sensiblement pure, un produit antibiotique analogue à la streptomycine.
L'invention s'applique à la culture de l'organisme Actinomyces griseus dans ou sur un milieu nutritif liquide de ce genre, c'est-à-dire à la fois à une culture immobile et immergée, cette dernière étant préférée parce qu'elle s'adapte plus rapidement et mieux pour une production sur une large échelle.
Les avantages de l'invention peuvent être réalisés quand bien même une autre source ou d'autres sources de substances azotées et/ou provoquant la culture sont introduites dans le milieu (farine, fleur, macération de farine ou macération de fleul). pour autant que ces autres sources se trouvent dans une proportion suffisamment faible pour ne pas gêner l'isolement du produit antibiotique analogue à la streptomy- cine . De préférence, de la farine, de la fleur, une macéra- tion de farine ou macération de fleur de ce genre peut être la source unique de substances azotées et provoquant la cultu- re dans le milieu .
Les termes "farine", "fleur" et "macération" sont utili- sés dans le mémoire dans leur sens accepté communément. Ainsi une "farine" defèv-e est un produit obtenu en broyant gros- sièrement des fèv-es et en éliminant toute l'huile ou une partie de cette huile. (L'huile peut être extraite par trai-
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tement à la presse (c'est-à-dire chassée par écrasement) ou par extraction avec des solvants organiques). Le terme "fleur" désigne un produit obtenu en broyant finement une farine ; et le terme "macération" désigne un extrait aqueux obtenu, par exemple, en chauffant dans l'eau une farine ou uni fleur et en filtrant. Les termes "farine" et "fleur" sont destinés à englober les formes purifiées de ces produits, mais les formes impures sont préférées au point de vue du rendement de la préparation du produit antibiotique.
La proportion de cette farine, fleur, macération de farine ou macération de fleur (sur une base sèche) peut varier entre des limites relativement larges, mais il est avantageux de la choisir à environ 0,5 - 2,5 % du milieu.
Les milieux nutritifs liquides utilisés dans la mise en oeuvre pratique de l'intention doivent, bien entendu, contenir également un sel nutritif et un hydrate de carbone assimilable par l'organisme . Les sels nutritifs utilisa- bles sont représentés par le chlorure de sodium et le sulfate de sodium qui sont les sels préférés) mais il est possible d'utiliser un certain nombre d'autres sels nutritifs conventionnels ou leurs combinaisons (chlorure de sodium plus chlorure de magnésium, et chlorure de sodium plus sulfate de sodium, entre autres) . Dans des conditions analogues, les hydrates de carbonelutilisables sont repré- sentés par le dextrose (qui est le préféré); mais il est possible d'utiliser d'autres hydrates de carbone assimi- lables par l'Actinomyces griseus (l'amidon par exemple).
La proportion de l'hydrate de carbone préféré (dextrose) est avantageusement d'environ 0,5 - 3,0 % du milieu .
Des milieux du genre utilisé pour la préparation,con- formément à l'invention, du produit antibiotique analogue à la streptomycine peuvent avantageusement être employés pour la préparation d'un ensemencement de spores Actinomy- ces griseus . Ainsi, la culture d'Actinomyces griseus sur un milieu solide liquéfiable, dont la source sensiblement
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unique de substances azotées et provoquant la culture est la farine, la fleur, la macération de farine ou la macération de fleur précitée, constitue un excellent ensemencement de spores pour la préparation du produit antibiotique analogue à la streptomycine.
Un milieu de ce genre peut être obtenu, par exemple, en faisant bouillir une suspension aqueuse à 2 % de farine de soja, en filtrant et en ajoutant au filtrat 0,2-1 % de dextro- se , 0,5 % de chlorure de sodium et, si on le désire, 2 % d'agar.
Les exemples qui suivent sont donnés pour illustrer l'invention (l'unité de potentiel mentionnée dérivant de la quantité de streptomycine nécessaire pour provoquer complètement la multiplication de 500-1000 cellules de K. pneumoniae se cultivant dans des conditions standardisées dans un milieu de culture contenant 1 % de tryptose; une unité étant l'équivalent de 1 gamma de base libre de streptomycine ):
EXEMPLE 1
100 ml. d'un milieu aqueux contenant 1,0 % de farine de soja (procédé à la presse), 1,0 % de dextrose (anhydre) , et 0,5 % de chlorure de sodium sont placées dans un flacon d'Erlenmeyer à 500 ml. puis sont stérilisées.
Le milieu stérilisé, dont le pH est 6,2 est ensuite ensemencé avec 0,5 ml. d'une suspension de spores Actinomyces griseus, puis est soumis à une incubation à 24 C dans un appareil à agitation (100 coups par minute). Au bout de six jours, la culture, dont le potentiel est de 265 unités/ml. est cen- trifugée et la portion qui surnage est utilisée ou traitée à nouveau comme un liquide de culture contenant de la strep- tomycine.
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EXEMPLE 2
3. 600 litres d'un milieu aqueux'contenant 1,5 % de farine de soja (procédé à la presse), 1,0 % de dextrose (anhydre) et 0,5 % de chlorure de sodium dans un bac de 6. 000 litres son(stérilisés et ensemencés avec 2 litres d'une suspension de spores Actinomyces griseus ; milieu ensemencé est soumis à une incubation à 25 C sous une pression de 15-25 cm. (de l'air passant à travers le milieu) tout en agitant (à une vitesse de 130 rpm). Au bout de 78 heures d'incubation, la culture, dont le potentiel est de 173 unités/ml., est centrifugée ; portion qui surnage est utilisée ou traitée à nouveau comme un liquide de culture contenant de la streptomycine.
EXEMPLE 3 a) 1.800 litres d'un milieu aqueux contenant 1,5 % de farine de soja, 1,0 % de dextrose et 0,5 % de chlorure de sodium dans un bac de 6. 000 litres sont stérilisés et en- semencés avec un mélange de spores et de mycélium d'Actinomy- ces griseus ; milieu ensemencé est soumis à une incuba- tion à 25 C sous une pression de 50-75 cm. (de l'air passant à travers le milieu) dout en agitant (à une vitesse de 130 rpm). b) Au, bout de 100 heures d'incubation, une portion de 100 ml. de la culture, qui a un potentiel de 27,6 unités/ml., est réglée à un pH de 3,5 en ajoutant 37 % d'acide chlorhy- drique , et la culture acidifiée est agitée pendant 24 heures à 4 C.
La culture, dont le potentiel est élevé, par ce traitement, à 38,6 unités/ml., est centrifugée ; por- tion qui surnage est utilisée ou traitée à nouveau comme un liquide de culture contenant de la streptomycine.
EXEMPLE 3 a) La culture décrite dans l'exemple 3 (a), après une incubation pendant 100 heures et l'élimination de la por-
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tion de 100 ml. mentionnée dans le paragraphe b de l'exem- ple 3 , est centrifugée . (La portion qui surnage est utili- sée ou traitée à nouveau comme un liquide de culture conte- nant de la streptomycine ). Le sédiment est recueilli et est lavé avec deux portions de un litre d'eau distillée par centri. fugation (les lavages ont un potentiel inférieur à 4,5 uni- tés ml., aussi peuvent-ils être écartés).
Au sédiment lavé, est ajouté un litre d'eau distillée, et le mélange est agité pour former une bouillie lourde homogène contenant environ 3,7 mg. de solides par ml. b) Une portion de 50 ml. de la bouillie obtenue dans le paragraphe précédent est réglée à un pH de 2,15 avec de l'acide sulfurique 5-normal, et le mélange est agité à 50 C pendant une heure. Ce mélange est ensuite centrifugé; et la portion claire qui surnage (extrait) , dont le potentiel est/de 96,2 unités/ml. (représentant une récupéra- tion de 25,8,unités/mg. de solides séchés), est utilisée ou traitée à nouveau comme un liquide de culture contenant de la streptomycine.
EXEMPLE 5
Utilisant un milieu aqueux contenant 1,5 % de farine de soja (procédé à la presse), 1,0 % de dextrose (anhydre) et 0,5 % de sulfate de sodium à la place du milieu de l'exemple 1, mais dans les mêmes conditions,on obtient un liquide de culture ayant lemême potentiel de 265 unités/ml.
EXEMPLE 6 ---------
Si l'on utilise un milieu aqueux contenant 1,5 % de farine de soja (procédé à la presse), 0,5 % de dextrose (anhydre ) et 0,5 % de chlorure de sodium à la place du milieu de l'exemple 1, mais dans les mêmes conditions avec cette exception que l'incubation est prolongée pendant 7 jours, le liquide de culture obtenu a un potentiel de 192 unités/ml.
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EXEMPLE 7
100 ml. d'un milieu aqueux (eau distillée) contenant 0,6 % de farine d'arachide, 3,0 % de dextrose (anhydre) et 0,5 % de chlorure de sodium sont placées dans un flacon d'Erlenmeyer de 500 ml. et sont stérilisées. Le milieu stéri- lisé est alors ensemencé avec 5 ml. d'un ensemencement Actinomyces griseus (décrit ci-après) et est soumis à une incubation, à 24-25 C. dans un appareil d'agitation par os- cillations (105-110 oscillations par minute). Au bout de 3 jours, la culture a un potentiel de 137 unités/mai. Au bout de 6 jours, la culture, dont le potentiel est de 216 unités/ml., est centrifugée; et la portion qui surnage est utilisée telle quelle ou est traitée à nouveau comme un liquide de culture contenant de la streptomycine.
Si l'on utilise 0,6 % d'une farine d'arachide obtenue d'une autre source et si l'on procède dans les mêmes conditions, avec cette exception que l'incubation est pro- longée pendante jours ; le liquide de culture obtenu a un potentiel de 310 unités/ml.
L'ensemencement est un mycélium ancien de 48 heures et obtenu en ensemençant 100ml. d'un milieu standard de farine de soja (voir l'exemple I) avec 0,5 ml. d'une sus- pension de spores d'Actinomyces griseus .
EXEMPLE 8
Si l'on utilise 0,6 % de farine de coton à la place de la farine d'arachide de l'exemple 7 et-si l'on procède dans les mêmes conditions, le liquide de culture obtenu à un potentiel de 128 unités/ml .
EXEMPLE 9
Si l'on utilise 0.6 % de farine de lin à la place de la farine d'arachide de l'exemple 7 et si l'on procède dans les mêmes conditions, le liquide de culture obtenu à un po-
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tentiel de 111 unités/ml.
EXEMPLE 10
Si l'on utilise 0,6 % de farine de fève de ricin à la place de la farine d'arachide de l'exemple 7 et si l'on pro- cède dans les mêmes conditions, avec cette exception que l'incubation est prolongée à 7 jours, Le liquide de culture obtenu à un potentiel de 237 unités/ml .
EXEMPLE 11 a) 5000 litres d'un milieu aqueux (eau du robinet) con- tenant 2,25 % de farine de soja, 1,62 % de Cerelose xx hydraté (dextrose), 0,75 % de chlorure de sodium NaCl et 180 gr. de soude NaOH sont placés dans un bac de fermentation en acier au carbone de 6000 litres, ce bac étant équipé avec un agitateur et un purgeur d'air; le bac est stérilisé pendant une heure à 120 c. Lorsque la température atteint 25 C, 225 litres d'un ensemencement d'Actinomyces griseus (décrit ci-après) sont ajoutés; le milieu ensemencé est soumis à une incubation à 25 C sous une pression de 15-30 cm.
(de l'air passant à travers le milieu) tout en agitant ( à une vitesse de 120 rpm). Pendant l'incubation, 5,6 litres d'une solution à 3 % d'octadecanol dans de l'huile de sain- doux sont ajoutés goutte à goutte comme agent anti-moussants.
L'ensemencement est constitué par un mycélium ancien de 50 heures et obtenu avec un milieu standard de farine de soja (voir l'exemple 1) dans un bac d'acier au carbone de 450 litres, en stérilisant en ensemençant avec une suspension de spores d'Actinomyces griseus et en soumettant à une incu- bation dans les conditions décrites dans le paragraphe précé- dent. b) Au bout de 89 heures d'incubation, un potentiel de 195 unités/ml. est atteint dans la culture, dont le pH est de 6,7 ;le pH est réglé à xx 1,5 avec de l'acide sulfurique concentré, et l'on ajoute 2 % de Celite n 503 et
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de 0,5 % de Darco G-60 , comme auxiliaires/filtration; le mélange est alors filtré à travers un filtre-presse .
Le filtrat, qui a un potentiel de 230 unités/ml., est utilisé tel.quel ou est traité à nouveau comme un liquide de culture contenant de la streptomycine .
L'inventian peut recevoir diverses variantes de mise en oeuvre du procédé décrit sans sortir du cadre de l'invention.
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Ministry of Economic Affairs and Middle Classes KINGDOM OF BELGIUM
General Directorate of Industry and Commerce ¯J'j
Commerce Administration
Industrial and Commercial Property Service
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N '...... 480 ... 602 .......
THE MINISTER OF ECONOMIC AFFAIRS AND MIDDLE CLASSES,
Considering the decree-law of July 8, 1946, extending, because of the events of war, the deadlines in matters of industrial property and the duration of patents for invention;
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Seen the law of 31 tot'CC111ble. , bearing the approval due the Arrangomont conoGrnant la i: .. ::. , -ii:., or the rootaumtion doc.droite of industrial property reached by the second world war, signed at NouM4e) r- on February 8, 1047. / Considering the law of March 30, 1948, modifying the decree-law of July 8, 1946, extending, because of the events of war, the deadlines in matters of industrial property and the duration of patents for inventions.
Reviewed the ministerial decree of 15-3-48, issuing under the N 480.602, to E.R. Squibb & Sons. a patent for: Process for the preparation of antibiotic products
STOPPED :
ARTICLE 1.- The following recitals are inserted in ministerial decree N 480.602 of March 15, 1948, after the recital "Considering the law of May 24, 1854 on patents for inventions,":
Considering the decree-law of July 8, 1946, extending due to the events of war, the deadlines in industrial property and the duration of patents, modified by the law of March 30, 1948; Having regard to the Union Convention for the Protection of Industrial Property; ART. 2. - This decree will be annexed to the ministerial decree referred to in article 1.
Brussels, January 11, 1949.
IN THE NAME OF THE MINISTER:
The delegated official,
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"Process For the preparation of antibiotic products"
The invention relates to a process for the preparation of antibiotic products.
It has already been established that:
1 - A product with antibiotic power, streptomycin, exists in a culture liquid obtained when the organism Actinomyces griseus is cultivated in contact with (that is to say in or on) certain liquid media;
2 - The composition of the medium in which the organism is cultivated is of considerable importance in the production of the antibiotic product;
3 - The presence of peptone (or another protein hydrolyzate, such as tryptone) and a specific substance causing the culture and provided by an extract
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of meat (or a grain-based liquor) is required for the production of the antibiotic product (Schatz, Bugie and Waksman, Proc. Soc. Exp. Biol. and Med., 1944, 55; 66).
However, it has been established in practice that the protein hydrolyzate (or certain constituents of this compound) and / or the meat extract make it difficult to isolate the antibiotic product, and that the use of media. containing these compounds is undesirable for this reason as well as for other reasons. It has been established that by using the grain maceration liquor as the substantially sole source of nitrogen compounds and inducing the culture of the medium, virtually no antibiotic product is formed.
The object of the invention is to prepare a strongly active streptomycin-like antibiotic product and to indicate methods for the preparation of this product; another object of the invention is to improve the processes for the preparation of an antibiotic product.
(Although the nature of the medium in which an organism is cultivated may qualitatively affect the antibiotic product prepared, and a different medium will be used in the practice of practicing the invention, it is possible that the antibiotic product prepared according to the invention differs qualitatively from streptomycin prepared by Schatz & others (work cited above). Hence, the antibiotic product prepared according to the invention is referred to herein as "streptomycin-like", although it may in fact be streptomycin or a derivative thereof.
In addition, although the antibiotic product prepared according to the invention is mentioned in the singular, it should of course be understood that it may comprise more than one component).
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It has been established that certain (vegetable) flours, flowers, flour macerations and flower macerations can be used as the sole source of nitrogenous substances and inducing cultivation for actinomyces griseus, which no longer necessitates the use of l hydrolyzate of protein and meat extract (and this eliminates the corresponding drawbacks), and that the substitution of these flours, flowers, macerations of flour or macerations of flowers for the compounds of peptone (or tryptone) and of extract of meat (or liquor for maceration of grains) of the media previously used does not hinder the yield of the preparation of the antibiotic product (but, in general, materially increases this yield).
The following flours (and the flowers, macerations of flour and macerations of corresponding flowers) are likely to be used in the practical implementation of the invention: bean flours (soybean flour, castor, Jack beans and Lima beans among others), peanut flour, cottonseed flour and flax flour.
The method of carrying out the invention essentially consists in cultivating the organism Actinomyces griseus in or on a liquid of a nutrient medium, the substantially sole source of nitrogenous substances and causing the culture is constituted by this flour, flower. , flour maceration or flower maceration (particularly broad bean flour, broad bean flower, maceration of broad bean flour or maceration of broad bean flower, in particular soybean flour); and the compounds obtained according to the invention essentially comprise the strongly active streptomycin-like antibiotic product obtained as a result of this culture.
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The antibiotic product exists both in the liquid and in the solids (mycelia, spores and other solids susceptible to sedimentation) of a culture of this kind; this. product can be recovered from the solids by extraction with aqueous acid.
The culture fluid containing the antibiotic product and / or the extract of the culture solids can be used or re-treated as a culture fluid containing streptomycin; these fluids can also be processed (either separately or together) to obtain in highly purified or substantially pure form a streptomycin-like antibiotic product.
The invention is applicable to the culture of the organism Actinomyces griseus in or on a liquid nutrient medium of this kind, that is to say both to a still and immersed culture, the latter being preferred because it adapts faster and better for large-scale production.
The advantages of the invention can be realized even if another source or other sources of nitrogenous substances and / or causing the culture are introduced into the medium (flour, flower, maceration of flour or maceration of fleul). provided that these other sources are in a sufficiently low proportion so as not to interfere with the isolation of the streptomycin-like antibiotic product. Preferably, flour, flower, flour maceration or such flower maceration can be the sole source of nitrogenous substances and inducing cultivation in the medium.
The terms "flour", "flower" and "maceration" are used in the specification in their commonly accepted meaning. Thus a defèv-e "flour" is a product obtained by coarsely grinding beans and removing all or part of this oil. (The oil can be extracted by processing
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tement with the press (that is to say driven out by crushing) or by extraction with organic solvents). The term "flower" denotes a product obtained by finely grinding a flour; and the term "maceration" denotes an aqueous extract obtained, for example, by heating a flour or flower in water and filtering. The terms "flour" and "flower" are intended to encompass the purified forms of these products, but the impure forms are preferred from the viewpoint of the efficiency of the preparation of the antibiotic product.
The proportion of this flour, flower, flour maceration or flower maceration (on a dry basis) can vary between relatively wide limits, but it is advantageous to choose it at about 0.5 - 2.5% of the medium.
The liquid nutrient media used in the practical implementation of the intention must, of course, also contain a nutrient salt and a carbohydrate which can be absorbed by the body. The nutrient salts which can be used are represented by sodium chloride and sodium sulphate which are the preferred salts) but it is possible to use a number of other conventional nutrient salts or their combinations (sodium chloride plus sodium chloride. magnesium, and sodium chloride plus sodium sulfate, among others). Under analogous conditions, the usable carbohydrates are represented by dextrose (which is preferred); but it is possible to use other carbohydrates assimilable by Actinomyces griseus (starch for example).
The proportion of the preferred carbohydrate (dextrose) is preferably about 0.5 - 3.0% of the medium.
Media of the kind used for the preparation, according to the invention, of the streptomycin-like antibiotic product can advantageously be employed for the preparation of an Actinomyces griseus spore seeding. Thus, the culture of Actinomyces griseus on a liquefiable solid medium, the source of which substantially
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unique of nitrogenous substances and causing cultivation is the aforementioned flour, flower, flour maceration or flower maceration, is an excellent spore seeding for the preparation of the streptomycin-like antibiotic product.
Such a medium can be obtained, for example, by boiling a 2% aqueous suspension of soybean meal, filtering and adding to the filtrate 0.2-1% dextrose, 0.5% chloride. sodium and, if desired, 2% agar.
The following examples are given to illustrate the invention (the mentioned unit of potential deriving from the amount of streptomycin necessary to completely induce the multiplication of 500-1000 K. pneumoniae cells growing under standardized conditions in a culture medium containing 1% tryptose; one unit being the equivalent of 1 gamma of streptomycin free base):
EXAMPLE 1
100 ml. an aqueous medium containing 1.0% soybean meal (press process), 1.0% dextrose (anhydrous), and 0.5% sodium chloride are placed in a 500 Erlenmeyer flask ml. then are sterilized.
The sterilized medium, the pH of which is 6.2, is then inoculated with 0.5 ml. of a suspension of Actinomyces griseus spores, then is subjected to incubation at 24 ° C. in a shaking apparatus (100 strokes per minute). After six days, culture, the potential of which is 265 units / ml. is centrifuged and the supernatant portion is used or treated again as a culture fluid containing streptomycin.
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EXAMPLE 2
3,600 liters of an aqueous medium containing 1.5% soybean meal (press process), 1.0% dextrose (anhydrous) and 0.5% sodium chloride in a bin of 6. 000 liters bran (sterilized and inoculated with 2 liters of an Actinomyces griseus spore suspension; inoculated medium is incubated at 25 C under a pressure of 15-25 cm. (Air passing through the medium) while with stirring (at a speed of 130 rpm). After 78 hours of incubation, the culture, whose potential is 173 units / ml., is centrifuged; the portion which supernates is used or treated again as a liquid of culture containing streptomycin.
EXAMPLE 3 a) 1,800 liters of an aqueous medium containing 1.5% soybean meal, 1.0% dextrose and 0.5% sodium chloride in a 6,000 liter tank are sterilized and seeded. with a mixture of spores and mycelium of Actinomyces griseus; inoculated medium is incubated at 25 ° C. under a pressure of 50-75 cm. (air passing through the medium) doubt while stirring (at a speed of 130 rpm). b) After 100 hours of incubation, a portion of 100 ml. The culture, which has a potential of 27.6 units / ml., is adjusted to pH 3.5 by adding 37% hydrochloric acid, and the acidified culture is stirred for 24 hours at 4 ° C.
The culture, the potential of which is high, by this treatment, to 38.6 units / ml., Is centrifuged; The supernatant portion is used or reprocessed as a culture fluid containing streptomycin.
EXAMPLE 3 a) The culture described in Example 3 (a), after incubation for 100 hours and removal of the por-
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tion of 100 ml. mentioned in paragraph b of Example 3, is centrifuged. (The portion which floats is used or treated again as a culture liquid containing streptomycin). The sediment is collected and washed with two one-liter portions of centri distilled water. fugation (washes have a potential of less than 4.5 ml units, so they can be discarded).
To the washed sediment is added one liter of distilled water, and the mixture is stirred to form a homogeneous heavy slurry containing about 3.7 mg. solids per ml. b) A portion of 50 ml. of the slurry obtained in the previous paragraph is adjusted to a pH of 2.15 with 5-normal sulfuric acid, and the mixture is stirred at 50 C for one hour. This mixture is then centrifuged; and the clear portion which floats (extract), the potential of which is / 96.2 units / ml. (representing a recovery of 25.8 units / mg of dried solids), is used or re-treated as a culture liquid containing streptomycin.
EXAMPLE 5
Using an aqueous medium containing 1.5% soybean meal (press process), 1.0% dextrose (anhydrous) and 0.5% sodium sulfate in place of the medium from Example 1, but under the same conditions, a culture liquid having the same potential of 265 units / ml is obtained.
EXAMPLE 6 ---------
If an aqueous medium containing 1.5% soybean meal (press process), 0.5% dextrose (anhydrous) and 0.5% sodium chloride is used instead of the medium of the Example 1, but under the same conditions with the exception that the incubation is prolonged for 7 days, the culture liquid obtained has a potential of 192 units / ml.
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EXAMPLE 7
100 ml. an aqueous medium (distilled water) containing 0.6% peanut flour, 3.0% dextrose (anhydrous) and 0.5% sodium chloride are placed in a 500 ml Erlenmeyer flask. and are sterilized. The sterilized medium is then inoculated with 5 ml. of an Actinomyces griseus seed (described below) and is incubated at 24-25 ° C. in an oscillating shaker (105-110 oscillations per minute). After 3 days the culture has a potential of 137 units / May. After 6 days, the culture, the potential of which is 216 units / ml., Is centrifuged; and the supernatant portion is used as is or is treated again as a culture fluid containing streptomycin.
If 0.6% of a groundnut flour obtained from another source is used and if the procedure is carried out under the same conditions, with the exception that the incubation is prolonged for days; the culture liquid obtained has a potential of 310 units / ml.
Seeding is a 48-hour old mycelium obtained by sowing 100ml. of a standard soybean flour medium (see Example I) with 0.5 ml. of a spore suspension of Actinomyces griseus.
EXAMPLE 8
If 0.6% cotton flour is used instead of the peanut flour of Example 7 and if the same conditions are used, the culture liquid obtained has a potential of 128 units. / ml.
EXAMPLE 9
If 0.6% flax flour is used instead of the peanut flour of Example 7 and if the same conditions are used, the culture liquid obtained has a po-
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tential of 111 units / ml.
EXAMPLE 10
If 0.6% castor bean flour is used instead of the peanut flour of Example 7 and if the procedure is carried out under the same conditions, with the exception that the incubation is extended to 7 days, The culture liquid obtained at a potential of 237 units / ml.
EXAMPLE 11 a) 5000 liters of an aqueous medium (tap water) containing 2.25% soybean meal, 1.62% Cerelose xx hydrate (dextrose), 0.75% sodium chloride NaCl and 180 gr. sodium hydroxide NaOH are placed in a 6,000-liter carbon steel fermentation tank, this tank being equipped with an agitator and an air vent; the tank is sterilized for one hour at 120 c. When the temperature reaches 25 ° C., 225 liters of an Actinomyces griseus seed (described below) are added; the seeded medium is incubated at 25 ° C. under a pressure of 15-30 cm.
(air passing through the medium) while stirring (at a speed of 120 rpm). During the incubation, 5.6 liters of a 3% solution of octadecanol in santar oil is added dropwise as an anti-foaming agent.
The inoculation consists of a 50-hour old mycelium obtained with a standard soybean flour medium (see example 1) in a 450-liter carbon steel tank, sterilizing by inoculating with a suspension of spores of Actinomyces griseus and incubating under the conditions described in the previous paragraph. b) After 89 hours of incubation, a potential of 195 units / ml. is reached in the culture, the pH of which is 6.7; the pH is adjusted to xx 1.5 with concentrated sulfuric acid, and 2% Celite n 503 is added and
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0.5% Darco G-60, as auxiliaries / filtration; the mixture is then filtered through a filter press.
The filtrate, which has a potential of 230 units / ml., Is used as is or is treated again as a culture liquid containing streptomycin.
The inventian can receive various implementation variants of the method described without departing from the scope of the invention.