<Desc/Clms Page number 1>
MinistèredesAffaires Economiques etdes ClassesMoyennes ROYAUME D E BELGIQUE
DirectionGénérale del'IndustrieetduCommerce ¯J'j
Administration du Commerce
Servicedela PropriétéIndustrielleetCommerciale
EMI1.1
N' ......480...602.......
LE MINISTRE DES AFFAIRES ECONOMIQUES ET DES CLASSES MOYENNES,
Vu l'arrêté-loi du 8 juillet 1946, prorogeant, en raison des événements de guerre, les délais en matière de propriété industrielle et la durée des brevets d'invention;
EMI1.2
Vu là loi du 31 àt'CC111ble. , portant approbation dû l'Arrangomont conoGrnant la i:..::. ,-ii:., ou la rootaumtion doc.droite do propriété induotriclle atteinte par la deuxième guerre mondiale, signe à NouM4e)r- le 8 février 1047. / Vu la loi du 30 mars 1948, portant modification à l'arrêté-loi dù 8juillet1946,prorogeant,en raison des événements de guerre, les délais en matière de propriété industrielle et la durée des brevets d'invention.
Revu l'arrêté ministériel du 15-3-48 , délivrant sous le N 480.602 ,àE.R. Squibb & Sons. un brevet d'invention pour : Procédé pour la préparation de pro- duits antibiotiques
ARRETE :
ARTICLE PREMIER.- Les considérants suivants sont insérés dans l'arrêté ministériel N 480.602 du 15 mars 1948 , après le considérant " Vu la loi du 24 mai 1854 sur les brevets d'inven- tion,, :
Vu l'arrêté-loi du 8 juillet 1946, prorogeant en raison des événements de guerre, les délais 'en matière de propriété industrielle et la durée des brevets d'invention, modifié par la loi du 30 mars 1948; Vu la Convention d'Union pour la Protection de la Propriété Industrielle; ART. 2. - Le présent arrêté sera annexé à l'arrêté ministériel visé à l'article premier.
Bruxelles, le 11 janvier 1949.
AU NOM DU MINISTRE :
Le Fonctionnaire délégué,
<Desc/Clms Page number 2>
" Procédé Pour la préparation de produits antibiotiques "
L'invention a trait à un procédé pour la préparation de produits antibiotiques.
Il a déjà été établi que :
1 - Un produit à pouvoir antibiotique, de la strepto- mycine, existe dans un liquide de culture obtenu lorsque l'organisme Actinomyces griseus est cultivé en contact avec (c'est-à-dire dans ou sur) certains milieux liquides;
2 - La composition du milieu dans lequel est cultivé l'organisme a une importance considérable dans la produc- tion du produit antibiotique ;
3 - La présence de peptone (ou d'un autre hydroly- sat de protéine, tel que la tryptone) et d'une substance spécifique provoquant la culture et fournie par un extrait
<Desc/Clms Page number 3>
de viande (ou une liqueur à mcération de grains) est nécessaire pour la production du produit antibiotique (Schatz, Bugie et Waksman, Proc. Soc. Exp. Biol. and Med., 1944, 55; 66).
Cependant, il a été établi, dans la pratique que l'hydrolysat de protéine (ou certains constituants de ce composé) et/ou l'extrait de viande rendent difficile l'iso- lement du produit antibiotique, et que l'emploi de milieux contenant ces composés est indésirable pour cette ra&son, également comme pour d'autres raisons. Il a été @ établi qu'en utilisant la liqueur à macération de grains comme source sensiblement unique de composés azotés et provoquant la culture du milieu, il ne se forme pratiquement aucun produit antibiotique .
L'invention a pour objet de préparer un produit anti- biotique analogue à la streptomycine et fortement actif et d'indiquer des procédés pour la préparation de ce pro- duit; un autre objet de l'invention réside dans l'améliora- tion des procédés pour la préparation d'un produit antibio- tique .
(Bien que la nature du milieu dans lequel est cultivé un organisme puisse affecter qualitativement le produit antibiotique préparé, et qu'un milieu différent soit utili- sé dans la pratiquee la mise en oeuvre de l'invention, il est possible que le produit antibiotique préparé conformé- ment à l'invention diffère qualitativement de la strepto- mycine préparée par Schatz & autres (ouvrage cité ci- dessus). Par suite, le produit antibiotique préparé con- formément à l'invention est désigné, dans le mémoire, comme "analogue à la streptomycine", même s'il peut être, en fait, de la streptomycine ou un dérivé de celle-ci.
De plus, bien que le produit antibiotique préparé conformé- ment à l'invention, soit mentionné au singulier, il doit être bien entendu quil peut comprendre plus qu'un compo- se).
<Desc/Clms Page number 4>
Il a été établi que certaines farines (végétales), fleurs, macérations de farines et macérations de fleurs peuvent être utilisées comme source unique de substances azotées et provoquant la culture pour l'actinomyces griseus , ce qui ne rend plus nécessaire l'emploi de l'hydrolysat de protéine et de l'extrait de viande (et ce qui supprime les inconvénients correspondants), et que la substitution de ces farines, fleurs, macérations de farines ou macérations de fleurs aux composés de peptone (ou tryptone) et d'extrait de viande (ou liqueur à macération de grains) des milieux antérieurement utilisés ne gêne pas le rendement de la préparation du produit antibiotique (mais, en général, augmente matériellement ce rende- ment).
Les farines suivantes (et les fleurs, macérations de farines et macérations de fleurs correspondantes) sont susceptibles d'être utilisées dans la mise en oeuvre pra- tique de l'invention : farines de fèv-es (les farines de soja, la farine de ricin, les fèves de Jack et les fèves de Lima entre autres), la farine d'arachide, la farine de coton et la farine de lin.
Le procédé de mise en oeuvre de l'invention consis- te essentiellement à cultiver l'organisme Actinomyces griseus dans ou sur un liquide d'un milieu nutritif dont la source sensiblement unique de substances azotées et provoquant la culture est constituée par cette farine, fleur, macération de farine ou macération de fleur (par- ticulièrement une farine de fève, une fleur de fèv=e, une macération de farine de fève ou une macération de fleur de fève, notamment de la farine de soja); et les compo- sés obtenus conformément à l'invention comprennent essen- tiellement le produit antibiotique analogue à la strepto- mycmne, fortement actif et obtenu à la suite de cette culture .
<Desc/Clms Page number 5>
Le produit antibiotique existe à la fois dans le liquide et dans les solides (mycélia, spores et autres solides susceptibles de sédimentation) d'une culture de ce genre; ce. produit peut être récupéré des solides par extraction avec un acide aqueux.
Le liquide de culture contenant le produit antibiotique et/ou l'extrait des solides de la culture peuvent être utili- sés ou être traités à nouveau comme un liquide de culture contenant de la streptomycine; ces liquides peuvent aussi être traités (soit séparément, soit ensemble) pour obtenir sous une forme fortement purifiée ou sensiblement pure, un produit antibiotique analogue à la streptomycine.
L'invention s'applique à la culture de l'organisme Actinomyces griseus dans ou sur un milieu nutritif liquide de ce genre, c'est-à-dire à la fois à une culture immobile et immergée, cette dernière étant préférée parce qu'elle s'adapte plus rapidement et mieux pour une production sur une large échelle.
Les avantages de l'invention peuvent être réalisés quand bien même une autre source ou d'autres sources de substances azotées et/ou provoquant la culture sont introduites dans le milieu (farine, fleur, macération de farine ou macération de fleul). pour autant que ces autres sources se trouvent dans une proportion suffisamment faible pour ne pas gêner l'isolement du produit antibiotique analogue à la streptomy- cine . De préférence, de la farine, de la fleur, une macéra- tion de farine ou macération de fleur de ce genre peut être la source unique de substances azotées et provoquant la cultu- re dans le milieu .
Les termes "farine", "fleur" et "macération" sont utili- sés dans le mémoire dans leur sens accepté communément. Ainsi une "farine" defèv-e est un produit obtenu en broyant gros- sièrement des fèv-es et en éliminant toute l'huile ou une partie de cette huile. (L'huile peut être extraite par trai-
<Desc/Clms Page number 6>
tement à la presse (c'est-à-dire chassée par écrasement) ou par extraction avec des solvants organiques). Le terme "fleur" désigne un produit obtenu en broyant finement une farine ; et le terme "macération" désigne un extrait aqueux obtenu, par exemple, en chauffant dans l'eau une farine ou uni fleur et en filtrant. Les termes "farine" et "fleur" sont destinés à englober les formes purifiées de ces produits, mais les formes impures sont préférées au point de vue du rendement de la préparation du produit antibiotique.
La proportion de cette farine, fleur, macération de farine ou macération de fleur (sur une base sèche) peut varier entre des limites relativement larges, mais il est avantageux de la choisir à environ 0,5 - 2,5 % du milieu.
Les milieux nutritifs liquides utilisés dans la mise en oeuvre pratique de l'intention doivent, bien entendu, contenir également un sel nutritif et un hydrate de carbone assimilable par l'organisme . Les sels nutritifs utilisa- bles sont représentés par le chlorure de sodium et le sulfate de sodium qui sont les sels préférés) mais il est possible d'utiliser un certain nombre d'autres sels nutritifs conventionnels ou leurs combinaisons (chlorure de sodium plus chlorure de magnésium, et chlorure de sodium plus sulfate de sodium, entre autres) . Dans des conditions analogues, les hydrates de carbonelutilisables sont repré- sentés par le dextrose (qui est le préféré); mais il est possible d'utiliser d'autres hydrates de carbone assimi- lables par l'Actinomyces griseus (l'amidon par exemple).
La proportion de l'hydrate de carbone préféré (dextrose) est avantageusement d'environ 0,5 - 3,0 % du milieu .
Des milieux du genre utilisé pour la préparation,con- formément à l'invention, du produit antibiotique analogue à la streptomycine peuvent avantageusement être employés pour la préparation d'un ensemencement de spores Actinomy- ces griseus . Ainsi, la culture d'Actinomyces griseus sur un milieu solide liquéfiable, dont la source sensiblement
<Desc/Clms Page number 7>
unique de substances azotées et provoquant la culture est la farine, la fleur, la macération de farine ou la macération de fleur précitée, constitue un excellent ensemencement de spores pour la préparation du produit antibiotique analogue à la streptomycine.
Un milieu de ce genre peut être obtenu, par exemple, en faisant bouillir une suspension aqueuse à 2 % de farine de soja, en filtrant et en ajoutant au filtrat 0,2-1 % de dextro- se , 0,5 % de chlorure de sodium et, si on le désire, 2 % d'agar.
Les exemples qui suivent sont donnés pour illustrer l'invention (l'unité de potentiel mentionnée dérivant de la quantité de streptomycine nécessaire pour provoquer complètement la multiplication de 500-1000 cellules de K. pneumoniae se cultivant dans des conditions standardisées dans un milieu de culture contenant 1 % de tryptose; une unité étant l'équivalent de 1 gamma de base libre de streptomycine ):
EXEMPLE 1
100 ml. d'un milieu aqueux contenant 1,0 % de farine de soja (procédé à la presse), 1,0 % de dextrose (anhydre) , et 0,5 % de chlorure de sodium sont placées dans un flacon d'Erlenmeyer à 500 ml. puis sont stérilisées.
Le milieu stérilisé, dont le pH est 6,2 est ensuite ensemencé avec 0,5 ml. d'une suspension de spores Actinomyces griseus, puis est soumis à une incubation à 24 C dans un appareil à agitation (100 coups par minute). Au bout de six jours, la culture, dont le potentiel est de 265 unités/ml. est cen- trifugée et la portion qui surnage est utilisée ou traitée à nouveau comme un liquide de culture contenant de la strep- tomycine.
<Desc/Clms Page number 8>
EXEMPLE 2
3. 600 litres d'un milieu aqueux'contenant 1,5 % de farine de soja (procédé à la presse), 1,0 % de dextrose (anhydre) et 0,5 % de chlorure de sodium dans un bac de 6. 000 litres son(stérilisés et ensemencés avec 2 litres d'une suspension de spores Actinomyces griseus ; milieu ensemencé est soumis à une incubation à 25 C sous une pression de 15-25 cm. (de l'air passant à travers le milieu) tout en agitant (à une vitesse de 130 rpm). Au bout de 78 heures d'incubation, la culture, dont le potentiel est de 173 unités/ml., est centrifugée ; portion qui surnage est utilisée ou traitée à nouveau comme un liquide de culture contenant de la streptomycine.
EXEMPLE 3 a) 1.800 litres d'un milieu aqueux contenant 1,5 % de farine de soja, 1,0 % de dextrose et 0,5 % de chlorure de sodium dans un bac de 6. 000 litres sont stérilisés et en- semencés avec un mélange de spores et de mycélium d'Actinomy- ces griseus ; milieu ensemencé est soumis à une incuba- tion à 25 C sous une pression de 50-75 cm. (de l'air passant à travers le milieu) dout en agitant (à une vitesse de 130 rpm). b) Au, bout de 100 heures d'incubation, une portion de 100 ml. de la culture, qui a un potentiel de 27,6 unités/ml., est réglée à un pH de 3,5 en ajoutant 37 % d'acide chlorhy- drique , et la culture acidifiée est agitée pendant 24 heures à 4 C.
La culture, dont le potentiel est élevé, par ce traitement, à 38,6 unités/ml., est centrifugée ; por- tion qui surnage est utilisée ou traitée à nouveau comme un liquide de culture contenant de la streptomycine.
EXEMPLE 3 a) La culture décrite dans l'exemple 3 (a), après une incubation pendant 100 heures et l'élimination de la por-
<Desc/Clms Page number 9>
tion de 100 ml. mentionnée dans le paragraphe b de l'exem- ple 3 , est centrifugée . (La portion qui surnage est utili- sée ou traitée à nouveau comme un liquide de culture conte- nant de la streptomycine ). Le sédiment est recueilli et est lavé avec deux portions de un litre d'eau distillée par centri. fugation (les lavages ont un potentiel inférieur à 4,5 uni- tés ml., aussi peuvent-ils être écartés).
Au sédiment lavé, est ajouté un litre d'eau distillée, et le mélange est agité pour former une bouillie lourde homogène contenant environ 3,7 mg. de solides par ml. b) Une portion de 50 ml. de la bouillie obtenue dans le paragraphe précédent est réglée à un pH de 2,15 avec de l'acide sulfurique 5-normal, et le mélange est agité à 50 C pendant une heure. Ce mélange est ensuite centrifugé; et la portion claire qui surnage (extrait) , dont le potentiel est/de 96,2 unités/ml. (représentant une récupéra- tion de 25,8,unités/mg. de solides séchés), est utilisée ou traitée à nouveau comme un liquide de culture contenant de la streptomycine.
EXEMPLE 5
Utilisant un milieu aqueux contenant 1,5 % de farine de soja (procédé à la presse), 1,0 % de dextrose (anhydre) et 0,5 % de sulfate de sodium à la place du milieu de l'exemple 1, mais dans les mêmes conditions,on obtient un liquide de culture ayant lemême potentiel de 265 unités/ml.
EXEMPLE 6 ---------
Si l'on utilise un milieu aqueux contenant 1,5 % de farine de soja (procédé à la presse), 0,5 % de dextrose (anhydre ) et 0,5 % de chlorure de sodium à la place du milieu de l'exemple 1, mais dans les mêmes conditions avec cette exception que l'incubation est prolongée pendant 7 jours, le liquide de culture obtenu a un potentiel de 192 unités/ml.
<Desc/Clms Page number 10>
EXEMPLE 7
100 ml. d'un milieu aqueux (eau distillée) contenant 0,6 % de farine d'arachide, 3,0 % de dextrose (anhydre) et 0,5 % de chlorure de sodium sont placées dans un flacon d'Erlenmeyer de 500 ml. et sont stérilisées. Le milieu stéri- lisé est alors ensemencé avec 5 ml. d'un ensemencement Actinomyces griseus (décrit ci-après) et est soumis à une incubation, à 24-25 C. dans un appareil d'agitation par os- cillations (105-110 oscillations par minute). Au bout de 3 jours, la culture a un potentiel de 137 unités/mai. Au bout de 6 jours, la culture, dont le potentiel est de 216 unités/ml., est centrifugée; et la portion qui surnage est utilisée telle quelle ou est traitée à nouveau comme un liquide de culture contenant de la streptomycine.
Si l'on utilise 0,6 % d'une farine d'arachide obtenue d'une autre source et si l'on procède dans les mêmes conditions, avec cette exception que l'incubation est pro- longée pendante jours ; le liquide de culture obtenu a un potentiel de 310 unités/ml.
L'ensemencement est un mycélium ancien de 48 heures et obtenu en ensemençant 100ml. d'un milieu standard de farine de soja (voir l'exemple I) avec 0,5 ml. d'une sus- pension de spores d'Actinomyces griseus .
EXEMPLE 8
Si l'on utilise 0,6 % de farine de coton à la place de la farine d'arachide de l'exemple 7 et-si l'on procède dans les mêmes conditions, le liquide de culture obtenu à un potentiel de 128 unités/ml .
EXEMPLE 9
Si l'on utilise 0.6 % de farine de lin à la place de la farine d'arachide de l'exemple 7 et si l'on procède dans les mêmes conditions, le liquide de culture obtenu à un po-
<Desc/Clms Page number 11>
tentiel de 111 unités/ml.
EXEMPLE 10
Si l'on utilise 0,6 % de farine de fève de ricin à la place de la farine d'arachide de l'exemple 7 et si l'on pro- cède dans les mêmes conditions, avec cette exception que l'incubation est prolongée à 7 jours, Le liquide de culture obtenu à un potentiel de 237 unités/ml .
EXEMPLE 11 a) 5000 litres d'un milieu aqueux (eau du robinet) con- tenant 2,25 % de farine de soja, 1,62 % de Cerelose xx hydraté (dextrose), 0,75 % de chlorure de sodium NaCl et 180 gr. de soude NaOH sont placés dans un bac de fermentation en acier au carbone de 6000 litres, ce bac étant équipé avec un agitateur et un purgeur d'air; le bac est stérilisé pendant une heure à 120 c. Lorsque la température atteint 25 C, 225 litres d'un ensemencement d'Actinomyces griseus (décrit ci-après) sont ajoutés; le milieu ensemencé est soumis à une incubation à 25 C sous une pression de 15-30 cm.
(de l'air passant à travers le milieu) tout en agitant ( à une vitesse de 120 rpm). Pendant l'incubation, 5,6 litres d'une solution à 3 % d'octadecanol dans de l'huile de sain- doux sont ajoutés goutte à goutte comme agent anti-moussants.
L'ensemencement est constitué par un mycélium ancien de 50 heures et obtenu avec un milieu standard de farine de soja (voir l'exemple 1) dans un bac d'acier au carbone de 450 litres, en stérilisant en ensemençant avec une suspension de spores d'Actinomyces griseus et en soumettant à une incu- bation dans les conditions décrites dans le paragraphe précé- dent. b) Au bout de 89 heures d'incubation, un potentiel de 195 unités/ml. est atteint dans la culture, dont le pH est de 6,7 ;le pH est réglé à xx 1,5 avec de l'acide sulfurique concentré, et l'on ajoute 2 % de Celite n 503 et
<Desc/Clms Page number 12>
de 0,5 % de Darco G-60 , comme auxiliaires/filtration; le mélange est alors filtré à travers un filtre-presse .
Le filtrat, qui a un potentiel de 230 unités/ml., est utilisé tel.quel ou est traité à nouveau comme un liquide de culture contenant de la streptomycine .
L'inventian peut recevoir diverses variantes de mise en oeuvre du procédé décrit sans sortir du cadre de l'invention.