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PROCEDE DE FABRICATION DE PREPARATIONS A BASE DEVOIE PRIORITE:
La présente invention est relative à l'accroissement de l'efficacité des extraits de foie par digestion avec la papa- ine et vise à augmenter l'utilité du foie en vue de la fabri- cation de produits utiles dans le traitement de l'anémie per- nicieuse et des états connexes, ainsi qu'à fabriquer, à par- tir de tels produits, des concentrés destinés à être adminis- trés par la voie parentérale et/ou par la bouche.
On sait (voir la demande de brevet belge déposée le et ayant pour titre: "procédé pour ex- traire du foie les principes actifset éléments nutritifs qu'il contient et produit en résultant", que l'action de la papa±ne sur le foie émincé, dans les conditions spécifiées dans la demande susdite, amplifie d'une façon marquée la pro-
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priété que possède le foie entier non fractionné de lutter contre l'anémie pernicieuse, c'est-à-dire augmente son effi- cacité en tant qu'agent "anti-anémique".
Toutefois, jusqu'à ce jour on n'a pas déterminé celle des fractions du foie entier ou émincé dont l'efficacité est amplifiée par l'action de la papaïne, et il est difficile de préparer un produit purifié à un degré élevé .satisfaisant et propre à permettre à la matière obtenue conformément à ladite demande d'être administrée par la voie parentérale.
La présente invention envisage la fabrication d'une sé- rie de préparations à base de foie destinées à être adminis- trées par la bouche dans le traitement de l'anémie pernici- euse, de l'anémie mégalocytique réfractaire, de l'anémie mé- galocytique de la nutrition et des états connexes ; que d'une série de préparations à base de foie destinées à être administrées par la voie parentérale, principalement pour le traitement de l'anémie pernicieuse, quoiqu'elles soient aussi utiles dans le traitement d'autres anémies mégalocytiques.
D'une façon générale, l'invention consiste à soumettre une fraction de foie entier à l'action de la papaïne. Le pro- duit résultant peut être sèché ou partiellement concentré par l'élimination d'eau (de préférence à basse température, par exemple de l'ordre de 45 C); ou bien il peut être soumis à des méthodes de fractionnement.
La Demanderesse a découvert, comme résultat d'expérien- ces, que la fraction du foie qui est extraite du foie entier par l'eau chaude est rendue plus efficace par la papalne et que, après digestion, cette fraction peut être fractionnée sans difficulté, en vue de concentrer ou d'accroître son ef- fica,cité en tant qu'anti-anémique, par l'application de cer- taines des méthodes utilement adoptées pour fractionner des extraits aqueux et non digérés de foie.
Conformément à un mode de réalisation de l'invention,
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on mélange une certaine quantité de foie émince (par exemple 158 kg) avec de l'eau froide (par exemple 182 litres) et on rend de préférence le mélange légèrement acide par l'addition d'une faible quantité d'acide sulfurique (p.ex.80 millilitres ) et chauf- fe le mélange (par exemple à 70 C) jusqu'à ce que toute la matiè- re thermiquement coagulable ait été coagulée ; sépare l'extrait aqueux de la portion insoluble du mélange, par filtration ou au- trement, et on le refroidit à environ 60 C.
On ajoute de la papaï- ne (par exemple 60 gr) en solution ou en suspension dans de l'eau (par exemple 4,54 litres) de préférence après l'avoir activée à l'aide de sulfure de sodium (0,2 gr.par exemple) ou d'un autre a- gent activant ou accélérateur approprié. On règle le pH, si né- cessaire, à une valeur de l'ordre de 5,6 et on laisse incuber le mélange à environ 60 C pendant un temps d'une durée convenable (par exemple environ 2 heures). En vue de détruire l'activité de la papaïne, on élève alors rapidement à 100 C la températu- re du mélange digéré et on fait bouillir ce mélange pendant le minimum de temps (environ 5 minutes) propre à assurer une telle inactivation, puis on le filtre, ou on le clarifie de quel- que autre manière.
La préparation ainsi obtenue, après réduction à un état solide ou sous forme d'une solution concentrée facile à ad- ministrer, possède des propriétés thérapeutiques analogues à celles du produit faisant l'objet de la demande de brevet belge précitée, en ce sens qu'elle effectue le traitement satisfaisant non seulement de l'anémie pernicieuse, mais aus- si, dans certains cas, de l'anémie macrocytique réfractaire.
Elle peut être sèchée ou fractionnée par les méthodes de fractionnement connues applicables aux extraits non digérés de foie, suivant qu'on désire un produit solide ou liquide destiné à être administré par la bouche ou un liquide brut ou ayant subi un haut degré de purification et propre à être administré efficacement en très petites doses par la voie
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parentérale.
Des fractions de l'extrait aqueux susmentionné peuvent être traités par la papalne d'une manière similaire. Par exem- ple, la Demanderesse a aussi découvert que la portion de matière du dit extrait qui est soluble dans de l'alcool à 70%, d'une part, et la matière qui est insoluble dans de 1' alcool à 70%, d'autre part, ont leur efficacité accrue, en tant qu'agents anti-anémiques, bien que la fraction insolu- ble dans l'alcool soit essentiellement inactive, du point de vue thérapeutique, avant le traitement par la papaïne.
La Demanderesse a établi expérimentalement que les mé- thodes de fractionnement suivantes peuvent être appliquées à l'extrait de foie aqueux digéré susmentionné en vue de la fabrication de produits destinés à être administrés par voie parentérale et propres à lutter contre l"anémie pernicieuse et de.s états connexes: a) Précipitation par l'acide Reinecke, suivie d'une dé- composition du précipité ; absorption sur du charbon de bois, suivie d'un lavage à l'aide d'alcool à 50% - 60%; c) précipitation par l'addition de sulfate d'ammonium ; solu- tion dans de l'alcool à 70% - 80%; e) solution dans des sol- vants phénoliques ; f)élimination du précipité produit par l'addition d'acétate de plomb ;
g)précipitation par l'acide phosphotungstique, suivie de la régénération du précipité.
A titre d'illustration, on donnera ci-après quelques exemples du traitement de l'extrait de foie susmentionné, aqueux, digéré, chauffé et clarifié:
Exemple 1.
On concentre la matière pour l'amener à l'état solide en en éliminant l'eau dans le vide à une température de 45 C. Le produit -dont la biotine que contenait le foie a été éliminée - comprendra, sous une forme rendue plus efficace, sensiblement toute l'activité anti-anémique et les autres
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substances physiologiquement actives qui sont présentes dans le foie, telles que la vitamine B 1, l'acide nicotini- que, la pyridoxine, l'acide pantothénique, l'acide folique, etc.. Un gramme de ce produit solide aura été dérivé de 18 grammes environ de foie entier. Une dose curative pour le traitement du cas moyen de l'anémie pernicieuse à l'état de rechute, dans le cas de l'administration par la bouche, est de 7 grammes par jour.
Exemple ?
La matière susmentionnée est concentrée par l'élimina- tion d'eau à des températures peu élevées (telles que 45 C) dans le vide à un degré tel que, après l'addition d'aromati- sants et d'un volume convenable d'alcool et/ou de glycérine à titre d'agents préservateurs, un cm3 aura été dérivé de 8 grammes environ de foie. La composition et les propriétés physiologiques de cette préparation liquide seront essentiel- lement analogues à celles du produit de l'exemple 1, et 14,8 c.c. de la dite préparation, administrés journellement par la bouche, assureront le traitement satisfaisant d'un cas d'anémie pernicieuse en état de rechute.
Exemple 3.
A 454 litres de la ligueur digérée chaude utilisée dans l'exemple précédent, ajouter 16 litres d'acide crésylique et 182 Kg de sulfate d'ammonium; remuer le mélange et séparer les couches d'acide crésylique d'avec la couche aqueuse de sulfate d'ammonium par tout moyen convenable, cette dernière couche pouvant, si on le désire, être de nouveau épuisée à l'aide de nouvelles quantités d'acide crésylique ; à la solution d'acide crésylique combinée ainsi obtenue (libre de sulfate d'ammonium) deux volumes d'éther éthylique ou d' un solvant similaire; séparer de la solution d'éther et d' acide crésylique le précipité engendré ; ce précipité avec de l'éther; dissoudre dans de l'eau le précipité lavé ; éliminer l'éther de la solution aqueuse par une chaleur mo-
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dérée;
diluer la solution libre d'éther à un degré corres- pondant à tout équivalent de foie désiré, et ajouter un a- gent préservateur approprié, par exemple 0,3% de tricrésol ou 0,1% de parachlor-métacrésol ; en filtrant à travers un dispositif approprié retenant les germes.
Ce produit contiendra sensiblement la totalité du prin- cipe anti-anémique présent dans la liqueur de digestion, ain- si que, en substance, la totalité de la riboflavine, de l' acide folique et des autres vitamines présentes dans le foie et solubles dans les solvants phénoliques. Une dilution pré- parée de telle manière que un millilitre ait été dérivé de 10 grammes de foie aura une teneur en éléments solides com- prise en 5% et 7%; et une dose de dix millilitr.permettra de traiter d'une manière satisfaisante un cas moyen d'anémie per- nicieuse en état de rechute pendant 14 jours.
Une solution correspondant à un équivalent de foie plus élevé aura une teneur en éléments solides accrue dans une me- sure correspondante et donnera une dose effective plus faible.
Exemple 4.
A 454 litres du produit de l'exemple 3, ajouter 9 kg. d'acétate de plomb, sous forme du produit solide ou d'une solution aqueuse, et, après avoir mélangé intimement, ajouter une solution de soude caustique aqueuse jusqu'à ce que le pH (mesuré de préférence à l'aide d'une électrode de verre) ait été porté à 7,5 ; filtrer le mélange ou séparer de quelque autre manière la phase liquide de la phase solide ; de l'acide sulfurique de manière à obtenir un pH de 4,5 ; ter 20 gr. de sulfate d'ammonium par litre de filtrat ; trer ou autrement séparer la portion ou phase aqueuse d'avec le précipité, qui consiste essentiellement en du sulfate de plomb ; ajouter 100 cc d'acide crésylique et 400 gr. de sulfa- te d'ammonium par litre de filtrat ;
la solution d'aci- de crésylique d'avec la couche aqueuse inférieure (la couche
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de sulfate d'ammonium aqueuse peut, si on le désire, être
1 soumise à un nouvel épuisement avec des quantités supplémen- taires d'acide crésylique); ajouter à la solution d'acide cré- sylique, combinée, limpide et libre de sulfate d'ammonium deux volumes d'éther éthylique ou d'un solvant similaire ; le précipité et laver ce précipité avec de l'éther; dissoudre le précipité dans de l'eau et épuiser cette solution avec de l'éther pour éliminer les traces d'acide crésylique ; à un degré correspondant à l'équivalent de foie désiré ; un agent préservateur approprié, par exemple 0,3% de tricrésol @ ou 0,1% de para-chlor-méta-crésol;
stériliser par filtration à travers un dispositif retenant les germes.
Une solution préparée de telle sorte que un millilitre ait été dérivé de 50 gr. de foie aura une teneur en éléments so- lides de 18% environ ; et une dose de 2 millilitr, assurera de manière satisfaisante le traitement d'un cas moyen d'anémie pernicieuse en état de rechute pendant 14 jours.
' Ce produit contient le facteur de traitement de l'anémie pernicieuse, mais ses teneurs en riboflavine et en acide foli- que sont moindres en comparaison avec le produit de l'exemple 3.
Il ressort de ce qui précède: que des préparations conformes à l'invention et destinées au traitement de l'ané- mie pernicieuse et d'autres anémies macrocytiques peuvent être rendues aussi efficaces que les produits correspondants préparés à partir d'extraits de foie non digérés, bien que leur fabrication n'exige qu'une quantité de foie inférieure à la moitié de celle exigée par les dits produits préparés à partir d'extraits de foie non digérés ; est possible de fabriquer des produits qui sont aussi efficaces, avec des doses plus petites, que des produits similaires fabriqués à partir du foie entier protéolysé ; que l'extrait de foie aqueux protéolysé obtenu peut facilement être fractionné par
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des méthodes connues.
Etant donné que tous les produits susmentionnés con- tiennent, en raison de leur traitement protéolytique, des substances physiologiquement actives libérées, tous ces produits sont supérieurs à toutes les préparations non pro- téolysées, à base de foie, servant au traitement de l'anémie pernicieuse et d'autres anémies macrocytiques.
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PROCESS FOR MANUFACTURING PREPARATIONS BASED ON PRIORITY:
The present invention relates to increasing the efficiency of liver extracts by digestion with papaine and aims to increase the utility of the liver for the manufacture of products useful in the treatment of anemia. harmful and related conditions, as well as to manufacture, from such products, concentrates for parenteral and / or oral administration.
We know (see the Belgian patent application filed on and having the title: "Process for extracting from the liver the active principles and nutrients which it contains and resulting produced", that the action of the papa ± ne on the liver. minced liver, under the conditions specified in the aforesaid application, markedly amplifies the pro-
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The ability of the whole unfractionated liver to control pernicious anemia, that is, to increase its effectiveness as an "anti-anemic" agent.
However, to date it has not been determined which of the fractions of whole or minced liver whose effectiveness is enhanced by the action of papain, and it is difficult to prepare a product purified to a high degree satisfactory. and adapted to allow the material obtained in accordance with said application to be administered parenterally.
The present invention contemplates the manufacture of a series of liver preparations for administration by mouth in the treatment of pernicious anemia, refractory megalocytic anemia, megalocytic anemia. - galocytic nutrition and related conditions; as a series of liver preparations intended for parenteral administration, primarily for the treatment of pernicious anemia, although they are also useful in the treatment of other megalocytic anemias.
In general, the invention consists in subjecting a whole liver fraction to the action of papain. The resulting product can be dried or partially concentrated by removing water (preferably at low temperature, for example of the order of 45 ° C.); or it may be subjected to fractionation methods.
The Applicant has discovered, as a result of experiments, that the fraction of the liver which is extracted from the whole liver by hot water is made more efficient by papalne and that, after digestion, this fraction can be fractionated without difficulty, with a view to concentrating or increasing its efficacy, cited as anti-anemic, by the application of some of the methods usefully adopted for fractionating aqueous and undigested extracts of liver.
In accordance with one embodiment of the invention,
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a certain amount of thin liver (for example 158 kg) is mixed with cold water (for example 182 liters) and the mixture is preferably made slightly acidic by the addition of a small amount of sulfuric acid (p .ex. 80 milliliters) and heat the mixture (eg to 70 C) until all the thermally coagulable material has coagulated; the aqueous extract is separated from the insoluble portion of the mixture, by filtration or otherwise, and cooled to about 60 ° C.
Papain (for example 60 g) is added in solution or in suspension in water (for example 4.54 liters), preferably after having activated it with sodium sulphide (0.2 gr. for example) or another suitable activating agent or accelerator. The pH is adjusted, if necessary, to a value of the order of 5.6 and the mixture is allowed to incubate at about 60 ° C. for a suitable period of time (for example about 2 hours). In order to destroy the activity of papain, the temperature of the digested mixture is then rapidly raised to 100 ° C. and this mixture is boiled for the minimum time (approximately 5 minutes) suitable for ensuring such inactivation, then the mixture is boiled. filter, or it is clarified in some other way.
The preparation thus obtained, after reduction to a solid state or in the form of a concentrated solution easy to administer, has therapeutic properties similar to those of the product which is the subject of the aforementioned Belgian patent application, in that It effects the satisfactory treatment not only of pernicious anemia, but also, in some cases, of refractory macrocytic anemia.
It can be dried or fractionated by known fractionation methods applicable to undigested liver extracts, depending on whether a solid or liquid product for oral administration or a crude liquid or having undergone a high degree of purification is desired and capable of being administered effectively in very small doses via the
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parenteral.
Fractions of the aforementioned aqueous extract can be treated with papalne in a similar manner. For example, we have also found that the material portion of said extract which is soluble in 70% alcohol, on the one hand, and the material which is insoluble in 70% alcohol, on the other hand, have their increased efficacy, as anti-anemic agents, although the alcohol insoluble fraction is essentially therapeutically inactive prior to papain treatment.
The Applicant has established experimentally that the following fractionation methods can be applied to the above-mentioned digested aqueous liver extract with a view to the manufacture of products intended to be administered parenterally and suitable for combating pernicious anemia and pernicious anemia. Related states: a) Precipitation with Reinecke acid, followed by decomposition of the precipitate, absorption on charcoal, followed by washing with 50% - 60% alcohol; c) precipitation by the addition of ammonium sulphate; solution in 70% - 80% alcohol; e) solution in phenolic solvents; f) removal of the precipitate produced by the addition of lead acetate;
g) precipitation with phosphotungstic acid, followed by regeneration of the precipitate.
By way of illustration, some examples of the processing of the aforementioned, aqueous, digested, heated and clarified liver extract will be given below:
Example 1.
The material is concentrated to bring it to a solid state by removing water in a vacuum at a temperature of 45 C. The product - from which the biotin contained in the liver has been removed - will include, in a form made more effective, substantially all anti-anemic activity and other
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physiologically active substances which are present in the liver, such as vitamin B 1, nicotinic acid, pyridoxine, pantothenic acid, folic acid, etc. One gram of this solid product will have been derived from About 18 grams of whole liver. A curative dose for the treatment of the average case of relapsed pernicious anemia, in the case of administration by mouth, is 7 grams per day.
Example?
The aforementioned material is concentrated by removing water at low temperatures (such as 45 ° C) in vacuum to such an extent that after addition of flavorings and a suitable volume of Alcohol and / or glycerin as preservatives, one cc will have been derived from approximately 8 grams of liver. The composition and physiological properties of this liquid preparation will be essentially analogous to those of the product of Example 1, and 14.8 cc of said preparation, administered daily by mouth, will ensure the satisfactory treatment of a case of pernicious anemia in a state of relapse.
Example 3.
To 454 liters of the hot digested ligeur used in the previous example, add 16 liters of cresylic acid and 182 kg of ammonium sulfate; stir the mixture and separate the layers of cresylic acid from the aqueous layer of ammonium sulfate by any suitable means, the latter layer being able, if desired, to be exhausted again with the aid of further quantities of cresylic acid; to the combined cresylic acid solution thus obtained (free from ammonium sulfate) two volumes of ethyl ether or a similar solvent; separating the precipitate generated from the solution of ether and cresylic acid; this precipitate with ether; dissolving the washed precipitate in water; remove the ether from the aqueous solution with moderate heat.
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derivative;
dilute the free ether solution to a degree corresponding to any desired liver equivalent, and add a suitable preservative, for example 0.3% tricresol or 0.1% parachlor-metacresol; by filtering through a suitable device retaining the germs.
This product will contain substantially all of the anti-anemic principle present in the digestion liquor, as well as, in substance, all of the riboflavin, folic acid and other vitamins present in the liver and soluble in the liver. phenolic solvents. A dilution prepared in such a way that one milliliter has been derived from 10 grams of liver will have a solids content of 5% and 7%; and a dose of ten milliliters will satisfactorily treat an average relapsing case of harmful anemia for 14 days.
A solution corresponding to a higher liver equivalent will have an increased solid content to a corresponding extent and give a lower effective dose.
Example 4.
To 454 liters of the product of Example 3, add 9 kg. lead acetate, either as the solid product or as an aqueous solution, and, after thoroughly mixing, add an aqueous caustic soda solution until the pH (preferably measured using a glass electrode) has been increased to 7.5; filtering the mixture or otherwise separating the liquid phase from the solid phase; sulfuric acid so as to obtain a pH of 4.5; ter 20 gr. ammonium sulfate per liter of filtrate; separating or otherwise separating the aqueous portion or phase from the precipitate, which consists essentially of lead sulfate; add 100 cc of cresylic acid and 400 gr. ammonium sulphate per liter of filtrate;
the solution of cresylic acid with the lower aqueous layer (the
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of aqueous ammonium sulfate may, if desired, be
1 subjected to further exhaustion with additional quantities of cresylic acid); add to the combined clear, free ammonium sulfate free cresylic acid solution two volumes of ethyl ether or a similar solvent; the precipitate and wash this precipitate with ether; dissolve the precipitate in water and exhaust this solution with ether to remove traces of cresylic acid; to a degree corresponding to the desired liver equivalent; a suitable preservative, for example 0.3% tricresol or 0.1% para-chlor-meta-cresol;
sterilize by filtration through a germ retaining device.
A solution prepared in such a way that one milliliter has been derived from 50 gr. liver will have a solids content of about 18%; and a dose of 2 ml, will satisfactorily provide treatment for an average case of pernicious anemia which has relapsed for 14 days.
This product contains the pernicious anemia treatment factor, but its contents of riboflavin and folic acid are lower compared to the product of Example 3.
It emerges from the foregoing: that preparations in accordance with the invention and intended for the treatment of pernicious anemia and other macrocytic anemias can be made as effective as the corresponding products prepared from extracts of non-liver. digested, although their manufacture requires only a quantity of liver less than half that required by the said products prepared from undigested liver extracts; it is possible to manufacture products which are as effective, at smaller doses, than similar products made from proteolyzed whole liver; that the proteolysed aqueous liver extract obtained can easily be fractionated by
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known methods.
Since all the aforementioned products contain, due to their proteolytic processing, released physiologically active substances, all these products are superior to all the non-protected, liver-based preparations used for the treatment of anemia. pernicious and other macrocytic anemias.