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Produit semblable à une vitamine et son procédé de préparation.
La présente invention concerne un agent ou un groupe d'agents possédant une activité biologique et se réfère plus particulièrement à sa fabrication.
Il a été observé qu'un agent de cette espèce est néces- saire à la croissance des poussins élevés au moyen d'un régime exempt de protéines d'origine animale, par exemple une alimen- tation farineuse à base d'huile de graines de soja. Des re- cherches ont révélé que cet agent favorise l'éclosion des oeufs fécondés,* On présume qu'il se révélera précieux en tant qu'agent de nutrition des mammifères. En fait, cet agent semble avoir quelque rapport, bien que d'une manière encore
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non élucidée, avec certains dérivés du foie qui contiennent le principe anti-anémique de l'anémie pernicieuse. Cet agent sera dénommé ici "principe actif".
Des expériences ont permis de déterminer que ce "prin- cipe actif" est contenu dans certaine matière protéinée d'origine animale, ou dans une partie de celle-ci, qu'il ne semble pas avoir une origine végétale, mais qu'il peut être d'origine microbienne. Bien que sa structure chimique soit inconnue à l'heure actuelle, on sait qu'il est relativement soluble dans l'eau, qu'il peut être extrait par l'éthanol, qu'il est adsorbable par le charbon animal (Darco G-60 ) par exemple, et qu'il peut être séparé (par désorption) d'un produit résultant de son adsorption sur le Darco G-60 avec, par exemple, des mélanges eau-éthanol-pyridine ou autres milieux légèrement alcalins.
Ce principe actif peut être classé parmi les vitamines B, bien que l'on considère qu'il soit différent des vitamines et des amino-acides déjà connus.
Ce principe actif a. un certain rapport avec quelques- uns de ceux qui sont dérivés de la farine de poisson, de la colle de poisson ou d'engrais de vache, bien que ces derniers produits puissent seulement avoir une fraction de l'activité du principe actif en questi on. En fait, celui-ci peut être un groupe d'agents à action biologique, qui ne se rencontrent pas tous dans l'engrais de vache ou dans les autres produits connus pour présenter une certaine activité.
La présente invention a pour objet la synthèse de ce principe actif par auto-fermentation, de préférence d'une matière stérilisée ou pasteurisée. Cette matière peut ne pas contenir initialement le principe actif désiré. La matière indiquée ici semble, à l'essai, être sensiblement exempte de
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principe actif.
Un mode typique de production va maintenant être exposé.
De la levure de bière fraîche est sensiblement débarrassée de l'alcool résiduel, par exemple par ébullition ou passage à l'autoclave. Cette opération tue également les cellules de levure et les dissocie. Les parties solides insolubles peuvent être éliminées. Cette opération donne naissance à une liqueur renforcée qui constitue l'aliment. Le pH est, de préférence, amené à 5, 5 et la liqueur est diluée, de préfé- rence, jusqu'à atteindre une teneur en matière solide infé- rieure à 4%. Elle est ensuite stérilisée ou pasteurisée.
Le liquide résultant constitue la matière de base ou de départ.'
Celle-ci n'est, de préférence, pas renforcée et ne subit pas d'addition, avant d'être soumise à l'autofermenta,- tion, parce que cette façon de procéder conduirait à produire un aliment n'empêchant pas la croissance des organismes indé- sirables. La matière de départ non renforcée permet de faire la synthèse du principe actif, par croissance des organismes recherchés au détriment de tous les autres. Il en résulte que la matière de départ stérilisée ou pasteurisée présente un caractère sélectif.
Cette matière de base ou aliment n'ayant pas subi d'addition et étant telle que décrit ci-dessus, est le siège, lorsqu'elle est soumise à l'autofermentation, d'une synthèse microbienne relativement importante du principe actif, en particulier lorsqu'on effectue cette autofermentation dans les conditions mentionnées ci,-,après. Il a été constaté que cette matière autofermentée se trouve dans un état permettant de l'employer pour inoculer de la matière de base fraîchement préparée.
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Dans certains cas, une deuxième croissance ou une crois- sance à un stade ultérieur, peut être réalisée dans la matière de base préalablement renforcée ou ayant subi une addition. En général, l'inoculation est de l'ordre de 10% pour cette raison que 1''excès de microbes recherchés semble paralyser la croissance des microbes indésirables et les étouffer. En travaillant dans des conditions stériles (en air stérile), l'inoculation peut être ramenée à un chiffre de l'ordre de 2% environ.
On effectue de même des traitements successifs pour produire un concentré puissant. On a observé que les micro-organismes en suspension dans l'air et utilisés présentent divers carac- tères, mais on a définitivement identifié le type connu sous la dénomination de bactérie aérobie. il se présente sous la, forme de bâtonnet, et est gram-négatif .Il ne forme pas de spores et donne par mutation d'autres espèces typiques ou atypiques lorsqu'il est cultivé sur cette matière basique. On a observé aussi que ces espèces obtenues par mutation sont pour une large part à l'origine de la synthèse microbienne du principe actif.
Le procédé utilisé de préférence va être exposé ci-après en détail, et l'exemple donné présente un ca.ractère de discon- tinuité, bien que le procédé puisse être appliqué en continu, les indications données n'ayant pas de caractère limita tif .
Un litre de levure de bière de fond fraîche, contenant environ 20 % de matière solide au total, est sensiblement débarrassée de l'alcool par chauffage jusqu'au point d'ébulli- tion tout en étant agité. On fait ensuite passer la levure
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résultante sensiblement débarrassée d'alcool, à l'autoclave pendant 12 heures environ, sous une pression d'environ 1,4 kg par en±. Cette opération dissocie les cellules de la levure.
On laisse déposer pendant 6 heures environ le produit résultant. Le liquide qui surnage est éliminé par décantation ou tout autre moyen approprié. La quantité du liquide résultant est de l'ordre de 800 millilitres (ml) et le liquide comprend un bouillon d'infusion de levure légèrement trouble. Le pH du liquide est amené à 5,5 environ par addition d'un corps alcalin dilué.
On incorpore 20 ml de ce bouillon à chacun de huit tubes de 50 ml . Des bouchons en coton et des cordeaux d'aération sont insérés dans chaque tube. Ceux-ci sont alors passés à l'autoclave à une pression d'environ 1,4 kg/cm2, pendant 15 minutes environ, pour produire la stérilisation. Bien que ce traitement puisse provoquer une précipitation dans le bouil- lon, cela ne semble pas présenter d'inconvénients,,
Les huit'tubes sus-mentionnés sont placés dans une étuve maintenue sensiblement à 28 C. Chaque tube est relié à une tubulure d'admission d'air fournissant de l'air non stérile au bouillon. Le tube d'aération se termine nettement au-dessus de ce niveau, si l'on utilise une pression négative pour produire l'aération.
De quelque manière que soit réalisée la circulation de l'air celle-ci est réglée de manière appro- priée pour éviter une formation d'écume excessive.
Si l'on utilise une pression positive, la tubulure d'aération comporte un clapet de commande à réglage précis.
Si l'on utilise une tubulure de dépression, le clapet y est incorporé. Quel que soit le type d'appareil d'aération utilisé, cette aération est prolongée pendant 48 heures environ. A ce
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moment, l'auto-fermentation sélective aura été réalisée ainsi que cela peut être mis en évidence par la synthèse du principe actif par les bactéries spécifiques en suspension dans l'air.
Cinq (5) ml sont transférés aseptiquement de chacun des huit tubes ayant subi le traitement ci.-dessus à cinquante (50) ml de matière de base renforcée, contenue dans des fla- cons de 250 ml. La matière de base est préparée comme décrit précédemment. Elle est toutefois renforcée avec 2 % de sucrose (comme source d'hydrate de carbone) et avec 0,17 d'urée (comme source de matière azotée). Ce renforcement est effectué de préférence avant la stérilisation . Le pH est amené de préférence à une valeur de 5,5 avant la stérilisation.
Les flacons ainsi inoculés sont placés dans un agitateur donnant environ 300 impulsions par minute, tout en étant maintenus à une température voisine de 28 C , et pendant un laps de temps allant de 18 à 24 heures.
A la fin de cette période d'incubation, dix (10) ml de chaque flacon sont transférés aseptiquement dans cent (100)ml de matière de base renforcée de la même manière et contenue dans des flacons de 500 ml. Ces flacons sont alors agités comme précédemment sensiblement dans les mêmes conditions que celles indiquées plus haut. A la fin d'une période de 24 heures, 50 ml de chacun des flacons sont transférés asep- tiquement dans 500 ml de matière de base renforcée contenue dans des flacons de 2000 ml. Celle-ci est alors soumise à l'incubation comme précédemment.
Ensuite, 100 ml' de chacun des flacons mentionnés en dernier lieu, sont transférés aseptiquement dans 1.000 ml de matière de base renforcée dans des flacons de 3.000 ml et soumis à l'incubation comme pré- cédemment.
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On a constaté que les produits ainsi obtenus contenaient des milliards de cellules vivantes par millilitre. Le contenu des huit flacons mentionnés en dernier lieu est alors rassem- blé et 5,7 litres du liquide sont transférés dans 57 litres de la matière de base renforcée contenue dans un réservoir de fermentation cylindrique d'une contenance de 114 litres muni de préférence d'un couvercle. Ce dernier comporte un agitateur entraîné à la vitesse de 600 tours/minute environ.
Une source de chaleur constituée par exemple par des serpen- tins à vapeur, y est également incorporée. La température est maintenue à 28 C environ. Le réservoir est muni de serpentins d'aération pour admettre de l'air en quantité suffisante pour une aération maximum sans produire une quantité excessive d'écume ' @ Cet air est traité de préférence pour réduire sa flore bactérienne avant d'être employé pour l' aérati on. Le degré d'aération peut être de l'ordre d'un volume d'air par volume de liquide et par minute. Un agent empêchant la formation de l'écume est ajouté de préférence en assez grandes quantités.
Ainsi, par exemple, un quart de partie d'huile de graines de soja est ajouté à chaque lot de 100 parties de matière devant subir une fer mentation. La matière ainsi inoculée est laissée à fermenter pendant 24 heures environ, à une température voisine de 28 C, tout en étant aérée et soumise à l'agitation.
A la fin de cette période de fermentation, 38 litres de la matière fermentée sont utilisés pour inoculer 380 litres de matière de base fortifiée contenue dans un réservoir de fermentation de 1140 litres, et les phases opératoires décrites sont répétées.
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Le cycle mentionné en dernier lieu peut être répété aussi souvent qu'on le désire en utilisant une (1) partie du produit fermenté pour inoculer dix (10) parties de la matière renforcée fraîchement préparée. On utilise par exemple pour la phase de traitement finale 1900 litres avec 19. 000 litres dans une citerne de 76.000 litres. Chaque fois qu'on le désire, comme dans le cas mentionné en dernier lieu, la période d'incubation peut être prolongée et portée par exemple à quarante huit (48) heures. Le produit obtenu contient très approximativement un excédent de (1) pour cent des matières solides totales contenues dans la matière de base utilisée.
Celui-ci est alors traité à nouveau pour assurer la concentration du principe actif. Le principe actif peut être extrait de la masse de la matière par une technique d'extrac- tion par adsorption et élution, ou bien le pH peut être amené à une valeur voisine de 6,0 , le produit résultant étant con- centré sous le vide pour être réduit à environ 35 % de la quantité totale de matières solides en vue de son séchage en- tre des cylindres et, de préférence, pas à moins de dix (10) pour cent du total des matières solides avant séchage par vap orisation. Il peut être séché de toute autre manière appropriée.
Bien que la température de 28 C ait été indiquée comme étant à utiliser de préférence, on peut faire intervenir des températures comprises entre 26 et 36 C suivant les besoins, et si on le désire, des températures différentes comprises entre ces limites peuvent être utilisées aux différents stades du traitement.
D'une manière analogue, bien que le pH à adopter de pré- férence ait été indiqué comme étant de 5,5 à tous les stades,
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les limites dont il faut tenir compte de préférence sont de 4,5 à 6,5 , et des valeurs de pH différentes peuvent être utilisées entre ces limites aux stades successifs du traitement.
De même, les périodes d'incubation de vingt-quatre (24) et quarante-huit (48) heures mentionnées ci-dessus peuvent être modifiées,et varier respectivement de 18 à 24 et de 36 à 48 heures. En d'autres termes, la période d'incubation peut varier à partir de celle désignée jusqu'à environ les trois-quarts de celle-ci.
Il convient de mentionner en outre qu'il existe une cor- rélation entre l'aération et l'agitation et, lorsque l'agi- tation est considérable, l'aération peut être proportionnelle- ment moindre que celle utilisée quand l'aération et l'agitation sont équilibrées et, inversement, l'aération est proportionnel- lement augmentée lorsque l'agitation est réduite dans les mêmes pr op orti ons .
Des recherches ont en outre permis de démontrer que, lors- que le produit d'addition azoté est constitué par de l'urée, le pourcentage de celle-ci peut varier de 0,1 à 0,8 et on peut constater en outre que pour une concentration d'environ 0,8 et plus, les augmentations de pourcentage pa.ralysent progressive,- ment la synthèse microbienne du principe actif.
On a pu également vérifier expérimentalement qu'il semble préférable de n'effectuer aucune addition d'urée plutôt que d'obtenir une concentration comprise dans les quantités cri- tiques et excessives indiquées ci-dessus.
Il doit en outre être entendu, que l'indication de l'urée comme produit d'addition azoté est donnée à titre d'exemple seulement, ca.r des recherches ont permis de constater que d'autres matières azotées peuvent être utilisées avec sensible- ment autant de compatibilité avec la production du principe
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actif, ces matières de remplacement pouvant être par exemple des sels d'ammonium inorganiques..
De même, l'hydrate de carbone dont il a été fait mention, à titre d'exemple/ ne constitue pas un exemple limi- tatif et peut être remplacé par d'autres hydrates de carbone tels que la cellulose, le maltose, le dextrose et le lactose.
Le procédé décrit ici n'est pas limité aux opérations indiquées, et les additions de produit azoté et d'hydrate de carbone peuvent être effectuées simultanément à un degré plus ou moins grand en utilisant des liquides résiduels industriels tels que les eaux de macération de grains, les mélasses, les résidus de laiterie tels que le petit-lait, et les liquides résiduels provenant des fermentations en général pour autant- que ceux-ci contiennent sous une forme quelconque un produit azoté et (ou) un hydrate de carbone qui convienne à la produc- tion de ce principe actif. Lors de l'utilisation de ces liquides industriels, il est préférable de les stériliser avant leur addition.
En ce qui concerne l'expression sucrose à 2 %, il doit être entendu que, lorsqu'on utilise du sucrose ou son équi- valent, la quantité doit être au moins de 1 % comme limite inférieure, la limite supérieure devant être déterminée par des conditions d'ordre économique, à savoir le prix de cette mati èr e .
Lorsque la matière manque de substances minérales, on y ajoute de préférence un supplément de substance minérale telle que du carbonate de calcium, superphosphate de calcium ou tout autre sel de calcium non-nuisible, ou un produit c orresp ondant.
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Bien que l'huile de graines de soja soit indiquée pour supprimer l'écume, il doit être entendu qu'elle ne constitue pas le seul agent empêchant la formation d'écume qui puisse être utilisé avec succès, d'autres produits équivalents appropriés pouvant être utilisés en remplacement. De même, les pourcentages indiqués ci-contre ne sont donnés qu'à titre d'exemples, car bien qu'on ait spécifié la valeur d'un quart, celle-ci peut varier par exemple depuis un dixième jus- qu'à une quantité déterminée par le prix du produit.
Quand le principe actif doit être employé par exemple comme produit d'addition, il peut être plus économique d'en- voyer au producteur d'aliments ce principe actif séché ou la matière partiellement déshydratée contenant le principe actif en question suivant la technique qui sera utilisée dans les installations de traitement et telle que l'exige l'équipement de l'usine appliquant le procédé. Par exemple, la déshydrata- tion effectuée comme une mesure partielle préliminaire de production d'aliment, c'est-à-dire la matière liquide con- tenant le principe actif concentré de façon appropriée, peut être mélangée avec un aliment à base d'huile de graines de soja avant le séchage, et ceci évite des frais considérables de séchage ultérieur.
En outre, ce produit résultant inter- médiaire est alors manipulé facilement, expédié ou donné comme aliment.
On remarquera que deux méthodes ont été citées, à savoir : extraction par adsorption et élution et séchage. On peut ex- traire le principe actif de la matière séchée, ainsi que cela a été constaté en utilisant de l'éthanol puis la matière peut être débarrassée de son alcool d'une manière connue en soi.
Lorsque l'on recherche une très grande pureté pour les pré- parations pharmaceutiques, la matière séparée de l'éthanol peut
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être de plus concentrée par adsorption et élution, puis séchage.
REVENDICATIONS
1. Procédé pour obtenir un "principe actif", dans lequel on soumet une culture de levure sensiblement exempte d'alcool à une stérilisation et à une phase de dissociation de la cellule, en séparant le constituant liquide, en réglant la valeur du pH, en soumettant le liquide traité à une phase de stérilisation ou de pasteurisation, en provoquant une auto- fermentation tout en aérant et en faisant incuber le liquide stérilisé, en inoculant ensuite un liquide stérilisé renfor- cé du type précédent avec le liquide sus-mentionné dans le rapport de un à dix, le liquide inoculé résultant étant alors aéré pendant l'incubation, le nombre des inoculations, aérations et incubations successives étant suffisant pour produire la quantité désirée de principe actif.