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Procédé pour la production de matières vitaminées par fermentation.
Cette invention concerne la production de produits vitaminés de valeur par fermentation. Plus particulièrement, elle concerne des résidus de fermentation qui peuvent être obtenus par le développement de cultures sélectionnées de . Fana dans des milieux nutritifs, et qui renferment de la vitamine B� synthétisée par moisissure, les substances vitaminées considérées ayant des propriétés d'activation <EMI ID=2.1>
tituant des adjuvants utiles pour la nourriture.
L'invention concerne un procédé pour la production de substances vitaminées convenant pour l'enrichissement
de nourriture pour animaux, déficientes quant au "facteur protéique animal", procédé comportant le développement d'un microorganisme sélectionné parmi le groupe comprenant des
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tritif, donnent des produits de fermentation titrant au moins
20 unités LLD par milligramme de solide contenu dans ces produits, le développement étant conduit dans un milieu nutritif pendant une dnrée suffisante pour produire un produit de fermentation ayant une activité LLD, basée sur la teneur en solides de ce produit, d'au moins 20 unités LLD par milligramme, et les matières solides solubles dans l'eau étant récupérées du bouillon de culture sans décomposition substantielle de leur teneur en vitamine.
L'invention concerne également une composition de nourriture pour animaux diététique ment convenable quant au "facteur protéique animal", comprenant une matière nutritive déficiente dans son "facteur protéique animal" et, comme source de ce "facteur", une préparation dérivant du bouillon de fermentation obtenu par le développement d'un
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lorsque cultivées dans un milieu nutritif, donnent des produits de fermentation titrait au moins 20 unités LLD par
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pement étant conduit dans un milieu nutritif pendant une durée suffisante pour produire un produit de fermentation ayant une activité LLD, basée sur la teneur en solide de ce produit , d'au moins 20 unités LLD par calligramme.
protéique animal'* ainsi dénommé (auquel on se référera Ici
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viande, de farine de foie, de farine de poisson, de poisson soluble, et produits analogues. Ces matières sont relativement peu abondantes. les sous produits de viande et la farine de foie sont tous deux coûteux et augmentent considérablement le prix de revient de l'élevage de la volaille. Ces substances présentent aussi l'inconvénient de renfermer des quantités relativement faibles et variables du "APF". était donc désirable de trouver une source plus concentrée et moins onéreuse de ce constituant Important de l'alimentation.
Nous avons maintenant découvert que le résidu de fermentation actif LLD produit par le développement de cer-
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sont des sources concentrées d'agents d'activation de croissance qui produisent sur la croissance des poussins essen-
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protéique animal". En outre, nous avons trouvé que, lorsque de tels résidus de fermentation sont soumis à un traitement
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que, dans une nourriture déficiente en "APF", une teneur
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effet satisfaisant et apparemment maximum sur la vitesse de croissance des poussins.
C'est une caractéristique de la présente Invention
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partir de bouillons de fermentation, les concentrés desdits bouillons peuvent être employés comme compléments de nour-
<EMI ID=12.1> par développement de cultures sélectionnées de fungus dans un milieu nutritif aqueux, et ensuite par séparation des constituants volatils des bouillons résultant de la fermentation à des températures inférieures à celles décomposant
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de moisissures qui ont été trouvées comme étant commercialement réalisables sont celles que produisent les bouillons
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gramme de solide contenu dans lesdits bouillons. Nous avons trouvé que les solides solubles dans l'eau de tels bouillons de fermentation peuvent avoir une activité s'élevant jus-
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de poisson et la farine de poisson, renfermaient seulement environ 1-3 unités LLD par mg.
Il faut noter qu'une nourriture basale pour volaille déficiente en "APF" est rendue satisfaisante sous le point de vue diététique par l'addition à cette nourriture de
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à celui produit par environ 1 à 5 % d'extrait soluble de poisson, de farine de poisson et produits analogues. Cette
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330.000 unités LLD par kg. de nourriture. Un concentré de
2.000 unités LLD par mg. d'activité comme celui mentionné
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de nourriture par addition dans.la proportion de 165 mg.
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n On sait que divers extraits solubles de fermentation
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ment à cause de leur teneur en riboflavine et autres vitamines de structure connue, comme la biotine, l'acide pentothenique, etc. Nous avons trouvé que ces substances préparées primitivement ne renferment que de faibles quantités de substances actives LLD; par exemple, des extraits solubles de fermentation butylique renferment seulement environ
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extraits solubles de fermentation ne renferment pas assez
de substance active LLD pour rendre possible la récupération à partir de ceux-là, de concentrés convenant pour l'enrichissement de nourriture déficiente quant au "facteur protéi-
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Pour rendre possible la récupération de tels con-
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convenables pour la production de bouillons de cette con-
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les Myxomycètes, Schizomycetes et Bumycetes. Les Schizo-
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être utilisées pour la préparation des antibiotiques streptomycine et griseine. D'autres espèces de Streptomyces,
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bienels nov. ap.; le Streptomyces roseochromogenus et le Streptocyces antibioticus renferment des cultures qui don-
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D'autres Schizomycetes appropriés sont des membres du genre
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trouvé appropriés pour la production commerciale de bouillons de fermentation titrant au moins 20 unités LLD par milligramme de solide contenu dans lesdits bouillons, sont
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Nous désirons souligner que, pour tout type de Fungus donné, il est nécessaire de sélectionner les cultures qui donnent des bouillons ayant l'activité LLD désirée. Notre Invention n'est pas limitée à un fungus particulier, et elle n'inclut pas toute culture de tout fungus donné. D'autre part, tout micro-organisme essayé, cependant, qui donnera un bouillon de fermentation titrant au moins 20 unités LID par mg. de solide du bouillon, a été trouvé satisfaisant pour la production de concentrés convenant pour l'enrichissement des nourritures pour animaux déficientes quant au "facteur protéique animal".
Un autre avantage encore de la présente découverte réside dans le fait que les produits vitaminés de valeur ici décrits peuvent être préparés à partir de liqueurs de fermentation résiduaires résultant de la production des antibiotiques streptomycine et griséine. Les procédés de fermentation de streptomycine et de griséine impliquent la fermentation de moûts de faible concentration, avec la conséquence que des volumes extrêmement importants de bouillon de fermentation doivent Atre utilisés pour une production relativement faible de streptomycine ou de griséine. Le résidu d'une grande installation de fermentation de strepto-
// mycine peut ainsi représenter plusieurs milliers de gallons de liqueurs de fermentation résiduaires par jour. _paravant, on ne connaissait la présence d'aucun produit utile
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de vitamines de structure connue réellement contenue dans ces liqueurs est trop faible que pour permettre une concentration économique des liqueurs en vue d'une récupération desdites vitamines. Ces liqueurs de fermentation de la streptomycine ont donc constitué un problème sérieux et onéreux d'utilisation de résidus.
Nous avons maintenant fait l'étonnante découverte que cette liqueur résiduaire de streptomycine, après enlèvement de l'anti-bio tique streptomycine de celle-là par emploi de résines à ion substituable, titre sensiblement plus de 20 unités LLD par mg. de solide y contenu. Nous avons démontré que des concentrés de jurande activité LLD peuvent être récupérés de cette liqueur, et que ces concentrés peuvent être utilisés pour l'enrichissement des nourritures pour animaux déficientes quant au "facteur protéique animal". Si on le désire, la liqueur peut être traitée
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résiduaires de griséine, après récupération de l'anti-biotique griséine, peuvent être traitées pour la récupération
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Dans l'application de la présente invention, nous pouvons utiliser tout milieu nutritif généralement utilisé dans le développement de Fungj. Les agents nutritifs habituels renferment une source de carbone, une source d'azote, des sels inorganiques et des facteurs de croissance si c'est nécessaire. Le carbone peut être fourni par un hydrate de carbone comme le dextrose, le maltose, le xylose, le sucre inverti, du sirop de blé, ou d'autres produits analogues.
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des extraits de levure, un digeste tryptique de caséine, un extrait de viande, de la farina de sang, des déchets protéiques de viande et d'os, de la farine de saumon, des farines de poisson, des extraits solubles de poisson, des extrait solubles de distillation et autres produite analogues. Si
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de protéines, (ou acides aminés) sans la présence d'hydrates de carbone dans le milieu, auquel cas les protéines (ou acides aminés) servent à la fois comme source de carbone et d'azote exigés par le micro-organisme. le développement est ordinairement opéré dans un milieu aqueux mais on peut aussi utiliser au lieu dudit milieu aqueux un milieu d'alcool de grain.
Lorsqu'on utilise un milieu nutritif aqueux, celuici est stérilisé puis inoculé avec une culture de filtre sélectionné de fungus et le mélange est soumis à l'incubation jusqu'à ce que le bouillon de fermentation titre au
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L'incubation est habituellement effectuée sous des conditions
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auquel on se réfère plus haut dans le présent exposé.
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fermenté peut être évaporé et les solides de fermentation ainsi obtenus sont utilisés sans autre traitement, pour en-
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Il est habituellement préféré de filtrer le bouillon de fer-mentation et de traiter le bouillon filtré avec un adsorbant comme une terre à foulon ou du charbon de bois activé, qui
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et peut alors être utilisé comme complément de nourriture.
Si on désire un complément de nourriture exempt d'adsorbant, l'adsorbat est lessivé avec des solvants appropriés comme des solutions aqueuses ou aqueuses alcooliques de pyridine ou d'alpha-picoline, et le produit du lessivage est évaporé à siccité. Le processus opère une purification partielle des constituants actifs LLD et le produit solide ainsi obtenu est une source concentrée de facteurs de croissance appropriée pour 1' enrichissement de nourriture pour animaux déficiente en "APF".
Si on désire une purification plus poussée, le con-
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rieur, ccmme l'alcool méthylique, et l'extrait alcoolique est passé dans une colonne garnie d'alumine activée, et
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est ensuite soumise à un lessivage avec du méthanol frais comme solvant et les fractions du produit de lessivage qui manifestent une activité LLD (comme déterminé par essai microbiologique) sont réunies, et les fractions du lessivage réunies sont concentrées. La solution alcoolique concentrée est alors mélangée avec un liquide miscible avec la dite solution et dans lequel la substance active est insolu� ble, comme l'acétone. la précipité, qui se forme, est recristallisé dans un mélange d'acétone et d'eau pour obtenir
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Les exemples suivants illustrent les méthodes d'exécution de la présente invention, mais il doit être entendu que ces exemples sont donnée à titre exemplatif et ne sont pas limitatifs.
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lide), 315 lb de digeste tryptique de caséine, 160 lb de chlorure de sodium, 720 gr de sulfate ferreux heptahydraté,
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de la griséine. Le milieu inoculé est soumis à une incuba tion à une température d'environ 28[deg.]C, pendant environ 48 heures, et est aéré de façon continue avec approximativement
5000 pieds cubes d'air par heure. A la fin de la période de fermentation, tout le bouillon de culture est acidifié au pH3 avec de l'acide phosphorique et filtré. Le gateau de filtre est lavé avec de l'eau et le filtrat avec les lavages est rendu légèrement alcalin avec de l'hydroxyde de sodium, puis filtré à nouveau. Le bouillon de fermentation
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A. Filtrat séché de bouillon de fermentation du
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100 gal. de bouillon de fermentation préparé comme décrit plus haut ont été évaporés sous pression réduite et
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Le concentré, qui avait une activité mierobiologique d'environ 40.000 unités LLD par al. a ensuite été séché par pulvé-
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unités LLD par mg.
B. Adaorbat de charbon de bois de bouillon
de fermentation du 8. grisées.
3500 gai. du môme bouillon de fermentation que celui
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tration et lavé par une suspension dans 100 gai. d'esu et filtré à nouveau.
195 gr. de l'adsorbat carboné humide furent séchés
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nant ainsi 99 g d'adsorbat sec. L'activité LLD de l'adsor-
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partir de l'activité présente à l'origine dans le bouillon de fermentation et de l'activité résiduaire de la liqueur usée après adsorption par le carbone.
C. Concentré obtenu par le lessivage
de l'adsorbat de charbon.
le reste de l'adsorbat de carbone lavé décrit sous le B (provenant de la mime cuvée de fermentation), représentant environ 160 lb de carbone activé, a été soumis à un lessivage par agitation pendant 30 minutes avec 167 gai. de
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de pyridine à 26 % pendant 20 minutes. Les deux tiers du produit de lessivage et du lavage réunis furent évaporés
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sous état congelé, et donnèrent 14,1 g de produit ayant une activité de 2800 unités LLD/mg.
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Un concentré solide préparé suivant le procédé décrit sous B et C ci-dessus en partant avec 3500 gai. de
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Que et l'extrait alcoolique fut ensuite passé à travers une
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avec de l'alcool méthylique frais et les fractions du produit de lessivage révélant l'activité LLD la plus prononcée furent concentrées ensemble. La solution alcoolique concentrée fut alors mélangée avec de l'acétone, provoquant la précipitation
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Cette matière fut purifiée par reprécipitation dans une solution d'éthanol par addition d'acétone et le produit fut purifié à nouveau par cristallisation d'une solution aqueuse
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La valeur des concentrés ci-dessus et de la vitamine pour remplacer les compléments de nourriture renfermant le "facteur protéique animal" était révélé par des tests d'a-
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Les poussins utilisés dans ces tests étaient éclos d'oeufs pondus par des poules maintenues à une alimentation
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Des poussins âgés d'un jour furent soumis à un régime basai comme suit:
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Après cinq jours sur l'alimentation basale ci-dessus,
on choisit des groupes de sept poussins chacun, équilibrés sous le point de vue du poids et on leur donna la nourriture basale ci-dessus complétée comme Indiqué dans la table suivante:
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Ces tests établissent clairement que la croissance des poussins d'expérience est nettement accrue, si on la compare avec la croissance de poussins nourris avec une
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d'expérience sont nourris avec ladite nourriture basale enrichie par l'un Quelconque des concentrés signalés plus haut ou avec la vitamine Bl2.
EXEMPLES.
Une cuve de fermentation de 4000 gel. a été chargée avec 95 lb de concentré d'extrait de boeuf, 315 lb d'un di-
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20 litres d'agent anti-mousse, et 3500 gai. d'eau. le milieu fut stérilisé, inoculé, fermenté, acidifié, filtré et neutralisé comme décrit dans l'exemple 1.
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ximativement 4000gal.) fut agité avec 96 lb de carbone actif pendant 30 minutas pour adsorber les constituants ac-
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par une suspension dons environ 100 gale d'eau et filtré à <EMI ID=79.1>
tation pendant 30 minutes avec 95 gal. d'alpha-picoline à
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Le gâteau de filtre fut lave sur filtre presse par recyclage
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Les produits du lessivage et du lavage réunis furent évaporés sous pression réduite (température de vapeur inférieure
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thanol. La matière inerte qui précipite fut éliminée et
les constituants actifs LLD bruts furent précipités par l'addition de la solution dans le méthanol à 180 gel. d'éther). Le précipité fut séparé par filtration, lavé à l'éther et séché dans un four à vide à une température inférieure à
30[deg.]C, pour donner 860 gr de produit sec; activité microbiologique de 1500 unités LLD/mg.
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comparée avec un extrait brut de foie et avec la vitamine
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des tests d'alimentaion de poussins comme décrit à la page suivante.
Tests d'alimentation de poussins.
Les poussins utilisés étaient éclos d'oeufs pondus par des poules nourries avec une nourriture déficiente en
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Des poussins vieux d'un jour furent soumis à un régime basai, Qui était identique à celui de l'exemple 1,
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de dextrose commercial.
Après 5 jours de l'alimentation hasale ci-dessus, on sélectionna des groupes de 7 poussins chacun, équilibrés Quant au poids et on leur donna la nourriture baaale précé-
�
<EMI ID=87.1>
Ces tests montrent que la croissance des poussins d'expérience est nettement accrue, par rapport à celle observée sur des poussins nourris avec une nourriture basale défi-
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montrent également que l'accroissement de croissance est approximativement le mime que celui produit en nourissant les poussins avec la nourriture basale enrichie par 1% d'extrait brut de foie, qui est l'un des meilleure produits utilisée procédèrent comme source de "facteur protéique animal*.
F
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Le milieu fut préparé, stérilisé et soumis à l'incubation avec 10% en volume d'une culture végétative de filtre
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2 jours sous immersion et sous aération. Le bouillon fermenté fut acidifié avec de l'acide phosphorique au pH3 et filtré sur
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tés LLD par mg de solide du bouillon).
60 gale de ce bouillon de fermentation filtré furent passés dans Un? colonne renfermant 600 g d'une résine du type
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sorption de la streptomycine sur la résine. Les bouillons effluents desquels la streptomycine était ainsi éliminée furent réunis.
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75 litres de ce bouillon effluent furent traités
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des substances actives initialement présentes dans le bouillon.
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19 <EMI ID=97.1>
charbon de bois décrit dans l'exemple 1 pour l'enrichissement des nourritures pour animaux déficientes en "APF".
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40 litres de bouillon effluent préparés en substance
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furent amenés au pH 2,5 avec de l'acide phosphorique, et le bouillon résultant fut traité avec 600 g de terre à foulon ("O.K. Brand") L'adsorbat dans la terre à foulon, qui renfer-
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de la même façon que l'sdsorbat dans le charbon de bois comme décrit plus haut et dans l'exemple 1 pour l'enrichissement des nourritures pour animaux déficientes en "APP".
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Une portion de 80 litres du même bouillon effluent Que la matière de départ utilisée dans la partie 4 du présent
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de cette solution concentrée (5740 ml) fut séchée par pulvérisation et donna ainsi 335 g. de produit sec ayant une activité microbiologique de 140 unités LLD/mg. Ce produit peut Atre utilisé de la même façon que le bouillon séché de
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EXEMPLE 4.
On prépare un milieu constitué par 1% de diges te
<EMI ID=104.1> <EMI ID=105.1>
flacon est alors inoculé avec environ 10 ml. d'une culture végétative de Itreptomyces roseochromogenus, et soumis à une incubation de 7 jours dans une machine à agiter rotative. Les contenus des flacons sont ensuite mélangés et filtrés.
Un litre de bouillon filtré (environ 1500 unités
<EMI ID=106.1>
rieure à 35[deg.]C) et séché à partir de l'état congelé, pour obtenir 6,9 g. de produit ayant une activité d'environ 130 unités LLD/mg.
Une autre portion de bouillon filtré, s'élevant à
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avec 23 g. de carbone activé. L'adsorbat, ainsi obtenu, est la-vé deux fois par lessivage sous agitation pendant 30 minutes avec un mélange de 126 ml. d'éthanol; 12,5 ml de pyri-
<EMI ID=108.1>
sont évaporés sous pression réduite (température inférieure à 35[deg.]C) et séchés à partir de l'état congelé pour obtenir
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Une culture de Streptomyces albidoflavie est préparée et incubée exactement comme décrit dans l'exemple 4 pour le Streptoayces roseochromogenus.
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de l'acide phosphorique, filtré, et le bouillon filtre est neutralisé à environ un pH 7 avec. de 1$hydroxyde de sodium
1570 ml. de bouillon neutre filtré (titrant 1000 unités LLD/ml:
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obtenu est récupéré par filtration. L'adsorbat humide est
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tenir 50,7 g.(adjuvant de filtration inclus) d'adaorbat sec, dont l'activité est environ 30 unités/mg. comme calculé à partir de l'activité du bouillon original neutre et filtré et de la liqueur épuisée provenant du traitement par le carbone.
L'adsorbat dans le carbone peut être utilisé de la même façon que les produits décrits dans l'exemple l, pour
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Un milieu de fermentation fut préparé avec les constituants suivants:
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40 il du milieu ci-dessus furent stérilisés dans un
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temps durant lequel le flacon fut agité continuellement sur une machine à agiter rotative.
�
Après achèvement de la période de fermentation, le titre LLD du bouillon fermenté était de 4800 unités par ml.
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Ce bouillon est utilisé pour obtenir des concentrés
<EMI ID=118.1>
<EMI ID=119.1>
EXEMPLE 7.
Huit milieux de fermentation, identiques quant aux sels inorganiques, mais renfermant différents produits azotés complémentaires, furent préparés. La composition de ces milieux était la suivante:
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40 ml de chacun de ces milieux furent stérilisés dans un flacon de 250 ml et inoculés avec 2 1/2 % en volume
<EMI ID=121.1>
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pendant 4 jours pendant lesquels les flacons furent agités continuellement sur une machine à agiter rotative.
Après achèvement de la période de fermentation, les bouillons fermentés furent titrés et les résultats obtenus, dépendant de l'agent complémentaire ajouté , sont résumés dans la table ci-après:
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Ces bouillons peuvent Atre utilisés pour produire
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crit dans l'exemple 1.
EXEMPLE 8.
<EMI ID=127.1>
Agar Difco 0,37% Cobalt (comme nitrate de cobalt) 2 part./million Eau distillée pour faire 100%
Ce milieu fut préparé et divisé en cinq flacons
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cons et leur contenu furent stérilisés et chacun des flacons fut inoculé avec un type différent de Clostridium, comme Indiqué dans la table ci-après..
Après inoculation, les bouillons inoculés furent Incubés sous des conditions anaréobles, sans agitation, pour
<EMI ID=129.1>
Après achèvement de cette période de fermentation, les ac-
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lactés Dorner comme test, furent les suivantes :
<EMI ID=131.1>
Chacun de ce* bouillons est ensuite traité comme décrit dans l'exemple 1, pour produire des concentrée solides
<EMI ID=132.1>
1.- Procédé pour la production de substances vitaminées "captées pour l'enrichissement d'aliments, pour ani-
<EMI ID=133.1>
sistant à développer un microorganisme sélectionné dans le groupe comprenant ces filtres de Fume qui, lorsque cultivés dans un milieu nutritif, permettent d'obtenir des produits
<EMI ID=134.1>
gramme de solide contenu dans ces produits, ce développement étant conduit dans un milieu nutritif pendant un temps suffisant pour atteindre un produit de fermentation ayant une
<EMI ID=135.1>
des vitamines y contenues*