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' Cette invention concerne l'obtention d'agents antibiotiques, à partir de solutions de ces agents,produite par le développement de microorganismes. Plus particulière- ment, cette invention concerne une méthode nouvelle et amé- liorée pour la récupération de streptomycine à partir de milieux nutritifs ou bouillons de culture dans lesquels l'antibiotique a été élaboré par le- développement de fil- trats de Streptomyçes griseus y contenus, producteurs de streptomycine.
L'invention consiste dans la récupération de strep- tomycine à partir de solutions aqueuses de celle-ci, en mettant au contact de la solution aqueuse de streptomycine une résine à ion échangeable, dans laquelle la capacité d'échange dérive de groupes carboxyliques, contact par le- quel ladite streptomycine est adsorbée sur ladite résine, et en effectuant un lessivage de ladite résine pour enle- ver la streptomycine adsorbée.
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La streptomycine est produite maintenant industriel- lement par le développement de filtrats, produisant de la streptomycine, de la moisissure Streptomvces griseus, dans un liquide renfermant des agents nutritifs pour la croissan- ce de ce microorganisme, cette culture étant conduite sous des conditions aérobies. Ces liquides, avant culture et également après achèvement de celle-ci, sont habituellement désignés sous les termes de milieux nutritifs ou de bouil- lon de culture* La solution résultante, qui, en plus de la streptomycine, renferme plusieurs produits métaboliques de fermentation et des substances résiduaires d'agent nu- tritif, doit alors être débarassée de l'organisme en dé- veloppement et des autres substances solides et traitée pour en récupérer la streptomycine.
Dans la technique actuelle, il est courant d'adsorber la streptomycine présente dans le bouillon sur du carbone activé, et d'extraire ensuite la streptomycine adsorbée du carbone activé par un lessivage avec un liquide de lavage convenable* Si ce procédé est efficace en ce qu'il permet de récupérer la streptomycine du milieu nutritif ou bouil- lon de culture, il constitue, du point de vue industriel, une méthode coûteuse et non satisfaisante, parce qu'il exige des quantités relativement importantes de carbone activé, qui est utilisé comme agent adsorbant* Par suite des propriétés faiblement adsorbantes du carbone activé pour la streptomycine, nécessitant l'emploi de quantités relativement importantes d'adsorbant, par rapport à la quan- tité de streptomycine à récupérer du bouillon de culture,
il est également nécessaire d'utiliser un appareillage de récupération, tels les filtres et évaporateurs, d'une ca- pacité relativement grande. Ce fait augmente considérables ment les frais de fabrication de cette antibiotine.
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En outre, le carbone activé est en soi un produit coûteux. Lorsqu'il a été utilisé une fois, suivant le pro- cédé classique par cuvée.pour l'adsorption de streptomycine d'un milieu nutritif dans lequel le Streptomyces griseus a été cultivé, il n'est généralement plus utilisable pour des opérations subséquentes d'adsorption.
Les inconvénients inhérents au procédé actuel de récupération de la streptomycine de bouillons de culture, en utilisant comme adsorbant le carbone activé, peuvent être résumés en disant que la méthode est en soi onéreuse, par suite de la faible capacité adsorbante du carbone ac- tivé. Des volumes relativement importants de carbone, et également un appareillage de capacité relativement grande, sont nécessaires pour recueillir des quantités relativement faibles de streptomycine. En outre, le procédé est rela- tivement lent, et a pour conséquence d'immobiliser pour une longue période de temps un appareillage de récupération relativement coûteux et de grande capacité. Ce facteur s'ajoute, avec une grande incidence, au coût élevé et aux difficultés d'un traitement de volumes relativement im- portants de bouillons de culture.
D'autre part, environ 60-80 seulement de la streptomycine sont récupérables par ce procédé au carbone. La streptomycine ainsi obtenue est également de qualité médiocre, et il est nécessaire de recourir à un certain nombre de procédés de purification pour obtenir unproduit pharmaceutique satisfaisant.
Jusqu'à présent, on a proposé d'adsorber des substan- ces antibiotiques sur des résines à ion échangeables, mais ces propositions n'ont pas été entièrement satisfaisantes, parce que les résines, qui ont été utilisées adsorbent non seulement les substances antibiotiques,mais d'autres com- posés organiques complexes divers, qui invariablement sont
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présents dans les bouillons de culture. Ces propositions souffrent aussi de la difficulté rencontrée dans l'extrac- tion par lessivage de l'antibiotique de la résine, opéra- tion qui ne peut être effectuée qu'en contaminant l'anti- biotique avec des quantités excessives d'acides, ou de sels; et en outre souvent avec des rendements tellement médiocres qu'elle ne peut convenir pour une production commerciale .
On a constaté cependant, que la streptomycine peut être récupérée, des bouillons de fermentation, avec une efficacité et une facilité surprenantes, au moyen de ré- sines à ion substituable dont les groupes polaires sont des groupes carboxyles. Ces résines présentent, sur tous les autres adsorbants qui ont été essayés, des avantages substantiels, au point de vue de la pureté du produit, des rendements de récupération, et de l'économie de l'opéra- tion.
Alors que, avec les autres adsorbants, tels le car- bone, l'argile smectique, les résines synthétiques d'acide sulfanique et les médites, le processus d'adsorption constitue essentiellement un stade de concentration, après lequel de nombreux stades compliqués de purification sont nécessaires, par contre, le produit obtenu directement du bouillon de culture par l'emploi de résines d'acide carbo- xylique est d'une pureté telle que l'on obtient directement, à partir d'une solution dans le méthanol, un sel complexe chloruré de calcium cristallin. La cause de ce degré élevé de pureté est double. Tous les composés non basiques échappent à l'adsorption hors du bouillon par suite de la nature de l'adsorption par substitution d'ion.
En outre, on a observé que l'action de ces résines était hautement sélective, adsorbant seulement la streptomycine à l'exclu- sion essentielle des autres composés organiques azotés
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présents dans le bouillon. En second lieu, l'antibiotique est extrait par lessivage de la résine par des quantités pratiquement stoechiométriques d'acide, ce qui permet d'éviter l'introduction de grandes concentrations de sels et d'acides, nécessaire généralement dans la plupart des autres types de solutions de résines.
Par l'emploi des résines d'acide carboxylique à ion substituât le, il est possible de récupérer la streptomycine avec des rendements quantitatifs, à partir des bouillons fermentés. En fait, les récupérations sont tellement sûres et quantitatives qu'un procédé de dosage pour les bouillons de culture a été mis au point, basé sur l'adsorption de streptomycine sur des résines, le lessivage, et l'identifi- cation de la streptomycine relativement pure extraite par lavage, par des réactions de dégradation.
En outre, la récupération de la streptomycine par le procédé ici décrit est tellement efficace que, couramment, nous faisons passer; à travers une colonne d'adsorption, diverses fractions de fabrication, telles les liqueurs mères de cristallisa- tion, les lavages de gateaux de filtration, les lavages de l'appareillage, etc., pour éliminer les dernières tra- ces de streptomycine avant de rejeter ces résidus. La colonne d'adsorption est ensuite soumise périodiquement à un lessivage et la streptomycine est récupérée de la façon habituelle .
Plusieurs autres caractéristiques favorables des résines de l'acide carboxylique à ion substituable contri- buent à donner, au procédé de récupération de la strepto- mycine basé sur l'emploi de ces dernières, un grand avan- tage économique. En tant que procédé reposant sur une sub- stitution d'ion, la récupération de la streptomycine res- semble à une opération d'adoucissement d'eau; la strepto -
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mycine est extraite du bouillon de culture par son passage sur la résine, la résine est lavée (lessivée) par un acide dilué et régénérée par un alcali et est susceptible d'être réutilisée. On ne doit donc recourir à aucun solvant or- ganique et la résine adsorbante peut être réutilisée in- définiment.
Comme les réactions ioniques en jeu sont très rapides, II est possible de faire passer sur le lit d'adsor bant de grands débits de bouillon de culture, par exemple, 3 à 10 fois le débit réalisable avec les lits d'adsorption de carbone. Une autre caractéristique présentant un grand intérêt et une grande importance réside dans la haute ca- pacité d'adsorption, atteignant jusqu' à I gramme de streptc mycine par gramme de résine, avec les meilleurs types de résine. Ce fait permet une plus grande économie d'appa- reillage et d'installation, puisque la streptomycine de gre,ndes quantités de bouillons de culture peut être adsor- bée sur des lits peu importants d'adsorbant et extraite par lessivage avec de faibles volumes d'acide, ce qui simplifie les problèmes du traitement ultérieur.
Les résines à ion subs tituable ayant des groupes polaires carboxyliques ont été précédemment décrites dans la littérature. En général, elles sont obtenues soit par condensation d'un phénol et d'un aldéhyde, l'une des substan ces renfermant un groupe carboxylique, en particulier l'a- cide résorcylique et le formaldéhyde., ou par copolymérisa- tion d'un acide polymérisable avec un composé divinylique , comme par exemple, l'acide acrylique ou méthacrylique et un divinylbenzène. Des résines de ces types sont décrites dans les brevets U.S. Nos 2.319.357; 2.333.754;
2.340.110; 2.340,111 et d'autres et sont caractérisées par la qualité @ commune de posséder une faculté de substitution d'ion dé- pendant des groupes carboxyles présents dans la molécule
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de résine. Dans la pratique de la présente invention, nous préférons utiliser un copolymère d'acide acrylique ou méthacrylique et divinylbenzène, parce que ces résines offrent un plus grand nombre de groupes carboxyles par unité de poids et, de ce fait, une plus grande capacité d'adsorption d'ions. Nous avons prouvé, cependant, que la capacité des résines à ion substituable d'adsorber la streptomycine ne dépend pas seulement du nombre de groupes polaires pour un poids ou un volume donné de résine.
Elie dépend aussi de la porosité de la résine, car, dans une résine compacte, seuls les groupes polaires de la surface extérieure des particules de résine sont capables de réa- gir avec l'antibiotique, tandis que dans le cas d'une résine de structure poreuse, les molécules de streptomycine pénè- treront au moins partiellement dans les pores de la résine et réagiront avec des groupes polaires contenus à l'inté- rieur des particules de résine.
Dans le cas des produits de condensation de phéno- formaldéhyde, on obtient une structure de résine poreuse en faisant passer la réaction de condensation par un stade de gel aqueux, de la façon bien connue de la technique.
Dans les copolymères d'acides polymérisables et de composés divinyliques , la porosité dépend, en grande partie, du degré de liaison double substituée conférée par le constituant divinyle- Dansces copolymères, le constituant divinyle con- fère à la résine l'insolubilité dans l'eau et un certain degré de dureté mais en même temps diminue la porosité de la résine. Il est, par conséquent, désirable dans l'appli- cation de la présente invention avec ce type de résine à ion substituable, d'utiliser une résine renfermant la plus petite quantité de composé divinylique qui suffira à con- férer les propriétés physiques requises dans une matière à ion substituable.
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@ On a trouvé que les résines à ion subs ti tua- ble les plus efficientes dans la pratique de :.ce procédé sont des copolymères d'acide acrylique ou méthacrylique et de divinyl-benzène, dans lesquelles le constituant divinylbenzène représente 2 1/2 à 5% de la composition de la résine* De telles résines possèdent une capacité d'ad- sorption extrêmement élevée pour la streptomycine et, dans certains cas, adsorbent du bouillon de culture leur propre poids de streptomycine* Leur capacité est de plus de trente fois, pour un poids égal, la capacité des adaor- bants à base de carbone,
et de dix à trente fois la capa- cité d'adsorption des résines à ion substituable du type acide sulfonique* On peut utiliser de plus grandes quan- tités de divinyl-benzène pour la préparation de la résine, mais en réduisant la capacité d'adsorption, et l'on n'a aucun avantage à dépasser une proportion de 10% de divinyl- be nzène .
:Pour l'adsorption de la streptomycine, l'on préfé- rera avoir la résine sous forme de son sel sodique, car le sel sodique est d'un emploi économique, facilement substi- tuable par la streptomycine et non toxique. D'autres mé- taux monovalents sont l'équivalent essentiel du sodium, pour cette opération, mais leur emploi est moins économique.
Le second choix se porte sur la résine sous forme de son sel ammonique. On peut aussi utiliser la résine sous la forme de ses sels avec des métaux divalents, quoique ces métaux ne soient pas aussi facilement substituables par la streptomycine que le, sont les ions monovalents. La résine sous la forme de son sel de calcium est particuliè- rement faible en capacité pour la streptomycine et sera évitée, à moins que l'on ajoute un agent tampon au bouillon de culture pour faciliter la subs ti tution. Les formes de
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sels de magnésium et de cuivre ont des capacités légèrement plus faibles que la forme de sel de métal monovalent.
On peut aussi utiliser les résines sous la forme hydrogé- née ou sous une forme mixte dans laquelle certains groupes carboxyles sont sous la forme de sel et les autres sous la forme hydrogénée.
Le pH du bouillon de culture en contact avec la résine doit être supérieur à 4,5 et de préférence au voisi- nage du point de neutralité. Lorsque la résine est utilisée sous la forme d'un sel d'une base forte, une augmentation du pH se produit dans la colonne,particulièrement si l'on emploie un bouillon acide. En conséquence, même si le bouillon a un pH inférieur à 4,5, son pH sera rapidement porté à la valeur de travail par une neutralisation de l'excès d'acidité par la résine à échange d'ion. Cepen- dant, la quantité de résine consommée pour neutraliser l'acidité n'est pas disponible pour l'adsorption de la streptomycine et, par conséquent, il est préférable de neutraliser tout excès d'acidité par d'autres moyens.
Les résines carboxyliques adsorberont la streptomycine des bouillons de culture nettement alcalins, et il semble que la limite supérieure de pH admise soit déterminée unique- ment par la stabilité de la streptomycine. Bien qu'il soit peu probable de rencontrer en pratique un bouillon de culture ayant un pH aussi élevé que 11,5, la strepto- mycine peut être séparée d'un bouillon ayant un pH aussi élevé. Dans uncas semblable, il serait préférable d'uti- liser la résine sous sa forme hydrogénée.
On a également observé que, alors que la présence d'ions de sodium dans les bouillons de fermentation n'af- fecte pas sensiblement la capacité de substitution des groupes carboxyliques pour la streptomycine, la présence de
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autres certains/ions, notamment les ions calcium, ont un effet marqué. Dans ces cas où un choix des conditions de fermen- tation peut conduire à une haute concentration d'ions gênants, il est désirable, par conséquent, d'éliminer l'ac- tion interférente de tels ions par dilution, par formation de complexes avec un agent tampon, ou par l'élimination des ions eux-mêmes par précipitation ou par le remplace- ment de ceux-ci par des ions sodium.
Le bouillon de fermentation renfermant la strepto- mycine après les opérations de filtration et de réglage du pH, éventuellement nécessaire ou désirable, est mis . en contact avec la résine du type carboxylique à ion substi- tuable . La chose est de préférence réalisée en faisant passer le bouillon à travers une ou plusieurs colonnes de la résine . Lorsqu'on utilise une seule colonne de résine, l'opération d'adsorption peut être interrompue dès que la streptomycine apparaît dans le liquide quittant la colonne. A ce moment, la capacité d'adsorption de la co- lonne pour la streptomycine n'est pas entièrement utilisée.
En continuant le processus d'adsorption au-delà de ce stade, on enregistre une perte de.gtreptomycine, mais une quantité plus grande de streptomycine est adsorbée par la résine.
Le bouillon quittant la colonne partiellement épuisée peut être introduit dans une seconde colonne chargée de résine fraîche, et la première colonne est maintenue en service, jusqu'à ce qu'il n'y ait plus d'adsorption de streptomy- cine. En travaillant de cette façon, avec deux colonnes ou davantage, et en alternant les passages de liquide sur les colonnes de façon que la streptomycine entraînée après passage sur une colonne partiellement épuisée passe sur un lit de résine fraîche, on utilise la capacité entière d'ad sorption de la résine pour la streptomycine, sans que l'on
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enregistre de perte par entraînement.
Après avoir fait passer de l'eau sur la colonne épuisée pour éliminer le reste du bouillon, on récupère la streptomycine adsorbée en faisant passer sur la colonne d'un électrolyte. On préfère l'emploi d'une solution aqueuse une solution aqueuse/d'un acide, particulièrement fort, acide inorganique, comme l'acide chlonydrique. On peut utiliser, au lieu d'une solution aqueuse d'un acide, une solution dans le méthanol, ou une solution renfermant à la fois de l'eau et du méthanol. Les résines du type carboxylique, à ion substituable, ont une affinité telle- ment forte pour l'hydrogène, que la streptomycine peut être facilement extraite de la résine par un léger excès seule- ment d'acide fort.
L'acide éliminera également de la résine tous les ions métalliques qui n'ont pas été substitués par la streptomycine pendant l'opération d'adsorption et, par conséquent, par le lessivage, on obtient une solution lé- gèrement acide aqueuse de streptomycine, qui renferme aussi un peu de sels métalliques. Lorsque l'opération d' ad- sorption est conduite comme décrit ci-dessus, de façon à utiliser la plus grande partie de la capacité de substi- tution de la résine, la quantité de sels métalliques est assez faible que pour n'engendrer aucune difficulté dans la fabrication.
La streptomycine peut être récupérée de cette solution par neutralisation, puis concentration par évaporation, de préférence sous pression réduite, jusqu'à faible volume ou siccité, reprise du résidu par le méthanol ou un autre solvant, qui dissoudra la streptomycine .sans dissoudre une quantité appréciable des sels présents, filtration des sels, précipitation de la streptomycine de sa solution dans le méthanol par addition d'acétone ou d'un autre agent de précipitation convenable, puis enfin filtration et séchage .. La streptomycine précipitée ainsi
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obtenue est facilement convertie en sel complexe de chlo- rure de calcium cristallin, par dissolution dudit produit dans le méthanol et addition de la quantité voulue de chlo- rure de calcium, comme décrit dans la technique .
Lorsqu'on utilise unacide pdur l'extraction par lessivage, la résine passe sous sa forme hydrogénée, et, pour la convertir en la forme sodique, on fait passer sur la colonne ou on y introduit, sans circulation, une solu- tion aqueuse d'hydroxyde de sodium. Après lavage, pour enlever la solution de régénération, la colonne est prête à être réutilisée pour l'adsorption de streptomycine.
La technique préférée consiste, comme décrit ci- dessus, en un cycle d'opérations en trois stades, adsorption extraction par lessivage, et régénération, effectué dans des colonnes de résine traversées successivement par le bouillon de fermentation, la solution de lessivage, et la solution de régénération. Il n'est cependant pas essentiel pour le procédé, de travailler avec des colonnes, et l'on peut effectuer les trois mêmes stades dans tout type d' ap- pareillage dans lequel les solutions et la résine peuvent être mises en contact. On constatera également que, lors- que la résine est utilisée sous sa forme hydrogénée pour l'adsorption de streptomycine, le stade d'extraction par l'acide sert aussi à régénérer la résine.
On signalera également qu'une solution de chlorure de calcium est tout à fait efficace pour le lessivage et permet une facile récupération de la streptomycine, sous une forme relatives ment pure, directement à partir du produit de l'extraction, par les processus habituels de cristallisation. Dans ce cas, la résine, après lessivage, se trouve sous la forme calcique, et la régénération sous la forme sodique peut être effectuée en faisant passer sur la colonne une solu- tion de chlorure de sodium.
Les exemples suivants sont donnés pour illustrer l'invention :
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EXEMPLE 1.
Un copolymère granulé d'acide méthacrylique et de divinylbenzène, renfermant 5% de divinybenzène, a été malaxé avec de l'eau, puis introduit dans une colonne con- venable d'adsorption. On constitua ainsi un lit de résine adsorbante d'environ trois pouces d'épaisseur.
La résine a été lavée avec de l'acide chlorhydrique 2,5 N puis avec de l'eau. Elle fut ensuite convertie sous la forme ammonique, par l'addition d'une solution d'hydro- xyde d'ammonium 2,5 N, suivie d'un nouveau lavage à l'eau.
Lorsque la résine est convertie en la forme ammonique, il se produit un gonflement, de sorte que l'épaisseur résul- tante du lit dans la colonne devient d'environ 5 pouces.
La colonne fut alors lavée à nouveau à l'eau, jusqu'à ce que le pH du liquide, à sa sortie, fut d'environ 10,5.
La colonne était ainsi preste pour être utilisée pour l'ad- sorption de streptomycine, à partir d'une solution aqueuse de l'agent antibiotique. Le bouillon filtré, résultant du développement du Streptomyces griseus dans un liquide renfermant des agents nutritifs pour le microorganisme, fut soumis à un traitement préliminaire de clarification et fut ensuite introduit dans la colonne d'adsorption, sous alimentation par gravité. La charge de liquide sur la colonne était d'environ 3 pieds et la vitesse d'alimentation réglée à un débit assurant une durée de contact d'une mi- nute entre la résine et le bouillon de culture.
A la fin de l'opération d'adsoption, la colonne fut soumise à un lavage à l'eau, par déplacement, et le niveau du liquide abaissé au niveau du sommet du lit de résine.
La solution de lessivage, acide chlorydrique d'une concen- tration de 1,0 à 1,5 N, fut alors introduite au sommet de la colonne et le liquide recueilli à la sortie de la co- lonne. Les dernières fractions du lessivage étant très aci- des (d'un pH inférieur à 1,0), furent neutralisées immédia-
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tement par addition d'une solution 2,5 N d'hydroxyde de sodium.
Le liquide d'extraction neutralisé fut concentré à un faible-volume sous pression réduite, dilué par addi- tion de méthanol, filtré, et la solution de méthanol sou- mise à la précipitation. Le produit solide fut éliminé par filtration, puis séché sous pression réduite à' la . température ambiante. C'était une streptomycine de quali- té thérapeutique satisfaisante .
Lorsque le lessivage fut terminé, la colonne fut lavée avec une nouvelle quantité d'acide chlorhydrique 2,5 N, puis avec de l'eau. La colonne fut alors régénérée avec une solution d'hydroxyde d'ammonium, par le traitement décrit plus haut, et était prête pour réemploi.
Le rendement de streptomycine après lessivage était de 96%, chiffre rapporté à la quantité de streptomycine adsorbée par la résine. L'activité du produit était de 500 unités par milligramme,et la perte dans le bouillon après passage dans la colonne était seulement de 1,6%.
EXEMPLE 2.
EMI14.1
--...-------------.
Deux colonnes renfermant 50 g. de la résine utilisée dans l'exemple 1 furent converties en la forme sodique,par la passage, à travers chaque colonne, de 1000 cc. d'une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium à 10%. Les colonnes furent lavées avec 2000 ce d'eau chacune. Les colonnes furent reliées entre elles par untube de caoutchouc, pour travailler en série.
Soixante quatre titrer, huit dixièmes de bouillon de streptomycine furent acidifiés à un pH 2 par de l'acide phosphbrique, filtrés, neutralisés au pH 7 avec une solu- tion aqueuse d'hydroxyde de sodium et filtrés à nouveau.
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le bouillon traité titrait 360 u./ ce.
Le bouillon traité fut alors introduit, sous une pression d'environ 1 lb., dans les deux colonnes de résine en série, à une vitesse de 150 cc./min/. Le bouillon épui- sé, à la fin du circuit, titrait 4,3 u./cc.ou 1,2%. Les colonnes furent lavées avec 1000 ce. d'eau, puis soumises à un lessivage, par le passage, à travers chaque colonne, de 1000 ce. de solution aqueuse d'acide chlorydrique, 1,0 N La lessive riche de la première colonne s'élevait à 670 ce. et titrait 25.000 u./co. La lessive riche de la seconde colonne s'élevait à 235 ce. et titrait 28.000 u./cc.
La récupérationcalculée de streptomycine était de 100,5%.
La lessive de la première colonne fut concentrée dans le vide à 30 C. presqu'à siccité, traitée avec 100 ce. de méthanol, et filtrée. Le solide retenu par la filtration pesait 2,75. La solution dans le méthanol fut précipitée dans 500 ce.d'acétone; le solide filtré, lavé avec 50 cc. d'acétone, et séché dans le vide. Poids : 26,3 g. , titre 650 u/mg., cendre (sulfatée) 15%. La récupération calcu- lée à ce stade était de 101,5%.
Le solide précipité par l'acétone fut dissous dans 81 ce* de méthanol et on ajoute à la solution 23,6 gr. de chlorure de calcium anhydre. La solution fut agitée pendant 40 heures puis filtrée. Le précipité fut lavé avec une solution à 10% de chlorure de calcium dans le méthanol, puis avec de l'éthanol, et séché. Le produit pesait 17,5 g. et titrait 780 u. /mg. (le chiffre théorique pour la strep- tomycine pure,sous la forme du complexe du chlorure de calcium est de 779 u./mg.). Le rendement total à partir du bouillon (à travers le première colonne) était de 80%.
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EXEMPLE 3.
EMI16.1
#.#.-.########.
Une colonne renfermant 2 g. du'produit de condensa- tion de l'acide résorcylique et du formaldéhyde, connu sous le nom de Wofatite C, fut convertie sous la forme sodique, par passage dans la colonne de 100 cc.d'hydroxyde de so- dium à 10%. La colonne fut lavée avec 200 ce* d'eau.
Un litre de bouillon de streptomycine fut acidifié à un pH de 2, avec de l'acide phosphorique, filtré, neu- tralisé avec de l'hydroxyde de sodium et refiltré. Le bouillon traité titrait 537 u./cc.
Le bouillon traité fut introduit dans la colonne de résine à une vitesse de 0,64 cc./ min. Le bouillon épuisé, qui titrait 198 u./cc., aurait dû normalement être recyclé sur une seconde colonne, mais cela ne fut pas fait dans ce cas. La colonne fut alors lavée avec 100 ce. d'eau et soumise à un lessivage avec 200 cc. d'une solution a- (]tueuse 1,0 N d'acide chlorhydrique. La lessive riche s'éle- vait à 172 ce et titrait 1,750 u,cc. Ceci correspond à une récupération de 88% de la streptomycine adsorbée par passage dans une colonne unique de résine.
La lessive fut concentrée dans le vide à 25 C, presqu'à siccité, et le concentré dilué avec 5 ce* de mé- thanol. La solution fut filtrée et additionnée à 25 ce. d'acétone. Ce précipité fut filtré et.séché dans le vide.
Poids ; 580 mg., activité 500 u./mg. Cela correspond à une récupération de 86,5% des unités adsorbées par la résine.
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E X E Id P L E 4.
La table ci-après illustre les efficacités compa- ratives de différents adsorbants. généralement utilisés et des résines du type carboxylique,pour l'adsorption
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et la récupération de la streptomycine à partir d'une so- lution aqueuse de cette dernière. Ces résultats expéri- mentaux furent obtenus en faisant passer une solution aqueu- se relativement pure renfermant environ 0,1% de strepto- mycine à travers des colonnes contenant les corps adsorbants
On a trouvé que les différents adaorbants demandent des agents divers de lessivage, pour obtenir les résultats optimum. Par exemple, la résine de silicate substituable est détruite par l'acide,de sorte que ce réactif ne peut être utilisé comme agent de lessivage.
Dans chaque cas, on signale l'emploi de la substance de lessivage donnant les. résultats op timum : Comparaison de différentes Résines à ion substituable et d'Adsorbants dans la Récupération de Streptomycine.
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Type <SEP> d'adsorbant <SEP> Capacité <SEP> mg/g <SEP> Agent <SEP> de <SEP> lesaivage <SEP> Récupération <SEP> Activité
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<tb> ..type <SEP> de <SEP> utilisé <SEP> du <SEP> lessivage <SEP> du <SEP> pro-
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<tb> l'adsorbant. <SEP> % <SEP> duit <SEP> ob-
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<tb> tenu.
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Résine <SEP> sulfonée <SEP> 10 <SEP> NaCl <SEP> aq. <SEP> 30-50 <SEP> env,100
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<tb> phé <SEP> nol-f <SEP> ormal- <SEP> H2SO4 <SEP> aq. <SEP> 40 <SEP> u/mg.
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<tb> déhyde.
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Résine <SEP> au <SEP> silicate <SEP> 40 <SEP> NaC1 <SEP> aq. <SEP> 100 <SEP> env. <SEP> 50
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<tb> substituable <SEP> u/mg.
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Résine de charbon NaCi aq. 40-60 env. 100 e,,i * * 12 NaCl aq. 40-60 env. 100 sulfonée l s api ,, /m> sulfonêe S04 aq. 40 u/mg.
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Carbone <SEP> 20 <SEP> eau-méthanol <SEP> 60-75 <SEP> 200-350
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<tb> acide <SEP> u/mg.
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Argile <SEP> smectique <SEP> 50 <SEP> hydrochlorure <SEP> 30-40 <SEP> 75
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<tb> de <SEP> pyridine <SEP> aq. <SEP> u/mg.
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Copolymère <SEP> d'acide <SEP> 600-1500 <SEP> HCl <SEP> aq. <SEP> 100 <SEP> 600
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<tb> méthacrylique <SEP> et <SEP> de <SEP> u/mg.
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<tb> divinylbenzène <SEP> ren-
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<tb> fermant <SEP> 5% <SEP> de <SEP> divinyl-
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<tb> benzène
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<tb> Copolymère <SEP> d'acide <SEP> 300-800 <SEP> HC1 <SEP> aq. <SEP> 100 <SEP> 600
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<tb> méthacrylique <SEP> et <SEP> de <SEP> ,. <SEP> u/mg.
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<tb> divinylbenzène <SEP> renf.
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10% <SEP> de <SEP> divinylbenzène
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<tb> Une <SEP> résine <SEP> carboxylique
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<tb> supposée <SEP> être <SEP> du <SEP> type <SEP> 500-900 <SEP> HCl <SEP> aq. <SEP> 100 <SEP> 650
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<tb> phénol-formaldéhyde, <SEP> u/mg.
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<tb> connue <SEP> sous <SEP> le <SEP> nom <SEP> de
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<tb> Permutite <SEP> XHIC.
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