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" Procède de production d'antigènes pour le diagnostic des avortements infectieux ".
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La présente invention concerne un procédé perfection- né pour produire un antigène utilisable pour le diagnostic des avortements infectueux par l'essai de l'anneau d'abortus BANG.
On sait que l'on emploie l'essai de l'anneau d'abor- tus BANG pour indiquer les anticorps des avortements in- fectueux, voir : P/A. BRUHM; Problems associated with the abortus-Bang-ring-test, Skandinavisk Veterinar Tidskrift t.38, pages 71-93 (1948). Dans l'essai de l'anneau , on emploie généralement un mélange de bacté- ries de l'avortement colorées ( brucella abortus Bang, brucella suis et éventuellement brucella melitensis) une partie en poids de bactéries étant mélangée à 5 parties en poids de liquide .
Suivant les indications publiées, on effectue la coloration en mélangeant simplement les bac- téries dans un liquide colorant qu'on laisse reposer à la température du réfrigérant, soit 2 à 4 C, pendant un laps de temps pouvant atteindre 24 heures, mais par ce procédé l'antigène n'est pas suffisamment colo- ré. Les bactéries ainsi colorées sont ensuite lavées à l'eau de ville . Toutefois, l'antigène ainsi produit n'est pas assez spécifique .
On ajoute une goutte du mélange de bactéries colo- rées mentionné ci-dessus de 1 cm3 du lait des animaux qu'il s'agit d'examiner. Lorsque le lait contient des anticorps (corps antagonistes) correspondant aux bacté- ries de l'avortement, ce qui signifie que le lait provient d'animaux infectés par ces bactéries, il se produit une adhérence de l'anticorps aux bactéries de l'avortement colorées qui ont été ajoutées avec l'antigène de l'essai
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de l'anneau, et il en résulte une défloculation de petits amas de bactéries qui adhèrent aux globules de corps gras du lait et qui sont entraînés avec ces derniers dans la couche de crème .
Au contraire, s'il n'y a pas d'anticorps dans le lait, ou s'ils sont pré- sents à un degré moindre, les bactéries d'avortement colorées ajoutées restent en suspension uniforme dans le lait. On utilise comme colorant de l'hématine qui peut être formée par oxydation de l'hématoxyline. Si l'essai est effectué, par exemple, sur 1 cm3 de lait contenant lesdits anticorps, les bactéries de l'avortement colorées, agglutinées, s'élèvent avec les globules de corps gras jusque dans la couche de crème qui se forme et forment ainsi un anneau ou plutôt un disque fortement coloré.
L'antigène employé jusqu'ici pour l'essai de l'anneau coloré a toutefois, ainsi qu'on l'a constaté, deux incon- vénients principaux . En premier lieu, il a plus ou moins le défaut de ne pas être spécifique par suite de la précipitation du colorant à l'extérieur des bactéries et, dans certains cas, parce que la souche de brucella em- ployée pour la production de l'antigène est dissociée et est donc constituée par un mélange de bacteria brucella différent de la souche d'origine en phase lisse, c'est-à- dire différent du point de vue de ses qualités de culture et de ses qualités aérologiques. En second lieu, l'antigène employé n'est pas assez sensible pour combattre l'avorte- ment en pratique .
Vis-à-vis de ces procédés connus, l'invention concerne un procédé pour produire un antigène utilisable pour le diagnostic de l'avortement infectieux par l'essai de l'anneau d'abortus Bang, caractérisé en ce qu'on colo- re les bacteria brucella par un colorant pour mordant et en ce qu'on dilue les bactéries colorées par un liquide dans une proportion allant de 5 cm3 à 100 cm3
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de liquide pour une quantité de bactéries correspondant à 1 gramme à l'état séparé humide.
Des expériences montrent qu'une coloration intense des bacteria brucella à utiliser pour faire l'antigène destiné à l'essai de l'anneau et la suspension des bacté- ries dans une quantité de liquide plus grande que celle qui était employée jusqu'ici, sont une condition importante ou primordiale pour faire un antigène très sensible conve- nant bien pour l'utilisation en pratique .
Un antigène coloré intensément est réparti en cinq échantillons que l'on agite dans un liquide de suspension tel que le glycérol à différents degrés de dilution : Antigène UI 1 g.de bacteria brucella colorées dans 5 cm3 de liquide de suspension
EMI4.1
<tb> Antigène <SEP> II <SEP> 1 <SEP> " <SEP> " <SEP> " <SEP> tt <SEP> 10 <SEP> cm3 <SEP> "
<tb>
EMI4.2
Antigène III 1 tr Il te 20 cm3 if
EMI4.3
<tb> Antigène <SEP> I <SEP> V <SEP> l <SEP> " <SEP> " <SEP> "
<tb>
EMI4.4
Antigène V 1 Ii " If If 80 cm) "
On prépare, en outre, dix dilutions de plus en plus étendues de lait mélangé, contenant l'anticorps des brucella (par abréviation cab) dans du lait complètement exempt d'an- ticorps de brucella (par abréviation eab) pour former des échantillons de 10 cm3 chacun,
de manière que la teneur en anticorps soit réduite de moitié d'une dilution à la sui- vante. On introduit à la pipette 1 cm3 de chaque échantillon dans cinq rangées de tubes d'agglutination, chaque rangée contenant autant de tubes qu'il y a d'échantillons de dilu- tion différente. On ajoute à chaque tube de la première de ces rangées une goutte (environ 0,05 cm3) d'antigène I,à chaque tube de la deuxième rangée une goutte d'antigène II et ainsi de suite. On agite fortement tous ces échantillons et on les place dans une étuve à 37 C. On les examine après
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un étuvage d'une heure, la réaction étant pratiquement terminée dans ces conditions.
Le résultat est indiqué dans le tableau suivant où la première ligne indique la dilution du lait contenant des anticorps de brucella dans le lait absolument exempt dtagglutinat de brucella:
EMI5.1
<tb> c <SEP> ab <SEP> 1:2 <SEP> 1 <SEP> :4 <SEP> 1:8 <SEP> 1:16 <SEP> 1:32 <SEP> 1:64 <SEP> 1:128 <SEP> 1:256 <SEP> 1:
512 <SEP> e <SEP> ab
<tb>
<tb> Ant. <SEP> 1 <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> (+) <SEP> o <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> o <SEP> o
<tb>
<tb> Ant. <SEP> II <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> (+) <SEP> o <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
<tb> Ant.III <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> ( <SEP> + <SEP> ) <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
<tb> Ant.IV <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> - <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> (+) <SEP> o <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
<tb> Ant. <SEP> V <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> ( <SEP> + <SEP> ) <SEP> 0 <SEP> o
<tb>
L'intensité de la réaction est indiquée/de la manière suivante . o : réaction négative.
Couche de crème blanche, colonne de lait @ sous-jacente violet bleuâtre.
(+): réaction douteuse. Couche de crème ayant à peu près la même couleur que la colonne de lait sous-jaeente.
+ : réaction faiblement positive. Couche de crème d'un violet bleuâtre en forme d'anneau, colonne de lait dé- sous-jacente non/colorée de manière visible.
++ : réaction positive. Couche de crème d'un violet bleuâ- tre en forme d'anneau, colonne de lait souskjacente dé colorée visiblement mais non totalement.
+++ : réaction nettement positive. Couche de crème colorée en violet bleuâtre et nettement définie, colonne de dé- lait sous-jacente complètement/colorée.
Cette image de la réaction est typique et montre que la sensibilité de l'antigène est approximativement une fonction linéaire du degré de dilution de l'antigène.
Cette loi n'est valable qae lorsque l'antigène employé est un antigène spécifique, c'est-à-dire lorsqu'il donne
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une couche de crème absolument blanche lorsqu'il est ajouté à du lait, ne contenant pas d'anticorps de brucella et lorsque ce mélange est étuvé à 37 C pendant une heure par exemple, délai à la fin duquel on suppose que la formation de la crème est achevée . On peut ajouter que, dans des cas rares, le lait peut contenir des substances sen inhibitrices qui réduet accroissement typique de la sensibilité avec l'accroissement de la dilution.
Si l'antigène n'est pas spécifique du fait de la précipitation de colorants à l'extérieur des bactéries ou au voisinage de celles-ci, ou du fait de sa capacité plus ou moins grande à s'agglutiner spontanément, ou du fait de ces deux raisons, et s'il se trouve que l'antigène ait une couleur pâle , la relation entre le degré de dilution de l'antigène et le degré de sensibilité est moins nette . Une réaction "positive" sera alors une fonction additive d'une réaction non spécifique et d'une réaction spécifique . Il sera donc pratiquement impossi- ble de distinguer une réaction faiblement positive d'une réaction négative . En pratique, il est nécessaire de considérer que le lait riche en bactéries colore l'anti- gène à un certain degré'.
C'est ce qu'on reconnaîtra notamment à la coloration intense de l'antigène aux faibles concentrations .
Il semble que la limite de dilution soit d'environ 1 g de bactéries colorées pour 100 ml de liquide de suspension. A cette dilution, on remarquera que, si la réaction n'est que faible, la couche de crème supérieure sera blanche, tandis que la couche inférieure sera colorée en bleu violet par les bacteria brucella colo- rées agglutinées. Ceci peut être dû au fait que les bactéries colorées en nombre relativement petit ne
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forment qu'assez lentement des grumeaux suffisamment grands pour adhérer aux globules gras qui s'élèvent.
Les bactéries peuvent être colorées en une seule phase en faisant agir simultanément le mordant et le colorant sur les bactéries ou en deux phases en traitant d'abord les bacté- ries par le mordant, puis par le colorant.
La coloration des bactéries peut avoir lieu à toute température appropriée entre -2 C et + 140 C. Pour opérer au- dessous de 0 c. il est nécessaire que le liquide contienne un antigel,par exemple de la glycérine. Les températures basses ont l'inconvénient d'exiger un traitement relativement long,à savoir plus de 12 heures entre -2 et + 10 c. A des terapératu- a res comprises entre 10 et 400',la durée de traitement nécessi re est réduite d'environ 12 heures à 1 heure.
A ces températu- res notamment à des températures allant jusque environ 20 C, des précipitations relativement grandes du complexe de mordant et de colorant se produisent à l'extérieur des bactéries.Des températures de plus de 100 C ont l'inconvénient d'exiger des autoclaves.Les températures préférées sont comprises entre 60 et 90 C.A ces températures le traitement s'effectue facilement en 1 à 5 ou en 10 minutes ou davantage,et les bactéries exis- tantes sont tuées.Les propriétés antigéniques des bacteria bru- cella ne sont pas détruites et il ne se forme que de petites précipitations ou aucune précipitation du complexe de mordant et de colorant au voisinage des bactéries,si la valeur de pH du liquide est suffisamment basse,
c'est-à-dire que le complexe est presque entièrement précipité sur les bactéries et qu'il n'y a pas de précipitations libres en suspension dans le liqui de environnant les bactéries,ces dernières précipitations li- bres étant répréhensibles.Il résulte de ce qui précède que la formation du complexe de mordant et de colorant est accrue lorsque la température monte.
Il est possible,à toutes les températures comprises entre -2 C et + 140 C, d'obtenir une coloration intense des bacteria brucella.
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La coloration peut être faite en une phase, les bactéria brucella étant traitées simultanément par le mordant et par le colorant. Les mordants employés peu- vent être, par exemple, des mordants à l'aluminium , au chrome ou au fer, et les colorants peuvent être de l'hématéine et d'autres colorants acides pour mordant.
Les bactéries sont colorées par un liquide contenant un mordant, par exemple du sulfate d'ammonium et d'alu- minium ou du chlorure d'aluminium et un colorant acide tel que l'hématéine auquel on ajoute les bactéries en les agitant de manière à obtenir une bonne suspension des bactéries dans le liquide . En laboratoire, on peut au besoin employer un mortier pour mettre les bacté- ries centrifugées en;suspension dans un peu de ce liquide, tel que de l'eau distillée et l'opération de coloration commence en ajoutant les bactéries d'abord goutter goutte puis plus rapidement. Plus la coloration que l'on désire donner aux bactéries est prononcée, plus la quantité de liquide de coloration employée doit être grande par rapport à la quantité de bactéries.
Il est ainsi possible d'effectuer la coloration en deux opérations, les bactéries étant d'abord traitées par un mordant, après quoi elles sont colorées au moyen du colorant. Comme mordant, il est avantageux d'employer de l'alun d'ammonium à faible concentra- tion, par exemple, une proportion molaire de 0,01 . La valeur de pH de cette solution est abaissée à un point tel que la valeur du pH de la solution soit comprise entre 2,50 et 5,0 lorsque la suspension de bactéries a été agitée à fond dans la solution. Les valeurs inférieures du pH, c'est-à-dire les valeurs d'environ 2,5, peuvent être employées lorsque le mordant de est/l'alun d'ammonium à concentration élevée ou de l'alun
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de fer.
A des valeurs plus grandes de pH et aussi, à des températures plus hautes, il se forme de plus grandes quantités du complexe mordant-colorant.
Aux plus hautes valeurs de pH, à partir de 3,7, quelques précipitations gênantes de composés basiques d'aluminium peuvent se former et donner à la suspension un caractère colloïdal marqué du fait de la formation d'hydroxyde d'aluminium qui agglutine-,les bactéries lorsqu'on se rapproche du point iso-électrique des bacté- ries. On laisse reposer le liquide pendant une heure à la température ambiante ou à des températures plus hau- tes, après quoi la valeur du pH est éventuellement réduite jusqu'à environ 3,0 , et on élimine par centri- fugation l'excès d'alun d'ammonium . Eventuellement, on lave le résidu à environ la même valeur de pH jusqu'à ce que l'excès de mordant soit éliminé.
Lorsque les bactéries ont été ainsi traitées par le mordant, on les agite dans une solution aqueuse d'hématine à 0,015 en proportion moléculaire par exemple, la valeur de pH de cette solution étant assez petite pour que, lorsque la solution a été agitée avec les bactéries combinées au mordant, la valeur du pH de la solution soit inférieure à 3,50. Après la coloration, que l'on peut obtenir en laissant reposer pendant longtemps à la température du réfrigérant, ou pendant moins longtemps à une tempé- rature plus haute, on élimine l'excès de liquide colo- rant avantageusement par centrifugation, le cas échéant après avoir abaissé la valeur du pH. L'excès du complexe de colorant peut être éliminé de la manière décrite ci-après.
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Il résulte de ce qui précède que la valeur du pH, des différentes solutions est très importante . La colo- ration doit avoir lieu dans un liquide dont le pH est compris entre 2,25 et 5. Si la valeur de pH est infé- rieure à 2,25, le mortant n'est pas suffisamment actif et il reste en grande partie dans la solution, et si la valeur de pH est sensiblement supérieure à 5, les diffi- cultés mentionnées plus haut rendront impossible toute coloration intéressante . Dans la plupart des cas, il est préférable de fixer les limites de pH à 2,50' et 3,50 et on peut souvent obtenir de meilleurs résultats encore entre les limites 2,75 et 3,25.
Dans certains cas, il est même préférable d'employer des limites encore plus voisi- nes, car on obtient souvent les meilleurs résultats entre 2,90 et 3.10, notamment dans le procédé de coloration en une phase .
Les valeurs élevées ou relativment élevées de pH peuvent être employées lorsque la teneur du liquide colorant en bactéries par cm3 est grande .
En colorant à une valeur de pH de 3 environ ou plus, on obtient pour les bactéries la coloration la plus foncée, qui est plutôt d'un violet noirâtre-
Si le pH est maintenu à une valeur ne dépassant pas 3,0 il est possible d'éviter une précipitation du com- plexe colorant d'hydroxyde d'aluminium, lorsqu'on utilise un mordant à l'aluninium. Lorsqu'on procède ainsi, on peut supprimer le lavage des bactéries colorées, lavage qui est ordinairement effectué et qui prend beaucoup de temps (voir plus loin) , à condition que la solution de colorant et de mordant qui est employée, ne contienne pas une quantité de colorant et de mordant supérieure à celle pour laquelle la solubilité du complexe hydroxy-
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de d'aluminium colorant est dépassée après la teintu- re à la valeur de pH particulièrement.
La valeur de pH de la solution de colorant et de mordant doit être réduite de manière à ne pas dépasser 3,0 environ après l'agitation avec les bactéries.
La coloration à un pH de plus de 3 ,0 environ, en- traîne des précipitations de complexe de mordant et de colorant qui sont d'autant plus prononcées que le pH est plus éleé, à moins que la quantité de bactéries proportionnellement au complexe de mordant et de colorant ne soit tellement grande que ces bactéries soient capa- bles, au cours de l'opération de coloration, de fixer une quantité telle du complexe de mordant et de colorant que sa solubilité après la coloration ne soit pas dépassée, à la valeur particulière du pH. Si la valeur du pH est sensiblement plus haute, le complexe de mordant et de colorant est précipité avec l'hydroxy- de.
.Les concentrations du mordant et du colorant ont un effet essentiel sur les résultats obtenus. Dans le procédé en une phase mentionné; plus haut, on peut em- ployer une concentration relit uinvemtn grande du mor- dant, jusqu'à 0,40 en proportion mo,aire ou un peu plus. Dans le procédé à deux phases, on peut utiliser des concentrations très basses pouvant être réduites jusqu'à 0,0001 en proportion molarue
Plus la coloration désirée des bactéries doit être prononcée, plus la quantité de liquide colorant doit être grande par rapport à la quantité de bactéries, et plus la solution de colorant doit être concentrée.
Il n'est généralement pas opportun d'employer des con- centrations de moins de 0,0035 en proportion molai- re, et il n'est pas nécessaire de dépasser environ 0,02
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en proportion molaire. Les faibles concentra- tions conviennent bien pour les suspensions diluées de bactéries, tandis que les fortes concentrations de 0,0045 et plus en proportion molaire doivent être utilisées pour les suspensions plus concentrées contenant une plus grande quantité de bactéries par cm3. Dans certains cas, on peut utiliser des concen- trations atteignant 0,02 en proportion molaire.
Pour produire un antigène de spécificité élevée ou absolue, il faut que la précipitation du complexe de mordant et de colorant combiné à l'hydroxyde soit environnant les nimum ou nulle dans' le liqueide e. bactéries.
On peut obtenir ce résultat en colorant les bac- téries à une haute température,par exemple entre 60 et 90 C, aussi bien dans le procédé en une seule pha- se que dans le procédé en deux p hases. En outre, dans le cas d'une précipitation éventuelle, on peut l'élirai ner en lavant la suspension contenant les bactéries par un liquide, par exemple de l'eau distillée ou de l'eau de ville acidifiée par l'addition d'une substan- ce acide, telle que de l'acide chlorhydrique, jusqu'à une valeur de pH d'environ 3 ou moins.
Après le mélange, on règle la valeur du pH pour- la réduira à environ 3 ,0 ou moins, après quoi on centri fuge les bactéries de nouveau. On répète ce lavage des bactéries à peu près à la même valeur de pH,jus- qu'à ce que l'excès de colorant soit éliminé, en d'autres termes aussi longtemps que des quantités con sidérables de colorant peuvent Être dissoutes. En général,deux lavages sont suffisants et,après la deu- xième lavage, on met en suspension ,de la manière de crite plus haut, les bactéries qui ont été séparées par le lavage.
Un autre moyen consiste à réduire le
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colorant, par exemple l'hématéine, en hématoxyline.On peut obtenir cette réduction par tout réducteur approprié tel que le thioglycolate de sodium, de préférence à de basses valeurs de pH. Après la réduction, il est préfé- rable d'éliminer par centrifugation l'excès de colorant réduit et de mordant. Le cas échéant, on peut neutraliser l'action de l'excès de mordant en élevant la valeur du pH.
Pour obtenir les meilleurs résultats, il est néces- saire d'employer une souche antigénique de bactéria brucel la bien équipée, qui ne soit pas agglutinable spontané- ment. A cet effet, on étale une bonne souche de ces bac- téries sur un milieu solide approprié, par exemple, un mélange de pommes de terre et de gélose ou de glycérine et de gélose auquel on ajoute 1 % de glucose . Après étuvage à 37 C pendant 48 à 72 heures on examine la culture à travers un objectif de faible puissance, en lumière réfléchie oblique et on prélève une colonie lisse typique et on l'utilise comme souche d'ensemencement pour la production d'antigène pour l'essai de l'anneau.
Dans la phase lisse, les bacteria brucella forment des colonies circulaires, lisses, convexes, luisantes, transparantes et de consistance molle . Ainsi qu'on l'a déjà dit, elles sont bien équipées antigéniquement et elles forment facilement des suspensions hemogènes.
Leur virulence peut varier. Expérimentalement,la cultu- re souche isolée dans la phase lisse est amenée à se dissocier par une culture répétée et prolongée dans un bouillon de glycérine, et on produit l'antigène pour l'essai de l'anneau, en partie avec la variante rugueu- se dissociée et en partie avec la souche lisse exacte- ment dans les mêmes conditions pour les deux cas. L'anti- gène produit avec la variante rugueuse, reste non spéci-
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fique, et done donc une réaction ++ aec du lait absolu- ment exempt d'anticorps d'avortement, tandis que l'anti- gène. produit à partir de la trace lisse non dissociée est complètement spécifique .
La souche de bacteria brucella est cultivée de ma- nière aérobie en phase lisse, c'est-à-dire en phase lisse, non agglutinable spontanément, de 37 C pendant 3 à 5 jours et nuits, de préférence sur une substance nutritive convenablement séchée. Il est aussi possible de cultiver les bactéries submergées dans un milieu li- quide aéré.
On peut verser un mélange fondu d'agar-agar et de pommes de terre, contenant par exemple 3 % d'agar-agar dans des flacons de Roux en quantité suffisante pour former une couche d'environ 1/2 cm lorsque les flacons sont posés horizontalement. On bouche ensuite les flacons et on les place dans un autoclave pendant 30 minutes,à cm2 une pression de lKg/ environ.
Pour les ensemencements, on emploie des bacteria brucella de type lisse, cultivées ce manière aérobie.
Chaque flacon de milieu de culture est ensemencé avec une suspension suffisante de bactéries. Les flacons easemencés sont ensuite renversés et placés horizontale- ment dans l'étuve où on les laisse 72 à 96 heures à 37 C
Après avoir examiné les cultures du point de vue de leur contamination, on met les cultures de bacteria bru- cella en suspension dans une solution saline physiologi- que et on filtre la suspension de bactéries à travers une gaze pour retenir l'agar-agar restant le cas échéant et provenant des flacons de Roux. On centrifuge ensuite la suspension de bactéries et on colore les bactéries après avoir décanté le liquide limpide qui surnage.
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La culture souche de bacteria brucella utilisée pour la production de l'antigène est en grande partie mainte- nue en phase unie par de fréquents ensemencements sur des milieux nutritifs solides convenablement séchés, sur les- quels elle est étuvée à 37 C pendant 12 heures environ.
On a constaté qu'il est très important de maintenir le'plus possible la culture de la souche à l'état de croissance dit positif pour tenir compte de la dissocia- tion . La culture de la souche doit être réensemencée fréquemment, par exemple tous les quatorze jours, et dans l'intervalle, elle doit être maintenue de préférence à la température du réfrigérant.
Après la coloration, on centrifuge les bactéries et on décante le liquide.
Le procédé conforme à l'invention permet de colorer les bactéries si intensément qu'on peut, après l'opéra- tion, les agiter dans un liquide de suspension tel qu'une solution saline à 0,85 %, à laquelle en peut ajouter un désinfectant approprié, tel que 1/2%. d'acide phénique, ou ce qui est préférable, pour la conservation et la sta- bilisation, dans un liquide organique inerte tel que de la glycérine, en proportion supérieure à celle qui a été employée jusqu'ici, c'est-à-dire en proportion supérieu- re à 1:5, par exemple 1:10 ou mieux encore 1: 20 ou même davantage . On a constaté, dans ces conditions , que la sensibilité de l'antigène croît avec le degré de dilu- tion.
On ajoute une goutte de cette suspension à 1 cm3 du lait à examiner.
Par la culture ci-dessus des bactéries en phase lis- se et par le traitement ultérieur décrit, on produit, contrairement à ce qui se passe, dans les procédés anté-
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rieurs, un antigène absolument spécifique pour l'essai de l'anneau .
Le procédé conforme à l'invention permet de produire un antigène complètement spécifique qui est plus de cent fois plus sensible que tout autre antigène décrit--- jus- qu'ici . En d'autres termes, il est maintenant possible de régler l'antigène de façon à obtenir toute sensibilité pratique désiréece fait étant très important pour la lutte contre l'avortement dans la vie pratique . Il est donc maintenant possible de produire un antigène de sensibilité telle qu'il puisse déceler, avec une marge de sécurité raisonnable, la présence d'une seule vache infectée d'avor- tement parmi un troupeau de cent vaches par exemple, par un seul essai de l'anneau appliqué au lait mélangé prove- nant des vaches en question.
Lorsque les bactéries sont tuées de la façon décrite ci-dessus par chauffage à plus de 60 C, par exemple à 80 C. il est possible d'éviter le risque d'infection que l'antigène utilisé pour l'essai de l'anneau pourrait présenter dans d'autres conditions.
On obtient ainsi des résultats décisifs non entachés des erreurs bien connues qui se produisent dans d'autres conditions et qui sont dues au résidu de complexe de mordant et de colorantprécipité à l'extérieur des bacté- ries dans le mélange d'antigène.
Exemple :
Le liquide colorant peut être convenablement composé de la façon suivante. On mélange 250 cm3 d'une solution aqueuse à 5% de sulfate d'ammonium et d'aluminium à 120 cm3 de glycérine et 200 cm3 d'une solution d'hématoys- line dans de l'alcool absolu . On ajoute ensuite 1 gr d'iodate de sodium dissous dans 15 cm3 environ deau distil-
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lée. On peut aussi utiliser tout autre oxydant appro- prié tel que du permanganate de potassium ou de l'eau oxygénée . On poursuit l'opération d'oxydation jusqu'à ce que la solution prenne une couleur rouge bordeaux foncé, puis on l'interrompt en diluant la solution de bouillon coloré avec 4750 cm3 d'une solution à 5 % d'alun d'ammoniaque .
Par le mode opératoire qui vient d'être décrit, l'hématoxyline est oxydée et transformée en hématéine de formule
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Si l'on ajoute une solution de ce colorant à une solution d'alun d'ammoniaque, les ions aluminium s e com- binent à l'hématéine et forment ce qu'on appelle le noyau de "chélate La combinaison de mordant, des ions d'aluminium et du colorant (hématéine). se présente alors de la façon suivante :
EMI17.2
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En d'autres termes; la réaction est la suivante :
EMI18.1
où F désigne le complexe de colorant, et la loi d'ac- tion de masse donne alors :
EMI18.2
Il en résulte donc que tout abaissement de la concentration en ions hydrogène provoque un accroisse- ment de la concentration du complexe de colorant et de mordant.
Suivant l'invention, il convient d'employer à cet effet une concentration de mordant relativement faible . Si m'on utilise un mordant à l'aluminium, il faut l'employer de préférence à une concentration
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, moleclai-re un peu inférieure à 0,38. On voit, en outre, qu'un accroissement de la concentration en ions d'aluminium joint à un accroissement de la concentration en hématéine , provoque un accroissement du complexe mordant-colorant, à condition que la valeur du pH soit maintenue la même . Toutefois, les choses se compliquent maintenant du fait que la combinaison d'hié- matéine et de mordant se comporte comme un indicateur avec un virage de couleur à une valeur approximative de pH 3 environ, à la température ambiante.
A une valeur de pH supérieure à 3, la solution de colorant prend une couleur violette foncée, tandis que, pour une valeur rougeâtre. de pH inférieure à 3, elle prend une couleur / On peut supposer que le complexe d'hématéine et de mordant mentionné dans l'équation donnée ci-dassus pour la loi d'action de masse se forme particulièrement lorsqu'on se rapproche d'une valeur/ pH de 3 ou davantage . La
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solubilité de ce dernier est très faible, car il pré- cipite à l'état d'hydroxyde suivant l'équation;
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ce qui signifie que l'activité du complexe modrant-col9- rant, multipliée par le cube de l'activité de l'hydroxy- de, est égale au produit de solubilité de l'électroly- te.
Ceci montre que la solubilité de HO,A1:F.A1 (OH)2 diminue brusquement lorsque la valeur du pH s'élève.
Ce qui se passe est probablement ce qui suit.
En chauffant une solution d'alun d'hématéine, ayant une valeur de pH de 2,50 à la température ambiante, et par conséquent une couleur rouge transparente, on remarque que cette couleur passera au violet foncé opaque, propa- blement parce qu'il se forme ainsi plus de +A1:F.A1 avec une solubilité qui est nettement plus grande à une température supérieure . Le phénomène explique ainsi le
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fait qu'à une température supérieure les bactéries reçoi- ,-ait qufà une température Mi 1Y vent une coloration violetteyintense mt ivysras xîits ymoraonm- même bien que le liquide colorant ait une couleur rougeâtre , aussi bien avant qu'après l'opération de coloration.
'Si l'on désire une coloration encore plus prononcée de l'antigène, on peut l'obtenir en appliquant une solution préparée de la façon suivante : on fait dissou- dre 1 gr d'hématoxyline + 2,54 g de NH4Al (SO4)2 12 H2O dans 100 cm3 d'eau distillée en chauffant. On oxyde ensuite l'hématoxyline en ajoutant 0,18 gr. de Na IO3 dissous dans environ 2 cm3 d'eau, ou tout autre oxydant approprié. La couleur devient alors rouge bordeaux foncé et il se produit en même temps des précipités colo- rés que l'on filtre et l'on utilise le filtrat pour la coloration de manière usuelle .
Les bactéries cultivées en phase lisse sont alors
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colorées dans la solution colorante décrite ci-dessus,puis on élimine tout surplus de colorant par un lavage par des acides dilués, non oxydants, par exemple de l'acide chlorhydrique très dilué . On mélange les bactéries puri- fiées à un liquide en quantité de 15 à 39 fois plus grande ou même davantage , suivant la sensibilité désirée, et on ajoute une goutte de cette suspension à 1 cm3 de lait à examiner- Après avoir agité à fond, on incube l'échantillon à 37 C et on l'évalue normalement après une heure.
On voit d'après ce qui précède qu'il est facile de normaliser l'antigène.
Le résultat d'expériences corrélatives faites avec divers types d'antigènes utilisés pour l'essai de l'anneau est indiqué dans le tableau ci-dessous. Pour les essais 1 , II et 111, on a utilisé un antigène produit par les procédés connus tandis que l'essai IV a été fait avec un antigène obtenu par le procédé conforme à l'invention, avant que le procédé ait été' mis au point dans tous ses détails, de.sorte que l'antigène n'était pas aussi sensible qu'il a été possible de le pro- duire depuis lors.
Durée d'incubation à 37 C
30 minutes
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<tb> To. <SEP> 1:2 <SEP> 1:4 <SEP> 1:8 <SEP> 1:16 <SEP> 1:32 <SEP> 1:64 <SEP> 1:128 <SEP> 1:256 <SEP> 1:512T
<tb>
<tb>
<tb> I <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> + <SEP> (+) <SEP> 0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> II <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> III <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> (+) <SEP> 0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> IV <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> (+) <SEP> 0
<tb>
1 heure
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<tb> I <SEP> To. <SEP> 1:2 <SEP> 1 <SEP> :4 <SEP> 1:8 <SEP> 1:16 <SEP> 1 <SEP> :32 <SEP> 1:64 <SEP> 1:120 <SEP> 1:256 <SEP> 1:
512 <SEP> Tr.
<tb>
<tb> I <SEP> +++ <SEP> %++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> + <SEP> (+) <SEP> (+) <SEP> (-!-) <SEP> ( <SEP> + <SEP> ) <SEP>
<tb>
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II +++ +++ +++ +-H- ++-!- +++ r+r +++ +++ -s -- -- 2e -!-
EMI20.4
<tb> III <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> ( <SEP> + <SEP> ) <SEP> ( <SEP> + <SEP> ) <SEP> ( <SEP> + <SEP> ) <SEP> ( <SEP> + <SEP> ) <SEP>
<tb> IV <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> (+) <SEP> 0
<tb>
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Ces essais ont été faits avec plusieurs échantillons de 5 cm3 de lait préparés par dilution suivant un rapport croissant d'un échantillon provenant d'un troupeau infec- té d'avortement (désigné par To)
dans un échantillon provenant d'un troupeau absolument non infecté (désigné par Tr) par fractions de 5 cm, en portions de 5 m1. On a ensuite placé 1 cm3 de ces échantillons au moyen d'une pipette dans de petits tubes d'essai (tubes d'agglutina- tion) disposés en 4 rangées, de façon que les dilutions correspondent exactement les unes aux autres dans les tubes. On a ensuite ajouté à chaque rangée une goutte de l'une des quatre sortesd'antigène pour l'essai de l'anneau, puis on a agité les échantillons et on les a étuvés à 37 C. L'estimation des réactions a eu lieu après 30 et 60 minutes respectivement.
L'estimation après 30 minutes à 37 C dans l'étuve montre que l'antigène II est nettement non spécifique et donne, même avec l'échantillon provenant d'un troupeau absolument non infecté, une réaction nettement positive, Quant à la sensibilité relative des autres antigènes,on constate que l'antigène IV est de beaucoup la plus sensi- ble; en effet il est quatre fois plus sensible que les antigènesl et III .
Après une heure, l'antigène II d'essai de l'anneau donne une réaction +++. qui est une réaction très marquée, même avec l'échantillon provenant d'un troupeau absolument non infecté constitué d'animaux pour lesquels ni l'examen de chaque vache par des essais d'anneau ni l'examen par des essais faits sur le sang, n'ont permis
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d'indiquer.d'anticorps contre l'avortement infectieux, même en examinant le sérum du sang dilué à 1 :10 .
En ce qui concerne les antigènes I et III, il semble probléma- tique d'étuver les échantillons provenant des troupeaux
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pendant une heure avant de procéder à l'évaluation car, dans les deux cas, on obtient une couche de crème de la même couleur violet bleuâtre que la colonne de lait sous-jacente ce qui, en pratique, donne une proportion relativement grande de réactions douteuses. D'autre part, l'antigène IV est constamment complètement spéci- fique , même après avoir été étuvé pendant une heure à 37 C, le. dépôt de crème pouvant alors être considéré comme pratiquement achevé, la couche de crème étant encore blanche .
Donc, en ce qui concerne les antigènes I et II pour l'essai de l'anneau, la durée d'étuvage devrait être limitée à 30 minutes afin d'éviter toutes réactions positives fausses. On voit également par le tableau que l'antigène IV est seize fois plus sensible que les antigènes I et III pour l'essai de l'anneau .
Comme l'antigène IV est nettement spécifique, on peut porter la durée d'étuvage d'une demi-heure à une heure en ou davantage, la réaction devant ainsi 4 fois plus sensible . De plus, l'antigène IV est colosé si intensé- ment par le chauffage, qu'il a été possible de diluer les bactéries colorées dans un liquide de suspension dans un rapport de 1 :20 lieu de 1:5 comme on le fait dans les procédés connus, tout en conservant une inten- sité de coloration suffisante pour l'antigène terminé, de sorte que la réaction est devenue en outre 4 fois plus sensible .
Le tableau fait aussi apparaîtra qu'il a été possi- ble, en utilisant l'antigène IV pour l'essai de l'an- neau, de diluer l'échantillon provenant d'un troupeau infecté d'avortement dans une quantité qui est au moins 256 fois plus grande d'un échantillon provenant d'un troupeau non infecté, en conservant une réaction positive .
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Cela signifie, en pratique, qu'il est possible, par des examens au moyen des essais de l'anneau d'échantillons provenant de troupeaux ou d'éch atillons mélangés, de décider avec un très haut degré de sûreté si le lait provient d'animaux infectés d'avortement et d'éviter ainsi, dans une grande mesure, l'essai compliqué et coûteux fait sur le sang de chacun des animaux, essai qui a été effectué jusqu'ici dans la lutte contre la brucellose, et de maintenir en général, contrairement à ce qui avait lieu jusqu'ici, le contrôle des animaux notés comme n'étant pas infectés, simplement par les exa- mens au moyen de l'essai de l'anneau En d'autres ter- mes, il est maintenant possible de signaler, d'une manière rapide, peu coûteuse et facile, à de courts intervalles et avec une grande efficacité, dans de grands et dans de petits champs ,
le bétail infecté individuelles d'avortement et aussi les vaches/infectés dans le bétail, ce qui permet d'enrayer largement le développement de la brucellose . On dispose également ainsi d'un moyen pour empêcher avec succès la fièvre ondulatoire (avorte- ment infectieux des veaux) qui est transmise à l'homme par l'absorption de lait non bouilli.