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PERFECTIONNEMENTS APPORTES AUX PROCEDES DE PREPARATION D'ANTIBIOTIQUES.
La présente invention est relative à un procédé de préparation d'une substance antibiotique dénommée viomycine; et elle concerne plus spé- cialement des procédés pour l'obtention de ce produit par fermentation, des méthodes pour sa récupération et sa concentration à partir de solutions brutes, y compris des bouillons de fermentation, pour sa purification et pour la préparation de ses sels. L'antibiotique et ses sels peuvent se présenter sous forme de leurs solutions diluées ou de concentrés bruts et à l'état de cristaux purs
L'antibiotique est formé au cours de la culture,, dans des con- ditions déterminées, d'un micro-organisme qui n'a pas encore été décrit jus- qu'ici et qui est dénommé Streptomyces puniceus.
Cet organisme a été isolé à partir d'un échantillon d'une terre qui se trouve près de Cienfuegos à Cu- ba, Sa description, selon la méthode indiquée dans le "Manuel de Bactériolo- gie déterminative!! de Bergey, 5e édition, pages 929 à 933, est donnée ci-a- près
Les caractéristiques culturelles de cette espèce, basées sur des souches portant les numéros 1314-5, sont données ci-dessous sous forme d'un tableau (les couleurs, à côté desquelles se trouve la lettre R, sont celles de Ridgway Golor Standards and Nomenclature).
. Les indications données sont basées sur dix éprouvettes à l'ex- ception de celles des sucres (2 éprouvettes).
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11 est à noter que, pour l'obtention de la viomycine on ne désire pas se limiter à cet organisme particulier ou à des organismes qui répondent entièrement à la description ci-dessus, celle-ci n'ayant été donnée qu'à titre illustratif. On vise également l'usage d'organismes qui sont obtenus à partir del'organisme décrit par des moyens de mutation tels que des rayons X, des rayons ultra-violets, des moutardes d'azote, etc.
Les antibiotiques, obtenus par les organismes du genre Streptomyces des Actinomycetes et dont plusieurs sont actuellement bien connus, appartien- nent à deux classes ; 1) des substances neutres qui peuvent être extraites hors des bouillons, avec un pH acide, neutre ou basique par des solvants et 2) des substances basiques en général et qui ne peuvent pas être extraites par des sol- vants organiques. La chloromycetine et l'actinomycine sont typiques pour le premier groupe et la streptomycine et streptothricine pour le deuxième.
D'après cette subdivision, la viomycine appartient au deuxième groupe. La viomy- cine partage également avec ce groupe la propriété de pouvoir être précipitée par certains colorants acides, tels que le chrome-violet Erio, l'orange fixe Pontamine, le rouge d'alizarine S, le bleu de synthracène, le bleu acier Pon- tamine, le-vert Pontamine et autres colorants à l'acide sulfonique similaires.
Ce groupe basique, auquel appartient la viomycine, est caractérisé par un spec- tre antibiotique étendu, plus particulièrement, parmi les bactéries gram-négatif.
Le tableau ci-dessous montre les spectres bactériens comparatifs de l'auréomy- cine,de la chloromycétine, de la streptomycine, de la streptothricine et de la viomy
Tableau I mg par ml * d'antibiotique nécessaire pour inhiber la croissance de micro-organismes sur des plaques d'agar nutritif.
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<tb>
<tb> M <SEP> Albicans <SEP> 2000 <SEP> 2000 <SEP> > <SEP> 2000 <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 3000
<tb>
chlorhydrate cristallisé cristallisé '3 Sulfate de streptomycine (750 unités de streptomycine mg) exprimé comme ba- se active en mg.
'Sulfate de streptothricine (ex helianthate cristallisée 800 unités de strep- tomycine/mg).
Sulfate de viomycine amorphe brut préparé selon l'exemple III ci-dessous.
La viomycine diffère, en outre, des antibiotiques connus et obtenus à partir du Streptomyces en comparant l'activité des préparations de ces antibiotiques pour des cultures de bactéries rendues résistantes à l'an- tibiotique par le transfert par série dans des bouillons contenant des quan- tités progressivement croissantes de l'antibiotique par rapport à la culture sensible initiale. Le tableau ci-dessous, dans lequel le dosage a été réduit à des unités de dilution E coli par milligramme (UDG), montre cette parti- cularité.
On entend, par unités de dilution E. coli par milligramme (UDC) le volume de bouillon nutritif en millilitres dans lequel un milligramme de la préparation antibiotique (qui peut avoir divers degrés de pureté) peut être dilué quand il est inoculé avec une dilution 10-b d'une culture pendant 18 heures d'une souche E. coli dans les mêmes conditions et qui, après une in- cubation pendant 18 heures à 37 , ne montre aucune croissance.
Tableau II
Comparaison de l'activité de divers antibiotiques contre des souches de A.aerogenes dans un bouillon nutritif
EMI6.2
<tb> Organisme <SEP> Aureomy- <SEP> Strepto <SEP> Strepto- <SEP> Chloromy- <SEP> Viomycine
<tb>
<tb> cine <SEP> mycine <SEP> thricine <SEP> cétine <SEP> 50 <SEP> 100
<tb>
<tb> 50 <SEP> 100 <SEP> 50 <SEP> 100 <SEP> 50 <SEP> 100 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb>
EMI6.3
(iDG/ml) (UDC:
/nl) (UDG/mil) (DDC/81) (UDe/ml)
EMI6.4
<tb> Ao <SEP> aerogenes <SEP> souche <SEP> A <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb>
<tb> Ao <SEP> aerogenes <SEP> souche <SEP> B <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> -
<tb>
<tb> A.
<SEP> aerogenes <SEP> souche <SEP> C <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb>
<tb> Ao <SEP> aerogenes <SEP> souche <SEP> D <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> +
<tb>
+ = croissance - = aucune croissance La souche A est sensible à 25 UDC/ml de tous les antibiotiques ci-dessus
EMI6.5
La souche B est sensible à 2000 UDC/ml de chloromycétine La souche C est sensible à 4400 UDG/ml de streptomycine et environ
25 UDG/ml de streptothricine La souche D est sensible à 7500 UDG/ml de streptothricine et environ
200 UDG/ml de streptomycine.
<Desc/Clms Page number 7>
Le tableau II montre que la viomycine est capable de retarder la croissance des souches de Ao aerogenes rendues résistantes à l'aureomycine, à la streptomycine et à la chloromycetine mais non pas des souches rendues résis- tantes à la streptothricine. Ceci distingue nettement la viomycine de tous ces antibiotiques, exception faite de la streptothricine.
La viomycine peut être distinguée de la streptothricine et de la strep- tomycine par son comportement sur un papier chromatographique dans de l'eau sa- turée avec du n-butanol et contenant 2% de pipéridine et 2% d'acide fi -toluène sulfonique, pour un traitement de 96 heures à 25 en se servant du B subtilis comme organisme d'essai.
EMI7.1
<tb>
Antibiotique <SEP> Rf
<tb>
<tb>
<tb> Streptomycine <SEP> A <SEP> 0,38
<tb>
<tb>
<tb> Streptothricine <SEP> 0,04
<tb>
<tb>
<tb> Viomycine <SEP> 0,06
<tb>
La viomycine est stable quand on la fait bouillir pendant 15 minutes à une concentration de 500 mgr/ml dans de l'eau avec un pH de 2,0, 6,5 et 9,0
La toxicité de divers antibiotiques y compris la viomycine est indiquée dans le tableau III.
Tableau III
Toxicité de divers antibiotiques (mg pour 20 gr. de souris)
EMI7.2
<tb> Antibiotique <SEP> Intraveineux <SEP> sous-cutané <SEP> par <SEP> la <SEP> bouche
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> LDo <SEP> Ld50 <SEP> Ld0 <SEP> LD50 <SEP> LDo <SEP> LD50
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> strepto- <SEP> 2,5
<tb>
<tb>
<tb> mycine
<tb>
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> strepto- <SEP> 4,0
<tb>
<tb>
<tb> thricine
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Chloromycétine <SEP> 0,6
<tb>
<tb>
<tb> Chlorhydrate <SEP> de <SEP> 1,5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Auréomycine
<tb>
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> viomyci-
<tb>
<tb>
<tb> ne <SEP> (brut) <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 10 <SEP> 35 <SEP> > <SEP> 200 <SEP> indéterminé
<tb>
La viomycine peut être obtenue par la culture du streptomyces punice- us,
de préférence de 24 à 30 , en profondeur avec agitation et aération sur un milieu contenant une source d'hydrate de carbone, telle que les sucres, l'amidon, le glycérol, une source d'azote organique, telle que la farine de fèves de soja ou du gluten de blé; une source de substances de croissance telle que des so- lubles de distillation; du sel ordinaire et du carbonate de calcium utilisés com- me agents tampons. Quand la croissance est terminée, le mycélium est séparé et l'antibiotique est précipité hors du bouillon, par exemple par l'addition de colo0- rants à l'acide sulfonique, tels que le chrome-violet Erio, l'orange fixe Pontami- ne, etc. Le gateau de colorant est ensuite décomposé et l'antibiotique est sépa- ré du filtrat.
L'inocluum peut être obtenu en utilisant une culture fournie par des souches ou flacons Roux inoculés avec du So puniceus. Un milieu solide, qui con- vient à cette souche initiale, est constitué par
EMI7.3
<tb> dextrose <SEP> 10 <SEP> gr.
<tb>
<tb> extrait <SEP> de <SEP> boeuf <SEP> 4 <SEP> gr.\
<tb>
<Desc/Clms Page number 8>
EMI8.1
<tb> peptone <SEP> 4gr.
<tb>
<tb> extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 1 <SEP> gr.
<tb>
<tb> chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 2,5 <SEP> gr.
<tb>
<tb> eau <SEP> distillée <SEP> pour <SEP> faire <SEP> 11q
<tb> on <SEP> règle <SEP> le <SEP> pH <SEP> à <SEP> 7,0 <SEP> et <SEP> on
<tb> ajoute <SEP> agar <SEP> 30 <SEP> gr.
<tb>
Cette souche initiale est utilisée pour inoculer des flacons se- coués ou des cuves d'inoculum submergée Suivant une variante les cuves d'ino- culum peuvent être inoculées avec le contenu de flacons secoués. Dans un flacon secoué, la croissance atteint généralement son maximum au bout de 4 jours alors que dans les cuves d'inoculum submergé la période la plus favora- ble est atteinte en 2 jours. Depuis la cuve d'inoculum, la souche mélangée au micro-organisme est refoulée dans l'appareil de fermentation dans des con- ditions absolument stériles et la culture continue pendant une nouvelle pé- riode de 2 jours.
A tout moment, l'aération est maintenue dans la cuve de fermentation en soufflant de l'air stérile par un distributeur à trous avec un débit de 0,5 à 2 volumes d'air libre par volume de bouillon et par minute pendant que le bouillon est agité. Une .stérilité complète existe à tout moment et la température du bouillon est généralement maintenue entre 24 et 30
La viomycine peut être récupérée hors du bouillon de fermentation, dans lequel elle est produite, par plusieurs méthodes différentes. Il est pos- sible de précipiter l'antibiotique hors de ses solutions aqueuses par l'addi- tion de divers colorants acides.
Parmi ceux-ci on peut citer les suivants : Cyamine fixe Erio, chrome violet Erio, Orange fixe Pontamine, muge alizarine S.,bleu de synthracène, bleu acier Pontamine, jaune polaire, méthylorange, vert Pontamine.
Parmi ceux-ci on préfère le chrome violet Erio. Les sels colo- rants précipités peuvent être -convertis en un sel simple de viomycine en trai- tant une suspension du sel colorant, dans un solvant tel que le méthanol ou un mélange de méthanol et d'acétone, avec du sulfate de triéthylamine. Le sul- fate de viomyoine ainsi précipité peut être filtré et séché ou il peut être filtré et dissous dans l'eau après quoi la solution aqueuse peut être séchée, par exemple par congélation dans le vide. D'autres sulfates d'amine ou des sels d'amine d'acides qui forment des sels solvants mais insolubles pour la viomycine peuvent être utilisés.
Suivant une variante on peut traiter un sel colorant de l'antibiotique par un sel inorganique tel que le chlorure de baryum ou de calcium et le sel métallique du colorant, ainsi précipité, peut être séparé d'avec la solution du sel antibiotique soluble.
Une autre méthode générale pour récupérer la viomycine hors de ses bouillons de fermentation ou des solutions aqueuses similaires consiste à uti- liser des échangeurs de cations, de préférence des résines carboxylées telles que l'Amberlite IRC 50 fourni par la Rö hm à Haas Co. Cette résine peut être utilisée sous forme de charges ou dans des tours. Après que l'antibiotique a été adsorbé par une résine de ce genre, il peut être repris par de l'acide dilué et la viomycine solide peut être récupérée hors de la solution aqueuse de diverses manières.
Après un réglage du pH à environ 6, la solution peut être séchée par congélation ou elle peut être concentrée et traitée par un solvant,tel que le méthanol ou par un-mélange de solvants tels que le mé- thanol et le butanol, pour précipiter un sel de la viomycine. Si l'on se sert d'acide chlorhydrique dilué pour enlever 1-'échangeur de cations, le chlorhydrate de viomycine peut être récupéré par les procédés ci-dessus ou il peut être converti en sulfate qui est précipité par du méthanol aqueux, par exemple par du méthanol contenant 20% d'eau.
Divers sels cristallisés de viomycine peuvent être préparés, notam ment le reineckate, le picrate, le sulfonate ss -naphtalène, le sulfate et le chlorhydrate,
<Desc/Clms Page number 9>
EMI9.1
Le reineckate de viomycine cristallisé peut être préparé en trai- tant du sulfate de viomycine amorphe dans l'eau avec du reineckate d:1 ammonium Le picrate cristallisé peut être préparé d'une manière similaire.
Du sulfona- te ;3-naphtalène de viomycine cristallisé peut être obtenu en traitant une solution aqueuse concentrée du sulfate amorphe avec une solution aqueuse con- centrée de l'acide J3 -;napIitalèné,.su.J"fèlI?iq.1.ÍI"y-,-Après' un réglage du pH à environ 6 à l'aide d'une so,utioridsâ-u éë-dhydroxyde'.e 'baryum/ la solution est fil- tirée, concentrée sous vide et traitée par de l'éthanol" Le sel cristallisé se sépare. . - 1..- ... < ""'.'-'3'J ...j. " i'"'?:: t!:::-,"" 1- "'t'","""",,,,,,,\q,, ;0:.," '",,,.,..... .. L ±: i't'1â.¯ ...
.¯,- Le Y-I.J",a:I., el- vJ.pID;1ce 19 S, <:I.J.J.flrse,.,}?6ll, c.R' r."..,;t7 .p.e-'t ; rentes manières...' ¯ësûât ït,P. ï 6 n:'g,r ôûûâyâz,',Ïpéu' dis- .,-, sous dans eau etj;a;i:as:{.tii"QIjusq:ttJë.q1i:'''s911?-ïon- c nen- sous dans l, ea ü ë r,st é ' .¯, ¯'. ü¯.ec,I. ß usqua a ce . q', a solution contien- ne environ ,7Ô% d.-. Ivan;:.'ôuissari ,I"s,ûtôi 'é;¯,n -'ttiit -.ë parois du' SQvants' 'e. sf'cii.er l'éthanol, ac'o.éè,ôüé,réycçi, .,û,puveïit..é: .iisésâ3â¯;pce ¯ du méthanoL. Le ' a.i x..t¯ .7. t. 1?'.. :!."' - '.' -- 'i..)) .U-.-.,!-..' j \ .. méthanol .
Le ? ; cô.d^a'.;Îe;lââ.o ahfééne, 70, mog/mg) peu .être converti en suifatecis.taliséë ,ïa Ié.,se,ânPh,,,pa dú,.:rtiSthahol' à 50 % avec un excés -cf.é = siâéC±te"dë séhy3 ; èdtehni âdi-ixxiel¯ Le sel de viomycine et le jaune polaire peuvent' etre' rai'ëés'dahs 1 par du sulfate da':tr:1;éthy-:ta.ndnê;--'-'c'1qüiPI"écip:i:ta l.e.1ttè:r.ate,-'Jd:e viomyoine amor- phe Après un-repos fdè::plliul3ie1:Û.'ssJ.oWs, fà<.u'staée''arphè',te .en-t crisfJal.-";S:
line.' ' ' - '# <.. :.2. ±.1.<à 1.<>.,l .;$::,",:...(1. ''# ?t.L.f:'.G.;a!:L¯1 ::12. s. ^ 5 .' i y, .:. ,j '.....'1taJ le chorhßdratè ,é.nïo P ,el¯a-au, reP. ;â. ;n.iôç,.à'"=siriçs ôéé ou en traitant 'liê.iâiï-Iiâtë 'é, c b3 c¯, j n;I .. , ëidé'= ' ' , ch'C.ôrßiq,iag " s zfe-t .y fhânôéa - ' n le, dissolvant dans un petit volume* d'f eaÜ,' en ajoutant -dümét''iano én refroidis- sant et en ensemençant'.-v'' d N..-n; a s': ¯f . ;¯R ": ¯ : x "sx,>s '..:,L.:
-'-:::LL'.='?, Ls.2omysinè, ,.telle;qü.o'btefiue;i:@a2tJi1P des(;!'boqilLIDons de fermenta- tion, contient deux constit1;s.JmbGt;1qun.n"!,.;actifso Les procédés, in- diqués plus haut, pour la préparat'iÓii' èles"'se1s"'cristaJ.1isés, servent à séparer la viomycine:'avë. son constituant majeur ài.1?.étàt2de sel cristallisé et son constituant mineur qui reste dans .la ..i9.11eP.r.-J!'!.:!f ,et peut être récupéré hors de celle-ci. Les deux constituants peuvent-'être sépares à l'aide de papier d. cbromatographiqùe en se serva1it-:.d'":a"';²'stè11le2:sélvant de pipéridine, butanol et aeide ,,8 -toluène. sulfoniqueJ te1:q1j!.';4J.du.,p<;p:'}'fnsten ( Journal of the Ame- rican Chemical.
Society 1.Q - page 3333 1.'j m Avec ce système, le constituant majeur passe à une vitesse f!ioMrki'.:s'Q.:6 3¯é:pâpièx que le constituant mineur Un traitement de 60 à 70 heuresf.,.éssa ¯ avec du papier Nhatman ? 4fJ pour séparer les constituants. ' " '" ]"'' La viomycine est une base organique forte constituée par les été- ' ments carbone,- ïcdrâgèn, ;âô-t'.ét"..oxè.o ¯¯Côi.e =.:jà^citt, 'lle forme des sels avec de nombreux acides-organiques et 1±ôrôaniqùesx?' ±à:
àôtatioà=oµtique spécifique d'un échantillon de sulfate cristallisé a été déterminée et corres- pond à (g ) 25= m3,3 cHO, a) Le spectre d'absorption ultra-violet d'un échantillon de sulfate cristallisé dans Peau. présente un maximum distinct et unique Ù$ à z5 m/c = 285 fi Le spectre infrarouge d'un échantillon de sulfate de viomycine cristallisée mélangé à de l'huile minérale, montre quelques bandes d'absorp- tion nettes et caractéristiques. Trois de ces bandes ont été observées à des fréquences (en centimètres réciproques) de 3240y 1677 et 1228. Une bande très large, avec son maximum à environ 1081, a également été observée.
Un échantillon du chlorhydrate cristallisé avait un point de fu- sion de 265-266 avec décomposition Le sulfate cristallisé n'a pas un point de fusion défini car il se décompose graduellement 'à une température élevée.
Un échantillon du sulfate' cristallisée séché à 100 pendant trois heures dans le vide, avait à l'analyse une composition moyenne suivante 36,73% de carboney 5,$0% d'hydrogène, 2i,12 d'azôte, 17,53% de l'ion sulfate et 18 52% d'oxygène (par différence).
<Desc/Clms Page number 10>
Les sels de la viomycine d'acides inorganiques, tels que l'acide chlorhydrique ou sulfurique,, sont très solubles dans l'eau, mais il sont seulement légèrement solubles dans des solvants tels quelle méthanol, l'acé- tone, et le métjy;ce;;psp;ve.
La viomyoine diffère de tous les antibiotiques connus comme on peut s'en rendre compte par les différentes propriétés physiques, indiquées ci-dessus.
L'activité de la viomyoine peut être déterminée par la méthode turbidimétrique en se servant de l'organisme l;ebsoe;;a pneumoniae, PCI 602 et du milieu d'essai antibiotique du Laboratoire Biologique de Baltimore pré- paré selon la formule de la Food and Drug Administration pour les bouillons pour l'analyse turbidimétrique de la streptopycine. La méthode d'essai est celle de Mc Mahan, J.R. (J. Biol. Chem. 153, pages 249 à 258, avril 1944).
Le sulfate de viomycine cristallisé, ayant les propriétés indiquées plus haut, est utilisé comme une norme pour la comparaison des activités d'autres échantillons de la viomycine et de ses solutions. l'activit accordée au sulfate,est de 765 mcg/mg, ce qui donneà la base libre de viomycine une activité égale à 1.000 mcg/mg.
Les exemples ci-dessous sont donnés pour illustrer la manière dont la viomycine peut être formée, récupérée, concentrée, purifiée et fina- lement convertie à l'état cristallisé et pur. Les sels cristallisés de la viomycine ont une valeur particulière à cause de leurs pureté et efficacité élevées. Les exemples donnés sont purement illustratifs et nullement limita- tifs ou restrictifs. Une souche de Streptomyces puniceus, portant les numé- ros 1314-5 est utilisée pour toué ces exemples.
Exemple I,- Formation et récupération de la viomvcineo
On prépare un milieu de culture ayant la composition suivante :
EMI10.1
<tb> Farine <SEP> de <SEP> fèves <SEP> de <SEP> soja <SEP> 10 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
Dextrose <SEP> 10 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb> solubles <SEP> de <SEP> distillation <SEP> 0,.5 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb> eau <SEP> pour <SEP> faire <SEP> 11.
<tb>
<tb>
<tb>
On <SEP> règle <SEP> le <SEP> pH <SEP> à <SEP> 7 <SEP> avec <SEP> du
<tb>
<tb>
<tb> KOH <SEP> et <SEP> on <SEP> ajoute
<tb>
<tb>
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 1 <SEP> gr.
<tb>
On introduit 500 ml de ce milieu dans un flacon de 2,8 1. de Fernbach et on stérilise pendant 30 min. à 121 Après refroidissement on inocule le milieu avec une suspension de S. puniceus fourni par une souche d'inocu lum ou par un flacon Roux, comme indiqué plus haut. On secoue le flacon sur un shaker tournant ayant un déplacement d'environ 62,5 mm. et tournant à 200 t/m pendant 4 jours et à 27 . On constate alors que le bouillon a une activité de 320 UDC par ml. avec un pH égal à 7,3. Le pH du mélange de bouillon et de mycélium est réglé à 2,0 avec du H2SO4 on ajoute une quantité réduite de Super-ce!.. et on filtre le mélange. Le pH du mélange clair est réglé à 5,5 et on ajoute du chrome violet Erio suivant une quantité de 2 g par litre, en agitant.
On continue l'agitation pendant une heure à la température ambiante et on ajoute assez de Super-cel pour permettre la filtration. Le gâteau est séparé par filtration et est lavé avec une quantité d'eau correspondant à 20 % du volume initial. Quand il est sec, le gâteau est mis en suspension dans 1/12e du volume originel de méthanol à 80 % et est décomposé à l'aide de 1 g. de BaCi22H2O pour chaque 2 gr. de chrome violet Erio en agitant pendant 2 heures à la température ambiante. Après filtration, le filtrat méthanolique est décoloré par une petite partie de carbone et est filtré à nouveau.
Au filtrat, limpide comme l'eau, on ajoute 2 volumes de méthanol absolu et 2 ml d'une solution à 50 % de sulfate de triéthylamine dans du méthanol pour chaque gramme de BaCI2 2H2O On sépare par filtration un préci-
<Desc/Clms Page number 11>
pité de sulfate de baryum et de sulfate de viomycine à l'aide de Super-cel.
Le gâteau est lavé au méthanol absolu et secoué avec de l'eau pour dissoudre le sulfate de viomycine, le sulfate de baryum et le Super-cel étant enlevés par filtration., La solution aqueuse, limpide comme l'eau, du sulfate de vio- mycine ainsi obtenue est séchée. La poudre blanche et amorphe, que l'on ob- tient,a une activité de 40 UDC/mg.
Exemple II.- Formation de viomycine.
On prépare un milieu de culture ayant la composition suivante :
EMI11.1
<tb> gluten <SEP> de <SEP> blé <SEP> 10 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> glycérol <SEP> 10 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> caséine <SEP> 5 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> mélasses <SEP> de <SEP> betteraves <SEP> 2 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> liqueur <SEP> de <SEP> corn <SEP> steep <SEP> 2 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> solubles <SEP> de <SEP> distillation <SEP> 2 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> on <SEP> règle <SEP> le <SEP> pH <SEP> à <SEP> 7,0 <SEP> avec
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> du <SEP> KOH <SEP> et <SEP> on <SEP> ajoute
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 5 <SEP> gr
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> eau <SEP> pour <SEP> faire <SEP> 1 <SEP> 1.
<SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> huile <SEP> de <SEP> fèves <SEP> de <SEP> soja <SEP> 1 <SEP> ml.
<tb>
On stérilise pendant 45 minutes à 121 0
On inocule environ 75 1. de ce milieu dans une cuve d'inoculum de 180 1. avec agitateur, à l'aide de 2 1. d'un inoculum tel que décrit plus haut, et obtenu par une culture en profondeur du S. puniceus et qui a été cul- tivé à 27 pendant 24 heures avec agitation constante et insufflation d'air stérile avec un volume de 1,0 à 1,5 d'air libre par volume de bouillon et par minute. Au bout de 24 heures l'inculum ainsi préparé est introduit, dans des conditions absolument stériles, dàns 560 1. du même milieu contenu dans une cuve de fermentation de 950 1. L'agitation et l'aération sont les mêmes que pour la cuve d'inoculum et au bout de 48 h. et à 27 le bouillon obtenu a une activité finale de 100 UDC/ml.
Exemple III. - Formation et récupération'de viomycine.
On prépare un milieu de culture ayant la composition suivante
EMI11.2
<tb> gluten <SEP> de <SEP> blé <SEP> 10 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb> glycérol <SEP> 10 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> N-Z-amine <SEP> B <SEP> (caséine <SEP> hydroli- <SEP> 5 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb> sé <SEP> s).
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> mélasses <SEP> de.betteraves <SEP> 2 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> liqueur <SEP> corn <SEP> steep <SEP> 2 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> solubles <SEP> de <SEP> distillation <SEP> 2 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> eau <SEP> jusque <SEP> 1 <SEP> la <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> on <SEP> règle <SEP> le <SEP> pH <SEP> à <SEP> 7,0 <SEP> avec
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> du <SEP> KOH <SEP> et <SEP> on <SEP> ajoute
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 5 <SEP> gr.
<tb>
On stérilise quatre flacons Fernbach à 2,8 1., contenant chacun 1 1. de ce milieu, pendant 20 minutes à 121 . Après refroidissement ils sont inoculés avec une suspension de So puniceus provenant d'une souche et ils .sont secoués dans un shaker tournant pendant 48 h. à 28 . Un mélange du bouillon et du mycelium est utilisé pour inoculer une cuve de fermentation de 180 la contenant 75 1. du milieu susdit et qui a été stérilisé pendant 20 minutes à
<Desc/Clms Page number 12>
121 dans des conditions aseptiques absolues. On remue avec un agitateur à hélice pendant que l'on maintient la cuve sous une pression d'air posi- tive par l'admission d'air stérile à l'aide d'un distributeur à trous.
Après 48 h. le bouillon a une activité de 100 UDC/ml.
Le bouillon, dont la quantité correspond à 75 1., est séparé du mycélium par filtration, son pH est régléà 6,5 avec du H2SO4 et on y ajoute 240 gr. d'oxalate d'ammonium pour précipiter le calcium à l'état d'oxalate qui est alors enlevé par filtration. Le pH du bouillon clair est réglé à 5,5 avec du H2SO4 et on ajoute 160 gr. de chrome violet Erio, après quoi le bouillon est agité pendant une heure et demie. Le colorant est séparé du bouillon usé par du Super-cet. Le gâteau-de colorant est lavé avec 15 1. d'eau et séché par insufflation d'air dans le filtre presse.
Le gâteau sec est mis en suspension dans 3 1. d'un mélange de 80 % de mé- thanol et 20 % d'acétone (en volume) et on ajoute 250 ml. d'une solution méthanolique à 50 % de sulfate de triéthylamine, l'ensemble étant agité pen- dant une heure et demie. La précipité de sulfate de viomycine et du Super- cel est séparé par filtration et est lavé avec l'acétone et ensuite avec du méthanol. Le gâteau séché est alors agité pendant une demi-heure dans deux litres d'eau distillée et le Super-cel est séparé de la solution de sul- fate de viomycine par filtration. La solution, limpide comme l'eau, du sulfate de viomycine est séchée et on obtient une substance solide blanche et amorphe avec une activité de 370 UDC/mg.
Exemple IV.- Récupération de la viomycine par précipitation d'un sel colo- rant.
On filtre 75 1. d'un bouillon de fermentation obtenu par la cul- ture d'une souche de Streptomyces puniceus qui donne à l'essai environ 570 meg/ ml., Après réglage du pH à 6,5 on traite la solution avec 240 gr.d'oxalate d'ammonium et l'oxalate de calcium précipité est filtré. Le pH de la solution est réglé à 5,5 et on introduit 160 gr. de chrome violet Erio en agitant.
Après que le mélange a été agité pendant un eheure, on ajoute un produit fa- cilitant la filtration et on sépare les matières solides par filtration.
Le gâteau est lavé avec 15 1. d'eau et est ensuite séché. Le gâteau de colo- rant séché est mis en suspension dans 3 1. d'un. mélange de 80 % d'acétone et 20 % de méthanol (en volume) et on ajoute une solution de sulfate de triéthylamine dans du méthanol à 50 %, ce qui est un peu plus que nécessaire pour précipiter complètement le sulfate antibiotique. Le mélange est agité pendant une heure et demie et est ensuite filtré. Le gâteau obtenu par fil- tration est lavé à l'acétone et au méthanol pour enlever le colorant.. il est séché par aspiration et ensuite ajouté à 2 1. d'eau distillée. Après que le sulfate de viomycine est dissous, la solution est filtrée, et le filtrat est séché par congélation.
La matière obtenue pèse 18 g et a une activité de 620 mcg/mg.
Exemple V. - Récupération de la viomycine par des échangeurs de cations,
On règle le pH de 2 1. d'un bouillon de fermentation filtré de viomycine, donnant à l'essai 600 mcg/ml, à environ 8 et on traite ce bouil- lon avec 100 g. d'Amberlite IRC-50. Le mélange est agité pendant 3 heures et la résine est enlevée par filtration et est lavée à l'eau. Le filtrat a conservé environ 34 % de son activité antibiotique. La résine est reprise en l'agitant, pendant 2 heures, dans l'acide chlorhydrique dilué. Le pH final est 2. La solution est filtrée et réglée à un pH de 6,6. Elle con- tient environ 50 % de l'antibiotique contenu initialement dans le bouillon de fermentation.
Cette solution peut être par congélation dans le vide pour former un chlorhydrate de viomycine solide., mais on préfère le purifier da- vantage comme expliqué ci-dessous.
La résine reprise est concentrée dans le vide en passant dans un courant de vapeurs chaudes de méthanol jusqu'à ce que la teneur en eau de la solution soit réduite jusqu'à 13 %. Quand 25 ml de cette solution sont traités par 25 ml de méthanol et quand le précipité est séparé par filtra- tion, on peut précipiter le chlorhydrate de viomycine avec une activité de
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325 mcg/mg. en ajoutant 50 ml de butanol. Le produit contenait 21 % de cen- dres. Quand cette matière solide est dissoute dans un volume minimum d'eau et quand elle est traitée à nouveau avec du méthanol et du butanol, on ob- tient un chlorhydrate de viomycine qui a une activité d'environ 800 mcg/mg et qui contient seulement 0,5 % de cendres.
Plutôt que de récupérer du chlorhydrate de viomycine, il est possible d'obtenir comme suit le sulfate. Le produit séparé d'avec l'échan geur de cations est neutralisé et est concentré jusqu'à une concentration d'environ 40.000 mcg/ml. Tout le calcium en présence est précipité par un traitement avec une solution de sulfate de triéthylamine dans du méthanol à 50 %. Après addition d'un volume égal de méthanol, le sulfate de cal- cium est filtré et le filtrat est traité avec du méthanol jusqu'à ce que la concentration du solvant soit égale à 80 %. Au besoin on ajoute davan- tage de sulfate de triéthylamine et on sépare le précipité de sulfate de viomycine par filtration.
Le produit séché a une activité d'environ 800 mcg/mg et contient peu de cendres.
Exemple VI.- Cristallisation du sulfate de viomycine.
Des semences de sulfate de viomycine cristallisé sont d'abord obtenues en préparant le reineckate cristallisé par le traitement d'une solu- tion aqueuse du sulfate de viomycine amorphe (activité environ 700 mcg/mg) par un léger excès de reineckate d'ammonium. Le reineekate antibiotique cristallisé, qui est séparé aisément, est traité dans du méthanol par du sulfate de triéthylamine pour obtenir le sulfate de viomycine cristallisé.
Ensuite on peut préparer directement le sulfate de viomycine cristallisé à partir de la matière amorphe ayant une pureté suffisante (env. 650 mcg/mg). La matière amorphe est dissoute dans un faible volume d'eau et on ajoute du méthanol jusqu'à ce que le mélange devienne trouble.
Des semences de cristaux de sulfate de viomycine sont ajoutées et on agite le mélange. La matière cristallisée est séparée par filtration et est sé- ché e. Elle a une activité d'environ 760 mcg/mg. On peut se servir d'autres solvants, tels que le mé thylcellosolve, l'acétone et l'éthanol, mais on pré- fère le méthanol.
Du chlorhydrate de viomycine amorphe, ayant une activité de 720 mcg/mg, est converti en sulfate cristallisé de la manière suivante.
On dissout 65 g de la substance dans un mélange de 500 ml d'eau et de 500 ml de méthanol.. On ajoute lentement un excès de sulfate de triéthylamine en so- lution dans du méthanol à 50 % (400 ml.). Le mélange est encemencé et agité et on ajoute encore 150 ml de méthanol. Les cristaux séparés sont filtrés et lavés successivement dàns du méthanol à 60 %, du méthanol à 80 % et du mé- thanol anhydre. Le produit est séché sous vide sur du chlorure de calcium anhydre. Il pèse 56,2 g et a une activité de 750 mcg/mg.
Exemple VII.- Cristallisation du chlorhydrate de viomycine.
On dissout 10 g de chlorhydrate de viomycine amorphe, ayant une activité d'environ 750 mct/mg, dans 40 ml d'eau et on ajoute 200 ml de métha- nol. La solution est chauffée, ensemencée et agitée. Quand elle est froide, on ajoute progressivement 500 ml de méthanol. Le chlorhydrate antibiotique cristallisé est filtré et séché. Il pèse 3,35 g et a une activité d'environ 800 mcg/mg. Ce produit a un point de fusion de 265-268 . Davantage de matiè- re cristallisée peut être obtenue en concentrant la liqueur-mère.
ExempleVIII.- Préparation du ss - naphtalè nesulfonate de viomycine cristal- lisé.
On dissout 10 g de sulfate de viomycine amorphe ayant une activi- té d'environ 500 mcg/mg, dans 10 ml d'eau et on ajoute une solution de 8,0 g d'acide ss - naphtalè ne sulfonique dans 20 ml d'eau. Le pH de la solution est réglé à 6,0 par une solution saturée d'hydroxyde de baryum et le sulfate de baryum est séparé par filtration. En concentrant le filtrat et en ajoutant de l'éthanol, on obtient la 5 g de /3 -naphtalène sulfonate de viomycine cris- tallisé avec une activité de 600 mcg/mg.
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Il est bien entendu que les compositions des milieux de culture, indiquées ci-dessus, sont uniquement données à titre d'exemple et qu'elles peuvent varier entre de larges limites, par exemple en remplaçant le gluten de blé par de la farine de graines de coton ou de fèves de soja, etc. De même,les conditions de fermentation, telles que l'agitation, le degré d'a- ération, la température, etc. peuvent varier d'une manière considérable.
De plus, plusieurs autres méthodes ou variantes, autres que celles indiquées, peuvent être utilisées pour récupérer,-concentrer et purifier l'antibiotique et ses sels. Par exemple, on peut récupérer et purifier l'antibiotique par adsorption sur de l'alumine activée, du charbon de bois et analogues suivie d' une reprise par des acides ou des solvants neutres, etc.
L'antibiotique, d'après les chiffres indiqués plus haut, a une grande valeur pour le traitement des diverses infections pour l'homme et les animaux. Il peut être administré par injection parentérale, par voie bucca- le, par action locale et avec les doses usuelles.
Comme il va de soi et comme il résulte,d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à celui de ses modes d'appli- cation non plus qu'à ceux des modes de réalisation de ses diverses parties, ayant plus spécialement été indiqués; elle en embrasse, -au contraire, toutes les variantes.
REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d'un antibiotique, consistant à culti- ver une souche de Streptomyces puniceus dans une solution aqueuse d'un hy- drate de carbone et contenant au moins une substance nutritive dans des con- ditions aérobiques et en profondeur, jusqu'à ce que la solution présente une activité antibactérienne substantielle, et à récupérer ensuite l'antibi- otique ainsi obtenu hors du bouillon de fermentation.
2. Procédé de préparation d'un antibiotique, consistant à culti- ver une souche de Streptomyces puniceus dans un milieu de culture aqueux con- tenant une substance en favorisant la croissance et maintenu dans des condi- tions de croissance aérobiques et en profondeur, à une température de 24 à 30 C environ pendant une période allant de 2 jours à une semaine, et à récu- pérer ensuite l'antibiotique ainsi obtenu hors du bouillon de fermentation.
3. Procédé suivant l'une ou l'autre des revendications 1 et 2, dans lequel on récupère l'antibiotique en le précipitant hors d'une solution aqueuse, en formant un sel de cet antibiotique, avec l'aide d'un sulfonate colorant.
4. Procédé suivant l'une ou l'autre des revendications 1 et 2 dans lequel on récupère l'antibiotique par adsorption sur -Lui échangeur de cations résineux.
5. Procédé de préparation d'un antibiotique, en substance, tel que décrit dans les exemples ci-dessus.
6. Antibiotiques, lorsqu'ils sont préparés par un procédé sui- vant l'une ou l'autre des revendications précédentes.
7. Nouvel antibiotique présentant les caractéristiques spécifiées ci-dessus d'un antibiotique obtenu en cultivant une souche de Streptomyces pu- niceus.
8. Sel d'un antibiotique suivant l'une ou l'autre des revendica- tions 6 et 7.
9. Sulfate d'un antibiotique suivant l'une ou l'autre des reven- dications 6 et 7.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.
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IMPROVEMENTS MADE TO ANTIBIOTIC PREPARATION PROCESSES.
The present invention relates to a process for preparing an antibiotic substance called viomycin; and more specifically it relates to processes for obtaining this product by fermentation, to methods for its recovery and concentration from crude solutions, including fermentation broths, for its purification and for the preparation of its salts. . The antibiotic and its salts may be in the form of their dilute solutions or of crude concentrates and in the form of pure crystals.
The antibiotic is formed during the cultivation, under specified conditions, of a microorganism which has not yet been described so far and which is called Streptomyces puniceus.
This organism was isolated from a sample of a land which is near Cienfuegos in Cu- ba, Its description, according to the method indicated in the "Manual of Determinative Bacteriology !! of Bergey, 5th edition, pages 929 to 933, is given below
The cultural characteristics of this species, based on strains with the numbers 1314-5, are given below in tabular form (the colors, next to which is the letter R, are those of Ridgway Golor Standards and Nomenclature ).
. The indications given are based on ten test tubes with the exception of those for sugars (2 test tubes).
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Galactose <SEP> moderate <SEP> gray <SEP> olive <SEP> pale <SEP> none <SEP> reverse <SEP> purple <SEP> vinous
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<tb> (R) <SEP> dark <SEP> (R).
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Sucrose <SEP> poor <SEP> white <SEP> none <SEP> towards white <SEP>.
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Maltose <SEP> moderate <SEP> gray <SEP> olive <SEP> pale <SEP> (R) <SEP> none <SEP> backwards <SEP> purple <SEP> vinous
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D-Manni- <SEP> good <SEP> gray-olive <SEP> pale <SEP> (R) <SEP> none <SEP> backwards <SEP> almost <SEP> purple
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<tb>
<tb>
<tb> couées
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Paraffin <SEP> no <SEP> growth.
<tb>
<Desc / Clms Page number 5>
It should be noted that, in order to obtain viomycin, it is not desired to be limited to this particular organism or to organisms which entirely correspond to the description above, the latter having been given only by way of illustration. . It is also aimed at the use of organisms which are obtained from the organism described by means of mutation such as X-rays, ultraviolet rays, nitrogen mustards, etc.
Antibiotics, obtained by organisms of the Streptomyces genus of Actinomycetes, several of which are now well known, belong to two classes; 1) neutral substances which can be extracted out of broths, with an acidic, neutral or basic pH by solvents and 2) basic substances in general and which cannot be extracted by organic solvents. Chloromycetin and actinomycin are typical for the first group and streptomycin and streptothricin for the second.
According to this subdivision, viomycin belongs to the second group. Viomycin also shares with this group the property of being able to be precipitated by certain acid dyes, such as chromium violet Erio, fixed orange Pontamine, alizarin red S, synthracene blue, steel blue Pon - tamine, Pontamine green and other similar sulfonic acid dyes.
This basic group, to which viomycin belongs, is characterized by an extended antibiotic spectrum, more particularly, among gram-negative bacteria.
The table below shows the comparative bacterial spectra of aureomycin, chloromycetin, streptomycin, streptothricin and viomy
Table I mg per ml * of antibiotic required to inhibit the growth of microorganisms on nutrient agar plates.
EMI5.1
<tb>
Organism <SEP> 1Aureo- <SEP> 2Chloro- <SEP> 3strepto- <SEP> 4Strepto- <SEP> 5viomycin
<tb>
<tb>
<tb> mycine <SEP> mycetine <SEP> mycine <SEP> thricine
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> S.aureus <SEP> 0.9 <SEP> 7 <SEP> 4 <SEP> 6 <SEP> 50
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> So <SEP> albus <SEP> 0.9 <SEP> 7 <SEP> 6 <SEP> 5 <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> B <SEP> subtilis <SEP> 1 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 30 <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> B.mycoides <SEP> 0.9 <SEP> 4 <SEP> 7 <SEP> 70 <SEP> 80
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Bodenheimer <SEP> 1 <SEP> 500 <SEP> 1000 <SEP> 10 <SEP> 500
<tb>
<tb> Org
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Sa <SEP> typhosa <SEP> 5 <SEP> 4 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> S,
<SEP> pullorum <SEP> 2 <SEP> 5 <SEP> 30 <SEP> 5 <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> S <SEP> paratyphi <SEP> A <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 20 <SEP> 5 <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> S. <SEP> paratyphi <SEP> B <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 30 <SEP> 10 <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> K <SEP> Pneumoniae <SEP> 7 <SEP> 5 <SEP> 10 <SEP> 5 <SEP> 30
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Sh, <SEP> paradysen- <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 10 <SEP> 7 <SEP> 100
<tb>
<tb> teriae
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> E <SEP> coli <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 7 <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> A <SEP> aerogenes <SEP> 0.9 <SEP> 2 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 30
<tb>
<Desc / Clms Page number 6>
EMI6.1
<tb> Ps <SEP> Aerugino- <SEP> 10 <SEP> 20 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 3000
<tb> his
<tb>
<tb>
<tb> Proteus <SEP> sp.
<SEP> 50 <SEP> 80 <SEP> 10 <SEP> 8 <SEP> 500
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> M <SEP> Albicans <SEP> 2000 <SEP> 2000 <SEP>> <SEP> 2000 <SEP> 100 <SEP>> <SEP> 3000
<tb>
Crystallized hydrochloride, crystallized Streptomycin sulfate (750 mg streptomycin units) expressed as active base in mg.
Streptothricin sulfate (eg crystallized helianthate 800 streptomycin units / mg).
Crude amorphous viomycin sulfate prepared according to Example III below.
Viomycin also differs from known antibiotics obtained from Streptomyces by comparing the activity of preparations of these antibiotics for cultures of bacteria made resistant to the antibiotic by serial transfer into broths containing quan - progressively increasing amounts of the antibiotic compared to the initial sensitive culture. The table below, in which the dosage has been reduced to E coli dilution units per milligram (UDG), shows this peculiarity.
By E. coli dilution units per milligram (UDC) is meant the volume of nutrient broth in milliliters in which one milligram of the antibiotic preparation (which may have varying degrees of purity) can be diluted when inoculated with a 10 dilution. -b of a culture for 18 hours of an E. coli strain under the same conditions and which, after incubation for 18 hours at 37, shows no growth.
Table II
Comparison of the activity of various antibiotics against strains of A.aerogenes in nutrient broth
EMI6.2
<tb> Organism <SEP> Aureomy- <SEP> Strepto <SEP> Strepto- <SEP> Chloromy- <SEP> Viomycin
<tb>
<tb> cine <SEP> mycine <SEP> thricine <SEP> ketine <SEP> 50 <SEP> 100
<tb>
<tb> 50 <SEP> 100 <SEP> 50 <SEP> 100 <SEP> 50 <SEP> 100 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb>
EMI6.3
(iDG / ml) (UDC:
/ nl) (UDG / mil) (DDC / 81) (UDe / ml)
EMI6.4
<tb> Ao <SEP> aerogenes <SEP> strain <SEP> A <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP > - <SEP> - <SEP>
<tb>
<tb> Ao <SEP> aerogenes <SEP> strain <SEP> B <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP > - <SEP> -
<tb>
<tb> A.
<SEP> aerogenes <SEP> strain <SEP> C <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb>
<tb> Ao <SEP> aerogenes <SEP> strain <SEP> D <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP > + <SEP> +
<tb>
+ = growth - = no growth Strain A is sensitive to 25 UDC / ml of all of the above antibiotics
EMI6.5
Strain B is sensitive to 2000 UDC / ml of chloromycetin Strain C is sensitive to 4400 UDG / ml of streptomycin and approximately
25 UDG / ml streptothricin Strain D is sensitive to 7,500 UDG / ml streptothricin and approximately
200 UDG / ml streptomycin.
<Desc / Clms Page number 7>
Table II shows that viomycin is capable of retarding the growth of strains of Ao aerogenes made resistant to aureomycin, streptomycin and chloromycetin but not strains made resistant to streptothricin. This clearly distinguishes viomycin from all of these antibiotics, except streptothricin.
Viomycin can be distinguished from streptothricin and streptomycin by its behavior on chromatographic paper in water saturated with n-butanol and containing 2% piperidine and 2% fi -toluene sulfonic acid. , for a treatment of 96 to 25 hours using B subtilis as the test organism.
EMI7.1
<tb>
Antibiotic <SEP> Rf
<tb>
<tb>
<tb> Streptomycin <SEP> A <SEP> 0.38
<tb>
<tb>
<tb> Streptothricin <SEP> 0.04
<tb>
<tb>
<tb> Viomycin <SEP> 0.06
<tb>
Viomycin is stable when boiled for 15 minutes at a concentration of 500 mgr / ml in water with a pH of 2.0, 6.5 and 9.0
The toxicity of various antibiotics including viomycin is shown in Table III.
Table III
Toxicity of various antibiotics (mg per 20 gr. Of mice)
EMI7.2
<tb> Antibiotic <SEP> Intravenous <SEP> subcutaneous <SEP> through <SEP> the <SEP> mouth
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> LDo <SEP> Ld50 <SEP> Ld0 <SEP> LD50 <SEP> LDo <SEP> LD50
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> <SEP> strepto- <SEP> sulfate <SEP> 2.5
<tb>
<tb>
<tb> mycine
<tb>
<tb>
<tb> <SEP> strepto- <SEP> sulfate <SEP> 4.0
<tb>
<tb>
<tb> thricine
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Chloromycetin <SEP> 0.6
<tb>
<tb>
<tb> Hydrochloride <SEP> of <SEP> 1.5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Aureomycin
<tb>
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> of <SEP> viomyci-
<tb>
<tb>
<tb> ne <SEP> (raw) <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 10 <SEP> 35 <SEP>> <SEP> 200 <SEP> undefined
<tb>
Viomycin can be obtained by culturing Streptomyces punice- us,
preferably 24 to 30, in depth with agitation and aeration on a medium containing a source of carbohydrate, such as sugars, starch, glycerol, a source of organic nitrogen, such as bean flour soy or wheat gluten; a source of growth substances such as distillation solubles; common salt and calcium carbonate used as buffering agents. When growth is complete, the mycelium is separated and the antibiotic is precipitated out of the broth, for example by the addition of sulfonic acid colourants, such as chromium violet Erio, fixed orange Pontami- ne, etc. The dye cake is then broken down and the antibiotic is separated from the filtrate.
Inocluum can be obtained using a culture provided by Roux strains or flasks inoculated with So puniceus. A solid medium, which is suitable for this initial strain, consists of
EMI7.3
<tb> dextrose <SEP> 10 <SEP> gr.
<tb>
<tb> extract <SEP> from <SEP> beef <SEP> 4 <SEP> gr. \
<tb>
<Desc / Clms Page number 8>
EMI8.1
<tb> peptone <SEP> 4gr.
<tb>
<tb> extract <SEP> of <SEP> yeast <SEP> 1 <SEP> gr.
<tb>
<tb> <SEP> sodium <SEP> chloride <SEP> 2.5 <SEP> gr.
<tb>
<tb> distilled <SEP> water <SEP> for <SEP> do <SEP> 11q
<tb> on <SEP> sets <SEP> the <SEP> pH <SEP> to <SEP> 7.0 <SEP> and <SEP> on
<tb> add <SEP> agar <SEP> 30 <SEP> gr.
<tb>
This initial strain is used to inoculate shaken vials or submerged inoculum vessels. Alternatively the inoculum vessels can be inoculated with the contents of shaken vials. In a shaken flask, growth usually reaches its maximum after 4 days, while in submerged inoculum tanks the most favorable period is reached in 2 days. From the inoculum tank, the strain mixed with the microorganism is pumped into the fermentation apparatus under absolutely sterile conditions and the culture continues for a further period of 2 days.
At all times, aeration is maintained in the fermentation tank by blowing sterile air through a hole dispenser with a flow rate of 0.5 to 2 volumes of free air per volume of broth and per minute while the broth is stirred. Complete sterility exists at all times and the temperature of the broth is usually maintained between 24-30
Viomycin can be recovered from the fermentation broth, in which it is produced, by several different methods. It is possible to precipitate the antibiotic out of its aqueous solutions by the addition of various acid dyes.
Among these, the following may be mentioned: Fixed cyamine Erio, chrome violet Erio, fixed Orange Pontamine, muge alizarin S., synthracene blue, steel blue Pontamine, polar yellow, methyl orange, Pontamine green.
Of these, Erio chrome violet is preferred. The precipitated color salts can be converted to a simple viomycin salt by treating a suspension of the color salt, in a solvent such as methanol or a mixture of methanol and acetone, with triethylamine sulfate. The viomyoine sulfate thus precipitated can be filtered and dried or it can be filtered and dissolved in water after which the aqueous solution can be dried, for example by freezing in vacuum. Other amine sulfates or amine salts of acids which form solvent but insoluble salts for viomycin can be used.
Alternatively, a coloring salt of the antibiotic can be treated with an inorganic salt such as barium or calcium chloride and the metal salt of the dye, thus precipitated, can be separated from the solution of the soluble antibiotic salt.
Another general method of recovering viomycin from its fermentation broths or similar aqueous solutions is to use cation exchangers, preferably carboxylated resins such as Amberlite IRC 50 supplied by Rö hm to Haas Co. This resin can be used in the form of fillers or in towers. After the antibiotic has been adsorbed by such resin, it can be taken up by dilute acid, and the solid viomycin can be recovered from the aqueous solution in various ways.
After adjusting the pH to about 6, the solution can be freeze-dried or it can be concentrated and treated with a solvent, such as methanol or a mixture of solvents such as methanol and butanol, to precipitate. a salt of viomycin. If dilute hydrochloric acid is used to remove the cation exchanger, viomycin hydrochloride can be recovered by the above methods or it can be converted to sulfate which is precipitated by aqueous methanol, for example. with methanol containing 20% water.
Various crystalline salts of viomycin can be prepared, including reineckate, picrate, sulfonate ss -naphthalene, sulfate and hydrochloride,
<Desc / Clms Page number 9>
EMI9.1
Crystallized viomycin reineckate can be prepared by treating amorphous viomycin sulfate in water with ammonium reineckate. Crystallized picrate can be prepared in a similar manner.
Crystallized viomycin sulfonate; 3-naphthalene can be obtained by treating a concentrated aqueous solution of the amorphous sulfate with a concentrated aqueous solution of the acid J3 -; napIitalene, .su.J "felI? Iq.1. After adjusting the pH to about 6 with a barium solution, the solution is filtered off, concentrated in vacuo and treated with dehydroxide. ethanol "The crystallized salt separates. - 1 ..- ... <" "'.'-' 3'J ... j." i '"'? :: t! ::: -, "" 1- "'t'", "" "" ,,,,,,, \ q ,,; 0:., "'" ,,,., ..... .. L ±: i' t'1â.¯ ...
.¯, - The YI.J ", a: I., El- vJ.pID; 1ce 19 S, <: IJJflrse,.,}? 6ll, cR 'r." ..,; t7 .pe-' t; rents manners ... '¯ësûât ït, P. ï 6 n: 'g, r ôûûâyâz,', Ïpéu 'dis-., -, under in water etj; a; i: as: {. tii "QIjusq: ttJë.q1i:' '' s911? -ïon- c nen- under in the ü ë r, st é '.¯, ¯'. ü¯.ec, I. ß usqua to this. q ', a solution contains approximately, 70% d.-. Ivan; :. 'ôuissari, I "s, ûtôi' é; ¯, n -'ttiit -.ë walls of 'SQvants'' e. sf'cii.er ethanol, ac'o.éè, ôüé, réycçi,., û, puveïit..é: .iisésâ3â¯; pce ¯ of methanol. The 'a.i x..t¯. 7. t. 1? '..:!. "' - '.' - 'i ..)) .U -.-.,! - ..' j \ .. methanol.
The ? ; cô.d ^ a '.; Îe; lââ.o ahféne, 70, mog / mg) can .be converted into suifatecis.taléeë, ïa Ié., se, ânPh ,,, pa dú,.: rtiSthahol' at 50% with an excess -cf.é = siâéC ± te "dë séhy3; èdtehni âdi-ixxiel¯ Viomycin salt and polar yellow can be 'rai'ëés'dahs 1 by sulphate da': tr: 1; ethy- : ta.ndnê; --'- 'c'1qüiPI "écip: i: ta le1ttè: r.ate, -' Jd: e viomyoine amor- phe After un-rest fdè :: plliul3ie1: Û.'ssJ.oWs , fà <.u'staée''arphè ', te .en-t crisfJal .- "; S:
line. ' '' - '# <..:. 2. ± .1. <To 1. <>., L.; $ ::, ",: ... (1. '' #? TLf: '. G.; a!: L¯1 :: 12. S . ^ 5. 'Iy,.:., J' ..... '1taJ the chorhßdratè, é.nïo P, el¯a-au, reP.; Â.; N.iôç, .à' "= siriçs ôéé or by treating 'liê.iâiï-Iiâtë' é, c b3 c¯, jn; I .., ëidé '=' ', ch'C.ôrßiq, iag "s zfe-t .y fhânôéa -' n le, dissolving in a small volume * of f eaÜ, 'adding -dümét''iano en cooling and seeding' .- v '' d N ..- n; a s': ¯f.; ¯R " : ¯: x "sx,> s' ..:, L .:
-'- ::: LL '. =' ?, Ls.2omysine,, .such; qü.o'btefiue; i: @ a2tJi1P des (;! 'Fermenta- tion boqilLIDons, contains two constit1; s.JmbGt; 1qun.n "!,. ;Actifso The methods, indicated above, for the preparation of crystals, serve to separate the viomycin: 'avë. Its major constituent ati.1? crystallized salt and its minor constituent which remains in the ..i9.11eP.r.-J! '!.:! f, and can be recovered out of it. The two constituents can be separated at using d. bromatographiqùe paper using - :. of ": a" '; ²'stè11le2: selvant of piperidine, butanol and aeide ,, 8 -toluene. sulfonicJ te1: q1j!.'; 4J. ., p <; p: '}' fnsten (Journal of the American Chemical.
Society 1.Q - page 3333 1.'jm With this system, the major constituent passes at a speed f! IoMrki '.: S'Q.: 6 3¯é: papièx than the minor constituent A treatment of 60 to 70 hoursf .,. éssa ¯ with Nhatman paper? 4fJ to separate the constituents. '"'"] "'' Viomycin is a strong organic base formed by the carbon elements, - ïcdrâgèn,; âô-t'.ét" .. oxè.o ¯¯Côi.e = .: jà ^ citt, 'it forms salts with many organic acids and 1 ± ôrôaniqùesx?' ± to:
αotatioà = specific oµtic of a crystallized sulfate sample has been determined and corresponds to (g) 25 = m3.3 cHO, a) The ultraviolet absorption spectrum of a sulfate crystallized sample from water. shows a distinct and unique maximum Ù $ at z5 m / c = 285 fi The infrared spectrum of a sample of crystallized viomycin sulphate mixed with mineral oil, shows some distinct and characteristic absorption bands. Three of these bands were observed at frequencies (in reciprocal centimeters) of 3240y 1677 and 1228. A very broad band, with its maximum at about 1081, was also observed.
A sample of the crystallized hydrochloride had a melting point of 265-266 with decomposition. Crystallized sulfate does not have a defined melting point because it gradually decomposes at an elevated temperature.
A sample of the crystallized sulphate dried at 100 for three hours in vacuum, on analysis had an average composition of 36.73% carboney 5.0% hydrogen, 21.12 nitrogen, 17.53% sulfate ion and 52% oxygen (by difference).
<Desc / Clms Page number 10>
The viomycin salts of inorganic acids, such as hydrochloric or sulfuric acid, are very soluble in water, but they are only slightly soluble in solvents such as methanol, acetone, and methyl ; ce ;; psp; ve.
Viomyoine differs from all known antibiotics as can be seen by the different physical properties, indicated above.
Viomyoine activity can be determined by the turbidimetric method using the organism l; ebsoe ;; a pneumoniae, PCI 602 and the Baltimore Biological Laboratory antibiotic test medium prepared according to the formula in Food and Drug Administration for Broths for Turbidimetric Analysis of Streptopycin. The test method is that of Mc Mahan, J.R. (J. Biol. Chem. 153, pages 249 to 258, April 1944).
Crystallized viomycin sulfate, having the properties indicated above, is used as a standard for comparing the activities of other samples of viomycin and its solutions. the activity granted to the sulfate is 765 mcg / mg, which gives the free viomycin base an activity equal to 1,000 mcg / mg.
The examples below are given to illustrate how viomycin can be formed, recovered, concentrated, purified, and ultimately converted to a crystalline and pure state. The crystallized salts of viomycin are of particular value because of their high purity and efficacy. The examples given are purely illustrative and in no way limiting or restrictive. A strain of Streptomyces puniceus, carrying the numbers 1314-5 is used for all these examples.
Example I, - Formation and recovery of viomvcineo
A culture medium is prepared having the following composition:
EMI10.1
<tb> Flour <SEP> from <SEP> beans <SEP> from <SEP> soybeans <SEP> 10 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
Dextrose <SEP> 10 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
Sodium <SEP> <SEP> <SEP> 5 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb> soluble <SEP> from <SEP> distillation <SEP> 0, .5 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb> water <SEP> for <SEP> do <SEP> 11.
<tb>
<tb>
<tb>
On <SEP> set <SEP> the <SEP> pH <SEP> to <SEP> 7 <SEP> with <SEP> of
<tb>
<tb>
<tb> KOH <SEP> and <SEP> on <SEP> add
<tb>
<tb>
<tb> Carbonate <SEP> of <SEP> calcium <SEP> 1 <SEP> gr.
<tb>
500 ml of this medium are introduced into a 2.8 L Fernbach flask and sterilized for 30 min. At 121 After cooling, the medium is inoculated with a suspension of S. puniceus supplied by a strain of inocu lum or by a Roux flask, as indicated above. The vial is shaken on a rotating shaker having a displacement of about 62.5 mm. and running at 200 rpm for 4 days and at 27. It is then observed that the broth has an activity of 320 UDC per ml. with a pH equal to 7.3. The pH of the broth and mycelium mixture is adjusted to 2.0 with H2SO4, a reduced amount of Super-ce! Is added and the mixture filtered. The pH of the clear mixture is adjusted to 5.5 and Erio chromium violet is added in an amount of 2 g per liter with stirring.
Stirring is continued for one hour at room temperature and enough Super-cel is added to allow filtration. The cake is separated by filtration and is washed with a quantity of water corresponding to 20% of the initial volume. When it is dry, the cake is suspended in 1 / 12th of the original volume of 80% methanol and is decomposed using 1 g. of BaCi22H2O for each 2 gr. Erio chrome violet by stirring for 2 hours at room temperature. After filtration, the methanolic filtrate is decolorized with a small part of carbon and is filtered again.
To the filtrate, clear as water, are added 2 volumes of absolute methanol and 2 ml of a 50% solution of triethylamine sulphate in methanol for each gram of BaCl2 2H2O.
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pity of barium sulfate and viomycin sulfate using Super-cel.
The cake is washed with absolute methanol and shaken with water to dissolve the viomycin sulfate, with the barium sulfate and Super-cel being removed by filtration., The aqueous solution, clear as water, of the vio sulfate - mycin thus obtained is dried. The white, amorphous powder which is obtained has an activity of 40 UDC / mg.
Example II - Formation of viomycin.
A culture medium is prepared having the following composition:
EMI11.1
<tb> gluten <SEP> from <SEP> wheat <SEP> 10 <SEP> gr.
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Sterilized for 45 minutes at 121 0
Approximately 75 l of this medium are inoculated into a 180 l inoculum tank with stirrer, using 2 l of an inoculum as described above, and obtained by deep culture of S. puniceus and which was cultured at 27 for 24 hours with constant agitation and insufflation of sterile air with a volume of 1.0 to 1.5 free air per volume of broth per minute. At the end of 24 hours the inculum thus prepared is introduced, under absolutely sterile conditions, into 560 1. of the same medium contained in a fermentation tank of 950 1. The agitation and aeration are the same as for the tank. inoculum and after 48 h. and at 27 the resulting broth has a final activity of 100 UDC / ml.
Example III. - Formation and recovery of viomycin.
A culture medium is prepared having the following composition
EMI11.2
<tb> gluten <SEP> from <SEP> wheat <SEP> 10 <SEP> gr.
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<tb> glycerol <SEP> 10 <SEP> gr.
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Four Fernbach flasks are sterilized at 2.8 L, each containing 1 L of this medium, for 20 minutes at 121. After cooling, they are inoculated with a suspension of So puniceus obtained from a strain and they are shaken in a rotating shaker for 48 h. to 28. A mixture of the broth and the mycelium is used to inoculate a 180 liter fermentation tank containing 75 liters of the aforementioned medium and which has been sterilized for 20 minutes at
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121 under absolute aseptic conditions. Stir with a propeller stirrer while the vessel is maintained under positive air pressure by the inlet of sterile air using a hole dispenser.
After 48 h. the broth has an activity of 100 UDC / ml.
The broth, the amount of which corresponds to 75 1., is separated from the mycelium by filtration, its pH is adjusted to 6.5 with H2SO4 and 240 gr. of ammonium oxalate to precipitate calcium in the state of oxalate which is then removed by filtration. The pH of the clear broth is adjusted to 5.5 with H2SO4 and 160 g are added. chrome violet Erio, after which the broth is stirred for an hour and a half. The dye is separated from the spent broth by Super-cet. The dye cake is washed with 15 l of water and dried by blowing air into the filter press.
The dry cake is suspended in 3 l of a mixture of 80% methanol and 20% acetone (by volume) and 250 ml are added. a 50% methanolic solution of triethylamine sulfate, the whole being stirred for one and a half hours. The precipitate of viomycin sulfate and Supercell is filtered off and washed with acetone and then with methanol. The dried cake is then stirred for half an hour in two liters of distilled water and the Super-cel is separated from the viomycin sulfate solution by filtration. The water-clear solution of viomycin sulfate is dried and a white amorphous solid is obtained with an activity of 370 UDC / mg.
Example IV Recovery of viomycin by precipitation of a coloring salt.
75 l of a fermentation broth obtained by culturing a strain of Streptomyces puniceus which gives the test about 570 meg / ml are filtered. After adjusting the pH to 6.5 the solution is treated with 240 gr. Of ammonium oxalate and the precipitated calcium oxalate is filtered. The pH of the solution is adjusted to 5.5 and 160 g are introduced. of chrome violet Erio waving.
After the mixture has been stirred for one hour, a filtration aid is added and the solids are separated by filtration.
The cake is washed with 15 l of water and then dried. The dried color cake is suspended in 3 liters of one. mixture of 80% acetone and 20% methanol (by volume) and a solution of triethylamine sulfate in 50% methanol is added, which is a little more than necessary to completely precipitate the antibiotic sulfate. The mixture is stirred for an hour and a half and is then filtered. The cake obtained by filtration is washed with acetone and methanol to remove the colorant. It is suction dried and then added to 2 L of distilled water. After the viomycin sulfate is dissolved, the solution is filtered, and the filtrate is freeze-dried.
The resulting material weighs 18 g and has an activity of 620 mcg / mg.
Example V. - Recovery of viomycin by cation exchangers,
The pH of 2 L of a filtered fermentation broth of viomycin, assayed 600 mcg / ml, is adjusted to about 8 and this broth is treated with 100 g. Amberlite IRC-50. The mixture is stirred for 3 hours and the resin is removed by filtration and is washed with water. The filtrate retained about 34% of its antibiotic activity. The resin is taken up with stirring for 2 hours in dilute hydrochloric acid. The final pH is 2. The solution is filtered and adjusted to a pH of 6.6. It contains about 50% of the antibiotic initially contained in the fermentation broth.
This solution can be by freezing in a vacuum to form a solid viomycin hydrochloride, but it is preferred to purify it further as explained below.
The resin taken up is concentrated in vacuo by passing through a stream of hot methanol vapors until the water content of the solution is reduced to 13%. When 25 ml of this solution is treated with 25 ml of methanol and when the precipitate is filtered off, the viomycin hydrochloride can be precipitated with an activity of.
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325 mcg / mg. adding 50 ml of butanol. The product contained 21% ash. When this solid material is dissolved in a minimum volume of water and when it is treated again with methanol and butanol, a viomycin hydrochloride is obtained which has an activity of about 800 mcg / mg and which contains only 0.5% ash.
Rather than recovering viomycin hydrochloride, it is possible to obtain sulfate as follows. The product separated from the cation exchanger is neutralized and concentrated to a concentration of about 40,000 mcg / ml. All the calcium present is precipitated by treatment with a solution of triethylamine sulfate in 50% methanol. After adding an equal volume of methanol, the calcium sulfate is filtered off and the filtrate is treated with methanol until the solvent concentration is 80%. If necessary, more triethylamine sulfate is added and the precipitate of viomycin sulfate is filtered off.
The dried product has an activity of about 800 mcg / mg and contains little ash.
Example VI.- Crystallization of viomycin sulfate.
Crystallized viomycin sulfate seeds are first obtained by preparing crystallized reineckate by treating an aqueous solution of amorphous viomycin sulfate (activity about 700 mcg / mg) with a slight excess of ammonium reineckate. The crystallized antibiotic Reineekate, which is easily separated, is treated in methanol with triethylamine sulfate to obtain crystallized viomycin sulfate.
Then the crystallized viomycin sulfate can be prepared directly from the amorphous material having sufficient purity (approx. 650 mcg / mg). The amorphous material is dissolved in a small volume of water and methanol is added until the mixture becomes cloudy.
Seeds of viomycin sulfate crystals are added and the mixture is stirred. The crystallized material is separated by filtration and is dried. It has an activity of about 760 mcg / mg. Other solvents, such as methylcellosolve, acetone and ethanol can be used, but methanol is preferred.
Amorphous viomycin hydrochloride, having an activity of 720 mcg / mg, is converted to crystallized sulfate as follows.
65 g of the substance are dissolved in a mixture of 500 ml of water and 500 ml of methanol. An excess of triethylamine sulfate dissolved in 50% methanol (400 ml) is slowly added. The mixture is seeded and stirred and another 150 ml of methanol are added. The crystals separated are filtered and washed successively in 60% methanol, 80% methanol and anhydrous methanol. The product is dried under vacuum over anhydrous calcium chloride. It weighs 56.2 g and has an activity of 750 mcg / mg.
Example VII.- Crystallization of viomycin hydrochloride.
10 g of amorphous viomycin hydrochloride, having an activity of about 750 mct / mg, is dissolved in 40 ml of water and 200 ml of methanol is added. The solution is heated, seeded and stirred. When it is cold, 500 ml of methanol are gradually added. The crystallized antibiotic hydrochloride is filtered and dried. It weighs 3.35 g and has an activity of about 800 mcg / mg. This product has a melting point of 265-268. Further crystalline material can be obtained by concentrating the mother liquor.
Example VIII Preparation of crystallized viomycin ss-naphtha nesulfonate.
10 g of amorphous viomycin sulphate having an activity of about 500 mcg / mg are dissolved in 10 ml of water and a solution of 8.0 g of ss-naphthane sulfonic acid in 20 ml of water is added. 'water. The pH of the solution is adjusted to 6.0 with a saturated solution of barium hydroxide and the barium sulfate is separated by filtration. By concentrating the filtrate and adding ethanol, 5 g of crystallized viomycin β-naphthalene sulfonate is obtained with an activity of 600 mcg / mg.
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It is understood that the compositions of the culture media, indicated above, are given only by way of example and that they can vary between wide limits, for example by replacing wheat gluten with seed flour. cotton or soybeans, etc. Likewise, the fermentation conditions, such as agitation, degree of aeration, temperature, etc. can vary considerably.
In addition, several other methods or variations, other than those indicated, can be used to recover, concentrate and purify the antibiotic and its salts. For example, the antibiotic can be recovered and purified by adsorption on activated alumina, charcoal and the like followed by recovery with acids or neutral solvents, etc.
The antibiotic, according to the figures given above, is of great value for the treatment of various infections in man and animals. It can be administered by parenteral injection, by mouth, by local action and with the usual doses.
As goes without saying and as it follows, moreover already from the foregoing, the invention is in no way limited to that of its modes of application nor to those of the embodiments of its various parts. , having more especially been indicated; it embraces, on the contrary, all the variants.
CLAIMS
1. A process for the preparation of an antibiotic, comprising cultivating a strain of Streptomyces puniceus in an aqueous solution of a carbohydrate and containing at least one nutrient under aerobic conditions and at depth, to that the solution exhibits substantial antibacterial activity, and then recovering the antibiotic thus obtained from the fermentation broth.
2. A method of preparing an antibiotic, comprising cultivating a strain of Streptomyces puniceus in an aqueous culture medium containing a growth promoting substance maintained under aerobic and deep growth conditions, at a temperature of about 24 to 30 C for a period ranging from 2 days to a week, and then recovering the antibiotic thus obtained from the fermentation broth.
3. Method according to either of claims 1 and 2, wherein the antibiotic is recovered by precipitating it out of an aqueous solution, forming a salt of this antibiotic, with the aid of a sulfonate. dye.
4. A method according to either of claims 1 and 2 wherein the antibiotic is recovered by adsorption on -Hui resinous cation exchanger.
5. A process for the preparation of an antibiotic, in substance as described in the examples above.
6. Antibiotics, when prepared by a process according to any one of the preceding claims.
7. A novel antibiotic having the characteristics specified above of an antibiotic obtained by culturing a strain of Streptomyces puniceus.
8. Salt of an antibiotic according to either of claims 6 and 7.
9. Sulfate of an antibiotic according to either of claims 6 and 7.
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