<Desc/Clms Page number 1>
PROCEDE DE PRODUCTION DE CRISTAUX: D'INSULINE, AYANT UNE TENEUR ACCRUE
EN METAL.
Il est connu que la présence préalable de certains métaux est nécessaire à la cristallisation de l'insuline. L'application en a été faite dans la production industrielle d'insuline cristallisée ou on ajoute du zinc sous forme d'un sel, un chlorure par exemple, au milieu aqueux dans lequel on effectue la cristallisation. Par un tel procédés, les cristaux d'insuline possèdent une certaine teneur en zinc, habituellement de l'ordre de 0,4%.
La présente invention se rapporte à un procédé de production de cristaux d'insuline ayant une teneur accrue en métal ; est carac- térisée principalement en ce qu'on met en contact de l'insuline cristallisée avec un milieu aqueux dans lequel des cristaux d'insuline sont insolubles ou difficilement solubles, le milieu aqueux possédant une teneur telle en un au moins de ces métaux dont la présence préalable est nécessaire à la cristallisation de l'insuline, par exemple le zinc, le cobalt, le nickel, le cadmium, le cuivre, le manganèse et le fer, et une valeur de pH telle que l'insuline cristallisée retient du.métal aux dépens du milieu, après quoi on sépare l'insuline.
Si on met des cristaux d'insuline, ayant une teneur en zinc de 0,4% environ ou une teneur correspondante des autres métaux mentionnés plus haut, dans de l'eau contenant un ou plusieurs de' ces métaux, ces derniers doivent s'y trouver à raison de 5 x A x 10-3 milliéquivalents par litre, "A" désignant le nombre d'unités internationales d'insuline par centimètre cube de suspension.
Au sujet de la teneur requise en métal du milieu aqueux, la rè- gle générale est que pour former des cristaux d'insuline avec teneur accrue prédéterminée en métal, une teneur croissante en métal du milieu est requise
<Desc/Clms Page number 2>
avec une valeur écroissante de pH du milieu. Pour une quantité prédétermi- née de cristaux d'insuline par unité de volume du milieu aqueux, une teneur croissante en métal dans le milieu amènera dans des conditions égales une teneur accrue en métal dans les cristaux.
De plus, lors du calcul de la teneur en métal du milieu en vue d'obtenir des cristaux d'insuline avec une teneur accrue prédéterminée en métal on doit voir si le milieu aqueux ne contient pas en supplément cer- taines substances ayant une plus grande affinité pour le métal que les cris- taux d'insuline, auquel cas on doit utiliser une teneur plus élevée en mé- tal que lorsque de telles substances ne sont pas présentes dans le milieu.
Il n'y a pas de limite supérieure pour la teneur en métal du milieu aqueux.
Si le milieu aqueux possède ou si on lui communique une valeur de pH d'environ 7, environ 2,7% de zinc sont à même d'être retenus par les cristaux dans les conditions normales, ce qui correspond au nombre de grou- pements acides dans la molécule d'insuline, mais avec des valeurs de pH plus élevées on peut atteindre de plus fortes teneurs en zinc. Des condi- tions similaires s'appliquent aux autres métaux.
Il est préférable que le milieu aqueux contienne le métal dési- ré sous forme d'un sel, par exemple de chlorure, sulfate, nitrate, acétate ou citrate, mais on peut administrer également le métal à l'état d'oxyde ou d'hydroxyde ou de composé complexe ou sous sa forme métallique propre pourvu que le métal ou le composé métallique utilisé dans les conditions prévalant dans le milieu soit dans une condition telle que le métal puisse être fixé par les cristaux d'insuline.
La valeur du pH du milieu aqueux a une influence décisive sur la solubilité des cristaux d'insuline dans le milieu et sur leur aptitude à fixer le métal aux dépens du milieu. Naturellement c'est une condition d'exécution du procédé que les cristaux ne se dissolvent pas complètement dans le milieu. D'un autre côté il n'est pas nécessaire que les cristaux soient insolubles dans le milieu vu que cette partie de l'insuline, si il y en a une , qui entre en solution est récupérable sous forme cristalline.
Pour autant que le milieu ne contienne pas de substance ayant une aptitude spécifique à supprimer la solubilité des cristaux, on ne peut pas éviter que tous les cristaux entrent en solution lorsqu'on les met en suspension dans un milieu montrant une valeur, de pH supérieure à 9. De plus, lorsqu'on dépasse cette valeur de pH l'insuline commence à se décomposer, ce qui amène une perte en insuline. Si la valeur du pH du milieu aqueux est inférieure à 2, il est difficile de mettre en pratique le procédé même lorsque des subs- tances qui possèdent la propriété de supprimer la solubilité des cristaux d'insuline sont présentes.
En conséquence, il est préférable suivant l'invention que le milieu aqueux possède ou qu'on lui communique une valeur de pH comprise entre 2 et 9, de préférence entre 5 et 8.
On préférera par dessus tout que le milieu aqueux ait ou qu'on lui communique une valeur de pH comprise entre 6 et 7, en partie parce que les cristaux d'insuline avec une teneur accrue en métal se sont montrés le plus difficilement solubles dans cet intervalle de pH et en partie parce qu'il faut une teneur en métal du milieu comparativement plus élevée aux valeurs basses de pH, et qu'aux valeurs supérieures à 7 il se produit sou- vent une précipitation simultanée de sels métalliques qui doivent être éli- minés plus tard des cristaux qui se sont séparés, si on désire obtenir des cristaux purs.
Suivant l'invention, on peut réaliser l'ajustement du milieu aqueux à la valeur de pH recherchée au moyen de un ou plusieurs agents tam- pons. Comme exemple de composés tampons pouvant être utilisés ici, on men- tionnera les tampons acétate, borate, citrate, diéthylbarbiturate, phospha- te et maléate ou leurs mélanges.
<Desc/Clms Page number 3>
Lors du choix de l'agent tampon et autres produits d'addition . ou des substances contenues dans le milieu aqueux,, il y a en outre une au; tre chose à prendre en considération. On a trouvé que la présence de cer- tains anions dans le milieu aqueux influence l'incorporation du métal dans les cristaux d'insuline à partir du milieu.
Si le milieu aqueux contient ou si on y introduit du phosphate ou du citrate, par exemple en utilisant un phosphate ou un citrate comme tampons, et que l'on communique au milieu une teneur en zinc qui est normalement suffisante pour former des cristaux d'insuline avec une teneur accrue en métal, les cristaux d'insuline ne fi- xeront pas du zinc à partir du milieu pour un pH 5 du milieu, tandis que les cristaux entreront en solution en ajustant le milieu au pH 7. Ce n'est seulement que lorsqu'on ajoute de telles grandes quantités de zinc pour que les ions phosphate ou citrate présents soient fixés par le zinc et qu'il reste encore après cela du zinc à la disposition des cristaux;
, que ceux-ci sont à même de montrer un accroissement de leur teneur en métal. D'un au- tre côté, la présence des ions phosphate dans les conditions mentionnées plus haut n'exerce aucune influence défavorable sur la formation des cris- taux d'insuline avec une teneur accrue en nickel.
Dans les conditions normales les cristaux fixent le métal à par- tir du milieu de suspension pour ainsi dire instantanément. En tout cas il n'y a pas de motif d'utiliser une période d'attente particulière avant de les séparer du milieu de suspension. L'emploi d'une telle période d'attente, comme par exemple un repos d'une nuit dans le milieu, augmente la teneur en métal de 10% au plus et un repos de 24 heures ne donne pas d'accroissement supplémentaire.
Les cristaux d'insuline avec une teneur accrue en métal obtenus suivant l'invention peuvent, entre autres choses, être utilisés pour prépa- rer des suspensions cristallines injectables montrant un effet à retardement lorsqu'on les injecte par voie sous-cutanée ou intramusculaire.
En exécutant le procédé de l'invention, on peut dans la prati- que partir des cristaux ordinaires d'insuline qui contiennent d'habitude 0,4% environ de zinc et qui, lorsqu'on les met en suspension dans une solu- tion aqueuse d'un sel d'un des métaux mentionnés plus haut, acquièrent une teneur acerue du métal en question en faisant usage, si on le désire, d'un agent tampon ou.d'un mélange tampon pour ajuster et maintenir la valeur re- cherchée du pH de la solution.
EXEMPLE 1
On met èn suspension 174 mg d'insuline cristallisée contenant environ 0,4% de zinc dans le 100 cm3 d'une solution aqueuse de chlorure de zinc contenant 0,008% de zinc et ajuste le pH à une valeur de 7 environ. On sépare alors les cristaux, par exemple par filtration ou centrifugation, et lave à l'eau. Les cristaux séparés montrent une teneur en zinc d'environ 2,3%.
EXEMPLE 2
On met en suspension 43,5 mg d'insuline cristallisée avec une teneur en zinc de 0,4% environ dans 100 cm3 de la solution de chlorure de zinc utilisée dans l'exemple 1 et on sépare ensuite les cristaux et lave à l'eau. Les cristaux séparés montrent.une teneur en zinc d'environ 2,6%.
EXEMPLE 3
On met en suspension 348 mg d'insuline cristallisée avec une te- neur en zinc de 0,4% environ dans 100 cm3 de la solution de chlorure de zinc utilisée dans l'exemple 1 et on sépare ensuite les cristaux et lave à l'eau.
Les cristaux séparés montrent une teneur en zinc d'environ 1,8 %.
EXEMPLE 4
On met en suspension 174 mg d'insuline cristallisée avec une te-
<Desc/Clms Page number 4>
neur en zinc de 0,4% environ dans 100 cm3 d'une solution aqueuse de chlo- rure de nickel contenant 0,005% de nickel et ajuste le pH à 6-7 avec de la soude caustique. Les cristaux, qui ont été séparés et lavés, contiennent du nickel.
EXEMPLE 5
On-met en suspension 174 mg d'insuline cristallisée avec une teneur en zinc de 0,4% environ dans 100 cm3 d'une solution aqueuse conte- nant 0,008% de zinc (à l'état de sulfate) et 1/120 de mole d'acétate de sodium et ajuste le pH vers 5 avec de l'acide chlorhydrique, après quoi on sépare les cristaux et les lave à l'eau. On obtient des cristaux d'in- suline avec une teneur en zinc de 0,5% environ.
EXEMPLE 6
On utilise le même procédé que dans l'exemple 5 sauf qu'on a- juste la solution aqueuse à un pH de 6 environ. Il en résulte des cristaux d'insuline avec une teneur en zinc de 1% environ.
EXEMPLE 7
On utilise le même procédé que dans l'exemple 5 sauf qu'on a- juste la solution aqueuse à un pH de 7 environ. Il en résulte des cristaux d'insuline avec une teneur en zinc de 1,9% environ.
EXEMPLE 8
On met en suspension 174 mg d'insuline cristallisée dans 100 cm3 d'une solution aqueuse contenant 0,002% de zinc (à l'état de chlorure) et 1/120 de mole d'acide diéthylbarbiturique et ajuste le pH à une valeur de 7,2 environ avec de la soude caustique, après quoi on sépare les cristaux.
Ils montrent une teneur en zinc de 1,1% environ.
EXEMPLE 9
On utilise le même procédé que dans l'exemple 8 sauf que la so- lution aqueuse renferme une teneur en zinc de 0,004%. Il en résulte des cris- taux avec une teneur en zinc de 1,7% environ.
EXEMPLE 10 On utilise le même procédé que dans l'exemple 8 sauf que la so- lution aqueuse renferme une teneur en zinc de 0,016%. Il en résulte des cris- taux avec une teneur en zinc de 2,5% environ.
EXEMPLE 11
On utilise le même procédé que dans l'exemple 8 sauf que la so- lution aqueuse renferme une teneur en zinc de 0,03% environ. Les cristaux sé- parés ont alors une teneur en zinc de 2,7% environ.
EXEMPLE 12
On met en suspension 174 mg d'insuline cristallisée avec une te- neur en zinc d'environ 0,4% dans 100 cm3 d'une solution aqueuse contenant 0,016% de zinc (à l'état de chlorure) et 1/120 de mole d'acide borique et ajuste le pH à une valeur de 7 environ. On sépare les cristaux et lave à l'eau. Les cristaux contiennent environ 2,5% de zinc..
EXEMPLE 13
On met en suspension 174 mg d'insuline cristallisée avec une te- neur en nickel de 0,3% environ dans 100 cm3 d'une solution aqueuse contenant 0,008% de nickel (à l'état de chlorure) et 1/120 de mole de phosphate de so- dium et ajuste le pH à une valeur de 7 environ, après quoi on sépare les cris- taux et les lave à l'eau. Ils montrent une-teneur accrue en nickel.
<Desc/Clms Page number 5>
EXEMPLE 14
On met en suspension 174 mg d'insuline cristallisée avec une teneur en zinc d'environ 0,4% dans 100 cm3 d'une solution aqueuse contenant 0,014% de cadmium (à l'état de chlorure) et 1/120 de mole d'acétate de so- dium et ajuste le pH aux environs de 7 après quoi on sépare les cristaux et les lave à l'eau. Ils montrent une teneur en cadmium de 3% environ.
EXEMPLE 15
On met en suspension 174 mg d'insuline cristallisée avec une te- neur en zinc d'environ 0,4% dans 100 cm3 d'une solution aqueuse contenant 0,006% de cuivre (à l'état de chlorure) et 1/120 de mole d'acétate de' so- dium et ajuste le pH aux environs de 6 avec HCL, après quoi on sépare les cristaux et les lavée à l'eau. Les cristaux séparés et lavés montrent une teneur en cuivre.
Dans les exemples mentionnés ci-dessus servent de matières pre- mières des cristaux d'insuline fabriqués préalablement et renfermant la te- neur habituelle en métal. Cependant, le procédé de l'invention peut égale- ment s'effectuer en relation avec la fabrication de cristaux d'insuline à partir d'insuline amorphe ou avec la recristallisation d'insuline cristal- lisée.
Par conséquent le procédé de l'invention est caractérisé en', . outre en ce qu'on fait cristalliser de l'insuline dans un milieu aqueux et en ce que l'on introduit un des métaux mentionnés dans le milieu et/ou change la valeur du pH du milieu en sorte qu'il-'se forme des cristaux d'in- suline ayant une teneur accrue en métal.
On peut effectuer la cristallisation d'une manière connue en soi dans laquelle on fait cristalliser de l'insuline dissoute à partir d'u- ne solution aqueuse acide contenant un ou plusieurs agents tampons, un sol- vant organique favorisant la cristallisation et un sel d'un des métaux com- me le zinc, le cobalt, le nickel et le cadmium, en ramenant la valeur du pH de la solution entre 5,5 et 6,5.
Lors du choix de l'agent tàmpon on doit tenir compte de ce qui a été établi dans la description précédente au sujet de l'influence de cer- tains anions sur l'aptitude des cristaux à fixer le métal après la cristal- lisation; Lorsqu'on effectue le procédé de l'invention en utilisant l'eau- mère des cristaux d'insuline comme milieu de suspension, il n'est pas ap- proprié, en vue de produire des cristaux d'insuline avec une teneur accrue en zinc, d'utiliser du phosphate ou du citrate comme agent tampon pour la cristallisation, tandis qu'il n'est pas approprié d'utiliser du citrate comme agent tampon pour la cristallisation lorsqu'on produit des cristaux d'insuline avec une teneur accrue en nickel.
EXEMPLE 16
On dissout 200 mg d'insuline amorphe (20 U.I. par mg) dans 100 cm3 d'une solution d'acide chlorhydrique contenant 0,001% de zinc (à l'état de chlorure), 1/120 de mole d'acétate de sodium et 1/120.de mole d'acide diéthylbarbiturique, et en ajustant la valeur du pH de.la solution à 5,6- 5,8 avec de la soude caustique. Au bout d'un certain temps, et en agitant si c'est nécessaire, l'insuline cristallise. Lorsque la cristallisation est terminée on ajoute 0,01% de zinc (à l'état de chlorure) et élève ensuite la valeur du pH aux environs de 7 au moyen de soude caustique. On sépare les cristaux par filtration sous vide et lave à l'eau. Les cristaux montrent u- ne teneur en zinc voisine de 2%.
EXEMPLE 17
On dissout au moyen d'acide chlorhydrique 2,0 g d'insuline amor- phe (20 U.I. par mg) dans un litre d'une solution contenant 5% d'acétone, 0,001% de zinc (à l'état de chlorure), 1/120 de mole d'acétate de sodium et
<Desc/Clms Page number 6>
1/120 de mole d' cide déithylbarbiturique, et élève ensuite la valeur du pH de la solution vers 5,8 avec de la soude caustique, provoquant ainsi la cristallisation de l'insuline. Lorsque la cristallisation est terminée on ajoute 200 mg de zinc (à l'état de chlorure) et élève la valeur du pH de la suspension cristalline vers 7 avec de la soude caustique. On sépare ensuite les cristaux et les lave à l'eau. Ils montrent une teneur en zinc voisine de 2,5%.
EXEMPLE 18
On dissout au moyen d'acide chlorhydrique 1,7 g de cristaux d'in- suline dans un litre d'une solution contenant 1/120 de mole d'acétate de so- dium et 1/120 de mole d'acide diéthylbarbiturique.et ajuste ensuite le pH de la solution à 5,5 - 5,7 avec de la soude caustique. Au bout d'un certain temps, et en agitant si c'est nécessaire, l'insuline cristallise. Lorsque la cristallisation est terminée on ajoute 100 mg de zinc (à l'état de chlo- rure) et élève la valeur du pH vers 7 avec de la soude caustique. Après avoir secoué la suspension cristalline on sépare les cristaux et les lave avec de l'eau. Ils montrent une teneur en zinc voisine de 2%.
EXEMPLE 19
On dissout 174 mg d'insuline cristallisée dans 20 em3 d'acide chlorhydrique 0,01 N et on ajoute successivement dans l'ordre indiqué :
10 cm3 d'une solution à 1/12 de mole d'acétate de sodium
70 cm3 d'une solution contenant 0,004% de zinc (à l'état de chlorure). et abaisse le pH à une valeur voisine de 5. Lorsque l'insuline précipitée est devenue cristalline après repos, on ajuste le pH de la suspension cris- talline à une valeur voisine de 7, et on sépare les cristaux par filtration sous vide et les lave à l'eau. Les cristaux montrent une teneur en zinc voi- sine de 1,4%.
D'après les exemples précédents il apparaît qu'on peut obtenir des cristaux d'insuline par le procédé suivant l'invention et que ces cris- taux présentent une grande variété de teneurs en métal, supérieures à la teneur que les cristaux montraient primitivement. Au moyen des cristaux produits suivant l'invention il devient possible de préparer des suspensions cristallines injectables montrant un effet différent de retardement en fonc- tion de la valeur de l'accroissement de la teneur en métal des cristaux.
Les cristaux d'insuline produits suivant l'invention sont carac- térisés en général par leur teneur en métal supérieure à 0,16 milliéquiva- lents par gramme de cristaux, de préférence supérieure à 0,25 milliéquiva- lents par gramme de cristaux. On préfère particulièrement atteindre une te- neur en métal supérieure à 0,35 milliéquivalents par gramme de cristaux.
Ceux-ci contiennent au moins un des métaux comme le zinc, le cobalt, le nickel, le cadmium, le cuivre, le manganèse et le fer, de préférence un ou plusieurs des 4 premiers métaux mentionnés.
REVENDICATIONS.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.
<Desc / Clms Page number 1>
PROCESS FOR THE PRODUCTION OF CRYSTALS: OF INSULIN, HAVING AN INCREASED CONTENT
MADE OF METAL.
It is known that the prior presence of certain metals is necessary for the crystallization of insulin. The application has been made in the industrial production of crystallized insulin where zinc is added in the form of a salt, a chloride for example, to the aqueous medium in which the crystallization is carried out. By such a method, the insulin crystals have a certain zinc content, usually on the order of 0.4%.
The present invention relates to a process for producing insulin crystals having increased metal content; is characterized mainly in that crystallized insulin is brought into contact with an aqueous medium in which insulin crystals are insoluble or hardly soluble, the aqueous medium having such a content of at least one of these metals of which the prior presence is necessary for the crystallization of insulin, for example zinc, cobalt, nickel, cadmium, copper, manganese and iron, and a pH value such that crystallized insulin retains. metal at the expense of the medium, after which the insulin is separated.
If insulin crystals, having a zinc content of about 0.4% or a corresponding content of the other metals mentioned above, are put in water containing one or more of these metals, the latter should be dissolved. Find therein at a rate of 5 x A x 10-3 milliequivalents per liter, "A" denoting the number of international units of insulin per cubic centimeter of suspension.
Regarding the required metal content of the aqueous medium, the general rule is that in order to form insulin crystals with a predetermined increased metal content, an increasing metal content of the medium is required.
<Desc / Clms Page number 2>
with an increasing pH value of the medium. For a predetermined amount of insulin crystals per unit volume of the aqueous medium, an increasing content of metal in the medium will lead under equal conditions to an increased content of metal in the crystals.
In addition, when calculating the metal content of the medium in order to obtain insulin crystals with a predetermined increased metal content, it must be seen whether the aqueous medium does not additionally contain certain substances having a higher concentration. metal affinity than insulin crystals, in which case a higher metal content should be used than when such substances are not present in the medium.
There is no upper limit for the metal content of the aqueous medium.
If the aqueous medium has or is communicated to a pH value of about 7, about 2.7% zinc is able to be retained by the crystals under normal conditions, which corresponds to the number of clusters. acids in the insulin molecule, but with higher pH values one can achieve higher zinc contents. Similar conditions apply to other metals.
It is preferred that the aqueous medium contains the desired metal in the form of a salt, for example chloride, sulfate, nitrate, acetate or citrate, but the metal can also be administered in the form of an oxide or an oxide. hydroxide or complex compound or in its proper metallic form provided that the metal or metallic compound used under the conditions prevailing in the medium is in such a condition that the metal can be fixed by the insulin crystals.
The pH value of the aqueous medium has a decisive influence on the solubility of insulin crystals in the medium and on their ability to bind metal at the expense of the medium. Of course, it is a condition of carrying out the process that the crystals do not completely dissolve in the medium. On the other hand it is not necessary that the crystals be insoluble in the medium since that part of the insulin, if there is one, which goes into solution is recoverable in crystalline form.
As long as the medium does not contain a substance having a specific ability to suppress the solubility of crystals, it cannot be avoided that all the crystals go into solution when they are suspended in a medium showing a higher pH value. to 9. In addition, when this pH value is exceeded, the insulin begins to decompose, which leads to a loss of insulin. If the pH value of the aqueous medium is less than 2, it is difficult to carry out the process even when substances which have the property of suppressing the solubility of insulin crystals are present.
Consequently, it is preferable according to the invention that the aqueous medium has or is communicated to it a pH value of between 2 and 9, preferably between 5 and 8.
Above all, it will be preferred that the aqueous medium has or is communicated to it a pH value of between 6 and 7, in part because insulin crystals with an increased metal content have been shown to be more difficult to dissolve in this medium. range and partly because a comparatively higher metal content of the medium is required at low pH values, and that at values above 7 there often occurs a simultaneous precipitation of metal salts which must be removed. - later mined crystals which separated, if one wishes to obtain pure crystals.
According to the invention, the adjustment of the aqueous medium to the desired pH value can be carried out by means of one or more buffering agents. As examples of buffer compounds which can be used herein, there will be mentioned acetate, borate, citrate, diethylbarbiturate, phosphate and maleate buffers or mixtures thereof.
<Desc / Clms Page number 3>
When choosing the buffering agent and other adducts. or substances contained in the aqueous medium, in addition there is an au; be something to take into consideration. It has been found that the presence of certain anions in the aqueous medium influences the incorporation of the metal into the insulin crystals from the medium.
If the aqueous medium contains or is introduced therein phosphate or citrate, for example using phosphate or citrate as buffers, and the medium is imparted a zinc content which is normally sufficient to form crystals of insulin with increased metal content, the insulin crystals will not fix zinc from the medium at pH 5 of the medium, whereas the crystals will go into solution by adjusting the medium to pH 7. This is not only that when such large quantities of zinc are added so that the phosphate or citrate ions present are fixed by the zinc and that there is still zinc remaining after that at the disposal of the crystals;
, that these are able to show an increase in their metal content. On the other hand, the presence of the phosphate ions under the above-mentioned conditions does not exert any adverse influence on the formation of insulin crystals with an increased nickel content.
Under normal conditions the crystals fix the metal from the suspending medium almost instantaneously. In any case there is no reason to use a particular waiting period before separating them from the suspension medium. The use of such a waiting period, such as for example an overnight rest in the medium, increases the metal content by at most 10% and a 24 hour rest does not give any further increase.
The crystals of insulin with increased metal content obtained according to the invention can, among other things, be used to prepare injectable crystalline suspensions showing a delayed effect when injected subcutaneously or intramuscularly.
In carrying out the process of the invention, it is in practice possible to start from ordinary insulin crystals which usually contain about 0.4% zinc and which, when suspended in a solution. of a salt of one of the metals mentioned above, acquire an acute content of the metal in question by making use, if desired, of a buffering agent or of a buffering mixture to adjust and maintain the value. - sought the pH of the solution.
EXAMPLE 1
174 mg of crystallized insulin containing approximately 0.4% zinc is suspended in 100 cm3 of an aqueous solution of zinc chloride containing 0.008% zinc and the pH is adjusted to a value of approximately 7. The crystals are then separated, for example by filtration or centrifugation, and washed with water. The separated crystals show a zinc content of about 2.3%.
EXAMPLE 2
43.5 mg of crystallized insulin with a zinc content of approximately 0.4% are suspended in 100 cm3 of the zinc chloride solution used in Example 1 and the crystals are then separated and washed with water. water. The crystals separated show a zinc content of about 2.6%.
EXAMPLE 3
348 mg of crystallized insulin with a zinc content of about 0.4% are suspended in 100 cc of the zinc chloride solution used in Example 1 and the crystals are then separated and washed with water. water.
The separated crystals show a zinc content of about 1.8%.
EXAMPLE 4
174 mg of crystallized insulin is suspended with a concentration of
<Desc / Clms Page number 4>
Zinc of about 0.4% in 100 cm3 of an aqueous solution of nickel chloride containing 0.005% nickel and adjust the pH to 6-7 with caustic soda. The crystals, which have been separated and washed, contain nickel.
EXAMPLE 5
174 mg of crystallized insulin with a zinc content of approximately 0.4% is suspended in 100 cm3 of an aqueous solution containing 0.008% zinc (in the sulphate state) and 1/120 of mole of sodium acetate and adjust the pH to 5 with hydrochloric acid, after which the crystals are separated and washed with water. Insulin crystals are obtained with a zinc content of about 0.5%.
EXAMPLE 6
The same process was used as in Example 5 except that the aqueous solution was just obtained at a pH of about 6. This results in insulin crystals with a zinc content of about 1%.
EXAMPLE 7
The same process as in Example 5 was used except that the aqueous solution was just obtained at a pH of about 7. This results in insulin crystals with a zinc content of approximately 1.9%.
EXAMPLE 8
174 mg of crystallized insulin is suspended in 100 cm3 of an aqueous solution containing 0.002% of zinc (as chloride) and 1/120 of a mole of diethylbarbituric acid and the pH is adjusted to a value of 7 , About 2 with caustic soda, after which the crystals are separated.
They show a zinc content of approximately 1.1%.
EXAMPLE 9
The same process as in Example 8 was used except that the aqueous solution contained a zinc content of 0.004%. This results in crystals with a zinc content of approximately 1.7%.
EXAMPLE 10 The same process as in Example 8 was used except that the aqueous solution contained a zinc content of 0.016%. This results in crystals with a zinc content of about 2.5%.
EXAMPLE 11
The same process as in Example 8 was used except that the aqueous solution contained a zinc content of about 0.03%. The separated crystals then have a zinc content of about 2.7%.
EXAMPLE 12
174 mg of crystallized insulin with a zinc content of about 0.4% is suspended in 100 cm3 of an aqueous solution containing 0.016% zinc (as chloride) and 1/120% zinc. mole of boric acid and adjust the pH to a value of approximately 7. The crystals are separated and washed with water. The crystals contain about 2.5% zinc.
EXAMPLE 13
174 mg of crystallized insulin with a nickel content of approximately 0.3% is suspended in 100 cm3 of an aqueous solution containing 0.008% nickel (in the chloride state) and 1/120 of a mole. sodium phosphate and adjust the pH to a value of about 7, after which the crystals are separated and washed with water. They show an increased nickel content.
<Desc / Clms Page number 5>
EXAMPLE 14
174 mg of crystallized insulin with a zinc content of about 0.4% is suspended in 100 cm3 of an aqueous solution containing 0.014% of cadmium (in the chloride state) and 1/120 of a mole. sodium acetate and adjust the pH to about 7 after which the crystals are separated and washed with water. They show a cadmium content of around 3%.
EXAMPLE 15
174 mg of crystallized insulin with a zinc content of about 0.4% is suspended in 100 cm3 of an aqueous solution containing 0.006% copper (as chloride) and 1/120 of. mole of sodium acetate and adjust the pH to about 6 with HCl, after which the crystals are separated and washed with water. The separated and washed crystals show a copper content.
In the examples mentioned above, insulin crystals produced previously and containing the usual metal content are used as raw materials. However, the process of the invention can also be carried out in connection with the manufacture of insulin crystals from amorphous insulin or with the recrystallization of crystallized insulin.
Consequently, the method of the invention is characterized by ',. besides crystallizing insulin in an aqueous medium and introducing one of the metals mentioned in the medium and / or changing the pH value of the medium so that it is formed insulin crystals with increased metal content.
The crystallization can be carried out in a manner known per se in which dissolved insulin is crystallized from an acidic aqueous solution containing one or more buffering agents, an organic solvent promoting crystallization and a salt. one of the metals such as zinc, cobalt, nickel and cadmium, by reducing the pH value of the solution to between 5.5 and 6.5.
When choosing the tampon agent, account must be taken of what has been established in the preceding description with regard to the influence of certain anions on the ability of the crystals to fix the metal after crystallization; When carrying out the process of the invention using the mother liquor of insulin crystals as a suspending medium, it is not suitable for producing insulin crystals with increased content of insulin. zinc, to use phosphate or citrate as a buffering agent for crystallization, while it is not suitable to use citrate as a buffering agent for crystallization when producing insulin crystals with increased content in nickel.
EXAMPLE 16
200 mg of amorphous insulin (20 IU per mg) is dissolved in 100 cm3 of a hydrochloric acid solution containing 0.001% zinc (as chloride), 1/120 of a mole of sodium acetate and 1/120. Mole of diethylbarbituric acid, and adjusting the pH value of the solution to 5.6-5.8 with caustic soda. After a while, and with stirring if necessary, the insulin crystallizes. When crystallization is complete, 0.01% zinc (in the chloride state) is added and the pH value is then raised to around 7 by means of caustic soda. The crystals are separated by filtration under vacuum and washed with water. The crystals show a zinc content of around 2%.
EXAMPLE 17
2.0 g of amorphous insulin (20 IU per mg) are dissolved in hydrochloric acid in one liter of a solution containing 5% acetone, 0.001% zinc (as chloride). , 1/120 of a mole of sodium acetate and
<Desc / Clms Page number 6>
1/120 of a mole of deithylbarbituric acid, and then raises the pH value of the solution to 5.8 with caustic soda, thus causing the insulin to crystallize. When crystallization is complete, 200 mg of zinc (in the chloride state) are added and the pH value of the crystalline suspension is raised to around 7 with caustic soda. The crystals are then separated and washed with water. They show a zinc content close to 2.5%.
EXAMPLE 18
1.7 g of insulin crystals are dissolved using hydrochloric acid in one liter of a solution containing 1/120 of a mole of sodium acetate and 1/120 of a mole of diethylbarbituric acid. and then adjust the pH of the solution to 5.5 - 5.7 with caustic soda. After a while, and with stirring if necessary, the insulin crystallizes. When crystallization is complete, 100 mg of zinc (in the chloride state) are added and the pH value is raised to around 7 with caustic soda. After shaking the crystalline suspension, the crystals are separated and washed with water. They show a zinc content of around 2%.
EXAMPLE 19
174 mg of crystallized insulin is dissolved in 20 em3 of 0.01 N hydrochloric acid and added successively in the order indicated:
10 cm3 of a 1/12 mole solution of sodium acetate
70 cm3 of a solution containing 0.004% zinc (as chloride). and lowering the pH to a value close to 5. When the precipitated insulin has become crystalline after standing, the pH of the crystalline suspension is adjusted to a value close to 7, and the crystals are separated by vacuum filtration and the crystals are removed. wash with water. The crystals show a zinc content of around 1.4%.
From the preceding examples it appears that insulin crystals can be obtained by the process according to the invention and that these crystals have a wide variety of metal contents, higher than the level which the crystals originally showed. By means of the crystals produced according to the invention it becomes possible to prepare injectable crystalline suspensions showing a different retarding effect depending on the magnitude of the increase in the metal content of the crystals.
The insulin crystals produced according to the invention are characterized in general by their metal content of greater than 0.16 milliequivalents per gram of crystals, preferably greater than 0.25 milliequivalents per gram of crystals. It is particularly preferred to achieve a metal content of greater than 0.35 milliequivalents per gram of crystals.
These contain at least one of the metals such as zinc, cobalt, nickel, cadmium, copper, manganese and iron, preferably one or more of the first 4 metals mentioned.
CLAIMS.
** ATTENTION ** end of DESC field can contain start of CLMS **.