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PROCEDE DE PRODUCTION DE CRISTAUX: D'INSULINE, AYANT UNE TENEUR ACCRUE
EN METAL.
Il est connu que la présence préalable de certains métaux est nécessaire à la cristallisation de l'insuline. L'application en a été faite dans la production industrielle d'insuline cristallisée ou on ajoute du zinc sous forme d'un sel, un chlorure par exemple, au milieu aqueux dans lequel on effectue la cristallisation. Par un tel procédés, les cristaux d'insuline possèdent une certaine teneur en zinc, habituellement de l'ordre de 0,4%.
La présente invention se rapporte à un procédé de production de cristaux d'insuline ayant une teneur accrue en métal ; est carac- térisée principalement en ce qu'on met en contact de l'insuline cristallisée avec un milieu aqueux dans lequel des cristaux d'insuline sont insolubles ou difficilement solubles, le milieu aqueux possédant une teneur telle en un au moins de ces métaux dont la présence préalable est nécessaire à la cristallisation de l'insuline, par exemple le zinc, le cobalt, le nickel, le cadmium, le cuivre, le manganèse et le fer, et une valeur de pH telle que l'insuline cristallisée retient du.métal aux dépens du milieu, après quoi on sépare l'insuline.
Si on met des cristaux d'insuline, ayant une teneur en zinc de 0,4% environ ou une teneur correspondante des autres métaux mentionnés plus haut, dans de l'eau contenant un ou plusieurs de' ces métaux, ces derniers doivent s'y trouver à raison de 5 x A x 10-3 milliéquivalents par litre, "A" désignant le nombre d'unités internationales d'insuline par centimètre cube de suspension.
Au sujet de la teneur requise en métal du milieu aqueux, la rè- gle générale est que pour former des cristaux d'insuline avec teneur accrue prédéterminée en métal, une teneur croissante en métal du milieu est requise
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avec une valeur écroissante de pH du milieu. Pour une quantité prédétermi- née de cristaux d'insuline par unité de volume du milieu aqueux, une teneur croissante en métal dans le milieu amènera dans des conditions égales une teneur accrue en métal dans les cristaux.
De plus, lors du calcul de la teneur en métal du milieu en vue d'obtenir des cristaux d'insuline avec une teneur accrue prédéterminée en métal on doit voir si le milieu aqueux ne contient pas en supplément cer- taines substances ayant une plus grande affinité pour le métal que les cris- taux d'insuline, auquel cas on doit utiliser une teneur plus élevée en mé- tal que lorsque de telles substances ne sont pas présentes dans le milieu.
Il n'y a pas de limite supérieure pour la teneur en métal du milieu aqueux.
Si le milieu aqueux possède ou si on lui communique une valeur de pH d'environ 7, environ 2,7% de zinc sont à même d'être retenus par les cristaux dans les conditions normales, ce qui correspond au nombre de grou- pements acides dans la molécule d'insuline, mais avec des valeurs de pH plus élevées on peut atteindre de plus fortes teneurs en zinc. Des condi- tions similaires s'appliquent aux autres métaux.
Il est préférable que le milieu aqueux contienne le métal dési- ré sous forme d'un sel, par exemple de chlorure, sulfate, nitrate, acétate ou citrate, mais on peut administrer également le métal à l'état d'oxyde ou d'hydroxyde ou de composé complexe ou sous sa forme métallique propre pourvu que le métal ou le composé métallique utilisé dans les conditions prévalant dans le milieu soit dans une condition telle que le métal puisse être fixé par les cristaux d'insuline.
La valeur du pH du milieu aqueux a une influence décisive sur la solubilité des cristaux d'insuline dans le milieu et sur leur aptitude à fixer le métal aux dépens du milieu. Naturellement c'est une condition d'exécution du procédé que les cristaux ne se dissolvent pas complètement dans le milieu. D'un autre côté il n'est pas nécessaire que les cristaux soient insolubles dans le milieu vu que cette partie de l'insuline, si il y en a une , qui entre en solution est récupérable sous forme cristalline.
Pour autant que le milieu ne contienne pas de substance ayant une aptitude spécifique à supprimer la solubilité des cristaux, on ne peut pas éviter que tous les cristaux entrent en solution lorsqu'on les met en suspension dans un milieu montrant une valeur, de pH supérieure à 9. De plus, lorsqu'on dépasse cette valeur de pH l'insuline commence à se décomposer, ce qui amène une perte en insuline. Si la valeur du pH du milieu aqueux est inférieure à 2, il est difficile de mettre en pratique le procédé même lorsque des subs- tances qui possèdent la propriété de supprimer la solubilité des cristaux d'insuline sont présentes.
En conséquence, il est préférable suivant l'invention que le milieu aqueux possède ou qu'on lui communique une valeur de pH comprise entre 2 et 9, de préférence entre 5 et 8.
On préférera par dessus tout que le milieu aqueux ait ou qu'on lui communique une valeur de pH comprise entre 6 et 7, en partie parce que les cristaux d'insuline avec une teneur accrue en métal se sont montrés le plus difficilement solubles dans cet intervalle de pH et en partie parce qu'il faut une teneur en métal du milieu comparativement plus élevée aux valeurs basses de pH, et qu'aux valeurs supérieures à 7 il se produit sou- vent une précipitation simultanée de sels métalliques qui doivent être éli- minés plus tard des cristaux qui se sont séparés, si on désire obtenir des cristaux purs.
Suivant l'invention, on peut réaliser l'ajustement du milieu aqueux à la valeur de pH recherchée au moyen de un ou plusieurs agents tam- pons. Comme exemple de composés tampons pouvant être utilisés ici, on men- tionnera les tampons acétate, borate, citrate, diéthylbarbiturate, phospha- te et maléate ou leurs mélanges.
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Lors du choix de l'agent tampon et autres produits d'addition . ou des substances contenues dans le milieu aqueux,, il y a en outre une au; tre chose à prendre en considération. On a trouvé que la présence de cer- tains anions dans le milieu aqueux influence l'incorporation du métal dans les cristaux d'insuline à partir du milieu.
Si le milieu aqueux contient ou si on y introduit du phosphate ou du citrate, par exemple en utilisant un phosphate ou un citrate comme tampons, et que l'on communique au milieu une teneur en zinc qui est normalement suffisante pour former des cristaux d'insuline avec une teneur accrue en métal, les cristaux d'insuline ne fi- xeront pas du zinc à partir du milieu pour un pH 5 du milieu, tandis que les cristaux entreront en solution en ajustant le milieu au pH 7. Ce n'est seulement que lorsqu'on ajoute de telles grandes quantités de zinc pour que les ions phosphate ou citrate présents soient fixés par le zinc et qu'il reste encore après cela du zinc à la disposition des cristaux;
, que ceux-ci sont à même de montrer un accroissement de leur teneur en métal. D'un au- tre côté, la présence des ions phosphate dans les conditions mentionnées plus haut n'exerce aucune influence défavorable sur la formation des cris- taux d'insuline avec une teneur accrue en nickel.
Dans les conditions normales les cristaux fixent le métal à par- tir du milieu de suspension pour ainsi dire instantanément. En tout cas il n'y a pas de motif d'utiliser une période d'attente particulière avant de les séparer du milieu de suspension. L'emploi d'une telle période d'attente, comme par exemple un repos d'une nuit dans le milieu, augmente la teneur en métal de 10% au plus et un repos de 24 heures ne donne pas d'accroissement supplémentaire.
Les cristaux d'insuline avec une teneur accrue en métal obtenus suivant l'invention peuvent, entre autres choses, être utilisés pour prépa- rer des suspensions cristallines injectables montrant un effet à retardement lorsqu'on les injecte par voie sous-cutanée ou intramusculaire.
En exécutant le procédé de l'invention, on peut dans la prati- que partir des cristaux ordinaires d'insuline qui contiennent d'habitude 0,4% environ de zinc et qui, lorsqu'on les met en suspension dans une solu- tion aqueuse d'un sel d'un des métaux mentionnés plus haut, acquièrent une teneur acerue du métal en question en faisant usage, si on le désire, d'un agent tampon ou.d'un mélange tampon pour ajuster et maintenir la valeur re- cherchée du pH de la solution.
EXEMPLE 1
On met èn suspension 174 mg d'insuline cristallisée contenant environ 0,4% de zinc dans le 100 cm3 d'une solution aqueuse de chlorure de zinc contenant 0,008% de zinc et ajuste le pH à une valeur de 7 environ. On sépare alors les cristaux, par exemple par filtration ou centrifugation, et lave à l'eau. Les cristaux séparés montrent une teneur en zinc d'environ 2,3%.
EXEMPLE 2
On met en suspension 43,5 mg d'insuline cristallisée avec une teneur en zinc de 0,4% environ dans 100 cm3 de la solution de chlorure de zinc utilisée dans l'exemple 1 et on sépare ensuite les cristaux et lave à l'eau. Les cristaux séparés montrent.une teneur en zinc d'environ 2,6%.
EXEMPLE 3
On met en suspension 348 mg d'insuline cristallisée avec une te- neur en zinc de 0,4% environ dans 100 cm3 de la solution de chlorure de zinc utilisée dans l'exemple 1 et on sépare ensuite les cristaux et lave à l'eau.
Les cristaux séparés montrent une teneur en zinc d'environ 1,8 %.
EXEMPLE 4
On met en suspension 174 mg d'insuline cristallisée avec une te-
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neur en zinc de 0,4% environ dans 100 cm3 d'une solution aqueuse de chlo- rure de nickel contenant 0,005% de nickel et ajuste le pH à 6-7 avec de la soude caustique. Les cristaux, qui ont été séparés et lavés, contiennent du nickel.
EXEMPLE 5
On-met en suspension 174 mg d'insuline cristallisée avec une teneur en zinc de 0,4% environ dans 100 cm3 d'une solution aqueuse conte- nant 0,008% de zinc (à l'état de sulfate) et 1/120 de mole d'acétate de sodium et ajuste le pH vers 5 avec de l'acide chlorhydrique, après quoi on sépare les cristaux et les lave à l'eau. On obtient des cristaux d'in- suline avec une teneur en zinc de 0,5% environ.
EXEMPLE 6
On utilise le même procédé que dans l'exemple 5 sauf qu'on a- juste la solution aqueuse à un pH de 6 environ. Il en résulte des cristaux d'insuline avec une teneur en zinc de 1% environ.
EXEMPLE 7
On utilise le même procédé que dans l'exemple 5 sauf qu'on a- juste la solution aqueuse à un pH de 7 environ. Il en résulte des cristaux d'insuline avec une teneur en zinc de 1,9% environ.
EXEMPLE 8
On met en suspension 174 mg d'insuline cristallisée dans 100 cm3 d'une solution aqueuse contenant 0,002% de zinc (à l'état de chlorure) et 1/120 de mole d'acide diéthylbarbiturique et ajuste le pH à une valeur de 7,2 environ avec de la soude caustique, après quoi on sépare les cristaux.
Ils montrent une teneur en zinc de 1,1% environ.
EXEMPLE 9
On utilise le même procédé que dans l'exemple 8 sauf que la so- lution aqueuse renferme une teneur en zinc de 0,004%. Il en résulte des cris- taux avec une teneur en zinc de 1,7% environ.
EXEMPLE 10 On utilise le même procédé que dans l'exemple 8 sauf que la so- lution aqueuse renferme une teneur en zinc de 0,016%. Il en résulte des cris- taux avec une teneur en zinc de 2,5% environ.
EXEMPLE 11
On utilise le même procédé que dans l'exemple 8 sauf que la so- lution aqueuse renferme une teneur en zinc de 0,03% environ. Les cristaux sé- parés ont alors une teneur en zinc de 2,7% environ.
EXEMPLE 12
On met en suspension 174 mg d'insuline cristallisée avec une te- neur en zinc d'environ 0,4% dans 100 cm3 d'une solution aqueuse contenant 0,016% de zinc (à l'état de chlorure) et 1/120 de mole d'acide borique et ajuste le pH à une valeur de 7 environ. On sépare les cristaux et lave à l'eau. Les cristaux contiennent environ 2,5% de zinc..
EXEMPLE 13
On met en suspension 174 mg d'insuline cristallisée avec une te- neur en nickel de 0,3% environ dans 100 cm3 d'une solution aqueuse contenant 0,008% de nickel (à l'état de chlorure) et 1/120 de mole de phosphate de so- dium et ajuste le pH à une valeur de 7 environ, après quoi on sépare les cris- taux et les lave à l'eau. Ils montrent une-teneur accrue en nickel.
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EXEMPLE 14
On met en suspension 174 mg d'insuline cristallisée avec une teneur en zinc d'environ 0,4% dans 100 cm3 d'une solution aqueuse contenant 0,014% de cadmium (à l'état de chlorure) et 1/120 de mole d'acétate de so- dium et ajuste le pH aux environs de 7 après quoi on sépare les cristaux et les lave à l'eau. Ils montrent une teneur en cadmium de 3% environ.
EXEMPLE 15
On met en suspension 174 mg d'insuline cristallisée avec une te- neur en zinc d'environ 0,4% dans 100 cm3 d'une solution aqueuse contenant 0,006% de cuivre (à l'état de chlorure) et 1/120 de mole d'acétate de' so- dium et ajuste le pH aux environs de 6 avec HCL, après quoi on sépare les cristaux et les lavée à l'eau. Les cristaux séparés et lavés montrent une teneur en cuivre.
Dans les exemples mentionnés ci-dessus servent de matières pre- mières des cristaux d'insuline fabriqués préalablement et renfermant la te- neur habituelle en métal. Cependant, le procédé de l'invention peut égale- ment s'effectuer en relation avec la fabrication de cristaux d'insuline à partir d'insuline amorphe ou avec la recristallisation d'insuline cristal- lisée.
Par conséquent le procédé de l'invention est caractérisé en', . outre en ce qu'on fait cristalliser de l'insuline dans un milieu aqueux et en ce que l'on introduit un des métaux mentionnés dans le milieu et/ou change la valeur du pH du milieu en sorte qu'il-'se forme des cristaux d'in- suline ayant une teneur accrue en métal.
On peut effectuer la cristallisation d'une manière connue en soi dans laquelle on fait cristalliser de l'insuline dissoute à partir d'u- ne solution aqueuse acide contenant un ou plusieurs agents tampons, un sol- vant organique favorisant la cristallisation et un sel d'un des métaux com- me le zinc, le cobalt, le nickel et le cadmium, en ramenant la valeur du pH de la solution entre 5,5 et 6,5.
Lors du choix de l'agent tàmpon on doit tenir compte de ce qui a été établi dans la description précédente au sujet de l'influence de cer- tains anions sur l'aptitude des cristaux à fixer le métal après la cristal- lisation; Lorsqu'on effectue le procédé de l'invention en utilisant l'eau- mère des cristaux d'insuline comme milieu de suspension, il n'est pas ap- proprié, en vue de produire des cristaux d'insuline avec une teneur accrue en zinc, d'utiliser du phosphate ou du citrate comme agent tampon pour la cristallisation, tandis qu'il n'est pas approprié d'utiliser du citrate comme agent tampon pour la cristallisation lorsqu'on produit des cristaux d'insuline avec une teneur accrue en nickel.
EXEMPLE 16
On dissout 200 mg d'insuline amorphe (20 U.I. par mg) dans 100 cm3 d'une solution d'acide chlorhydrique contenant 0,001% de zinc (à l'état de chlorure), 1/120 de mole d'acétate de sodium et 1/120.de mole d'acide diéthylbarbiturique, et en ajustant la valeur du pH de.la solution à 5,6- 5,8 avec de la soude caustique. Au bout d'un certain temps, et en agitant si c'est nécessaire, l'insuline cristallise. Lorsque la cristallisation est terminée on ajoute 0,01% de zinc (à l'état de chlorure) et élève ensuite la valeur du pH aux environs de 7 au moyen de soude caustique. On sépare les cristaux par filtration sous vide et lave à l'eau. Les cristaux montrent u- ne teneur en zinc voisine de 2%.
EXEMPLE 17
On dissout au moyen d'acide chlorhydrique 2,0 g d'insuline amor- phe (20 U.I. par mg) dans un litre d'une solution contenant 5% d'acétone, 0,001% de zinc (à l'état de chlorure), 1/120 de mole d'acétate de sodium et
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1/120 de mole d' cide déithylbarbiturique, et élève ensuite la valeur du pH de la solution vers 5,8 avec de la soude caustique, provoquant ainsi la cristallisation de l'insuline. Lorsque la cristallisation est terminée on ajoute 200 mg de zinc (à l'état de chlorure) et élève la valeur du pH de la suspension cristalline vers 7 avec de la soude caustique. On sépare ensuite les cristaux et les lave à l'eau. Ils montrent une teneur en zinc voisine de 2,5%.
EXEMPLE 18
On dissout au moyen d'acide chlorhydrique 1,7 g de cristaux d'in- suline dans un litre d'une solution contenant 1/120 de mole d'acétate de so- dium et 1/120 de mole d'acide diéthylbarbiturique.et ajuste ensuite le pH de la solution à 5,5 - 5,7 avec de la soude caustique. Au bout d'un certain temps, et en agitant si c'est nécessaire, l'insuline cristallise. Lorsque la cristallisation est terminée on ajoute 100 mg de zinc (à l'état de chlo- rure) et élève la valeur du pH vers 7 avec de la soude caustique. Après avoir secoué la suspension cristalline on sépare les cristaux et les lave avec de l'eau. Ils montrent une teneur en zinc voisine de 2%.
EXEMPLE 19
On dissout 174 mg d'insuline cristallisée dans 20 em3 d'acide chlorhydrique 0,01 N et on ajoute successivement dans l'ordre indiqué :
10 cm3 d'une solution à 1/12 de mole d'acétate de sodium
70 cm3 d'une solution contenant 0,004% de zinc (à l'état de chlorure). et abaisse le pH à une valeur voisine de 5. Lorsque l'insuline précipitée est devenue cristalline après repos, on ajuste le pH de la suspension cris- talline à une valeur voisine de 7, et on sépare les cristaux par filtration sous vide et les lave à l'eau. Les cristaux montrent une teneur en zinc voi- sine de 1,4%.
D'après les exemples précédents il apparaît qu'on peut obtenir des cristaux d'insuline par le procédé suivant l'invention et que ces cris- taux présentent une grande variété de teneurs en métal, supérieures à la teneur que les cristaux montraient primitivement. Au moyen des cristaux produits suivant l'invention il devient possible de préparer des suspensions cristallines injectables montrant un effet différent de retardement en fonc- tion de la valeur de l'accroissement de la teneur en métal des cristaux.
Les cristaux d'insuline produits suivant l'invention sont carac- térisés en général par leur teneur en métal supérieure à 0,16 milliéquiva- lents par gramme de cristaux, de préférence supérieure à 0,25 milliéquiva- lents par gramme de cristaux. On préfère particulièrement atteindre une te- neur en métal supérieure à 0,35 milliéquivalents par gramme de cristaux.
Ceux-ci contiennent au moins un des métaux comme le zinc, le cobalt, le nickel, le cadmium, le cuivre, le manganèse et le fer, de préférence un ou plusieurs des 4 premiers métaux mentionnés.
REVENDICATIONS.
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