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PERFECTIONNEMENTS APPORTES AUX PROCEDES DE PREPARATION D'ANTIBIOTIQUES.
L'invention a pour objet un procédé de préparation de sels d'a- cides mixtes de la dihydrostreptomycine qui se distinguent par leur solubi- lité relativement réduite dans l'eau. L'invention concerne non seulement la préparation de ces sels mais également leur usage pour la purification de la dihydrostreptomycine.
La dihydrostreptomycine constitue un antibiotique de valeur éle- vée et est dérivée de la streptomycine par réduction.'Ses propriétés, à la fois chimiques et biologiques, ont été décrites complètement dans la litté- rature récente. Les sels simples et bien connus de la dihydrostreptomycine, tels que le chlorhydrate, le sulfate et analogues, sont extrêmement solubles dans l'eau. La récupération de ces composés, surtout à l'état cristallisé pur, est ainsi rendue difficile par une méthode simple.
L'invention a pour objet un procédé pour la préparation d'un groupe 'de sels de la dihydrostreptomycine dont la solubilité dans l'eau est nettement moindre que les sels simples connus jusqu'ici. On sait, bien en- tendu, que les sels de la dihydrostreptomycine avec des colorants à l'aci- de sulfonique ou des précipitants, tels que l'acide de reinecke ou l'acide picrique, ont également une solubilité plus réduite dans l'eau que les sels simples tels que le sulfate.
Toutefois, on ne se sert pas de -ces sels com- plexes pour la¯thérapie quelle que soit leur intervention pour la récupéra- tion de la dihydrostreptomycine et ils ne conviennent pas à la séparation de la streptomycine d'avec la mannosidostreptomycine. L'invention a égale- ment pour objet un procédé pour isolér la dihydrostreptomycine sous la for- me d'un composé cristallisé pur par la formation d'un de ces groupes de sels.
Un objet additionnel est une méthode pour séparer la dihydrostreptomycine d'avec la mannosido-dihydrostreptomycine adjointe à celle-ci.
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On sait que la molécule de dihydrostreptomycine est une base tria- cide qui normalement forme des sels avec trois équivalents d'un acide. Les sels simples, tels que le chlorhydrate, le bromhydrate, le sulfate, l'acéta- te,le citrate et analogues sont tous extrêmement solubles dans l'eau. Des essais pour cristalliser ces matières par la concentration d'une solution a- queuse sont presque toujours restés sans résultat. On a trouvé maintenant, d'une manière inattendue, que lorsque des sels de la dihydrostreptomycine sont formés avec au moins deux acides inorganiques différents, la solubilité des sels d'acides mixtes dans l'eau est nettement inférieure à celle des sels d'acides simples correspondants.
Ainsi, par exemple, un sel de la dihydrostrep- tomycine a été préparé en combinant deux équivalents (une molécule) d'acide sulfurique et une molécule d'acide iodhydrique par molécule de dihydrostrep- tomycine. Ce sel d'acides mixtes a une solubilité dans l'eau d'un ordre bien inférieur à celle de l'iodhydrate simple ou du sulfate simple. Des sels d'a- cides mixtes comparables de la dibydrostreptomycine, contenant les acides chlorhydrique et sulfurique, les acides bromhydrique et sulfurique, les aci- des iodhydrique et sulfureux, les acides nitreux et thiosulfurique, ont éga- lement été préparés. Tous ces composés peuvent être cristallisés directement hors de leur solution aqueuse contrairement à ce qui se produit pour les sels d'acides simples correspondants.
D'une manière générale, les sels d'acides mixtes de la dihydro- streptomycine peuvent contenir deux ou trois anions différents. Ordinaire- ment, ils contiennent deux anions différents et dans la plupart des cas un de ceux-ci est monovalent alors que l'autre est bivalent. Toutefois, tous les anions peuvent être monovalents ou bivalents et un des anions peut être trivalent comme dans le cas du phosphate. Quand les anions, combinés avec la dihydrostreptomycine, comprennent des anions polyvalents pour lesquels le total des valences est supérieur à trois, il est possible qu'un des anions polyvalents puisse être lié à plus d'une molécule de dihydrostreptomycine ou puisse être satisfait seulement en partie de cette manière.
Les structu- res exactes de tous les sels d'acides mixtes,qui peuvent être préparés con- formément à l'invention, ne sont pas connues mais on sait qu'ils peuvent ê- tre préparés à l'état cristallisé et que la présence de plusieurs anions inor- ganiques différents peut être démontrée par l'analyse. Des acides inorgani- ques typiques, qui conviennent à la formation de sels d'acides mixtes selon l'invention, sont l'acide sulfurique, sulfureux, chlorhydrique, thiosulfuri- que, bromhydrique, iodhydrique, nitrique, nitreux, thiocyanique ou phospho- rique.
La solubilité dans l'eau des sels d'acides mixtes dont question plus haut varie considérablement mais chacun de ces sels est moins soluble dans l'eau que chacun des sels d'acides simples correspondants et chacun peut être cristallisé directement hors d'une solution aqueuse. La solubilité dans l'eau de ces sels d'acides mixtes est d'un ordre différent et bien in- férieur à celle des sels d'acides simples. Parmi les sels d'acides mixtes spécifiquement cités plus haut, l'iodure-sulfite a la solubilité la plus fai- ble dans l'eau, celle de l'iodure-sulfate étant un peu plus élevée et celle du bromure-sulfate encore plus élevée.
Quand les sels de plusieurs acides inorganiques différents sont en présence, dans la solution aqueuse, avec la dihydrostreptomycine, le sel mixte particulier, qui a la solubilité la plus basse, se sépare du moment que la concentration totale est suffisamment éle- vée et que des quantités suffisantes de chaque anion sont en présence. Ain- si, si des quantités substantielles de sulfate de sodium et d'iodure de so- dium sont ajoutées à une solution aqueuse de chlorhydrate de dihydrostrepto- mycine, ayant une teneur d'environ 80.000 unités/ml ou davantage, l'iodure- sulfate se sépare. La solubilité des sels varie également quelque peu avec le pH de la solution dans laquelle ils sont formés. On préfère généralement maintenir ce pH entre environ 4 et environ 8.
L'effet du pH sur la solubilité peut être particulièrement apparent quand on obtient un sel mixte de la dihy- drostreptomycine contenant au moins un ion polyvalent. Le pH pour la solubi- lité minimum d'un sel mixte donné peut être déterminé par des essais réduits au minimum.
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Pour préparer les sels d'acides mixtes on peut traiter une so- lution aqueuse concentrée d'un des sels d'acides simples de la dihydrostrep- tomycine, par exemple le sulfate, avec un sel soluble quelconque, de préfé- rence un sel d'un métal alcalin, d'ammonium ou d'ammonium. organique mais d'un acide inorganique différent, par exemple l'iodure de sodium. La solu- tion est agitée et laissée au repos. En peu de temps, des cristaux d'un sel mixte commencent à se séparer. Généralement, la cristallisation est terminée en quelques heures. Si on le désire, la solution peut être refroidie et/ou ensemencée pour accélérer la formation du sel mixte cristallisé.
Quand le sulfate de dihydrostreptomycine est utilisé comme matière initiale, on se sert ordinairement d'une solution aqueuse contenant au moins environ 80.000 unités/m1 de l'antibiotique. Des concentrations plus élevées sont désirables si l'on veut préparer certains des sels d'acides mixtes les plus solubles.
Généralement au moins un équivalent, de préférence environ deux équivalents, du sel ajouté sont utilisés par molécule de l'antibiotique. La présence d'un certain excès du sel ajouté sert à abaisser la solubilité du sel mixte obte- nu. Par exemple, un excès d'iodure de sodium ou un excès de sulfate de so- dium diminue la solubilité de l'iodure-sulfate mais un mélange d'un excès d'iodure de sodium et de sulfate de sodium est par contre plus efficace. Le sulfitde-iodure de dihydrostreptomycine a une solubilité d'environ 48.000 mcg/ml dans l'eau alors que la présence d'un excès de sels utilisés pour former le composé antibiotique abaisse la solubilité à environ 25.000 mcg/ ml ou encore moins.
Une caractéristique particulièrement valable de l'invention est que des solutions relativement brutes de dihydrostreptomycine peuvent être utilisées pour la préparation des sels d'acides mixtes cristallisés. Ainsi, par exemple, la streptomycine à l'état brut et recueillie à partir d'un bouillon de fermentation, par une méthode d'adsorption sur une résine échan- geuse d'ions et d'élution avec un acide, peut être hydrogénée pour fournir une solution aqueuse de dihydrostreptomycine brute. La solution aqueuse doit être concentrée avant ou après l'hydrogénation et toutes les impuretés qui peuvent se séparer au cours de cette concentration doivent être enlevées par filtration. L'enlèvement de ces impuretés peut également être facilité par l'addition d'un solvant organique tel que le méthanol.
La concentration de la solution aqueuse brute de dihydrostreptomycine obtenue doit correspon- dre au moins à environ 100.000 unités/ml et est, de préférence, supérieure à 200.000 unités/ml afin qu'une proportion raisonnablement élevée de l'anti- biotique puisse être séparée sous la forme d'un des sels d'acides mixtes.
Certaines combinaisons d'acides nécessitent même une concentration plus éle- vée de l'antibiotique pour obtenir un rendement appréciable en sel mixte.
Les sels d'acides mixtes cristallisés se séparent à l'état pur et quand on se sert d'acides ayant une toxicité réduite pour la formation de ces sels, le produit peut être utilisé tel quel. Si un acide, qui ne convient pas à un usage thérapeutique, intervient dans la formation de sels d'acides mixtes, il peut être remplacé par une réaction métathétique appropriée pour fournir un sel de dihydrostreptomycine fortement purifié qui peut être utilisé pour la thérapie.
Il est particulièrement intéressant que les sels d'acides mixtes de dihydromannosidostreptomycine ne cristallisent pas ou ont des solubilités beaucoup plus. 'élevées que les sels d'acides mixtes correspondants de la dihy- drostreptomycine. Par conséquent, la formation des sels en question consti- tue une méthode appropriée pour séparer la dihydrostreptomycine du composé mannosido qui est moins désirable et qui a une activité moins élevée. Il est étonnant que le procédé selon l'invention ne soit pas applicable de la même manière à la streptomycine. Il n'existe pas une différence correspondante entre les propriétés des sels d'acides mixtes et les sels d'acides simples de la streptomycine.
Il a été dit ci-dessus que le sulfate de dihydrostreptomycine peut être utilisé comme matière 'initiale pour un groupe de sels d'acides mix- tes. L'invention n'est toutefois pas limitée à l'utilisation du sulfate comme matière initiale. Par exemple, une série des sels d'acides mixtes de dihydro-
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streptomycine a été préparée en se servant de l'iodure comme matière ini- tiale. Une solution aqueuse concentrée de l'iodure peut être préparée à par- tir du sulfate par métathèse, par exemple en ajoutant de l'iodure de baryum et en séparant par filtration le sulfate de baryum formé.
Quand on ajoute un ou plusieurs équivalents molaires d'un sel soluble dans l'eau, de préfé- rence un sel d'un métal alcalin ou d'ammonium, des anions indiqués ci-des- sous à une solution aqueuse concentrée du tri-iodhydrate de dihydrostrep- tomycine, on peut séparer aisément les sels d'acides mixtes suivants d'avec la solution :chlorate, hydrosulfite, nitrate, nitrite, sulfite, chlorure, bromure, thiosulfate. On se sert d'une solution aqueuse d'environ 500.000 unités/ml de l'iodure mais des solutions à activité moindre peuvent égale- ment être utilisées. Suivant une variante, on peut employer des solutions concentrées de chlorure ou bromure de dihydrostreptomycine comme matières initiales pour la préparation de sels d'acides mixtes analogues.
On doit veiller, toutefois, à ce que les sels inorganiques uti- lisés pour la formation des sels mixtes soient compatibles. Ainsi, l'usage de sulfate d'argent et d'iodure de dihydrostreptomycine, pour former le sulfate-iodure, ne convient évidemment pas.
La base de dihydrostreptomycine peut être utilisée comme matiè- re initiale et, dans ce cas, les anions inorganiques choisis sont ajoutés sous la forme d'acides, par exemple l'acide sulfurique ou iodhydrique en quantités appropriées pour former un sel d'acide mixte.
Dans la plupart des cas au moins un anion inorganique monova- lent est combiné dans le sel d'acide mixte. Un anion inorganique bivalent se combine généralement avec deux des trois groupements basiques en présen- ce dans la molécule de dihydrostreptomycine. Il parait vraisemblable que dans certains cas un seul anion inorganique et polyvalent peut être lié à plus d'une molécule de dihydrostreptomycine. Quelle que soit la structure des composés obtenus selon l'invention, on a constaté qu'ils étaient très utiles. Plusieurs des sels d'acides mixtes ont une toxicité marquée pour des souris et on a constaté qu'ils sont très comparables au sulfate de l'an- tibiotique. Evidemment, on ne peut pas se servir d'anions connus comme é- tant très toxiques, pour la préparation des sels d'acides mixtes quand ils doivent être utilisés pour la thérapie.
Toutefois, ces composés peuvent être utilisés pour la récupération et la purification de l'antibiotique si les anions toxiques sont ensuite soigneusement éliminés. On a fait remarquer que les iodures améliorent l'effet de la streptomycine pour le traitement expé- rimental de la tuberculose. Les sels d'acides mixtes à iodure constituent des moyens pour fournir l'iodure combiné avec l'agent thérapeutique.
Les exemples ci-dessous sont donnés à titre illustratif seule- ment et ne doivent pas être considérés comme étant les seuls modes de réa- lisation de l'invention.
Exemple 1.- Un concentrat de sulfate de dihydrostreptomycine est obtenu en recueillant l'antibiotique à partir d'un bouillon de fermen- tation de streptomycine avec une résine échangeuse d'ions du type acide car- boxylique. Après séparation de l'antibiotique d'avec la résine par l'acide chlorhydrique dilué, la solution obtenue est concentrée, purifiée davantage et convertie en sulfate. Le sulfate est réduit pour donner une matière ayant une pureté d'environ 90 %. Le concentrat utilisé pesait 1150 g et avait une activité de 317.000 unités/ml. A cette solution aqueuse concentrée on ajoute 182 g d'iodure de sodium en agitant constamment. Des cristaux commencent bientôt à se séparer de la solution claire qui est maintenue à peu près à la température ambiante.
Le mélange est laissé au repos pendant deux ou trois heures à la température ordinaire et le produit cristallisé lourd est séparé par filtration. Les cristaux sont lavés avec un petit volume d'eau glacée et sont séchés à une température de 50-60 à la pression atmosphérique. Le pro- duit obtenu pèse 452 g et a une activité de 730 unités/mg. Dans le filtrat (545 ml) séparé des cristaux se trouvent 26. 000 unités/ml de l'antibiotique ce qui correspond à un total de 3,88 % de l'antibiotique utilisé comme ma- tière initiale. L'eau glacée, ayant servi au lavage, a un volume de 375 ml
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et à l'essai contient 39.000 unités/ml. Ceci correspond à 4,02 % de l'an- tibiotique total utilisé comme matière initiale.
Une portion de 100 g du produit cristallisé, décrit plus haut, est recristallisée par dissolution dans une quantité 3à 4'fois plus grande d'eau., Celle-ci est chauffée à 80-90 pour dissoudre le produit et, après refroidissement, on filtre les cristaux séparés. On recueille de 9 à 10 g de ces cristaux. En concentrant la solution, on obtient 65,7 g d'un sulfa- te-iodure de dihydrostreptomycine très fortement purifié qui à l'essai don- ne 750 mcg/mg quand il est séché à l'air. Quand on le sèche sous un vide é- levé, il donne à l'essai 765 mcg/ml. Ceci est équivalent à un sulfate de dihydrostreptomycine cristallisé ayant une activité très élevée.
Un échantillon de sulfate-iodure de dihydrostreptomycine est sé- ché à 78 sous un vide élevé et pendant toute une nuit et est analysé.
Analyse : Par calcul pour C21H41N7O12. HI.HSO, on obtient :
C=31,14; H=5,48; N=12,11; SO4= =11,8; I =15,67.
On trouve : C=3l,21; H=5,65; N=12,22; SO4=11,85;
I= 15,47.
Exemple II.- Une portion de sulfate pur de dihydrostreptomycine, pesant 12,5 g, est dissoute dans 12 ml d'eau; à cette solution on ajoute 3,5 g de bromure de sodium (2 équivalents molaires) dissous dans 5 ml d'eau.
Après un court repos, les cristaux se séparent. Ils sont enlevés après une heure et le produit est lavé avec un volume réduit d'eau glacée. Les cris- taux sont séchés à 50-60 . Ils pèsent 8,6 g et contiennent, à l'essai par une méthode microbiologique, 720 unités/mg. La liqueur-mère, provenant de la préparation de sulfate-bromure de dihydrostreptomycine cristallisé a un volume de 14 ml et contient 83.000 unités/ml de l'antibiotique. L'eau de lavage a un volume de 17 ml et contient 85.500 unités/ml.
Un échantillon du sulfate-bromure est chauffé à 70 sous un vide élevé pendant la nuit. La matière est ensuite analysée.
EMI5.1
Analyse : Par calcul pour C?-lH4lN7012.HBr.H2SO4 on obtient : C=33,06; H=5,82; N=12,86 ; Br=10,48; SO4=12,60.
EMI5.2
On trouve : C=33el4; H--6,03; N=12,78: Br =IO,62;
SO4= 12,55.
Exemple III.- Du sulfate de dihydrostreptomycine, pesant 13,75 g, est dissous dans 13,2 ml d'eau. A cette solution on ajoute 2,7 g de chlorure de sodium. La solution est agitée jusqu'à ce que le chlorure de sodium soit dissous et on laisse le mélange au repos pendant la nuit. Le produit cristal- lisé, qui s'est reposé, est filtré, lavé avec un faible volume d'eau et est séché. Le produit obtenu, qui est le sulfate-chlorure de dihydrostreptomy- cine, pèse 4,3 g et donne à l'essai 770 mcg/mg quand il est séché à l'air.
Exemple IV.- Plusieurs portions de sulfate de dihydrostreptomy- cine cristallisé, pesant chacune 1,25 g sont versées dans un groupe de pe- tites cuvetteso Chaque portion est dissoute dans 1,2 ml d'eau et on utilise alors deux équivalents molaires de plusieurs sels inorganiques que l'on a- joute respectivement aux cuvettes. Après addition des sels suivants : nitra- re, nitrite, sulfite, thiocyanate et thiosulfate de sodium, des sels d'aci- des mixtes cristallisés de dihydrostreptomycine se séparent de la solution aqueuse. Pour les deux premiers de ces composés, les sels sont obtenus avec des rendements très bons. Pour les trois derniers composés les rendements sont considérablement inférieurs.
Quand on ajoute du bromate ou de l'ioda- te de sodium aux solutions de .sulfate de dihydrostreptomycine, on n'obtient qu'une précipitation réduite ou nulle pour la concentration indiquée.
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Plusieurs portions de tri-iodhydrate, pesant chacune 1,65 g, sont introduites dans un groupe de cuvettes. Chaque portion du sel antibiotique est dissoute dans 1,2 ml d'eau. On a ajouté au contenu de chacune des cuvet- tes deux équivalents molaires d'un des sels faisant partie du groupe suivant : chlorure, hydrosulfite, nitrate et nitrite de sodium, sulfite de potassium, thiosulfate et bromure de sodium, sulfate d'ammonium. Dans chaque cas et peu de temps après que le sel ajouté a été dissous, il se produit la séparation, d'avec la solution, du sel mixte de dihydrostreptomycine correspondant.
Exemple V.- Trois portions de trichlorhydrate de dihydrostrepto- mycine, pesant chacune 1,2 g, sont dissoutes chacune dans 1,2 ml d'eau. Quand deux équivalents molaires de sulfite de sodium sont ajoutés à une portion de la solution antibiotique, on obtient bientôt la séparation du sulfite-chloru- re de dihydrostreptomycine cristallisé. Toutefois, quand le bromure et le nitrate de sodium sont ajoutés aux autres parties de la solution du chlorhy- drate de l'antibiotique, aucune quantité appréciable du sel cristallisé ne se sépare pour cette concentration particulière.
Exemple VI.- Un bouillon de fermentation de streptomycine, obte- nu par la culture du Streptomyces griseus dans des conditions de submersion et d'aération dans un milieu nutritif, est filtré pour enlever les mycelles.
Un polyphosphate, soluble dans l'eau, est ajouté au bouillon filtré pour sé- questrer les métaux polyvalents. On fait ensuite passer le bouillon dans une tourelle contenant une résine synthétique et échangeuse d'ions, du type acide carboxylique. Après avoir lavé la résine avec un petit volume d'eau, on traite l'antibiotique avec de-l'acide chlorhydrique dilué. Le calcium est séparé de la masse obtenue à l'aide d'acide oxalique et l'excès d'acide chlor- hydrique est neutralisé. La solution aqueuse est concentrée sous vide jus- qu'à une concentration supérieure à 200.000 mcg/ml.
Les sels inorganiques, qui ont été séparés, sont filtrés et la solution est soumise à une réduction catalytique à une température d'environ 75-80 sous une pression d'hydrogène de 70 kg/cm2 en se servant comme catalyseur du nickel Raney. Quand la réduc- tion est, en substance, complète, le catalyseur est séparé, par filtration, de la solution refroidie. Le concentrat de chlorhydrate de dihydrostreptomy- cine obtenu donne, à l'essai par une méthode microbiologique, une teneur d'environ 243.000 mcg/ml.
Une centaine de millilitres de ce concentrat de chlorhydrate brut de dihydrostreptomycine (0042 M) est traitée avec 13 g de sulfate de sodium anhydre (0,092 M). Quand le sel ajouté est dissous, une quantité ré- duite d'un précipité non cristallisé est séparée par filtration et on ajou- te ensuite 14 g (0,093 M) d'iodure de sodium. Le mélange est agité jusqu'à ce que la dissolution soit complète et des cristaux d'un sel acide mixte de dibydrostreptomycine commencent lentement à se former. On laisse le mélange au repos pendant plusieurs jours à la température ambiante. Le produit cris- tallisé est alors filtré, lavé avec un petit volume d'eau glacée et séché à environ 50-60 . Il pèse 25,7 g et a une activité, déterminée par une méthode microbiologique de 655 mcg/mg.
Ce produit est, comme le montre l'analyse, le sulfate-iodure de dihydrostreptomycine.
Exemple VII.- Plusieurs portions de tribromhydrate de dihydro- streptomycine, pesant chacune 1,3 g, sont diluées jusqu'à 2,0 ml avec de l'eau. On procède comme pour l'exemple IV, chaque portion étant traitée avec 1,5 équivalent molaire des sels suivants pour former les sels mixtes correspondants de dibydrostreptomycine : hydrosulfite, thiosulfate, sulfi- te, nitrate, nitrite et chlorure de sodium.
Les sels mixtes bromure-hydrosulfate, bromure-thiosulfate et bromure-sulfite se séparent, à l'état de cristaux, des solutions mais pour les concentrations utilisées le bromure-nitrate, bromure-nitrite et bromure- chlorure ne cristallisent pas.
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Exemple VIII.- Plusieurs portions de trinitrate de dihydrostrep- tomycine, pesant chacune 1,3 g, sont pesées et diluées jusqu'à 2,0 ml avec de l'eau. Aux portions de ces solutions on ajoute 1,5 équivalent molaire de chacun des sels suivants :bromate, chlorate, iodure, perchlorate, sulfite, thiocyanate et thiosulfate de sodium. Dans chaque cas le sel mixte cristal- lisé de dihydrostreptomycine se sépare du mélange de réaction. Quand on uti- lise le bromure, le fluorure, le nitrite ou le chlorure de sodium, aucun sel mixte ne se sépare pour la concentration particulière utilisée.
Exemple IX.- Du tri-iodhydrate de dihydrostreptomycine, pesant 1695 g, est dissous dans 8 ml d'eau. On ajoute 10 ml d'une solution aqueuse de sulfite de triéthylamine. Ce dernier est préparé en suspendant 300 g de triéthylamine dans 250 ml d'eau, le mélange étant agité et refroidi pendant qu'on fait barboter de l'anhydride sulfureux dans le mélange. Quand le pH a atteint 6,6 on arrête le débit d'anhydride sulfureux. A ce moment le volume de la solution est de 575 ml. Quand 10 ml de la solution sont ajoutés à l'iod- hydrate de dihydrostreptomycine, le pH du mélange tombe à 4,6. Il est réglé à 6,1 avec une solution à 10 % d'hydroxyde de sodium. Après un repos de 4 heures à la température ambiante, l'idoure-sulfite cristallisé de dihydro- streptomycine est séparé par filtration.
Il est lavé avec un petit volume d'eau glacée et est séché à la température ambiante pendant la nuit. Le pro- duit pèse Il,8 g et a une activité de 700 mcg/mg. La liqueur-mère a une ac- tivité de 58.000 mcg/ml.
Exemple X. - Un concentrat de chlorhydrate de streptomycine, ob- tenu comme dans l'exemple VI est déshydraté et est dissous ensuite dans du méthanol. Le concentrât méthanolique de chlorhydrate de streptomycine ainsi obtenu est séparé par filtration des sels insolubles. La solution méthano- lique claire est ensuite évaporée pour enlever tout le méthanol. On ajoute de l'eau pour obtenir une solution ayant une activité d'environ 400.000 mcg/ ml en streptomycine. On ajoute un catalyseur au nickel Raney et on soumet le mélange à une hydrogénation à environ 80 sous une pression d'hydrogène de 70 kg/cm2. Quand la réaction est terminée, le mélange est refroidi et le catalyseur est lavé à l'eau pour enlever les matières résiduelles. Un essai biologique montre que la solution contient 294. 000 mcg/ml de dihydrostrepto- mycine.
On constate qu'elle a été convertie en composé de dihydrostreptomy- cine à un degré correspondant à environ 98 %.
Une centaine de millilitres du concentrat de chlorhydrate de di- hydrostreptomycine (0,053 M) est traitée avec 16,6 g (0,117 M) de sulfate de sodium. Le mélange est agité jusqu'à ce qu'on obtienne une solution claire à laquelle on ajoute 17,5 (0,117 M) d'iodure de sodium. Le sulfate-iodure cristallisé de dihydrostreptomycine commence bientôt à se séparer. Le mélan- ge est agité et refroidi dans un bain de glace pendant une heure. Le produit se sépare sous forme de fines aiguilles qui sont séparées par filtration, lavées à l'eau glacée et séchées à environ 50-60 . Le produit, qui a une cou- leur blanche, pèse 28,4 g. Il contient un peu de sels inorganiques et présen- te, à l'essai par une méthode microbiologique, une teneur de 605 mcg/mg.
Un rendement de 60 % est obtenu pour cette première récolte, basée sur la quan- tité de dibydrostreptomycine contenue dans le concentrat aqueux. La liqueur- mère, avec un volume de 53 ml, contient 128.000 mcg/ml de l'antibiotique (par un essai biologique et calculé comme dihydrostreptomycine). L'eau de lavage a un volume de 52 ml et donne à l'essai 113.000 mcg/ml. On recueille davanta- ge de sulfate-iodure de dihydrostreptomycine cristallisé en concentrant la liqueur-mère et l'eau de lavage sous vide. La quantité de la première récol- te est augmentée jusqu'à environ 745 mcg/ml par recristallisation.
On a constaté que le sulfate-iodure de dihydromannosidostrepto- mycine ne se sépare pas dans les mêmes conditions que celles décrites plus haut. Par conséquent, la méthode en question est utile pour séparer le com- posé mannosido, de valeur moindre et qui a une activité biologique considé- rablement inférieure à celle de la dihydrostreptomycine.
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On a constaté également que la solubilité de l'iodure-sulfate de dihydrostreptomycine est diminuée par la présence d'un excès d'iodure organique ou d'un excès de sulfate inorganique. Toutefois, un mélange d'io- dure et de sulfate inorganiques est plus efficace que chacun des sels inor- ganiques ci-dessus pour abaisser la solubilité de l'iodure-sulfate de dihy- drostreptomycine. Il est donc désirable de disposer toujours d'un excès des deux anions participants présents dans la solution.
REVENDICATIONS.
1. Procédé pour préparer un sel acide mixte de dihydrostrepto- mycine, dans lequel on ajoute à une solution aqueuse d'un sel acide unique de dihydrostreptomycine au moins un équivalent molaire (et de préférence deux) d'un sel qui est soluble dans l'eau et qui possède un anion inorga- nique différent.
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IMPROVEMENTS MADE TO ANTIBIOTIC PREPARATION PROCESSES.
The object of the invention is a process for the preparation of mixed acid salts of dihydrostreptomycin which are distinguished by their relatively reduced solubility in water. The invention relates not only to the preparation of these salts but also to their use for the purification of dihydrostreptomycin.
Dihydrostreptomycin is a high value antibiotic and is derived from streptomycin by reduction. Its properties, both chemical and biological, have been fully described in recent literature. The simple and well known salts of dihydrostreptomycin, such as the hydrochloride, sulfate and the like, are extremely soluble in water. The recovery of these compounds, especially in the pure crystalline state, is thus made difficult by a simple method.
The invention relates to a process for the preparation of a group of salts of dihydrostreptomycin whose solubility in water is markedly lower than the simple salts known hitherto. It is, of course, known that the salts of dihydrostreptomycin with sulfonic acid dyes or precipitants, such as reinecke's acid or picric acid, also have a lower solubility in water. water than simple salts such as sulfate.
However, these complex salts are not used in therapy regardless of their intervention for the recovery of dihydrostreptomycin and they are not suitable for the separation of streptomycin from mannosidostreptomycin. A further subject of the invention is a process for isolating dihydrostreptomycin in the form of a pure crystalline compound by the formation of one of these salt groups.
An additional object is a method for separating dihydrostreptomycin from mannosido-dihydrostreptomycin appended thereto.
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It is known that the dihydrostreptomycin molecule is a triacid base which normally forms salts with three equivalents of an acid. Simple salts, such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, acetate, citrate and the like are all extremely soluble in water. Attempts to crystallize these materials by concentrating an aqueous solution have almost always failed. It has now been found, unexpectedly, that when salts of dihydrostreptomycin are formed with at least two different inorganic acids, the solubility of salts of mixed acids in water is markedly lower than that of salts of acids. simple correspondents.
Thus, for example, a salt of dihydrostreptomycin has been prepared by combining two equivalents (one molecule) of sulfuric acid and one molecule of hydriodic acid per molecule of dihydrostreptomycin. This salt of mixed acids has a solubility in water of a much lower order than that of simple hydrochloride or simple sulfate. Comparable mixed acid salts of dibydrostreptomycin, containing hydrochloric and sulfuric acids, hydrobromic and sulfuric acids, hydriodic and sulfurous acids, nitrous and thiosulfuric acids, were also prepared. All these compounds can be crystallized directly out of their aqueous solution, unlike what happens for the corresponding simple acid salts.
Generally speaking, the mixed acid salts of dihydro-streptomycin may contain two or three different anions. Usually they contain two different anions and in most cases one of these is monovalent while the other is bivalent. However, all of the anions can be monovalent or bivalent and one of the anions can be trivalent as in the case of phosphate. When the anions, combined with dihydrostreptomycin, include polyvalent anions for which the total of valences is greater than three, it is possible that one of the polyvalent anions could be linked to more than one molecule of dihydrostreptomycin or could be satisfied only by part that way.
The exact structures of all the salts of mixed acids which can be prepared according to the invention are not known, but it is known that they can be prepared in the crystalline state and that the presence of of several different inorganic anions can be demonstrated by analysis. Typical inorganic acids which are suitable for the formation of salts of mixed acids according to the invention are sulfuric, sulphurous, hydrochloric, thiosulphuric, hydrobromic, hydroiodic, nitric, nitrous, thiocyanic or phosphoric acid. .
The water solubility of the salts of mixed acids discussed above varies considerably but each of these salts is less soluble in water than each of the corresponding simple acid salts and each can be crystallized directly out of solution. watery. The solubility in water of these salts of mixed acids is of a different order and much lower than that of the salts of simple acids. Among the salts of mixed acids specifically mentioned above, iodide-sulphite has the lowest solubility in water, that of iodide-sulphate being a little higher and that of bromide-sulphate even more. high.
When the salts of several different inorganic acids are present in the aqueous solution with dihydrostreptomycin, the particular mixed salt, which has the lowest solubility, separates as long as the total concentration is sufficiently high and sufficient amounts of each anion are present. Thus, if substantial amounts of sodium sulfate and sodium iodide are added to an aqueous solution of dihydrostreptomycin hydrochloride, having a content of about 80,000 units / ml or more, the iodide- sulfate separates. The solubility of salts also varies somewhat with the pH of the solution in which they are formed. It is generally preferred to maintain this pH between about 4 and about 8.
The effect of pH on solubility can be particularly apparent when a mixed salt of dihydrostreptomycin containing at least one polyvalent ion is obtained. The pH for the minimum solubility of a given mixed salt can be determined by minimal testing.
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To prepare the mixed acid salts, a concentrated aqueous solution of one of the simple acid salts of dihydrostreptomycin, for example sulfate, can be treated with any soluble salt, preferably a salt of. an alkali metal, ammonium or ammonium. organic but a different inorganic acid, for example sodium iodide. The solution is stirred and left to stand. In a short time, crystals of a mixed salt begin to separate. Usually, crystallization is complete within a few hours. If desired, the solution can be cooled and / or seeded to accelerate the formation of the crystallized mixed salt.
When dihydrostreptomycin sulfate is used as the starting material, an aqueous solution containing at least about 80,000 units / ml of the antibiotic is usually used. Higher concentrations are desirable if some of the more soluble mixed acid salts are to be prepared.
Usually at least one equivalent, preferably about two equivalents, of the added salt is used per molecule of the antibiotic. The presence of some excess of the added salt serves to lower the solubility of the resulting mixed salt. For example, an excess of sodium iodide or an excess of sodium sulphate decreases the solubility of the iodide-sulphate but a mixture of an excess of sodium iodide and sodium sulphate is on the other hand more effective. . Dihydrostreptomycin sulfite-iodide has a solubility of about 48,000 mcg / ml in water while the presence of an excess of salts used to form the antibiotic compound lowers the solubility to about 25,000 mcg / ml or even less.
A particularly valuable feature of the invention is that relatively crude solutions of dihydrostreptomycin can be used for the preparation of the crystallized mixed acid salts. Thus, for example, streptomycin in the raw state and collected from a fermentation broth, by a method of adsorption on an ion exchange resin and elution with an acid, can be hydrogenated to provide an aqueous solution of crude dihydrostreptomycin. The aqueous solution should be concentrated before or after the hydrogenation and any impurities which may separate during this concentration should be removed by filtration. The removal of these impurities can also be facilitated by the addition of an organic solvent such as methanol.
The concentration of the resulting crude aqueous solution of dihydrostreptomycin should be at least about 100,000 units / ml and is preferably greater than 200,000 units / ml so that a reasonably high proportion of the antibiotic can be separated. in the form of one of the salts of mixed acids.
Certain combinations of acids require even a higher concentration of the antibiotic to obtain an appreciable yield of mixed salt.
The crystallized mixed acid salts separate in a pure state and when acids of reduced toxicity are used for the formation of these salts, the product can be used as is. If an acid, which is unsuitable for therapeutic use, is involved in the formation of salts of mixed acids, it can be replaced by an appropriate metathetic reaction to provide a highly purified salt of dihydrostreptomycin which can be used for therapy.
It is of particular interest that the mixed acid salts of dihydromannosidostreptomycin do not crystallize or have much greater solubilities. 'higher than the corresponding mixed acid salts of dihydrostreptomycin. Therefore, formation of the salts in question is a suitable method of separating dihydrostreptomycin from the mannosido compound which is less desirable and has lower activity. It is surprising that the process according to the invention is not applicable in the same way to streptomycin. There is no corresponding difference between the properties of the mixed acid salts and the single acid salts of streptomycin.
It has been said above that dihydrostreptomycin sulfate can be used as the starting material for a group of salts of mixed acids. The invention is not, however, limited to the use of sulfate as the starting material. For example, a series of mixed acid salts of dihydro-
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streptomycin was prepared using iodide as the starting material. A concentrated aqueous solution of the iodide can be prepared from the sulfate by metathesis, for example by adding barium iodide and filtering off the barium sulfate formed.
When one or more molar equivalents of a water soluble salt, preferably an alkali metal or ammonium salt, are added, the anions indicated below to a concentrated aqueous solution of the tri- dihydrostreptomycin iodide, the following mixed acid salts can be easily separated from the solution: chlorate, hydrosulfite, nitrate, nitrite, sulfite, chloride, bromide, thiosulfate. An aqueous solution of about 500,000 units / ml of the iodide is used, but less potent solutions can also be used. Alternatively, concentrated solutions of dihydrostreptomycin chloride or bromide can be employed as starting materials for the preparation of salts of analogous mixed acids.
Care must be taken, however, to ensure that the inorganic salts used for the formation of the mixed salts are compatible. Thus, the use of silver sulphate and dihydrostreptomycin iodide, to form the sulphate-iodide, is obviously not suitable.
Dihydrostreptomycin base can be used as a starting material and in this case the selected inorganic anions are added in the form of acids, for example sulfuric or hydriodic acid in appropriate amounts to form a mixed acid salt. .
In most cases at least one monovalent inorganic anion is combined in the mixed acid salt. A divalent inorganic anion generally combines with two of the three basic groups present in the dihydrostreptomycin molecule. It seems likely that in some cases a single inorganic and polyvalent anion may be linked to more than one molecule of dihydrostreptomycin. Whatever the structure of the compounds obtained according to the invention, it has been found that they are very useful. Several of the mixed acid salts have marked toxicity to mice and have been found to be very comparable to the antibiotic sulfate. Obviously, anions known to be very toxic cannot be used for the preparation of the salts of mixed acids when they are to be used for therapy.
However, these compounds can be used for the recovery and purification of the antibiotic if the toxic anions are then carefully removed. It has been pointed out that iodides enhance the effect of streptomycin for the experimental treatment of tuberculosis. Salts of mixed acids with iodide are a means for providing the iodide combined with the therapeutic agent.
The examples below are given by way of illustration only and should not be considered as the only embodiments of the invention.
Example 1. A concentrate of dihydrostreptomycin sulfate is obtained by collecting the antibiotic from a fermentation broth of streptomycin with a carboxylic acid type ion exchange resin. After separating the antibiotic from the resin by dilute hydrochloric acid, the obtained solution is concentrated, further purified and converted to sulfate. The sulfate is reduced to give a material having a purity of about 90%. The concentrate used weighed 1150 g and had an activity of 317,000 units / ml. To this concentrated aqueous solution is added 182 g of sodium iodide with constant stirring. Crystals soon begin to separate from the clear solution which is kept at about room temperature.
The mixture is left to stand for two or three hours at room temperature and the heavy crystalline product is separated by filtration. The crystals are washed with a small volume of ice water and dried at a temperature of 50-60 at atmospheric pressure. The product obtained weighs 452 g and has an activity of 730 units / mg. In the filtrate (545 ml) separated from the crystals there are 26,000 units / ml of the antibiotic which corresponds to a total of 3.88% of the antibiotic used as starting material. Ice water, used for washing, has a volume of 375 ml
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and tested contains 39,000 units / ml. This corresponds to 4.02% of the total antibiotic used as starting material.
A 100 g portion of the crystallized product, described above, is recrystallized by dissolving in a 3-4 times greater amount of water., This is heated to 80-90 to dissolve the product and, after cooling, it is heated. filters the separated crystals. 9 to 10 g of these crystals are collected. On concentrating the solution, 65.7 g of a very highly purified dihydrostreptomycin sulfate-iodide are obtained which, on test, gives 750 mcg / mg when it is air dried. When dried under high vacuum it tested 765 mcg / ml. This is equivalent to a crystallized dihydrostreptomycin sulfate having very high activity.
A sample of dihydrostreptomycin sulfate-iodide is dried at 78 under high vacuum overnight and analyzed.
Analysis: By calculation for C21H41N7O12. HI.HSO, we get:
C, 31.14; H = 5.48; N = 12.11; SO4 = = 11.8; I = 15.67.
We find: C = 31.21; H = 5.65; N = 12.22; SO4 = 11.85;
I = 15.47.
Example II A portion of pure dihydrostreptomycin sulfate, weighing 12.5 g, is dissolved in 12 ml of water; to this solution is added 3.5 g of sodium bromide (2 molar equivalents) dissolved in 5 ml of water.
After a short rest, the crystals separate. They are removed after an hour and the product is washed with a reduced volume of ice water. The crystals are dried at 50-60. They weigh 8.6 g and contain, tested by a microbiological method, 720 units / mg. The mother liquor, from the preparation of crystallized dihydrostreptomycin sulfate bromide has a volume of 14 ml and contains 83,000 units / ml of the antibiotic. The wash water has a volume of 17 ml and contains 85,500 units / ml.
A sample of the sulfate bromide is heated to 70 under high vacuum overnight. The material is then analyzed.
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Analysis: By calculation for C? -LH41N7012.HBr.H2SO4 we obtain: C = 33.06; H = 5.82; N = 12.86; Br = 10.48; SO4 = 12.60.
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We find: C = 33el4; H - 6.03; N = 12.78: Br = 10.62;
SO4 = 12.55.
Example III - Dihydrostreptomycin sulfate, weighing 13.75 g, is dissolved in 13.2 ml of water. To this solution is added 2.7 g of sodium chloride. The solution is stirred until the sodium chloride is dissolved and the mixture is allowed to stand overnight. The crystallized product, which has settled, is filtered, washed with a small volume of water and dried. The obtained product, which is dihydrostreptomycin sulfate chloride, weighed 4.3 g and tested 770 mcg / mg when air dried.
Example IV - Several portions of crystallized dihydrostreptomycin sulfate, each weighing 1.25 g are poured into a group of small cuvettes o Each portion is dissolved in 1.2 ml of water and two molar equivalents of several inorganic salts which are respectively added to the cuvettes. After addition of the following salts: sodium nitrate, nitrite, sulphite, thiocyanate and thiosulphate, crystallized mixed acid salts of dihydrostreptomycin separate from the aqueous solution. For the first two of these compounds, the salts are obtained in very good yields. For the last three compounds the yields are considerably lower.
When sodium bromate or iodate is added to solutions of dihydrostreptomycin sulphate, only little or no precipitation is obtained at the concentration indicated.
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Several portions of tri-iodhydrate, each weighing 1.65 g, are placed in a group of cuvettes. Each serving of the antibiotic salt is dissolved in 1.2 ml of water. Two molar equivalents of one of the salts belonging to the following group: sodium chloride, hydrosulfite, sodium nitrate and nitrite, potassium sulfite, thiosulfate and sodium bromide, ammonium sulfate, were added to the contents of each of the cuvettes. In each case, and shortly after the added salt has dissolved, the corresponding mixed salt of dihydrostreptomycin is separated from the solution.
Example V. Three portions of dihydrostreptomycin trihydrochloride, each weighing 1.2 g, are each dissolved in 1.2 ml of water. When two molar equivalents of sodium sulfite are added to one portion of the antibiotic solution, separation of the crystallized sulfite-chloride of dihydrostreptomycin soon occurs. However, when the bromide and sodium nitrate are added to the other parts of the hydrochloride solution of the antibiotic, no appreciable amount of the crystallized salt will separate at that particular concentration.
Example VI A streptomycin fermentation broth, obtained by culturing Streptomyces griseus under submersion and aeration conditions in a nutrient medium, is filtered to remove the fungi.
A water soluble polyphosphate is added to the filtered broth to sequester the polyvalent metals. The broth is then passed through a turret containing a synthetic resin and ion exchange, of the carboxylic acid type. After washing the resin with a small volume of water, the antibiotic is treated with dilute hydrochloric acid. The calcium is separated from the resulting mass using oxalic acid and the excess hydrochloric acid is neutralized. The aqueous solution is concentrated in vacuo to a concentration greater than 200,000 mcg / ml.
The inorganic salts, which have been separated, are filtered off and the solution is subjected to catalytic reduction at a temperature of about 75-80 under a hydrogen pressure of 70 kg / cm 2 using Raney nickel as a catalyst. When the reduction is substantially complete, the catalyst is filtered off from the cooled solution. The hydrochloride concentrate of dihydrostreptomycin obtained gives, when tested by a microbiological method, a content of about 243,000 mcg / ml.
About one hundred milliliters of this concentrate of crude dihydrostreptomycin hydrochloride (0042 M) is treated with 13 g of anhydrous sodium sulfate (0.092 M). When the added salt is dissolved, a reduced amount of an uncrystallized precipitate is filtered off and then 14 g (0.093 M) of sodium iodide is added. The mixture is stirred until dissolution is complete and crystals of a mixed acid salt of dibydrostreptomycin slowly begin to form. The mixture is left to stand for several days at room temperature. The crystallized product is then filtered, washed with a small volume of ice water and dried at about 50-60. It weighs 25.7 g and has an activity, determined by a microbiological method, of 655 mcg / mg.
This product is, as the analysis shows, the sulphate-iodide of dihydrostreptomycin.
Example VII Several portions of dihydro-streptomycin trihydrobromide, each weighing 1.3 g, are diluted to 2.0 ml with water. The procedure is as in Example IV, each portion being treated with 1.5 molar equivalents of the following salts to form the corresponding mixed salts of dibydrostreptomycin: hydrosulfite, thiosulfate, sulfite, nitrate, nitrite and sodium chloride.
The bromide-hydrosulphate, bromide-thiosulphate and bromide-sulphite salts separate, in the form of crystals, from the solutions, but for the concentrations used, the bromide-nitrate, bromide-nitrite and bromide-chloride do not crystallize.
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Example VIII Several portions of dihydrostreptomycin trinitrate, each weighing 1.3 g, are weighed and diluted to 2.0 ml with water. To the portions of these solutions are added 1.5 molar equivalents of each of the following salts: bromate, chlorate, iodide, perchlorate, sulphite, thiocyanate and sodium thiosulphate. In each case the mixed crystallized salt of dihydrostreptomycin separates from the reaction mixture. When using bromide, fluoride, nitrite or sodium chloride, no mixed salt will separate for the particular concentration used.
Example IX - Dihydrostreptomycin tri-dihydrate, weighing 1695 g, is dissolved in 8 ml of water. 10 ml of an aqueous solution of triethylamine sulfite are added. The latter is prepared by suspending 300 g of triethylamine in 250 ml of water, the mixture being stirred and cooled while sulfur dioxide is bubbled through the mixture. When the pH has reached 6.6, the flow of sulfur dioxide is stopped. At this time the volume of the solution is 575 ml. When 10 ml of the solution is added to the dihydrostreptomycin iodihydrate, the pH of the mixture drops to 4.6. It is set to 6.1 with 10% sodium hydroxide solution. After standing for 4 hours at room temperature, the crystallized idoure sulfite from dihydro-streptomycin is filtered off.
It is washed with a small volume of ice water and dried at room temperature overnight. The product weighs 11.8 g and has an activity of 700 mcg / mg. The mother liquor has an activity of 58,000 mcg / ml.
Example X. A concentrate of streptomycin hydrochloride, obtained as in Example VI, is dehydrated and is then dissolved in methanol. The streptomycin hydrochloride methanolic concentrate thus obtained is separated by filtration from the insoluble salts. The clear methanol solution is then evaporated to remove all of the methanol. Water is added to obtain a solution having an activity of about 400,000 mcg / ml of streptomycin. A Raney nickel catalyst is added and the mixture is subjected to hydrogenation at about 80 under a hydrogen pressure of 70 kg / cm 2. When the reaction is complete, the mixture is cooled and the catalyst is washed with water to remove residual material. Bioassay shows that the solution contains 294,000 mcg / ml of dihydrostreptomycin.
It is found to have been converted to the compound of dihydrostreptomycin to an extent corresponding to about 98%.
About one hundred milliliters of the dihydrostreptomycin hydrochloride concentrate (0.053 M) is treated with 16.6 g (0.117 M) of sodium sulfate. The mixture is stirred until a clear solution is obtained to which is added 17.5 (0.117 M) of sodium iodide. The crystallized dihydrostreptomycin sulfate-iodide soon begins to separate. The mixture is stirred and cooled in an ice bath for one hour. The product separates out as fine needles which are separated by filtration, washed with ice water and dried to about 50-60. The product, which has a white color, weighs 28.4 g. It contains some inorganic salts and has, when tested by a microbiological method, a content of 605 mcg / mg.
A yield of 60% is obtained for this first crop, based on the amount of dibydrostreptomycin contained in the aqueous concentrate. The mother liquor, with a volume of 53 ml, contains 128,000 mcg / ml of the antibiotic (by bioassay and calculated as dihydrostreptomycin). The wash water has a volume of 52 ml and gives the test 113,000 mcg / ml. Further crystallized dihydrostreptomycin sulfate iodide is collected by concentrating the mother liquor and washing water in vacuo. The amount of the first harvest is increased to about 745 mcg / ml by recrystallization.
It has been found that the dihydromannosidostreptomycin sulfate-iodide does not separate under the same conditions as those described above. Therefore, the method in question is useful in separating the mannosido compound, which is of lesser value and which has a considerably lower biological activity than that of dihydrostreptomycin.
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It has also been found that the solubility of dihydrostreptomycin iodide sulfate is decreased by the presence of an excess of organic iodide or an excess of inorganic sulfate. However, a mixture of inorganic iodide and sulfate is more effective than each of the above inorganic salts in lowering the solubility of dihydrostreptomycin iodide sulfate. It is therefore desirable to always have an excess of the two participating anions present in the solution.
CLAIMS.
A process for preparing a mixed acid salt of dihydrostreptomycin, wherein an aqueous solution of a single acid salt of dihydrostreptomycin is added to at least one molar equivalent (and preferably two) of a salt which is soluble in water. water and which has a different inorganic anion.