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PERFECTIONNEMENTS APPORTES AUX PROCEDES DE PREPARATION D'ANTIBIOTIQUES.
L'invention a pour objet un procédé de préparation de sels d'a- cides mixtes de la dihydrostreptomycine qui se distinguent par leur solubi- lité relativement réduite dans l'eau. L'invention concerne non seulement la préparation de ces sels mais également leur usage pour la purification de la dihydrostreptomycine.
La dihydrostreptomycine constitue un antibiotique de valeur éle- vée et est dérivée de la streptomycine par réduction.'Ses propriétés, à la fois chimiques et biologiques, ont été décrites complètement dans la litté- rature récente. Les sels simples et bien connus de la dihydrostreptomycine, tels que le chlorhydrate, le sulfate et analogues, sont extrêmement solubles dans l'eau. La récupération de ces composés, surtout à l'état cristallisé pur, est ainsi rendue difficile par une méthode simple.
L'invention a pour objet un procédé pour la préparation d'un groupe 'de sels de la dihydrostreptomycine dont la solubilité dans l'eau est nettement moindre que les sels simples connus jusqu'ici. On sait, bien en- tendu, que les sels de la dihydrostreptomycine avec des colorants à l'aci- de sulfonique ou des précipitants, tels que l'acide de reinecke ou l'acide picrique, ont également une solubilité plus réduite dans l'eau que les sels simples tels que le sulfate.
Toutefois, on ne se sert pas de -ces sels com- plexes pour la¯thérapie quelle que soit leur intervention pour la récupéra- tion de la dihydrostreptomycine et ils ne conviennent pas à la séparation de la streptomycine d'avec la mannosidostreptomycine. L'invention a égale- ment pour objet un procédé pour isolér la dihydrostreptomycine sous la for- me d'un composé cristallisé pur par la formation d'un de ces groupes de sels.
Un objet additionnel est une méthode pour séparer la dihydrostreptomycine d'avec la mannosido-dihydrostreptomycine adjointe à celle-ci.
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On sait que la molécule de dihydrostreptomycine est une base tria- cide qui normalement forme des sels avec trois équivalents d'un acide. Les sels simples, tels que le chlorhydrate, le bromhydrate, le sulfate, l'acéta- te,le citrate et analogues sont tous extrêmement solubles dans l'eau. Des essais pour cristalliser ces matières par la concentration d'une solution a- queuse sont presque toujours restés sans résultat. On a trouvé maintenant, d'une manière inattendue, que lorsque des sels de la dihydrostreptomycine sont formés avec au moins deux acides inorganiques différents, la solubilité des sels d'acides mixtes dans l'eau est nettement inférieure à celle des sels d'acides simples correspondants.
Ainsi, par exemple, un sel de la dihydrostrep- tomycine a été préparé en combinant deux équivalents (une molécule) d'acide sulfurique et une molécule d'acide iodhydrique par molécule de dihydrostrep- tomycine. Ce sel d'acides mixtes a une solubilité dans l'eau d'un ordre bien inférieur à celle de l'iodhydrate simple ou du sulfate simple. Des sels d'a- cides mixtes comparables de la dibydrostreptomycine, contenant les acides chlorhydrique et sulfurique, les acides bromhydrique et sulfurique, les aci- des iodhydrique et sulfureux, les acides nitreux et thiosulfurique, ont éga- lement été préparés. Tous ces composés peuvent être cristallisés directement hors de leur solution aqueuse contrairement à ce qui se produit pour les sels d'acides simples correspondants.
D'une manière générale, les sels d'acides mixtes de la dihydro- streptomycine peuvent contenir deux ou trois anions différents. Ordinaire- ment, ils contiennent deux anions différents et dans la plupart des cas un de ceux-ci est monovalent alors que l'autre est bivalent. Toutefois, tous les anions peuvent être monovalents ou bivalents et un des anions peut être trivalent comme dans le cas du phosphate. Quand les anions, combinés avec la dihydrostreptomycine, comprennent des anions polyvalents pour lesquels le total des valences est supérieur à trois, il est possible qu'un des anions polyvalents puisse être lié à plus d'une molécule de dihydrostreptomycine ou puisse être satisfait seulement en partie de cette manière.
Les structu- res exactes de tous les sels d'acides mixtes,qui peuvent être préparés con- formément à l'invention, ne sont pas connues mais on sait qu'ils peuvent ê- tre préparés à l'état cristallisé et que la présence de plusieurs anions inor- ganiques différents peut être démontrée par l'analyse. Des acides inorgani- ques typiques, qui conviennent à la formation de sels d'acides mixtes selon l'invention, sont l'acide sulfurique, sulfureux, chlorhydrique, thiosulfuri- que, bromhydrique, iodhydrique, nitrique, nitreux, thiocyanique ou phospho- rique.
La solubilité dans l'eau des sels d'acides mixtes dont question plus haut varie considérablement mais chacun de ces sels est moins soluble dans l'eau que chacun des sels d'acides simples correspondants et chacun peut être cristallisé directement hors d'une solution aqueuse. La solubilité dans l'eau de ces sels d'acides mixtes est d'un ordre différent et bien in- férieur à celle des sels d'acides simples. Parmi les sels d'acides mixtes spécifiquement cités plus haut, l'iodure-sulfite a la solubilité la plus fai- ble dans l'eau, celle de l'iodure-sulfate étant un peu plus élevée et celle du bromure-sulfate encore plus élevée.
Quand les sels de plusieurs acides inorganiques différents sont en présence, dans la solution aqueuse, avec la dihydrostreptomycine, le sel mixte particulier, qui a la solubilité la plus basse, se sépare du moment que la concentration totale est suffisamment éle- vée et que des quantités suffisantes de chaque anion sont en présence. Ain- si, si des quantités substantielles de sulfate de sodium et d'iodure de so- dium sont ajoutées à une solution aqueuse de chlorhydrate de dihydrostrepto- mycine, ayant une teneur d'environ 80.000 unités/ml ou davantage, l'iodure- sulfate se sépare. La solubilité des sels varie également quelque peu avec le pH de la solution dans laquelle ils sont formés. On préfère généralement maintenir ce pH entre environ 4 et environ 8.
L'effet du pH sur la solubilité peut être particulièrement apparent quand on obtient un sel mixte de la dihy- drostreptomycine contenant au moins un ion polyvalent. Le pH pour la solubi- lité minimum d'un sel mixte donné peut être déterminé par des essais réduits au minimum.
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Pour préparer les sels d'acides mixtes on peut traiter une so- lution aqueuse concentrée d'un des sels d'acides simples de la dihydrostrep- tomycine, par exemple le sulfate, avec un sel soluble quelconque, de préfé- rence un sel d'un métal alcalin, d'ammonium ou d'ammonium. organique mais d'un acide inorganique différent, par exemple l'iodure de sodium. La solu- tion est agitée et laissée au repos. En peu de temps, des cristaux d'un sel mixte commencent à se séparer. Généralement, la cristallisation est terminée en quelques heures. Si on le désire, la solution peut être refroidie et/ou ensemencée pour accélérer la formation du sel mixte cristallisé.
Quand le sulfate de dihydrostreptomycine est utilisé comme matière initiale, on se sert ordinairement d'une solution aqueuse contenant au moins environ 80.000 unités/m1 de l'antibiotique. Des concentrations plus élevées sont désirables si l'on veut préparer certains des sels d'acides mixtes les plus solubles.
Généralement au moins un équivalent, de préférence environ deux équivalents, du sel ajouté sont utilisés par molécule de l'antibiotique. La présence d'un certain excès du sel ajouté sert à abaisser la solubilité du sel mixte obte- nu. Par exemple, un excès d'iodure de sodium ou un excès de sulfate de so- dium diminue la solubilité de l'iodure-sulfate mais un mélange d'un excès d'iodure de sodium et de sulfate de sodium est par contre plus efficace. Le sulfitde-iodure de dihydrostreptomycine a une solubilité d'environ 48.000 mcg/ml dans l'eau alors que la présence d'un excès de sels utilisés pour former le composé antibiotique abaisse la solubilité à environ 25.000 mcg/ ml ou encore moins.
Une caractéristique particulièrement valable de l'invention est que des solutions relativement brutes de dihydrostreptomycine peuvent être utilisées pour la préparation des sels d'acides mixtes cristallisés. Ainsi, par exemple, la streptomycine à l'état brut et recueillie à partir d'un bouillon de fermentation, par une méthode d'adsorption sur une résine échan- geuse d'ions et d'élution avec un acide, peut être hydrogénée pour fournir une solution aqueuse de dihydrostreptomycine brute. La solution aqueuse doit être concentrée avant ou après l'hydrogénation et toutes les impuretés qui peuvent se séparer au cours de cette concentration doivent être enlevées par filtration. L'enlèvement de ces impuretés peut également être facilité par l'addition d'un solvant organique tel que le méthanol.
La concentration de la solution aqueuse brute de dihydrostreptomycine obtenue doit correspon- dre au moins à environ 100.000 unités/ml et est, de préférence, supérieure à 200.000 unités/ml afin qu'une proportion raisonnablement élevée de l'anti- biotique puisse être séparée sous la forme d'un des sels d'acides mixtes.
Certaines combinaisons d'acides nécessitent même une concentration plus éle- vée de l'antibiotique pour obtenir un rendement appréciable en sel mixte.
Les sels d'acides mixtes cristallisés se séparent à l'état pur et quand on se sert d'acides ayant une toxicité réduite pour la formation de ces sels, le produit peut être utilisé tel quel. Si un acide, qui ne convient pas à un usage thérapeutique, intervient dans la formation de sels d'acides mixtes, il peut être remplacé par une réaction métathétique appropriée pour fournir un sel de dihydrostreptomycine fortement purifié qui peut être utilisé pour la thérapie.
Il est particulièrement intéressant que les sels d'acides mixtes de dihydromannosidostreptomycine ne cristallisent pas ou ont des solubilités beaucoup plus. 'élevées que les sels d'acides mixtes correspondants de la dihy- drostreptomycine. Par conséquent, la formation des sels en question consti- tue une méthode appropriée pour séparer la dihydrostreptomycine du composé mannosido qui est moins désirable et qui a une activité moins élevée. Il est étonnant que le procédé selon l'invention ne soit pas applicable de la même manière à la streptomycine. Il n'existe pas une différence correspondante entre les propriétés des sels d'acides mixtes et les sels d'acides simples de la streptomycine.
Il a été dit ci-dessus que le sulfate de dihydrostreptomycine peut être utilisé comme matière 'initiale pour un groupe de sels d'acides mix- tes. L'invention n'est toutefois pas limitée à l'utilisation du sulfate comme matière initiale. Par exemple, une série des sels d'acides mixtes de dihydro-
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streptomycine a été préparée en se servant de l'iodure comme matière ini- tiale. Une solution aqueuse concentrée de l'iodure peut être préparée à par- tir du sulfate par métathèse, par exemple en ajoutant de l'iodure de baryum et en séparant par filtration le sulfate de baryum formé.
Quand on ajoute un ou plusieurs équivalents molaires d'un sel soluble dans l'eau, de préfé- rence un sel d'un métal alcalin ou d'ammonium, des anions indiqués ci-des- sous à une solution aqueuse concentrée du tri-iodhydrate de dihydrostrep- tomycine, on peut séparer aisément les sels d'acides mixtes suivants d'avec la solution :chlorate, hydrosulfite, nitrate, nitrite, sulfite, chlorure, bromure, thiosulfate. On se sert d'une solution aqueuse d'environ 500.000 unités/ml de l'iodure mais des solutions à activité moindre peuvent égale- ment être utilisées. Suivant une variante, on peut employer des solutions concentrées de chlorure ou bromure de dihydrostreptomycine comme matières initiales pour la préparation de sels d'acides mixtes analogues.
On doit veiller, toutefois, à ce que les sels inorganiques uti- lisés pour la formation des sels mixtes soient compatibles. Ainsi, l'usage de sulfate d'argent et d'iodure de dihydrostreptomycine, pour former le sulfate-iodure, ne convient évidemment pas.
La base de dihydrostreptomycine peut être utilisée comme matiè- re initiale et, dans ce cas, les anions inorganiques choisis sont ajoutés sous la forme d'acides, par exemple l'acide sulfurique ou iodhydrique en quantités appropriées pour former un sel d'acide mixte.
Dans la plupart des cas au moins un anion inorganique monova- lent est combiné dans le sel d'acide mixte. Un anion inorganique bivalent se combine généralement avec deux des trois groupements basiques en présen- ce dans la molécule de dihydrostreptomycine. Il parait vraisemblable que dans certains cas un seul anion inorganique et polyvalent peut être lié à plus d'une molécule de dihydrostreptomycine. Quelle que soit la structure des composés obtenus selon l'invention, on a constaté qu'ils étaient très utiles. Plusieurs des sels d'acides mixtes ont une toxicité marquée pour des souris et on a constaté qu'ils sont très comparables au sulfate de l'an- tibiotique. Evidemment, on ne peut pas se servir d'anions connus comme é- tant très toxiques, pour la préparation des sels d'acides mixtes quand ils doivent être utilisés pour la thérapie.
Toutefois, ces composés peuvent être utilisés pour la récupération et la purification de l'antibiotique si les anions toxiques sont ensuite soigneusement éliminés. On a fait remarquer que les iodures améliorent l'effet de la streptomycine pour le traitement expé- rimental de la tuberculose. Les sels d'acides mixtes à iodure constituent des moyens pour fournir l'iodure combiné avec l'agent thérapeutique.
Les exemples ci-dessous sont donnés à titre illustratif seule- ment et ne doivent pas être considérés comme étant les seuls modes de réa- lisation de l'invention.
Exemple 1.- Un concentrat de sulfate de dihydrostreptomycine est obtenu en recueillant l'antibiotique à partir d'un bouillon de fermen- tation de streptomycine avec une résine échangeuse d'ions du type acide car- boxylique. Après séparation de l'antibiotique d'avec la résine par l'acide chlorhydrique dilué, la solution obtenue est concentrée, purifiée davantage et convertie en sulfate. Le sulfate est réduit pour donner une matière ayant une pureté d'environ 90 %. Le concentrat utilisé pesait 1150 g et avait une activité de 317.000 unités/ml. A cette solution aqueuse concentrée on ajoute 182 g d'iodure de sodium en agitant constamment. Des cristaux commencent bientôt à se séparer de la solution claire qui est maintenue à peu près à la température ambiante.
Le mélange est laissé au repos pendant deux ou trois heures à la température ordinaire et le produit cristallisé lourd est séparé par filtration. Les cristaux sont lavés avec un petit volume d'eau glacée et sont séchés à une température de 50-60 à la pression atmosphérique. Le pro- duit obtenu pèse 452 g et a une activité de 730 unités/mg. Dans le filtrat (545 ml) séparé des cristaux se trouvent 26. 000 unités/ml de l'antibiotique ce qui correspond à un total de 3,88 % de l'antibiotique utilisé comme ma- tière initiale. L'eau glacée, ayant servi au lavage, a un volume de 375 ml
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et à l'essai contient 39.000 unités/ml. Ceci correspond à 4,02 % de l'an- tibiotique total utilisé comme matière initiale.
Une portion de 100 g du produit cristallisé, décrit plus haut, est recristallisée par dissolution dans une quantité 3à 4'fois plus grande d'eau., Celle-ci est chauffée à 80-90 pour dissoudre le produit et, après refroidissement, on filtre les cristaux séparés. On recueille de 9 à 10 g de ces cristaux. En concentrant la solution, on obtient 65,7 g d'un sulfa- te-iodure de dihydrostreptomycine très fortement purifié qui à l'essai don- ne 750 mcg/mg quand il est séché à l'air. Quand on le sèche sous un vide é- levé, il donne à l'essai 765 mcg/ml. Ceci est équivalent à un sulfate de dihydrostreptomycine cristallisé ayant une activité très élevée.
Un échantillon de sulfate-iodure de dihydrostreptomycine est sé- ché à 78 sous un vide élevé et pendant toute une nuit et est analysé.
Analyse : Par calcul pour C21H41N7O12. HI.HSO, on obtient :
C=31,14; H=5,48; N=12,11; SO4= =11,8; I =15,67.
On trouve : C=3l,21; H=5,65; N=12,22; SO4=11,85;
I= 15,47.
Exemple II.- Une portion de sulfate pur de dihydrostreptomycine, pesant 12,5 g, est dissoute dans 12 ml d'eau; à cette solution on ajoute 3,5 g de bromure de sodium (2 équivalents molaires) dissous dans 5 ml d'eau.
Après un court repos, les cristaux se séparent. Ils sont enlevés après une heure et le produit est lavé avec un volume réduit d'eau glacée. Les cris- taux sont séchés à 50-60 . Ils pèsent 8,6 g et contiennent, à l'essai par une méthode microbiologique, 720 unités/mg. La liqueur-mère, provenant de la préparation de sulfate-bromure de dihydrostreptomycine cristallisé a un volume de 14 ml et contient 83.000 unités/ml de l'antibiotique. L'eau de lavage a un volume de 17 ml et contient 85.500 unités/ml.
Un échantillon du sulfate-bromure est chauffé à 70 sous un vide élevé pendant la nuit. La matière est ensuite analysée.
EMI5.1
Analyse : Par calcul pour C?-lH4lN7012.HBr.H2SO4 on obtient : C=33,06; H=5,82; N=12,86 ; Br=10,48; SO4=12,60.
EMI5.2
On trouve : C=33el4; H--6,03; N=12,78: Br =IO,62;
SO4= 12,55.
Exemple III.- Du sulfate de dihydrostreptomycine, pesant 13,75 g, est dissous dans 13,2 ml d'eau. A cette solution on ajoute 2,7 g de chlorure de sodium. La solution est agitée jusqu'à ce que le chlorure de sodium soit dissous et on laisse le mélange au repos pendant la nuit. Le produit cristal- lisé, qui s'est reposé, est filtré, lavé avec un faible volume d'eau et est séché. Le produit obtenu, qui est le sulfate-chlorure de dihydrostreptomy- cine, pèse 4,3 g et donne à l'essai 770 mcg/mg quand il est séché à l'air.
Exemple IV.- Plusieurs portions de sulfate de dihydrostreptomy- cine cristallisé, pesant chacune 1,25 g sont versées dans un groupe de pe- tites cuvetteso Chaque portion est dissoute dans 1,2 ml d'eau et on utilise alors deux équivalents molaires de plusieurs sels inorganiques que l'on a- joute respectivement aux cuvettes. Après addition des sels suivants : nitra- re, nitrite, sulfite, thiocyanate et thiosulfate de sodium, des sels d'aci- des mixtes cristallisés de dihydrostreptomycine se séparent de la solution aqueuse. Pour les deux premiers de ces composés, les sels sont obtenus avec des rendements très bons. Pour les trois derniers composés les rendements sont considérablement inférieurs.
Quand on ajoute du bromate ou de l'ioda- te de sodium aux solutions de .sulfate de dihydrostreptomycine, on n'obtient qu'une précipitation réduite ou nulle pour la concentration indiquée.
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Plusieurs portions de tri-iodhydrate, pesant chacune 1,65 g, sont introduites dans un groupe de cuvettes. Chaque portion du sel antibiotique est dissoute dans 1,2 ml d'eau. On a ajouté au contenu de chacune des cuvet- tes deux équivalents molaires d'un des sels faisant partie du groupe suivant : chlorure, hydrosulfite, nitrate et nitrite de sodium, sulfite de potassium, thiosulfate et bromure de sodium, sulfate d'ammonium. Dans chaque cas et peu de temps après que le sel ajouté a été dissous, il se produit la séparation, d'avec la solution, du sel mixte de dihydrostreptomycine correspondant.
Exemple V.- Trois portions de trichlorhydrate de dihydrostrepto- mycine, pesant chacune 1,2 g, sont dissoutes chacune dans 1,2 ml d'eau. Quand deux équivalents molaires de sulfite de sodium sont ajoutés à une portion de la solution antibiotique, on obtient bientôt la séparation du sulfite-chloru- re de dihydrostreptomycine cristallisé. Toutefois, quand le bromure et le nitrate de sodium sont ajoutés aux autres parties de la solution du chlorhy- drate de l'antibiotique, aucune quantité appréciable du sel cristallisé ne se sépare pour cette concentration particulière.
Exemple VI.- Un bouillon de fermentation de streptomycine, obte- nu par la culture du Streptomyces griseus dans des conditions de submersion et d'aération dans un milieu nutritif, est filtré pour enlever les mycelles.
Un polyphosphate, soluble dans l'eau, est ajouté au bouillon filtré pour sé- questrer les métaux polyvalents. On fait ensuite passer le bouillon dans une tourelle contenant une résine synthétique et échangeuse d'ions, du type acide carboxylique. Après avoir lavé la résine avec un petit volume d'eau, on traite l'antibiotique avec de-l'acide chlorhydrique dilué. Le calcium est séparé de la masse obtenue à l'aide d'acide oxalique et l'excès d'acide chlor- hydrique est neutralisé. La solution aqueuse est concentrée sous vide jus- qu'à une concentration supérieure à 200.000 mcg/ml.
Les sels inorganiques, qui ont été séparés, sont filtrés et la solution est soumise à une réduction catalytique à une température d'environ 75-80 sous une pression d'hydrogène de 70 kg/cm2 en se servant comme catalyseur du nickel Raney. Quand la réduc- tion est, en substance, complète, le catalyseur est séparé, par filtration, de la solution refroidie. Le concentrat de chlorhydrate de dihydrostreptomy- cine obtenu donne, à l'essai par une méthode microbiologique, une teneur d'environ 243.000 mcg/ml.
Une centaine de millilitres de ce concentrat de chlorhydrate brut de dihydrostreptomycine (0042 M) est traitée avec 13 g de sulfate de sodium anhydre (0,092 M). Quand le sel ajouté est dissous, une quantité ré- duite d'un précipité non cristallisé est séparée par filtration et on ajou- te ensuite 14 g (0,093 M) d'iodure de sodium. Le mélange est agité jusqu'à ce que la dissolution soit complète et des cristaux d'un sel acide mixte de dibydrostreptomycine commencent lentement à se former. On laisse le mélange au repos pendant plusieurs jours à la température ambiante. Le produit cris- tallisé est alors filtré, lavé avec un petit volume d'eau glacée et séché à environ 50-60 . Il pèse 25,7 g et a une activité, déterminée par une méthode microbiologique de 655 mcg/mg.
Ce produit est, comme le montre l'analyse, le sulfate-iodure de dihydrostreptomycine.
Exemple VII.- Plusieurs portions de tribromhydrate de dihydro- streptomycine, pesant chacune 1,3 g, sont diluées jusqu'à 2,0 ml avec de l'eau. On procède comme pour l'exemple IV, chaque portion étant traitée avec 1,5 équivalent molaire des sels suivants pour former les sels mixtes correspondants de dibydrostreptomycine : hydrosulfite, thiosulfate, sulfi- te, nitrate, nitrite et chlorure de sodium.
Les sels mixtes bromure-hydrosulfate, bromure-thiosulfate et bromure-sulfite se séparent, à l'état de cristaux, des solutions mais pour les concentrations utilisées le bromure-nitrate, bromure-nitrite et bromure- chlorure ne cristallisent pas.
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Exemple VIII.- Plusieurs portions de trinitrate de dihydrostrep- tomycine, pesant chacune 1,3 g, sont pesées et diluées jusqu'à 2,0 ml avec de l'eau. Aux portions de ces solutions on ajoute 1,5 équivalent molaire de chacun des sels suivants :bromate, chlorate, iodure, perchlorate, sulfite, thiocyanate et thiosulfate de sodium. Dans chaque cas le sel mixte cristal- lisé de dihydrostreptomycine se sépare du mélange de réaction. Quand on uti- lise le bromure, le fluorure, le nitrite ou le chlorure de sodium, aucun sel mixte ne se sépare pour la concentration particulière utilisée.
Exemple IX.- Du tri-iodhydrate de dihydrostreptomycine, pesant 1695 g, est dissous dans 8 ml d'eau. On ajoute 10 ml d'une solution aqueuse de sulfite de triéthylamine. Ce dernier est préparé en suspendant 300 g de triéthylamine dans 250 ml d'eau, le mélange étant agité et refroidi pendant qu'on fait barboter de l'anhydride sulfureux dans le mélange. Quand le pH a atteint 6,6 on arrête le débit d'anhydride sulfureux. A ce moment le volume de la solution est de 575 ml. Quand 10 ml de la solution sont ajoutés à l'iod- hydrate de dihydrostreptomycine, le pH du mélange tombe à 4,6. Il est réglé à 6,1 avec une solution à 10 % d'hydroxyde de sodium. Après un repos de 4 heures à la température ambiante, l'idoure-sulfite cristallisé de dihydro- streptomycine est séparé par filtration.
Il est lavé avec un petit volume d'eau glacée et est séché à la température ambiante pendant la nuit. Le pro- duit pèse Il,8 g et a une activité de 700 mcg/mg. La liqueur-mère a une ac- tivité de 58.000 mcg/ml.
Exemple X. - Un concentrat de chlorhydrate de streptomycine, ob- tenu comme dans l'exemple VI est déshydraté et est dissous ensuite dans du méthanol. Le concentrât méthanolique de chlorhydrate de streptomycine ainsi obtenu est séparé par filtration des sels insolubles. La solution méthano- lique claire est ensuite évaporée pour enlever tout le méthanol. On ajoute de l'eau pour obtenir une solution ayant une activité d'environ 400.000 mcg/ ml en streptomycine. On ajoute un catalyseur au nickel Raney et on soumet le mélange à une hydrogénation à environ 80 sous une pression d'hydrogène de 70 kg/cm2. Quand la réaction est terminée, le mélange est refroidi et le catalyseur est lavé à l'eau pour enlever les matières résiduelles. Un essai biologique montre que la solution contient 294. 000 mcg/ml de dihydrostrepto- mycine.
On constate qu'elle a été convertie en composé de dihydrostreptomy- cine à un degré correspondant à environ 98 %.
Une centaine de millilitres du concentrat de chlorhydrate de di- hydrostreptomycine (0,053 M) est traitée avec 16,6 g (0,117 M) de sulfate de sodium. Le mélange est agité jusqu'à ce qu'on obtienne une solution claire à laquelle on ajoute 17,5 (0,117 M) d'iodure de sodium. Le sulfate-iodure cristallisé de dihydrostreptomycine commence bientôt à se séparer. Le mélan- ge est agité et refroidi dans un bain de glace pendant une heure. Le produit se sépare sous forme de fines aiguilles qui sont séparées par filtration, lavées à l'eau glacée et séchées à environ 50-60 . Le produit, qui a une cou- leur blanche, pèse 28,4 g. Il contient un peu de sels inorganiques et présen- te, à l'essai par une méthode microbiologique, une teneur de 605 mcg/mg.
Un rendement de 60 % est obtenu pour cette première récolte, basée sur la quan- tité de dibydrostreptomycine contenue dans le concentrat aqueux. La liqueur- mère, avec un volume de 53 ml, contient 128.000 mcg/ml de l'antibiotique (par un essai biologique et calculé comme dihydrostreptomycine). L'eau de lavage a un volume de 52 ml et donne à l'essai 113.000 mcg/ml. On recueille davanta- ge de sulfate-iodure de dihydrostreptomycine cristallisé en concentrant la liqueur-mère et l'eau de lavage sous vide. La quantité de la première récol- te est augmentée jusqu'à environ 745 mcg/ml par recristallisation.
On a constaté que le sulfate-iodure de dihydromannosidostrepto- mycine ne se sépare pas dans les mêmes conditions que celles décrites plus haut. Par conséquent, la méthode en question est utile pour séparer le com- posé mannosido, de valeur moindre et qui a une activité biologique considé- rablement inférieure à celle de la dihydrostreptomycine.
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On a constaté également que la solubilité de l'iodure-sulfate de dihydrostreptomycine est diminuée par la présence d'un excès d'iodure organique ou d'un excès de sulfate inorganique. Toutefois, un mélange d'io- dure et de sulfate inorganiques est plus efficace que chacun des sels inor- ganiques ci-dessus pour abaisser la solubilité de l'iodure-sulfate de dihy- drostreptomycine. Il est donc désirable de disposer toujours d'un excès des deux anions participants présents dans la solution.
REVENDICATIONS.
1. Procédé pour préparer un sel acide mixte de dihydrostrepto- mycine, dans lequel on ajoute à une solution aqueuse d'un sel acide unique de dihydrostreptomycine au moins un équivalent molaire (et de préférence deux) d'un sel qui est soluble dans l'eau et qui possède un anion inorga- nique différent.