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ESTERS POLYSULFURIQUES DES ESTERS METHYLIQUES DES ACIDES POLYGALACTURONIQUES
ET LEUR PROCEDE DE PREPARATION.
On sait que par sulfatation des pectines, que l'on considère comme étant des esters méthyliques des acides poly-galacturoniques estérifiés à différents degrés, on peut obtenir des esters acides polysulfuriques doués de propriétés biologiques analogues à celles de l'héparine. Jusqu'à présent la préparation de ces esters polysulfuriques se faisait par traitement de la pectine ou des produits de dégradation de la pectine, avec de l'acide chlorosulfonique dans de la pyridine, à des températures réactionnelles de 1000 environ. On a obtenu ainsi des composés qui empêchent la coagulation du sang in vitro et in vivo, mais qui sont doués dune toxicité considérable.
Leur effet de choc en particulier s'oppose à leur utilisation clinique comme anticoagulants et contre les thromboseso Ce n'est que par des méthodes compliquées de purification et de fractionnement que l'on a pu obtenir des produits qui peuvent être utilisés dans la thérapieo Il fallait alors veiller tout particulièrement à séparer complétement la pyridine extrêmement toxique, qui se fixe aux esters acides poly-sulfuriques de poids moléculaire élevé,non seulement avec formation d'un sel, mais aussi par adsorptiono En outre,lors de la sulfatation avec de l'acide chlorosulfonique dans de la pyridine, il se fait une transformation partielle du groupe carbométhoxylique des esters méthyliques des acides polygalacturoniques en un groupe carboxylique libre,
ce qui agit d'une façon défavorable sur la tolérance des esters polysulfuriques ainsi obtenus et de leurs produits de dégradation dans l'organisme.
La demanderesse a trouvé que l'on peut obtenir des esters polysulfuriques des esters méthyliques des acides polygalacturoniques (la pectine et ses produits de dégradation) ayant une teneur élevée en groupes méthoxyliques et dépourvus dans une large mesure d'impuretés nuisibles, lorsqu'on fait réagir à basse température de l'acide chlorosulfonique dans de la formamide, de préférence un mélange déjà préparé d'avance, sur les esters méthyliques des acides polygalacturoniques. Lorsqu'on introduit la pectine ou l'un de ses produits de dégradation partielle dans un mélange de composition ap-
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propriée, il se fait à température ordinaire.}) en quelques heures, une esterification très poussée, qui fournit directement un produit contenant 12 % de soufre ou plus.
La quantité diacide chloro-sulfonique utilisée pour la sulfatation d9une quantité définie de pectine.}) ainsi que le rapport selon lequel l'acide chloro-sulfonique et la formamide sont mélangés ont une influence considérable sur la vitesse de réaction, sur le rendement en substance active et sur sa toxicitéo La sulfatation doit se faire de manière à éviter autant que possible la scission des groupes carbométhoxyliques et par là une réduction de la teneur en groupes méthoxyliqueso Pour sulfater 1 partie d'esters méthyliques polygalacturoniques on a avantage à utiliser 1,5-à 3 parties en volume diacide chlorosulfonique dans 5 à 12 fois son volume de formamide.
Dans le cas où on utiliserait une quantité diacide chlorosulfonique plus élevée pour 1 partie d'esters méthyliques polygalacturoniques, on devrait utiliser une quantité de formamide relativement encore plus grandeo Dans ce cas, on laisse réagir le mélange plus longtemps, par exemple pendant 24 heures ou plus à 20-25 et on obtient ainsi un produit dont la teneur en groupes méthoxyliques est remarquablement peu réduite.
On peut isoler le produit de réaction d9une manière simpleo p.e. en versant le mélange réactionnel dans de l'alcool et en séparant le précipité par filtrationo On le sépare ainsi dans une large mesure des autres composantes du mélange réactionnelo Il est inutile de prendre d'autres mesures pour éliminer les impuretés fixées par adsorption, car elles s'y trouvent en quantités insignifiantes qui n'ont pas d'influence sur la toxicité du produit de réactiono Par réaction avec le carbonate ou le bicarbonate de sodium, on obtient de manière simple les sels sodiques des esters acides polysulfuriques des esters méthyliques polygalacturoniques.
Le produit de réaction a une teneur en groupes méthoxyliques qui correspond à peu près à celle du produit de départe
Pour le procédé de sulfatation conforme à l'invention, on peut prendre en considération les pectines de fruits, de feuilles et autres parties de plantes ainsi que leurs produits de dégradation partielle.
Il est évident que la sulfatation ne peut pas s'effectuer exactement de la même manière pour tous les produits de départ et il faut déterminer par des essais quelles sont les conditions de réaction les plus favorableso
On a intérêt à utiliser les produits de dégradation partielle de la pectine pour la raison que leurs esters polysulfuriques acides donnent des solutions aqueuses non visqueuses, même à concentration élevée, contrairement à ceux de la pectine elle-même, de sorte que ces esters polysulfuriques acides peuvent être injectés à des concentrations beaucoup plus élevées.
Il est évident que, lorsqu'on applique la nouvelle méthode de sulfatation améliorée aux produits de dégradation de la pectine, ses avantages ne ressortent que si la dégradation de la pectine n'a pas entraîné une diminution considérable de la teneur en groupes méthoxyliques, c.-à-d. une scission des groupes carbométhoxyliques.
Il faut donc que la dégradation de la pectine soit effectuée dans des conditions telles que la longueur des chaines de la molécule de pectine soit réduite alors que les groupes carbométhoxyliques restent parfaitement intacts. Lorsqu'on fait réagir sur la pectine la pectinase que l'on trouve dans le commerce, il se produit en général aussi bien une scission des chaines polysaccharidiques qu'une saponification rapide des groupes carbométhoxyliques, de sorte que le produit final est l'acide-galacturonique non estérifiéo Ceci provient probablement du fait que lespactinases contiennent comme impuretés des pectases,c.-àd.
les enzymes provoquant la scission des groupes carbométhoxyliques et qui sont très difficiles à éli- minero
La demanderesse a trouvé que l'on peut obtenir une scission partielle des chaînes pectiniques, laissant parfaitement intacts les groupes carbométhoxyliques, lorsqu'on laisse agir la préparation enzymatique sur la pectine pendant un temps relativement court, à faible concentration, à un pH de 2 à 3. Dans ces conditions, la pectinase présente une activité élevée, tandis que la pectase est pratiquement inactiveo Suivant l'origine et la composition des pectinasesa suivant la température et suivant la concentration,
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la durée de la réaction est plus ou moins longue.
Lorsque la température se trouve entre 10 et 40 la durée varie entre 1/2 heure et 24 heures. En ajou- tant de l'alcool au mélange réactionnel, on obtient un précipité de produits de dégradation qui se prêtent à la préparation d'esters acides polysulfuri- ques possédant une action anticoagulante élevée et une faible toxicité.
Les solutions aqueuses de tels esters polysulfuriques ont une viscosité peu éle- vée, de sorte qu'elles restent fluides et bien injectables, même à des con- centrations de 10 % ou pluso
On peut également effectuer la scission partielle de la chaîne pectinique dans des conditions analogues après la sulfatation des esters mé- thyliques des acides polygalacturoniques de poids moléculaire élevée Dans ce cas il se forme également des esters polysulfuriques de poids moléculaire moins élevé, présentant une activité anticoagulante élevée, une toxicité faible et dont les solutions aqueuses possèdent une faible viscosité. Par des déterminations de viscosité, on peut suivre l'action de dégradation de la pectinase sur les esters méthyliques polygalacturoniques ou leurs esters po- lysulfuriques.
On peut obtenir des produits intermédiaires ou des produits finaux plus ou moins visqueux et dont les chaines sont plus ou moins longues en interrompant l'action enzymatiques lorsqu'on a atteint une certaine visco- sitéo Les produits finaux moins visqueux sont relativement moins toxiques que ceux dont la viscosité est élevée. La durée de Inaction anticoagulante diminue avec la diminution de la viscosité, ce qui peut être avantageux ou non, suivant les circonstances; lorsque la durée d9action est courte, l'effet anticoagulant peut être plus facilement contrôlé et on peut le supprimer plus rapidement s'il se produit des complications, mais d'autre part, une durée d'action plus longue permet de réduire le nombre des injections.
Les exemples suivants illustrent l'invention. Les parties sont indiquées en poids.
Exemple 1
On mélange intimement 50 parties de pectine de citron dont la teneur en groupes méthoxyliques est de 6,79% et 1 partie de Pectinol 100 D (Pectinase commerciales Rohm et Haas, Philadelphie), puis on y ajoute en agitant 500 parties en volume d'acide acétique 0,4 n à température ordinaire (23 ) et on secoue pendant 1 heure. On chauffe ensuite jusqu'à décomposition de la pectinase. Dès que la température a atteint 60 on ajuste le pH à une valeur de 6 par addition de 10 parties d'acétate de sodium et 480 parties en volume de soude caustique normale, puis on continue à chauffer jusqu'à 80-900 et on filtre sur du kieselgur, après addition de 5 parties de charbon actif.
On ajoute au filtrat le double de son volume de méthanol et on filtre le précipité. Après avoir lavé avec du méthanol et de l'éther, on sèche au vide et on obtient 31 parties d'une poudre presque incolore.
On dissout 5 parties de ce produit de dégradation de la pectine dans 25 parties en volume de formamide et on verse cette solution à 10 dans un mélange de 45 parties en volume de formamide, et 11 parties en volume d'acide chlorosulfonique. On maintient le mélange à 20 pendant 6 heures en agitant énergiquement, puis on le verse dans 400 parties en volume de méthanol.
Le précipité incolore qui s'est formé est filtrée puis lavé, d'abord avec du méthanol, puis avec de l'éther et il est ensuite dissous dans 140 parties d'une solution de bicarbonate de sodium 0,5 no On le concentre ensuite à une pression de 14 mm de Hg jusqu9à ce que l'on puisse indiquer par la réaction de Nessler que tout l'ammoniac est éliminéo On neutralise le mélange par addition de 23 parties d'acide acétique 2 n et on chauffe pendant un moment au bain marie après addition de 6 parties de kieselgur. Après filtration, on peut précipiter l'ester polysulfurique acide sous la forme de son sel sodique en ajoutant au filtrat 5 fois son volume d'éthanol. Le précipité est filtré, lavé d'abord avec du méthanol puis avec de l'éther et séché au vide.
On obtient ainsi 6 parties d9une substance incolore, très facilement soluble dans 1?eau, avec une teneur de 3,96% de groupes méthoxyliques et de 12,5% de soufre. On peut utiliser de la pectine de pomme au lieu de pectine de citron.
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Exemple 2.
On dissout ou on met en suspension 5 parties de pectine de citron dans 20 parties en volume de formamide, puis on verse ce mélange rapidement à 15 dans un mélange de 10,5 parties en volume d'acide chlorosulfonique et 50 parties en volume de formamideo Puis on agite le mélange pendant 5 heures à 22 .On le verse ensuite dans 500 parties en volume de méthanol.
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POLYSULFURIC ESTERS OF METHYL ESTERS OF POLYGALACTURONIC ACIDS
AND THEIR PROCESS OF PREPARATION.
It is known that by sulphation of pectins, which are considered to be methyl esters of poly-galacturonic acids esterified to different degrees, polysulphuric acid esters endowed with biological properties similar to those of heparin can be obtained. Until now, the preparation of these polysulfuric esters has been carried out by treating pectin or the degradation products of pectin, with chlorosulfonic acid in pyridine, at reaction temperatures of approximately 1000. Compounds have thus been obtained which prevent blood coagulation in vitro and in vivo, but which are endowed with considerable toxicity.
Their shock effect in particular opposes their clinical use as anticoagulants and against thrombosis o It is only by complicated methods of purification and fractionation that it has been possible to obtain products which can be used in therapy. Particular care then had to be taken to completely separate the extremely toxic pyridine, which binds to poly-sulfuric acid esters of high molecular weight, not only with the formation of a salt, but also by adsorption o Furthermore, during sulphation with l 'chlorosulfonic acid in pyridine, there is a partial transformation of the carbomethoxylic group of the methyl esters of polygalacturonic acids into a free carboxylic group,
which acts unfavorably on the tolerance of the polysulphuric esters thus obtained and of their degradation products in the organism.
The Applicant has found that polysulfuric esters of the methyl esters of polygalacturonic acids (pectin and its degradation products) having a high content of methoxylic groups and largely devoid of harmful impurities can be obtained when making reacting at low temperature chlorosulfonic acid in formamide, preferably a mixture already prepared in advance, with the methyl esters of polygalacturonic acids. When pectin or one of its partial degradation products is introduced into a mixture of suitable composition
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propriée, it is done at room temperature.}) in a few hours, a very thorough esterification, which directly produces a product containing 12% sulfur or more.
The amount of dichloro-sulfonic acid used for the sulfation of a defined amount of pectin.}) As well as the ratio in which the chlorosulfonic acid and formamide are mixed have a considerable influence on the reaction rate, on the yield of substance. active and on its toxicity o The sulfation must be done in such a way as to avoid as much as possible the scission of the carbomethoxylic groups and thereby a reduction in the content of methoxylic groups o To sulfate 1 part of polygalacturonic methyl esters it is advantageous to use 1.5 -to 3 parts by volume of chlorosulfonic acid in 5 to 12 times its volume of formamide.
If a higher amount of dichlorosulfonic acid is used per 1 part of polygalacturonic methyl esters, a relatively even larger amount of formamide should be used. In this case, the mixture is left to react for longer, for example for 24 hours or more than 20-25 and thus a product is obtained in which the content of methoxylic groups is remarkably little reduced.
The reaction product can be isolated in a simple way: by pouring the reaction mixture into alcohol and separating the precipitate by filtration. In this way it is separated to a large extent from the other components of the reaction mixture. measures to remove the impurities fixed by adsorption, since they are found there in insignificant quantities which have no influence on the toxicity of the reaction product o By reaction with sodium carbonate or bicarbonate, the sodium salts of polysulfuric acid esters of polygalacturonic methyl esters.
The reaction product has a methoxylic group content which roughly corresponds to that of the starting product
For the sulphation process according to the invention, consideration may be given to pectins from fruits, leaves and other parts of plants as well as their partial degradation products.
It is obvious that the sulfation cannot be carried out in exactly the same way for all the starting products and it is necessary to determine by tests which are the most favorable reaction conditions.
It is advantageous to use the partial degradation products of pectin for the reason that their acidic polysulfuric esters give non-viscous aqueous solutions, even at high concentration, unlike those of pectin itself, so that these acidic polysulfuric esters can be injected in much higher concentrations.
It is evident that when the new improved sulphation method is applied to the degradation products of pectin, its advantages are only apparent if the degradation of the pectin has not resulted in a considerable decrease in the content of methoxyl groups, i.e. i.e. a scission of the carbomethoxylic groups.
The degradation of pectin must therefore be carried out under conditions such that the length of the chains of the pectin molecule is reduced while the carbomethoxylic groups remain perfectly intact. When commercially available pectinase is reacted with pectin, in general both polysaccharide chain cleavage and rapid saponification of the carbomethoxylic groups occur, so that the end product is the acid. - unesterified galacturonic This is probably due to the fact that impactinases contain pectases as impurities, i.e.
enzymes which cause the cleavage of carbomethoxylic groups and which are very difficult to eliminate
The Applicant has found that it is possible to obtain a partial cleavage of the pectinic chains, leaving the carbomethoxylic groups perfectly intact, when the enzymatic preparation is allowed to act on the pectin for a relatively short time, at low concentration, at a pH of 2. to 3. Under these conditions, the pectinase exhibits a high activity, while the pectase is practically inactive o Depending on the origin and the composition of the pectinasesa depending on the temperature and the concentration,
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the duration of the reaction is more or less long.
When the temperature is between 10 and 40 the duration varies between 1/2 hour and 24 hours. By adding alcohol to the reaction mixture a precipitate of degradation products is obtained which lend themselves to the preparation of polysulfuric acid esters having high anticoagulant action and low toxicity.
Aqueous solutions of such polysulphuric esters have a low viscosity, so that they remain fluid and well injectable, even at concentrations of 10% or more.
Partial cleavage of the pectinic chain can also be carried out under analogous conditions after sulfation of the methyl esters of high molecular weight polygalacturonic acids. In this case also forms polysulfuric esters of lower molecular weight, exhibiting anticoagulant activity. high, low toxicity and aqueous solutions of low viscosity. By viscosity determinations, the degrading action of pectinase on polygalacturonic methyl esters or their polysulfuric esters can be followed.
Intermediate products or end products that are more or less viscous and whose chains are more or less long can be obtained by interrupting the enzymatic action when a certain viscosity has been reached o The less viscous end products are relatively less toxic than those whose viscosity is high. The duration of anticoagulant inaction decreases with decreasing viscosity, which may or may not be advantageous, depending on the circumstances; when the duration of action is short, the anticoagulant effect can be more easily controlled and can be suppressed more quickly if complications occur, but on the other hand, a longer duration of action makes it possible to reduce the number of injections.
The following examples illustrate the invention. Parts are given by weight.
Example 1
50 parts of lemon pectin, the content of methoxylic groups of which is 6.79% and 1 part of Pectinol 100 D (commercial pectinase Rohm and Haas, Philadelphia) are intimately mixed, then 500 parts by volume of 0.4 n acetic acid at room temperature (23) and shaking for 1 hour. Then heated until decomposition of pectinase. As soon as the temperature has reached 60, the pH is adjusted to a value of 6 by adding 10 parts of sodium acetate and 480 parts by volume of normal caustic soda, then heating is continued to 80-900 and filtered. on kieselguhr, after addition of 5 parts of activated carbon.
Double its volume of methanol is added to the filtrate and the precipitate is filtered off. After washing with methanol and ether, it is dried in vacuo and 31 parts of an almost colorless powder are obtained.
5 parts of this pectin degradation product are dissolved in 25 parts by volume of formamide and this 10 parts solution is poured into a mixture of 45 parts by volume of formamide, and 11 parts by volume of chlorosulfonic acid. The mixture is kept at 20 for 6 hours with vigorous stirring, then poured into 400 parts by volume of methanol.
The colorless precipitate which has formed is filtered and then washed, first with methanol, then with ether and it is then dissolved in 140 parts of a 0.5N sodium bicarbonate solution. It is then concentrated. at a pressure of 14 mm Hg until it can be indicated by the Nessler reaction that all the ammonia has been removed. The mixture is neutralized by the addition of 23 parts of 2 n acetic acid and heated for a while at water bath after addition of 6 parts of diatomaceous earth. After filtration, the acidic polysulfuric ester can be precipitated in the form of its sodium salt by adding to the filtrate 5 times its volume of ethanol. The precipitate is filtered, washed first with methanol then with ether and dried in vacuo.
This gives 6 parts of a colorless substance, very easily soluble in water, with a content of 3.96% methoxylic groups and 12.5% sulfur. You can use apple pectin instead of lemon pectin.
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Example 2.
5 parts of lemon pectin are dissolved or suspended in 20 parts by volume of formamide, then this mixture is rapidly poured at 15 into a mixture of 10.5 parts by volume of chlorosulfonic acid and 50 parts by volume of formamideo The mixture is then stirred for 5 hours at 10 p.m. It is then poured into 500 parts by volume of methanol.