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PROCEDE DE PREPARATION D'UN ANTICOAGULANT DE SYNTHESE.
Depuis que l'on a mis en évidence la présence de groupes ester sulfurique dans la molécule de l'héparine naturelle, on a préparé de nombreux dérivés de polysaccharides possédant dans leur molécule un certain nombre de groupes -O.SO3H, dans l'espoir de trouver un composé présentant envers le sang Inactivités anticoagulante de l'héparine. Celle-ci est d'un accès diffi- cile et la quantité- disponible est nettement insuffisante. Les tentatives de suppléer par des produits de synthèse n'ont cependant pas eu le succès voulu, car ces produits ne possèdent qu'Une activité anticoagulante très ré- duite par rapport à l'héparine naturelle, et accusent en même temps une toxi- cité plus forte.
Dans son ouvrage "Heparin" (Londres, 1946,2e édit.p.49), J.E. JOBPES indique comme activité d'un certain nombre de produits:
EMI1.1
<tb> l'héparine <SEP> naturelle <SEP> la <SEP> plus <SEP> pure <SEP> 13
<tb>
<tb>
<tb> l'acide <SEP> chondroitine <SEP> polysulfurique <SEP> synthétique <SEP> 1,5-2
<tb>
<tb>
<tb> l'acide <SEP> chitine <SEP> disulfurique <SEP> 1,5
<tb>
<tb>
<tb> l'acide <SEP> cellulose <SEP> trisulfurique <SEP> 1
<tb>
<tb>
<tb> l'ester <SEP> polysulfurique <SEP> de <SEP> l'acide <SEP> pectique <SEP> 1
<tb>
<tb>
<tb> l'acide <SEP> trisulfurique <SEP> de <SEP> l'amidon <SEP> 0,
5
<tb>
<tb>
<tb> l'acide <SEP> trisulfurique <SEP> de <SEP> glycogène <SEP> 1/12-1/3
<tb>
<tb>
<tb> l'ester <SEP> sulfurique <SEP> de <SEP> la¯gomme <SEP> arabique <SEP> 1/4
<tb>
<tb>
<tb> l'ester <SEP> sulfurique <SEP> de <SEP> l'acide <SEP> nucléique <SEP> de <SEP> levure <SEP> 1/2
<tb>
Selon KARRER et col. (Helv. chim. Acta, 26, (1943).,1296-1315), la toxicité de ces produits est 3 à 4 fois plus grande que celle de l'hépa- rine. Ces auteurs ont montré que la toxicité peut être réduite par l'intro- duction dans la molécule de polysàccharide d'un groupe acide comme l'acide glycolique avant 1-'estérification par le groupement sulfurique. L'activité étant peu modifiée., il ne résulte de ce traitement pas de produit pouvant fa- vorablement remplacer l'héparine.
Plus récemment, MAURER et VINCKE (Chem.Bre.80, (1947), 179-187) ont obtenu un produit anticoagulant bien soluble en convertissant de la cel- lulose par N2O4 en acide uronique (carboxy-cellulose) et en estérifiant celui- ci par le groupement sulfurique. Les auteurs reconnaissent que la dose tolérée
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de leurs produits est 3 à 4 fois inférieure à celle de l'héparine et que leur activité anticoagulante n'atteint que 17 à 25 % de celle du produit naturel.
La présente invention se rapporte à la préparation d'un produit anticoagulant dont l'activité est plus rapprochée de celle de l'héparine que c'est le cas pour les produits cités et dont la dose tolérée dépasse même celle de l'héparine. Le procédé selon l'invention utilise comme matière de départ de l'acide alginique. Celui-ci est d'abord partiellement dégradé et ensuite estérifié par l'introduction de groupes sulfuriques et rendu so- luble dans l'eau par salification.
L'acide alginique est extrait des algues et se trouve dans le commerce sous forme du sel sodique., dont il peut facilement être libéré. Il représente un composé à poids moléculaire élevé., de l'ordre dé 145.000., cor- respondant à la formule brute C6H8O6 et devant être considéré comme un acide uronique naturel. Ses propriétés et emplois sont décrits par exemple dans le tome I de "Encyclopedia of chemical Technology" de KIRK et OTHMER, aux pa- ges 343-353 (voir au mot "algin"), Il est connu que l'acide alginique ne se laisse que difficilement attaquer par les moyens chimiques ordinaires.
Ain- si, l'acétylation ne s'effectue pas à l'ébullition avec de l'anhydride acé- tique ou de l'acétate de soude anhydre, même en présence de pyridine ou d'acide sulfurique.
On a maintenant trouvé que l'acide alginique partiellement dé- gradé peut être soumis à l'estérification sulfurique et qu'il est possible d'introduire dans sa molécule le nombre désiré de groupes -O.SO3H. L'estéri- fication est de préférence exécutée par l'intermédiaire d'une suspension py- ridinique d'acide anhydro-pyridinesulfurique. Cette suspension est préparée d'après une méthode de BAUMGARTEN (Ber. Dtsch. chem.Ges.59, (1926), 1166-71) en introduisant avec précaution de 1-'acide chlorosulfonique dans de la pyri- dine.
L'acide alginique partiellement dégradé est introduit dans cette sus- pension et selon la durée et la température de réaction choisies, un plus ou moins grand nombre de groupes hydroxyles de l'acide alginique est estérifié.
Il est .êvident que l'invention comprend tout autre moyen permettant l'esté- rification sulfurique de l'acide alginique au préalable partiellement dégra- dé, tel que par l'anhydride sulfurique.
La dégradation plus ou moins accentuée de l'acide alginique peut s'effectuer par tous les moyens connus, en usage pour opérer la saccharifi- cation plus ou moins complète de la cellulose. On utilise par exemple de l'acide chlorhydrique aqueux ou alcoolique à chaud ou à froids de l'acide sulfurique à 80 % à froid, de l'anhydride sulfureux ou de l'anhydride carbo- nique en autoclave, de l'acide formique, de l'acide phosphorique., etc. Une dégradation trop poussée de l'acide alginique conduit., après estérification à l'obtention d'un produit qui ne possède- qu'un faible pouvoir anticoagulant,. même si la teneur en soufre est correcte, c'est-à-dire même si tous les grou- pes hydroxyles sont estérifiés par l'acide sulfurique.
On a trouvé que l'a- cide alginique dégradé jusqu'à un poids moléculaire moyen compris entre 10.000 et 50.000 donne, après estérification, un produit très peu toxique ayant un. pouvoir anticoagulant intéressant.
Il est à remarquer que, - comme pour 1-' héparine, le produit préci- pite par l'action du sulfate de protamine, ce qui permet la cessation rapide de l'activité anticoagulante, lorsque cela est jugé utile. Aussi, le sel de baryum est peu soluble, et il est possible de purifier le produit par double décomposition.
Exemple 1.
On soumet de l'acide alginique à une dégradation partielle en le chauffant à reflux., pendant 24 heures, avec du méthanol contenant 10 % d'HCl.
Le produit est filtré, lavé à l'eau jusqu'à disparition de l'ion de chlore et séché à poids constant au vide sur l'acide sulfurique et ensuite finement broyé. Son poids moléculaire est d'environ 24.000.
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On introduit rapidement 5 g d'acide alginique ainsi dégradé dans une suspension d'acide anhydropyridinesulfurique obtenue par addition de 10 cm3 d'acide chlorosulfonique à 125 cm3 de pyridine se trouvant dans un ballon à trois tubulures refroidi par un mélange réfrigérant. On chauffe lentement jusque a 100 G et on maintient le mélange à cette température pen- dant 24 heures. Après. refroidissement, on reprend par de l'alcool et on fil- tre. Le filtrat est écarté-. Le précipité est constitué en majeure partie par le sel de pyridine de l'acide alginique-sulfurique, On le dissout dans environ 400 de eau distillée et on ajoute une solution de soude causti- que jusqu'à virage de la phénolphtaléine.
On filtre sur du kieselguhr et on précipite le filtrat par addition de 400 cm3 d'alcool ordinaire. Le pré- cipité essoré est alors redissous dans de l'eau distillée et soumis à la dialyse (membrane de cellophane) jusqu'à disparition complète des ions sul- furiques.
Après concentration à environ 400 cm3 et décoloration éventuel- le, on précipite le sel sodique par 800 cm3 d'alcool. Par dessication, on obtient un produit titrant 15,64 % de soufre (calculé pour C12H10O24S4Na6: %S = 15,92 %). Le poids moléculaire du produit est d'environ 20.000.
Exemple 2.
On triture 25 g d'acide alginique avec 75 cm3 d'acide sulfuri- que de 80 % et on maintient la masse pendant 3 heures vers 30 G. Puis on la verse dans 750 cm3 d'acétone, on agite, filtre, lave soigneusement à l'acé- tone et sèche à poids constant.
L'acide alginique ainsi dégradé est estérifié au moyen de 20cm3 d'acide chlorosulfonique dans 250 cm3 de pyridine pendant 16 heures à la tem- pérature de 80 c. Le produit de réaction est traité comme indiquaci-dessus et on obtient un produit anticoagulant dont la teneur en soufre est de .
12,30 %.
Exemple 3.
De l'acide alginique est partiellement dégradé en l'agitant pendant environ 2 heures à température ambiante avec de l'acide chlorhydri- que hydroalcoolique à 5 % d'HGl. Le produit de dégradation accuse un poids moléculaire de 80.000. L'estérification et le traitement subséquent se font comme indiqué dans l'exemple 1. On obtient un composé dont la teneur en sou- fre varie de 10,40 à 10,80 %. Le sel sodique de l'ester sulfurique possède une toxicité plus grande que le produit de l'exemple 1.
Exemple 4.
L'acide alginique est partiellement dégradé en le chauffant dans un autoclave sous une pression de 105 kg/cm2 pendant 5 heures à 150 C en présence d'eau et d'anhydride carbonique.'On filtre après refroidisse- ment et le précipité, redissous par la- soude caustique diluée, est décolo- ré par dù noir animal. Puis, on reprécipite par de- 1-' acide chlorhydrique dilué, on filtre, lave et sèche.
L'acide alginique partiellement dégradé de cette manière est estérifié selon l'exemple 1. On obtient un composé d'une teneur en soufre de 15,33 %.
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PROCESS FOR PREPARING A SYNTHETIC ANTICOAGULANT.
Since the presence of sulfuric ester groups in the natural heparin molecule has been demonstrated, many polysaccharide derivatives have been prepared having in their molecule a certain number of -O.SO3H groups, in the hope to find a compound exhibiting anticoagulant inactivities of heparin towards the blood. This is difficult to access and the quantity available is clearly insufficient. Attempts to supplement with synthetic products have not, however, had the desired success, because these products have only a very reduced anticoagulant activity compared to natural heparin, and at the same time show toxicity. stronger.
In his work "Heparin" (London, 1946, 2nd ed. P.49), J.E. JOBPES indicates the activity of a certain number of products:
EMI1.1
<tb> heparin <SEP> natural <SEP> the <SEP> plus <SEP> pure <SEP> 13
<tb>
<tb>
<tb> <SEP> chondroitin <SEP> polysulfuric acid <SEP> synthetic <SEP> 1.5-2
<tb>
<tb>
<tb> <SEP> chitin <SEP> disulfuric acid <SEP> 1.5
<tb>
<tb>
<tb> <SEP> cellulose <SEP> trisulfuric acid <SEP> 1
<tb>
<tb>
<tb> polysulfuric <SEP> ester <SEP> of <SEP> pectic acid <SEP> <SEP> 1
<tb>
<tb>
<tb> <SEP> trisulfuric acid <SEP> from <SEP> starch <SEP> 0,
5
<tb>
<tb>
<tb> <SEP> trisulfuric acid <SEP> from <SEP> glycogen <SEP> 1 / 12-1 / 3
<tb>
<tb>
<tb> <SEP> sulfuric ester <SEP> of <SEP> arabic <SEP> <SEP> 1/4
<tb>
<tb>
<tb> <SEP> sulfuric ester <SEP> of <SEP> <SEP> nucleic acid <SEP> of <SEP> yeast <SEP> 1/2
<tb>
According to KARRER et al. (Helv. Chim. Acta, 26, (1943)., 1296-1315), the toxicity of these products is 3 to 4 times greater than that of heparin. These authors have shown that the toxicity can be reduced by the introduction into the polysaccharide molecule of an acid group such as glycolic acid before esterification by the sulfuric group. As the activity is little modified, no product results from this treatment which can favorably replace heparin.
More recently, MAURER and VINCKE (Chem.Bre. 80, (1947), 179-187) obtained a well soluble anticoagulant product by converting cellulose with N2O4 into uronic acid (carboxy-cellulose) and by esterifying it. ci by the sulfuric group. The authors recognize that the tolerated dose
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of their products is 3 to 4 times lower than that of heparin and that their anticoagulant activity is only 17 to 25% of that of the natural product.
The present invention relates to the preparation of an anticoagulant product, the activity of which is closer to that of heparin than is the case for the products mentioned and of which the tolerated dose even exceeds that of heparin. The process according to the invention uses as starting material alginic acid. This is first partially degraded and then esterified by the introduction of sulfuric groups and made soluble in water by salification.
Alginic acid is extracted from algae and is found commercially in the form of sodium salt, from which it can easily be released. It represents a compound with a high molecular weight, of the order of 145,000., Corresponding to the molecular formula C6H8O6 and to be regarded as a natural uronic acid. Its properties and uses are described, for example, in volume I of "Encyclopedia of chemical Technology" by KIRK and OTHMER, on pages 343-353 (see under the word "algin"). It is known that alginic acid does not form. leaves that hardly attacked by ordinary chemical means.
Thus, the acetylation does not take place at the boil with acetic anhydride or anhydrous sodium acetate, even in the presence of pyridine or sulfuric acid.
It has now been found that partially degraded alginic acid can be subjected to sulfuric esterification and that it is possible to introduce into its molecule the desired number of -O.SO3H groups. The esterification is preferably carried out via a pyridinic suspension of anhydro-pyridinesulfuric acid. This suspension is prepared according to a method of BAUMGARTEN (Ber. Dtsch. Chem.Ges.59, (1926), 1166-71) by carefully introducing 1-chlorosulfonic acid in pyridine.
The partially degraded alginic acid is introduced into this suspension and depending on the reaction time and temperature chosen, a greater or lesser number of hydroxyl groups of the alginic acid is esterified.
It is obvious that the invention comprises any other means allowing the sulfuric esterification of the previously partially degraded alginic acid, such as by sulfuric anhydride.
The more or less accentuated degradation of the alginic acid can be carried out by all the known means in use to effect the more or less complete saccharification of the cellulose. For example, hot or cold aqueous or alcoholic hydrochloric acid is used, 80% cold sulfuric acid, sulfur dioxide or carbonic anhydride in an autoclave, formic acid, etc. phosphoric acid., etc. Excessive degradation of alginic acid leads., After esterification, to obtaining a product which has only a weak anticoagulant power. even if the sulfur content is correct, ie even if all the hydroxyl groups are esterified with sulfuric acid.
It has been found that alginic acid degraded to an average molecular weight between 10,000 and 50,000 gives, after esterification, a very low toxicity product having a. interesting anticoagulant power.
It should be noted that, as for 1-heparin, the product precipitates by the action of protamine sulphate, which allows the rapid cessation of the anticoagulant activity, when this is considered useful. Also, the barium salt is poorly soluble, and it is possible to purify the product by double decomposition.
Example 1.
Alginic acid is subjected to partial degradation by heating it under reflux for 24 hours with methanol containing 10% HCl.
The product is filtered, washed with water until the disappearance of the chlorine ion and dried to constant weight in vacuum over sulfuric acid and then finely ground. Its molecular weight is around 24,000.
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5 g of alginic acid thus degraded are rapidly introduced into a suspension of anhydropyridinesulfuric acid obtained by adding 10 cm3 of chlorosulfonic acid to 125 cm3 of pyridine in a three-necked flask cooled by a cooling mixture. Slowly heat up to 100 G and maintain the mixture at this temperature for 24 hours. After. cooling, the residue is taken up in alcohol and filtered. The filtrate is discarded. The precipitate consists mainly of the pyridine salt of alginic-sulfuric acid. It is dissolved in about 400 of distilled water and a solution of caustic soda is added until the phenolphthalein changes.
It is filtered through kieselguhr and the filtrate is precipitated by adding 400 cm3 of ordinary alcohol. The drained precipitate is then redissolved in distilled water and subjected to dialysis (cellophane membrane) until complete disappearance of the sulfuric ions.
After concentration to about 400 cm3 and possible discoloration, the sodium salt is precipitated with 800 cm3 of alcohol. By desiccation, a product titrating 15.64% sulfur is obtained (calculated for C12H10O24S4Na6:% S = 15.92%). The molecular weight of the product is approximately 20,000.
Example 2.
25 g of alginic acid are triturated with 75 cm3 of 80% sulfuric acid and the mass is maintained for 3 hours at around 30 G. Then it is poured into 750 cm3 of acetone, stirred, filtered, washed thoroughly. acetone and dry to constant weight.
The alginic acid thus degraded is esterified by means of 20 cm3 of chlorosulphonic acid in 250 cm3 of pyridine for 16 hours at a temperature of 80 ° C. The reaction product is treated as indicated above and an anticoagulant product is obtained, the sulfur content of which is.
12.30%.
Example 3.
Alginic acid is partially degraded by stirring it for about 2 hours at room temperature with 5% HG1 hydroalcoholic hydrochloric acid. The degradation product has a molecular weight of 80,000. The esterification and the subsequent treatment are carried out as indicated in Example 1. A compound is obtained with a sulfur content ranging from 10.40 to 10.80%. The sodium salt of the sulfuric ester has a greater toxicity than the product of Example 1.
Example 4.
Alginic acid is partially degraded by heating it in an autoclave under a pressure of 105 kg / cm2 for 5 hours at 150 ° C. in the presence of water and carbon dioxide. After cooling, the mixture is filtered and the precipitate is redissolved. by dilute caustic soda, is discolored by animal black. Then, it is reprecipitated with dilute hydrochloric acid, filtered, washed and dried.
The alginic acid partially degraded in this way is esterified according to Example 1. A compound with a sulfur content of 15.33% is obtained.