<Desc/Clms Page number 1>
La présente invention a pour objet l'atténuation du virus rabjque virulent en une forme non pathogène sans perte appréciable de ses propriétés antigènes, et la préparation u'un vaccin antirabique à partir de cette forme non pathogène.
La rage est une maladie déjà connue depuis les temps anciens, et les manifestations cliniques, la pathologie, l'épidémiologie, ainsi que d'autres caractéristiques de la maladie, ont été bien cataloguées et sont maintenant bien connues de l'homme de l'art. Actuellement, la rage est toujours une menace sérieuse pour les animaux, y compris l'homme, dans beaucoup de parties du monde, et même aux Etats-Unis, on signale que des années 1938 à 1945, une moyenne d'environ 8000 chiens par an sont morts de la rage.
Depuis de longues années, des tentatives ont été faites pour cré- er un vaccin sûr et efficace pour la prévention de la rage, et en fait, de grands succès ont été signalés ces dernières années avec des vaccins antira- biques phénolisés ou carbolisés. Toutefois, il est bien reconnu que ces vac- cins souffrent de divers défauts. En premier lieu, comme avec tous les vaccins de virus tués, la protection obtenue avec le vaccin antirabique phénolisé n'est pas durable, et la vaccination annuelle est généralement recommandée. Un deuxième inconvénient de ces vaccins, est qu'ils sont habituellement préparés à partir de tissus cérébraux du lapin, et que l'usage de ces tissus dans un vaccin ne peut être considéré comme offrant toute sécurité, étant donné les constatations croissantes d'accidents neuroparalytiques consécutifs à leur usage.
Un troisième inconvénient de ces vaccins est leur prix de revient élevé, dû au processus compliqué nécessaire à leur préparation.
Comme on pouvait s'y attendre étant donné les désavantages et les limitations dont souffrent les vaccins antirabiques de virus tués, on a fait de nombreuses tentatives pour créer un vaccin antirabique à base de virus,qui soit sûr et véritablement atténué. Mais ces tentatives se sont heurtées à un échec, ou tout au plus, elles ont eu un succès limité, à cause de la tendance que présente le virus rabique à garder des caractéristiques fixes après un nombre de passages relativement réduit dans un sujet donné, Autrement dit, quand le virus rabique a passé, en série, par un sujet donné, il subit généralement un certain degré d'atténuation pendant les premiers passages, et atteint ensuite un point où de nouveaux passages en série ne modifient pas les caractéristiques du virus dans une mesure importante.
Par exemple, on a fait passer dans des lapins en plus de 2000 passages en série, des souches de virus provenant de Pasteur et aptes à se développer chez le lapin, sans que les caractéristiques de la souche primitive de Pasteur soient notablement modifiées. Malgré la tendance générale que présente le virus rabique à se fixer après quelques passages en série seulement, on a constaté que l'on peut obtenir un virus rabique vivant véritablement atténué et préparer un vaccin sûr par les nouveaux procédés de la présente invention.
Conformément à l'invention, on fournit une méthode pour atténuer le virus rabique virulent en une forme non pathogène sans perte appréciable de ses propriétés antigènes, qui consiste à introduire le virus rabique virulent dans un oeuf en incubation, à laisser le virus s'y développer pendant un certain temps, à enlever de cet oeuf en incubation des particules de virus et à les introduire dans un autre oeuf en incubation, et à continuer le passage en série du virus rabique d'un oeuf en incubation à un autre oeuf en incubation, jusqu'à ce que l'on ait fait au moins 150 passages dans des oeufs en incubation, et jusqu'à ce que le virus ait perdu son caractère pathogène.
Toujours conformément à l'invention, on fournit une méthode pour préparer un vaccin antirabique, qui consiste à récupérer des particules de virus dans les oeufs en incubation et à préparer avec elles un vaccin antirabique qui n'est pas pathogène mais qui est capable de produire des anticorps protecteurs contre la rage lorsqu'on l'injecte à des mammifères sujets à la rage.
Les nouveaux vaccins de la présente invention, préparés à partir du virus rabique entièrement attériué, surmontent beaucoup des invonvénients
<Desc/Clms Page number 2>
et des limitations .dont souffraient les vaccins antirabiques à base de virus tués de la technique antérieure. Les nouveaux vaccins de la présente invention sont relativement peu coûteux, produisent .:une immunité -relativement durable, et sont pratiquement exempts -de tissus nerveux centraux, de sorte que l'on ne rencontre pas de difficultés avec les réactions neuroparalytiques.
Les nouveaux vaccins de la présente invention ont'l'avantage supplémentaire que le procédé,de fabrication est grandement simplifié, par suite principalement du fait que le virus employé dans la préparation des vaccins se propage dans des embryons d'oeuf, contrairement à l'utilisation des lapins dans la technique antérieure. Lorsqu'on emploie un animal tel que le lapin pour le développement d'un virus destiné aux vaccins, l'animal doit d'abord être examiné par un vétérinaire, mis en quarantaine pendant un certain laps de temps,1subir dans beaucoup de cas des tests de dépistage de la tuberculose et d'autres maladies, et être ensuite traité par les antibiotiques ou d'autres corps chimiothérapeutiques pour les rendre exempts d'infection bactérienne.
En outre, la région à inoculer doit être rasée, lavée et stérilisée. Contrairement à ce processus compliqué,les seules opérations nécessaires pour inoculer un embryon d'oeuf sont de s'assurer d'abord que les oeufs sont exempts de S. Pullorum, puis de mirer l'oeuf et de percer une petite ouverture en un point choisi pour l'injection du virus d'ensemencement. Un autre avantage des vaccins préparés avec l'embryon d'oeuf est que l'on rencontre moins de manifestations allergiques indésirables dans l'usage des vaccins préparés avec les embryons d'oeuf qu'avec toute autre matière.
Toutefois, l'avantage le plus important des nouveaux vaccins de la présente invention, est que le degré d'atténuation au virus est si grand que l'on peut les employer avec une sécurité à peu près complète. Dans le passé, on a employé des virus vivants partiellement atténués pour la pré tion des maladies neurotropiques, spécialement chez les animaux domestiques, alors même que le degré d'atténuation était tel que, si les vaccins étaient injectés par voie intracérébrale, la paralysie ou même la mort pouvait survenir. Cela parait possible uniquement parce que l'organisme animal produit suffisamment d'anticorps, lorsqu'on fait l'injection par voie intramusculaire ou sous-cutanée, avant que le virus vivant n'ait eu le temps de s'établir dans le système nerveux.
Mais, le vaccin ne peut être considéré entièrement sûr, aussi longtemps qu'il reste possible que le virus pénètre dans le système nerveux, avant que la teneur en anticorps ait atteint un niveau suffisamment élevé, le virus pouvant ainsi causer la paralysie ou la mort. Les nouveaux vaccins de l'invention sont si complètement atténués que, même si on les injecte directement dans les tissus cérébraux ae plusieurs sortes d'animaux connus pour être sujets à la rage dans une mesure inaccoutumée, on ne peut observer aucun effet nuisible sérieux. On p'eut voir que c'est à la fois un avantage réel et un avantage psychologique, et que cela permet d'envisager l'utilisation future du vaccin dans tous les cas où l'immunisation contre la rage est jugée désirable.
Dans la mise en oeuvre du nouveau procédé de la présente invention, on obtient un virus rabique vivant atténué grâce aux étapes suivantes; inoculer avec le virus rabique des oeufs en incubation, en an point quelconque, de préférence la membrane vitelline ou la membrane allantoïde, au bout d'un temps d'incubation de cinq à neuf jours ; récolter le virus sur l'embryon de poussin cinq à douze jours après l'inoculation, utiliser le virus ainsi récolté pour inoculer un deuxième embryon de poussin vieux de cinq à neuf jours, et continuer le passage en série du virus rabique, jusqu'à ce qu'on ait accompli air moins 150 passages dans des embryons de poussin.
Après environ 150 à 200 passages dans des embryons de poussin, on a constaté que le virus rabique subit une modification marquée et rapide de ses propriétés pathogènes, de sorte qu'il devient non virulent, même pour des souris de quatorze jours lorsqu'on l'injecte par voie intracérébrale. La souris est bien connue pour être l'un des animaux les plus sujets àla rage, et on croit que
<Desc/Clms Page number 3>
c'est le premier exemple d'un virus atténué que l'on peut injecter par voie intracérébrale à haute concentration sans causer la mort. Mais il est enco- re plus surprenant que le virus garde le même pouvoir antigène qu'un virus qui a suoi seulement quelques passages dans des oeufs.
Autrement dit, les virus atténués de la présente invention donnent une excellente réaction im- munologique, alors même qu'ils ont perdu leur faculté de provoquer la rage typique lorsqu'ils sont injectés par voie intracérébrale.
On peut utiliser dans le procédé nouveau de la présente invention presque toutes les souches de virus que l'on peut trouver. Contrairement à beaucoup d'autres virus, on éprouve très peu de difficulté à provoquer le développement uans les embryons d'oeuf, et ce, pour presque toutes les sou- ches de virus rabique. Pratiquement toutes les souches de virus rabiques peu- vent être cultivées sur ce sujet, grâce à quelques passages alternés d'embryon d'oeuf à souris ou autre sujet, et de nouveau à l'embryon d'oeuf, et avec la plupart des souches de virus rabiques, ces passages alternés ne sont pas nécessaires, et le virus s'adapte facilement à la culture dans l'embryon d'oeuf au bout de quelques passages en série.
Il est donc possible d'utiliser du virus courant pour préparer les nouveaux vaccins de la présente invention, mais il est souvent avantageux d'utiliser une souche de virus qui a été "fixée" par dés passages en série dans un sujet animal.
Quand on fait passer en série du virus courant dans des animaux tels que lapins ou cobayes, le virus subit d'abord des changements rapides, de sorte que sa période d'incubation raccourcit notablement, que son pouvoir infectieux croit et que d'autres modifications se produisent. Toutefois, après un certain nombre de passages, généralement de vingt à quatre-vingts environ, la souche se fixe relativement dans ses caractéristiques, de sorte que de nouveaux passages ne changent pas appréciablement la nature du virus. Il existe beaucoup de souches de virus fixés que l'on peut trouver aujourd'hui, et à peu près toutes conviennent pour servir à la préparation des nouveaux vaccins de la présente invention.
Toutefois, s'il est vrai que l'on peut utiliser n'importe laquelle de ces souches de virus fixé dans le nouveau procédé de la présente invention, il est généralement avantageux de choisir une souche connue pour avoir un faible caractère pathogène, et une souche qui est connue pour donner une forte réaction immunologique.
La souche "flury" de virus fixé est excellente pour servir dans le procédé nouveau de la présente invention. Cette souche de virus a été primitivement isolée et fixée par passage en série dans les tissus cérébraux de poussins. On le trouve à la Rockfeller Foundation, New-York City. Ses propriétés la rendent particulièrement apte à servir aans le nouveau procédé de la présente invention. Par exemple, la souche présente un faible pouvoir pathogène vis-à-vis des lapins, comme on l'a déterminé par inoculation intracérébrale au 50ème passage en oeuf, et s'il est vrai que le virus produit une rage mortelle si on l'injecte à des chiens par voie intracérébrale, les glandes salivaires des animaux atteints restent exemptes de virus.
Malgré ces caractéristiques relativement faibles, la souche "Flury" de virus donne une réaction immuhologique élevée, en comparaison d'autres souches de virus rabique fixé.
La souche Flury de virus rabique peut être transmise en série à des embryons de poussin, sans nécessité de passages alternés; toutefois, on a noté qu'il y a une chute appréciable dans la D. M. 50 chez les jeunes poussins et souris, pendant les premiers passages en oeuf. A bout du dixième ou quinzième passage environ, on trouvera que la D. M. 50 du virus, tant chez les poussins que les souris, est à un niveau raisonnablement élevé, et reste relativement constante au cours de passages successifs, jusqu'à ce qu'on remarque un changement marqué, vers le 150ème ou 200ème passage en oeuf.
A ce moment, le caractère pathogène de la souche, pour la souris comme pour d'autres animaux, diminue notablement, de sorte que des souris de quatorze jours et plus ne sont pas atteintes mortellement par la rage, même. après injection intracérébrale du virus atténué.
<Desc/Clms Page number 4>
Bien qu'il soit préférable que le virus soit atténué par passa- ge direct en série dans le tissu embryonnaire de poussin en développement, on peut trouver désirable, aux fins d'essais ou pour préparer une masse de stockage, d'interrompre les passages en série en cultivant le virus sur d'autres sujets, tels que poussins d'un jour ou jeunes souris. Les passages en série peuvent alors être repris dans l'oeuf en incubation. Les oeufs de poule sont préférables, à cause de leurs bas prix de revient, et de la pos- sibilité de les trouver continuellement, mais l'usage d'oeufs d'autres oi- seaux n'est pas exclus.
En bref, la méthode la plus intéressante pour cultiver le virus atténué et en préparer un vaccin, peut être récapitulée comme suit.
On choisit des oeufs fécondés de cinq à neuf jours, de volailles exemptes de S.Pullorum, et on ouvre la coquille à l'extrémité correspondant à la chambre à air, avec une vrille, et on l'ensemence avec 0,5 cm3 de virus rabique ayant subi plus de 150 passages en oeuf, et à une dilution détermi- née au préalable par titrage dans des oeufs et chez des souris à la mamelle, et calculée de maniéré à donner un développement optimum.
On bouche les oeufs avec du collodion et on fait incuber à 34-36 C pendant 7 à 12 jours. A la fin de l'incubation, on mire les oeufs et on élimi- ne ceux qui contiennent des embryons morts.
On récolte les embryons vivants , dans des conditions d'asepsie, on les triture à 100 % de tissu dans un broyeur, et on dilue jusqu'à une con- centration finale en tissu de 70 %. On filtre alors cette suspension sur de la gaze, de façon que le filtrat puisse traverser facilement une aiguille du calibre 20.
A ce filtrat, on peut ajouter de la streptomycine jusqu'à une concentration de 1000 # /cm3, et de la pénicilline jusqu'à une concentration de 500 U/cm3. Si l'on ajoute ces antibiotiques, on maintient la suspension à 44 C pendant deux heurs, et ensuite, on met en récipients, on congèle et on dessèche. Si l'on n'ajoute pas d'antibiotiques, on peut mettre la suspension en récipients immédiatement. Après dessiccation, on vérifie l'humidité du produit, son inocuité pour les animaux, et sa puissance.
Pour illustrer de façon plus détaillée le nouveau procédé de la présente invention, on réhydrate une suspension de cervelle de poussin repré- sentant le 136ème passage dans des poussins, de la souche Flury de virus ra- bique provenant ae la Rockfeller Foundation, et on l'injecte par voie intra- cérébrale à des poussins d'un jour. On sacrifie les oiseaux le sixième jour après l'inoculation, et on fait un autre passage sur des poussins d'un jour.
On sacrifie ceux-ci à leur tour le 6ème jour, et on inocule 0,5 cm3 d'une suspension à 10% de leurs tissus cérébraux, dans la membrane vitelline d'oeufs fécondés de 7 jours. Six jours après l'inpculation, on sacrifie les embryons et on prépare des suspensions des embryons homogénéisés. On inocule alors dans les membranes vitellines d'oeufs défoncés de 7 jours, une suspension d'embryon à 20 dans l'eau distillée, et 6 jours après l'inoculation, on sacrifie à nouveau les embryons, et on prépare des suspensions homogénéisées de la matière embryonnaire. On répète le processus sur un total de 12 passa- ges en série sur des embryons de poussin vieux de 7 jours, en récoltant après le 6ème jour, jusqu'à ce qu'on ait réalisé un total de 14 passages en série sur des embryons d'oeufs.
Au 15ème passage et aux suivants, on procède à la récolte de 8ème ou 10ème jour après l'inoculation, car on a trouvé que l'on obtenait de meilleurs résultats avec ce procédé. Au bout de 20 passages envi- ron, le virus semble être relativement fixé, de sorte qu'il ne change pas ap- préciablement au cours de nombreux passages successifs. Pendant ce laps de temps, le virus reste entièrement infectieux lorsqu'on l'injecte directement dans le système nerveux central de cobayes, hamsters et souris, et jusqu'au 180ème passage inclus, on constate que le virus est mortel pour 6 souris sur 6, par injection intracérébrale.
Au 181ème passage, on observe un changement
<Desc/Clms Page number 5>
marqué et rapide dans les propriétés pathogènes de la souche rabique, et quand on injecte par voie intracérébrale à des souris de 14 jours un virus de l82ème passage aucun des animaux ne présente de signes de maladie, et ils sont invariablement immunisés contre les contacts ultérieurs avec le virus courant. Le virus garde ces caractéristiques faibles au cours des pas- sages ultérieurs, et semble être entièrement atténué.
Pour vérifier le caractère reproductible des résultats, on ré- pète les expériences ci-dessus en partant de matières de 170ème passage. A nouveau, on trouve que cette matière est entièrement virulente lorsqu'elle est injectée par voie intracérébrale à des souris, ainsi que la matière de 171ème et 172ème passages. On trouve que la matière du 174ème passage est entièrement dépourvue de virulence pour aes souris de 14 jours, même par injection intracérébrale, exactement comme la matière de l'expérience pré- cédente, et que les souris inoculées ne présentent aucun des symptômes de la rage.
On répète encore les expériences ci-dessus en partant d'une matière de 170ème passage. Dans ce cas, en note un changement marqué au 172ème passage, et on trouve que le 173ème passage et les suivants sont entièrement atténués et dépourvus de virulents, lorsqu'on les injecte par voie intracérébrale à des poussins de 14 jours.
Les expériences ultérieures indiquent que le changement peut se faire à tout moment depuis le 150ème passage jusqu'au 200ème passage environ.
On a vérifié les propriétés antigènes du virus, sur de nombreuses espèces d'animaux, parmi lesquels la souris, le cobaye, le chien, la vache et le chimpanzé. Dans chaque cas, le vaccin donne une excellente immunité contre les contacts ultérieurs avec le virus courant, ou bien on constate qu'il stimule une réaction a'anticorps élevée. Les chimpanzés n'ont été mis en contacts avec le virus courant, vu le caractère coûteux de ces animaux, mais le présence d'anticorps a pu être clairement démontrée.
On a fait de nombreux essais pour déterminer le caractère antigène du nouveau virus de la présente invention, chez les chiens, et dans chaque cas, on a obtenu d'excellents résultats. Dans ces expériences, chaque chien bâtard' reçoit 5 cm3 d'une suspension à 20 % de matière rabique, par voie intramusculaire dans la patte de derrière. Dans une série d'expériences,portant sur un total de 44 chiens, on vaccine 25 animaux choisis, avec de la matière rabique, préparée comme décrit plus haut avec une matière de l87ème passage en oeuf, et on utilise 19 animaux comme témoins. Trente jours après l'inocu- lation, tous les animaux sont mis en contact avec le virus courant, par inoculation intramassétérienne avec du virus courant de New-York.
Aucun des chiens vaccinés avec le nouveau vaccin ae l'invention ne contracte la rage, mais 15 des 19 chiens ne recevant pas le nouveau vaccin de la présente invention, contractent une rage aigue et meurent. On a fait beaucoup d'autres expériences sur des chiens, et dans chaque cas on a obtenu d'exellents résultats, comparables à ceux ci-dessus.
Dans des essais comparables faits sur des cobayes qui reçoivent 0,25 cm3 d'une dilution donnée de vaccin injectée par voie intramusculaire dans la patte de derrière, et qui sont mis en contact avec le virus rabique courant 21 jours plus tard, le vaccin donne d'excellents résultats. En fait, même quand on utilise la matière embryonnaire de poussin à des dilutions de 1 : 20, 1 : 80, et 1 : on obtient une immunité excellente, et tous les animaux inoculés restent sains lorsqu'ils sont mis en contact avec le virus courant, de la manière usuelle. On a utilisé dans les expériences ci-dessus des matières de 178ème et de 179ème passages sur embryon de poussin, et les deux matières ont donné des résultats égaux et satisfaisants. Par contre, 10 témoins sur 10 ont été tués lorsqu'on les mettait en contact avec le virus courant.
Dans d'autres essais sur des cobayes, des vaccins préparés avec des
<Desc/Clms Page number 6>
matières de 184ème et de 187ème passages sur embryon de poussin, donnent, dans chaque cas, une excellente immunité aux 6 cobayes essayés, et 8 témoins non vaccinés sur 9 sont tués par la rage lorsqu'ils sont mis en contact avec elle. Dans d'autres essais sur des cobayes avec du vaccin préparé avec des virus de 19ème, 196ème et 200ème passage en oeuf, on trouve que, dans cha- que cas, 6 animaux sont complètement protégés par les nouveaux vaccins de la présente invention, tandis que 6 témoins sur 6 meurent lorsqu'ils sont mis en contact, 21-jours plus tard, avec le virus rabique courant.
Des essais comparés sur des vaches et des chimpanzés indiquent que les nouveaux vaccins de la présente invention donnent également d'excellentes réactions immunologiques sur ces animaux. Des vaches ayant reçu de 3 à 15 cm3 d'un nouveau vaccin de la présente invention présentent une excellente réaction immunologique par la présence d'anticorps neutralisant le sérum, et aussi par leur faculté de survivre au contact avec le virus courant à diverses dilutions. Des chimpanzés présentent aussi une excellente réaction immunologique par la présence d'anticorps neutralisant le sérum 14 jours et même plus longtemps après l'inoculation avec un des nouveaux vaccins de la présente invention, préparé avec une matière embryonnaire de 194ème passage en oeuf de souche Flury.
REVENDICATIONS 1. Procédé pour atténuer le virus rabique virulent en une forme non pathogène sans perte appréciable de ses propriétés antigènes, dans lequel procédé on introduit un virus rabique virulent dans un oeuf en incubation, on laisse le virus s'y développer un certain temps, on enlève de cet oeuf en incubation des particules de virus, et on les introduit dans un autre oeuf en incubation, et on continue le passage en série de virus rabique d'un oeuf en incubation à l'autre, jusqu'à ce que l'on ait fait au moins 150 passages sur des oeufs en incubation,et jusqu'à ce que le virus ait perdu son caractère pathogène.