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La présente invention a pour objet un procédé de préparation et de raffinage des quatrimycines, qui con- stituent un groupe nouveau d'antibiotiques présentant des caractéristiques antibactériennes utiles .
On pense que les quatrimycines sont des-isomères des antibiotiques tétracycline, en ce sens qu'elles ont la même composition chimique, le même poids moléculaire, et
EMI1.1
qu'elles peuvent en dériver par un processus d'isc risa- tion. Chacune des tétracyclines - notanui3nt tétracycline, chlorotétracycline, bromotétracycline, et oxytétracycline - possède un isomère quatrimycine correspondant, que l'on ap- pelle quatrimycine, chloroquatrimycine, bromoquatrimycine, et( oxyquatrimycine respectivement .
La tétracycline est désignée chimiquement sous
EMI1.2
le nom de l-diméthylâb'lino-4,6-dioxo .,-méthyl-2,.a5,7,i1.- pe iit aliydroxy-l, ., la, 6 , l.a,12 , 7.2a-o ct ahydronapht a ène-3--car-. boxamide . Il n'est pas possible, actuellement, de désigner les quatrimycines par un nom chimique similaire, car on ne connaît pas la structure exacte de ces corps. Il semble, d'après le spectre d'absorption d'ultra-violet des quatri- mycines, qu'elles diffèrent des tétracyclines correspondan-' tes par un réarrangement d'atomes relatif aux positions 1,2 et 3 ou 4 du noyau tétracycline. On peut formuler d'au- tres explications quant à la structure des isomères, et l'invention ne sera pas liée à telle ou telle configuration hypothétique des produits en question .
Les analogues quatrimycines diffèrent notablement de leurs isomères tétracycline respectifs par leurs proprié-.
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tés )llysinxles, chimiques et biologiques. Les produits sont
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stables et généralement plus solubles dans l'eau que leurs isomères tétracycline. Ils possèdent des spectres d'absorp- tion d'ultra-violet et d'infra-rouge nettement-différents, comme on peut le voir par les dessins ci-joints qui seront expliqués plus loin.
Les quatrimycines possèdent une activi- té antibactérienne in vitro notablement inférieure à celle de leurs isomères tétracycline vis-à-vis des microorganis- mes que l'on a essayés, mais elles ent un activité compara- ble in vivo,et on peut les utiliser dans le traitement de la maladie d'une façon très semblable à celle adoptée pour l'usage des tétracyclines . Les doses formes et voies d'ad- ministration seront le mieux déterminées par le médecin traitant . Les solubilités différentes et les caractéristi- ques physiologiques différentes des antibiotiques considérés les rendent plus intéressants que les tétracycline-s dans di- vers cas particuliers .
Il est possible que les quatrimycines se forment directement par fermentation avec des espèces de Streptomyces car on les a isolées dans ces liqueurs de fermentation lors- qu'on les a traitées dans des conditions particulières. Hais le mieux est de les préparer directement à partir de la té- tracycline correspondante, par un processus d'isomérisation comportant certaines conditions réglées qui seront décrites ci-après. Autrement dit, on peut obtenir =la quatrimycine à partir de la tétracycline, on peut obtenir la chloroquatri- mycine à partir de la chlorotétracycline, etc...
Le processus d'isomérisation des tétracyclines en quatrimycines se fait quand on dissout une tétracycline dans un solvant aoproprié, à certains Ph , et quand on la laisse reposer. Au repos, l'isomérisation se fait jusqu'à ce que soit atteint un équilibre pour lequel, apparemment, on ob-
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t?8nt den quantités aDT)roxirntivel.1ent égales de la tétra.-.
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cycline et de la quatrimycine. On peut alors récupérer la quatrimycine dans la solution et la séparer de la tétra- cycline initiale .
Le pH de la solution semble être le facteur le plus déterminant dans l'isomérisation. On obtient les ren- dements les plus élevés en quatrimycine dans le temps le plus court lorsque le pH est compris entre 3,5 et 4,5, bien que des pH d'une gamme plus étendue amènent aussi une con- version appréciable des tétracyclines en.quatrimycines cor- respondantes, en des temps plus longs. L'isomérisation peut se faire dans l'eau distillée ajustée à un pH compris dans l'intervalle préférentiel, mais elle est très lente. Un des facteurs qui expliquent cette faible vitesse de conversion est la faible concentration de la tétracycline dans la so- lution. Les faibles concentrations de tétracycline amènent de faibles vitesses de conversion.
Donc, il est déisrable que la concentration de la solution soit aussi élevée que possible en ce qui concerne la matière première tétracycline.
Les systèmes solvants dans lesquels les tétracyclines sont le plus solubles sont donc préférables.
L'isomérisation se conduit le plus commodément à la température ambiante, bien qu'une plus grande vitesse de conversion soit obtenue à des températures plus élevées.
Il semble aussi que certains sels et acides catalysent oh augmentent la vitesse de conversion. Le rôle que jouent ces corps en catalysant l'isomérisation n'est pas connu, mais peut provenir de l'action d'anions ou de cations dans le processus d'isomérisation. Les tampons sont préférables, car ils jouent le rôle supplémentaire qui consiste à main- tenir le pH de la solution au voisinage de la valeur optimum.
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On a noté aussi qu'eu accroissant la concentration du tampon, on accroît aussi la vitesse de conversion des tétracyclines en quatrimycines.
EMI4.1
On. a examiné un c:ertain nombre de systèmes solvants et tampons pour la conversion de. la tétracycline en quatri- mycine. Un groupe typique est indiqué dans le tableau sui- vant. Pour obtenir ces résultats,, on prépare-une.solution à 20% de chlorhydrate de tétracycline dans le système sol- vant, et on lasse la solution s'équilibrer à la température ambiante pendant le laps de temps indiqué dans le tableau.
-Dans quelques cas, la limite de solubilité était inférieure
EMI4.2
à 200, et les résultats ont été déterminé.f?: pour ,une.: soutiol1 saturée. Dans les tableaux I et II, Me désigne CH3 et Bu dé- signe C4H9.
TABLEAU 1
EMI4.3
<tb> Isomérisation <SEP> % <SEP> de <SEP> quatrimycine
<tb>
<tb> Système <SEP> pH <SEP> temps <SEP> (h)
<tb>
EMI4.4
PO49 2Na 1M :6sl..p.e 4. 2 14e0H (1;1:l) 3 , 5 72 51,0 P04H2Na 4M :Mea(112) 3,5 24 35,5 PO e211 a U4 :Acétone(1:2) 3,5 24 '3810 POe2Na 4M :eëtos 1:12 ) 3,5 24 23 , 0 P04H2Na ]}I :MeOH (H2) 3,5 24 ' 50,5
EMI4.5
<tb> P04H2Na <SEP> 1M <SEP> :BuOH <SEP> :MeOH
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (45:1) <SEP> 3,5 <SEP> 24 <SEP> 50,5
<tb>
EMI4.6
P04H2Na 1M :MeOH (1:2) 3,5 24 55,5 Hz0 (206 -JI cm3) 3,5 120 12 Xie0H (tétracycline neutre l69 f crrt ) - 120 17 De moine, on détermine la conversion de la chloro-
EMI4.7
tf--'tracycline en chloroquatrimycine dans divers solvants, et les résultats sont indiqués dans le tableau suivant :
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'ÀBLIAU 11. -
EMI5.2
<tb> Système <SEP> Temps <SEP> d'iso- <SEP> Chloroqua-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> mérisation <SEP> trimycine
<tb>
<tb>
<tb> ours)¯¯ <SEP> @
<tb>
EMI5.3
2-éthoxyéthanol : P04H2Na 1M (2:1) 7 43,0 2-rnéthoxypropano1 : P04H2Na 1M (2:1) 1 31,1 2méthoxypropanol : P04H2Na lM (2:1) pH 2,5 1 36,4 tétraliydrofurane PO2Na 1M (2:1) 1 40,7 thanol P04H2Na IN (2:1) pH 2,5 2 51,0 MEPH, (MgCl2) :
P002 Na 1M (2:1). 1 19,3
EMI5.4
<tb> Acide <SEP> borique <SEP> à <SEP> 5% <SEP> 3 <SEP> 4,5
<tb>
<tb>
<tb> cide <SEP> citrique <SEP> à <SEP> 5% <SEP> 3 <SEP> 36,2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Oxalate <SEP> d'ammonium <SEP> à <SEP> 5% <SEP> 3 <SEP> 54,0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Acide <SEP> acétique <SEP> : <SEP> MeOH <SEP> (1: <SEP> 1) <SEP> 3 <SEP> 31,0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> PO <SEP> H@Na <SEP> 1M: <SEP> diméthylformamide <SEP> : <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> 42 <SEP> tétrahydrofurane <SEP> (1:1:1) <SEP> 3 <SEP> 46,5
<tb>
<tb>
<tb> PO4H2Na <SEP> 1M <SEP> : <SEP> tétrahydrôfurane <SEP> (1:2) <SEP> 3 <SEP> 54,0
<tb>
EMI5.5
P l.H2Na lu : diméthylformamide (1:2) 1 .$, 0
EMI5.6
<tb> PO4H2Na <SEP> 1M <SEP> :
<SEP> MeOH <SEP> (1:2) <SEP> 3 <SEP> 50
<tb>
On observe des résultats similaires quand on
EMI5.7
convertit la bromotétracycline en bromoquatrimycine et Lloyy- .. tétracycline en oxyquatrimycine.
EMI5.8
Une autre Bérie d'expériences, indiquée au t.b'Ia.
III, montre l'effet de la concentration de tampon sur la conversion de la tétracycline en quatrimycine. Dans ces ex- périences, la concentration de la tétracycline dans la solu-
EMI5.9
tion primitive était comprise entre 186 et 206 microgammas par cm3.
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TABLEAU III.-
EMI6.1
Temps (jours) )1 quatrimycine PO H Na P0¯ H2Na formiate d'am- formiate d'a- 3 031,fi monium 0.1M monimn 0,01.: 0,31ï pH 3 'Hlr3J pH 3y8 piu 3,5
EMI6.2
<tb> 28 <SEP> 13 <SEP> 27 <SEP> 17
<tb>
<tb> 2 <SEP> 37 <SEP> 15 <SEP> 31 <SEP> 22
<tb>
<tb> 5- <SEP> 37 <SEP> 34 <SEP> 33
<tb>
Divers tampons qui maintiennent le pH de la solu- 'tion dans l'intervalle préférentiel peuvent être utilisés en plus de ceux indiqués dans les tableaux di-dessus, pour la conversion des tétracyclines en quatrimycines correspondan- tes.
EMI6.3
On'peut récupérer les quatrimycines ayx.dépens de solutions dans lesquelles elles existent, grâce à des techni- ques variées. De façon générale, on peut les récupérer en même temps que les tétracyclines correspondantes auxquelles elles sont associées de la même manière que l'on peut récupé- rer les tétracyclines dans des solutions similaires. On peut
EMI6.4
séparer la quatrimycine de la tgtracycline par plusieurs pro- cédés basés, sur des différences de propriétés physiques. Par exemple, les quatrimycines sont considérablement plus solu- bles dans divers solvants que les tétracyclines correspondan- tes et on peut les récupérer par cristallisation fraction- née.
On peut aussi les séparer des tétracyclines grâce à des procédés d'extraction à contre-courant comme celui de Craig, ou par adsorption chromatographique ou chromatographie de séparation.
Un procédé préférentiel pour récupérer les quatri- mycines et les séparer des tétracyclines associées, consiste
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à traiter une solution de la matière pour éliminer la matiè- re insoluble et les sels minéraux, à préparer une solution aqueuse concentrée de la matière par évaporation de solvants organiques, s'il y a lieu, et d'une partie de l'eau; et à précipiter la solution aqueuse par un alcali tel que l'ammo- niac, la triéthylamine, le carbonate de potassium, la soude, etc... A un pH de 8 environ, le produit contient une forte proportion de quatrimycine et une faible proportion de tétra- cycline, mais le rendement est relativement faible. Aux pH plus élevés, on obtient une récupération plus complète de la quatrimycine, mais le produit contient aussi davantage de tétracycline.
Des précipitations et recristallisation répétées produisent une quatrimycine pure. Ces procédés seront illus- trés dans les exemples qui suivent.
-En général, les quatrimycines sous leur forme neu- tre, aussi'appelée la base libre, sont solubles dans l'eau, les alcools inférieurs, les solvants polaires humides, les acides et les bases. Ils sont insolubles dans les hydrocar- bures, les esters, les éthers et les chlorocarbures.
Les chlorhydrates sont solubles dans l'eau, les alcools inférieurs, le 2-éthoxyéthanol, les solvants polai- res humides et les bases pyridine. Ils sont insolubles dans le butanol sec, l'acétone, les esters, les éthers et les sol- vants non polaires.
Les sels drammonium sont solubles dans l'eau, l'a- cétone humide, le méthanol, l'éthanol, le propanol et le buta- nol humides, le 2-éthoxyéthanol humide, les bases pyridine, la diméthylformamide et l'acide acétique. Ils sont insolu- bles dans les cétones sèches, l'ammoniac aqueux, les alcools supérieurs secs, les hydrocarbures, les hydrocarbures chlo- rés, les esters et les éthers.
Les quatrimycines forment des sels et des complexe
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similaires à ceux formés par la tétracycline, la varotevra- cycline, la bromotétracycline et l'oxytétracycline. Ces sels comprennent des sels d'addition d'acides, tels que chlorhy- drate, sulfate, phosphate, ascorbate, acétate, citrate, etc..
EMI8.2
aussi bien que des sels à cations-tels que sodium, calcium, magnésium, ammonium, et les sels d'alkylamides, et ceux d'au- tres métaux alcalins, métaux7alcalino-terreux et amines.
Comme indiqué ci-dessus, les quatrimycines ont. la même composition chimique que leurs isomères tétracycline correspondants. Mais on peut les distinguer par d'autres ca-
EMI8.3
ractéristiquoes, partàmmbiërement par leurs spectres infra-rou ge et ultra-violet.
. Sur la figure 1- ci-jointe, on voit le spectre in-
EMI8.4
fra-rouge de-la quatr;mycine obtenu avec un spectro-photomè- tre enregiowur à infra-rouge Perkin-Elmer modèle 21 à dou- ble faisceau--y pajjr un échantillon de chlorhydrate de quatri- mycine pur. Aux fins de comparaison, et.pour montrer sa pa-
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renté étro avec 1at tétracyc7.ine cette figure montre aussi un enregise.n1 fait sur le même instrument pour un échan- tillon de chlorhydrate de tétracycline préparé dans les mé- mes conditions. Le dessin est un tracé des connues réelles données par le'spectrophotomètre ferkin-Elmer modèle 21.
A la figure 1, de même d'ailleurs qu'à la figure 2, la lon- gueur d'onde en microns et la fréquence en cm-1 sont indiquées en abscisse respectivement en dessous et au-dessus du. schéma, tandis que la transmission en % est donnée en ordonnée. la courbe en trait plein est relative au chlorhydeate de tétra cycline, alors que la courbe en traits interrompus concerne le chlorhydrate de quatrimycine.
La figure 2 montre un spectre d'absorption d'in-
EMI8.6
fra-rouge pour le sel d'al!lInonium de la quatrymicine. Cette conbe est obtenue pour une phase solide cristalline de sel
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d'ammonium dans une plaque de bromure de potassi um. Les raies d'absorption caractéristiques, exprimées en cm-1, se trou- vent au voisinage de :
3623 1117
3412 1091
3278 1071
2941 1054
2881 1049
2105 1022
1607 995
1503 952
1459 938 1388 921
1353 884
1333 852
1290 822
1265 812
1237 790 1206' 787
1190 773
1173 756 '1161 722 1149 701
1136 685
1126
Sur les figures 3 à 5 ci-jointes, on voit le spec- tre ultra-violet de la quatrimycine (courbes en trait plein) comparé aux ppectres correspondants de la clilorotétracyclint (figure 3) de l'oxytétracycline (figure 4) et de la tétra- cycline (figure 5) (Sur ces figures, la longueur d'onde en millimicrons est indiquée en abscisse et l'absorbance en ordonnée).
Chacun de ces spectres a été pris dans l'acide
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sulfurique 0,1N dans l'eau, à une concentration d'antibioti- que d'environ 50 mg/litre sous forme de chlorhydrate. On no- tera que les quatre courbes sont similaires par la configu- ration générale, chacune présentant trois pointes dans la bande des 200 à 400 millimicrons. L'absorption absolue pour une longueur d'onde arbitraire peut servir d'indice de con- centration de l'un de ces antibiotiques.
On mesure les densités optiques en dissolvant un échantillon dans l'acide sulfurique 0,1N à une dilution d'en- viron 50 miurogrammes par cm3. L'absorbance ou densité opti- que est mesurée à la température ambiante .'On Mesure les courbes sur un spectrophotomètre enregistreur Cary,et elles donnent le graphique de la densité opttique ou absorbance
1. ' qui est le logarithme décimal de 1. si l'on appelle 1. l'in- tensité du rayonnement incident et 1 l'intensité du rayonne- ment transmis pour une longueur d'onde donnée. On utilise pour la mesure une-cellule de quartz d'un centimètre. Sur les figures, on voit le graphique de l'absorbance en fonction de la longueur d'onde pour la quatrimycine recristallisée à deux reprises sous forme 'de sel d'ammonium.
EMI10.1
Les courbes de la chlorotétracyc.zne,de l'oxytétra- cycline et de la tétracycline concernent les chlorhydrates à une concentration de 50 microgrammes par cm3.
La figure 6 représente les spectres d'absorption d'ultra violet de la chloroquatrimycine (courbe en trait pleit et de la chlorotétracycline (courbe en traits interrompus) pour la longmeur d'onde indiquée. Sur cette figure 6, de même que sur la figure 7, la longueur d'onde en millimicrons est portée en abscisse et l'absorbance en ordonnée.
La figure 7 représente l'absorption d'ultra-violet
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de l'oxyquatrimycine (courbe en trait plein) et de l'oxytétra- cycline (courbe en traits interrompus.Sur chacune des figurer
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6 et 7, les antibiotiques ont été dissous dans l'acide sulfu-
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rique O,1N à une concentration de 30 microgranune s par cm3 de solution.
Les spectres d'absorption d'ultra-violet et ces antibiotiques tels qu'ils sont représentés sur les figures 3 à 7 sont des instruments analytiques très utiles pour dé- terminer la quantité d'une quatriniycine particulière dans une solution aqueuse. La petite échelle des courbes reproduites permet difficilement de déterminer les rapports des densités opiques des divers antibiotiques, et en conséquence, on donne le tableau suivant, avec des rapports optiques des quatrimy- cines et des tétracyclines les plus importantes à diffé- rentes longueurs d'ondes.
TABLEAU IV.-
EMI11.2
255 m z55m, 255m,4 357m(Ú 357mgr 268 m,4.i, 357m 300m,.t4 300m 217mk QuatrîmyPi;ie 1,07 1,10 2,34 2,12' , 1,07 Chloroquatrimy- cinq 1,12 2,03 3,24 a.,5 0,57 0xyquat;]inycine 1,14 1,16 , 2,07 1,80 r,Ol Tétracycline 0 , $$ 1, 09 l, $6 1, 69 1,05 Ch10rQtétr4\cy- cjjqo o, 9 - ¯ 1,76 2,52 lt43 0,72 Terrartcre 0,90 1,24 1,92 1,55 0,96
Les spectres d'absorption d'infra-rouge du chlor- hydrate de chloroquatrimycine (courbe en traits pleins) et du chlorhydrate de chlorotétracycline (courbe en traits inter- rpmpus) sont indiqués comparativement sur la figure 8 (abs-
EMI11.3
c.sses:lon;ueur dinde en microns et fréquence en crri Z; ordon- TH1es:transmission en 50).
De même,les spectres d'absorption d'iulra-rouge du chlorhydrate d'oxyquatrimycine (courbe en troit plein) et du chlorhydrate d'o jt4tracficline (courbe en traits interrompus) sont indiques sur 1u fl!llr0 9 (1I1tllleS abscisses et ordonnée qu'à la figure 8).
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Les tests colorimétriques avec lucide sulfurique sur la quatrimycine ressemblent à ceux de la tétracycline et donnent une couleur Violacée, tant pour la quatrimycine que pour le borate de quatrimycine.
Des propriétés typiques supplémentaires des quatri- mycines et des tétracyclines sont indiquées dans le tableau v, dans lequel on voit la rotation spécifique.
TABLEAU V.-
EMI12.1
<tb> Composé <SEP> Solvant <SEP> Rotation <SEP> spé-
<tb>
<tb> ¯¯¯¯¯ <SEP> cifique
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Sel <SEP> d'ammonium <SEP> de <SEP> quatrimycine <SEP> HCl <SEP> 0,2N <SEP> - <SEP> 319 <SEP> 4
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Quatrimycine <SEP> neutre <SEP> HCl <SEP> 0,2N <SEP> - <SEP> 333,0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Sel <SEP> d'ammonium <SEP> de <SEP> chloroqua-
<tb>
<tb>
<tb> trimycine <SEP> SO4H2 <SEP> 0,1N <SEP> .- <SEP> 353,1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Chloroquatrimycine <SEP> neutre <SEP> SO4H2 <SEP> 0,1N <SEP> - <SEP> 275,9 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Chlorhydrate <SEP> de <SEP> chloroquatri-
<tb>
<tb>
<tb> mycine <SEP> H20 <SEP> -223,
6
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Chlorhydrate <SEP> de <SEP> tétracycline <SEP> H2O <SEP> -227
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Chlorhydrate <SEP> de <SEP> chlorotétra-
<tb>
<tb>
<tb> cycline <SEP> H20 <SEP> -241
<tb>
Les points de fusion des quatrimycines et des tétracyclines ne sont pas nets. Toutefois, les températures de fusion et/ou de décomposition suivantes sont indiquées dans le tableau VI.
<Desc/Clms Page number 13>
TABLEAU VI.-
EMI13.1
<tb> composé <SEP> Point <SEP> de <SEP> fusion, <SEP> C-,
<tb>
<tb>
<tb> Sel <SEP> d'ammonium <SEP> de <SEP> quatrimycine <SEP> fond <SEP> à <SEP> 1700
<tb>
<tb>
<tb> Quatrimycine <SEP> neutre <SEP> fond <SEP> à <SEP> 178,5 C
<tb>
EMI13.2
Sel d'atlawniuni de chloroquatrimycine brunit à 156(> fond à lÓJ-lÓ4' Chloroquatrimycine neutre brunit à 19 ,' fond à U,'-1,3'
EMI13.3
<tb> Chlorhydrate <SEP> de <SEP> chloroquatrimycine <SEP> brunit <SEP> à <SEP> 188 ,
<SEP> fond <SEP> à <SEP> 211-214
<tb>
<tb> Tétracycline <SEP> neutre <SEP> fond <SEP> à <SEP> 170-173
<tb>
<tb> Chlorotétracycline <SEP> neutre <SEP> fond <SEP> à <SEP> 168-169
<tb>
<tb> Chlorhydrate <SEP> de <SEP> tétracycline <SEP> se <SEP> décompose <SEP> à <SEP> 214
<tb>
<tb> Chlorhydrate <SEP> de <SEP> chlorotétracycline <SEP> se <SEP> décompose <SEP> à <SEP> 210
<tb>
La quatrimycine est plus soluble dans l'eau que la tétracycline. Par exemple, dans des conditions similaires, quand on ajuste au pH 5,5 une solution de chlorhydrate de tétracycline à l'aide de soude, il se forme, dans une solu-
EMI13.4
tion contenant primitivement 11-100 miur ,ramnes par cire3, des cristaux de base libre tétracycline, et il reste une solu-
EMI13.5
tion éqpuisée d'une concentration de 390 microgrammes par cm3.
Une solution similaire de quatrimycine, au même pH et dans les mêmes conditions, reste à l'état de solution claire à un,pH de 5,5, ce qui montre qu'à un pH de 5 , 5 la base li-
EMI13.6
bre tétracycline est soluble à raison de 0,039'-"&, tandis que la quatramycine et beaucoup de ses sels. notamment le chlor- hydrate, le bronihydrate, le sulfate, le phosphate, le sel de potassium et le sel dtéthylène.-diarnine, sont extrêmement solubles dans l'eau et forment des sirops et des masses vi-
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treuses quand on accroît la. concentration.
La ressemblance chimique étroite entre la tétracycline et la quatrimycine est
EMI13.8
confirmée par une tendance que présente la quatrimycine à cristalliser conjointement avec la tétracycline à partir <1,1 sortions aqueuses, même si elles sont à lJllf' conc( nt1''t.Loll
<Desc/Clms Page number 14>
telle que la quatrimycine seule resterait, en solution dans la phase aqueuse.
La puissance in vivo est montrée par l'injection de chlorhydrate de quatrimycine à des souris qui ont été mi- ses en contact avec le Streptococcus hemolyticus C-203. On
18 inocule, à des souris pesant/+ 2 grammes, mille doses mortel- les de S.hémopyticus C-203, et on les traite simultanément par voie intrapéritonéale avec du chlorhydrate de quatrimyci- ne. A une dose de 10 mg/kg, 90% survivent ; à 5 mg/kg, 40% ,survivent.
De même, des souris mises en contact avec le Klebsiella pneumoniae K-AD, et protégées par le chlorhydrate de quatrimycine, présentent les survivances suivantes :
EMI14.1
<tb> Dose, <SEP> en <SEP> mg/kg <SEP> % <SEP> de <SEP> survivants <SEP>
<tb> 80 <SEP> 90 <SEP> ' <SEP>
<tb>
<tb> 40 <SEP> 70
<tb>
<tb>
<tb> 10 <SEP> 10
<tb> 5 <SEP> 0
<tb>
On met les oeufs de poule de sept jours en contact avec la Meningopneumonitis Cal.10. Les embryons non protégés meurent Dix sur dix embryons protégés par 0,15 mg de chlorhydrate de quatrimycine par embryon, survivènt.
EXEMPLE I. - Quatrimycine tirée de la liqueur de fermentation.-
On prend une liqueur résultant de la fermentation d'un milieu nutritif aqueux par une souche de S.aureofaciens et contenant de la tétracycline et de la quatrimycine, on l'ajuste au pH 7,1 avec de la soude à 50%. On ajoute 1 1/4 kg de silicate de magnésium synthétique (Magnesol), on agite le mélange pendant 30 minutes puis on filtre. Le tourteau pèse 33,4 kg et contient 95,4% de l'activité de la masse de fermen- tation, titrée par voie spectrophotométrique. Un extrait le
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tourteau à trois reprises, chaque fois avec 70 litres de bu- tanol à un pH de 2,0, en acidifiant la masse de fermenta- tion avec de l'acide chlorhydrique.
On ajoute 7 litres d'eau pendant la deuxième et la troisième extraction pour mainte- nir la phase butanol saturée d'eau. On réunit les extraits butanoliques et on y ajoute 0,2% de charbon décolorant (Dar- co) et 1% de chlorure de sodium, calculés en poids par volu- me , puis on filtre l'extrait. On laisse le filtrat déposer pendant 10 h et on enlève la couche aqueuse.
On concentre l'extrait clarifié sous vide à 23-
29 C, jusqu'à 16,8 litres titrant 2.600 microgrammes par cm3. On extrait à trois reprises ce concentré butanolique par son propre volume d'eau à un pH de 2, 6. On réunit les extraits aqueux, mesurant 52,0 litres, et on ajuste au pH 5,5 avec de la soude à 50%, on laisse vieillir 10 1/2 heures et on filtre. Les cristaux bruts contiennent de la tétracy- cline et de la quatrimycine, on les lave à l'eau saturée de butanol et on sèche sous vide pendant 16 h à 45 C pour obte- nir 1068 g de produit titrant 632 microgrammes par milligram- me. Le rendement à partir de la masse de fermentation est de 64% de l'activité.
On prépare un mélange de 80 litres de butanol, 20 litres de chloroforme, 20 litres d'eau distillée et 20 cm3 d'acide chlorhydrique concentré. Après agitation et sépara- tion, on sépare les deux couches formées. Le pH de la couche aqueuse est de 2,0. On mélange 2,35 litres de la phase a- queuse avec 4,7 kg de terres d'infusoires (Celite 545) lav6e à l'acide, et on tasse fortement ce mélange dans une colonne en verre de 15 cm de diamètre, pour former une colonne d'envi roll 1,10 m de hauteur. un délaie 40g des cristaux mélangés de l'exemble 1 avec 250 cm3 de la phase aqueuse. Un ajuste le pH à 2,0 avec de l'acide chlorhydrique.
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sur la terre d'infusoires comme adjuvant de filtration, et on obtient 240 cm3 de la solution saturée contenant au total 12,75 g de l'antibiotique. On mélange cette solution avec 480 g de Celite 545 et on tasse par dessus la Celite qui se trouve déjà dans la colonne. On développe la colonne avec 32,2 litres da la phase solvant du mélange. On prend des portions de 730 cm3 chacune et on les titre par voie spec- trophotométrique à 365 millimicrons. Les portions 28 à 35 qui contiennent 2,68 g d'activité, principalement chlorhy- drate de quatrimycine, sont réunies et on les concentre sous vide en présence d'eua pour donner un résidu de 100 cm3 de solution aqueuse.
On clarifie cette solution par filtration à l'aide de terre d'infusoires, on congèle, et on sèche.
On obtient un.rendement de 2,47 g qui titre environ 80% de chlorhydrate de quatrimycine.
EXEMPLE II. -
Sel d'ammonium que quatrimycine.-
On cristallise la matière amorphe congelée et séchée ci-dessus en la délayant avec 12,4 cm3 d'ammoniaque concentrée. On centrifuge la pâte cristalline épaisse obte- nue et on la lave avec une autre portion de 12,4 cm3 dtammo- niaque concentrée. On dissout les cristaux, humides d'ammo- niaque, dans 20 cm3 d'eau et on ajoute 100 cm3 d'acétone. La cristallisation commence rapidement. Apèès vieillissement de 2 h- à -10 C, on filtre la bouillie. On lave les cristaux avec un mélange de 5:1 d'acétone et dteau, puis à l'acétone, puis on sèche sous vide à la température ambiante. Les cris- taux de gel d'ammonium de quatrimycine ainsi formés pèsent 1,87 g.
Une portion du sel d'ammonium de quatrimycine ob- tenu ci-dessus, et recristallisé à deux reprises par le mélange eau-acétone-ammoniac, présente une teneur en eau, par
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la méthode Karl Fischer, de 3,98 et 3,78%. Le spectre ultra-
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violet de ce produit dans l'aide sulfurique O,1N est repr6- senté par les figures 3,4 et 5.
EXEMPLE III. -
On laisse reposer pendant une heure une bouillie de 56,5 g de chlorhydrate de tétracycline dans 80 cm3 de PO 4 H 2 Na 1M et 160 cm3 de méthanol, et on filtre pour enlever les corps insolubles. On laisse reposer- le filtrat clair àla température ambiante sous atmosphère d'azote pendant 24 heu-
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res; à ce moment, la solution titre 5.000 microgranunes par cm3 de quatrimycine, par la méthode de rapport de densité op- tique (ODR).
On mélange une portion de 10 cm3 de la solution avec 20 cm3 d'eau et on concentre sous vide et sous atmos- phère d'azote jusqu'àne que le méthanol soit chassé. Un amène le concentré à 30 cm3 avec de l'eau, et on ajuste du pH 2,7 au pH 5,3 avec de la soude. On ensemence le mélange avec de la tétracycline, on laisse vieillir 15 minutes et on centrifuge pour enlever les solides, qui contiennent 36% de quatrimycine. Le séchage de la liqueur-mère par congélation
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donne 1,25 g d'une matière solide titrant 428 microgrammes par mg de quatrimycine.
On mélange une portion de 39,4mg de la matière séchée par congélation, avec 0,25 cm3 d'ammoniac concentré, et on centrifuge les cristaux qui se forment immédiatement, on les lave à l'ammoniac concentré et à l'acétone, et on les sèche sous vide On obtient un rendement de 26,5 mg du sel d'ammonium de la Quatrimycine.
EXEMPLE IV. - un laisse reposer à la température ambiante pen-
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dant. 1± heures environ une solution de 200 r;" de ch] ',ll'hycJl' 11,1' ne tétracycline (976 1;;icr;.jranuT e# par r i;) <1;;ii:; ,> > <; ,i 1<,
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P 4-H2.\la. 'h) et 670 cm3 de méthanol. On traite la solution équilibrée par 1500 cm3 d'acétone et on laisse reposer à 4 C pendant 2 h ; au bout de ce temps, on enlève par filtra- tion les sels précipités.
On concentre alors la solution .sous vide jusqu'à 400 cm3
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On fait barboter c3. 1%ànwlôliac gazeux dans une portion de 100 cm3 du concentré. On filtre -le précipité qui se forme, on le lave à l'ammoniac concentré, puis à l'acétone et on le sèche sous vide. On obtient un rendement de 41,47 g du 'sel d'ammonium de quatrimycine.
EXEMPLE V.-
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gréparntion du sel d'ammonium de quatrimycine'et conversion en chlorhydrate.- -Ou purifie 40 g de quatrimycine neutre brute (632 microgrammes par mg) par le procédé de chromatographi-
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que ci-après pour éliminer la têt!l."afQy'Cli# et Les autres im- p'lÍ1"et'e:s On p'reparë titi mélange de 80 litres de bntanol; 20 litres de chloroforme; 20 itères iëdti ë 20 em3 d'acide chlorhydrique concentré. Après agitation et décaiitatiofii on sépare les deux couches. Le pH de la phase aqueuse est de 2,0. On fait un mélange de 2,35 litres de cette phase aqueu- se et de 4,7 kg de terre d'infusoires (Celité 545) lavée à l'acide, et on le tasse fortement'dans une colonne en verre de 15 cm de diamètre pour former une colonne d'environ 1,10 m de haut.
On délaie 40 g de la quatrimycine brute avec 250 cm3 de la nhase aqueuse préparée ci-dessus et on ajuste le pH
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à 2,Ll avec L5 l'acide chlorhydrique. On filtre la bouillie et on mélange le filtrat ( solution àatur4e contenant au total a 2r q5 g ri' arxt zbiotia ue ) avec /j80 de Celite 54, et on tans-
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se par dessus le contenu de la colonne.
On développe la colonne avec 32,2 litres de la phase solvant. On prend des portions de 730 cm3 et on titre par voie spectrophotométrique . On réunit les portions 28 à
35, qui contiennent 2,68 g d'activité, principalement quatri- mycine, et on les concentre sous vide en présence d'eau pour donner un résidu de 100 cm3 de solution aqueuse. On filtre cette solution, on la congèlent on la sèche on ob- tient 2,47 gr d'un produit amorphe contenant environ 80% de quatrimycine. On effectue la cristallisation en délayant avec 12,4 cm3 d'ammoniaque concentrée.
On centrifuge les cristaux, on lave à ltammoniaque, puis on recristallise en dissolant dans 20 cm3 d'eau et en ajoutant 100 cm3 d'acétone,
Après vieillissement de 2 h à -10 C on filtre le sel d'am- monium cristallin de la quatrimycine, on le lave au mélange acétone-eau 5:1, puis à l'acétone, et on sèche sous vide.
On obtient un rendement de 1,87 g d'un produit titrant 935 microgrammes par mg.
6n chromatographie à nouveau une portion de cette matière par le procédé décrit ci-dessus. On concentre sous vide, en présence d'eau, les portions appropriées du liquide d'écoulements de la colonne, ce qui donne un concentré aqueux que l'on sèche par congélation. On convertit le produit en sel cristallin d'ammonium dans l'ammoniaque, et on chromatogr phie à nouveau le produit résultant, comme précédemment, en faisant passer une solution acide (HCl) au pH 2,0, à tra- vers une colonne de Celite.
On concentre les portions ap- propriées en présence d'eau, pour obtenir une solution aqeu- se que l'on sèche par congélation pour donner du chlorhydra- te de quatrimycine amorphe.
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EXEMPLE VI.- Quatrimycine neute.-
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On prépare un mélange',de dè:'.rOjU"nées' de sel d'am- monium brut de quatrimycine, représentait au total 1.171 g .
Les produits bruts sont obtenus par -une -méthode similaire à celle décrite à l'exemple III. On dissout le mélange dans 4 litres d'eau par addition de 150 cm3 d'acide chlorhydrique concentré jusqu'au pH 6,5. Après avoir filtre les-impuretés insolubles, on ajoute 160 cm3 d'ammoniac concentré pour éle- ver le pH à 8,0 et la cristallisation se produit..On agite le mélange et on filtre le produit, on lave au mélange acéto- ne-eau 4:1, à l'eau, au mélange acétone-eau 2:1, et on sèche sous vide.
On prend une solution de 300 g de ce sel d'ammonium dans deux litres d'eau, on,l'ajuste au pH 5,75 avec 48 cm3 d'acide chlorhydrique concentré. On filtre le produit cris- tallin et on le lave à l'eau.
On prend une bouillie du produit humide dans 300 cm3 d'eau, on la traite par'l'acide chlorhydrique pour pro- voquer la dissolution au pH 4,0, puis on ajuste au pH 7,0 avec de l' ammoniac concentré. On laisse vieillir la.bouillie de cristaux obtenue et on la filtre, on lave le produit et on le sèche sous vide. On obtient un rendement de 62,8g.
On délaie 2 g de la quatrimycine neutre dans 25 cm3 d'eau, et on ajuste le pH à 1,20 avec de l'acide chlorhydri- que concentré. On filtre la solution résultante et on l'ajus- te au pH 5,75 avec de l'ammoniac concentré. On filtre le pro- duit cristallin, on le lave à l'eau et à l'acétone, et on sèche sous vide. Analyse : calculée pour la quatrimycine neu-
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tre C2zH=120 ) : C : 5g, &; H : 5,44; Il 6,32; 0 : 2$, $. Effective : C T: 57988; ; H : 5e58; i1 6,02;.0 : 30,52 (diff);
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perte par dessiccation : 2,78; cendres : 0.
EXEMPLE VII. - Préparation du sel d'ammonium de chloroquatrimycine.-
On prend une solution de 100 g de chlorhydrate de chlorotétracycline dans 500 cm3 d'un mélange 1:2 de
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P04H2N'a 114 et de diméthylformai11ide, on la place sur un agita- teur rotatif à la température ambiante pendant environ 16 heures et on filtre pour enlever la portion insoluble. On précipite les sels inorganiques par addition de 750 cm3 d'acétone et on les élimine par filtration. On ajoute de ltammoniaque concentrée pour ajuster le pH à 8,0 et on agite le mélange pendant une heure pour permettre la cristallisa- tion complète. On filtre le ,produit, on le lave avec un mé- lange de solvants comprenant 2 parties en volume d'acétone et 1 partie en volume de diméthylformamide; puis avec de l'acétone, et on sèche.
Le produit est le sel d'ammonium de chloroquatrimycine...
On obtient une deuxième récolte en ajoutant encore 250 cm3 d'acétone.'Après filtration, lavage et séchage, le produit pèse 7,89 gr.
EXEMPLE VIII. -
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Préparation du, sel d t aammonium de cliloroquatrimycine.-
On prépare une solution en dissolvant 20 gr de chlorhydrate de chlorotétracyline dans 400 cm3 de PO4H2Na 1M et 800 cm3 de méthanol. Quelques cristaux se for- ment aux dépens de la solution , et on les élimine par filtra- tion. On laisse reposer la solution claire à température am- biante sous atmosphère d'azote pendant 3 jours.
Pour éliminer le méthanol, on concentre la solution équilibré sous vide, avec azote, jusqu'à un volume de 194 cm3. On extrait alors le concentré à cinq reprises par 50 cm3
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d'alcool benzylique, et on sèche l'extrait sur du sulfate de sodium anhydre.
On effectue la précipitation de l'activité par addition graduelle de l'extrait à 6 litres dtéther. On filtre le précipité, on le lave à l'éther, puis au tétrachlorure de carbone, et on sèche sous vide pour obtenir 10,47 g de produit.
On délaie le précipité amorphe avec 52,5 cm3 d'am- moniac concentré pour produire la cristallisation immédiate.
On centrifuge le produit. On le lave à l'ammoniac concentré, puis à l'acétone, et on le sèche sous vide. On obtient' un 'rendement de 5 , 2 g.
EXEMPLE IX.- Préparation du chlorhydrate de chloroquatrimycine-
On prend un échantillon de 209 mg du se)1,d'ammonium préparé dans l'exemple VIII, on le délaie dans 2 cm3 d'un mélange à 98% cellosolve et 2% eau, et on traite par l'acide chlorhydrique concentré jusqu'à ce que le pH soit inférieur à 2. On enlève les matières insolubles amorphes par centri- fugation, et on laisse cristalliser la liqueur surnageante pendant 4 1/2.heures à la température ambiante. On filtre le produit, on le.lave à l'eau, puis à l'éthanol anhydre, et on le sèche sous vide. Rendement 65,6 mg.
EXEMPLE X.- Préparation de la chloroquatrimycine neutre.- .
On prend un échantillon de 50 mg du sel d'ammonium préparé dans l'exemple VIII, on .le délaie avec 0,3 cm3 de HCl 0,1N et on le traite par une'goutte: d'acide chlorhydrique ' concentré pour.produire la dissolution à un pH de 5 'environ.
'Il ;se forme, facilement un précipité cristallin, on le centri- fuge, on le lave à l'eau et on le sèche par congélation..
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Les propriétés optiques des quatrimycines ne sont pas faciles à déterminer car les cristaux sont très petits et ne sont pas bien définis. Toutefois, la chloroquatrimycine spus 'forme de base libre a un indice de réfraction alpha de 1,607 0,003 et un indice de réfraction bêta de 1,688 ¯ 0,003. Les indices de réfraction correspondants pour la chlo tétracycline base libre sont alpha 1,650 + 0,005 et bêta 1,672 + 0,005. Le chlorhydrate de chloroquatrimycïne a un indice de réfraction bêta de 1,694¯ 0,003, le signe optique étant positif. Le chlorhydrate de chlorotétracycline a un indice bêta de 1,705¯ 0,003 et un signe optique négatif.
EXEMPLE XI. -
On prépare du sel d'ammonium brut de chloroquatri- mycine par un procédé similaire à l'exemple III.' On dissout une portion de 1,43 kg de la matière dans 2,5 litres d'eau, pour former une solution au pH 7,6. L'addition de 250 cm3 d'ammoniac concentré amène le pH à 9,3 et la cristallisation commence. Après avoir agité pendant 1 heure, on filtre le produit, on le lave avec un mélange acétone-eau 4:1, puis à 'acétone, et on sèche sous vide.
On obtient un rendement de 444 g de sel d'ammonium de chloroquatrimycine. f
On prépare une solution de 49,7 gr du produit ci- dessus dans 400 cm3 d'eau, et, on en fait cristalliser la
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chloroquatrimycine neutre par addition de 14,2 cm3 d'acide chlorhydrique concentré jusqu'au pH 5,5. Après vieillisse- ment de deux heures, on filtre le produit, on le lave à l'acétone et on le sèche sous vide.
On dissout 1 g de ce produit dans 30 cm3 de métha- nol, on filtre rapidement et on déclenche la cristallisation en grattant la paroi du récipient. On filtre la chloroquatri- mycine neutre 'cristalline, on la lave à l'eau et au méthanol, et on sèche sous vide.
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Analyse : Calculée pour C22H23N2C108:
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: 55, ; H : t., 0 Pd : 5 , $c-; Cl 7,41; 0 : 26,7. Effective : C : 55,03; H : 4ego; TvT : 5,3;C1 7,36; 0 : 26,Se (diff), cendres 0,1%; perte au séchage 0,37%.
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EXIàIPIE XII. - Préparation de l'oxyquatrimycine.Beutre.- , .'l] On-prend une solution de 20,2,g d'oxytétracycline neutre dans 100 cm3 d'acide acétique glacial, on l'agite
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sous atmas-ohexe d'azote pendant 24 h'environ, e à ce moment elle titre 60..00' mfcrogrammes d'oxyquatrimycine-par cm3.
On mélange la solution avec 500 cm3 d'eau et on concentre sous vide sous atmosphère d'azote jusqu'à un volume de 100 cm3.
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On ajoute une àw**1é*e,portion de 500 cm3 d'eau, et on répète la concentration. La recristallisation, qui commence peu de
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te!np& apréw, 3a deuxième, addition d'eau, continue pendant tout le reste de la concentration. On filtre les,cristaux ( principalement oxvjSetracycline) et ,on sèche le filtrat par c; é.t pr,h.¯'en3r 6,15 g de produit titrant 660 mi- crogranunew àlrozyquatrimycine par mg.
L'addition de 30 cm3 d'eau 4 la matière amorphe amène la formation immédiate de cristaux, que l'on dissout en ajoutant 3,1 cm3 d'ammoniac concentré jusqu'au pH 9,2.
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Quand o t-ra:ite; par 2,3 cm3 d'acide ,chlorhydrique 6N, jus- qu" au pX'à#..,.:E apparaît une cristallisation lente. Au bout de 30 minutes, en filtre le produit, on lave à l'eau, et on sèche sous vide. Rendement : 2,35 g, 920 microgrammes d'oxy- quatrimycine par mg.
On isole une deuxième récolte de cristaux de la liqueur-mère en ajustant encore le pH à 5,6 à l'aide de 1,8 cm3 d'acide chlorhydrique 6N. Après lavage et séchage, le
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produit pèse 2,79 é titre 5±0 microgrammes dfoxyqu,).trL,-,y- eine par mg.
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EXEMPLE XIII. -
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rrénaration du sel de sodium de loxyguatrimycine.- On prépare une suspension de 202 mg d'oxyquatrimy- cine neutre dans 7,5 cm3 de méthanol. Il se produit une disso- lution partielle, mais elle est suivie d'une reprécipitation.
Quand on ajoute 50 mgr de soude dissous dans 2,5 cm3 de mé- thanol, on obtient la dissolution complète des solides, mais après repos de 2 1/2 heures à 4 C. il ne cristallise plus de sel de sodium. On ajoute encore 20 mg de soude, dissous dans 1 cm3 de.méthanol. Au bout de 18 haures à -11 C, il y a quel-
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quen 9=5 jamac! de cristaux, quand on les divise, il s'ensuit une cristallisation abondante. On laisse vieillir la bouillie pendant 4 heures de plus à -11 C, et on filtre. On lave le produit au méthanol et on sèche sous vide. Rendement : 186 mg.
EXEMPLE XIV.-
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'. â.,. ^ss:.: ,d,u chlorhydrate d' oxyquatrimycine.... prend une solution de 98,5 mg d'oxyquatrimycine neutre dans 0,5 cm3 d'acide chlorhydrique 3N, et on l'enesemen-
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ce .avec du chlorhydrate d'c;>xyq{uatrimycine, et il se produit une cristallisation rapide. On ajoute encore 0,3 cm3 d'acide chlorhydrique 3N pour diluer la bouillie et faciliter la fil- tration. On lave le produit filtré à l'acétone et on sèche sous vide pour obtenir 47,3 mg; titrant 925 microgrammes d'oxy. quatrimycine par mg.
EXEMPLE XV.-
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Préparation de 1'oUquatriniyeine neutre. -
On agite pendant 4 h une bouillie de 10,06 gr de clilorhydrate d'oxytétracycline et 2,06 g d'acétate de potae sium dans 50 cm3 d'acide acétique glacial jusqu'à ce que la dissolution se produise, et on filtre le léger résidu insolu- ble.On laisse repose la solution une nuit sous atmosphère
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d'azote , on la mélange avec 250 cm3 d'eau, et on la concen- tre sous vide jusqu'à 50 cm3. On ajoute une autre portion de 250 cm3 d'eau, et on répète l'étape de concentration.
On filtre le précipité cristallin, qui est principa- lement de l'oxytétracycline, et on le lave à l'eau. On réunit le filtrat et la liqueur de lavage, on les sèche par congé- lation pour donner 3,33 gr d'oxyquatrimycine brute.
On dissout le produit amorphe dans 16,7 cm3 d'eau et on élimine les matières insolubles par centrifugation.
On'ajuste la liqueur surnageante au pH 6 par addition d'am- moniac con'centré, et on agite pendant 20 minutes. On filtre le produit cristallin, on lave à l'eau et on sèche sous vide pour donner 1,7.g.
On recristallise le produit "à quatre reprises par l'eau, en le dissolvant au pH 9,2 et en utilisant de l'ammo- niac pour l'ajustement du pH, et en reprécipitant par addition d'acide chlorhydrique jusqu'au pH 8. C:
Analyse : calculée pour C22H24N2O94H2O :/49,6; H;6,06; N :5,26; 0 : 3,91; H2O; 13,5. Effective : C: 48,51; 48,50; H : 6,16; 6,05; N : 4,.$2; 5,04; 0 : 40,51; 40,41; (par différence); H2O; 12,40; .12,42.
EXEMPLE XVI. - Réduction de la chloroquatrimycine.-
On dissout 5 g de sel d'ammonium de chloroquatri- mycine dans 45,0 cm3 d'eau, et on hydrogène sur un agitateur Barr en présence de 1,4 g de Pd à 5% sur C. En l'espace de 20 minutes, la réduction s'arrête, un équivalent d'hydrogène ayant été absorbé. On filtre le mélange et on l'ajoute à la solution clarifiée de l'ammoniac concentré, élevant le pH à 9,0. On ajoute'-un égal volume d'acétone, et davantage d'am- moniac pour réajuster le pH de 8,5 à 9,0. On filtre le préci-
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pit6 obtenu au bout de 25 minutes, on le lave à l'acétone et on le sèche sous vide à température ambiante pendant 1 h.
On obtient un rendement de 1,@0 g de sel d'ammonium de quatrimycine.
EXEMPLE XVII. - Conversion de la quatrimycine en tétracycline.-
On dissout 50 mg du sel d'ammonium de quatrimycine dans 1,0 cm3 d'eau et on ajuste le pH avec de l'acide formi- que à 4,25. Après repos d'une nuit à température ambiante, la solution précipite une substance cristalline jaune pâle.
On recueille environ 20 mgdu produit cristallin par centri- fugation, on lave à lteau et on sèche sous vide. Le spectre ultra-violet du produit indique que c'est un mélange de té- tracycline et de quatrimycine contenant environ 70% de tétra- cycline. On dissout le produit dans une goutte de 2-éthoxyé- thanol, on acidifie à l'acide chlortiydrique et on laisse éva- porer jusqu'à siccité. Quand on mouille à nouveau le chlorhy- drate vitreux séché avec du 2-éthoxyéthanol, et quand on ense- mence avec une quantité minime de chlorhydrate de tétracycli- ne, la masse vitreuse cristallise en donnant un bon rende- ment de chlorhydrate de tétracycline cristallin. On identifie le produit par le spectre ultra-violet et le spectre infra- rouge, tous deux étant identiques aux spectres d'un spécimen authentique de chlorhydrate de tétracycline .
La composition du milieu de fenmentatino, les con- ditions de fermentation, les souches cultivées, et les procé- dés de récupération, peuvent varier dans une large mesure tout en restant dans le cadre de la présente invention.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.