Procédé de préparation d'une Céphalosporine insensible à la pénicillinase provenant de B. subtilis On a déjà constaté que quand on fait fermenter un milieu nutritif avec une moisissure du genre auquel appartient le Cephalosporium IMI. 49137 (American Type Culture Collection No 11550), ce milieu acquiert une activité antibiotique. On a déjà décrit en détail l'isolement de deux antibiotiques différents à partir de ce milieu.
L'un de ces anti biotiques est actif principalement contre les bactéries gram-positives, et est connu comme Cephalospo- rine P. L'autre, connu sous le nom de Céphalospo rine N, est une substance sensible à la pénicillinase, et qui est actif contre les bactéries gram-négatives et les bactéries gram-positives.
Dans le brevet anglais No 745.208, il est décrit un procédé de fermentation pour la production de Céphalosporine N et des méthodes pour l'obtention de Céphalosporine N à un état très purifié.
La présente invention est fondée sur l'observa tion que la Céphalosporine N ainsi produite et encore impure, lorsqu'on la maintient à un pH de 2,5 à 5,5, donne un mélange d'acide pénillique de Céphalo sporine N avec une substance antibiotique inconnue jusqu'à présent.
Cette troisième substance antibio tique, qui sera appelée Céphalosporine C, est, comme la Céphalosporine N, active contre les bactéries gram-positives et gram-négatives, mais, contrairement à la Céphalosporine N, elle est insensible à la péni- cillinase préparée à partir de<I>B.</I> subtilis. Elle est soluble dans l'eau et presque insoluble dans l'éthanol et l'éther.
Elle peut être identifiée à l'aide de son spectre d'absorption dans l'ultraviolet, l'antibiotique sous la forme d'une solution aqueuse de son sel de sodium ayant un pouvoir rotatoire spécifique de [ ]D -f- 1030 et présentant un maximum d'absorption dans l'ultraviolet à 260 millimicrons. La présente invention a donc pour objet un pro cédé de préparation de la Céphalo:
sporine C, carac térisé en ce que de la Céphalosporine N provenant de la culture d'une moisissure de l'espèce Céphalo- sporium et contenant en mélange de ladite Cépha- losporine insensible à la pénicillinase, est maintenue à un pH de 2,5 à 5,5<B>_</B>pendant un temps suffisant pour transformer au moins en partie la Céphalospo rine N en acide pénillique de Céphalosporine N, et en ce que l'on isole la Céphalosporine désirée.
La Céphalosporine C est de caractère acide. Tant l'acide libre que son sel de sodium sont aisé ment solubles d'ans l'eau, mais insolubles dans l'acé tone et l'éther. Une solution aqueuse du sel de sodium, de pouvoir rotatoire [cc]D -I- 1030, montre une absorption à 260 ml, de E 1 o/m = 200.
La Céphalosporine C contient du carbone, de l'hydrogène, de l'oxygène, de l'azote et du soufre, mais pas d'halogène ni de phosphore. L'analyse élé mentaire de son sel de sodium et de l'acide libre a donné les résultats suivants <I>Sel de sodium</I> Trouvé: C 39,5, 40,0 ; H 4,8, 5,2 ; N 8,9 ; S 6,2 ; Na 4,9 %. Equi. (titration) 480 15. P.M. déterminé par analyse cristallographique aux rayons X : 470 15.
C16H2oO8N3SNa, 2H20 correspond à : C40,5; H 5,1 ; N 8,9 ; S 6,7 ; Na 4,9 %. P.M. 473. <I>Acide libre</I> Trouvé<B>:</B> C 44,4 ; H 5,6 ; N 9,8 ; S 7,3 CioH210sN3S, H20 correspond à : C 44,5 ; H 5,3 ; N 9,7 ; S 7,4 /o.
Les résultats d'analyse donnent donc à supposer que la Céphalosporine C a la formule moléculaire C16H2108N3S.
La Céphalosporine C donne la réaction à la ninhydrine. La titration électromagnétique indique qu'elle est un acide monoaminodicarboxylique, ayant deux groupes acides avec des valeurs de pH de moins de 2,6 et de 3,1, et un groupe basique avec un pi,, de 9,8. Quand on la soumet à la ionophorèse sur papier, dans un tampon d'acétate de collidine à un pH de 7, elle se déplace vers l'anode à une vitesse à peu près la même que celle de la Céphalospo rine N.
Le spectre infrarouge du sel de sodium de la Céphalosporine C (en pâte de paraffine) montre des bandes aux longueurs d'ondes suivantes: 2,94 3,06 I, (NH), 5,77 1, (groupe ester ou lactone), 6,05 @, et 6,57 R. (C = O d'amide monosubstituée), 6,29 (-C00 ), 7,17 li et 7,36 [, (groupe isopropyle)
. Les indications entre parenthèses ne sont que dies inter- prétations possibles. Le sel de sodium de la Cépha losporine C montre aussi une bande à 5,61 R,. La Céphalosporine N et le benzylpénicillinate de sodium donnent aussi une bande dans cette région, bande que l'on a attribuée, pour ce dernier composé, au C = O du système de noyaux condensés P-lactame thiazolidine (Thompson,
Brattain, Randall et Ras mussen, The Chemistry of Penicillin, Chapitre 13, Princeton University Press, 1949).
Contrairement à la Céphalosporine N et à la benzylpénicilline, la Céphalosporine C est stable en solution aqueuse d'un pH de 2,5. Elle est cependant rapidement rendue inactive à un pH de 12. Après l'avoir maintenue à un pH de 12 pendant deux heu res, une titration en retour a montré qu'il s'était formé deux groupes acides par molécule.
Dans des conditions semblables, il n'est libéré qu'un seul groupe acide de la Céphalosporine N et de la benzyl- pénicilline. La Céphalosporine C est plus stable en présence de certains ions de métaux lourds, tels que C,++, pb++ et Zn++, que ne le sont la Céphalo- sporine N ou la benzylpénicilline.
Par hydrolyse avec un acide (HCl, 1 N, pendant huit heures à 110o C), la Céphalosporine C, comme la Céphalosporine N, donne du dioxyde de carbone et un aminoacide qui se comporte comme l'acide a-aminoadipique à la chromatographie sur papier.
Le produit obtenu en faisant réagir la Céphalo sporine C avec du 1,3,4-fluorodinitrobenzène donne par hydrolyse un produit qui se comporte comme le dérivé dinitrophénolique de l'acide a-ami- noadipique. Il semble donc que le groupe a-amino de l'acide a-aminoadipique est libre dans la Cépha losporine C et que (puisque ce groupe amino montre une valeur de pK de 9,8) le groupe a-carboxyle est aussi libre.
On n'a pas pu avoir la certitude de la formation d'une quantité notable de pénicillamine ((i-thiolva- line) par hydrolyse de Céphalosporine C, mais l'hy drolyse du produit obtenu par hydrogénolyse de cette dernière avec du nickel Raney a donné des aminoacides qui se comportaient comme l'acide a-aminoadipique, respectivement la valine, à la chro matographie sur papier.
La Céphalosporine C montre une activité d'un même ordre de grandeur envers un certain nombre de bactéries gram-positives et gram-négatives. Elle est moins efficace que la Céphalosporine N contre le Staph. aureus et le Salm. typhi, in vitro, ayant une activité de 8-10 unités par Meg. (l'unité étant celle indiquée par Abraham, Newton et Hale, 1954. Biochem. J. 58, 94).
Elle a une activité semblable à celle de la Céphalosporine N contre une espèce de Bact. coli. Sa toxicité n'a pas encore été évaluée par des essais biologiques complets, mais on croit qu'elle est faible, puisqu'on peut donner à des souris au moins 10 mg de la substance purifiée, par injection intraveineuse, sans que celles-ci paraissent en souffrir.
Pour mettre en aeuvre le présent procédé, on peut faire fermenter un milieu approprié avec une moisissure de l'espèce Cephalosporium, par exemple comme d'écrit dans le brevet anglais mentionné, enlever le mycélium du liquide fermenté, mettre ce liquide en contact avec du charbon activé, éluer la matière adsorbée par ce charbon, mettre l'éluat en contact avec de l'alumine, et éluer de l'alumine la substance antibiotique adsorbée.
La Céphalosporine C est présente avec la Céphalosporine N dans l'éluat obtenu à partir de l'alumine.
Par élimination du solvant, on peut obtenir un mélange brut contenant les céphalosporines N et C. Ainsi qu'on l'a dit, la Céphalosporine N est instable à des pH au-dessous de 5,5, tandis que la Céphalo- sporine C est stable même à des pH aussi faibles que 2,5.
La séparation de la Céphalosporine C peut donc être effectuée en convertissant la Céphalosporine N du mélange en acide pénillique de Céphalosporine N, puis en traitant le mélange résultant pour en séparer la Céphalosporine C, par exemple par fractionnement par solvant, par adsorption fractionnée sur un adsor bant solide tel que l'alumine ou une substance échan- geuse d'anions, par conversion de l'acide pénillique en un dérivé insoluble, ou par une combinaison de ces méthodes.
La conversion de la Céphalosporine N en son acide pénillique peut être effectuée simple ment en maintenant le mélange pendant deux heures à un pH de 3 et une température de 370 C.
Les façons suivantes de séparation de la Cépha losporine C d'avec l'acide pénillique de la Cépha losporine N ont donné de bons résultats. 1. On fait couler une solution aqueuse du mélange dans une colonne d'une résine échangeuse d'anions, telle que la résine Amberlite IR4B(XE-59) (le terme Amberlite est une marque de fabrique enregistrée), et on effectue l'élution avec un acide dilué, une solution tampon convenable telle qu'un formiate d'ammonium aqueux ou d'acétate d'ammonium aqueux d'un pH de 3,2 à 5,0, ou une solution aqueuse d'une base tertiaire, telle que la pyridine,
partiellement neutralisée avec de l'acide sulfurique ou oxalique. Une bande consistant en acide pénillique de Céphalosporine N sort de la colonne avant une bande consistant en Céphalosporine C.
2. On soumet une solution aqueuse du mélange, dans une machine de répartition, à une réparti tion à contre-courant à des conditions faiblement acides dans un système solvant à deux phases obtenu à partir d'eau et de phénol (ou d'un phé nol substitué convenable tel qu'un crésol ou un xylénol). Si désiré, les coefficients de partage dans ce système peuvent être modifiés par addi tion d'une quantité convenable d'un solvant orga nique, par exemple le tétrachlorure de carbone. Le pH du système est amené à une valeur de 2 à 5 par addition d'acide acétique ou d'acétate d'ammonium ou de formate d'ammonium for mant tampon.
On fait des transferts jusqu'à ce que la Céphalosporine C et l'acide pénillique de Céphalosporine N aient formé des bandes sépa rées. De préférence les conditions sont réglées de telle façon que la Céphalosporine C soit reti rée de la machine dans la phase aqueuse.
3. Une solution aqueuse du mélange est ajoutée à une colonne d'alumine lavée à l'acide, et l'élution est effectuée avec un alcali aqueux dilué, tel que de l'hydroxyde de sodium 0,01 N. La Cépha- losporine C sort de la colonne, sous forme d'une solution de son sel de sodium, avant l'acide pénillique de la Céphalosporine N.
4. On ajoute une solution aqueuse de chlorure mercurique à une solution contenant un mélange brut de Céphalosporine C et d'acide pénillique de Céphalosporine ; ce dernier composé est con verti en une pénillamine qui est précipitée comme mercaptide. La solution surnageante contient de la Céphalosporine C brute.
Après sa séparation d'avec l'acide pénillique de la Céphalosporine N, la Céphalosporine C peut être purifiée par l'une ou l'autre des méthodes pouvant être employées pour la purification de la Céphalo sporine N. En général, ces méthodes sont plus faciles à appliquer, vu la stabilité de la Céphalosporine C dans les solutions acides.
Si la méthode de purification comprend l'emploi d'acétate ou de formiate d'ammonium comme tam pons, ceux-ci peuvent être enlevés de la solution de Céphalosporine C résultante par évaporation et subli- mation sous un vide élevé ou par électrophorèse (en employant, par exemple, la cellule à quatre compar timents de Synge, Biochem. 7. 1951, 49, 642) ou en employant une résine d'échange d'ions convenable.
Les solutions de Céphalosporine C libre, obte nues soit en employant une colonne d'échange d'anions, soit la répartition à contre-courant, peuvent être évaporées à siccité dans le vide, et on peut faire passer la Céphalosporine C à travers une autre colonne d'échange d'anions pour la purifier encore. La Céphalosporine C purifiée peut être convertie en son sel de sodium, si désiré, en la dissolvant dans de l'eau et en amenant le pH à 6,0 avec de l'hydroxyde de sodium.
Les solutions du sel de sodium de la Céphalo sporine C obtenues par l'une de ces méthodes peu vent si nécessaire être décolorées à l'aide de charbon activé, et concentrées dans le vide. Le sel de sodium de la Céphalosporine C forme des cristaux mono- cliniques contenant de l'eau de cristallisation. Il peut être recristallisé dans de l'éthanol aqueux ou du pro panol aqueux. Par séchage dans le vide à la tem pérature ordinaire, il perd de son eau de cristalli sation, qui peut être rapidement regagnée par expo sition à l'air.
<I>Exemple 1</I> On a introduit 6,41 de liqueur de macération de blé, contenant un total de 256g d'azote organique, 6,4 kg de sucrose et 1,408 kg d'acétate d'ammonium, dans une cuve de fermentation d'une capacité de 45001. On a porté le contenu à 3201 avec de l'eau, 108 ml de citrate de triamyle et 30 ml de chloro forme contenant 6 g d'un agent antimousse connu dans le commerce sous la marque Dow Corning Silicone A .
On a stérilisé le milieu et la cuve au moyen de vapeur à 1 atm. pendant 20 min., on a refroidi à 300 C et on a ensemencé avec 81 d'une culture de 72 h de Cephalosporium I.M.I. <I>49137</I> cultivée dans un récipient de verre contenant le même milieu.
On a laissé fermenter à une température de 28-300 C avec une vitesse d'agitation de 400 t/min., tout en faisant passer de l'air dans le milieu à un débit de 4201/min.
Au bout de 48 h, on a refroidi le bouillon à moins de 20 C et on l'a filtré pour en éliminer le mycélium et les spores. On a ajusté le bouillon Iim- pide à un pH de 5,7 au moyen d'acide chlorhydri que et on en a fait descendre 3001,à un débit d'en viron 21/min., à travers une colonne garnie de 301 de carbone granulé, préalablement tamponné avec une solution de phosphate de sodium au pH 6,0 et bien lavé à l'eau.
Après l'adsorption, on a fait descendre de l'acé- tone aqueuse (60% d'acétone en vol.), on l'a recueil- lie par fractions de 41,
puis on a porté chaque frac- tion à 70 % en vol. d'acétone et on a ajusté le pH de manière à obtenir une valeur de 5,8 avec une électrode de verre. On a dosé l'activité antibiotique des fractions et on a séché et pesé les échantillons dosés pour en déterminer la teneur totale en matiè res solides.
On a réuni les meilleures fractions et on a obtenu 361 d'acétone à 70 % en vol., avec un titre de 30 unités par ml.
On a fait descendre un échantillon des 361 d7acé- tone à 70 'o/o en vol. à travers une petite colonne d'alumine activée (60 à 120 mailles) préalablement équilibrée avec de l'eau au pH 4,6. On a estimé qu'il faudrait 51 de cette alumine pour adsorber toute l'activité du restant des 361.
Par conséquent, on a fait descendre le tout à travers une colonne conte nant cette quantité de la même alumine. Après l'ad sorption, on a élué la colonne avec de l'acétone aqueuse à 20 a/o en vol., on a recueilli des fractions, on a réuni les meilleures fractions et on les a ajustées de manière à obtenir une lecture de pH de 5,8 au moyen d'uns électrode de verre.
On a chassé l'acétone de la solution par distil lation sous vide, puis on a congelé la solution aqueuse et on l'a séchée sous vide. La Céphalospo rine brute ainsi obtenue et donnant à l'essai 20 uni tés/mg, a été dissoute dans 110 ml d'eau. Un échan tillon a été prélevé pour servir de témoin dans des mesures spectroscopiques subséquentes. On a ajouté de l'acide chlorhydrique 10N (en général environ 1 ml) jusqu'à ce que la réaction de cette solution corresponde à un pH entre 2,7 et 3,0. La solution a alors été chauffée à 370 C et on en a pris des échan tillons à intervalles de demi-heure.
Ces échantillons ont été dilués avec de l'eau de façon à avoir des solutions contenant 0,075 mg/ml, et on a mesuré la densité optique de ces solutions à 240 mut par rapport à une solution du témoin qui a été diluée de la même manière. La réaction a été considérée comme com plète quand on n'a plus constaté d'augmentation de la densité optique à 240 ml. (120-180 minutes). L'augmentation de densité à 240 m[, était générale ment d'environ 0,3 unité de densité quand on employait une cellule de 1 cm et une concentration de 0,075 mg/ml.
Quand la transposition du compo sant Céphalosporine N en acide pénillique fut ter minée, la solution a été séchée à froid, ce qui a donné 7,0 g de mélange.
Une résine échangeuse d'anions ( Amberlite XE 59), tamponnée avec du formiate d'ammo nium 0,2 M à un pH de 3,0-3,2, a été préparée comme décrit par Hirs, Moore et Stein (l952, J. Biol. Chem., <I>195,</I> 699).
On a garni une colonne de 59 X 4 cm avec cette résine, puis on a fait pas ser de haut en bas à travers la colonne 500 ml de formiate d'ammonium 2 M contenant 0,5'% de thiodiglycol.
On a dissous 3,5 g du mélange de Céphalospo rine C et d'acide pénillique de Céphalosporine N dans 30 ml du tampon 0,2 M et on a ajusté la réac tion de la solution de façon qu'elle soit de 0,2 unité de pH supérieure à celle du tampon dans la colonne. Cette solution a été appliquée à la colonne en trois portions de 10 ml. La vitesse d'écoulement dans la colonne était réglée de façon que chaque portion de 10 ml prenne 10-15 minutes pour pénétrer dans la colonne.
La solution a alors été lavée dans la colonne avec deux fois 10 ml de tampon 0,2 M con tenant 0,5 11/o de thiodiglycol. La colonne a alors été remplie avec la même solution tampon et reliée à un réservoir à niveau constant. La vitesse d'écoulement de la colonne était réglée de façon à recueillir une fraction de 20 ml toutes les 30 minutes.
Des échantillons de chaque quatrième fraction ont été prélevés et dilués dix fois avec de l'eau. On a mesuré les densités, optiques de ces solutions diluées à 240 m#t et 260 mR par rapport à un échantillon semblablement dilué de la solution tampon. La Céphalosporine C se trouvait principalement dans les fractions 96 à 118.
Les fractions 96 à 118 ont été assemblées et concentrées jusqu'à environ 60 ml dans un évapo rateur rotatif à vide à une température au-dessous de 25() C. Le concentre a été évaporé dans un appa reil de séchage à froid de façon à donner un sirop épais. Ce sirop a été lavé deux fois avec de l'acétone pour éliminer le thiodiglycol. Il est resté un mélange de formiate d'ammonium et du sel d'ammonium de Céphalosporine C. Le formiate d'ammonium a été éliminé soit par (A) sublimation sous un vide poussé, ou (B) par électrophorèse.
A) La masse solide restant après lavage avec l'acé tone a été dissoute dans quelques ml d'eau et transférée à un appareil de sublimation. Cette sublimation est effectuée comme décrit par Hirs, Moore et Stein (1952, J. Biol. Chem.,195, 699). Le résidu de la sublimation consistait surtout en sel d'ammonium de Céphalosporine C. Ce sel a été dissous dans 2-3 ml d'eau et on a fait pas ser la solution à travers une petite colonne (0,5 X 0,5 cm) de charbon activé, pour en enle- vers les pigments.
En faisant évaporer doucement le percolat, le produit a cristallisé.
B) La masse solide restant après le lavage avec l'acétone a été dissoute dans 25 ml d'eau et versée dans le compartiment neutre d'une cellule à quatre compartiments (Synge, 1951, Biochem. J. 49, 642). La cellule était munie d'un serpentin de refroidissement à travers lequel on pompait de l'alcool à -50 C. Les compartiments à acide acétique et ammoniaque étaient changés toutes les 3 heures. Le désalage était ordinairement terminé en 12-16 heures quand on employait des voltages jusqu'à 500 volts. Les solutions prove nant des compartiments à acide acétique ont été réunies et séchées à froid.
Le produit, qui con sistait en l'acide libre de Céphalosporine C, con taminé par des traces d'acide acétique, a été libéré de l'acide acétique en le dissolvant dans une faible quantité d'eau, en le reprécipitant avec un grand excès d'acétone et en secouant le précipité avec de l'acétone sec. L'acide libre de la Céphalosporine C a alors été dissous dans de l'eau et neutralisé avec NaOH 2N (0,3-0,2 ml). En laissant évaporer doucement, le sel de sodium a précipité.
Les cristaux ont été débarrassés de toute gomme non cristalline par lavage avec de l'éthanol à 70 %, puis recristallisés dans de l'al- cool aqueux. Le rendement en substance recris- # n tallisée a été de 100 mg. A 260 m#t, E l% était 200.
<I>Exemple 2</I> De la Céphalosporine brute (400 mg) obtenue par fermentation comme décrit à l'exemple 1, don nant à l'essai 22 unités/mg, a été dissoute dans de l'eau (30 ml) et le pH de la solution a été ajusté à 3,0 avec de l'HC12N. La solution a été maintenue à 37 C pendant 21/2 heures, puis on l'a faite passer à travers une colonne de 14 cm de long, contenant 10 g d'alumine (Savory & Moore Ltd., Londres. Pour analyse chromographique)
. L'alumine avait été préalablement agitée avec suffisamment de HCl dilué pour amener le pH du liquide surnageant à l'équilibre à un pH de 4,8. Quand toute la solution eut été ajoutée à l'alumine, il y avait une mince bande brune au sommet de la colonne et une bande jaune pâle s'étendait au-dessous sur les deux tiers de la longueur de la colonne.
Dans le percolat, il n'y avait qu'une trace de substance ninhydrine-positive. La colonne a été lavée avec de l'eau (20 ml) et on en a commencé l'élution avec du NaOH 0,01N, le liquide sortant étant recueilli en fractions de 5 ml, le taux d'écoulement était de 1 ml par minute. L'extinction de ces fractions à 240 ml, et 260 mu a été mesurée dans un spectrophotomètre de Beck- man. A partir de la fraction 13, l'absorption aux deux longueurs d'onde a commencé à augmenter nettement.
Avec les fractions 13 à 17, contenant la Céphalosporine C, l'absorption est restée plus grande à 260 m#t qu'à 240 ml,. A la fraction 18, il y a eu un accroissement subit de l'absorption relative à 240 mu, dû à l'apparition dans l'éluat d'acide pénil lique de Céphalosporine N. A la fraction 21, un pigment jaune est apparu dans l'éluat.
Les fractions 13-17 (pH 5,0) ont été réunies et concentrées dans le vide à 2 ml. Le pigment a été enlevé de la solution résultante en la faisant passer à travers une petite colonne de charbon activé (0,5 cm de diamètre X 3 cm de haut) qui avait été préalablement lavée avec de l'eau. Par concentration du percolat dans le vide, il s'est pris en une masse cristalline de Céphalosporine C. Ce produit pesait 33 mg. Il contenait un peu de gomme non cristal line, et la mesure de son absorption à 260 m[, a indiqué la présence de 25 mg de Céphalosporine C. Les cristaux ont été séparés de la gomme par agi tation avec un peu d'éthanol à 70 0/0, et filtration. Le produit cristallin a été recristallisé dans du pro panol aqueux.
<I>Exemple 3</I> On a dissous un mélange (7,3 g) d'acide pénil- lique de Céphalosporine N et de Céphalosporine C, obtenu comme décrit à l'exemple 1, dans 80 ml de la phase du haut et 40 ml de la phase de fond d'un système solvant préparé comme suit De l'eau saturée de phénol (51), du phénol saturé d'eau (4,51) et de l'acide acétique glacial (0,451) ont été mélangés, et on a laissé le mélange se mettre en équilibre à 200 C. La réaction de la couche supérieure au point d'équilibre correspondait à un pH de 2,6 (à l'électrode de verre).
De la phase de fond (20 ml) et de la phase de sommet (40 ml) de cette solution ont été placées dans les tubes 'O' et 'l' d'une machine de répartition à contre-courant en verre (Craig et Craig, 1950, Technique & Organic Chemistry, vol. 3, chapitre 4). Cent transferts de la couche du haut (40 ml) ont été effectués en opérant selon la méthode fondamentale, lesquels ont été suivis par trois cents retraits de la couche supérieure (40 ml) du tube '100'.
<I>Analyse des fractions:</I> On a prélevé un échan tillon (0,2 ml) de chaque dixième fraction de la série des extraits et on a mesuré photométriquement la densité de couleur développée par chauffage avec de la ninhydrine (0,5 ml), par la méthode de Moore et Stein, 1948, J. Biol. Chem. <I>176,</I> 367. En faisant le graphique des densités optiques obtenues de cette manière en regard du nombre de la fraction, on a constaté une bande contenant de l'acide pénillique de Céphalosporine N dans les fractions 51 à 100 et une bande contenant de la Céphalosporine C dans les fractions 190 à 300.
La valeur du coefficient de partage
EMI0005.0056
de la Céphalosporine C calculée d'après la position du sommet de la bande était de 0,2 et celle calculée pour l'acide pénillique de Céphalosporine N était 0,63.
Les fractions tirées 200-300 ont été rassemblées et concentrées jusqu'à environ 500 ml (400 ml de couche aqueuse et 100 ml de couche de phénol) dans un évaporateur rotatif à vide. Le concentré a été placé dans un entonnoir de séparation et secoué avec 400 ml de tétrachlorure de carbone. Après que les couches se furent séparées, la phase tétrachlorure de carbone a été mise de côté et la phase aqueuse a été extraite trois fois avec un égal volume de benzène. Le résidu aqueux a été concentré à environ 100 ml dans l'évaporateur rotatif, puis séché à froid.
Des traces d'acide acétique ont été éliminées du produit en dissolvant celui-ci dans un faible volume d'eau et précipitant la Céphalosporine C (acide libre) avec un excès d'acétone. Le précipité a été lavé avec de l'acétone sec.
L'acide libre a été dissous dans un petit volume d'eau, puis neutralisé avec de la soude caustique 2 N (0,5-0,6 ml). Le sel de sodium de la Céphalospo rine C a cristallisé quand on a évaporé lentement la solution neutralisée. Les cristaux ont été lavés avec de l'éthanol à 70 Vo, qui en a enlevé la substance non cristalline. Rendement: 168 mg. Cette substance a été recristallisée dans du propanol aqueux.
<I>Exemple 4</I> Une solution aqueuse de Céphalosporine brute éluée d'une colonne à échange d'anions, colonne chargée elle-même à partir d'un bouillon de culture, a été acidifiée à un pH de 2,5 et maintenue à 370 C pendant 2 heures. L'inactivation de la Céphalospo rine N a été complète. La solution a été séchée à froid après qu'on eut ajusté son pH à 5,0. Le pro duit (600 mg, 0,45 unités par mg) a été ajouté à 3 ml d'un tampon d'acétate de pyridine de pH 5,0 [acide acétique 2 M (150 ml), pyridine N (250 ml) et eau (600 ml)], et un peu de substance insoluble a été enlevée par centrifugation.
La solution claire résultante (pH 5,0) a été ajoutée lentement en deux portions au sommet d'une colonne (1,9 X 20 cm) d' Amberlite JR4B (200-400 mailles). La résine avait été amenée à un pH de 5,0 avec de l'acétate de pyridine en lavant la forme acétate de la résine avec le tampon acétate de pyridine (préparé comme indiqué ci-dessus) sur un filtre jusqu'à ce que le tampon versé dessus et celui en sortant aient le même pH, soit 5,0.
Après que la solution de Céphalosporine C brute se fut écoulée dans la colonne, elle a été suivie de deux additions de 2 ml de tampon<B>.</B> acétate de pyri- dine, et on a relié le sommet de la colonne avec un réservoir à niveau constant contenant le tampon acétate de pyridine. La hauteur du réservoir a été ajustée pour donner la vitesse d'écoulement désirée (9 ml/heure). Cette vitesse d'écoulement était obte nue quand la hauteur du tampon dans le réservoir était seulement de quelques centimètres au-dessus de la plaque de fond de la colonne.
L'effluent a été recueilli en fractions de 3 ml toutes les 20 minutes.
Des fractions ont été analysées en mesurant l'ac tivité antibactérienne envers le S.<I>typbi,</I> d'échantil lons qui avaient été neutralisés avec une solution d'hydroxyde de sodium, et aussi par la méthode photométrique à la ninhydrine (Moore et Stein, 1948, J. Biol. Chem. <I>176,</I> 367).
La Céphalosporine C a été éluée dans les frac tions 72-108. Ces fractions ont été réunies et con centrées dans le vide (à 300 C, température du bain) dans un évaporateur rotatif. Le résidu a été dissous dans un petit volume d'eau, transféré dans une cuvette et séché jusqu'au lendemain dans le vide sur de la KOH et du l'@0,;, après quoi on ne pouvait plus percevoir d'odeur de pyridine ou d'acide acé tique. Il a alors été dissous dans un petit volume d'eau (0,3 ml) et on y a ajouté 10 ml d'acétone.
Le précipité a été séparé par centrifugeage, agité avec quelques ml d'acétone, recentrifugé et séché dans le vide; on a obtenu une poudre blanche légè rement teintée, d'acide libre Céphalosporine C. L'acide libre a été dissous dans de l'eau (2 ml) en donnant une solution de pH 3,0, et on lui a ajouté avec soin du NaOH 0,1N (0,49 ml) à l'aide d'une burette jusqu'à ce que le pH se soit élevé à 6,5. La solution résultante de sel de sodium de Céphalospo rine C a été séchée à froid. La substance sèche a été cristallisée en la dissolvant dans un petit volume d'eau et en évaporant lentement cette solution.
La matière sèche cristalline (39 mg) a été débarrassée d'impuretés non cristallines en la lavant avec un petit volume d'éthanol à 70 O/o (v/v). <I>Exemple 5</I> Une solution de Céphalosporine brute éluée d'une colonne échangeuse d'anions, chargée elle-même à partir d'un bouillon de culture, a été acidifiée à un pH de 2,5 et maintenue à 37 pendant 2 heures, durant lesquelles toute l'activité de la Céphalospo rine N a. été détruite. La solution a été séchée à froid après qu'on eut ajusté son pH à 5,0.
Le produit (4 g, 0,08 unité par mg) a été secoué avec 8 ml d'acétate de pyridine pH 5,0 (voir exemple 4). On a ajouté quelques gouttes de pyridine pour maintenir la réaction de la solution à pH 5,0. Après environ 20 minutes, la solution a été centrifugée, et le liquide surnageant a été décanté.
On a secoué le précipité avec encore 4 ml de tampon, recentrifugé, et le second liquide surnageant (12 ml) a été introduit en 4 portions de 3 ml dans une colonne de 2 cm X 42 cm d' Amberlite JR4B (79'0/0 40-60 mail- les, et 20'% 60-100 mailles)
. La résine avait été traitée avec du tampon acétate de pyridine (pH 5,0) comme décrit à l'exemple 4. La solution de Cépha losporine C a été suivie de 2 portions de 3 ml du tampon acétate de pyridine, puis la colonne a été traitée comme décrit à l'exemple 7.
La Céphalo.sporine C se trouvait dans le volume d'effluent entre 280 à 500 ml. La substance dans le volume d'effluent 387 m1-443 ml a été débarrassée du tampon acétate de pyridine et précipitée avec de l'acétone comme décrit à l'exemple 4, ce quia donné 18 mg de Céphalosporine C impure, à l'état d'acide libre. Ce dernier a été dissous dans l'eau (2,0 ml) et on y a ajouté du NaOH 0,1N (0,14 ml) jusqu'à ce que le pH se soit élevé à 6,5. Cette solution a été évaporée lentement et de la matière s'est séparée en cristaux.
Le mélange de substance cristalline et non cristalline a été lavé sur un filtre avec de l'éthanol à 70'% (v/v), ce qui a donné 2 mg du sel cristallisé de sodium de la Céphalosporine C. Le liquide de lavage à l'éthanol a donné 14 mg d'une substance à 2,5 unités/mg. La solution restante du volume effluent 280 m1-500 ml a été trouvée contenir 23 mg d'une substance à 2,5 unités/mg.
Chacun des systèmes de solvants employés pour séparer la Céphalosporine C de l'acide pénillique de la Céphalosporine N par répartition à contre- courant peut être adapté au partage chromatogra- phique, l'une des phases étant adsorbée sur un sup port tel que le Kieselguhr, ou peut être utilisé dans une colonne d'extraction à écoulement continu de solvant telle que celle décrite par Scheibe1 & Karr (Ing. Eng. Chem. 42, p.
1048 - (1950).) Il a été indiqué ci-dessus que la Céphalosporine C est insensible à la pénicillinase, c'est-à-dire qu'elle n'est pas sensiblement attaquée par celle-ci. Cela constitue la propriété avantageuse 1a plus importante du nouvel antibiotique, puisqu'elle le rend utilisable contre les micro-organismes qui produisent de la pénicillinase et qui, de ce fait, sont plus ou moins résistants à la pénicilline. La Céphalosporine C peut donc agir pour protéger la pénicilline contre son inactivation par de tels micro-organismes.
Des essais ont montré que la Céphalosporine C n'est pas sensiblement affectée par la pénicillinase pure produite par des genres de<I>B.</I> subtilis et<I>B.</I> cereus <I>;</I> la table I montre les quantités de dif férentes préparations de pénicillinase qui sont néces saires pour produire une inactivation à 50 %, expri mées en termes de la quantité requise pour la Cépha losporine C divisée par la quantité requise pour une quantité égale de Céphalosporine N.
EMI0007.0011
Table <SEP> I
<tb> Pénicillinase <SEP> Quantité <SEP> relative
<tb> Source <SEP> Pureté <SEP> C <SEP> / <SEP> N
<tb> <I>B. <SEP> subtilis</I>
<tb> (genre <SEP> 749) <SEP> Brute <SEP> . <SEP> 100
<tb> <I>B. <SEP> cereus</I>
<tb> (NRRL <SEP> 569) <SEP> Brute <SEP> 5
<tb> <I>B. <SEP> cereus</I>
<tb> (NRRL <SEP> 569) <SEP> Purifiée <SEP> 30
<tb> <I>B. <SEP> cereus</I>
<tb> 5/B. <SEP> En <SEP> cristaux <SEP> <B>10000</B> Les quantités relatives plus faibles nécessaires de préparations de pénicillinase moins pure sont proba blement dues à la présence d'impuretés ayant un effet nuisible sur la Céphalosporine C.
EMI0007.0013
Table <SEP> II
<tb> Concentration <SEP> la <SEP> plus
<tb> Organisme <SEP> basse <SEP> empêchant <SEP> le
<tb> développement <SEP> en
<tb> <U>24 <SEP> heures, <SEP> #Lg/ml</U>
<tb> <I>Staph. <SEP> aureus,</I> <SEP> genre <SEP> Heatley,
<tb> sensible <SEP> à <SEP> la <SEP> pénicilline <SEP> 50-100
<tb> <I>Staph. <SEP> aureus,</I> <SEP> résistant <SEP> à <SEP> la
<tb> pénicilline <SEP> 25
<tb> <I>Str. <SEP> pyogenes <SEP> 25</I>
<tb> <I>B. <SEP> anthracis <SEP> 25</I>
<tb> <I>N. <SEP> meningitidis</I> <SEP> 1,6
<tb> <I>N.gonorrhoeae</I> <SEP> 1,6
<tb> <I>H. <SEP> pertussis</I> <SEP> 1,6
<tb> <I>H. <SEP> influenzae <SEP> 12,5</I>
<tb> <I>S. <SEP> typhi <SEP> 25</I>
<tb> <I>S. <SEP> paratyphi <SEP> B <SEP> 25</I>
<tb> <I>S. <SEP> typhimurium</I> <SEP> 50
<tb> <I>V. <SEP> cholerae</I> <SEP> 50
<tb> <I>Bact.
<SEP> friedlünderi</I> <SEP> 50
<tb> <I>8act. <SEP> coli</I> <SEP> I <SEP> 200 L'efficacité de la Céphalosporine C contre divers micro-organismes est indiquée dans la table II, laquelle ne doit cependant pas être considérée comme exposant son spectre bactérien entier, et n'est qu'un exposé de cette activité antibiotique telle qu'elle a été constatée jusqu'à présent.
Les caractères de la Céphalosporine C sont illus trés au dessin annexé, dans lequel la fig. 1 est la courbe d'absorption dans l'ultra violet ; -la fig. 2 est le spectre dans l'infrarouge.