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La présente invention concerne,, de manière générale, la production de composés stéroides de valeur par fermentation.
Plus particulièrement, elle est relative à un nouveau procédé microbiologique pour introduire une double liaison entre les atomes de carbone c-1 et C-2 du noyau stéroide à l'aide de
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microorganismes du genre No cardia. Conformément à une forme d'exécution préférée de l'invention, des 4 -3-céto-stéroides tels que le / '-prégnén-3, 11,20-trione-17 ,21-diol et le Q '-prégnène-3,0-dione-11391? c{ ,21-triol sont convertis en fa ' -3-céto-stéroïdes correspondants, à savoir le 1,4¯pré- gnadiéne-3,11, 20-trione-1? c ,21-diol et le fa j., &-prégnadiène- 20-dione-1.1/3, .? o( , .-trio3. respectivement .
Ces, derniers composés possèdent une activité cortisonale, mais diffèrent de la cortisone par le fait qu'ils sont sensiblement exempts d'ef- fets secondaires indésirables, tels que l'oedème, étant donné qu'ils ne possèdent pas d'action appréciable décrètent ion de sodium ou d'eau.
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La préparation des /il,43 't ., -d pax des La préparation des fa ' '-.3-céto-stéroïdes par des moyens chimiques n'a pas donné satisfaction, en raison du fait que les réactions chimiques produisent des mélanges de plusieurs composés. La séparation des produits intermédiaires et finaux désirés à partir de ces mélanges est coûteuse et ne permet
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d'obtenir que des rendements faibles en composés /j 1,4¯3-céto- stéroïdes désirés .
La présente invention a pour objet un procédé en un stade pour introduire une double liaison 1 dans des composés stéroïdes et la réalisation de cette non saturation en ¯1 par/un procédé sélectif donnant lieu à la formation du / 1 sté roide désiré non contaminé par des sous-produits son désirés.
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L'invention a encore pour objet un procédé grâce
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auquel des composés de à -3-céto-prégnènes peuvent être coin- vertis directement, et avec un rendement élevé, en composés de à l'-3-céto-prégnadiène correspondants .
L'invention a encore pour objet la production de 1,4¯.3-céto-stéroides de la série du prégnane, directement et avec un rendement élevé, à partir des composée de 3-céto- prégnanes et de 3-hyd.roxy-prégnanes correspondants* découvert que la 1-déshydrôgénation compo. On a découvert que la /} -déshydrogénation de compo- sés stéroïdes peut être accomplie par un nouveau processus de déshydrogénation microbiologique, qui consiste à mettre un
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composé stéroide,.
en particulier un composé stéroïde non statu- ré en c-5 et 3-oxygéné en contact avec l'activité déshydrogé- nante de microorganismes du genre Nocardia, de préférence de
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microorganismes de l'espèce Nocardia blaelniellii, Nocardia astenides, Nocardia minima, Nocardia globerulaNocardia leish- manii, Nocardia formica, Nocardia oonvoluta!t Nocardia coral- lina.Ces microorganismes du genre Nocardia peuvent être obtenus à partir de sources connues, telles que 1' american Type Culture Collection de Washington ou bien ils peuvent être isolés de sources naturelles, telles que le sol ou des processus morbides, par des procédés connus .
La déshydrogénation peut s'effectuer par contact du composé stéroide avec les microorganismes du genre Nocardia eux-mêmes ou, si on le préfère, avec des systèmes enzymatiques des microorganismes du type Nocardia, de façon que l'hydrogène attaché aux atomes de carbone c-1 et C-2 soit sélectivement éliminé, de manière à produire le /\ -stéroïde désiré sensible- ment non contaminé par des sous-produits indésirables . Lorsque le composé de /\ -3-céto-prégnène est soumis à l'activité déshy- drogénante de microorganismes du genre Nocardia, le composé ¯1,4
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prégnadiénique est obtenu directement et avec un rendement élevé .
Bien que le nouveau procédé de déshydrogénation microbiologique soit applicable à la -déshydrogénation de
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composés 3-céta-sGéraides en général, quels que soient les
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substituants attachés aux noyaux B, C et D ou le degré de
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non saturation de ces noya"ux, on préfère ordinairement utiliser,
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comme matière de départ dans ce procédé, des composés stéroïdes
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non saturés en 0-5 et 3-oxygéués de' la série du prégnane, tels que par exemple les / "-3-céto-prégnèneSj comme la f\ -prégnène 3,20-dione, le /\ -prégnène-3,20-dione-17 0-0l, le ( 4¯prégnène" 3,20-dione-21-ol, le 21-acylate de 4¯prégnène -3,20-dione-21- ol, le 21-acétate de / -prégnéyze-3,2fl-dione-21-oL, le -pré- gl1ène -3,20-diozze-l'7 c(,2ldio, le 21- acylate de /\ 4¯prégnène- 3,20-dione-17 ,21-diol,
le 21-acétate de /[ -prégnène-3?20-dio- ne-17c(,21-diol, le /, -prégzaè??e-3, 20-diozze-.7 -ol-21-al, la (j -prégnène-3,ll,20-trione, le , -prégzzèz?e-3,11,20=criozze-î? c( -ol, le '--prégnèzxe-3,11,20-tr3one-.2'..-ol, le 21-acylate de 6 4- .prégnène-3,1.1.,2Q-trio:xe-21-ol, le 21-acétate de % iF.picg:z.2xe4, 3, 11¯, 20- trio11e-l-ol le '.-prégnèzxe-â,1.,2fl--tiohze-17 c't 321-dio3a le 21-acylate de ' -nrégzxEZZ.e-3,1.,.!.triorze-1721d.o., le 21- acétate de -pr ég:zne:
, .., 20-trione-l ,2:!-diol, le /J. 4¯pré- gzZêne--3,1.,2Q-trzone-1? c(-ol-21¯al, le /\-prGgnène-3,2O-dione- 11/3 -ol, le f '-prégzzéixe-.3, 2fl-dïone-1 , 2.-di oi, le 21-acylate... de -prégnène-3, 20-dione-ll,21-diol, le 21-acéSate de Li4¯p1"é- ânèrze--3,0-diozxe-,..,/ ,l d3.ola le s^., pre néne¯3,z0-d.ozxe-lI - .Ge Qy -pre ,ncne.,,J-o..one .,3., ,3.'!r -d.ol, o1-al, e '-prégszéne-3, 20-dione.-li/'.5 , l'% c( , 2ldtrio;
le 21-acy- late de L\ -.pré;aën,e.3, 20.d.one-11,17, 2'Z-'rio3., le IJ 4¯prégnène@ 3,20--dio;.e-llg.7 c-d.oL-21-a1, le 21 acétate de (j 4¯p1"égnène-3, 20-dione-ll, l7 c,?Z..trioi, les dérivés 9-halogénés de ces L1 4-3-céto-prégnènes, conutte le 9¯halo-/\ -prégnène-3, 20-dione-17}
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21-diol, le -fluoro- -prégnëne-3, 20-dione-17 c( , 21-diol, le 21-acylate de 9¯halo¯± -prégnène-3,2fl-dione-.17,21-d3.ol, le 21-acétate de 9-fluoro..L1 '-prgnène-3,2t-dione-1? c(,21-diol le 9-halo -/3 -prégnène-,11,20-trione -17, 21-diol, le 9-fluo- ra-/-prégnëne-3,11,:-trzone-17 d,21-diol , le 21-acylate de 9-h.àlo-A 4o¯prégnèna-3,11,20-trione-17,2l-diol, le 21-acétate de 9-fluoro- "-prégz:
ène-,3.Z,2t-trione-li d 21-diol, le 9-halo. 4¯prégnène-J,20-dione-ll,17,21-trio1, le 9-fluoro-à 4¯prégnè- ne-3,20-dîone-il..Al?o(,21-triol, le 21-acylate de 9-halo- 4 prégnéne-3,2ü-d3.one-.1,17,21-triol, le 21-acétate de 9-fluoro-.
'¯prégnène-3,23-dion s-11391' 4,21-triol et analogues . Au lieu de -3-céto-prêgaène% on peut employer, comme matières
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de départ, d'autres composés stéroldes non saturés en C-5 et
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3-oxygénés ,tels que les /\ ¯3..lydroxy-prég>xèrzes, comme le- / 5 -prégnène-20-one-3-ol, le -prégnène-20-one-3 , 17 c(-diol, le 5-prégnène-2D-one-3,21-diol, le 21-acylate de -prégnè- ne-20-one-3,21-diol, le 21-acétate de /\ -prégnène-20-one-3,2i- Jt diol,f,l -prégnène- 20-one-3,17 4,21-triol, le 21-acylate de j 5-prégnéne-2t-one-3,1?,21-triol, le 21-acétate de ±15 -prégnè- ne -20-one-3,17o(,21-triol, la 5¯prégnèna-ll,20-dione-3-o1, le 5-prégnène-ll-,20-dione- 3tel7 4 -diol, le /\ -prégnène-11, 20-dione-3,21-diol, le 21-acylate de '-prégnène-11,20-dmone- 3,21-diol, le 21-acétate de 5-pz gzxène-.1,20-dione-3321-di.oli le L1 -prégnène-11,
2-dione-3,.'l a(,21-triol, le 21-acylate de 5-prégnène-11,20-dione-3,1-7,21-trîol, le 21-acétate da 5. prêgnèzae-11,2(3-dione-.,17 c,2.-triol le /\ -prégnène-20-one- 3,11/3 -diol, le -prégnène-2-one-3,I13;21-triol,le 21-acylate de à 5-prégnène-20-one-3,11,21-triol, le 21-acêtate de 5¯pré- gnène-20-one-3,11/1 ,21-triol, le j 5-prégnèrze-20-one-3,11 ,170 -triol; le 5 -prégnène-20-one-.3 ,11.8 ,17 4 21-tetrol, le 21 - acylate de fa -prégnène-20-oae-3,ll,17,21-tetrol, le 21-acétate
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de /, -prégtiène-20-one-â , lly l 7 d , 21-tebroi, le s dérivés 9-halo- génés de ces 5 tels que le 9-halo-j 5- prégnène -20-one-3Slaê-triol, le 9 fluoro-'r,-prêgnène-20-. one-3.17 d,21-triol, le 21 acylate de 9-halo-5-prégnène-20- otle, , :i , 2:.t::
.cal, le 1-acétate de 9-fluoro - -prégnène-20- one-3,17 c,2. :r.1, le 9-halo- .-prêgnèzwe-11,2û-dson.e-,1r,21 '-triol, le 9-.fluoz.o- -prégnène-11!/3, 20-diozze-3,17 c(,21-triol, le 21-acylâte de 9-halo-/ 5-prégnèî).9-llî20-dione-3, 17,21- triol, le 21-acétate de 9-f luoro 5¯prégnène-11j3 ,20-dione-i3,17 c{ , 21w triol, le 9-halo-a le 9-flu- oro-d, -prëgnène-20-orae.,l. ,.i o{,21-tëtroi., le 21-acylate de 9-halo-â 5 -prégnène 207-one-3,11,17,21-tétrc)l, le 21-acétate de 9-fluoro- 5-pW gnëne-20-one-.$,11 ,1' t,21.-tétrol, et les -3-(alcanoyloxy inférieur,}.prégnènes tels que les 3-(alcano- ates inférieurs) de 5-prégznzze20-.one-3-ol, le 3-acétate de Li 5-prégnène-20-oiie-3-ol, les 3- (a.lcanoates inférieurs). de /( - prégnène-20-one-3,17-diol, le 3-acétate de ± -pré;
tzèazc..z0-,ona- 3,17 c(-diol, les 3-(alcanoates inférieurs) de 3 5¯prégnène-20- one-3,21-diol, le 3-acétate de /\ -prégnène-20-oae-3,21-diol, les 3,21-bis (alcanoates inférieurs) de t -pz êgtaènem2t3-ozae-,, 21-diol, le 3,21-diacétate de /3 y;rgaaeFt-20-..or'e-,21-diol, les 3- (alcanoates inférieurs) de ' ..>p;
êgnèPZ-2Q-ozze-3,17, .-trioZ, le 3-acétate de L1 5 -prégnène-20-.one-3 , 17 c{,2..-trJ.oZ, les 3,21- bie(alcanoates inférieurs) de ) . 5 -prégnène -20-one-3,17,21-tri- ol, le 3,21-diacétate de -régzzène-?0-one-3,.'Î c,21--t iol, -/'les 3-(alcanoates inférieurs) de j 5-nrégnène-11,20-dione-3-ol- le 3-acétate de (1 -pré;nène sl ? , 20-diozze-.â-ol, le 3- ( alaanoates inférieurs)de -prégnène-ll,20-dioae-3,17-diol, le 3-acétate de 5-prégnène ll}20-dione-3,17 ct-diol, les 3-(alcanoates infé- rieurs) de 5¯prégnène-ll,20-dione-J,21-diol, le 3-acétate de /j -prégnène-ll,20-dione-3,21-diol, les 3,21-bis(alcanoates infé- rieurs) de à 5¯ préguëne-1.,20¯dion.e-3,21-diol, le ;
,21-diacétte
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de / -prégnène-11,2-dione-3,a.-diol, les 3-(alcanoates inférieurs) de tl-prégnène-ll,20-dione-3,17,2l-triol, le 3- acétate de /-prégnène-11,2J-dioiae-3,17 ci,21-triol, les. 3, 21- bis(alcanoates inférieurs) de -prégnètze-7.1, 20-diotie-3,17, 21-triol, le 3,21-diacétate de -prégnêne-ll,20-dione-3,17 4 ]2l-triol, les .3-(alcanoates inférieurs) de/prégnène-20-one-3, 11-diol) le 3-acétate de /¯prégnèzie-2fl-one-3?113 -dioL, les 3-(aloanoates inférieurs) de f-20-one-3,1l,17-trPl le 3- acgtate de J -20-one-.3,.1Jj3 ,17 d -triol, les 3-(alcauoates in- férieurs) de /-prégnène-20-one-3,11,21-triol, le 3-acétate de /JS.:prégnène-0-one-3,11,3 ,21-triol, les 3,21-bis{alcanoates inférieurs) de Il-prégnène-20-one,3 ,ll,Zl-triol, le 3,23:
-diacé- tate de 'i5 (prégnène-20-otxe-3,113 ,21-triol, lés 3-(alcanoates inférieurs) .de /15-préglène.-20-otxe-3 ,11 c( ,17,21-tétrol, le 3- acétate de -prégtiène-wtJ-one-3,ZZf3 ,17 Q ,21-tétrol, les 3, 2l-pis(alkauoates inférieurs) de /!5-prégnène-20-one,3,11,17,21- tétrol,' le 3,21-diacétate de /5-prêgciène..20-one-3,1133 ;
17 d , 21-tétrol, les dérivés 9-halogénés de ces /5-3-alanoylox3r inférieurs)-prégnènes, tels que l.e s. 3- { alcanoates inférieurs) de 9-halo--prégtiène-20-one-3,17,21-trial, le 3-acétate de 9- fluoro--prégnène-2d-one-3,17 c{,1-triol, les 3-(alcanoates inférieurs) de 9-halo-f-prégnène-ll,20-dione-.3,17,2l-triol, le 3-acétate de 9-f luoro--prégnène-Zl, 20-dione-3, L7 .d , 2l-triol, les 3,21-bis{alcanoates inférieurs) de 9-halo-/j -pré gnène- 11,20- dioxe-3,17,21-triol, le 3,21-diacétate de 9-fluoro-/j -prégnène- ,
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ll,20-dione-3,17 d ,21-triol, les 3-(alcanoates inférieurs) de
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9-halo-/-prégnène-?0¯orie-3,11,17,21-tétrol, le. 3-acétate de 9-f iuoro-/-prégrrène-20-one-3 ,11 , ,17 d ,2i# tétro.i;
les s 3 , 21- ' bis (alcanoates inférieurs) de -halo--pgiène-2Q.-otte-3,11, 17,21-tétrol, le 3,21-diacétate de 9-fluôro-/f-prégnène-20-one- .31j1/.3 ,17 ci ,21-tétrol et analogues.Ces'prégnènes /) 5-3-oxygétié
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de départ sont convertis directement par l'activité déshydrQgé-
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nante de ces microorganismes du genre Nocardia en / '-3-eéto-
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prégnadiènes correspondants, cette conversion pouvant s'opérer, suppose-t-on, par formation intermédiaire du compose. - -ce-
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tonique.
Dans iesbatières dl départ susmentionnées, le substi- tuant ester préféré dans lepositions 3 et/ou 21 est ordinai- rement l T acé1:;a:e 1 b:i.ell cure d'autres esters,acides carboxyliques
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d'hydrocarbures inférieurs, tels que le propionate , le butyra-
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te, le t .er.t. -butylacétate ,fbenzoa'Ge et analogues puissent être #employésAu lieu de l'acétate, j.i on le désire.
Au lieu de ces prégnènes C-5 non saturés et 3-oxygénés, on peut aussi utiliser, comme matières de départ des composés 3-céto-prégnanes, 3-hy- droxy-prégnanes ou 3-hydrox5=ull.opa c ;zxaes, qui sont sélective-
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ment déshydrogénés par les microorganismes du genre Nocardia,.
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de manière à produire une - eû 4 non-saturation ( et dans le cas des composés 3-hydroxy-prégaanesj, une oxydation da radai-
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cal 3-hydroxy en substituant 3-céto), en sorte que l'on obtient
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le composé l''-3-céto-prégnadiènique correspondant. Les 3céto-prégnanes et 3-hydroxy-prégnalies que l'on utilise ordinai-
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rement comme matières de départ pour ce procédé de déshydrogéna-
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tion microbiologique à l'aide de microorganismes du genre Nocar- dia comprennent la pré ;tzatae-3,<-dzoae, le. irégzme-3,?Omdioge-.
170(-0l, le prégnane-3,20-diozïe-21-ol, lei prégiaz?ev,0¯dione- 17 ci ,21-diol, la prêgnane-.â 9113 9-. trioae, le prégnane-3, 11,20- trione-17 d-ol, le prégnane-3, 11, 20-"trione-21-01, le préggane- 3,ll,20-trione-17,21-diol, le pr.êgnane.-.,L1¯d,Ole-1.-0l, le prégnane-3,20-dione- 11p, ,1' c(-dio1, le prëgztarxe-3,--diorae-11/3 21-diol, le prégnane.,3 ).O-.diOl1e-l/3 ,.7 d, 21-trio1, le prégnane...
20-one-3-ol, le prégnane-20-one-3 ,17 d..diol, .a ¯pr;gnazie-20-o:e- 3,21-diol, le prégnane¯20-one-3,17 ci ,21-triol, .Le prégnane-11,20--. dione-3-ol, le prégnane -11,20- dïone-3 , I' -d,iol, le prégnane- ll,20-dione-3,21-diol, le prégnane- 111,20-di.oiie-3,'Lee 4,21-trlol, le prégnane-.0¯one-,î..disl le prégzlane-?.-one-3,1./3 ,17 c(-
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triol, le prégnane-20-one-3,11ss,21-triol le prégnane-20-one- 3.11-3,17Ó ,21-tétrol et, pour les matières de départ énumé- rées plus haut, qui contiennent des radicaux hydroxy dans les positions 3 et/ou 21, leurs 3- et/ou 21-esters avec des acides carboxyliques d'hydrocarbures inférieurs, tels que l'acide adé- tique, l'acide propionique, l'acide tert-butyl-acétique l'aci- de benzoïque et analogues .
Le présent procédé de déshydrogénation microbiologi- que consiste à mettre le'composé,stéroïde 3-oxygéné en contact avec l'activité déshydrogénante de microroganismes du genre Nocardia . Ceci peut se faire en ajoutant, dans des conditions stériles, le composé stéroïde, sous forme de solide ou sous forme d'une solution dans un solvant, tel qu'une dialcoylcétone comme l'acétone, une dialcoyl-formamide comme la diméthylforma- mide et analogues, à une culture du microorganisme dans un mi- lieu nutritif, et en agitant le mélange résultant, de manière à assurer la croissance du microorganisme et la déshydrogénation du composé stéroïde.
Le stéroide peut être ajouté au moment où le milieu nutritif est inoculé à l'aide de la culture de micro- organismes du genre Nodardia ou bien il peut être ajouté à une culture établie. Au lieu dajouter le composé stéroïde à la culture établie dans le milieu nutritif, les cellules de cette culture peuvent être séparées par filtration du bouillon , la- vées à l'eau distillée et mises en suspension dans une solution aqueuse tamponnée contenant le composé stéroïde 3-oxygéné, le mélange résultant étant agité de manière à opérer la déshydro- génation du composé stéroide, de façon à former le stéroïde 1 ¯ "3-oxygéné correspondant.
Ge dernier est récupéré plus fa- cilement de ce milieu que du mélange obtenu, lorsque le stéroide est incubé avec le microorganisme dans le milieu nutritif ori- ginel, tandis que des rendements plus élevés en -stéroïdes sont obtenus avec ce milieu, lorsqu'on fait usage de 3-hydroxy- prégnanes comme matières de départ. Le stéroïde 3-oxygéné peu
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aussi être mis en contact, 1I'C des préparations enzymatiques
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déshydrogénantes provenait :.e la croissance: de microorganismes
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du genre Nocardia, de 5.5. sre à former le composé stérol.de Al3 'é LI -.3-oxygaé oorres>enc".a< '.
Í:,E'1=,..:t. 'J';:; --.-.-.# ils utilisés pour l'exécution de cette dé !shydl'og;, .<;.:.J '.0[' [1:. :eobiologique sont ceux ordinairement
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utilisés pour la propagation des microorganismes du genre No-
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cardia. Les matières RU'c:riti7es usuelles comprennent une source d'azote et de carbone, des ?3ls Inorganiques et des facteurs
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de croissance lorsque ceux-ci sont nécessaires .
Le carbone
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peut être fourni par des l'v: ,'c,..:;ùz rels que acétates, et lacta-
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tes, ce qui assure une croissance accrue et des rendements plus
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élevés dans le cas de (i0!.'S,:oj n033 espèces, telles que le Nocardia blackwel1ii et analogues , --"2.zo'G':' peut être fourni par un sel ammonique, des a:zTaomac:s 0'.1 des protéines, telles que les graines de soja, les avoines ':',2. levure, les extraits de levure les produits de ,j1.;sest,Ü,u t:. T;'¯,r:w.s,.u de caséine., les extraits de viande, les farines 1..10 8,"W:: les '1[!':taades protéiniques et les fragments da,r, le..Marine de oé':'.1.Ti!Ollt les farines de pois- son, les solubles d 00 1. "3 ,?,,}Ü, 1; s':<.Lole3 de distillateur et analogues.
Si on le c,4-'il:/-î '... 0\ n::'.\-, 'ooa:ii.'3es du gtnre Nocar- dia peuvent être ¯¯. #;. c ' . -># #-#'cilii j.;.t. -:.is protéines (or. des amino-acides) s#' ùo :.a T'"f''?'-?:,¯ de ç; '3..(' '::0;';:: en présence dans le milieu auquel sa-j ,2S ':'\.2:i. c"'-:':\ .'.:!? oxacide servent de sour- ces de carbone tâ- ¯ .'.,c ' }:;.j,11.: ###;.:-" Z.-3& FIILiOZ'gaEI3.;11185 Bien q1!$, C'."'-::- '-"¯: :. - ¯. v d,: plus îls Lt2 la déshydro- génation du compris*, fi : I-.'''-"1 .1 =¯:f 9'.w suisse se faire en uti- lisant des prép? . ¯ ::û'::..:....',.:
(¯C'..5 cl;::;11)dro'bfmD.ntes provenant de la croissance de ;.,lCI''-::';'-;'',-.,:,Ü5me:,> du genre Bocard ou en mettant le composé 1:'(.0:;, ;);;'.110 'è..U ct-iitaet :';\" une suspension d fune culture établie "::t1.'.[:;:' -5.::; l' S-ôH1. c v..:;;i 11 : . 3 ",. préfère ordinaire ment ajouter le frFaf.a.¯.: ,:;i:'S2. ,)},i."k: 3 r'"îr%eûë il un milieu nutritif
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contenant une culture de 24 heures de microorganismes du genre Nocardia. La proportion de composé stéroïde, qui peut être ajoutée au milieu, varie selon le substrat particulier à déshydrogéner, mais on préfère ordinairement employer une con- centration d'environ 0,005% à 0,2% de composé stéroïde 3-oxy- géné, bien que des concentrations plus élevées ou moins éle- vées puissnt être utilisées, si on le désire.
La culture con- tenant le composé stéroïde 3-oxygéné ajouté est alors incubée, de préférence en, agitant et en aérant, pendant une période supplémentaire qui varie ordinairement entre environ 10 heures et 50 heures, bien que des durées de fermentation plus courtes ou plus longues puissent être, avantageuses pour la déshydrogé- nation de substrats 3-céto-stéoides particuliers. En raison du fait que des fermentations prolongées peuvent adonner lieu à la destruction d'une partie du composé /\ 1-3-céto-stéroide on pré fère ordinairement appliquer une durée de fermentation d'envi- ron 10 à 24 heures, qui, selon le substrat stéroïde utilisé,, donne des rendements maxima en produit stéroide -déshydrogê- né .
Lorsque le processus de déshydrogénation est terminé, le produit est avantageusement récupéré du bouillon fermenté par extraction à l'aide d'un solvant non miscible dans l'eau, tel qu'un hydrocarbure chloré, comme le choroforme, une cétone, comme la méthylisobtylcétone, un alcanoate d'alcoyle, comme l'acétate d'éthyle, etc.... L'extrait contenant le produit stéroïde /\ -déshydrogéné et éventuellement de la matière de dé- part qui n'a pas réagi, est avantageusement purifié par chroma- tographie, en utilisant du gel de silice, dé l'alumine activée, etc.. ou bien, si on le désire, par des chromatogrammes sur pa- pier descendant.
Après séparation du produit déshydrogéné de la matière de départ qui n'a pas réagi, le produit peut être purifié davantage, si on le désire, par recristallisation dans un solvant, tel que l'acétate d'éthyle, les mélanges acétate
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d'éthyle-ether de pétrole et analogues .
Par ce procédé de déshydrogénation microbiologique, en utilisant les composés stéroïdes 3-oxygénés et non saturés en C-5, les 3-céto-prégnanes et les 3-hydroxy-prégnanes énu-
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mères plus haut, on obtient des /} ' -3-céto-prégnadiènes, tels que la 6 1 ' -prégtadiène-3 c 20-dione , le 6 l' '-prégnadiène-3 , 20- dione-17 c(-o., le ± 1s -rrêgnadiène-3,2-dione-2l-ol, le d 1,4. prégnadiène-3,20-diflnee1? c(,21-diol, le Q l'"-prégnadiène-3,20- pdione-1? c(-ol-21-al, le- 1,4:
prégnadiène -3,11,20-trione, le fa 1'*-prégnadiène-3-1.,20-trivne-7.7 c(-ol, le /jl,4¯prégne.diène- 3,ll,20-trione-21-ol, le l''=prégnadiène-31?,20-trioze-17 21-diol, le /\ -prégMdiene-3,ll,20-.trione-17 d-o?-21-a., le / l''-prêgnadiènr-3,û0-dionei E 11 -ol, le n Z''- prégnadiène-3, 20-dione-11,-01-21-al, le /11,4¯Drégnadiène-3,20-dione-1 21- diol, le '' '-prégnadiène;.3 20¯dione-lll3 , 17 4 -diol, le (\ 1> - prégnadiène-3,20-diozze-1./3,1r c(,21-triol;
des 1,4¯3-Cét- prégnadiènes 9-halogénés, tels que les 9-halo- #!- ¯prégnadiène- 3,20-dione 17,21-diols, le 9-flLCro-/ Z''- prégnadiùne-3,20-d-i.oni 17 c{ ,21-diol, les -halo- ''-préguadière-3,20-dione-.'I,11321- triol, les 9-halo- l'-prégnadiène-3,11,20-trione-17,21-dio3, le 9-. luoro-1'' '-pré gnadzène-3,11, 20-trione-7.7 c , 21-diol, le 9-fluoro-./j '' -prégnadiëne-3, 20-diozle-113,17 ((,21-trio ou les composés / 4¯prégnéniqUes correspondants et analogues .
Les exemples suivants illustrent des modes d'exécu- tion de la présente invention, mais il est entendu que ces exem- ples sont donnés à titre illustratif et non limitatif.
EXEMPLE 1.-
On prépare 50 cc d'un milieu nutritif de composition suivante:
EMI11.2
<tb> Cérélose <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Eda.mine <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 0,25 <SEP> ce
<tb>
EMI11.3
Eau distillée q.s.a3; 50 ce .
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Ce milieu est amené à pH 6,5 à l'aide de KOH, stéri- lisé et inoculé à l'aide d'environ 2,5 à 5 cc d'une culture de Nocardia astéroïdes ma 272; ATCC 9970) et la culture inoculée est alors incubée à une température de 28 C, en agitant, pen- dant 48 heures.
A la culture résultante, on ajoute une solution contenant 10 mgr d'hydrocortisone ¯ 4-prégnène-11,3,17 d ,21-tri- ol-3,20-dione) dissous dans 0,1 ce de diméthylformamide* La cul- ture contenant le composé stéroide est incubée, en agitant, pendant une période supplémentaire d'environ 24 heures à 28 c
Le bouillon de fermentation est extrait à l'aide de quatre fractions de 50 ce d'acétate d'éthyle et les extraits à l'acétate d'éthyle sont combinés et évaporés sous vide jusqu'à un volume d'environ 5 ce. La solution concentrée est alors uti- lisée pour préparer des chromatogrammes sur papier, qui sont développés en utilisant de la formamide comme phase liquide stationnaire et du chloroforme comme phase liquide mobile.
On obtient deux bandes dont l'une ( qui correspond au constituant le plus mobile) présente la caractéristique maximum d'absorp- tion d'ultra-violet de l'hydrocortisone et dont l'autre (qui correspond au constituant le moins mobile) présente un maximum d'absorption d'ultra-violet à environ 242 mu Le chromatogram- me sur papier est séché et la bande correspondant à l'adsorption de 242 mu est découpée et extraite à l'aide de méthanol. La matière extraite à l'aide de méthanol est à nouveau soumise à une chromatographie sur papier, en utilisant du papier, qui a été extrait pendant 48 heures à l'aide de méthanol, et en fai- sant usage du système chloroforme-formamide précédemment employé.
Le chromatogramme résultant ne présente qu'une trace de bande correspondant à l'hydrocortisone de départ, tandis que la bande principale a un maximum d'absorption d'ultra-violet à 242 mu .
.Le chromatogramme sur papier est séché à fond,et la bande cor- respondant au maximum d'adsorption de 242 m .est découpée et
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extraite au méthanol. L'extrait méthanolique est évaporé sous
EMI13.1
vide jusqu'à siccité, eu sorte qu'on obtient de la A 1,4 -prégnadiène-lL6 17 d,1-tri.oL-3,0-c?iozae. EXEMPLE 2.-
Ou prépare 50 ce d'un milieu nutritif de composition suivante :
EMI13.2
<tb> Cérélose <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Edamine <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 0,25 <SEP> ce
<tb>
<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> q.s.ad <SEP> 50 <SEP> cc.
<tb>
Ce milieu est amené à pH 6,5 à l'aide de KOH ,stéri-
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lisé et inoculé-à l'aide d'environ 2,5 à 5 ce d'une culture de Nocardia minima (ICi. 292; i11CJ 8674) et la culture inoculée est alors incubée à une température de 2ë C , en agitant, pendant lu8 heures.
A la. culture résultante, on ajoute une solution contenant 10 mgr d'hydrocortisone (/ '-prégnène-1J./3 ,1.7 d 9f 1- triol-3,0-d.iote j dissous dans 0,1 cc de dinzéthy3 formâani de< La culture contenant le composé stéroïde est incubée, en agitant, pendant une période supplémentaire d'environ. 24 heures à 28 c
Le bouillon de fermentation est extrait à l'aide de
EMI13.4
quatre fractions de 50 ce d?acétate d'éthyle et les extraits à l'acétate d'éthyle sont combinés et évaporés sous vide jusque un volume d'environ 5 cc. La solution concentrée est alors uti- lisée pour préparer des chromatogrammes sur papier , qui sont
EMI13.5
développés en utilisant de la forJ;!3.I!1ide COI,lTI10 phase liquide stationnaire et du chloroforme cornue phase liquide mobile.
On obtient deux bandes , dont l'une (qui correspond au constituant le plus mobile) présente la caractéristique maximum d'absorption d'ultra-violet di l'hydrocortisone et dont l'autre ( qui corres- pond au constituant le moins mobile) présente un maximum d'ad-
EMI13.6
sorption d'ultra-violet à environ 242 fil . Le chromatogramme sur papier est séché et la bande correspondant à l'absorptior
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de 242 mu est découpée et extraite à l'aide de méthanol. La matière extraite à l'aide de méthanol est à nouveau soumise à une chromatographie sur papier, en utilisant du papier,' qui a été extrait pendant 48 heures à l'aide de méthanol, et en fai- sant usage du système chloroforme-formamide précédemment em- ployé.
Le chromatogramme résultant ne présente qu'une trace de bande correspondant à l'hydrocortisone de départ, tandis que la bande principale a un maximum d'absorption d'ultra-violet à 242 mu Le chromatogramme sur papier est séché à -fond et la bande correspondant au maximum d'absorption de 242 mu est dé- coupée et extraite au méthanol. L'extrait méhanolique est éva- poré sous vide jusqu'à siccité, en sorte qu'on obtiant de la ¯ 1,4 prégnadièbe-11,3,17 Ó 21-triol-3,20-dione
EXENPLE 3
On prépare 50 ce d'un milieu nutritif de composition suivante:
EMI14.1
<tb> . <SEP> Cérélose <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Edamine <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> maïs <SEP> 0,25 <SEP> cc
<tb>
<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> q:s:ad <SEP> 50 <SEP> ce.
<tb>
Ce milieu est amené à pH 6,5 à l'aide de KOH, stéili sé et inoculé à l'aide d'environ 2,5 à 5 ce d'une culture de Nocardia astéroïdes MA 289; ATCC 100,04)et la culture inoculée est alors incubée à une température de 28 C en agitant, pen- dant 48 heures. A la culture résultante, on ajoute une solution contenant 10 mgr d'hydrocortisone ¯ 4-prégnène-11ss 17 Ó 21 triol-3,20-dione) dissous dans 0,1 cc de diméthylformamide. La culture contenant le composé stéroïde est incubée, en agitant, pendant une période supplémentaire d'environ 24 heures à 28 c
Le bouillon de fermentation est extrait à l'aide de quatre fractions de 50 ce dtacétate d'éthyle et Les extraits à l'acétate d'éthyle sont combinés et évaporés sous vide jusqu'à un volume d'environ 5 cc.
La solution concentrée est alors uti-
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lisée pour préparer des chromatogrammes sur papier, qui sont développés en utilisant de la formamide comme, phase liquide stationnaire et du chloroforme comme! phase liquide mobile.On obtient deux bandes, dont l'une qui correspond au constituant le plus mobile) présente la caractéristique maximum d'absorption dultra-violet de l'hydrocortisone et dont 1-' autre (qui corres- pond au constituant le moins mobile),
présente un maximum d'ab- sorption d'ultra-violet à environ 242 muLe chromatogramme sur papier est séché et la bande correspondant à l'absorption de
242 mu est découpée et extraite à l'aidp de méthanol. la matière extraite à l'aide de méthanol est à nouveau soumise à une chro=- matographie sur papier, en utilisant du papier, qui a été ex- trait pendant 48 heures à l'aide de méthanol, et en faisant usa- ge du système chloroforme-formamide précédemment employé .Le.
chromatogramme résultant ne présente qu'une trace de bande cor- respondant à L'hydrocortisone de départ, tandis que la bande principale a un maximum d'absorption d'ultra-violet à 242
Le chromatogramme sur papier est séché à fond et la bande --or- respondant au maximum d'absorption de 242 mu est découpée et extraite au méthanol.
L'extrait méthanolique est évaporé sous vide jusqu'à siccité, en sorte qu'on obtient de la 1,4 prégna diène-11ss ,17 Ó,21-triol-3,20-dione EXEMPLE 4.- On prépare 50 ce d'un milieu nutritif de composition suivante:
EMI15.1
<tb> Cérélose <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Edamine <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 0,25 <SEP> ce
<tb>
<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> q. <SEP> s. <SEP> ad <SEP> 50 <SEP> ce.
<tb>
Ce milieu est amené à pH 6,5 à l'aide de KOH, stérili- sé et inoculé à l'aide d'environ 2,5 à 5 ce d'une culture de Nocardia globerulaMA 280 ATCC 9356) et la culture est alors
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incubée à une température de 28 C en agitant, pendant 48 heu- res. A la culture résultante, on ajoute une solution contenant
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10 mgr d'hydrocortisone (LI 4¯prégnène-l1j3 ,17 c( ,21- trio 1-3, 20- dione) dissous dans 0,1 cc de diméthylformamide. La culture contenant le composé stéroïde est incubée, en agitant, pendant une période supplémentaire d'environ 24 heures à 28 c
Le bouillon de fermentation est extrait à l'aide de quatre fractions de 50 ce d'acétate d'éthyle et les extraits à l'acétate d'éthyle sont combinés et évaporés sous vide jus- qu'à un volume d'environ 5 ce.
La solution concentrée est alors
EMI16.2
utilisée pour préparer des chromatogramrues sur papier, qui sont développés en utilisant de la i'ormamide comme phase liquide stai tionnaire et du chloroforme comme phase liquide mobile. On ob- tient deux bandes, dont l'une (qui correspond au constituant le plus mobile) présente la caractéristique maximum d'absorption d'ultra-violet de l'hydrocortisone et dont l'autre (qui cor- respond au constituant le moins mobile) présente un maximum d'adsorption d'ultra-violet à environ 242 mu Le chromatogram- me sur papier est séché et la bande correspondant à l'a sorp- tion de 242 mu est découpée et extraite à l'aide de méthanol.
La matière extraite à l'aide de méthanol est à nouveau soumise à une ahromatographie sur papier en utilisant du papier, qui a été extrait pendant 48 heures à l'aide de méthanol, et en fai- sant usage du système chloroforme-formamide précédemment employé Le chromatogramme résultant ne présente qu'une trace de bande correspondant à l'hydrocortisone de départ,t andis que la bande principal a un maximum d'absorption d'ultra-violet à 242 mu .
Le chromatogramme sur papier est séché à fond et la bande cor-
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respondant au maximum d'absorption de 242.ra.ukst découpée et extraite au méthanol. L'extrait méthanolique'est évaporé sous vide jusqu'à siccité, en sorte qu'on obtient de la /\ 1,4-prégna
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diène JIP, 17 c(,zl-triol-3,20-dione.
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EXEMPLE 5. -
On prépare 50 ce d'un milieu nutritif de composition suivante :
Cérélose 1 gr
Edamine 1 gr -Liqueur do macération, de mais 0,25 ce
Eau distille q,s,ad, 50 ce
Ce milieu est amené à pH 6,5 à l'aide de KOH sté- rilisé et inoculé à l'aide d'environ 2,5 à 5 cc d'une culture de Nocardia leishmaii MA 281; ATCC 6855) et la culture inocu- lée est alors incubée à une température de 28 c en agitant, pendant 48 heures.
A la culture résultante, on ajoute une so- lution contenant 10 mgr d'hydrocortisone ¯ 4-prégnène-11/3 17 d ,21-triol-3,20-dione) dissous dans 0,1 cc de diméthylfor- mamide La culture contenant le composé stéroide est incubée , en agitent, pendant une période supplémentaire d'environ 24 heures à 28 c
Le bouillon de fermentation est extrait à l'aide de quatre fractions de 50 ce d'acétate d'éthyle et lesextraits à l'acétate d'éthyle sont combinés et évaporés sous vide jus- qu'à un volume d'environ 5 ce.
La solution concentrée est alors utilisée pour préparer des chromatogrammes sur papier, qui sont. développés en utilisant de la formamide comme phase liquide stationnaire et du chloroforme comme phase liquide mobile. On obtient deux bandes, dont l'une (qui correspond au consti- tuant le plus mobile) présente la caractéristique maximum d'ab- sorption d'ultra- violet de l'hydrocortisone et dont l'autre (qui correspond au constituant le moins mobile) présente un maximum d'absorption d'ultra-violet à environ 242 mu.
Le chro- matogramme sur papier est séché et la. bande correspondant à l'absorption de 242 mu est découpée et extraite à l'aide de mé
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thanol. La matière extraite à l'aide de méthanol est à nouveau soumise à une chromatographie sur papier, en utilisant du pa- pier, qui a été extrait pendant 48 heures à l'aide de méthanol, et en faisant usage du système chloroforme-formamide précédem- ment employé. Le chromatogramme résultant ne présente qu'une trace de bande correspondant à l'hydrocortisone de départ, tan dis que la bande principale a un maximum d'absorption d'ultra- violet à 242 mu.
Le chromatogramme sur papierst séché à fond et la bande correspondant au maximum d'absorption de 242 mu est découpée et extraite au méthanol. L'extrait méthanolique est évaporé sous vide jusqu'à siccité, en sorte qu'on obtient
EMI18.1
de la -prégnadièMe-11 , 17 c( ,21-trlol-3,20-dione.
EXEMPLE 6,- On prépare 50 ce d'un mulieu nutritif de composition suivante :
EMI18.2
<tb> Cérélose <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Edamine <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> mais <SEP> 0,25 <SEP> cc
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> q.s.ad <SEP> 50 <SEP> ce
<tb>
Ce milieu est amené à pH 6,5 à l'aide de KOH stérile -se et inooulé à l'aide d'environ 2,5 à 5 cc d'une culture de Nocardia formica MA 143; NRRL 2470) et la culture inoculée est alors incubée à une température de 28 c en agitant, pendant 48 heures.
A la culture résultante, on ajoute une solo
EMI18.3
tion contenant 10 mgr d'hydrocortisone (/j'-prégnëne-11,3 ,17 du 21-triol-3,20-dione dissous dans 0,1 cc de diméthylformamide.
La culture contenant le composé stéroïde est incubée, en agi- tant, pendant une période supplémentaire d'environ 24 heures à 28 c
Le bouillon de fermentation est extrait à l'aida de quatre fractions de 50 cc d'acétate d'éthyle et les extraits
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à l'acétate d'éthyle son combinés- et évaporés sous vide jus qu'à un volume d'environ 5 ce. La solution' concentrée est alors utilisée pour préparer des chromatogrammes sur papier, qui sont développés en utilisant de la formamide comme phase liquide stationnaire.et du chloroforme comme phase liquide mobile.
On obtient deux bandes, dont l'une(qui correspond au constituant le plus mobile) présente la caractéristique max- imum d'absorption d'ultra-violet de 1 'hydrocortisone et dont l'autre (qui correspond au constituant le moins mobile) présen- te un maximum d'absorption d'ultra-violet à environ 242 mu.
Le chromatogramme sur papier est séché et la bande correspon- dant à l'absorption de 242 mu est découpée et extraite à l'aide de métha nol. La matière extraite à l'aide de méthanol est à nouveau soumise à une chromatographie sur papier, en utilisant du papier, qui a été extrait pendant 48 heures à l'aide de métha- nol, et en faisant usage du système chloroforme-formamide pré- cédemment employé. Le chromatogramme résultant ne présente- qu'une trace de bande correspondant à l'hydrocortisone de dé- part, tandis que la bande principale a un maximum d'absorption d'ultra-violet à 242 mu.
Le chromatogramme sur papier est sé- ché à fond et la bande correspondant au maximum d'absorption de 242 mu est découpée et extraite au méthanol. l'extrait mé- thanolique est évaporé sous vide jusqu'à siccité, en sorte qu'on obtient de la ¯ 1,4-prégnadiène-11.3 ,17 Ó ;21-triol- 3t20-dione.
EXEMPLE
On prépare 50 cc d'un milieu nutritif de composi- tion suivante :
EMI19.1
<tb> Gérélose <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Edamine <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> maïs <SEP> 0,25 <SEP> ce
<tb>
<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> q.s.ad <SEP> 50 <SEP> ce
<tb>
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Ce milieu est amené à pH 6,5 à l'aide de KOH, stérilisé et ino- culé à l'aide d'environ 2,5à 5 ce d'une culture de Nocardia
EMI20.1
convoluta (MA 275; ATCC 4275) et la culture inoculée est alors incubée à une température de 28 C, en agitant, pendant 48 heu- res. A la culture résultante, on ajoute une solution contenant
EMI20.2
10 mgr d 'hydrocortic#lG' (--prégène.,-113 , l? d, 21-triol-3,20- dione) dissous dans G, 1 ce de diméthflforntamide.
La culture contenant le composé stéroïde est incubée, en agitant, pendant une période supplémentaire d'environ 24 heures à 28 c
Le bouillon de fermentation est extrait à l'aide de quatre fractions de 50 cc d'acétate d'éthyle et les extraits à l'acétate d'éthyle sont combinés et évaporés sous vide jus- qu'à un volume d'environ 5 cc. La solution concentrée est a- ,lors utilisée pour préparer des chromatogrammessur 'papier; qu sont développés en utilisant de la formamide comme phase liqui- - de stationnaire et du chloroforme comme phase liquide mobile.
On obtient deux bandes, dont l'une (qui correspond au consti- . tuant le plus mobile) présente la caractéristique maximum d'ab- sorption d'ultra-violet de l'hydrocortisone et dont l'autre (qui correspond au constituant le moins mobile) présente un maximum d'absorption d'ultra-violet à environ 242 mu. Le chro matogramme sur papier est séché et la bande correspondant à l'adsorption de 242 mu est découpée et'extraite à l'aide de méthanol. La matière extraite à l'aide de méthanol est à nou- veau soumise à une chromatographoe sur papier, en utilisant du papier, qui a été entrait pendant 48 heures à l'aide de mé thanol, et en faisant usage du système chloroforme-formamide précédemment employé.
Le chromatogramme résultant ne présente qu'une trace de bande correspondant à l'hydrocortisone de dé- part,tandis que la bai.de principale a un maximum d'absorption d'ultra-violet de 242 4u Le chromatogramme sur papier est sé- ché à fond et la bande correspondant au maximum d'absorption
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de 242 mu est'découpée et extraite au méthanol. -L'extrait mé-
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thanolique est évaporé sous vide jjusqufà siccité, en sorte qu'a 14 obtient de la 1,4¯r,>régnadiène-10 . 7 d ,21-triol-3,20-dione.
ET''-.13'1,E 8.- On prépare 50 ce d'un milieu nutritif, de, c'QmpQsi- tion suivante :
EMI21.2
Gérélose bzz mgr
EMI21.3
<tb> Edamine <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 0,25 <SEP> cc
<tb>
<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> q. <SEP> s. <SEP> ad. <SEP> 50 <SEP> cc
<tb>
Ce milieu est amené à pH 6,5 à l'aide de KOH, stérilisé et inoculé à l'aide d'environ 2,5 à 5 ce d'une culture de Nocar- dia corallina MA 277; ATCC 4273),et la cultureinoculée ,est alors incubée à une température de 28 C, en agitant, pendant 48 heures.
A la culture résultante, on ajoute une solution con-
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tenant 10 mgr d'hydrocortisone ('-prgQzléz,e¯llf3 , 17 c( ,21- triol-3,20-dione) dissous dans 0,1 ce de diméthylformamide. la culture contenant le composé stéroïde est incubée, en agitant, pendant une période supplémentaire d'environ 24 heures à 28 c
Le bouillon de fermentation est extrait à l'aide de quatre fractions de 50 cc d'acétate d'éthyle et les extraits à l'acétate d'éthyle sont combinés et évaporés sous vide jus- qu'à un volume d'environ 5 ce. La solution concentrée est a- lors utilisée pour préparer des chromatogrammes sur paoier, qui sont développés en utilisant de la. formamide comme phase liquide stationnaire et du chloroforme comme phase liquide mobile.
On obtient deux bandes, dont l'une (qui correspond au constituant le plus mobile) présente la caractéristique maxi-
EMI21.5
mum d' absorption d'ultra-violet de l'hydrocortisone et dont l'autre (qui correspond au constituant le moins mobile) pré- sente un maximum d'absorption d'ultra-violet à environ 242 mu.
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Le chromatogramme sur papier est séché et la bande correspon- dant à l'absorption de 242 mu est découpée et extraite à l'aide de méthanol. La matière extraite à l'aide de méthanol est à nouveau soumise à une chromatographie sur papier, en utilisant du papier, qui a été extrait pendant 48 heures à l'aide de mé- thanol et en faisan+-:usage du système chloroforme-formamide précédemment employé. Le chromatogramme résultant ne présente qu'une trace de bande correspondant à l'hydrocortisone de dé- part, tandis que la bande principale a un maximum d'absorption dtultra-violet à 242 mu. Le chromatogramme sur papier est sé- ché à fond et la bande' correspondant au maximum d'absorption de 242 mu est découpée et extraite au méthanol.
L'Extrait mé- thanolique est évaporé sous vide jusqu'à siccité, en sorte qu'on obtient de la ¯1,4-prégnadiène-11.3 17c(,21-triol-3,20- dione.
EXEMPLE 9.-
Six fractions de 50 cc du milieu à base d'édamine décrit dans les exemples 1 à 8 sont amenées à pH 6,5, stéri- lisées par chauffage pendant' 15 minutes dans,un autoclave à environ 120 C et chacun des'milieux stérilisés est inoculé à l'aide d'une culture de microorganismes Nocardia blackwellii (ATCC 6846). Les cultures inoculées sont incubées à une tempé- rature de 28 c en agitant, rendant environ 48 heures et à chacune des six cultures résultantes on ajoute une solution de 10 mgr d'un composé 3-céto-stéroide différent dans 0,1 cc de diméthylformamide.
Les cultures contenant; les composés 3-céto- stéroïdes sont alors incubées, en agitant, pendant une période . supplémentaire d'environ 24 heures.
Chacun des bouillons de fermentation, ainsi obtenus, est individuellement extrait avec 4 fractions de 50 cc d'acé- tate d'éthyle.--Les extraits à l'acétate d'éthyle correspondant à chaque bouillon et dérivés d'un substrat 3-céto-stéroide par-
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ticulier sont combinés et évaporés jusqu'à siccité sous vide.
Chacun des six produits résiduels ainsi obtenus est dissous dans de l'acétone .et soumis à une chromatographie surf.papier. Lei divers chromatogrammes sont développés en utilisant le systè- me solvant indiqué peur la matière de départ particulière dans le tableau donné ci-dessous.
Les bandes supérieures pour cha- que chromatogramme,correspondant aux -déhydro-dérivés, sont découpées,, extraites individuellement à l'aide de méthanol et la matière extraite au méthanol est à nouveau soumise à une La bande supérieure est à nouveau découpée,puis séchée et extraite au métand
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chromatographie sur papier- /"L'extrait méthanolique est évaporé jusqu'à siccité sous vide, en sorte qu'on obtient, pour chaque substrat utilisé comme matière de départ, les composés
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/Jl'"-3-céto-stéroide's( particu.iers indiqués dans le tableau suivant :
EMI23.3
<tb> Système <SEP> solvant <SEP> utilisé <SEP> pour <SEP> chromatographie <SEP> sur <SEP> papier. <SEP> - <SEP>
<tb>
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Essai Substrat Phase stationnaire Phase mobils /1'¯céto-
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<tb> No. <SEP> 'stéroïde
<tb> obtenu
<tb>
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1 '4- -prégnène-l?f ' formamide chloroforme L}l, 1.. -préo-na- 17 0( , 21-triol-3 , 20- dièue-11 3 , diane 17d , z1-iol- 3,20-dione 2 Prégnane-113 ,17 d ;
formamide Chloroforme /1' '-prégtia- 21-triol-3,20-dione diène-1 / , 17d , zl-riol- 3,20-dione 3 21-acétate de prégna- forrnamide l:lchlorofor- Ll1,4-¯prégnacli, ne-17 d ,21-diol-3,ll, me-toluène èe-17e{ 21-
EMI23.7
<tb> 20-trione
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 20-trinne <SEP> diol-3,11,20-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> trione
<tb>
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4 21-acétate de allô- formamide 1:1 chlorofor- L\l,4¯prégna. prégnane-17 et. ,21- me-toluèue diène-17c(,!
EMI23.9
<tb> diol-3,ll,20-trione <SEP> 21-diol-3,
<tb>
<tb> 11,20-trione
<tb>
<tb>
<tb> 5 <SEP> Prégnane-17c(,21- <SEP> formamide. <SEP> benzène <SEP> /[ <SEP> ' <SEP> -prégna- <SEP>
<tb>
EMI23.10
dioZ-3,zo-diou cTiène-17| ,21.
EMI23.11
<tb> diol-3,20dione
<tb>
EMI23.12
6 21-acétate de formamide benzène Ll,4¯prégna- alloprégnane-l7c( , diè;
le-17d ,21. 21-diol-3,11-dione diol-.3,20-di-
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<tb> one
<tb>
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EMI24.1
E::'LE 11.-
On prépare 50 ce d'un milieu, nutritif de composition suivante:
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<tb> Cérélose <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Edamine <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 0,25 <SEP> ce
<tb>
<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> q.s.ad <SEP> 50 <SEP> ce.
<tb>
Ce milieu est amené à pH 6,5 à l'aide de KOH stérili- sé et inoculé à l'aide d'environ 2,5 à 5 ce d'une culture de Nocardia astéroïdes MA 272; ATCC 9970) et la culture inoculée est alors incubée à une température de 28 c en agitant, pen- dant 48 heures. A la culture résultante, en ajoute une solution
EMI24.3
contenant 10 mgr de prégnane--.?3,1 ,?l-tr,a'1-3,c-diozae dis- sous dans 0,1 ce de diméthylformamide . La culture contenant le composé stéroïde est incubée , en agitant, pendant une pério- de supplémentaire d'environ: 12, heures à 28 c
Le bouillon de fermentation est extrait à l'aide de quatre fractions de 50 ce d'acétate d'éthyle et les extraits à l'acétate d'éthyle sont combinés et évaporés sous vide Jusque un volume d'environ 5 ce.
La solution concentrée est alors uti- lisée pour préparer des chromât ogre mine sur papier, qui sont développés en utilisant de la formamide comme phase liquide stationnaire et du chloroforme comme phase liquide mobile* La bande principale ainsi formée présente la caractéristique maxi- mum d'absorption d'ultra-violet de l'hydrocortisone; le chroma- togramme sur papier est séché et cette bande est découpée et extraite à l'aide de méthanol. La matière extraite à l'aide du méthanol est à nouveau soumise à une chromatographie sur papier, en utilisant du papier qui a été extrait pendant 48 heures à l'aide de méthanol et en faisait usage du système chloroforme- formamide précédemment employé.
Le chromatogramme résultant est séché à fond et la/ bande présentant la caractéristique maximum
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d'absorption d'ultra-violet de l'hydrocortisone est découpée et extraite à l'aide de méthanol. L'extrait méthanolique est -/' évaporé jusqu'à siccité sous vide, en sorte qu'on obtient de l'h
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1 'hydrocortisone à -prégnaze-11/3, Z7 c( , 1-triol-3 , 0-dione ) .
Le procédé décrit ci-dessus est répété, en utilisant le même Mlieu à base d'édamine, la prégnane-l²,17 ,21-t.r:Lol- 3,20-dione comme substrat et une période d'incubation de 12 heures, mais en faisant usage , au lieu de microorganismes du genre Nocardia astéroïdes MA. 272, des, microorganismes suivants: Nocardia minima - (Â 292; ATCG $671) Nocardia globerula - (Ul 2$0; ATGO 9356) Nocardia le5..shIllani - ( M9. 2:81; ATCC 6855) Nocardia formica - li3; NRLL 2470)
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Nocardia astéroïdes - (MA. 289; AïCC 10904)'
L'extraction des bouillons de fermentation résul- tants et la chromatographie sur papier des extraits séchés dans un système formamide-chloroforme donnent, dans chaque cas, une bade sur le chromatogramme correspondant à 1'hydrocortisone.
L'élution de cette bande de la ménière décrite plus haut donne de l'hydrocortisone identifiée par son spectre d'absorption d'ultra-violet comme produit stéroïde principal obtenu.
EXEMPLE 12.-
On prépare 50 cc d'un milieu nutritif de composition suivante:
EMI25.3
<tb> Cérélose <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Edamine <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 0,25 <SEP> ce
<tb>
<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> q.s.ad. <SEP> 50 <SEP> ce.
<tb>
Ce milieuest amené à pH 6,5 à l'aide de KOH, stérili- sé et inoculé à l'aide d'environ 2,5 à 5 ce d'une culture de
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Nocardia blackwellii (MA. 273; ATCC 684h) et la culture inoculée est alors incubée à une température de 28 C en agitant, pen-
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dant l$ heures.
A la culture résultante, on ajoute une solution
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contenant 0,64 gr de 1-acêtc.te de prégnane-3/3;17o(,21-triol- 11,20-dione dissous dans de le dizz.éthy:lformautice. , La culture coizt^:;::z le composé stéroïde est incubée en agitant et en aérant, pc une période supplémentaire d'environ 4 heures à 28 C
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Le bouillon ie fer:':?ntation est extrait à l'aide d'acétate d'éthyle et l'extrait est séparé et évaporé jusqu'à sicité. Le produit résiduel séché est réparti entre de l'é .ther de pétrole et du méthanol aqueux à 70% la couche d'éther -de pétrole étant rejetée.
Le méthanol. aqueux contenant le pro- est .duit/ évaporé sous pression réduite, de Manière à chasser le méthanol. La couche aqueuse résultante est extraite plusieurs
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fois à l'aide d'acétate d'éthyle et le eouchff d'acétate d'éthy- le est évaporée jusqu'à siccité, en sorte qu'on obtient de la / l'-prégnadiène-17 c,l.-diol.-3,11,G-;,riotie pa.r'ci3J lement pu- rifiée. Cette matière est dissoute dans de la pyridine et mise en réaction dans un excès d'anhydride acétique, de manière à
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former du 21-acétate de x '--i7âv1li.22 -iÎ -c , ,21-diol-3,11,20. trione, qui est récupéré du mSlane dtacétyls.tion par addition d'eau et récupération de la matière précipitée par filtration.
Le 21-acétate de j le4 prë ;z:adi :.ze.-11 , =' -ûzol.-3,11,0-trione activée est dissous dans de l'éther et cl1romatorephié sur de l'alumine La colonne d'alumine est développée en utilisant, comme solvants de développement, de l'éther et un mélange d'éther et de chloro- forme. Le produit désiré est élue dau2 la colonne avec du chlo- roforme et ltéluat chloroforuique est évaporé, en sorte qu'on
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obtient du 21-acétate de /, 1, 4 -nréLnadièze-17 c(,l-diol-3,11,20- trione cristallin ensiblE'1ftcnt pur .
EÍ.: 1 :J-'lli 13.- Deux fractions de 50 ce du milieu à base d'édamine décrit dans les exemples 1 à ># sont ar:.exz:2s à pH 6,5 à l'aide
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'de KOH, stérilisées par chauffage,pendant 15 minutes dans un autoclave à 120 C et chacun des milieux stérilisés est inoculé à l'aide d'une culture de Nocardia blackwellii (ATCC 6846).
Les cultures inoculées sont incubées à une température de 28 c en agitant, pendant environ 48 heures. A la fin de la période d'incubation, les cultures sont centrifugées, les cellules étant retenues et.le liquide, surnageant est jeté. Les cellules retenues sont lavées à l'aide d'eau distillée et additionnées d'eau tamponnée à pH 7,0 jusqu'à un volume de 25CC A une des suspensions de cellules, on ajoute une solution de 5 mgr de 21 acétate de prégnane-3,17 Ó,21-triol-11,20-dione dans 0,1 cc de diméthylformamdide à l'autre suspension de cellules on ajoute une solution de 5 mgr de 21-acétate de prégnane-17 d ,21-diol- 3,11,20-trione dans 0,1 cc de diméthylformamide.
Les suspension de cellules contenant les composés prégnaniques sont alors in- cubées, en agitant, pendant une période d'environ 12 à 15 heu- res.
Chacun des bouillons de fermentation ainsi obtenus est .extrait individuellement à l'aide de quatre fractions de
50 ce d'acétate d'éthyle. Les extraits à l'acétate d'éthyle correspondant à chacun desdeux bouillons sont combinés et évaporés jusqu'à siccité sous vide, en sorte qu'on obtient, dans chaque cas, de la ¯ 1,4-prégnadiène-17 ¯,21-diol-3,11029 trione. Dans chaque cas, le rendement, déterminé par analyse polographique des produits, excède 85% du rendement théorique.
REVENDICATIONS.-.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.