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La présente invention concerne, de manière générale la production, par fermentation, de composés stéroides de valeur. Elle est plus particulièrement relative à un nouveau procédé microbiologique pour introduire une double liaison entre les atomes de carbone c-1 et C-2 du noyau stéroïde à l'aide de microorganismes du genre Bacillus. Suivant une forme d'exécution préfé-
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rée de l'invention, des d-3-cétostéroides tels que Ô'-prégnène-3,11,20-trions-17 C , 21-diol et 4µY-prégnène-3,20-dioàs-11 fi , 17 << ,21-triol sont convertis en Q1'4-3-céto-stéroides correspondants) soit respectivement le 41'-prégnadiène-3,11>20trione-17 1-diol et le Ol'-prégnadiène-3,20-dionell 3 ' 17 0(,21- triol.
Ces derniers composés possèdent une activité cortisonale, mais ils diffèrent de la cortisone en ce sens qu'ils sont sensiblement exempts d'effets secondaires indésirables, tels que l'oedème, étant donné qu'ils ne possèdent pas d'action appréciable de rétention d'eau ou de sodium.
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La préparation de al'3-céto-stéroïdes par voie chimique nta.pas donné satisfaction, en raison du fait que les réactions chimiques en cause donnent des mélanges de plusieurs composés. La séparation des intermédiaires et produits finaux désirés de ces mélanges est onéreux et donne des rendements faibles en composés
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1'-3-céto-stêroïdes désirés.
La présente invention a pour objet un procédé en un stade pour introduire une double liaison en ¯1 dans des composés stéroides.
L'invention a encore pour objet l'obtention de cette non-saturation en al par un procédé sélectif
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dînant lieu à la formation du ¯1-stéroïde désiré non contaminé par des sous-produits indésirables.
L'invention a également pour objet un procédé' gràce auquel des ¯1,4-3-céto-stéroïdes de la série du prégnane peuvent être produits directement et avec un rendement élevé à partir des composés de ¯4-3-céto- prégnène correspondants.
On a découvert à présent que la déshydregéna- tion sélective en l da composés stéroïdes peut être obtenue par un nouveau processus de déshydrogénation bactériologique, consistant à mettre un composé stérol- de, en particulier un composé stéroide 3-oxygéné et non saturé en C-5, en contact avec le principe déshydrogé- hant de microorganismes du genre Bacillus, de préférence des microorganismes appartenant à l'espèce Bacillus sphaericus. L'espèce Bacillus sphaericus, telle qu'ell est définie dans l'ouvrage de Bergey "Manual for Deter- minative Bacteriology", 6è édition, comprend plusieurs variétés, telles que la variété rotans, la varieté furi formis, etc.., et dans certaines collections, ces varié.
tés sont désignées,par les noms d'espèces Bacillus rotans et Bacillus fusiformis. Ces microorganismes du genre Bacillus sphaericus peuvent être obtenus à partir de sources connues, telles que lt"American Type Culture
Collection", Washington, D. C., ou bien ils peuvent être isolés de sources maturelles, telles que la terre, par des méthodes connues.
La déshydregénation peut s'opérer en mettant le composé stéroïde en contact avec les microorganismes du genre Bacillus sphaericus eux-mêmes ou, si on le préfère, avec des systèmes enzymatiques des microorganismes du genre Bacillus sphaericues, en sorte que l'hydrogène attaché aux atomes de carbone en C-1 et C-2 est sélecti-
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17 0(,2ldiol 21 acylate de prégnène-3,20-dions- 17,21-diol, 21-acétate de ,(,-prégnène-3,20-dione-1? o( - ,diol,-prémène-3.2(b,die,-lo(- ;'l'''101,'''''''''''+-prégnène-3 2 !1.}One-17... o( -ol-21-al/ . ±b-prégnéne-3,llR ii:l.Jn""fl"lt, ":prégnene-J ,11,20...trione, -prégnène-) ,ll
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vement enlevé, de manière à fournir le ni-st6roide dé-
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siré sensiblement non contaminé par des sous-produits
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indésirables.
Lorsqu'un composé do Q'-3-cétoprégnène
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est soumis au principe déshydrogénant de microorganismes
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du genre Bacillus sphaericus, le composé ,1''.-prégna-
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diénique correspondant est obtenu directement et avec un rendement élevé.
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Bien que çe nouveau procédé bactériologique de déshydrogénation soit applicable à la ,0,1-déshydro-
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génation de composés 3-céto-stéroldes en général, quels que soient les substituants attachés aux noyaux B, C et D et quel que soit le degré de non-saturation dans ces noyaux, on préfère ordinairement utiliser comme matières de départ dans ce procédé des composés stéroides non saturés en C-5 et oxygénés en 3 de la série de
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prégnane, comme, par exemple, des composés de '-3.cé.. to-prégnène, tels que prégnène-3,20-dio,1%9, ':i3= dione-17 q -01, ,'-prégnène-3,20dions-21-ol, 21-acylate de 4'-prégnène-3,zo..dions-21-ol, 21-acétate de ¯J'-prëgnène.-3 , 20-.dione-21-ol, ,'prégnène..3 , 20dione-.
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20-trônez -ol, 4¯prégnèneJ,11,20-trione-2l-ol, 21-acylate de -prégnène3,11,20-trione-21-ol, 2lacH tate de ±f-prégnéne-3,11,20-trione-21-ol, '±±4-prégnène- 3,1120-trione-17 du 21-diol, 21-acylate de tAr-pr6gnène-3ell,20-trione-17,21-diol, 21-acétate de A4-prégnène3,11,20-trionel7 , fll-àiol, ±µ4-prégnène-3,11,20trione-17 o(-ol-21-al, Il.-prégnène-3 , 20-dione-11 ole ('-prégnène-3,20..dionell 3 , 21-diol, 21-acylate de Z-\7-prégnène-3,20-dione-11,21-diol, 21-acétate de /\-prégnène-3,20-dione-11 A 21-diol, (,-prégnène.3,z0-.
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dione-11 / -ol-21-al, 4-prâgnène-3, 20-dione-.11 3 17 o(-diol) '-prégnêne-3,20-.dione-11 17 o( , 21triol, 21-acylate de ±4-prégnène-3,20-dione-11,17,21triol, '-prégnène-3 , 20-dione-11 fi, 17 c{ -diol-2l-al, 21-acétate de 4Y4-prégnéne-3,20-dione-11 / , 17 q 1 21-
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triol, de même que les dérivés 9-halogénés de ces compo'-'
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sués de '-3-.céto-prégnène, tels que 9-l0-.,'-.prégnène-3,20-dione-17,21-diol, 9-fluoro:
-a..prégnène-3 , 20 dione-17 c( 21-diol, 21-acylate de 9-halo '-prégnène- 3,20-dione-17,21-diol, 21-acétate de 9-fluoro-,4-prégnène-3,20-dione-17 c( ,21-diol,9-halo-,'-prégnène- 3,11,20-trione-l',21-diol, 9-fluoro-,(,'-prégnène-3,11, 20-trione-17 o( , 21-diol, 21-acylate de 9-halo-A4-pré-
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gnène-3,11,20-trione-17,21-diol, 21-acétate de 9-fluoro-
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-prégnène-3,,11,20-trione-17 C( ,21-diol, 9-halo-±±4¯ Prégnène-3,20-dione-11,17,21-triol, 9-fluoro-,(,'..prégnène-3,20-dione-11 , 17 0(,21-triol, 21-acylate de 9-halo- '-prégnène-320-dione-11,17,21-triol, 21-acétate de 9 fluoro-a..prêgnène-3,20-dione-11 3 , 17 o(, 21-triol et analogues.
Au lieu de composés de /-3-céto-prégnè-
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ne, on peut utiliser, comme matières de départ, d'autres composés non saturés en C-5 et 3-oxygénés comme, par
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exemple, les composés de 4±5-3-hydroxy-prégnène, tels que "-prégnène-20-one-3.ol, 5-prégnène-20-one-317 <. dol, a5-prégnène¯20-one-3 21-diol, 21-acylate de 5prégnène-20-one-3,21-diol, 21-acétate de A5-prégnène- 20-one-3,21-diol, 5..prégnène-20-one-3 17 0( 21-.triol 21-acylate de 5-prégnène-20-one 3,1?,21-triol, 21-acétate de 5..prégnène20-one-3 17 0( 21-triol, 5¯prégnène-ll,20-dione-J-ol" A5-prégnène-11$20-dione.
3,17 o( -diol, ÔPréénène-11,20-àione-3,21-dioi, 21acylate de j5..prégnène-11,20-dione-3,21-diol, 21-acétate de ,5-p.ggnène-11, 20 dione-3, 21-diol, ±y5-prégnéne-
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11,20-dione-3,17 d ,21-triol, 21-éciate de Z2-prégnène-1l,20-dione-3,17,21-triol, 21-acétate de ,L"5--pré;nène-l1,20-dione-3,17 o( ,21-triol, "5 prëE;
nêne-ZO-one- 3,11 /3 -diol, ,5-prëgnène-20-one-3 ,11 j3, 21-triol, 21-acylate de 5-prégnène-20-one 3,11,21-triol, 21-acétate de f-prégnène-20 one-3,11 /j , 21-triol, ±Y5-prégnène-â0-One-3,11 j , 17 d -triol, ,"5 prégnène-2U-one- 3,11 P 21-tétrol, 21-a.cylate de prégnène-20-one- 3,11,17,21-tétrol, 21-acétate de "5-prêgnène-20-one- 3 11 , 17 d , 21-tétrol de même que les dérivés 9-halogénés de ces composés de 4 5-3-hydroxy-prégnène, tels que 9 halo-,5 prégnène-20-one317,21-triol, 9-fluoro- 5-régnèné-20-one 3,171 , 21-triol, 21-acylate de 9.-halo-,5 prêgnène-20-one-3,17,21-triol, 21-acétate de 9-fluoro-,-prégnène-20-one-3,17 é ,21 triol, 9-halo- 5¯prégnène-1l,20-dione-3,17,21-triol, 9-fluoro 5prégnène-11 /j,20-dione-3,1? c( , 21-triol, 21-acylate de 9-halo-5-prégnène-11, 20-dione-3 , l', 21--triol,
21-acétate de 9-fluoro-5-prégnëne-11 j , ZÓ-dione-3,17 d , 21-triol, 9-halo L5-prëgnène-20-on'e-3,11,17,21-tétrol, 9-f1uoro-Ll5¯prégnne-;20"'one-3,ll P , 17 c( , 21 tétrol, 21-acylate de 9-halo-5-prégnène-20-one-3,11,1721 tétrol, 21-acétate de 9--fluoro-.(5-;oré;nène20 one-3 11 /3 ) 17 c( 21-tétrol, et les composés de 5-3-(alkanoyloxy
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inférieur) prégnène, tels que 3alkanoate inférieur)de
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5-prégnène-20-one-3-ol, 3-acétate de A5-prégnène-20one-3-ol, 3-(alkanoate inférieur) de /\¯-prégnène-20one-3,17-diol, 3-acétate de 5-prégnêne 20-one 3,17 0( diol, 3-(alkanoate inférieur) de j,5-prégnëne-20 one- 3,21-diol, 3-acétate de -prégnène-?0-one-3,,21-diol, 3,21-bis(alkanoate inférieur)de ,5-prégnène-20 one- 3,21-diol, 3,21-diacétate de 5-prégnène-20-one-321 diol, 3-(alkanoate inférieur)de ,,5-prédnêne-20vone 3,17,
21-trio, 3-acétate de ,(,,..prégnène-20-one-3,17 0( ,
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21-triol, 3,21-bis(alkanoate intérieur}de 5-prégnène- 20-one-3,17t21-triol, 3,21-diacétate de /5-prégnéne-20one-3,17 o( , 21-triol, 3-. ( alkanoate inférieur) de 5prégnène-11,20-dione-3-oit 3-acétate de jà5-prégnène- 11,20-dione-3.ol, 3-(alkanoate inférieur)de a5-prégnène-11, 20-dione-3 ,17diol, 3-acétate de ±5-prégnène-11, 20-dione3,17 0( -diol, 3-(alkanoate inférieur)de 5prégnène-11,20-dione-3,21-diol, 3-acétate de 5-prégnène-ll,20-dione-3,21-diol, 3e2l-bis (alkanoate inférieur) de 5-prégnène-11,2U-dione-3,21-diol, 3,21-diacétate de ±±-Prégnène-11,20-dione-3,21-àioi, 3- ( alkanoate inférieur)de àPfééèell,2 -di ne-3,1?,21-triol, 3-acétate de 5..prégnène-11,20-dione-3,17 0(, 21-triol, 3p2l-bis (alkanoate,'infér'ieur)
de ±5-prégnéne-11 20¯ dione-3,17,21-triol, 3,21-diacétate de A5-prégnène-11, 20-dione..3,17 0(, 21-triol, 3-(alkanoate inférieur)de 5-prégnène-20-one-3,11¯diol, 3-acétate de lL5Éprégnène-20-one-3,11 f3 -diol, 3-(alkanoate inférieur)' de f.:l5- 20-one-3,11,17-triol, 3-acétate de 5-20-one-3,11 j3 , 17 0( -.triol, 3-(alkanoate inférieur) de LJ(-prégnène- 20-one-3,11,21-triol, 3-acétate de 5-prggnène-20-one- 3,11 , 21-triol, 3,21-bis(alkanoate inférieur) de (,5-prégnène-20-one-3,11, 21-triol, 3,21-diacétate de Ll.
-prégnène-20-one-3, 11 f3, 21-triol, 3-(alkanoate inférieur de 5-prégnêne-2!0--one-3,11 d , 17,21-tétrol, 3-acétate de 5¯prégnène-20-one-.3,Z1 j , 17 0{ , 21tétrol, 3, 21-.bis ( alkanaate inférieur) de 5¯prégnène- 20-one-3,11ol7e2l-tétrolp 3,21-diacétate de 5¯prégnène-20-one-3,116 , e 17 0(p 21-tétrol, les dérivés 9-halogénés de ces composés de d-3-(alkanoyioxy inférieur)peégnène, tels que 3-(alkanoate inférieur) de 9-halo- 5¯prégnène-20-one-3,17,21-triol, 3-acétate de 9-fluoro-n5-prégnène-20-one-3,17 c( 21-triol, 3-(alkanoate
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inférieur) de 9-halo-L-3 -prégnène-11>20-dionc-317>21triol 3acêtate de -.'.uoro-,(¯prégrW nc11,2U-rione- 3,1? ou , 21-triol, 3,21¯bis(licanoate inférieur) de 9halo--pr:
Jnène¯11,20-diona¯3,17,21tr.ol, 3,21-diacétate de 9-lluoro¯,("-prégnène-1192U-d.one¯3,1'l , 21triol, 3-(alkanoate inférieur) de 9halo-Li5¯prégnène- 20-one-3,11,17,21-tétrol, 3-acétate de 9-fluoro--prégnène-20-.one¯3911 /3 , 17 o(g 21-tétrol,, 3,21-bis(alkanoate inférieur)de 9¯haloM'-prêgnène¯2U-one-3,11>1%a21 tétrol, 3,21-diacétate de 9-fluoro-/-prégnène-e0-one- 3,11ss, 17 c(., 21-tétrol et analogues. Ces composés de ¯3-prégnène 3-oxygénés de départ sont convertispar le principe déshydrogénant des microorganismes au @enre
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Bacillus directement en composés de ,,1''-3-ceto pxe- gnadiène correspondants, cette conversion pouvant, suppose-t-on, s'opérer par la formation intermédiaire du
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composé ,L;¯3-céto.
Dans les matières de dµpart sus- mentionnées, le substituant ester préféré dans la position 3 et/ou dans la position 21 est ordinairement l'acétate, bien que d'autres esters d'acides carboxyliques d'hydrocarbures inférieurs, tels que propionate, butyrate, tert.-butylacétate, benzoate et analogues, puissent être utilisés au lieu de l'acétate, si on le désire.
Au lieu de ces composés de prégnène non saturés en C-5 et 3-oxygénés, on peut aussi utiliser, comme matières de départ, des composés de 3-céto-prégnane ou des composés de 3-hydroxy-prégnane, tels que prégnène-3,20-
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dione, prégné.ne-3,20-dione-l' cl -01, prégnè,ne-3,20-dâ.one-21-ol, Prégnéne-3,20-dione-17 o( , 21-diol, prégQène- 3 11 20-trione, prégnane-J,11,20-trione-17 4 -os, prégnane-3,11,20-trione-21-ol, prégnane-3,11,20-trione- 17 o( , 21-diol, prégna'ne-3,20-dione-il p -01, prégnane- 3,2 di ne-il p, 17 o( - diol, prégnane-3,20-dione-il
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21-diol, prégnane-3 20-dionc-11 /3 , 17 0(, 21-triol, prégnane-'20-one-3-ol, pré;
nane-2!0-one-3 ,17 c( -diol , prégnane-20-one-3,21-diol, prégnane-20-one-3 ,17 o( , 21triol, prégnane..11,20-dione-3-ol, prégnane-ll,20-dione- 3,17 o(-diol, prégnane-11,20-dione-3,21-diol, prégnane- 11, 20-dione-3 ,17 0( , 21-triol, prégnane-20-oqe-3,11 zij diol, prégnane-20-one-3,11 /j, 17 o(-triol, prégnane- 20-one-3 ,11 3 , 21-triol, prégnane-20-one-3 ,11 /3 , 17 c( , 21-tétrol, ainsi que, pour les matières de départ énu-
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mérée ci-dessus qui contiennent des radicaux hydroxy dans les positions 3 et/ou 21, leurs 3- et/ou 21-esters avec des acides carboxyliques d'hydrocarbures inférieurs, tels que les acides acétique, propionique, tert. -butylacétique, benzoïqùe et analogues.
Le procédé de déshydrogénation bactériologique suivant l'invention est exécuté en mettant le com-
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posé stéroide 3-oxygéné avec le principe déshydrogénant de microorganismes du genre Bacillus sphaericus. Ceci peut s'effectuer en ajoutant le composé stéroide, sous forme solide ou sous forme d'une solution dans un solvant, tel que, par.exemple, une dialcoylcétone, comme l'acétone, une dialcoyl-formamide comme la diméthylformamide et analogues, dans des conditions stériles à une culture du microorganisme dans un milieu nutritif et en agitant le mélange résultant, de façon à assurer la croissance du microorganisme et la déshydrogénation du composé stéroïde. Le stéroïde peut être ajouté au moment où le milieu nutritif est inoculé à l'aide de la culture de microorganismes du genre Bacillus sphaericus.
Ou bien, le stéroïde peut être ajouté à une culture établie. Au lieu'd'ajouter le composé stéroïde à la culture établie dans le milieu nutritif, les cellules développées dans la culture établie peuvent être sépa-
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pees par filtration du bouillon, lavées à l'eau distil- lée, puis mises en suspension dans une solution aqueuse tamponnée contenant le composé stéroïde 3-oxygéné,après quoi le mélange résultant est agité, de façon à assurer la déshydrogénation du composé stéroide, de manière à former le composé ¯1-3-oxygéné- correspondant. Ce der- nier composé est plus aisément récupéré de ce milieu que du mélange obtenu, lorsque le stéroide est incubé avec le microorganisme dans le milieu nutritif originel.
Dans une autre forme d'exécution, le composé stéroide
3-oxygéné peut être mis en contact avec des préparations ' enzymatiques déshydrogénantes provenant de la croissance de microorganismes du genre Bacillus sphaericus' de façon à former le composé stéroide ¯1-3-oxygéné corres- pondant.
Les milieux nutritifs utilisés pour l'exécu- tion de cette déshydrogénation bactériologique sont ceux que l'on utilise communément pour la propagation des microorganismes du genre Bacillus. Les milieux nu- tritifs usuels contiennt@une source d'azote et de carbo- he, des sels inorganiques et des facteurs de croissance, si ceci est nécessaire. Le carbone peut être fourni par des composés, tels que des acétates, lactates et analogues. Les hydrates de carbone sont peu utilisés par les Bacillus sphaericus et peuvent être utilisés dans le milieu nutritif ou en être omis, sans affecter sérieusement la déshydrogénation du stéroide.
L'azote peut être fourni par un sel ammonique, des amino-acides ou des protéines, telles que des graines de soja, des de la levure, des extraits de levure, des produits de digestion tryptiques de caséine, des extraits de viande, des farines de sang, des viandes protéiniques et de poix, des farines de saumon, des farines de poisson,
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des produits solubles extraits de poisson, des solubles de distillateurs, et analogues. Si on le désire, les microorganismes du genre Bacillus peuvent être propagés, en utilisant des protéines (ou des amino-acides) sans qu'aucun hydrate de carbone soit présent dans le milieu, auquel cas les protéines ou amino-acides servent à la fois comme source de carbone et comme source d'azote requises par les microorganismes.
Bien que, comme on l'a signalé plus haut, la déshydrogénation du composé stéroïde 3-oxygéné puisse s'effectuer en utilisant des préparations enzymatiques éshydrogénantes provenant de la croissance de microor- anismes du genre Bacillus sphaericus ou en mettant le eomposé stéroïde en contact avec une suspension d'une oulture établie dans de l'eau distillée, on préfère or- dinairement ajouter le composé stéroïde 3-oxygéné à un
Milieu nutritif contenant une culture de 24 heures de microorganismes du genre Bacillus sphaericus.
La proportion de composé stéroïde, qui peut être ajoutée au Milieu, varie en fonction du substrat à déshydrogéner, mais on préfère ordinairement employer une concentration d'environ 0,005 % à 0,2 % de composé stéroïde 3-oxygéné, bien que des concentrations plus élevées ou moins élevées puissent être employées, si on le désire. La culture contenant le composé stéroïde 3-oxygénjouté est alors incubée, de préférence en l'agitant et en l'aérant pendant une période additionnelle, qui varie ordinairement d'environ 10 eures à 50 heures, bien que des durées de fermentation plus courtes ou plus longues puissent être avantageuses pour la déshydrogénation de substrats 3-cétostéroïdes particuliers.
En raison du fait que des fermentations prolongées puissent donner lieu à la destruction d'une partie du produit ¯1-3-céto-stéroïde, on pré-
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fèreordinairement appliquer une durée de fermentation d'environ 10 heures à 24 heures qui, selon le substrat stéroide, s'est révélée apte à donner des rendements
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maxima en produit stéroide A 1-déshydrogéné.
Lorsque le processus de déshydrogénation est achevé, le produit est avantageusement récupéré du bouil- lon fermenté par extraction à l'aide d'un solvant non miscible à l'eau, tel que, par exemple, un hydrocarbure chloré, comme le chloroforme, une cétone, comme la mé- thylisobutylcétone, un alkanoate alcoylique, comme l'acé- tate d'éthyle, et analogues. L'extrait du produit sté- roide -déshydrogéné et de la matière de départ n'ayant pas réagi, qui peut éventuellement être présente, est avantageusement purifié par chromatographie, en utilisant du gel de silice, de l'alumine activée et analogues ou, si on le désire, à l'aide de chromatogrammes descendants sur papier.
Après séparation du produit déshydrogéné de la matière de départ n'ayant pas réagi, le produit peut être purifié davantage, si on le désire par recris- .tallisation dans un solvant, tel que l'acétate d'éthyle, un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther de pétrole, et analogues.
En appliquant le procédé de déshydrogénation bactériologique décrit plus haut et en utilisant les com-
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posés stéroïdes non saturés en C-5 et 3oxygéné9énumérés' plus haut, on obtient des composés l''-3-céto-prégnadiéniques, tels que É'-Prégnadiéne-3,20-dione, 1''-prégnadiène-3,20-dione-1? q -01, 1''-prégnadiè- 3,? di n-21-ol, .",''.-prégnadiène-3,20-dione-17 c( , 2..diol, al '-prégna c ne-3 , 20.-dione-1? o( -oh21-al, 1''-prégnadiène-3 ,11, 20-trione, 1 >*-prégna dièo.e3 y ll 20..trione-l'% o( -ol, jl''-prégnadiène..3,11, 20-trione- 21-ol, l''-.prégnadiène-3,11,20-trione-li 0(, 21-diol,
<Desc/Clms Page number 12>
EMI12.1
±±'4-prégnadiéne-3,11,20-trione-1? 0( -0l-21-al, Ê-1 24prégnadiène-3, 20-dione-ll /3 -ol 1*..prégnadiène-3,2üdione-11 -ol-21-al, dls4..prégnadiène..3,2U-dione-11 P-1 21-diol, ,
1a4-prégnadiène-3 r2U-dionell /3 17 d-diol, 1''prégnadiène-3 20-dione-11 17 0( , 21-triol, des composés 9.-halo-,l''-3-céto-prégnadiénaues tels que 9-haloprégnadiène3,20-dione-17, 2L..diol,9.-fluoro- ''-prégnadiène-3,20-dione-17 0( , 21-diol, 9-halol''-prégnadiène-3,20-dione-.17, 11,21-triol, 9-halol''-prégnadiène.-3,11,2p-trione-17f21-diol, 9-fluoro- (1''prégnadiène--3,11,20.-trione-17 0( , 21-diol, 9-fluoro-/,1'..prégnadiène-3,2p-dione-11 f , 17 0( , 21-triol, et analogues.
Les exemples suivants illustrent des modes d'exécution de la présente invention, mais il doit être entendu que ces exemples sont donnés à titre illustratif et non limitatif.
EXMPLE 1
On prépare 50 cc d'un milieu nutritif de composition suivante :
EMI12.2
<tb>
<tb> cérélose <SEP> 1 <SEP> gr.
<tb> édamine <SEP> 1 <SEP> gr.
<tb> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 0,25 <SEP> cc
<tb> extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 0,05 <SEP> gr
<tb> eau <SEP> distillée <SEP> q.s. <SEP> 50 <SEP> cc
<tb>
Ce milieu est ajusté à pH 6,5 à l'aide de KOH, stérilisé et inoculé avec environ 2,5 à 5 cc d'une cul- ture, obtenue par incubation de Bacillus sphaericus
EMI12.3
(M B 431) dans le même milieu pendit 2µ. heures Q 280 C; la culture inoculée est alors incubée à une température de 28 C avec agitation, pendant une période de 24 heu- res.
A la culture résultante est ajoutée une solution
EMI12.4
contenant 10 mgr d'hydrocortisone (..prénéne..xl
<Desc/Clms Page number 13>
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17 0{ , ;?1-trio'L-,3,:U-oiom) diusous Ùiillij 0,1 cc ae cllrnJtiyli'oxenimidu, 1;\ culture cunt..ol1('nt. le compo:;:) ct :roi.f est incuba en citant pendant une période supplémentaire d'environ 10 heures à 28 C.
Le bouillon de fermentation est extrait à l'aide de trois fractions de 50 cc d'acétate d'éthyle et les extraits d'acétate d'éthyle sont combinés et évaporés sous vide jusqu'à un volume d'environ 5 cc. La solution concentrée est alors utilisée pour préparer des chroma- togrammès sur papier, qui sont développés en utilisant de la formamide comme phase liquide stationnaire et du chloroforme comme phase liquide mobile. Deux bandes se forment, dont l'une correspondant au composant le plus mobile) présente le maximum d'adsorption d'ultraviolet caractéristique de l'hydrocortisone et dont l'autre (composant le moins mobile) révèle un maximum d'adsorption d'ultra-violet à environ 242 mu.
Le chromatogramme sur papier est séché et la bande correspondant à l'adsorption à 242 mu est découpée et extraite à l'aide de méthanol. La matière extraite à l'aide de méthanol est à nouveau soumise à chromatographie sur papier, en utilisant du papier qui a été extrait pendant 48 heures à l'aide de méthanol et en utilisant le système chloroforme-formamide précédemment employé. Le chromatogramme obtenu ne révèle qu'une bande de trace correspondant à
EMI13.2
l'hydrocortismne de départ, ainsi qu'une bande importan- te ayant un maximum d'adsorption d'ultra-violet à 242 mu. Le chromatogramme sur papier est séché à fond et la bande correspondant au maximum d'adsorption de 242 mu est dé- coupée et extraite au méthanol.
L'extrait méthanolique est évaporé jusqu'à siccité sous vide, en sorte qu'on
EMI13.3
obtient de la lf-préünadiene-11 /j , 17 0( , 2l-triol- 3,20-dione.
<Desc/Clms Page number 14>
EXEMPLE 2
On prépare 20 litres d'un milieu nutritif de composition suivante :
EMI14.1
<tb>
<tb> cérélose <SEP> 400 <SEP> gr
<tb> édamine <SEP> 400 <SEP> gr
<tb> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 100 <SEP> cc
<tb> extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 20 <SEP> gr
<tb> eau <SEP> distillée <SEP> q.s.ad <SEP> 20 <SEP> 1 <SEP>
<tb>
Ce milieu est ajusté à pH 6,5 à l'aide de KOH, stérilisé et inoculé avec environ 1 litre d'une culture de 24 heures de Bacillus sphaericus (M B 431). La culture inoculée est incubée à une température de 28 C, en agitant, pendant une période d'environ 24 heures et la culture résultante est auditionnée d'une solution de 4 gr d'hydrocortisone dans 40 cc de diméthylformamide.
La culture aontenant le composé stéroïde est incubée, en agitant, pendant une période d'environ 10 heures à 28 C.
Le bouillon de fermentation est extrait à plusieurs reprises à l'aide d'acétate d'éthyle et les extraits à l'acétate d'éthyle sont combinés et évaporés jusqu'à siccité sous vide. Un échantillon de la matière résiduelle est dissous dans de l'açétone et appliqué par gouttes sur un chromatogramme de papier, qui est développé à l'aide de formamide comme phase fixe et à l'aide de chloroforme comme phase mobile.
Deux bandes séparées sont obtenues; la bande antérieure, qui correspond à de l'hydrocortisone inchangée, est découpée; l'autre bande, qui correspond au dérivé 1-déshydrogéné, est également découpée et éluée avec du méthanol. Ltana- lyse par adsorption d'ultra-violet de cet éluat méthanolique révèle que la bande supérieure contient une quan-
EMI14.2
tité de j, prédnadiène-11,17,21¯triol-3,20¯dione cor-
<Desc/Clms Page number 15>
respondant à un rendement total d'approximativement 1
EMI15.1
gramme, sur la base des 4 grammes d'hydrocorti;one de départ.
La partie principale de la matière résiduelle obtenue après évaporation de l'extrait à l'acétate d'éthyle est soumise à une séparation entre, d'une part, du méthanol aqueux à 70% et, d'autre part, de l'éther de pétrole, de façon à éliminer les impuretés huileuses dans la phase éther de pétrole. Le méthanol est chassé de la phase de méthanol aqueux par évaporation sous vide et la pâte aqueuse résiduelle est extraite à l'aide d'acétate d'éthyle. L'extrait à l'acétate d'éthyle est évaporé sous vide jusqu'à siccité et la matière résiduelle est dissoute dans de l'acétone et soumise à chromatographie sur papier, en utilisant de la formamide comme phase stationnaire et du chloroforme comme phase mobile.
La bande supérieure, qui correspond au dérivé /\ -déshydrogéné, est découpée et extraite au méthanol, l'extrait méthanolique étant à nouveau soumis à une chromatographie sur papier. La bande supérieure est à nouveau découpée, séchée à fond et extraite au moyen de méthanol, l'extrait méthanolique étant évaporé sous vide jusqu'à siccité. La matière résiduelle est recristallisée dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther de pétrole, en sorte qu'on obtient environ 200
EMI15.2
mgr de 1'-prégnadiènell 17 c( , 21-triol-3 ' 20- dione sensiblement pure; P.F.: 222-228 C.
EXEMPLE 3 On prépare 20 litres d'un milieu nutritif de composition suivante :
EMI15.3
<tb>
<tb> cérélose <SEP> 400 <SEP> gr
<tb> édamine <SEP> 400 <SEP> gr
<tb> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 100 <SEP> cc
<tb> extrait'de <SEP> levure <SEP> 20 <SEP> gr
<tb> eau <SEP> distillée <SEP> q.s.ad <SEP> - <SEP> .1 <SEP> le, <SEP> -- <SEP> 20 <SEP> 1.
<tb>
<Desc/Clms Page number 16>
Ce milieu est ajusté à pH 0,5 à l'aire au KOH, stérilisé'et inoculé avec environ 1 litre d'un; culture de 24 heures de Bacillus sphaericus (M B 431). La cul- ture inoculée est incubée à une température de 28 C, en agitant, pendant une période d'environ 24 heures et la culture résultante est additionnée d'une solution de
4 gr de cortisone dans 40 cc de diméthylformamide. La culture contenant le composé stéroïde est incubée, en agitant, pendant une période d'environ 10 heures à 28 C
Le bouillon de fermentation est extrait à plu- sieurs reprises à l'aide d'acétate d'éthyle et les ex- traits à l'acétate d'éthyle sont combinés et évaporés jusqu'à siccité sous vide.
L'analyse d'un échantillon de cette matière résiduelle par chromatographie sur papier, suivie d'une mesure de l'adsorption d'ultra-violet de la matière contenue dans les deux bandes séparées développées dans le chromatogramme,révèle que la-matière résiduelle contient environ 3 grammes de cortisone inchangée et environ 1 gramme de ¯1,4-prégnadiène-17 Ó, 21-diol-3,11,20-trione.
La partie principale de la matière résiduelle obtenue après évaporation de l'extrait à l'acétate d'éthyle est soumise à une séparation'entre, d'une part, du méthanol aqueux à 70 % et, d'autre part, de l'éther. de pétrole, de façon à éliminer les impuretés huileuses dans la phase éther de pétrole. Le méthanol est chassé de la phase de méthanol aqueux par évaporation sous vide et la pâte aqueuse résiduelle est extraite à l'aide d'acétate d'éthyle.
L'extrait à l'acétate d'éthyle est évaporé sous vide jusqu'à siccité et la matière résiduelle est soumise à chromatographie sur papier (en utilisant de l'acétone comme solvant pour.transférer ladite matière sous forme de bandes sur les chromotogrammes sur papier)
<Desc/Clms Page number 17>
en utilisant de la formamide comme phase stationnaire et du chloroforme comme phase mobile. La bande supérieure, qui correspond au dérivé ±'-déshydrogéné, est découpée et extraite au méthanol, l'extrait méthanolique étant à nouveau soumis à une chromatographie sur papier.
La bande supérieure est à nouveau découpée, séchée à fond et extraite au moyen de méthanol, l'extrait méthanolique étant évaporé sous vide jusqu'à siccité. La matière résiduelle est recristallisée dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther de pétrole, en sorte qu'on obtient environ 250 mgr de ¯1,4-prégnadiène-17 ci ,21- diol-3,ll,20-trione sensiblement pure; P.F. : 232-236 C.
.EXEMPLE /).
On prépare 20 litres d'un milieu nutritif de composition suivante :
EMI17.1
<tb>
<tb> cérélose <SEP> 400 <SEP> gr
<tb> édamine <SEP> 400 <SEP> gr
<tb> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 100 <SEP> gr
<tb> extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 20 <SEP> gr
<tb> eau <SEP> distillée <SEP> q.s. <SEP> ad <SEP> 20 <SEP> 1.
<tb>
Ce milieu est ajusté à pH 6,5 à l'aide de KOH, stérilisé et inoculé avec environ 1 litre d'une culture de 24 heures de Bacillus sphaericus (Ni B 4310. La culture inoculée est incubée à une température de 28 C, en agitant, pendant une période-d'environ 24 heures et la culture résultante est additionnée d'une solution de 4 gr de prégnène, 17Ó, 21-diol-3,20-dione dans 40 cc de diméthylformamide. La culture contenant le composé stéroïde est incubée, en agitant, pendant une période d'environ 10 heures à 28 C.
Le bouillon de fermentation est extrait à plusieurs reprises à l'aide d'acétate d'éthyle et les extraits à l'acétate d'éthyle sont combinés et évaporés
<Desc/Clms Page number 18>
jusqu'à siccité sous vide. La matière résiduelle est soumise à' une séparation entre, d'une part, du méthanol aqueux à 70 % et, d'autre part, de l'éther de pétrole,, de façon à éliminer les impuretés huileuses solubles dans la phase éther de pétrole. Le méthanol est évaporé sous vide de la phase méthodique aqueuse et la pâte aqueuse résiduelle est extraite à l'acétate d'éthyle.
L'extrait à l'acétate d'éthyle est évaporé sous vide jusqu'à siccité et la matière résiduelle est dissoute dans de l'acétone et étaliée en bande sur des chromatogrammes en papier, qui sont développés en utilisant de la formamide comme phase stationnaire et du benzène comme phase mobile. Les bandes supérieures de chaque chromatogramme, qui correspond'au dérivé ¯1-déshydrogéné, sont découpées et extraites au méthanol, après quoi la matière extraite au méthanol est à nouveau soumise à chromatographie sur papier. La bande supérieure est à nouveau découpée, séchée à fond et extraite au méthanol, après quoi l'extrait méthanolique est évaporé sous vide jusqu'à siccité.
La matière résiduelle est recristallisée dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther de pétrole, en sorte qu'on obtient de la ¯1,4-prégnadiène 17 c( , 21-diol-3,20-dione sensiblement pure ; P.F. 230- 236 c.
EXEMPLE 5
On prépare 20 litres d'un milieu nutritif de composition suivante :
EMI18.1
<tb>
<tb> cérélose <SEP> 400 <SEP> gr
<tb> édamine <SEP> 400 <SEP> gr
<tb> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 100 <SEP> cc
<tb> extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 20 <SEP> gr
<tb> eau <SEP> distillée <SEP> q.s.ad <SEP> 20 <SEP> 1.
<tb>
Ce milieu est ajusté à pH 6,5 à l'aide de KOH,
<Desc/Clms Page number 19>
stérilisé et inoculé avec environ 1 litre d'une cul-
EMI19.1
ture de 24 heures de 13n.ìlJ..1!l? L3L)hierjcus (M B 431) La culture inoculée est incubée à une température de 28
EMI19.2
c,' en citant, pelaz.,U \.\t1G période d'aviron 24 heures et la culture résultante est additionnée d'une solution de 4 gr de 9 ';
, - fluoro-b., 4 ...prégnène-l1 j3 , 17 c iltriol3,0-c 3 one dans . cc de,diméthy1formamide. La culture contenant le composé stéroïde est incubée, en agitant, pendant une période d'environ 10 heures à 28 C.
Le bouillon de fermentation est extrait à plu- sieurs reprises à l'aide d'acétate d'éthyle et les ex- traits à l'acétate d'éthyle sont combinés et évaporés jusqu'à siccité sous vide. La matière résiduelle est soumise à une séparation entre, d'une part, du méthanol aqueux à 70 % et, d'autre part, de l'éther de pétrole, de façon à éliminer les impuretés huileuses solubles dans la phase éther de pétrole. Le méthanol est évaporé sous vide de la phase méthanolique aqueuse et la pâte aqueuse résiduelle est extraite à l'acétate d'éthyle.
L'extrait à l'acétate d'éthyle est évaporé sous vide jusqu'à siccité et la matière résiduelle est dissoute dans de l'acétone et étalée en bandes sur des chromato- grammes en papier, qui sont développés en utilisant de la formamide comme phase stationnaire et du benzène comme phase mobile. Les bandes supérieures de chaque chromatogramme, qui correspondent au dérivé Et ¯1-déshy- drogéné, sont découpées et extraites au méthanol, après quoi la matière extraite au méthanol est à nouveau sou- mise à chromatographie sur papier. La bande supérieure est à nouveau découpée, séchée à fond et extraite au méthanol, après quoi l'extrait méthanolique est évaporé sous vide jusqu'à siccité.
La matièree résiduelle est
<Desc/Clms Page number 20>
recristallisée dans un mélange d'acétate d'éthyle t d'éther de pétrole, en sorte qu'on obtient de la 9 o(-
EMI20.1
fluoro l '.-prégnadiène ll /3 , 17 0( , 21-trioh3 20... dione; par acétylation de cette matière à l'aide d'anhy-.. dride acétique dans de la pyridine, on obtient du 21-
EMI20.2
acétate de : c --fluuro-.Z' prégnadiène ll j3 17 cl..
21'bh'f.03.3', Zt3-dione; 3 P4F. 236 G.
EXEMPLE 6
On prépare 20. litres d'un milieu mutritif de composition suivante :
EMI20.3
<tb>
<tb> cérélose <SEP> 400 <SEP> gr
<tb> édamine <SEP> 400 <SEP> gr
<tb> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 100 <SEP> fc
<tb> extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 20 <SEP> gr
<tb> eau <SEP> distillée <SEP> q. <SEP> s.ad <SEP> 20 <SEP> 1.
<tb>
Ce milieu est ajusté à pH 6,5 à l'aide de KOH, stérilisé et inoculé avec environ 1 litre d'une.culture
EMI20.4
de 24 heures de Bacillus sphaericus (M B t31), La cul- ture inoculée ost incubée à une température de 28 C, en agitant, pendant une période d'environ 24 heures et la culture résultante est additionnée d'une solution de
EMI20.5
4 gr de j.,prégnènell /3 2l..diol-3,20-dione dans 40 cc de diméthylformamide. La culture contenant le composé stéroïde est incubée, en atitant, pendant environ 10 heures à une température d'environ 28 C.
EMI20.6
Le ,1,1''stéroide formé par'le principe déshy- drogénant des microorganismes du genre Bacilles sphaeri..
EMI20.7
eus est extrait du bouillon de fermentation à l'aide' d'a- cétate d'éthyle et est.purifié en utilisant sensiblement Le.même procédé de purification que celui.décrit dans . l'exemple 4, ce procédé comportant (1) la péparation entre éther de pétrole et méthanol pour éliminer les imprêtés huileusolubles dans l'éther de pétrole, (2)
<Desc/Clms Page number 21>
la chromatographie sur papier en utilisant de la formemide c@mme phase stationnaire et du benzine comme phase mobile ;
et (3) la recristallisation dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther de pétrole, en sorte qu'on obtient de la ¯1,4-prégnodiène-11/3, 21-diol-3,20-dio- ne sensiblement pure ; P.F.231-234 C.
EXEMPLE 7
On prépare 20 litres d'un milieu nutritif de composition suivante ;
EMI21.1
<tb>
<tb> cérélose <SEP> 400 <SEP> gr
<tb> édamine <SEP> 400 <SEP> gr
<tb> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 100 <SEP> cc
<tb> extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 20 <SEP> gr
<tb> eau <SEP> distillée <SEP> q.s. <SEP> ad <SEP> 20 <SEP> 1.
<tb>
Ce milieu est ajusté à pH 6,5 à l'aide de KOH, stérilisé et inoculé avec environ 1 litre d'une culture de 24 heures de Bacillus sphaericus (M B 431). La culture inoculée est incubée à une température de 28 C, en agitant, pendant une période d'environ 24 heures et la culture résultante est additionnée d'une solution de 4 gr de ¯4-prégnène-21-o1-3,20-dione dans 40 cc de diméthylformamide. La culture contenant le composé stéroide est incubée, en agitant, pendant une période d'environ 10 heures à 28 C.
Le bouillon de fermentation est extrait à plusieurs reprises à l'aide d'acétate d'éthyle et les extraits à l'acétate d'éthyle sont combinés et évaporés jusqu'à siccité sous vide. La matière résiduelle est soumise à une séparation entre, d'une part, du méthanol aqueux à 70 % et, d'autre part, de l'éther de pétrole, de façon à éliminer les impuretés huileuses solubles dans la phase éther de pétrole. Le méthanol est évaporé sous vide de la phase méthanolique aqueuse et la pâte
<Desc/Clms Page number 22>
aqueuse résiduelle est extraite à l'acétate d'éthyle.
L'extrait à l'acétate d'éthyle est évaporé sous vide jusqu'à siccité et la matière résiduelle est dissoute dans de l'acétone et étalée en bandes sur des chromato- grammes en papier, qui sont développés en utilisant, d'une part, un mélange à 50 % de méthanol et de formami- de comme phase fixe et, d'autre part, un mélange à 50% de benzène et cyclohexane comme phase mobile. Les ban- des supérieures de chaque chromatogramme, qui correspond. au dérivé -déshydrogéné, sont découpées et extraites au méthanol, après quoi la matière extraite au métha- nol est à nouveau soumise à chromatographie sur papier.
La bande supérieure est à nouveau découpée, séchée à fond et extraite au méthanol, après quoi l'extrait mé- thanolique est évaporé sous vide jusqu'à siccité. La matière résiduelle est reciittallisée dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther de pétrole, en sorte qu'on
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obtient de la 1'-.prégnadiène-21.-0l-3,20dione sensi- blement pure:
P.F.: 191-193 c.
EXEMPLE 8
EMI22.2
On prépare fo 1-i-tres.d'un milieu nutritif de composition suivante :
EMI22.3
<tb>
<tb> cérélose <SEP> 1 <SEP> gr
<tb> édamine <SEP> 1 <SEP> gr
<tb> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 05cc
<tb> extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 0.05gr
<tb> eau <SEP> distillée <SEP> q. <SEP> s. <SEP> ad <SEP> 50
<tb>
Ce milieu est ajusté à pH 6,5 à l'aide de KOH, stérilisé et inoculé avec environ 2,5 à 5 cc d'une culture, obtenue par incubation de Bacillus sphaericus (M B 431) dans le même millieu pendant 24 heures à 28 C; la culture inoculée est alors incubée à une température de 28 C avec gagitation, pendant une période de 24 heures.
A la culture résultante est ajoutée une solution
<Desc/Clms Page number 23>
EMI23.1
contenant 10 mgr p'rP)rSir.0,<ï:9r'\i1.1J!bQf3 .r 0.prégnène-11,3 , 7' y Z'., ,gy,.3 0dione dissous dans 0,1 cc de dimé- thylformamide. La culture contenant le composé stéroide est incubée en agitant pendant une période supplémentaire d'environ 10 heures à 28 C.
Le bouillon de fermentation est extrait à l'ai- de de trois fractions de 50 cc d'acétate d'éthyle et les extraits d'acétate d'éthyle sont combinés et évaporés .,sous vide jusqu'à un volume d'environ 5 cc. La solution concentrée est alors utilisée pour préparer des chroma- togrammes sur papier, qui sont développés en utilisant, , d'une part, un mélange à 50 jo de méthanol et de formami- de comme phase liquide fixe et, d'autre part, un mélange à 50% de benzène et de cyclohexane comme phase liquide mobile Dons bandes 'se forment, dont l'une (correspon- dant au composant le plus mobile) présente le maximum d'adsorption d'ultra-violet caractéristique de la 11 /Il-
EMI23.2
hydroxy-progestérone et dont l'autre (composant le moins mobile)
révèle un maximum d'adsorption d'ultra-violet à environ 241 mu. Le chromatogramme sur papier est séché ; et la bande correspondant au composant le moins mobile est découpée et extraite au méthanol. La matière extraite au méthanol est à nouveau soumise à chromatographie sur papier en employant le système solvant utilisé pré- cédemment. Le chromatogramme résultant ne révèle qu'une
EMI23.3
bande de trace correspondant à la 11 /3 -hydroxy-.proges- térone de départ. Le chromatogramme sur papier est séché à fond et la bande majeure ayant un maximum d'adsorption ultra-violet de 241 mu est découpée et extraite au méthanol.
L'extrait méthanolique est évaporé sous vide jusqu'à siccité, en sorte qu'on obtient de la ¯1,4-prégnadiène-11ss -ol-3,20-dione.
<Desc/Clms Page number 24>
EXEMPLE 9
On prépare 20 litres d'un milieu nutritif' de composition suivante :
EMI24.1
<tb>
<tb> cérélose <SEP> 400 <SEP> gr <SEP>
<tb> édamine <SEP> 400 <SEP> gr <SEP>
<tb> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 100 <SEP> cc
<tb> extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 20 <SEP> gr
<tb> eau <SEP> distillée <SEP> q.s, <SEP> ad <SEP> 20 <SEP> 1.
<tb>
Ce milieu est ajusté à pH 6,5 à l'aide de KOH, stérilisé et inoculé avec environ 1 litre d'une culture de 24 heures de Bacillus sphaericus (M B 431).
La culture inoculée est incubée à une température ae 28 C, en agitant, pendant une période d'environ 24 heures et la culture résultante est additionnée d'une solu-
EMI24.2
tion cé 4 gr de A-prégnène-3,20-dione dans 40 cc de diméthylformamide. La culture contenant le composé stéroide est incubée, en agitant, pendant une période d'environ 10 heures à 28 C. Mol et de
Le bouillon de fermentation est extrait à plu- sieurs reprises à l'aide d'acétate d'éthyle et les ex- traits à l'acétate d'éthyle sont combinés et évaporés jusqu'à siccité sous vide. La matière résiduelle est soumise à une séparation entre, d'une part, du méthanol aqueux à 70 % et, d'autre part, de l'éther de pétrole, de façon à éliminer les impmretés huileuses solubles dans la phase éther de pétrole.
Le méthanol est évaporé sous vide de la phase méthanolique aqueuse et la pâte aqueuse résiduelle est extraite à l'acétate d'éthyle.
L'extrait à l'acétate d'éthyle est évaporé sous vide jusqu'à siccité et la matière résiduelle est dissoute dans de l'acétone et étalée en bandes sur des chromato- grammes en papier, qui sont développées en utilisant,
EMI24.3
forma'l1J.de COUl'le phase st,3.ti on,uit', '>1 .1 ""',,,.. "t ;-;xt;,: -,ti¯; -,., '. d'une part, un mélange à6 jde benzène et de cyclôrié;
<Desc/Clms Page number 25>
EMI25.1
x;:ne comme phase niobila. L0U bnd.; aa;?,"sri.c;vw:a L1J chaqae h . 1 r. <liJi'à-'Jé ]. l' J que chr-omatogram-ne, qui correspond duriv: '-dsydrogéné, sont découpées et extrct.tc:: au !Il6tb11j()1) iiiJr4i quoi la matière extraite au méthane]. eiJi à n0UVUU soumise .à chromatographie sur popier.
La bande supcrioure est à nouveau découpée, léchée à fond et; extraite au f:L8thanol, après quoi leaçra.e ¯ Hiéthanolique est évapore sous vide jusqu'à siccité. La matière résiduelle est recristallisée dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther de pétrole, en sorte qu'on obtient de la 1,4
EMI25.2
pré;nediène-,20c?ione; P.F. 14S"'150 Ca E.t.iPL 10
On prépare 20 litres d'un milieu nutritif de composition suivante :
EMI25.3
<tb>
<tb> cérélose <SEP> 400 <SEP> gr
<tb> édaline <SEP> 400 <SEP> gr
<tb> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 10@ <SEP> ce
<tb> extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 20 <SEP> gr
<tb> eau <SEP> di <SEP> illée <SEP> q.s. <SEP> ad <SEP> 20 <SEP> 1.
<tb>
Ce milieu est ajusté à pH 6,5 à l'aide de KOH, stérilisé et inoculé avec environ 1 litre d'une culture de 24 heures de Bacillus sphaericus (M B 431). La culture inoculée est incubée à une température de 28 C, en agitant, pendant une période d'environ 24 heures et la culture résultante est additionnée d'une solution de
EMI25.4
4 gr de ,5-prébnène-3yol-20-one dans 40 cc de diméthyl- formamide. La culture contenant le composé stéroïde est incubée, en agitant, pendant une période d'environ 10 heures à 28 C.
Le bouillon de fermentation est extrait à plusieurs reprises à l'aide d'acétate d'éthyle et les extraits à l'acétate d'éthyle sont combinés et évaporés jusqu'à siccité sous vide. La matière résiduelle est
<Desc/Clms Page number 26>
soumise à une séparation entre, d'une part, du méthanol aqueux à 70 % et, d'autre part, de l'éther de pétrole, de façon à éliminer les impuretés huileuses solubles dans la phase éther de pétrole.
Le méthanol est évaporé sous vide de la phase méthanoligue aqueuse et la pâte aqueuse résiduelle est extraite à l'acétate d'éthyle,
L'extrait à ltacétate d'éthyle est évaporé sous vide jus- qu'à siccité et la matière résiduelle est dissoute dans de l'acétone et étalée en bandes sur des chromatogremmes en papier, qui sont développés en utilisant, d'une part, un mélange 4 50% de méthanol et de formamide comme phase stationnaire et, d'autre part, un mélange à 50 % de benzène et de cyclohexane comme phase mobile. Les bandes supérieures de chaque chromatogramme, qui corresponde dérivé ¯1-déshydrogéné, sont découpées et extraites au méthanol, après quoi la matière extraite au méthanol est à nouveau soumise à chromatographie sur papier.
La ban- de supérieure est à nouveau découpée, séchée à fond et extraite au méthanol, après quoi l'extrait méthanolique est évaporé sous vide jusqu'à siccité. La matière rési- duelle est recristallisée dans un mélange d'acétate d'é- thyle et d'éther de pétrole, en sorte qu'on obtient de la ¯1,4-prégnadiène-3,20-dione sensiblement pure; P.F.:
148- 150 C.
EXEMPLE 11
Des fractions de 50 cc de chacun des sept mi- lieux nutritifs différents, dont les compositions sont indiquées dans le tableau suivant, sont ajustées à pH 7, stérilisées par chauffage pendant 15 minutes dans un au- toclave à environ 1200 C. Chaque milieu est inoculé à l'aide d'une culture de microorganismes du genre Bacillus sphaericus (M B 431). Les cultures inoculées sont incu bées à une température de 28 C, en agitant, pendant en-
<Desc/Clms Page number 27>
viron 24 heures. A chacune des cultures résultantes est ajoutée une solution de 10 mgr d'hydrocortisone dans
0,1 cc de diméthylformamide.
Les cultures contenant l'hydrocortisone sont alors incubée, en agitant, pendant une période supplémentaire d'environ 24 heures à 28 C.
Chacun des bouillons d:. fermentation ainsi ob- tenus est individuellement extrait à l'aide de trois fractions de 50 cc d'acétate d'éthyle et les extraits à l'acétate d'éthyle correspondant à chaque bouillon et provenant d'un milieu particulier sont combinés et éva- porés sous vide jusqu'à siccité. Chacun des sept pro- duits résiduels ainsi obtenus est analysée pour déter- miner sa teneur, en ¯1,4-prégnadiène-11 ss, 17 o( , 21- triol-3,20-dione par analyse polarographique, en mesurant la demi-onde à 1,52 volts.
Les compositions des milieux utilisés et la quantité de ¯1,4-prégnadiè-11 ss, 17 o, 21-triol-3,20-dione ( /\ -hydrocortisone) obtenue avec chaque milieu, exprimée en pour cent de la quantité théo- riquement obtenable à partir des 10 mgr de l'hydrocorti- sone de départ,.sont indiquées dans le tableau suivant
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<tb>
<tb> N <SEP> Composition <SEP> du <SEP> milieu <SEP> Rendement <SEP> en <SEP> ¯1-hydrocortisone;
% <SEP> par <SEP> rapport <SEP> à <SEP> la <SEP> théorie <SEP>
<tb>
<tb> 1 <SEP> comme <SEP> dans <SEP> l'exemple <SEP> 1 <SEP> 37 <SEP> %
<tb> 2 <SEP> % <SEP> de <SEP> solables <SEP> de <SEP> distillateur <SEP> 37 <SEP> %
<tb> 3 <SEP> % <SEP> HCl <SEP> hydrolysat <SEP> de <SEP> caséine <SEP> 44%
<tb> 4 <SEP> (1% <SEP> de <SEP> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 31 <SEP> %
<tb> (1% <SEP> de <SEP> farine <SEP> de <SEP> graines <SEP> de <SEP> soja <SEP> %
<tb> 5 <SEP> 2% <SEP> de,farine <SEP> de <SEP> poisson <SEP> 30%
<tb> 6 <SEP> 2% <SEP> de <SEP> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 34%
<tb> 7 <SEP> 2% <SEP> tankage <SEP> 26%
<tb>
EXEMPLE 12
Une fraction de 10 mgr de ¯4-prégnène-11 Ó, 17 o( , 21-triol-3,
20-dione est mise en contact avec le
<Desc/Clms Page number 28>
principe déshydrogénant de microorganismes du genre Bacillus sphaericus (M B 431) et le produit déshydrogéné
EMI28.1
est isolé par le procédé décrit pour la déshyarogénation de '.prégnène-.11 3 -.01-3 , 2U-dions dans l'exemple 8, en sorte qu'on obtient de la 1*-prégnadiêne-11 0( , 17 0, 21-triol-3,20-dione.
EXEMPLE 13 ,
EMI28.2
Une fraction de 10'mgr de 4..androstène-3,20.. dione est mise en contact avec le principe déshydrogénant de microorganismes du genre Bacillus sphaericus (M B 431) et le produit déshydrogéné est isolé par le procédé décrit pour la déshydrogénation de ¯-prégnène- 11 ss-o1-3,20-dione dans l'exemple 8, en sorte qu'on ob-
EMI28.3
tient de la Llj'-androstadiène-3,20-dione.
EXEMPLE 14
Une fraction de 50 cc du milieu d'édamine dé- crit dans l'exemple 8 est ajustée à pH 7 et stérilisée par chauffage pendant 15 minutes dans un autoclave à environ 120 C, après quoi le milieu stérilisé est inocu- lé à l'aide de microorganismes du genre Bacillus sphaericus (A.T.C.C.- 245). La culture inoculée est incubée à une température de 28 C, en agitant, pendant environ 24 heures et la culture résultante est additionnée d'une solution de 10 mgr d'hydrocortisone dans 0,1 cc de diméthylformamide. Les cultures contenant l'hydrocortisone sont alors incubées, en agitant, pendant une période supplémentaire d'environ 10 heures à 28 C.
- Le bouillon de fermentation ainsi obtenu est extrait à l'aide de trois fractions de 50 cc d'acétate d'éthyle et les extraits à l'acétate d'éthyle sont combinés et évaporés sous vide jusqu'à siccité. Le produit résiduel ainsi obtenu est soumis à une analyse polarographique, en mesurant la demi-onde à 1,52 volts et on
<Desc/Clms Page number 29>
EMI29.1
c<,ii;¯iti,1=e qu'il, i.mit unc . , L' l )" .ii=. Ct.u'.te qu'il '1011t lUlL' quntit. '!/L '''"-pr.d10ne-ll!3 17 C( , ?di-1riLJl-3 , 2flV..< '-'nu corw ,al;.nt û un rendement de plus de 50 IV par rapport ,1. 1.;wJ;>n;,:nt théorique > obtn,ahl.. - là partir des 10 (1( 3'hydrocor- tisone de départ.
EXMPLE 15
EMI29.2
Une {.'l'action d4 50 cc di;. <.<i,lieu d c.rm:ine d'j- crit dans l'exemple 8 est ajustée a pH 7 e' stérilisée
EMI29.3
par chauffage pendant 15 minutes arm um utocl,ve à environ 120 C, après quoi le milieu stérilisé est inoculé à l'aide de microorganismes du genre Bacillu3
EMI29.4
sphaericus (A.T.CoC. - 705@)1 qui constitue une variété fusiforme de Bacillus sphaericus, parfois qu(;)lifié' de
Bacillus fusiformis. La culture inoculéee st incubée à une tempérzture de 28 C, en agitant, pendant environ 24 heures et la culture résultante est additionnée à -' une solution de 10 mgr d'hydrocortisone dans 0,1 cc de diméthylformamide.
La culture contenant l'hydrocorti- sone est alors incubée, en agitant, pendant @e période supplémentaire d'environ 10 heures à 28 C.
Le bouillon de fermentation ainsi obtenu est extrait à l'aide de trois fractions de 50 cc d'acétate d'éthyle et les extraits à l'acétate d'éthyle sont combinés et évaporés sous vide jusqu'à siccité. Le produis
EMI29.5
résiduel s lisi obtenu est soumis à une analyse polé::ro- graphique, en mesurant la demi-onde à 1,52 volts et on
EMI29.6
constate qu'il contient une quantité de ,,1' 'r..préâriadiène-11/5 , 17 d. , 21-triol-3,20-dione cOr1-eSponciant à un rendement de plus de 50 % par rapport au rendement théorique obtenable à partir des 10 mgr de l'hydrocortisone de départ.
EMI29.7
f4.l!;\If>I,l!; 16 Une fraction de 50 ce du millen d'édamine dé-
<Desc/Clms Page number 30>
EMI30.1
crit dans l'exemple . ct üju ¯t V ' , l)H 7 ut ...t;Jrlli'1J par chauffée pendant 1) minute::;
([,, Ils un r.utoG.rfrc: à environ 120 C, âpres quoi le Illiliuu :;t:x i.li.:; cet inoculé à l'aide de microoru,mi:..;m8s du genre Buci 2ph'Grjcus (A.T.C.C. - 7Ù5 , qui constitue une véJri6t6 fusiforme de Bacillus sth;ieicus, parfois qu.lifi6.de bacil- lus fusiformis. La culture inocula est incubée à une température de 28 C, en agitant, pendat environ 24 heures et la culture résultante est adaitionnée d'une
EMI30.2
solution de 10 mgr de 9 c( -fluoro-L 1H ..prénène-11 ,
17Ó, 21-triol-3,20-dione dans 0,1 ce de diméthylfor- mamide. La culture contenant le composé tréroïde est incubée, en agitant, pendant une période d'au roins 10 heures à 28 C.
Le bouillon de fermentation ainsi obtenu est extrait à l'aide de trois fractions de 50 cc d'acétate d'éthyle et les extraits à l'acétate d'éthyle sont combinés et évaporés sous vide jusqu'à siccité. Le produit résiduel ainsi obtenu est soumis à une analyse polaro- graphique,¯ en mesurant la demi-onde à 1,52 volts et on constate qu'il contient une quantité de 9 Ó-fluoro-
EMI30.3
1'-prégnadiène-11 17 0( 21-triol-3,20-dione cor- respondant à un rendement de plus de 50% par rapport au rendement théorique obtenable à partir des 10 ùgr de
EMI30.4
9 0( -flioro.,¯prégnène-.11 l3 , 17 0( , 21-triol-3,20- dione de départ.
EXEMPLE 17 Treize fractions-de 50 cc du milieu d'édamine décrit dans l'exemple $ sont ajustées à pH 7 et stérilisées par chauffage pendant 15 minutes dans un autoclave à environ 1200 C. Chacun des milieux stérilisés est ino-
EMI30.5
culé à l'aide d'une culture de microorgê,ni.s!!h;s du genre -Bacillus sphaericus (111 B $34); cette culture a Út8 isolée r ë34); cette culture été isolée
<Desc/Clms Page number 31>
d'une terre provenant d'un champ pétrolifère du Texas et est désigné comme isolait bactérien 246 E2 X. Les cultures inoculées sont incubées à une température de
28 C, en agitant, pendant environ 24 heures.
A chacune des treize cultures résultantes est ajoutée une solu- tion de 10 mgr d'un composé 3-hydroxy-ou @-céto-stéroïde différent dans 0,1 cc de diméthylformamide. Les cultures contenant les composés 3-céto- stéroïdes sont alors incu- bées, en agitant, pendant une période supplémentaire d'environ 10 heures.
Chacun des bouillons de fermentation ainsi ob- tenus est extrait individuellement avec trois fractions de 50 ce d'acétate d'éthyle et les extraits à l'acétate d'éthyle correspondant à chaque bouillon et dérivés d'Un substrat 3-céto-stéroide particulier sont combinés et évaporés jusqu'à siccité sous vide. Chacun des trei- ze produits résiduels ainsi obtenus est dissous'dans de l'acétone et étalé en bandes sur des chromatogrammes sur papier, qui sont chacun développés en utilisant le système solvant indiqué pour le substrat de départ particulier dans le tableau donné plus loin. Les bandes supérieures pour chaque chromatogramme, qui correspondent aux dérivés -déshydrogénés, sont découpées et individuellement extraites à l'aide de méthanol, après quoi l'extrait méthanolique est à nouveau soumis à chromatographie sur papier.
La bande supérieure est à nouveau découpée, puis séchée et extraite à l'aide de méthanol, après quoi l'extrait méthanolique est évaporé jusqu'à siccité sous vide, en sorte qu'on obtient, pour chaque substrat de départ, le composé ¯1,4-3-céto-stéroïde particulier indiqué dans le tableau suivant :
<Desc/Clms Page number 32>
Système solvant utilisé pour la chromatographie sur papier
EMI32.1
<tb>
<tb> Essai <SEP> Substrat <SEP> Phase <SEP> fixe <SEP> Phase <SEP> mobile <SEP> ¯1,4-3-céton <SEP> stéroïde <SEP> obtenu
<tb>
EMI32.2
1 /\"-prégnène-21-' 1:1 méthanol- 1:1 benzène- J,,4¯prégna-
EMI32.3
<tb>
<tb> ol-3,20-dione <SEP> formamide <SEP> cyclohexane <SEP> diène-21-o1-
<tb> 3,20-dione
<tb>
EMI32.4
2 A''-'prégnène-3, 1:1 métha- 1:1 benzène- j'4-prégna-
EMI32.5
<tb>
<tb> 20-dione <SEP> nol-forma- <SEP> cyclohexane <SEP> diène-3,20mide <SEP> dione
<tb>
EMI32.6
3 5-prégnéne-3- 1;1 métha- 1:
1 benzène- 1,4¯prégna-
EMI32.7
<tb>
<tb> ol-20-one <SEP> nol-forma- <SEP> cyclohexane <SEP> diène-3,20mide <SEP> dione
<tb>
EMI32.8
'4 4¯prégnène- formamide benzène 1''-prégna- 17 o(,21-diol- diene-17 c{
EMI32.9
<tb>
<tb> 3, <SEP> 20-dione <SEP> 21-diol-3,20dione
<tb> 5 <SEP> 21-acétate <SEP> de <SEP> formamide <SEP> benzène <SEP> ¯1,4-prégna-
<tb>
EMI32.10
4¯prégnène- diène-17 q , l'T o(p, 21-diol- 21-diol-3,20, 3,20-dione dione 6 f\4¯prégnène- formamide benzène 1,4¯prégna-
EMI32.11
<tb>
<tb> 17 <SEP> Ó, <SEP> 21-diol- <SEP> diène-1
<tb>
EMI32.12
3,11,20-trione 21-diol 1 1 20-trione 7 4¯prégnène- formamide chloroforme LiIJ4-prélna- 21-trioL3 2Ô- 17 C{, 2-
EMI32.13
<tb>
<tb> dione <SEP> triol-3,20dioe
<tb>
EMI32.14
9 o(-fluoro- formamide chloroforme 9 d -fluor- ..prégnène- 1''.pré na- 4¯prégnène- /\l,
4-prl' na- 2rio326- dIène-Il 2Jtrol-3 ,2u- 17 c{ , 2 -'
EMI32.15
<tb>
<tb> dione <SEP> triol-3,20dione
<tb>
EMI32.16
9 4-androstane- 1:1 métha- 1:1 benzène- 1,4-andro-
EMI32.17
<tb>
<tb> 3,17-dione <SEP> nol-forma- <SEP> cyclohexane <SEP> stadiène-3.
<tb> mide <SEP> 17-dione
<tb>
EMI32.18
10 2I-acétate de òrmamide' benzène LlI,4.prégnaprégn;
ne-3 ,17 C{, diène-17 0( , dione 21-diol-J,II,
EMI32.19
<tb>
<tb> dione <SEP> 20-trione
<tb> 11 <SEP> 21-acétate <SEP> de <SEP> formamide <SEP> benzène <SEP> ¯1,4-prégnaprégnane-17 <SEP> Ó <SEP> diène-17 <SEP> Ó
<tb>
EMI32.20
17d01-J,ll,2U- 21-diol-.3 , l,
EMI32.21
<tb>
<tb> trione <SEP> 20-trione
<tb>
<Desc/Clms Page number 33>
EMI33.1
<tb>
<tb> 12 <SEP> 21-acétate <SEP> de <SEP> formamide <SEP> benzène <SEP> ¯1,4-prégnadièprégnane-3, <SEP> ne-17 <SEP> 0( <SEP> ,21-diol-
<tb> 17Ó <SEP> ,21-tri- <SEP> 3,20-dione
<tb> ol-20-one
<tb> 13 <SEP> 21-acétate <SEP> de <SEP> formamide <SEP> benzène <SEP> ¯1,4-prégnadiè-
<tb>
EMI33.2
,réjnane-17 d , ne-17 0( 21-diol-
EMI33.3
<tb>
<tb> 21-diol-3,20- <SEP> 3,20-dione
<tb> dione
<tb>
REVENDICATIONS
EMI33.4
1.
Procédé pour la ahdésdrogénation d'un com- posé stéroïde, dans lequel on met ce composé en contact
EMI33.5
avec le principe déshydrogénant de.miçroorganismes du genre Bacillus.
2. Procédé dans lequel on cultive des microorgas nismes du genre Bacillus dans un milieu nutritif aqueux en présence d'un composé stéroïde, dont les atomes de carbone en C-1 et C-2 sont reliés par une simple liaison, de manière à former un composé ¯1-stéroïde.
3. Procédé pour la production d'un composé ¯1-sté roï de, dans lequel on met un composé stéroide, dans lequel une simple liaison relie les atomes de car- bone C-1 et C-2, en contact avec des enzymes déshydrogé- nantes produites par des microorganismes du genre Bacil- lus sphaericus.
4. Procédé dans lequel on met un composé stéroide
3-oxygéné de la série du prégnane, dans lequel une liai- son simple relie les atomes de carbone C-1 et C-2, en contact avec le principe déshydrogénant de microorganis- mes du genre Bacillus sphaericus.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.