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L'invention est relative aux procédés de prépara- tion de la lysine qui est une aminé acide essentiel ayant une grande importance ; et elle concerne, plus spécialement, un procédé pour'préparer la lysine à partir du composé dé- nommé acide diaminopimélique ainsi qu'un procédé pour prépa-
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rer l'acide dianinopimélique lui-même.
Bien que les travaux dans ce domaine soient relati- vement récente, la littérature, à cause de l'importance de la lysine, contient déjà des indications considérables à son sujet. Davis, dit dans Nature, Vol 169, page 534 (1952) que certains auxotrophes, qui ont besoin de lysine, des Esche- richia coli fournissent des quantités relativement grandes d'acide diaminopimélique.
Une enzyme, qui décarboxyle l'aci-
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de dia:1Ïnopil1CHique pour fournir de la lysine, est indiquée comme existant dans plusieurs bactéries z. iiork - 11 sympo- sium on Amino Acid Métabolism, 1955) mais comme étant absen- te dans les auxotrophes ayant besoin de lysine (Lewey, Iloare &u'ork, 3iochcrnical Journal, Vol. 58 page S;.3 1954 Voir 6[':0.- lement Wright et Cresson, Proceedings of the Society :or Expérimental Biology and Médecine, Vol. F2, }''.2:e 35'i-, 1953.) ' On a découvert maintenant que l'acide. (1.i.<.H1jilhhL- mélique peut être obtenu avec un rendement é]'v6 ut, .J81..ti'., ensuite, être converti en lysine avec un 1'8]\<' W'!l::1Jl, '1 e,r'l quand on a recours à certaines conditions, nouvelles et réglé es, pour les réactions.
Par conséquent, on étudié une méthode pour pré- parer la lysine à un prix notablement inférieur à celui au- quel le composé est couramment vendu dans le commerce.
La première opération pour cette nouvelle synthèse de la lysine est la production de l'acide diaminopimélique.
Cette opération a lieu dans une cuve profonde et aérée, c'est- à-dire par fermentation submergée, on utilisant uneespèce mu
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tante de E. coli qui est incapable de décarboxyler l'acide diaminopimélique en lysine. Ces espèces mutantes peuvent ê tre obtenues par la méthode à la pénicilline de Davis (cités plus haut). On a découvert que plusieurs souches de E. coli, qui ne sont pas capables de convertir l'acide diaminopimé-, lique en lysine et ont besoin de lysine pour leur croissance, sont utiles pour la mise en oeuvre de cette réaction.
En particulier, on a découvert qu'une souche, choisie parmi plusieurs autres.souches convient pour cette réaction, pour fournir le meilleur rendement, bien que d'autrs souches de E. coli, ayant besoin de lysine, conviènnent également. Une culture croissante de'cette souche préférée de E. coli, ayant besoin de lysine.pour sa croissance, et qui convient à la production d'acide diaminopimélique avec un rendement élevé a été déposée à la American Type Culture Collection à Washington, D. C. et ajoutée à sa collection per manente dans laquelle on lui a donné le numéro ATCC 12,408 Afin que cette réaction, qui produit l'acide diaminopiméli- que, puisse se faire avec un rendement élevé, les conditions doivent être soigneusement réglées. On a découvert que, pen dant la fermentation, le pH doit être maintenu au voisinage de la neutralité.
Pendant la fermentation, le pH tend à di minuer et la neutralité est conservée par l'addition d'alca li, par exemple le NaOH ou KOH et, de préférence, de l'hy- droxyde d'ammonium. L'urée peut également être utilisée à cet effet quand elle est convertie en ammoniac* Vers la fin de la fermentation, le pH tend à augmenter et la neutra- lité est conservée en ajoutant au milieu de l'acide sulfuri' due. On a également découvert que l'addition de glycérol au milieu est extrêmement utile. On a aussi découvert que le mar nitol peut être utilisé à la place du glycérol, mais on a constaté que le glycorol est plus efficace et plus économi- que.
De plus-, on a découvert que la'liqueur de macération de
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maïs est un constituant particulièrement bon pour le milieu de fermentation. Cette liqueur fournit la lysine nécessaire à la croissance des auxotrophes de E. coli et agit, peut-être aussi comme source économique de précurseurs tels que l'acide aspartique et l'acide lactique. Par conséquent, à l'aide de ces trois réglage:; nouvellement découverts de la fermentation àsavoir : 1) réglage précis du pH à, ou au voisinage de, la neutralité ; 2) addition de glycérol depuis 1 à 10% en volume;
3) usage de la liqueur de macération de maïs ; on a constaté qu'il est possible d'obtenir de l'acide dia- minopimélique d'une manière économique et sur une grande échelle industrielle. L'acide diaminopimélique est, évidemment un composé ayant une valeur extrêmement importante. Il est utile par lui-même etégalement, comme produit intermédiaire pour la synthèse de lysine, convie indiqué plus loin. On a également obtenu une certaine preuve que l'acide diaminopimé- . lique peut être utilisé comme supplément pour la nourriture de la volaille pour laquelle il peut remplacer la lysine.
Cette fermentation a lieu a environ 25 et, géné ralement trois jours à peu près sont nécessaires pour obtenir un rendement optimum. Il est évident que les conditions, pour obtenir le meilleur rendraient, varient quelque peu avec la souche particulière de l'organisme utilisé.
L'opération finale pour la synthèse de la lysine est la conversion de 1 acide diaminopimélique en lysine. Ceci est obtenu par le traitement de l'acide diaminopimélique de préférence dans le bouillon initial contenant les cellules, avec la décarboxyliase d'enzyne d'acide diaminoimélique obte-. que à partir d'organismes de l'espèce Aerobacter aerogenes et aussi à partir des membres ordinaires de l'espèce E. coli qui n'ont pas besoin do lysine pour leur croissance. L'enzyme est libérée, à partir de ces organismes, par une quelconque des méthodes ordinaires utilisées pour libérer les enzymes.
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Ces méthodes comprennent le traitement avec un solvant tel que le butanol, le traitement par une énergie ultrasonique, et la préparation d'une poudre séchée par l'acétone.
On a découvert que la méthode préférée pour libérer la décarboxylase d'enzyme d'acide diaminopimélique d'avec les organismes du genre A.aerogenes et les organismes du genre E. coli qui n'oint pas besoin de lysine pour leur croissance est le traitement avec le solvant toluène, ce qui présente l'a- vantage additionnel de conserver la stérilité pendant les dernières phases de la réaction pour laquelle l'enzyme est utilisée. Les cellules peuvent être traitées avec le toluè- ne avant ou après l'addition du bouillon d'acide diaminopi- mélique initial mais dans l'un ou l'autre cas on profère que le toluène soit présent dans le mélange de conversion et n'en soit pas séparé.
Une souche particulière de A. aerogened, qui procure des rendements très élevés parce qu'elle ne con- tient pas de décarboxylase d'enzyme de lysine, a été déposée au ATCC et a reçu le numéro 12.409.
Pour obtenir la conversion maximum de l'acide dia- minopimélique en lysine, il est avantageux que certaines con- ditions soient utilisées. On a découvert que l'adddition d agents de chelification, tels que les ions citrate et les sels tétrasodiques de l'acide éthylènediaminetétracétique est très avantageuse pour effectuer cette réaction. l'additon de la vitamine B6 est également utile. L'agent de chelification et la vitamine B6 sont spécialement utiles quand on fait réagir des concentrations élevées d'acide diaminopimélique. On a éga lement découvert que la mise en oeuvre de cette réaction en l'absence de lumière augmente également le rendement mais ceci n'est pas essentiel.
Cette conversion de l'acide diaminopimélique en lysine a lieu en environ 24 heures. On a constaté qu'une température d'environ 28 procure de bosn résultats.
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Après cette réaction, la lysine est purifiée par filtration du mélange de réaction enzyme, par absorption de la lysine sur une résine échangeuse de cations forte., telle que la résine à base d'acide sulfonique, dénommée Amberlite IR-120 (TM de Rohm and Haas Co), par élution de la lysine d'avec la résine échangeuse de cations par un alcali dilué tel que l'hydroxyde de potassium ou de sodium, par le passage de cet éluat à travers une réside échangeuse de cations faible, telle que la résine carboxylique Amberlite IRC-50(TM de Rohm and Haas Co) qui n'absorbe pas la lysine, et par séchage de lteffluant: Une purification additionnelle se fait alors par la méthode ordinaire de recristallisation.
Les exemples ci-dessous sont donnés uniquement à titre illustratif et n'ont aucun caractère limitatif ni res- trictif car plusieurs variantes de ces exemples sont passi- bles sans sortir des limites de protection de l'invention EXEMPLE I:
- Production de l'acide diaminopimélique
On cultive le E. coli ATCC 12.408 pendant 20 heures à 28 en le secouant avec le milieu suivant, qui a été stéri- lisé prélablement dans un autoclave pendant 30 minutes sous une pression de 1,4 kg/cm2
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<tb> NH42PO4 <SEP> 0,5%
<tb>
<tb>
<tb> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 0,5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> glycérol <SEP> 0,5
<tb>
pH réglé à 7,5 avec de l'hydroxyde de potassium.
Un autre milieu est préparé pour l'obtention effec- tive d'acide diaminopimélique. Ce milieu a la composition suivante :
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<tb> NH4) <SEP> 2HP4 <SEP> 4%
<tb>
<tb>
<tb> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 4 <SEP> en <SEP> volunie
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> glycétol <SEP> 6 <SEP> " <SEP> "
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> CaCO <SEP> 0,5
<tb>
Le pH est réglé à 7,5 avec de l',hydroxyde de po tassium. On traite deux litres de ce milieu dans un autoclave
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pendant une heure sous une pression de 1,4 kg/cm2.
On ajoute 100 cm3 de ltinoculum initial à deux litres du milieu utilisé pour la.production. La réaction est effectuée à 28 avec agitation à une vitesse de 1750 t/min., avec aération et a un débit de 1 volume d'air par volume du mélange de réaction et par minute. Une trace d'huile de soja est ajoutée comme agent anti-mousse. Après 72 heures, l'analyse du mélange montre qu'il a une teneur en acide diaminopimélique de 9,0 mg/ml.
EXEMPLE II
Variante de la production de l'acide diamino- pimélique.
On cultive le E. coli n ATCC 12.408 sur le milieu nutritif décrit dans l'exemple I pour obtenir un inooulum. Un litre de cet inoculum est ajouté à 85 litres du milieu' de production stérilisé suivant :
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<tb> (NH4)2HOP4 <SEP> 2 <SEP> % <SEP>
<tb> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 4 <SEP> en <SEP> volume
<tb>
<tb> glycérol <SEP> 7 <SEP> " <SEP> "
<tb>
<tb> CaCo3 <SEP> 0,5
<tb>
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pu réglé à 7,5 avec de LllliyclroxycL'e de potassium.
La réaction a lieu à 28 avec agitation à une vitesse de 1750 t/min et avec aération, à un débit d'un volume dtair par volume de mélange de réaction et par minu- te. Une trace dtAntifoam A de la Société Dow Corning (anti-mousse à base de silicone) est ajoutée comme agent anti-mousse. Pendant la réaction, le pH est maintenu au voisinage de la neutralité en ajoutant progressivement de lthydroxyde dtammonium en commençant à la fin d'une durée de réaction d'environ 24 heures. Le pH tend à diminuer et on préfère ajouter progressivement de l'hydroxyde d'ammo-
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nium de manière à maintenir le pH très légèrementjàu-dessus de la neutralité (entre 7 et environ 7,5) pour empêcher
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ainsi le développement d'un bas pH.
Après 64 heures de progression de la réaction, il est nécessaire d'ajouter de l'acide sulfurique pour conserver la neutralité car, à cette phase de la réaction, le pH tend à monter. Après 68 heures, l'analyse du mélange de réaction montre qu'il a une teneur en acide diaminopimélique de 6,5 mg/ml.
EXEMPLE III
Conversion de l'acide diaminopimélique en ly- sine.
On règle le pH à 7,2 de 100 ml d'un bouillon dans lequel l'acide diaminopimélique a été obtenu de la ma nière décrite dans l'exemple I, ce bouillon ayant une te- neur de 2,5 mg d'acide diaminopimélique par ml. Il est à noter que les cellules de E. coli utilisées pour produire l'acide diaminopimélique n'ont pas été enlevées de ce bouillon et qu'on a permis qu'elles restent dans celui-ci.
Ce bouillon est contenu dans un flacon Erlenmeyer de 300 cm3. On y ajoute 5 cm3 de toluène.
On cultive du A. aerogenes, ATCC n 12,409 pendant 20 heures dans des portions de 2 litres du milieu suivant :
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<tb> - <SEP> glycérol <SEP> 0,5 <SEP> %
<tb>
EMI7.2
(NH 4)2HP04 0,5
EMI7.3
<tb> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 0,5
<tb>
pH réglé à 7,5 par de l'hydroxyde d'ammonium.
Les conditions pour la culture sont : une tem- pérature de 28 une agitation à la vitesse de 1750 t/min; une aération avec un débit d'un volume d'air/volume du mé lange/minute. Une trace d'huile de soja est ajoutée comme agent anti-mousse. Après 20 heures, on procède à la cen- trifugation de 25 cra3 du bouillon contenant les cellules en suspension. Le liquide surnageant est écarté. Ces cellules sont alors introduites dans le flacon Erlenmeyer
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contenant le bouillon d'acide diaminopimélique et le toluè- ne. Ce flacon est secoué pendant 16 heures à 28 et à la fin de cette période, l'acide diaminopimélique est conver- ti en lysine avec un rendement de 100 %. La lysine est obtenue par un traitement avec éehange d'ions.
EXEMPLE IV
Variante pour la conversion de l'acide diamino pimélique en lysine.
On introduit 100 cm3 d'un bouillon d'acide diaminopimélique dans un flacon Erlenmeyer de 300 cm3. Le pH est réglé à 7,2 et 5 cm3 de toluène sont ajoutés.
On cultive du A. aerogenes, n ATCC 12.409, comme dans l'exemple III et à la;fin de 20 heures on sou- met 7 ml du bouillon dans lequel! sont suspendues les cel- lules à une centrifugation. Le liquide surnageant est écarté. Les cellules sont séchées par congélation et don- nent 75 mg de matières solides qui sont ajoutées au flacon Erlemmeyer contenant l'acide diaminopimélique et le toluè- ne. Ce flacon Erlenmeyer est secoué pendant 16 heures à 28 et, après cela, on constate que l'acide diamonopiméli- que a été convertu en lysine avec un rendement de 100%
EXEMPLE V
Utilisation de composés de chélification.
Au cours d'autres expériences concernant la conversion d'acide diaminopimélique en lysine, effectuées de la manière indiquée dans les exemples III et IV ci-des- sus, on a constaté que, dans les cas d'un bouillon conte- nant de l'acide diaminopimélique avec une teneur élevée en cet acide, la conversion en lysine peut se faire d'une manière plus complète et plus rapide que cela pourrait se faire avec des bouillons contenant ces concentrations éle- vées quand on ajoute un agent de chélification à ce mélan- ge. L'acte citrique et le sel tétrasodique de l'acide
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éthylènediaminotétracétique sont avantageux, lorsqu'ils sont ajoutés à des concentrations comprises entre environ
0,004 partie moléculaire et 0,032 partie moléculaire. L'u- sage de concentrations plus élevées n'est pas recommandé.
L'addition de la vitamine B6 au cours de la conversion de l'acide diaminopimélique en lysine est -éga- lement utile pour la mise en oeuvre de l'invention. Des traces de cette vitamine sont seulement nécessaires.
REVENDICATIONS
1. Procédé pour préparer de l'acide diaminopiméli- 'que par fermentation submergée aérobique d'une espèce mu- tante de E. coli qui a besoin de lysine pour sa croissance et ne contient pas de décarboxylase d'enzyme d'acide dia- minopimélique, la fermentation ayant lieu sur un milieu nutritif dont le pH est maintenu à une valeur voisine de la neutralité.